ES2200587T3

ES2200587T3 - Combinaciones de inhibidors del transporte de acidos biliares del ileon e inhibidores de la proteina de transferencia de colesteril ester para indicaciones cardiovasculares.

Info

Publication number: ES2200587T3
Application number: ES99965902T
Authority: ES
Inventors: Bradley T. Keller; James A. Sikorski; Kevin C. Glenn; Daniel T. Connolly; Mark E. Smith; Joseph R. Schuh
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: PT1140188E; DE69908414T2; MXPA01006471A; HK1044479A1; IL143946A0; NZ512536A; BR9916486A; HK1041443A1; HUP0201972A2; US6458851B1; EP1342475A1; CN1342089A; HUP0201972A3; NO20013161D0; CZ20012340A3; US20030203892A1; AU776620B2; CA2356422A1; EA200100705A1; DK1140188T3

Abstract

Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon (IBAT) y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster (CETP), donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz contra un estado hiperlipidémico, una cantidad eficaz contra un estado aterosclerótico, o una cantidad eficaz contra un estado hipercolesterolémico de los compuestos, y donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster comprende el compuesto C-12 representado por: o enantiómeros o racematos del mismo.

Description

Combinaciones de inhibidores del transporte de ácidos biliares del íleon e inhibidores de la proteína de transferencia de colesteril éster para indicaciones cardiovasculares.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y, específicamente, se refiere a combinaciones de compuestos y de composiciones y a su uso en medicina, particularmente en la profilaxis y tratamiento de estados hiperlipidémicos tales como los asociados con la aterosclerosis, hipercolesterolemia y otras enfermedades de las arterias coronarias en mamíferos. Más particularmente, la invención se refiere a compuestos inhibidores del transportador de ácidos biliares del íleon (IBAT). La invención también se refiere a compuestos inhibidores de la actividad de la proteína de transferencia de colesteril éster (CETP).

Descripción de la técnica relacionada

Está bien establecido que los estados hiperlipidémicos asociados con concentraciones elevadas de colesterol total y colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad (LDL) son factores de riesgo importantes para la enfermedad cardíaca coronaria y, particularmente, para la aterosclerosis. Como los altos niveles de colesterol LDL aumentan el riesgo de aterosclerosis, los métodos para reducir los niveles de colesterol LDL en plasma serían terapéuticamente beneficiosos para el tratamiento de la aterosclerosis y de otras enfermedades asociadas con la acumulación de lípidos en los vasos sanguíneos. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad vascular periférica y apoplejía.

La aterosclerosis es la base fundamental de la mayoría de las enfermedades de las arterias coronarias (CAD), una causa importante de morbididad y mortalidad en la sociedad moderna. Se ha demostrado que los altos niveles de colesterol LDL (por encima de aproximadamente 180 mg/dl) y los bajos niveles de colesterol HDL (por debajo de 35 mg/dl) son contribuyentes importantes al desarrollo de la aterosclerosis. Otras enfermedades o factores de riesgo, tales como la enfermedad vascular periférica, la apoplejía y la hipercolesterolemia, se ven afectadas negativamente por relaciones adversas de HDL/LDL.

Se ha descubierto que la interferencia con la recirculación de los ácidos biliares procedentes del lumen del tracto intestinal reduce los niveles de colesterol en suero en una relación causal. Se han acumulado datos epidemiológicos que indican que tal reducción conduce a una mejoría en el estado de enfermedad de la aterosclerosis. Stedronsky, en "Interaction of bile acids and cholesterol with nonsystemic agents having hypocholesterolemic properties", Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994), describe la bioquímica, fisiología y agentes activos conocidos en relación con los ácidos biliares y el colesterol.

Se ha demostrado que ciertas alteraciones patofisiológicas transitorias están relacionadas con la interrupción de la circulación enterohepática de los ácidos biliares en seres humanos con una ausencia de actividad IBAT heredada, como se informa por Heubi, J.E., et al. Véase "Primary Bile Acid Malabsorption: Defective in Vitro Ileal Active Bile Acid Transport", Gastroenterology, 83, 804-11 (1982).

En otra estrategia para la reducción de la recirculación de ácidos biliares, el sistema de transporte de ácidos biliares del íleon es un supuesto agente farmacéutico para el tratamiento de la hipercolesterolemia, basado en una interrupción de la circulación enterohepática con inhibidores del transporte específicos (Kramer, et al., "Intestinal Bile Acid Absorption" The Journal of Biological Chemistry, 268 (24), 18035-46 (1993).

En varias solicitudes de patente individuales, Hoechst Aktiengesellschaft describe polímeros de diversos constituyentes naturales del sistema de circulación enterohepática y sus derivados, incluyendo ácidos biliares, que inhiben el transporte fisiológico de ácidos biliares con el objetivo de reducir el nivel de colesterol LDL suficientemente como para ser eficaces como agentes farmacéuticos y, en particular, para uso como agentes hipocolesterolémicos. Las solicitudes de patente de Hoechst individuales que describen tales compuestos inhibidores del transporte de ácidos biliares se indican por separado a continuación.

R1. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.025.294.

R2. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.078.588.

R3. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.085.782.

R4. Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.085.830.

R5. Solicitud EP Nº 0 379 161.

R6. Solicitud EP Nº 0 549 967.

R7. Solicitud EP Nº 0 559 064.

R8. Solicitud EP Nº 0 563 731.

En la solicitud de patente mundial número WO 93/321146 se describen benzotiepinas seleccionadas para numerosos usos, incluyendo el metabolismo de ácidos grasos y enfermedades vasculares coronarias.

Se conocen otras benzotiepinas seleccionadas para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos, especialmente para el tratamiento o prevención de la aterosclerosis como se describe en la solicitud de patente Nº EP 508425. Una solicitud de patente francesa, FR 2661676 describe benzotiepinas adicionales para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos. Además, la solicitud de patente Nº WO 92/18462 indica otras benzotiepinas para uso como agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos. Patente de Estados Unidos Nº 5.994.391 (Lee et al.). Cada uno de los agentes hipolipémicos e hipocolesterolémicos de benzotiepina descritos en estas solicitudes de patente individuales está limitado por una amida unida al carbono adyacente al anillo de fenilo del anillo de biciclobenzotiepina condensado.

En la solicitud de patente Nº PCT/US95/10863 se describen benzotiepinas adicionales útiles para el tratamiento de la hipercolesterolemia y la hiperlipidemia. En el documento PCT/US97/04076 se describen más benzotiepinas útiles para la profilaxis y tratamiento de la hipercolesterolemia y la hiperlipidemia, así como composiciones farmacéuticas de tales benzotiepinas. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de serie 08/816.065 se describen otras benzotiepinas y composiciones de las mismas útiles para la profilaxis y tratamiento de la hipercolesterolemia y la hiperlipidemia.

En la descripción de The Wellcome Foundation Limited de la Solicitud de Patente Nº WO 93/16055 para "compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos", se describe que la inhibición del transporte de ácidos biliares in vitro está correlacionada con la actividad hipolipidémica. Esta publicación describe varios compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos. En la Solicitud de Patente Nº WO 96/05188 se describen compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos adicionales (particularmente compuestos de 2,3,4,5-tetrahidrobenzo-1-ti-4-azepina). Una benzotiazepina particularmente útil descrita en el documento WO 96/05188 es el compuesto de fórmula B-2. En la Solicitud de Patente Nº WO 96/16051 se describen otros compuestos de benzotiazepina hipolipidémicos.

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1,1 dióxido de (3R,5R)-3-butil-3-etil-2,3,4,5-tetrahidro-7, 8-dimetoxi-5-fenil-1-4-benzotiazepina

En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 99/35135 se describen otros compuestos de benzotiazepina útiles para el control del colesterol. En esta descripción se incluye el compuesto de fórmula B-7.

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Otros compuestos inhibidores de IBAT adicionales incluyen una clase de compuestos de naftaleno, descritos por T. Ichihashi et al. en J. Pharmacol. Exp. Ther., 284 (1), 43-50 (1998). En esta clase, es particularmente útil el S-8921 (1-(3,4-dimetoxifenil)-3-(3-etilvaleril)-4-hidroxi-6,7,8-trimetoxi-2- naftoato de metilo). La estructura de S-8921 se muestra en la fórmula B-20. En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 94/24087 se describen otros compuestos de naftaleno o derivados de lignina útiles para el tratamiento o profilaxis de la hiperlipidemia o aterosclerosis.

68

Se ha demostrado que la inhibición de la proteína de transferencia de colesteril éster (CETP) modifica eficazmente las relaciones plasmáticas de HDL/LDL, y es de esperar que detenga el progreso y/o la formación de ciertas enfermedades cardiovasculares. CETP es una proteína plasmática que facilita el movimiento de los colesteril ésteres y los triglicéridos entre las diversas lipoproteínas presentes en la sangre (Tall, J. Lipid Res., 34, 1255-74 (1993)). El movimiento del colesteril éster de HDL a LDL por CETP tiene el efecto de reducir el colesterol HDL. Por lo tanto, se deduce que la inhibición de CETP debe conducir a una elevación del colesterol HDL en plasma y a una reducción del colesterol LDL en plasma, proporcionando de esta manera un perfil de lípidos en plasma terapéuticamente beneficioso. Se describen pruebas de este efecto en McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993). Se describe otra prueba de este efecto en Sitori, Pharmac. Ther., 67, 443-47 (1995)). Este fenómeno se demostró por primera vez por Swenson et al., (J. Biol. Chem., 264, 14318 (1989)) con el uso de un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente CETP. En conejos, el anticuerpo produjo una elevación del colesterol HDL en plasma y una reducción del colesterol LDL. Son et al. (Biochim. Biophys. Acta, 795, 743-480 (1984)) describen proteínas procedentes del plasma humano que inhiben CETP. La Patente de Estados Unidos Nº 5.519.001, incorporada en este documento como referencia, expedida a Kushwaha et al., describe un péptido de 36 aminoácidos derivado de apo C-1 de mandril que inhibe la actividad CETP. Cho et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391, 133-144 (1998)) describen un péptido procedente del plasma de cerdo que inhibe la CETP humana. Bonin et al. (J. Peptide Res., 51, 216-225 (1998)) describen un decapéptido inhibidor de CETP. Hedge et al., en Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1277-80 (1998), describen un metabolito fúngico desp-peptídico como un inhibidor de CETP.

Hay varios informes de compuestos no peptídicos que actúan como inhibidores de CETP. Barrett et al. (J. Am. Chem. Soc., 188, 7863-63 (1996)) describen inhibidores de CETP que contienen ciclopropano. Kuo et al. (J. Am. Chem. Soc., 117, 10629-34 (1995)) describen otros inhibidores de CETP que contienen ciclopropano. Pietzonka et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1951-54 (1996)) describen análogos de colesteril éster que contienen fosfonato como inhibidores de CETP. Coval et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 605-610 (1995)) describen Wiedendiol-A y -B, y compuestos de sesquiterpeno relacionados, como inhibidores de CETP. Lee et al. (J. Antibiotics, 49, 693-96 (1996)) describen inhibidores de CETP derivados de un hongo de insectos. Busch et al. (Lipids, 25, 216-220, (1990)) describen bromuro de colesteril acetilo como un inhibidor de CETP. Morton y Zilversmit (J. Lipid Res., 35, 836-47 (1982)) describen que el p-cloromercurifenil sulfonato, el p-hidroximercuribenzoato y el mercuritiosalicilato de etilo inhiben CETP. Connolly et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 223, 42-47 (1996)) describen otros reactivos de modificación de cisteína como inhibidores de CETP. Xia et al. describen 1,3,5-triazinas como inhibidores de CETP (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 919-22 (1996)). Bisgaier et al. (Lipids, 29, 811-8 (1994)) describen 4-fenil-5-tridecil-4H-1,2,4-triazol-tiol como un inhibidor de CETP. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/153.360 se describen otros inhibidores de CETP de triazol adicionales. Sikorski et al. describió nuevos inhibidores de CETP adicionales en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914204.

Pueden usarse compuestos de 2-mercaptoanilina amida substituidos como inhibidores de CETP, y tales compuestos terapéuticos se describen por H. Shinkai et al. en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 98/35937.

Algunos compuestos de heteroalquilamina substituidos son conocidos como inhibidores de CETP. En la Solicitud de Patente Europea Nº 796846, Schmidt et al. describen piridinas 2-aril-substituidas como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster útiles como agentes cardiovasculares. Un sustituyente en el C_{3} del anillo de piridina puede ser un grupo hidroxialquilo. En la Solicitud de Patente Europea Nº 801060, Dow y Wright describen derivados heterocíclicos substituidos con un producto de adición de aldehído de una alquilamina para producir 1-hidroxi-1-aminas. Se indica que estos compuestos son agonistas de receptores \beta3-adrenérgicos útiles para tratar la diabetes y otros trastornos. En la Solicitud de Patente Británica Nº 2305665, Fisher et al. describen agonistas derivados de piridina 3-substituidos con aminoalcohol secundario útiles para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo las alteraciones de los niveles de colesterol y las enfermedades ateroscleróticas. En la Solicitud de Patente Europea Nº 818448, Schmidt et al. describen derivados de tetrahidroquinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. En la Solicitud de Patente Europea Nº 818197, Schmek et al. describen piridinas con heterociclos condensados como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. Brandes et al, en la Solicitud de Patente Alemana Nº 19627430, describen derivados de piridina condensados bicíclicos como inhibidores de la proteína de transferencia de colesterol éster. En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9839299, Muller-Gliemann et al. describen derivados de quinolina como inhibidores de la proteína de transferencia de colesteril éster.

A. Oomura et al, en la Patente Japonesa Nº 10287662, describen compuestos policíclicos que son útiles como inhibidores de CETP. Por ejemplo, se prepararon compuestos terapéuticos que tenían las estructuras C-1 y C-8 cultivando Penicillium spp.

Schmidt et al, en la Patente Europea Nº EP 818448, describen cicloalquilpiridinas útiles como inhibidores de CETP. Por ejemplo, el compuesto terapéutico que tiene la estructura C-9 se describe como un compuesto terapéutico particularmente eficaz como un inhibidor de CETP.

En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914174 se describen compuestos de tetrahidronaftaleno substituidos útiles como inhibidores de CETP. Un compuesto descrito específicamente en esta descripción como un inhibidor de CETP útil es (8S)-3-ciclopentil-1-(4-fluorofenil)-2-[(S)-fluoro(4-trifluorometilfenil)metil]- 8-hidroxi-6-espirociclobutil-5,6,7,8-tetrahidronaftaleno.

En la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9914215 se describen algunas 4- heteroaril-tetrahidroquinolinas útiles como inhibidores de CETP. Por ejemplo, esta descripción describe 3-(4-trifluorometilbenzoil)-5,6,7,8-tetrahidroquinolin-5-ona como un inhibidor de CETP útil.

En la bibliografía se han descrito algunas terapias de combinación para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/037.308 se describen combinaciones de inhibidores de IBAT con inhibidores de la HMG CoA reductasa útiles para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

J. Sasaki et al. (Id.) describen una terapia de combinación de fluvastatina y niceritrol. Estos investigadores concluyen que la combinación de fluvastatina con niceritrol "a una dosis de 750 mg/día, no parece aumentar o atenuar los efectos beneficiosos de la fluvastatina".

L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264 (23), 3013-17 (1990)) describen efectos beneficiosos de una terapia de combinación de colestipol y niacina sobre la aterosclerosis coronaria. Los efectos descritos incluyen la ausencia de progresión y la regresión en lesiones de las arterias coronarias congénitas.

Una terapia de combinación de acipimox y simvastatina muestra efectos beneficiosos sobre las lipoproteínas HDL en pacientes que tienen altos niveles de triglicéridos (N. Hoogerbrugge et al., J. Internal Med., 241, 151-55 (1997)).

H. Gylling et al. (J. Lipid Res., 37, 1776-85 (1996)) describen una terapia de combinación con margarina de éster de sitostanol y pravastatina. Se indica que esta terapia inhibe simultáneamente la absorción de colesterol y reduce el colesterol LDL significativamente en hombres diabéticos no dependientes de insulina.

Brown et al. (New Eng. J. Med., 323 (19), 1289-1339 (1990)) describen una terapia de combinación de lovastatina y colestipol que reduce la progresión de las lesiones asteroscleróticas y aumenta la regresión de las lesiones con respecto a la lovastatina sola.

Chang et al, en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9823593, describieron una terapia de combinación de un inhibidor de la secreción de apoB con un inhibidor de CETP.

Buch et al. (Solicitud de Patente PCT Nº WO 9911263) describen una terapia de combinación que comprende amlodipina y un compuesto de estatina para tratar a los sujetos que sufren angina de pecho, aterosclerosis, o hipertensión e hiperlipidemia combinadas, y para tratar los síntomas del paro cardíaco. Buch et al, en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 9911259, describen una terapia de combinación que comprende amlodipina y atorvastatina.

Scott et al. (Solicitud de Patente PCT Nº WO 9911260) describen una terapia de combinación que comprende atorvastatina y un agente antihipertensor.

Dettmar y Gibson (Solicitud de Patente del Reino Unido Nº GB 2329334 A) reivindican una composición terapéutica útil para reducir los niveles plasmáticos de lipoproteína de baja densidad y de colesterol, donde la composición comprende un inhibidor de la HMG CoA reductasa y un agente complejante de bilis.

Las referencias anteriores demuestran la necesidad continua de encontrar agentes seguros y eficaces para la profilaxis o tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Sumario de la invención

Para satisfacer la necesidad irresoluta de encontrar agentes seguros y eficaces para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, ahora se presentan terapias de combinación de fármacos cardiovasculares.

Entre sus diversas realizaciones, la presente invención proporciona una terapia de combinación que comprende una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de un inhibidor de CETP, útil en la profilaxis o el tratamiento de la hiperlipidemia, la aterosclerosis o la hipercolesterolemia, donde dichas primera y segunda cantidades conjuntamente comprenden una cantidad eficaz contra un estado hiperlipidémico, una cantidad eficaz contra un estado aterosclerótico, o una cantidad eficaz contra un estado hipercolesterolémico, de los compuestos. Por ejemplo, una de las muchas realizaciones de la presente invención es una terapia de combinación que comprende dosificaciones terapéuticas de un inhibidor de IBAT y un inhibidor de CETP. Una realización preferida de la presente invención es una terapia de combinación que comprende dosificaciones terapéuticas de un inhibidor de IBAT de benzotiepina y un inhibidor de CETP.

Otra realización de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias de combinación cardiovasculares descritas en este documento, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la hipercolesterolemia, la aterosclerosis o la hiperlipidemia. Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un estado hiperlipidémico, de una combinación en forma de dosificación unitaria, donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad de los compuestos eficaz contra estados hiperlipidémicos.

En otra realización, la presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un estado aterosclerótico, de una combinación en forma de dosificación unitaria, donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz de los compuestos contra un estado aterosclerótico.

En otra realización, la presente invención proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la hipercolesterolemia, de una combinación en forma de dosificación unitaria, donde la combinación comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de CETP, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz de los compuestos contra un estado hipercolesterolémico.

El alcance adicional de la aplicabilidad de la presente invención se hará evidente tras la descripción detallada proporcionada a continuación. Sin embargo, debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos proporcionados más adelante, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan sólo a modo ilustrativo, ya que a los especialistas en la técnica se les ocurrirán diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención a partir de esta descripción detallada.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La siguiente descripción detallada se proporciona para ayudar a los especialistas en la técnica en la puesta en práctica de la presente invención. Incluso así, no debe considerarse que esta descripción detallada limita indebidamente la presente invención, ya que los especialistas en la técnica pueden realizar modificaciones y variaciones en las realizaciones descritas en este documento sin apartarse del alcance del presente descubrimiento de la invención.

a. Definiciones

Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector a comprender la descripción detallada de la presente invención:

"Transportador de ácidos biliares del íleon" o "IBAT" es sinónimo de un transportador de ácidos biliares co-dependiente de sodio apical o ASBT.

"Inhibidor de IBAT de benzotiepina" significa un inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon que comprende un compuesto terapéutico que comprende una estructura de 1,1-dióxido de 2,3,4,5-tetrahidro-1-benzotiepina.

\newpage

Como se usa en este documento, la expresión "inhibidor de CETP" o "compuesto inhibidor de CETP" significa cualquier compuesto terapéutico obtenido a partir de fuentes químicas o biológicas que inhibe la actividad de la proteína de transferencia de colesteril éster.

"Terapia de combinación" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar un estado hiperlipidémico, por ejemplo la aterosclerosis y la hipercolesterolemia. Tal administración incluye la co-administración de estos agentes terapéuticos de una manera substancialmente simultánea, tal como en una sola forma de dosificación que tiene una relación fija de ingredientes activos o en formas de dosificación múltiples separadas para cada agente inhibidor. Además, tal administración también incluye el uso de cada tipo de agente terapéutico de una manera secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos en el tratamiento del estado hiperlipidémico.

La expresión "terapéuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad combinada de inhibidores en la terapia de combinación. Esta cantidad combinada conseguirá el objetivo de reducir o eliminar el estado hiperlipidémico.

El "compuesto terapéutico" significa un compuesto útil en la profilaxis o tratamiento de un estado hiperlipidémico, incluyendo la aterosclerosis y la hipercolesterolemia.

b. Combinaciones

Las combinaciones de la presente invención tendrán varios usos. Por ejemplo, por medio del ajuste de la dosificación y el control médico, las dosificaciones individuales de los compuestos terapéuticos usados en las combinaciones de la presente invención serán menores que las dosificaciones típicas de los compuestos terapéuticos cuando se usan en monoterapia. La reducción de la dosificación proporcionará ventajas, incluyendo la reducción de efectos secundarios de los compuestos terapéuticos individuales en comparación con la monoterapia. Además, los menores efectos secundarios de la terapia de combinación en comparación con las monoterapias conducirán a una mayor aceptación de los regímenes de terapia por parte de los pacientes.

Otro uso de la presente invención será en combinaciones que tienen efectos complementarios o modos de acción complementarios. Por ejemplo, los inhibidores de IBAT controlan los niveles de colesterol en el suero sanguíneo inhibiendo la reabsorción de ácidos biliares en el íleon. Por el contrario, los inhibidores de CETP inhiben el movimiento del colesteril éster y de los triglicéridos entre las diversas lipoproteínas presentes en la sangre.

Los compuestos útiles en la presente invención incluyen una amplia serie de compuestos terapéuticos. Algunos inhibidores de IBAT útiles en la presente invención se describen en la solicitud de Patente Nº PCT/US95/10863. En el documento PCT/US97/04076 se describen más inhibidores de IBAT. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/816.065 se describen otros inhibidores de IBAT adicionales útiles en la presente invención. En el documento WO 98/40375 se describen más compuestos inhibidores de IBAT útiles en la presente invención. En la solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 08/816.065 se describen otros compuestos inhibidores de IBAT adicionales útiles en la presente invención. En la Patente de Estados Unidos Nº 5.994.391 se describen compuestos inhibidores de IBAT adicionales útiles en la presente invención. Los inhibidores de IBAT de interés particular en la presente invención incluyen los mostrados en la tabla 1, así como los de diastereómeros, enantiómeros, racematos, sales y tautómeros de los inhibidores de IBAT de la tabla 1.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

4

7

10

13

15

18

21

24

27

29

31

35

39

En las siguientes solicitudes de patente individuales se describen por separado algunos compuestos inhibidores de CETP individuales.

R9. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101661.

R10. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101711.

R11. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101660.

R12. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101664.

R13. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101668.

R14. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101662.

R15. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101663.

R16. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101669.

R17. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 60/101667.

R18. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/401.916.

R19. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/405.524.

R20. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/404.638.

R21. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/404.638.

R22. Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Nº de Serie 09/400.915.

R23. Patente de Estados Unidos Nº 5.932.587.

R24. Patente de Estados Unidos Nº 5.925.645.

El compuesto inhibidor de CETP usado en la presente invención es el compuesto C-12 mostrado en la tabla 2, así como sus diastereómeros, enantiómeros, racematos, sales y tautómeros.

TABLA 2

40

43

46

49

53

57

Los compuestos (por ejemplo, compuestos inhibidores del transporte de ácidos biliares del íleon o compuestos inhibidores de CETP) útiles en la presente invención pueden no tener ningún átomo de carbono asimétrico o, como alternativa, los compuestos útiles pueden tener uno o más átomos de carbono asimétricos. Por lo tanto, cuando los compuestos útiles tienen uno o más átomos de carbono asimétricos, incluyen racematos y estereoisómeros, tales como diastereómeros y enantiómeros, tanto en forma pura como en forma de mezcla. Tales estereoisómeros pueden prepararse usando técnicas convencionales, por ejemplo, por reacción de materiales de partida enantioméricos o por la separación de los isómeros de compuestos de la presente invención.

Los isómeros pueden incluir isómeros geométricos, por ejemplo, isómeros cis o isómeros trans a través de un doble enlace. Todos tales isómeros se contemplan entre los compuestos útiles en la presente invención.

Los compuestos útiles en la presente invención también incluyen tautómeros.

Los compuestos útiles en la presente invención, como se describe más adelante, incluyen sus sales, solvatos y profármacos.

Dosificaciones, formulaciones y vías de administración

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades o estados hiperlipidémicos por cualquier medio, preferiblemente oral, que produzca el contacto de estos compuestos con su sitio de acción en el cuerpo, por ejemplo, en el íleon, el plasma o el hígado de un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

Para la profilaxis o tratamiento de los estados mencionados anteriormente, los compuestos útiles en las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse como el compuesto per se. Las sales farmacéuticamente aceptables son particularmente adecuadas para aplicaciones médicas debido a su mayor solubilidad en agua con respecto al compuesto parental. Claramente, tales sales deben tener un anión o catión farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención, cuando es posible, incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico, sulfónico y sulfúrico, y ácidos orgánicos tales como los ácidos acético, bencenosulfónico, benzoico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glicólico, isotiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, metanosulfónico, succínico, toluenosulfónico, tartárico y trifluoroacético. La sal cloruro es particularmente preferida para fines médicos. Las sales de bases farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio y potasio, y sales de metales alcalinotérreos tales como sales de magnesio y calcio.

Por supuesto, también se requiere que los aniones útiles en la presente invención sean farmacéuticamente aceptables y también se seleccionan entre la lista anterior.

Los compuestos útiles en la presente invención pueden presentarse con un vehículo aceptable en forma de una composición farmacéutica. Por supuesto, el vehículo debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no debe ser perjudicial para el receptor. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y preferiblemente se formula con el compuesto como una composición de dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, que puede contener de un 0,05% a un 95% en peso del compuesto activo. También pueden estar presentes otras substancias farmacológicamente activas, incluyendo otros compuestos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse por cualquiera de las técnicas bien conocidas de farmacia, que consisten esencialmente en mezclar los componentes.

Opcionalmente, la combinación de la presente invención puede comprender una composición que comprende un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y un compuesto inhibidor de CETP. En tal composición, el compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y el compuesto inhibidor de CETP pueden estar presentes en una sola forma de dosificación, por ejemplo un píldora, una cápsula o un líquido que contenga los dos compuestos.

Estos compuestos pueden administrarse por cualquier medio convencional disponible para uso junto con agentes farmacéuticos, como compuestos terapéuticos individuales o como una combinación de compuestos terapéuticos.

Por supuesto, la cantidad de compuesto que se requiere para conseguir el efecto biológico deseado dependerá de varios factores tales como el compuesto específico elegido, el uso para el que se desea, el modo de administración y el estado clínico del receptor.

En general, una dosis diaria total de un inhibidor de IBAT puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg/día, más preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/día.

Para un inhibidor de CETP, generalmente puede ser apropiada una dosis diaria de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, y preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día.

Las dosis diarias descritas en los párrafos anteriores para los diversos compuestos terapéuticos, pueden administrarse al paciente en una sola dosis, o en múltiples subdosis proporcionadas. Las subdosis pueden administrarse de 2 a 6 veces al día. Las dosis pueden estar en una forma de liberación sostenida eficaz para obtener los resultados deseados.

En el caso de las sales farmacéuticamente aceptables, los pesos indicados anteriormente se refieren al peso del equivalente ácido o del equivalente básico del compuesto terapéutico derivado de la sal.

El suministro oral de las combinaciones de la presente invención puede incluir formulaciones, como son bien conocidas en la técnica, para proporcionar la liberación prolongada o sostenida del fármaco en el tracto gastrointestinal por cualquier número de mecanismos. Éstos incluyen, pero sin limitación, la liberación sensible al pH de la forma de dosificación basándose en el cambio de pH del intestino delgado, la erosión lenta de un comprimido o cápsula, la retención en el estómago basándose en las propiedades físicas de la formulación, la bioadhesión de la forma de dosificación en el revestimiento de la mucosa del tracto intestinal, o la liberación enzimática del fármaco activo desde la forma de dosificación. Para algunos de los compuestos terapéuticos útiles en la presente invención (por ejemplo, inhibidores de IBAT o inhibidores de CETP), el efecto deseado es prolongar el período de tiempo durante el cual se libera la molécula de fármaco activa en el sitio de acción (por ejemplo, el íleon) por medio de la manipulación de la forma de dosificación. De esta manera, dentro del alcance de la presente invención se encuentran formulaciones de liberación controladas con recubrimiento entérico. Los recubrimientos entéricos adecuados incluyen acetato ftalato de celulosa, acetato ftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros aniónicos de ácido metacrílico y éster metílico de ácido metacrílico.

Las combinaciones de la presente invención pueden suministrarse por vía oral en una forma sólida, semisólida o líquida. Cuando están en una forma líquida o semisólida, las combinaciones de la presente invención, por ejemplo, pueden estar en forma de un líquido, jarabe o contenidas en una cápsula de gel (por ejemplo, una cubierta de gel). En una realización, el inhibidor de IBAT puede proporcionarse en forma de un líquido, jarabe o contenido en una cápsula de gel. En otra realización, el inhibidor de CETP puede proporcionarse en forma de un líquido, jarabe o contenido en una cápsula de gel.

La dosis de cualquiera de estos compuestos terapéuticos puede administrarse convenientemente como una infusión de aproximadamente 10 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 100 ng/kg de peso corporal por minuto. Los fluidos de infusión adecuados para este fin pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 10 mg, preferiblemente de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 10 mg por mililitro. Las dosis unitarias pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 g del compuesto de la presente invención. De esta manera, las ampollas para inyección pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica, bucal (por ejemplo, sublingual) y parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa), aunque la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá de la naturaleza y la gravedad del estado a tratar y de la naturaleza del compuesto particular que se esté usando. En la mayoría de los casos, la vía de administración preferida es la vía oral.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral pueden presentarse en unidades discretas, tales como cápsulas, sellos, grageas o comprimidos, conteniendo cada una cantidad predeterminada de al menos un compuesto terapéutico útil en la presente invención; como un polvo o gránulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Como se indica, tales composiciones pueden prepararse por cualquier método adecuado de farmacia que incluya la etapa de asociar el compuesto o compuestos activos y el vehículo (que puede comprender uno o más ingredientes auxiliares). En general, las composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido o sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto. Por ejemplo, un comprimido puede prepararse por comprensión o moldeo de un polvo o gránulos del compuesto, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Los comprimidos de compresión pueden prepararse por compresión, en una máquina adecuada, del compuesto en una forma fluida, tal como un polvo o gránulos opcionalmente mezclados con uno o más agentes aglutinantes, lubricantes, diluyentes inertes y/o tensioactivos. Los comprimidos moldeados pueden obtenerse por moldeo, en una máquina adecuada, del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen grageas que comprenden un compuesto de la presente invención en una base aromatizada, normalmente sacarosa, y goma arábiga o tragacanto, y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral convenientemente comprenden preparaciones acuosas estériles de un compuesto de la presente invención. Estas preparaciones preferiblemente se administran por vía intravenosa, aunque la administración también puede realizarse por medio de inyección subcutánea, intramuscular o intradérmica. Tales preparaciones convenientemente pueden prepararse mezclando el compuesto con agua y haciendo que la solución resultante sea estéril e isotónica con la sangre. Las composiciones inyectables de acuerdo con la invención generalmente contendrán de un 0,1 a un 5% p/p de un compuesto descrito en este
documento.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal preferiblemente se presentan como supositorios de una sola dosis. Éstos pueden prepararse mezclando un compuesto de la presente invención con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y después dando forma a la mezcla resultante.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica en la piel preferiblemente toman la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, pulverización, aerosol o aceite. Los vehículos que pueden usarse incluyen petrolato (por ejemplo, vaselina), lanolina, polietilenglicoles, alcoholes y combinaciones de dos o más de los mismos. El compuesto activo generalmente está presente a una concentración del 0,1 al 50% p/p de la composición, por ejemplo, del 0,5 al 2%.

También es posible la administración transdérmica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período de tiempo prolongado. Tales parches convenientemente contienen un compuesto de la presente invención en una solución acuosa opcionalmente tamponada, disuelta y/o dispersa en un adhesivo, o dispersa en un polímero. Una concentración adecuada del compuesto activo es de aproximadamente un 1 a un 35%, preferiblemente de aproximadamente un 3 a un 15%. Como una posibilidad particular, el compuesto puede suministrarse desde el parche por electrotransporte o iontoforesis, por ejemplo, como se describe en Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

En cualquier caso, la cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con materiales de vehículo para producir una sola forma de dosificación a administrar variará dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administración.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral que incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gel y gránulos, indicadas anteriormente, comprenden uno o más compuestos útiles en la presente invención mezclados con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, substancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio o agentes solubilizantes tales como ciclodextrinas. En el caso de las cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas de gel y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y píldoras adicionalmente pueden prepararse con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, y agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumes.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes de dispersión o solidificación y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Además, convenientemente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen todos los anteriores y similares.

En la terapia de combinación, puede tener lugar la administración de dos o más de los agentes terapéuticos útiles en la presente invención secuencialmente en formulaciones separadas, o puede realizarse por medio de la administración simultánea en una sola formulación o en formulaciones separadas.

La administración puede realizarse por vía oral, o por inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas. La formulación puede estar en forma de un bolo, o en forma de soluciones o suspensiones de inyecciones estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles que tengan uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, o un aglutinante tal como gelatina o hidroxipropilmetil celulosa junto con uno o más de los siguientes: un agente lubricante, conservante, tensioactivo o dispersante.

Para la administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, un comprimido, cápsula, suspensión o líquido. Las cápsulas, comprimidos, etc., pueden prepararse por métodos convencionales bien conocidos en la técnica. La composición farmacéutica preferiblemente se obtiene en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del ingrediente o ingredientes activos. Son ejemplos de unidades de dosificación comprimidos o cápsulas. Ventajosamente, éstos pueden contener uno o más compuestos terapéuticos en la cantidad descrita anteriormente. Por ejemplo, en el caso de un inhibidor de IBAT, el intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente 0,01 mg/día a aproximadamente 500 mg/día o cualquier otra dosis, dependiendo del inhibidor específico, como se conoce en la técnica. En el caso de un complejante de ácidos biliares, el intervalo de dosificación puede ser de aproximadamente 1.000 mg/día a aproximadamente 30.000 mg/día o cualquier otra dosis, dependiendo del complejante de ácidos biliares específico, como se conoce en la técnica.

Los ingredientes activos también pueden administrarse por inyección como una composición donde, por ejemplo, puede usarse solución salina, dextrosa o agua como un vehículo adecuado. Una dosis diaria adecuada de cada compuesto terapéutico activo es una dosis que consigue el mismo nivel en el suero sanguíneo que el producido por la administración oral como se ha descrito anteriormente.

Los compuestos terapéuticos pueden administrarse adicionalmente por cualquier combinación de vías oral/oral, oral/parenteral o parenteral/parenteral.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma oral o por administración intravenosa. Se prefiere la administración oral de la terapia de combinación. La dosificación para administración oral puede realizarse con un régimen que requiera una sola dosis diaria, o una sola dosis una día sí y otro no, o dosis múltiples distribuidas a lo largo del día. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia de combinación pueden administrarse simultáneamente, en una forma de dosificación combinada o en formas de dosificación separadas destinadas a la administración oral substancialmente simultánea. Los compuestos terapéuticos que constituyen la terapia de combinación también pueden administrarse secuencialmente, administrándose cualquiera de los compuestos terapéuticos por un régimen que requiera la ingestión en dos etapas. De esta manera, un régimen puede requerir la administración secuencial de los compuestos terapéuticos con una ingestión espaciada de los ingredientes activos por separado. El período de tiempo entre las etapas de ingestión múltiple puede variar de algunos minutos a varias horas, dependiendo de las propiedades de cada compuesto terapéutico, tales como la potencia, la solubilidad, la biodisponibilidad, la vida media en plasma y el perfil cinético del compuesto terapéutico, así como dependiendo del efecto de la ingestión de alimentos y la edad y estado del paciente. La variación circadiana de la concentración de moléculas diana también puede determinar el intervalo de dosificación óptimo. Los compuestos terapéuticos de la terapia combinada, tanto si se administran simultáneamente, como si se administran de una forma substancialmente simultánea o secuencialmente, pueden implicar un régimen que requiera la administración de un compuesto terapéutico por vía oral y otro compuesto terapéutico por vía intravenosa. Si los compuestos terapéuticos de la terapia combinada se administran por vía oral o intravenosa, por separado o conjuntamente, cada uno de tales compuestos terapéuticos estará contenido en una formulación farmacéutica adecuada de excipientes, diluyentes u otros componentes de la formulación farmacéuticamente aceptables. Anteriormente se han proporcionado ejemplos de formulaciones farmacéuticamente aceptables adecuadas que contienen los compuestos terapéuticos para administración oral.

Régimen de tratamiento

El régimen de dosificación para prevenir, aliviar o mejorar un estado de enfermedad que tiene hiperlipidemia como un elemento de la enfermedad, por ejemplo, aterosclerosis, o para proteger contra o tratar adicionalmente los altos niveles de colesterol en plasma o sangre con los compuestos y/o composiciones de la presente invención, se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores. Éstos incluyen el tipo, edad, peso, sexo, dieta y estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como los perfiles de actividad, eficacia, farmacocinética y toxicología del compuesto particular empleado, si se utiliza un sistema de liberación de fármacos, y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos. De esta manera, el régimen de dosificación empleado realmente puede variar ampliamente y, por lo tanto, desviarse del régimen de dosificación preferido indicado anteriormente.

El tratamiento inicial de un paciente que sufre un estado hiperlipidémico puede comenzar con las dosificaciones indicadas anteriormente. El tratamiento generalmente debe continuarse cuando sea necesario durante un período de varias semanas a varios meses o años, hasta que se haya controlado o eliminado el estado de enfermedad hiperlipidémico. Los pacientes sometidos a tratamiento con los compuestos o composiciones descritas en este documento pueden controlarse rutinariamente, por ejemplo, midiendo los niveles de colesterol LDL y total en suero por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, para determinar la eficacia de la terapia de combinación. El análisis continuo de tales datos permite la modificación del régimen de tratamiento durante la terapia, de forma que se administren cantidades eficaces óptimas de cada tipo de compuesto terapéutico en un cualquier punto de tiempo, y de forma que también pueda determinarse la duración del tratamiento. De esta forma, el régimen de tratamiento/programa de dosificación puede modificarse racionalmente durante el transcurso de la terapia de forma que se administre la cantidad mínima de los compuestos terapéuticos que conjuntamente presentan una eficacia satisfactoria, y de forma que la administración se continúe sólo durante el tiempo necesario para tratar satisfactoriamente el estado hiperlipidémico.

Una ventaja potencial de la terapia de combinación descrita en este documento puede ser la reducción de la cantidad de dosificación de cualquier compuesto terapéutico individual, o de todos los compuestos terapéuticos, eficaz en el tratamiento de estados hiperlipidémicos tales como aterosclerosis e hipercolesterolemia. La reducción de la dosificación proporcionará ventajas incluyendo la reducción de efectos secundarios de los compuestos terapéuticos individuales en comparación con la monoterapia.

Una de las diversas realizaciones de la presente invención comprende una terapia de combinación que comprende el uso de una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de otro agente terapéutico cardiovascular útil en la profilaxis o tratamiento de la hiperlipidemia, aterosclerosis o hipercolesterolemia, donde dichas primera y segunda cantidades conjuntamente comprenden una cantidad eficaz contra un estado hiperlipidémico, una cantidad eficaz contra un estado aterosclerótico o una cantidad eficaz contra un estado hipercolesterolémico, de dichos compuestos. Por ejemplo, una de las muchas realizaciones de la presente invención es una terapia de combinación que comprende dosificaciones terapéuticas de un inhibidor de IBAT y un inhibidor de CETP. Una realización preferida de la presente invención es una terapia de combinación que comprende dosificaciones terapéuticas de un inhibidor de IBAT de benzotiepina y un inhibidor de CETP.

Las realizaciones de la presente invención pueden comprender una terapia de combinación que usa dos o más de los compuestos terapéuticos descritos o incorporados en este documento. La terapia de combinación puede comprender dos o más compuestos terapéuticos de diferentes clases de química, por ejemplo, un inhibidor de IBAT puede combinarse terapéuticamente con un inhibidor de CETP. Las combinaciones terapéuticas pueden comprender más de dos compuestos terapéuticos. Por ejemplo, la terapia puede comprender el uso de un inhibidor de IBAT, un inhibidor de CETP y un inhibidor de HMG CoA reductasa. Como alternativa, dos o más compuestos terapéuticos de la misma clase de química pueden constituir la terapia, por ejemplo, una terapia de combinación que comprende dos o más inhibidores de IBAT o dos o más inhibidores de CETP.

Otra realización de la presente invención comprende el uso de cualquiera de las terapias de combinación cardiovasculares descritas en este documento para la profilaxis o tratamiento de la hipercolesterolemia, aterosclerosis o hiperlipidemia.

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar diversos aspectos de la presente invención.

c. Ejemplos

La tabla 3 ilustra ejemplos de algunas de las muchas combinaciones de la presente invención y algunas otras combinaciones con fines ilustrativos, donde la combinación comprende una primera cantidad de un inhibidor de IBAT y una segunda cantidad de un inhibidor de CETP, donde dichas primera y segunda cantidades conjuntamente comprenden una cantidad eficaz contra un estado hiperlipidémico, una cantidad eficaz contra un estado aterosclerótico, o una cantidad eficaz contra un estado hipercolesterolémico de dichos compuestos.

TABLA 3

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
1	B-1	C-1
2	B-1	C-2
3	B-1	C-3
4	B-1	C-4
5	B-1	C-5
6	B-1	C-6
7	B-1	C-7
8	B-1	C-8
9	B-1	C-9
10	B-1	C-10
11	B-1	C-11
12	B-1	C-12
13	B-1	C-13
14	B-1	C-14
15	B-1	C-15
16	B-1	C-16
17	B-1	C-17
18	B-1	C-18
19	B-1	C-19
20	B-1	C-20
21	B-2	C-1
22	B-2	C-2
23	B-2	C-3
24	B-2	C-4

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
25	B-2	C-5
26	B-2	C-6
27	B-2	C-7
28	B-2	C-8
29	B-2	C-9
30	B-2	C-10
31	B-2	C-11
32	B-2	C-12
33	B-2	C-13
34	B-2	C-14
35	B-2	C-15
36	B-2	C-16
37	B-2	C-17
38	B-2	C-18
39	B-2	C-19
40	B-2	C-20
41	B-3	C-1
42	B-3	C-2
43	B-3	C-3
44	B-3	C-4
45	B-3	C-5
46	B-3	C-6
47	B-3	C-7
48	B-3	C-8
49	B-3	C-9
50	B-3	C-10
51	B-3	C-11
52	B-3	C-12
53	B-3	C-13
54	B-3	C-14
55	B-3	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
56	B-3	C-16
57	B-3	C-17
58	B-3	C-18
59	B-3	C-19
60	B-3	C-20
61	B-4	C-1
62	B-4	C-2
63	B-4	C-3
64	B-4	C-4
65	B-4	C-5
66	B-4	C-6
67	B-4	C-7
68	B-4	C-8
69	B-4	C-9
70	B-4	C-10
71	B-4	C-11
72	B-4	C-12
73	B-4	C-13
74	B-4	C-14
75	B-4	C-15
76	B-4	C-16
77	B-4	C-17
78	B-4	C-18
79	B-4	C-19
80	B-4	C-20
81	B-5	C-1
82	B-5	C-2
83	B-5	C-3
84	B-5	C-4
85	B-5	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
86	B-5	C-6
87	B-5	C-7
88	B-5	C-8
89	B-5	C-9
90	B-5	C-10
91	B-5	C-11
92	B-5	C-12
93	B-5	C-13
94	B-5	C-14
95	B-5	C-15
96	B-5	C-16
97	B-5	C-17
98	B-5	C-18
99	B-5	C-19
100	B-5	C-20
101	B-6	C-1
102	B-6	C-2
103	B-6	C-3
104	B-6	C-4
105	B-6	C-5
106	B-6	C-6
107	B-6	C-7
108	B-6	C-8
109	B-6	C-9
110	B-6	C-10
111	B-6	C-11
112	B-6	C-12
113	B-6	C-13
114	B-6	C-14
115	B-6	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
116	B-6	C-16
117	B-6	C-17
118	B-6	C-18
119	B-6	C-19
120	B-6	C-20
121	B-7	C-1
122	B-7	C-2
123	B-7	C-3
124	B-7	C-4
125	B-7	C-5
126	B-7	C-6
127	B-7	C-7
128	B-7	C-8
129	B-7	C-9
130	B-7	C-10
131	B-7	C-11
132	B-7	C-12
133	B-7	C-13
134	B-7	C-14
135	B-7	C-15
136	B-7	C-16
137	B-7	C-17
138	B-7	C-18
139	B-7	C-19
140	B-7	C-20
141	B-8	C-1
142	B-8	C-2
143	B-8	C-3
144	B-8	C-4
145	B-8	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
146	B-8	C-6
147	B-8	C-7
148	B-8	C-8
149	B-8	C-9
150	B-8	C-10
151	B-8	C-11
152	B-8	C-12
153	B-8	C-13
154	B-8	C-14
155	B-8	C-15
156	B-8	C-16
157	B-8	C-17
158	B-8	C-18
159	B-8	C-19
160	B-8	C-20
161	B-9	C-1
162	B-9	C-2
163	B-9	C-3
164	B-9	C-4
165	B-9	C-5
166	B-9	C-6
167	B-9	C-7
168	B-9	C-8
169	B-9	C-9
170	B-9	C-10
171	B-9	C-11
172	B-9	C-12
173	B-9	C-13
174	B-9	C-14
175	B-9	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
176	B-9	C-16
177	B-9	C-17
178	B-9	C-18
179	B-9	C-19
180	B-9	C-20
181	B-10	C-1
182	B-10	C-2
183	B-10	C-3
184	B-10	C-4
185	B-10	C-5
186	B-10	C-6
187	B-10	C-7
188	B-10	C-8
189	B-10	C-9
190	B-10	C-10
191	B-10	C-11
192	B-10	C-12
193	B-10	C-13
194	B-10	C-14
195	B-10	C-15
196	B-10	C-16
197	B-10	C-17
198	B-10	C-18
199	B-10	C-19
200	B-10	C-20
201	B-11	C-1
202	B-11	C-2
203	B-11	C-3
204	B-11	C-4
205	B-11	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
206	B-11	C-6
207	B-11	C-7
208	B-11	C-8
209	B-11	C-9
210	B-11	C-10
211	B-11	C-11
212	B-11	C-12
213	B-11	C-13
214	B-11	C-I4
215	B-11	C-15
216	B-11	C-16
217	B-11	C-17
218	B-11	C-18
219	B-11	C-19
220	B-11	C-20
221	B-12	C-1
222	B-12	C-2
223	B-12	C-3
224	B-12	C-4
225	B-12	C-5
226	B-12	C-6
227	B-12	C-7
228	B-12	C-8
229	B-12	C-9
230	B-12	C-10
231	B-12	C-11
232	B-12	C-12
233	B-12	C-13
234	B-12	C-14
235	B-12	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
236	B-12	C-16
237	B-12	C-17
238	B-12	C-18
239	B-12	C-19
240	B-12	C-20
241	B-13	C-1
242	B-13	C-2
243	B-13	C-3
244	B-13	C-4
245	B-13	C-5
246	B-13	C-6
247	B-13	C-7
248	B-13	C-8
249	B-13	C-9
250	B-13	C-10
251	B-13	C-11
252	B-13	C-12
253	B-13	C-13
254	B-13	C-14
255	B-13	C-15
256	B-13	C-16
257	B-13	C-17
258	B-13	C-18
259	B-13	C-19
260	B-13	C-20
261	B-14	C-1
262	B-14	C-2
263	B-14	C-3
264	B-14	C-4
265	B-14	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
266	B-14	C-6
267	B-14	C-7
268	B-14	C-8
269	B-14	C-9
270	B-14	C-10
271	B-14	C-11
272	B-14	C-12
273	B-14	C-13
274	B-14	C-14
275	B-14	C-15
276	B-14	C-16
277	B-14	C-17
278	B-14	C-18
279	B-14	C-19
280	B-14	C-20
281	B-15	C-1
282	B-15	C-2
283	B-15	C-3
284	B-15	C-4
285	B-15	C-5
286	B-15	C-6
287	B-15	C-7
288	B-15	C-8
289	B-15	C-9
290	B-15	C-10
291	B-15	C-11
292	B-15	C-12
293	B-15	C-13
294	B-15	C-14
295	B-15	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
296	B-15	C-16
297	B-15	C-17
298	B-15	C-18
299	B-15	C-19
300	B-15	C-20
301	B-16	C-1
302	B-16	C-2
303	B-16	C-3
304	B-16	C-4
305	B-16	C-5
306	B-16	C-6
307	B-16	C-7
308	B-16	C-8
309	B-16	C-9
310	B-16	C-10
311	B-16	C-11
312	B-16	C-12
313	B-16	C-13
314	B-16	C-14
315	B-16	C-15
316	B-16	C-16
317	B-16	C-17
318	B-16	C-18
319	B-16	C-19
320	B-16	C-20
321	B-17	C-1
322	B-17	C-2
323	B-17	C-3
324	B-17	C-4
325	B-17	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
326	B-17	C-6
327	B-17	C-7
328	B-17	C-8
329	B-17	C-9
330	B-17	C-10
331	B-17	C-11
332	B-17	C-12
333	B-17	C-13
334	B-17	C-14
335	B-17	C-15
336	B-17	C-16
337	B-17	C-17
338	B-17	C-18
339	B-17	C-19
340	B-17	C-20
341	B-18	C-1
342	B-18	C-2
343	B-18	C-3
344	B-18	C-4
345	B-18	C-5
346	B-18	C-6
347	B-18	C-7
348	B-18	C-8
349	B-18	C-9
350	B-18	C-10
351	B-18	C-11
352	B-18	C-12
353	B-18	C-13
354	B-18	C-14
355	B-18	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
356	B-18	C-16
357	B-18	C-17
358	B-18	C-18
359	B-18	C-19
360	B-18	C-20
361	B-19	C-1
362	B-19	C-2
363	B-19	C-3
364	B-19	C-4
365	B-19	C-5
366	B-19	C-6
367	B-19	C-7
368	B-19	C-8
369	B-19	C-9
370	B-19	C-10
371	B-19	C-11
372	B-19	C-12
373	B-19	C-13
374	B-19	C-14
375	B-19	C-15
376	B-19	C-16
377	B-19	C-17
378	B-19	C-18
379	B-19	C-19
380	B-19	C-20
381	B-20	C-1
382	B-20	C-2
383	B-20	C-3
384	B-20	C-4
385	B-20	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
386	B-20	C-6
387	B-20	C-7
388	B-20	C-8
389	B-20	C-9
390	B-20	C-10
391	B-20	C-11
392	B-20	C-12
393	B-20	C-13
394	B-20	C-14
395	B-20	C-15
396	B-20	C-16
397	B-20	C-17
398	B-20	C-18
399	B-20	C-19
400	B-20	C-20
401	B-21	C-1
402	B-21	C-2
403	B-21	C-3
404	B-21	C-4
405	B-21	C-5
406	B-21	C-6
407	B-21	C-7
408	B-21	C-8
409	B-21	C-9
410	B-21	C-10
411	B-21	C-11
412	B-21	C-12
413	B-21	C-13
414	B-21	C-14
415	B-21	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
416	B-21	C-16
417	B-21	C-17
418	B-21	C-18
419	B-21	C-19
420	B-21	C-20
421	B-22	C-1
422	B-22	C-2
423	B-22	C-3
424	B-22	C-4
425	B-22	C-5
426	B-22	C-6
427	B-22	C-7
428	B-22	C-8
429	B-22	C-9
430	B-22	C-10
431	B-22	C-11
432	B-22	C-12
433	B-22	C-13
434	B-22	C-14
435	B-22	C-15
436	B-22	C-16
437	B-22	C-17
438	B-22	C-18
439	B-22	C-19
440	B-22	C-20
441	B-23	C-1
442	B-23	C-2
443	B-23	C-3
444	B-23	C-4
445	B-23	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
446	B-23	C-6
447	B-23	C-7
448	B-23	C-8
449	B-23	C-9
450	B-23	C-10
451	B-23	C-11
452	B-23	C-12
453	B-23	C-13
454	B-23	C-14
455	B-23	C-15
456	B-23	C-16
457	B-23	C-17
458	B-23	C-18
459	B-23	C-19
460	B-23	C-20
461	B-24	C-1
462	B-24	C-2
463	B-24	C-3
464	B-24	C-4
465	B-24	C-5
466	B-24	C-6
467	B-24	C-7
468	B-24	C-8
469	B-24	C-9
470	B-24	C-10
471	B-24	C-11
472	B-24	C-12
473	B-24	C-13
474	B-24	C-14
475	B-24	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
476	B-24	C-16
477	B-24	C-17
478	B-24	C-18
479	B-24	C-19
480	B-24	C-20
481	B-25	C-1
482	B-25	C-2
483	B-25	C-3
484	B-25	C-4
485	B-25	C-5
486	B-25	C-6
487	B-25	C-7
488	B-25	C-8
489	B-25	C-9
490	B-25	C-10
491	B-25	C-11
492	B-25	C-12
493	B-25	C-13
494	B-25	C-14
495	B-25	C-15
496	B-25	C-16
497	B-25	C-17
498	B-25	C-18
499	B-25	C-19
500	B-25	C-20
501	B-26	C-1
502	B-26	C-2
503	B-26	C-3
504	B-26	C-4
505	B-26	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
506	B-26	C-6
507	B-26	C-7
508	B-26	C-8
509	B-26	C-9
510	B-26	C-10
511	B-26	C-11
512	B-26	C-12
513	B-26	C-13
514	B-26	C-14
515	B-26	C-15
516	B-26	C-16
517	B-26	C-17
518	B-26	C-18
519	B-26	C-19
520	B-26	C-20
521	B-27	C-1
522	B-27	C-2
523	B-27	C-3
524	B-27	C-4
525	B-27	C-5
526	B-27	C-6
527	B-27	C-7
528	B-27	C-8
529	B-27	C-9
530	B-27	C-10
531	B-27	C-11
532	B-27	C-12
533	B-27	C-13
534	B-27	C-14
535	B-27	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
536	B-27	C-16
537	B-27	C-17
538	B-27	C-18
539	B-27	C-19
540	B-27	C-20
541	B-28	C-1
542	B-28	C-2
543	B-28	C-3
544	B-28	C-4
545	B-28	C-5
546	B-28	C-6
547	B-28	C-7
548	B-28	C-8
549	B-28	C-9
550	B-28	C-10
551	B-28	C-11
552	B-28	C-12
553	B-28	C-13
554	B-28	C-14
555	B-28	C-15
556	B-28	C-16
557	B-28	C-17
558	B-28	C-18
559	B-28	C-19
560	B-28	C-20
561	B-29	C-1
562	B-29	C-2
563	B-29	C-3
564	B-29	C-4
565	B-29	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
566	B-29	C-6
567	B-29	C-7
568	B-29	C-8
569	B-29	C-9
570	B-29	C-10
571	B-29	C-11
572	B-29	C-12
573	B-29	C-13
574	B-29	C-14
575	B-29	C-15
576	B-29	C-16
577	B-29	C-17
578	B-29	C-18
579	B-29	C-19
580	B-29	C-20
581	B-30	C-1
582	B-30	C-2
583	B-30	C-3
584	B-30	C-4
585	B-30	C-5
586	B-30	C-6
587	B-30	C-7
588	B-30	C-8
589	B-30	C-9
590	B-30	C-10
591	B-30	C-11
592	B-30	C-12
593	B-30	C-13
594	B-30	C-14
595	B-30	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
596	B-30	C-16
597	B-30	C-17
598	B-30	C-18
599	B-30	C-19
600	B-30	C-20
601	B-31	C-1
602	B-31	C-2
603	B-31	C-3
604	B-31	C-4
605	B-31	C-5
606	B-31	C-6
607	B-31	C-7
608	B-31	C-8
609	B-31	C-9
610	B-31	C-10
611	B-31	C-11
612	B-31	C-12
613	B-31	C-13
614	B-31	C-14
615	B-31	C-15
616	B-31	C-16
617	B-31	C-17
618	B-31	C-18
619	B-31	C-19
620	B-31	C-20
621	B-32	C-1
622	B-32	C-2
623	B-32	C-3
624	B-32	C-4
625	B-32	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
626	B-32	C-6
627	B-32	C-7
628	B-32	C-8
629	B-32	C-9
630	B-32	C-10
631	B-32	C-11
632	B-32	C-12
633	B-32	C-13
634	B-32	C-14
635	B-32	C-15
636	B-32	C-16
637	B-32	C-17
638	B-32	C-18
639	B-32	C-19
640	B-32	C-20
641	B-33	C-1
642	B-33	C-2
643	B-33	C-3
644	B-33	C-4
645	B-33	C-5
646	B-33	C-6
647	B-33	C-7
648	B-33	C-8
649	B-33	C-9
650	B-33	C-10
651	B-33	C-11
652	B-33	C-12
653	B-33	C-13
654	B-33	C-14
655	B-33	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
656	B-33	C-16
657	B-33	C-17
658	B-33	C-18
659	B-33	C-19
660	B-33	C-20
661	B-34	C-1
662	B-34	C-2
663	B-34	C-3
664	B-34	C-4
665	B-34	C-5
666	B-34	C-6
667	B-34	C-7
668	B-34	C-8
669	B-34	C-9
670	B-34	C-10
671	B-34	C-11
672	B-34	C-12
673	B-34	C-13
674	B-34	C-14
675	B-34	C-15
676	B-34	C-16
677	B-34	C-17
678	B-34	C-18
679	B-34	C-19
680	B-34	C-20
681	B-35	C-1
682	B-35	C-2
683	B-35	C-3
684	B-35	C-4
685	B-35	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
686	B-35	C-6
687	B-35	C-7
688	B-35	C-8
689	B-35	C-9
690	B-35	C-10
691	B-35	C-11
692	B-35	C-12
693	B-35	C-13
694	B-35	C-14
695	B-35	C-15
696	B-35	C-16
697	B-35	C-17
698	B-35	C-18
699	B-35	C-19
700	B-35	C-20
701	B-36	C-1
702	B-36	C-2
703	B-36	C-3
704	B-36	C-4
705	B-36	C-5
706	B-36	C-6
707	B-36	C-7
708	B-36	C-8
709	B-36	C-9
710	B-36	C-10
711	B-36	C-11
712	B-36	C-12
713	B-36	C-13
714	B-36	C-14
715	B-36	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
716	B-36	C-16
717	B-36	C-17
718	B-36	C-18
719	B-36	C-19
720	B-36	C-20
721	B-37	C-1
722	B-37	C-2
723	B-37	C-3
724	B-37	C-4
725	B-37	C-5
726	B-37	C-6
727	B-37	C-7
728	B-37	C-8
729	B-37	C-9
730	B-37	C-10
731	B-37	C-11
732	B-37	C-12
733	B-37	C-13
734	B-37	C-14
735	B-37	C-15
736	B-37	C-16
737	B-37	C-17
738	B-37	C-18
739	B-37	C-19
740	B-37	C-20
741	B-38	C-1
742	B-38	C-2
743	B-38	C-3
744	B-38	C-4
745	B-38	C-5

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
746	B-38	C-6
747	B-38	C-7
748	B-38	C-8
749	B-38	C-9
750	B-38	C-10
751	B-38	C-11
752	B-38	C-12
753	B-38	C-13
754	B-38	C-14
755	B-38	C-15
756	B-38	C-16
757	B-38	C-17
758	B-38	C-18
759	B-38	C-19
760	B-38	C-20
761	B-40	C-1
762	B-40	C-2
763	B-40	C-3
764	B-40	C-4
765	B-40	C-5
766	B-40	C-6
767	B-40	C-7
768	B-40	C-8
769	B-40	C-9
770	B-40	C-10
771	B-40	C-11
772	B-40	C-12
773	B-40	C-13
774	B-40	C-14
775	B-40	C-15

TABLA 3 (continuación)

Ejemplo Número	Componente 1	Componente 2
776	B-40	C-16
777	B-40	C-17
778	B-40	C-18
779	B-40	C-19
780	B-40	C-20

Ensayos biológicos

La utilidad de las combinaciones de la presente invención puede demostrarse por los siguientes ensayos. Estos ensayos se realizan in vitro y en modelos animales usando esencialmente procedimientos reconocidos para demostrar la utilidad de la presente invención.

Ensayo in vitro de compuestos que inhiben la absorción mediada por IBAT de [^{14}C]-taurocolato (TC) en células H14

Se siembran células de riñón de cría de hámster (BHK) transfectadas con el ADNc de IBAT humano (células H14) a 60.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos Top-Count de 96 pocillos para los ensayos realizados en las 24 horas posteriores a la siembra, a 30.000 células/pocillo para los ensayos realizados en las 48 horas posteriores a la siembra y a 10.000 células/pocillo para los ensayos realizados en las 72 horas posteriores a la siembra.

En el día del ensayo, la monocapa de células se lava suavemente una vez con 100 \mul de tampón de ensayo (medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa + 0,2% (p/v) de albúmina de suero bovino sin ácidos grasos - (FAF)BSA). A cada pocillo se le añaden 50 \mul de un concentrado de dos veces de compuesto de ensayo en tampón de ensayo junto con 50 \mul de [^{14}C]-taurocolato 6 \muM en tampón de ensayo (concentración final de [^{14}C]- taurocolato 3 \muM). Las placas de cultivo de células se incuban 2 horas a 37ºC antes de lavar suavemente cada pocillo dos veces con 100 \mul de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) a 4ºC que contiene un 0,2% (p/v) de (FAF)BSA. Los pocillos después se lavan suavemente una vez con 100 \mul de PBS a 4ºC sin (FAF)BSA. A cada pocillo se le añaden 200 \mul de fluido de recuento de centelleo de líquidos, y las placas se sellan térmicamente y se agitan durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de medir la cantidad de radiactividad en cada pocillo en un instrumento Top-Count Packard.

Ensayo In Vitro de compuestos que inhiben la absorción de [^{14}C]-alanina

El ensayo de absorción de alanina se realiza de una forma idéntica al ensayo de taurocolato, con la excepción de que el taurocolato marcado se substituye por alanina marcada.

Medición de la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) de rata

Se recogieron las heces fecales totales de ratas encerradas individualmente durante 24 ó 48 horas, se secaron bajo una corriente de nitrógeno, se pulverizaron, se mezclaron y se pesaron. Se pesaron aproximadamente 0,1 g y se sometieron a extracción en un disolvente orgánico (butanol/agua). Después de la separación y el secado, el residuo se disolvió en metanol y la cantidad de ácido biliar presente se midió enzimáticamente usando la reacción de 3\alpha-hidroxiesteroide esteroide deshidrogenasa con ácidos biliares para reducir NAD. (véase Mashige, F. et al. Clin. Chem., 27, 1352 (1981).

Ensayo de sonda de rata

A ratas Wister macho (275-300 g) se les administran inhibidores de IBAT usando un procedimiento de sonda oral. Se administra fármaco o vehículo (TWEEN 80 al 0,2% en agua) una vez al día (9:00-10:0 a.m.) durante 4 días a dosificaciones variables en un volumen final de 2 ml por kilogramo de peso corporal. (TWEEN 80 es un tensioactivo de monooleato de polióxido de etileno sorbitán 20 molar fabricado por ICI Specialty Chemicals, Wilmington, Delaware, U.S.A.) Se recogen muestras fecales totales durante las 48 horas finales del período de tratamiento y se analizan con respecto al contenido de ácidos biliares usando un ensayo enzimático como se describe más adelante. La eficacia del compuesto se determinará por comparación del aumento de la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) en las ratas tratadas con la concentración media de FBA de las ratas del grupo de vehículo.

\newpage

Absorción de [^{3}H]taurocolato en vesículas de membrana de limbo penicilado (BBMV) de conejo

Se preparan membranas de limbo penicilado de íleon de conejo a partir de mucosa de íleon congelada, por el método de precipitación por calcio descrito por Malathi et al. (Biochimica Biophysica Acta, 554, 259 (1979). El método para medir el taurocolato es esencialmente el descrito por Kramer et al. (Biochimica Biophysica Acta, 1111, 93 (1992), con la excepción de que el volumen de ensayo es de 200 \mul en lugar de 100 \mul. En resumen, se incuba a temperatura ambiente una solución de 190 \mul que contiene [^{3}H]-taurocolato 2 \muM (0,75 \muCi), Tris 20 mM, NaCl 100 mM, manitol 100 mM, pH 7,4, durante 5 segundos con 10 \mul de vesículas de membrana de limbo penicilado (60-120 \mug de proteína). La incubación se inicia por la adición de las BBMV mientras se agita vorticialmente y la reacción se detiene por la adición de 5 ml de tampón enfriado con hielo (Hepes-tris 20 mM, KCl 150 mM) seguido inmediatamente por filtración a través de un filtro de nylon (con poros de 0,2 \mum) y un lavado adicional de 5 ml con tampón de detención.

Medición de la concentración de colesterol hepático (COL HEPÁTICO)

Se pesa tejido hepático y se homogeneiza en cloroformo:metanol (2:1). Después de la homogeneización y la centrifugación, el sobrenadante se separa y se seca en una atmósfera de nitrógeno. El residuo se disuelve en isopropanol y el contenido de colesterol se mide enzimáticamente, usando una combinación de colesterol oxidasa y peroxidasa, como se describe por Allain, C. A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974).

Medición de la actividad HMG CoA-reductasa (HMG COA) hepática

Se separan microsomas hepáticos por homogeneización de muestras de hígado en un tampón fosfato/sacarosa, seguido de separación centrífuga. El material sedimentado final se resuspende en tampón y se ensaya una alícuota con respecto a la actividad HMG CoA reductasa por incubación durante 60 minutos a 37ºC en presencia ^{14}C-HMG-CoA (Dupont-NEN). La reacción se detiene añadiendo HCl 6 N seguido de centrifugación. Se separa una alícuota del sobrenadante, por cromatografía de capa fina, y la mancha correspondiente al producto enzimático se raspa de la placa, se extrae y la radiactividad se determina por recuento de centelleo (Referencia: Akerlund, J. y Bjorkhem, I. (1990) J. Lipid Res. 31, 2159).

Medición de la actividad colesterol 7-\alpha-hidroxilasa (7a-ohasa) hepática

Se preparan microsomas hepáticos por homogeneización de muestras de hígado en tampón fosfato/sacarosa, seguido de separación centrífuga. El material sedimentado final se resuspende en tampón y se ensaya una alícuota con respecto a la actividad colesterol 7-\alpha-hidroxilasa por incubación durante 5 minutos a 37ºC en presencia de NADPH. Después de la extracción en éter de petróleo, el disolvente orgánico se evapora y el residuo se disuelve en acetonitrilo/metanol. El producto enzimático se separa inyectando una alícuota del extracto en una columna de HPLC de fase inversa C_{18} y cuantificando el material eluido usando detección UV a 240 nM. (Referencia: Horton, J. D., et al. (1994) J. Clin. Invest. 93, 2084).

Determinación del colesterol en suero (COL SER, COL-HDL, TGI y VLDL + LDL)

El colesterol total en suero (COL SER) se mide enzimáticamente usando un kit comercial de Wako Fine Chemicals (Richmond, VA); Cholesterol C11, Nº de catálogo 276-64909. El colesterol-HDL (COL-HDL) se ensaya usando este mismo kit después de la precipitación de VLDL y LDL con el reactivo de colesterol HDL de Sigma Chemical Co. con el Nº de catálogo 352-3 (método de sulfato de dextrano). Los triglicéridos totales en suero (blanco) (TGI) se ensayan enzimáticamente con GPO-Trinder de Sigma Chemical Co. con el Nº de catálogo 337-B. Las concentraciones de colesterol VLDL y LDL (VLDL + LDL) se calculan como la diferencia entre el colesterol total y HDL.

Medición de la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) de hámster

Se recogen las heces fecales totales de hámsteres encerrados individualmente durante 24 ó 48 horas, se secan bajo una corriente de nitrógeno, se pulverizan y se pesan. Se pesan aproximadamente 0,1 gramos y se extraen en un disolvente orgánico (butanol/agua). Después de la separación y el secado, el residuo se disuelve en metanol y la cantidad de ácido biliar presente se mide enzimáticamente usando la reacción de 3\alpha-hidroxiesteroide esteroide deshidrogenasa con ácidos biliares para reducir NAD (Mashige, F. et al. Clin. Chem., 27, 1352 (1981).

Modelo de perro para evaluar los fármacos reductores de lípidos

A perros beagle macho, obtenidos de un criador, tal como las granjas Marshall, y que pesan 6-12 kilos, se les administran alimentos una vez al día durante 2 horas y agua ad libitum. Los perros se asignan aleatoriamente a grupos de dosificación que constan de 6 a 12 perros cada uno, tales como: vehículo, i.g; 1 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, i.g.; 4 mg/kg, i.g.; 2 mg/kg, p.o. (polvo en cápsula). La dosificación intragástrica del material terapéutico disuelto en solución acuosa (por ejemplo, solución de Tween 80 al 0,2% [monooleato de polioxietileno, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO]) se realiza usando un tubo de sonda. Antes de iniciar la dosificación, se extraen muestras de sangre de la vena cefálica por la mañana antes de suministrar la comida para evaluar los niveles en suero de colesterol (total y HDL) y triglicéridos. Durante varios días consecutivos, a los animales se les administra la dosificación por la mañana, antes de suministrar la comida. A los animales se les dejan 2 horas para comer antes de retirar la comida restante. Se recogen las heces durante un período de 2 días al final del estudio y se analizan con respecto al contenido de ácidos biliares o lípidos. También se toman muestras de sangre, al final del período de tratamiento, para comparación con los niveles de lípidos en suero previos al estudio. El significado estadístico se determina usando el ensayo T de Student convencional con p<0,05.

Medición de lípidos en suero de perro

Se recoge sangre de la vena cefálica de perros que han permanecido en ayunas en tubos separadores de suero (Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). La sangre se centrifuga a 2000 rpm durante 20 minutos y se decanta el suero.

El colesterol total se mide en un formato de 96 pocillos usando un kit de diagnóstico enzimático Waco (Cholesterol CII) (Wako Chemicals, Richmond, VA), utilizando la reacción de colesterol oxidasa para producir peróxido de hidrógeno, que se mide colorimétricamente. Se prepara una curva patrón de 0,5 a 10 \mug de colesterol en las dos primeras columnas de la placa. Se añaden muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración de lípidos esperada) o muestras de control de suero conocidas a pocillos separados por duplicado. Se añade agua para llevar el volumen a 100 \mul en cada pocillo. Se añade una alícuota de 100 \mul de reactivo colorante a cada pocillo y las placas se leen a 500 nm después de una incubación de 15 minutos a 37 grados centígrados.

El colesterol HDL puede ensayarse usando el kit Sigma Nº 352-3 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) que utiliza sulfato de dextrano e iones de Mg para precipitar selectivamente LDL y VLDL. Se añade un volumen de 150 \mul de cada muestra de suero a tubos de microcentrífuga individuales, seguido de 15 \mul de reactivo de colesterol HDL (Sigma 352-3). Las muestras se mezclan y se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos. Después se mezcla una alícuota de 50 \mul del sobrenadante con 200 \mul de solución salina y se ensaya usando el mismo procedimiento que para la medición del colesterol total.

Los triglicéridos se miden usando el kit Sigma Nº 337 en un formato de placas de 96 pocillos. Este procedimiento mide el glicerol, después de su liberación por reacción de los triglicéridos con lipoproteína lipasa. Para generar la curva patrón, se usan soluciones patrón de glicerol (Sigma 339-11) que varían de 1 a 24 \mug. Se añaden muestras de suero (20-40 \mul, dependiendo de la concentración de lípidos esperada) a los pocillos por duplicado. Se añade agua para llevar el volumen a 100 \mul en cada pocillo y también se añaden a cada pocillo 100 \mul de reactivo colorante. Después de la mezcla y de una incubación de 15 minutos, las placas se leen a 540 nm y los valores de triglicéridos se calculan a partir de la curva patrón. También se realiza una placa de réplica usando un reactivo enzimático blanco para realizar las correcciones con respecto a cualquier glicerol endógeno en las muestras de suero.

Medición de ácidos biliares fecales de perro

Se recogen muestras fecales para determinar la concentración de ácidos biliares fecales (FBA) para cada animal. Las recolecciones de heces pueden realizarse durante las 48 horas finales del estudio, durante dos períodos consecutivos de 24 horas entre las 9:00 am y las 10:00 am cada día, antes de la dosificación y de la comida. Las dos recolecciones diarias separadas de cada animal se pesan, se combinan y se homogeneizan con agua destilada en un procesador (Guisinart) para generar una suspensión homogénea. Se extraen aproximadamente 1,4 g del homogeneizado en una concentración final de 50% de butanol terciario/agua destilada (2:0,6) durante 45 minutos en un baño de agua a 37ºC y se centrifugan durante 13 minutos a 2000 x g. La concentración de ácidos biliares (mmoles/día) se determina usando un sistema de ensayo enzimático de 96 pocillos (1,2). Se añade una alícuota de 20 \mul del extracto fecal a dos series de pocillos por triplicado en una placa de ensayo de 96 pocillos. También se analizan una solución de taurocolato sódico estandarizada y un solución de extracto fecal estandarizada (obtenidas previamente a partir de muestras reunidas y caracterizadas con respecto a su concentración de ácidos biliares), para el control de calidad del ensayo. De forma similar, se añaden alícuotas de 20 \mul de taurocolato sódico diluidas en serie para generar una curva patrón, a dos series de pocillos por triplicado. A cada pocillo se le añaden 230 \mul de mezcla de reacción que contiene hidrato de hidrazina 1 M, pirofosfato 0,1 M y 0,46 mg/ml de NAD. Después se añade a una de las dos series de triplicados una alícuota de 50 \mul de enzima 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD, 0,8 unidades/ml) o tampón de ensayo (pirofosfato sódico 0,1 M). Todos los reactivos pueden obtenerse en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Después de 60 minutos de incubación a temperatura ambiente, se mide la densidad óptica a 340 nm y se calcula la media de cada serie de muestras por triplicado. La diferencia en densidad óptica \pm enzima HSD se usa para determinar la concentración de ácidos biliares (mM) de cada muestra basándose en la curva patrón de taurocolato sódico. La concentración de ácido biliar del extracto, el peso del homogeneizado fecal (gramos) y el peso corporal del animal se usan para calcular la concentración de FBA correspondiente en mmoles/kg/día para cada animal. La concentración de FBA media (mmoles/kg/día) del grupo de vehículo se resta de la concentración de FBA de cada grupo de tratamiento para determinar el aumento (valor delta) en la concentración de FBA como resultado del tratamiento.

Ensayo de lípidos en plasma en conejos

Los lípidos plasmáticos pueden ensayarse usando métodos convencionales indicados por J.R. Schuh et al., J. Clin. Invest., 91, 1453-1458 (1993). A grupos de conejos blancos New Zealand macho se les pone una dieta estándar (100 g/día) suplementada con un 0,3% de colesterol y un 2% de aceite de maíz (Zeigler Bothers, Inc., Gardners, PA). El agua se administra ad libitum. Los animales de los grupos de control y de tratamiento se sacrifican después de 1 y 3 meses de tratamiento. Los tejidos se retiran para la caracterización de las lesiones ateroscleróticas. Se toman muestras de sangre para determinar las concentraciones de lípidos en plasma.

Lípidos plasmáticos

El plasma para el análisis de lípidos se obtiene extrayendo sangre de la vena de la oreja en tubos que contienen EDTA (Vacutainer; Becton Dickenson & Co., Rutherford, NJ) seguido de separación centrifuga de las células. El colesterol total se determinó enzimáticamente, usando la reacción de colesterol oxidasa (C.A. Allain et al., Clin. Chem., 20, 470-475 (1974). El colesterol HDL también se midió enzimáticamente, después de una precipitación selectiva de LDL y VLDL por sulfato de dextrano con magnesio (G. R. Warnick et al., Clin. Chem, 28, 1379-1388 (1982)). Los niveles de triglicéridos en plasma se determinan midiendo la cantidad de glicerol liberada por la lipoproteína lipasa por medio de un ensayo unido a enzimas (G. Bucolo et al., Clin. Chem., 19, 476-482 (1973).

Aterosclerosis

Los animales se sacrifican por inyección de pentobarbital. Se retiran rápidamente las aortas torácicas, se fijan por inmersión en formalina tamponada neutra al 10% y se tiñen con ácido oleico O (0,3%). Después de una sola incisión longitudinal a lo largo de la pared opuesta del ostium arterial, los vasos se abren y se fijan con clavos para la evaluación del área de placas. El porcentaje de cobertura de placas se determina a partir de los valores para el área total examinada y el área teñida, por análisis de umbral usando un analizador de imágenes de color absoluto (Videometric 150; American Innovision, Inc., San Diego, CA) conectado a una cámara a color (Toshiba 3CCD) montada en un microscopio de disección. El colesterol tisular se mide enzimáticamente como se ha descrito, después de la extracción con una mezcla de cloroformo/metanol (2:1) de acuerdo con el método de Folch et al., (J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957).

Respuesta vascular In Vitro

Las aortas abdominales se escinden rápidamente, después de la inyección de pentobarbital sódico, y se ponen en tampón de Krebs-bicarbonato oxigenado. Después de retirar el tejido perivascular, se cortan segmentos de anillo de 3 mm, se ponen en un baño de músculo a 37ºC que contiene solución de Krebs-bicarbonato y se suspenden entre dos alambres de acero inoxidable, uno de los cuales está conectado a un transductor de fuerza (Grass Instrument, Co., Quincy, MA). En un registrador de gráficos se registran los cambios de fuerza en respuesta a la angiotensina II añadida al baño.

Ensayo de actividad CETP en plasma humano (Colesteril éster tritiado)

Se obtiene sangre a partir de voluntarios sanos. La sangre se recoge en tubos que contienen EDTA (grupo de plasma EDTA). El grupo de plasma humano EDTA previamente almacenado a -20ºC, se descongela a temperatura ambiente y se centrifuga durante 5 minutos para retirar toda la materia particulada. Se añade HDL tritiado, radiomarcado en resto de colesteril éster ([^{3}H]CE-HDL) como se describe por Morton y Zilversmit (J. Biol. Chem., 256, 11992-95 (1981)), al plasma a una concentración final de (25 \mug/ml de colesterol). Los compuestos inhibidores se añaden al plasma como se indica a continuación: se añaden volúmenes iguales de plasma que contiene el [^{3}H]CE-HDL (396 \mul) por medio de una pipeta a microtubos(Titertube®, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA). Los compuestos, normalmente disueltos como soluciones madre de 20 a 50 mM en DMSO, se diluyen en serie en DMSO (o un disolvente alternativo en algunos casos, tal como dimetilformamida o etanol). Después, a cada uno de los tubos de plasma se le añaden 4 \mul de cada una de las diluciones en serie de compuestos inhibidores o DMSO solo. Los tubos se mezclan inmediatamente. Después se transfieren alícuotas (100 \mul) por triplicado de cada tubo de plasma a los pocillos de placas de microtitulación de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Corning, Corning, NY). Las placas se sellan con una película de plástico y se incuban a 37ºC durante 4 horas. Los pocillos de ensayo contienen plasma con diluciones de compuestos inhibidores. Los pocillos de control contienen plasma con DMSO solo. Los pocillos blancos contienen plasma con DMSO solo, que se dejan en los microtubos a 4ºC durante el período de incubación de 4 horas y se añaden a los pocillos de microtitulación al final del período de incubación. Las partículas de VLDL y LDL se precipitan por la adición de 10 \mul de reactivo de precipitación (1% (p/v) de sulfato de dextrano (Dextralip50)/cloruro de magnesio 0,5 M, pH 7,4) a todos los pocillos. Los pocillos se mezclan en un mezclador de placas y después se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las placas después se centrifugan a 1000 x g durante 30 minutos a 10ºC. Después, los sobrenadantes (50 \mul) de cada pocillo se transfieren a placas de 96 pocillos Picoplate™ 96 (Packard, Meriden, CT) que contienen 250:1 Microscint™-40 (Packard, Meriden, CT). Las placas después se sellan térmicamente (TopSeal™-P, Parckard, Meriden, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se mezclan durante 30 minutos. La radioactividad se mide en un contador de centelleo de microplacas (TopCount, Packard, Meriden, CT). Los valores de IC_{50} se determinan como la concentración de compuesto inhibidor que inhibe la transferencia de [^{3}H]CE desde el [^{3}H]CE-HDL del sobrenadante a las partículas VLDL y LDL precipitadas en un 50% en comparación con la transferencia obtenida en los pocillos de control. El porcentaje máximo de transferencia (en los pocillos de control) se determina usando la siguiente ecuación:

% \ de \ Transferencia = \frac{[dpm_{blanco} - dpm_{control}] \ x \ 100}{dpm_{blanco}}

El porcentaje de transferencia de control determinado en los pocillos que contienen compuestos inhibidores se determina como se indica a continuación:

% \ de \ Control =\frac{[dpm_{blanco} - dpm_{ensayo}] \ x \ 100}{dpm_{blanco} - dpm_{control}}

Los valores de IC_{50} se calculan a partir de gráficos de % de control frente a la concentración de compuesto inhibidor.

Actividad CETP In Vitro

La capacidad de los compuestos para inhibir la actividad CETP se evalúa usando un ensayo in vitro que mide la velocidad de transferencia de colesteril éster radiomarcado ([^{3}H]CE) desde partículas donadoras de HDL a partículas aceptoras de LDL. Los detalles del ensayo se proporcionan por Glenn et al. (Glenn y Melton, "Quantification of Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP): A) CETP Activity and B) Immunochemical Assay of CETP Protein", Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996)). La CETP puede obtenerse a partir del medio acondicionado sin suero de células CHO transfectadas con un ADNc para CETP (Wang, S. et al., J. Biol. Chem., 267, 17487-17490 (1992)). Para medir la actividad CETP, se incuban partículas HDL marcadas con [^{3}H]CE, LDL, CETP y tampón de ensayo (tris(hidroximetil)aminometano 50 mM, pH 7,4; cloruro sódico 150 mM, ácido etilendiamina-tetraacético 2 mM; albúmina de suero bovino al 1%) en un volumen de 200 \mul, durante 2 horas a 37ºC en placas de 96 pocillos. Las partículas LDL se precipitan diferencialmente por la adición de 50 \mul de sulfato de dextrano al 1% (p/v)/cloruro de magnesio 0,5 M, se mezclan vorticialmente y se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solución (200 \mul) se transfiere a una placa de filtro (Millipore). Después de la filtración, se mide la radiactividad presente en las LDL precipitadas por recuento de centelleo de líquidos. La corrección de la transferencia no específica o precipitación se realiza incluyendo muestras que no contienen CETP. La velocidad de transferencia de [^{3}H]CE usando este ensayo es lineal con respecto al tiempo y la concentración de CETP, hasta un 25-30% de [^{3}H]CE transferido.

La potencia de los compuestos de ensayo puede determinarse realizando el ensayo descrito anteriormente en presencia de concentraciones variables de los compuestos de ensayo y determinando la concentración requerida para la inhibición de la transferencia de [^{3}H]CE desde HDL a LDL en un 50%. Este valor se define como la IC_{50}. Los valores de IC_{50} determinados a partir de este ensayo son precisos cuando la IC_{50} es mayor de 10 nM. En el caso de que los compuestos tengan una mayor potencia inhibidora, pueden determinarse mediciones precisas de IC_{50} usando tiempos de incubación más largos (de hasta 18 horas) y concentraciones finales menores de CETP (<50 nM).

Inhibición de la actividad CETP In Vivo

La inhibición de la actividad CETP por un compuesto de ensayo puede determinarse administrando el compuesto a un animal por inyección intravenosa o sonda oral, midiendo la cantidad de transferencia de colesteril éster marcado con tritio ([^{3}H]CE) desde las partículas HDL a las partículas VLDL y LDL, y comparando esta cantidad de transferencia con la cantidad de transferencia observada en los animales de control.

Se mantienen hámsteres sirios dorados macho con una dieta de pienso que contiene un 0,24% de colesterol durante al menos las dos semanas previas al estudio. En el caso de los animales que reciben la dosificación intravenosa, inmediatamente antes del experimento, los animales se anestesian con pentabarbital. La anestesia se mantiene a lo largo de todo el experimento. Se insertan catéteres en la vena yugular y en la arteria carótida. Al principio del experimento, todos los animales reciben 0,2 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena yugular. [^{3}H]CE-HDL es una preparación de partículas HDL humanas que contienen colesteril éster marcado con tritio, y se prepara de acuerdo con el método de Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339- 351 (1996)). El compuesto de ensayo se disuelve como una solución madre 80 mM en vehículo (etanol al 2%: PEG 400 al 98%, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) y se administra por inyección en embolada o por infusión continua. Dos minutos después de administrar la dosis de [^{3}H]CE-HDL los animales reciben 0,1 ml de la solución de ensayo inyectada en la vena yugular. Los animales de control reciben 0,1 ml de la solución de vehículo intravenoso sin compuesto de ensayo. Después de 5 minutos, se extraen las primeras muestras de sangre (0,5 ml) de la arteria carótida y se recogen en tubos microtainer convencionales que contienen ácido etilendiamina tetraacético. Se inyecta solución salina (0,5 ml) para lavar el catéter y reemplazar el volumen de sangre. Las siguientes muestras de sangre se toman después de 2 horas y después de 4 horas por el mismo método. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta que finaliza el experimento. Se obtiene plasma por centrifugación de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma (50 \mul ) se trata con 5 \mul de reactivo de precipitación (sulfato de dextrano, 10g/l; cloruro de magnesio 0,5 M) para retirar las partículas VLDL/LDL. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante (25 \mul) que contiene HDL se analiza con respecto a la radiactividad usando un contador de centelleo de líquidos.

El porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las HDL a las LDL y VLDL (% de transferencia) se calcula basándose en la radiactividad total en muestras de plasma equivalentes antes de la precipitación. Típicamente, la cantidad de transferencia desde las HDL a las LDL y VLDL en los animales de control es del 20 al 35% después de 4 horas.

Como alternativa, los animales no anestesiados conscientes reciben una dosis por sonda oral de compuesto de ensayo como una suspensión en metilcelulosa al 0,1% en agua. A un tiempo determinado para cada compuesto en el que los niveles plasmáticos de la substancia de ensayo alcanzan su máximo (C_{max}) después de la dosificación oral, los animales se anestesian con pentobarbital y después reciben 0,2 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena yugular como se ha descrito anteriormente. Los animales de control reciben 0,25 ml de la solución de vehículo sin compuesto de ensayo por sonda oral. Después de 4 horas, los animales se sacrifican, se recogen muestras de sangre y se ensaya el porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las HDL a las LDL y VLDL (% de transferencia) como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, la inhibición de la actividad CETP por un compuesto de ensayo puede determinarse administrando el compuesto a ratones que se han seleccionado con respecto a la expresión de CETP humana (hCETP) por manipulación transgénica (ratones hCETP). Los compuestos de ensayo se administran por inyección intravenosa o por sonda oral y se determina la cantidad de transferencia de colesteril éster marcado con tritio ([^{3}H]CE) desde las partículas HDL a las partículas VLDL y LDL, y se compara con la cantidad de transferencia observada en los animales de control. Los ratones C57B1/6 que son homocigotos para el gen hCETP se mantienen con una dieta de pienso de alto contenido de grasa, tal como TD 88051, como se describe por Nishina et al., (J. Lipid. Res., 31, 359-369 (1990)) durante al menos dos semanas antes del estudio. Los ratones reciben una dosis por sonda oral de compuesto de ensayo como una suspensión en metilcelulosa al 0,1% en agua o una inyección intravenosa en embolada de compuesto de ensayo en etanol al 10% y polietilenglicol al 90%. Los animales de control reciben la solución de vehículo sin compuesto de ensayo por sonda oral o por una inyección intravenosa en embolada. Al principio del experimento, todos los animales reciben 0,05 ml de una solución que contiene [^{3}H]CE-HDL en la vena de la cola. [^{3}H]CE-HDL es una preparación de partículas HDL humanas que contienen colesteril éster marcado con tritio y se prepara de acuerdo con el método de Glenn et al., (Meth. Enzimol., 263, 339-351 (1996)). Después de 30 minutos, se extrae sangre de los animales y se recoge en tubos microtainer convencionales que contienen ácido etilendiamina tetraacético. Las muestras de sangre se mezclan bien y se mantienen en hielo hasta que termina el experimento. Se obtiene plasma por centrifugación de las muestras de sangre a 4ºC. El plasma se separa y se analiza por cromatografía de exclusión molecular y se determina la proporción relativa de [^{3}H]CE en las regiones de VLDL y LDL y HDL.

El porcentaje de [^{3}H]CE transferido desde las partículas HDL a las partículas LDL y VLDL (% de transferencia) se calcula basándose en la radiactividad total en muestras de plasma equivalente antes de la precipitación. Típicamente, la cantidad de transferencia desde las partículas HCL a las partículas LDL y VLDL en los animales de control es del 20 al 35% después de 30 minutos.

Ensayo de absorción de colesterol intestinal

Se demuestra que varios compuestos inhiben la absorción de colesterol del tracto intestinal. Estos compuestos reducen los niveles de colesterol en suero reduciendo la absorción intestinal tanto del colesterol procedente de fuentes exógenas (colesterol de la dieta) como el colesterol endógeno (secretado por la vesícula biliar al tracto intestinal).

En hámsteres, se ha perfeccionado el uso del método de relación plasmática de isótopos dual para medir la absorción de colesterol intestinal y se ha evaluado como se describe por Turley et al., (J. Lipid. Res. 35, 3329-339 (1994).

A hámsteres macho que pesan 80-100 g se les administra alimento y agua ad libitum en una sala con períodos alternos de luz y oscuridad de 12 horas. A las cuatro horas del período de luz, a cada hámster se le administra primero una dosis intravenosa de 2,5 \muCi de [1,2-^{3}H]colesterol suspendido en Intralipid (20%) y después una dosis oral de [4-^{14}C]colesterol en un aceite de triglicéridos de cadena media (MCT). La dosis i.v. se administra inyectando un volumen de 0,4 ml de la mezcla Intralipid en la vena femoral distal. La dosis oral se administra por medio de una sonda administrando un volumen de 0,6 ml de la mezcla de aceite MCT introducida por vía intragástrica a través de un tubo de polietileno. Después de 72 horas, se extrae sangre de los hámsteres y se determina la cantidad de ^{3}H y ^{14}C en el plasma y en la cantidad original de marcador administrado por espectrometría de centelleo de líquidos. La absorción de colesterol se calcula basándose en la siguiente ecuación:

Porcentaje de colesterol absorbido = \frac{\text{% de dosis oral por ml de muestra de plasma de 72 horas}}{\text{% de dosis i.v. por ml de muestra de plasma de 72 horas}} x 100

Los ejemplos de este documento pueden realizarse substituyendo los compuestos usados en los ejemplos anteriores por compuestos terapéuticos descritos genérica o específicamente o ingredientes inertes.

Habiéndose descrito la invención de esta manera, es evidente que puede variarse de muchas formas. Tales variaciones no deben considerarse una desviación del alcance de la presente invención, y se pretende que todas tales modificaciones y equivalentes, como será evidente para una especialista en la técnica, se incluyan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Una combinación terapéutica que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon (IBAT) y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster (CETP), donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz contra un estado hiperlipidémico, una cantidad eficaz contra un estado aterosclerótico, o una cantidad eficaz contra un estado hipercolesterolémico de los compuestos, y donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster comprende el compuesto C-12 representado por:

60

o enantiómeros o racematos del mismo.

2. La combinación terapéutica de la reivindicación 1, donde dicho compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon comprende el compuesto B-5 representado por:

61

o enantiómeros o racematos del mismo.

3. Uso de una combinación que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz de los compuestos contra un estado hiperlipidémico, y

donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster se representa por la fórmula
(C-12):

62

o enantiómeros o racematos del mismo, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un estado hiperlipidémico.

4. Uso de una combinación que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz de los compuestos contra un estado aterosclerótico, y

63

o enantiómeros o racematos del mismo, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de un estado aterosclerótico.

5. Uso de una combinación que comprende una primera cantidad de un compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon y una segunda cantidad de un compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster, donde la primera cantidad y la segunda cantidad comprenden conjuntamente una cantidad eficaz de los compuestos contra un estado hipercolesterolémico, y

donde dicho compuesto inhibidor de la proteína de transferencia de colesteril éster se representa por la formulación (C-12):

64

o enantiómeros o racematos del mismo, para la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la hipercolesterolemia.

6. El uso de las reivindicaciones 3 a 5, donde dicho compuesto inhibidor del transporte de ácidos biliares del íleon comprende el compuesto B-5 representado por:

65

o enantiómeros o racematos del mismo.