CN1342089A - 适用于心血管疾病的回肠胆汁酸转运抑制剂和胆固醇酯转移蛋白抑制剂的组合 - Google Patents

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Abstract

本发明提供预防或治疗心血管疾病包括高胆固醇血症、动脉粥样硬化或高脂血症的心血管的治疗性化合物的组合。所公开的组合包括与胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂联合的回肠胆汁酸转运抑制剂。

Description

适用于心血管疾病的回肠胆汁酸转运抑制剂和胆固醇酯 转移蛋白抑制剂的组合
本申请要求美国临时申请序号60/143,047(1999年7月7日提交)和美国临时申请序号60/113,955(1998年12月23日提交)的优先权。
                     发明背景
发明领域
本发明涉及治疗心血管疾病的方法，特别是涉及化合物的组合、组合物和它们在医学中的使用方法，具体地说，用于预防和治疗哺乳动物中例如与动脉粥样硬化、高胆固醇血症和其它冠状动脉疾病相关的高脂血症。更具体地说，本发明涉及回肠胆汁酸转运蛋白(IBAT)抑制化合物。本发明还涉及胆固醇酯转移蛋白(CETP)活性抑制化合物。
相关领域的描述
已经完全确定，与升高的总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的浓度有关的高脂血症是冠心病和尤其是动脉粥样硬化的主要危险因素。由于高水平的LDL胆固醇增加动脉粥样硬化的危险，因此降低血浆LDL胆固醇的方法对治疗动脉粥样硬化和其它与血管中脂质积聚有关的疾病在治疗学上将是有益的。这些疾病包括，但不限于，冠心病、外周血管疾病和中风。
动脉粥样硬化为大多数冠状动脉疾病(CAD)的基础，为现代社会的主要发病和死亡原因。已表明高的LDL胆固醇(约180mg/dl以上)和低的HDL胆固醇(低于35mg/dl)为产生动脉粥样硬化的重要起因。其它疾病或危险因素，例如，外周血管疾病、中风和高胆固醇血症受不利的HDL/LDL比率的负面影响。
已发现干扰来自肠道腔中的胆汁酸的再循环可以由于因果关系而降低血清胆固醇的水平。积累的流行病学数据指示，此种降低导致动脉粥样硬化的疾病状况的改善。Stedronsky在“胆汁酸和胆固醇与具有降低血胆固醇特性的非系统药物的相互作用”Biochimica etBiophysica Acta，1210，255-287(1994)中对围绕着胆汁酸和胆固醇的生物化学、生理学和已知的活性药物进行了讨论。
正如Heubi，J.E等报道，一过性的病理生理学改变已显示与患有遗传性缺乏IBAT活性病人的胆汁酸的肝肠循环的中断一致。见“原发性胆汁酸吸收不良：体外回肠活性胆汁酸转运的缺陷”，Gastroeoterology，83，804-11(1982)。
在另一种减少胆汁酸再循环的方法中，回肠胆汁酸转运系统为使用特异性的转运抑制剂治疗基于肝肠循环中断的高胆固醇血症的假定的药物靶(Kramer等，“肠道胆汁酸的吸收”The Joumal of BiologicalChemistry，268(24)18035-46(1993))。
在几个个案专利申请中，Hoechst Aktiengesellschaft公开了肝肠循环系统的各种自然存在的成分的聚合物及其衍生物，包括胆汁酸，其抑制生理学的胆汁酸转运，从而达到作为药物，尤其是用作降低血胆固醇剂的药物足以有效降低LDL胆固醇的水平。Hoechst的个案专利申请分别列出如下，它们公开了这些胆汁酸转运抑制化合物，
R1.加拿大专利申请第2,025,294号，
R2.加拿大专利申请第2,078,588号，
R3.加拿大专利申请第2,085,782号，
R4.加拿大专利申请第2,085,830号，
R5.欧洲专利申请第0 379 161号，
R6.欧洲专利申请第0 549 967号，
R7.欧洲专利申请第0 559 064号，
R8.欧洲专利申请第0 563 731号。
世界专利申请号WO 93/321146公开了具多种用途包括脂肪酸代谢和冠状血管疾病的选择的苯并噻氮杂(benzothiepines)。
如申请号EP 508425所公开的，已知其它的选择的苯并噻氮杂用作降血脂药和降低血胆固醇药，尤其是用于治疗或预防动脉粥样硬化。法国专利申请FR 2661676公开了用作降血脂药和降低血胆固醇药的其它苯并噻氮杂。另外，专利申请号WO 92/18462列出了用作降血脂药和降低血胆固醇药的其它苯并噻氮杂。美国专利第5,994,351号(Lee等)。在这些专利申请中描述的苯并噻氮杂的降血脂药和降低血胆固醇药中的每一个都受到连接于稠合的二环苯并噻氮杂环的苯环邻近的碳原子的酰胺的限制。
可用于治疗高胆固醇血症和高脂血症的其它苯并噻氮杂公开于专利申请号PCT/US95/10863中。可用于预防和治疗高胆固醇血症和高脂血症的其它苯并噻氮杂以及此类苯并噻氮杂的药用组合物描述于PCT/US97/04076中。可用于预防和治疗高胆固醇血症和高脂血症的其它苯并噻氮杂及其组合物描述于美国申请序号08/816,065中。
The Wellcome Foundation Limited的专利申请号WO 93/16055(“降血脂的苯并噻氮杂化合物”)的说明书公开了体外胆汁酸转运抑制作用与降血脂药活性有关。该公开说明书描述了一些降血脂的苯并噻氮杂化合物。其它的降血脂的苯并噻氮杂化合物(特别是2，3，4，5-四氢苯并-1-噻-4-氮杂化合物)公开于专利申请号WO 96/05188。WO96/05188公开的特别有用的苯并噻氮杂为式B-2化合物。其它的降血脂的苯并噻氮杂化合物描述于专利申请号WO 96/16051。
Figure A9981626800081
(3R，5R)-3-丁基-3-乙基-2，3，4，5-四氢-7，8-二甲氧基
   -5-苯基-1-4-苯并噻氮杂1，1-二氧化物
其它可用于控制胆固醇的苯并噻氮杂化合物描述于PCT专利申请号WO 99/35135。该说明书包括式B-7化合物。
Figure A9981626800082
其它的IBAT抑制剂化合物包括T.Ichihashi等在J.Pharmacol.Exp.Ther.，(1)，43-50(1)中描述的一类萘化合物。在该类化合物中，S-8921(1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(3-乙基戊酰基)-4-羟基-6，7，8-三甲氧基-2-萘甲酸甲酯)特别有用的。S-8921的结构示于式B-20中。可用于治疗或预防高脂血症或动脉粥样硬化的其它萘化合物或木素衍生物描述于PCT专利申请WO 94/24087中。
已表明抑制胆固醇酯转移蛋白(CETP)可有效改善血浆HDL/LDL的比率，并期望能检查某些心血管疾病的发展和/或形成。CETP为促进胆固醇酯和甘油三酯在血液中各种脂蛋白之间移动的血浆蛋白(Tall，J.Lipid Res.，34，1255-74(1993))。CETP将胆固醇酯由HDL向LDL的移动具有降低HDL胆固醇的作用。因此，可以推定CETP的抑制将导致血浆HDL胆固醇的升高和血浆LDL胆固醇的降低，因而由此提供治疗学上有益的血浆脂质分布。McCarthy，Medicinal Res.Revs.，13，139-59(1993)描述了这种作用的证据。这种作用的其它证据描述于Sitori，Pharmac.Ther.，67，443-47(1995)中。这种现象被Swenson等(J.Biol.Chem.，264，14318(1989))用特异性地抑制CETP的单克隆抗体首先证实。在兔子中，该抗体引起血浆HDL胆固醇的升高和LDL胆固醇的降低。Son等(Biochim Biophys.Acta，795，743-480(1984))描述了来自人血浆的抑制CETP的蛋白质。授权给Kushwaha等的美国专利5,519,001(通过引用结合到本文中)描述了衍生自抑制CETP活性的狒狒apo C-1的36个氨基酸肽。Cho等(Biochim Biophys.Acta 1391，133-144(1998))描述了得自猪血浆的抑制人CETP的肽。Bonin等(J.Peptide，Res.，51，216-225(1998))公开了CETP的十肽抑制剂。Hedge等在Bioorg，Med.Chem.Lett.，8，1277-80(1998)公开了作为CETP抑制剂的depspeptide真菌代谢产物。
有几篇关于起CETP抑制剂作用的非-肽化合物的报道。Barrett等(J.Am.Chem.Soc.，188，7863-63(1996))描述了含环丙烷的CETP抑制剂。Kuo等(J.Am.Chem Soc.，117，10629-34(1995))描述了其它含环丙烷的CETP抑制剂。Pietzonka等(Bioorg，Med.Chem.Lett.，6，1951-54(1996))描述了作为CETP抑制剂的胆固醇酯的含膦酸酯的类似物。Coval等(Bioorg，Med.Chem.Lett.，5，605-610(1995))描述了作为CETP抑制剂的Wiedendiol-A和-B以及有关的倍半萜化合物。Lee等(J.Antibiotics，49，693-96(1996))描述了衍生自一种昆虫真菌的CETP抑制剂。Busch等(Lipids，25，216-220，(1990))描述了作为CETP抑制剂的胆甾醇乙酰溴。Morton和Zilversmit(J.Lipid Res.，35，836-47(1982))描述了对氯汞基苯磺酸盐、对羟基汞基苯甲酸盐和汞基硫代水杨酸乙酯。Connolly等(Biochem.Biophys.Res.Comm.，223，42-47(1996))描述了作为CETP抑制剂的其它半胱氨酸改性试剂。Xia等描述了作为CETP抑制剂的1，3，5-三嗪(Bioorg，Med.Chem.Lett.，6，919-22(1996))。Bisgaier等(Lipids，29，811-8(1994))描述了作为CETP抑制剂的4-苯基-5-三癸基-4H-1，2，4-三唑-硫醇。其它的三唑CETP抑制剂描述于美国专利申请序号09/153360中，通过引用结合到本文中。Silorski等在PCT专利申请号WO 9914204中公开了其它新的CETP抑制剂。
取代的2-巯基苯胺酰胺化合物可用作CETP抑制剂，H.Shinkai等在PCT专利申请号WO 98/35937中描述了这种治疗性化合物。
一些取代的杂烷基胺化合物已知为CETP抑制剂。在欧洲专利申请号796846中，Schmidt等描述了可用作心血管药物的为胆固醇酯转移蛋白抑制剂的2-芳基-取代的吡啶。在吡啶环C3上的一个取代基可以为羟烷基基团。在欧洲专利申请号801060中，Dow和Wright描述了烷基胺的醛加成产物取代而提供1-羟基-1-胺的杂环衍生物。有报道β3-肾上腺能受体激动剂可用于治疗糖尿病和其它疾病。在英国专利申请号2305665中，Fisher等公开了可用于治疗几种疾病，包括胆固醇水平和动脉粥样硬化症的3-激动剂仲氨基醇取代的吡啶衍生物。在欧洲专利申请号818448中(通过引用结合到本文中)，Schmidt等描述了作为胆固醇酯转移蛋白抑制剂的四氢喹啉衍生物。在欧洲专利申请号818197中，Schmek等描述了作为胆固醇酯转移蛋白抑制剂的具有稠合杂环的吡啶。Brandes等在德国专利申请号19627430中描述了作为胆固醇酯转移蛋白抑制剂的二环稠合的吡啶衍生物。在PCT专利申请号WO 9839299中，Muller-Gliemann等描述了作为胆固醇酯转移蛋白抑制剂的喹啉衍生物。
A.Oomura等在日本专利申请号10287662中也公开了可用作CETP抑制剂的多环化合物。例如，通过培养种名待定的青霉(Penicillium spp.)制备具有C-1和C-8的治疗性化合物。
Schmidt等在欧洲专利申请号EP 818448中公开了可用作CETP抑制剂的环烷基吡啶。例如，公开了作为CETP抑制剂特别有效的具有C-9结构的治疗性化合物。
PCT专利申请号WO 9914174描述了可用作CETP抑制剂的取代的四氢萘化合物。在该公开中具体描述为有用的CETP抑制剂的有(8S)-3-环戊基-1-(4-氟代苯基)-2-[(S)-氟代(4-三氟甲基苯基)甲基]-8-羟基-6-螺环丁基-5，6，7，8-四氢萘。
在PCT专利申请号WO 9914215中描述了可用作CETP抑制剂的一些4-杂芳基-四氢喹啉。例如，该公开描述了作为有用的CETP抑制剂的3-(4-三氟甲基苯甲酰基)-5，6，7，8-四氢喹啉-5-酮。
文献中描述了治疗心血管疾病的一些联合疗法。美国专利申请号09/037308公开了可用于治疗心血管疾病的IBAT抑制剂与HMG CoA还原酶抑制剂的组合。
J.Sasaki等(同上)描述了氟伐他汀和戊四烟酯的联合疗法。这些研究人员得出结论，氟伐他汀与戊四烟酯的组合“在日剂量750mg/天的剂量时，似乎不增强或减弱氟伐他汀的有益效果”。
L.Cashin-Hemphill等(J.Am.Med.Assoc.，264(23)，3013-17(1990))描述考来替泊和烟酸的联合疗法对冠状动脉粥样硬化的有益效果。所述效果包括先天性(native)冠状动脉损伤的非发展和消退。
阿昔莫司和辛伐他汀的联合治疗在具有高甘油三酯水平的患者中显示出有益的HDL作用(N.Hoogerbrugge等，J.Intemal Med.，241，151-55(1997))。
H.Gylling等(J.Lipid Res.，37，1776-85(1996))描述了谷甾醇(Sitostanol)酯margarine和普伐他汀的联合疗法。该疗法被报道在非-胰岛素-依赖性糖尿病病人中同时地明显抑制胆固醇吸收和降低LDL胆固醇。
Brown等(New Eng.J.Med.，323(19)，1289-1339(1990))描述了洛伐他汀和考来替泊的联合疗法，所述疗法与仅使用洛伐他汀相比，减轻了动脉粥样硬化损伤的发展并加快损伤的消退。
Chang等在PCT专利申请号WO 9823593中公开了apoB分泌抑制剂与CETP抑制剂的联合疗法。
Buch等(PCT专利申请号WO 9911263)描述了包含氨氯地平和抑制素化合物的联合疗法，用于治疗患有心绞痛、动脉粥样硬化、合并的高血压和高脂血症的受治疗者，及治疗心博停止的症状。Buch等在PCT专利申请号WO 9911259中描述了包含氨氯地平和atorvastatin的联合疗法。
Scott等(PCT专利申请号WO 9911260)描述了包含atorvastatin和抗高血压药的联合疗法。
Dettmar和Gibson(英国专利申请号GB 2329334 A)要求保护可用于减少血浆低密度脂蛋白和胆固醇水平的治疗组合物，其中组合物包含HMC CoA还原酶抑制剂和胆汁络合剂。
以上参考文献显示出寻找预防或治疗心血管疾病的安全的、有效的药物的不断需求。
                  发明概述
为满足对发现预防或治疗心血管疾病的安全而有效的药物的不断需求，现在报告心血管药物的联合治疗。
在本发明的几个实施方案中，本发明提供包括使用第一个量的IBAT抑制剂和第二个量的另一种心血管治疗剂的联合疗法，可用于预防或治疗高脂血症、动脉粥样硬化或高胆固醇血症，其中所述第一个量和第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量、抗动脉粥样硬化症的有效量或抗高胆固醇血症的有效量。例如，许多本发明实施方案中的一个为包含治疗剂量的IBAT抑制剂和CETP抑制化合物的联合疗法。本发明的一个优选的实施方案为包括治疗剂量的苯并噻氮杂IBAT抑制剂和CETP抑制剂的联合疗法。
本发明的另一个实施方案包括使用在此描述的任何心血管联合疗法，以预防或治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化或高脂血症。因此，在本发明的一个实施方案中，提供预防或治疗高脂血症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的CETP抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量。
在另一个实施方案中，本发明提供预防或治疗动脉粥样硬化症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的CETP抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗动脉粥样硬化症的有效量。
在再一个实施方案中，本发明提供预防或治疗高胆固醇血症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的CETP抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗高胆固醇血症的有效量。
本发明的实用性的其它范围从下文的详细描述中将变得显而易见。然而，应该理解，下面的详细描述和实施例虽然说明了本发明的优选实施方案，但仅以例举说明的方式给出，因为从这些详细的描述中，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员来说，将是显而易见的。
                  优选实施方案的详述
提供以下的详细描述，以帮助本领域技术人员实施本发明。尽管如此，这种详细描述不应解释为对本发明的不适当的限制，因为在不背离本发明的发现的精神或范围的情况下，本领域的普通技术人员可进行在此讨论的实施方案中的各种修改和变化。
在此引用的各参考文献的内容，包括在这些原始参考文献中引用的参考文献的内容，均作为其整体通过引用结合到本文中。a.定义
提供以下定义，以帮助读者理解本发明的详述：
“回肠胆汁酸转运蛋白”或“IBAT”与顶部钠共依赖性(apical sodiumco-dependent)胆汁酸转移蛋白或ASBT同义。
“苯并噻氮杂IBAT抑制剂”指回肠胆汁酸转移抑制剂，其包括包含2，3，4，5-四氢-1-苯并噻氮杂1，1-二氧化物结构的治疗性化合物。
如在此所用的术语“CETP抑制剂”或“CETP抑制化合物”指由化学或生物学来源衍生的抑制胆固醇酯转移蛋白活性的任何治疗性化合物。
“联合疗法”指给予两种或更多种治疗剂以治疗高脂血症，例如，动脉粥样硬化和高胆固醇血症。这样的给药包括以基本同时的方式，例如以具有固定比例的活性成分的单一剂型或多种的每种抑制剂分开的剂型共同给予这些治疗剂。另外，这样的给药也包括以顺序的方式使用每一类型的治疗剂。无论何种情况，治疗方案都将在治疗高脂血症方面提供药物组合的有益效果。
短语“治疗有效的”意在限制联合疗法中的抑制剂的合并量。这种合并的量将达到减轻或消除高脂血症的目的。
“治疗性化合物”指可用于预防或治疗高脂血症，包括动脉粥样硬化和高胆固醇血症的化合物。b.组合
本发明的组合将具有多种用途。例如，通过剂量调节和医学监测，用于本发明组合中的治疗性化合物的各剂量将低于单一治疗时所用的治疗性化合物的通常用量。剂量降低将提供以下优点，包括，当与单一治疗比较时，减少各治疗性化合物的副作用。此外，与单一治疗比较，联合治疗的较少的副作用将使患者对治疗方案产生的更大依从性。
本发明的另一个用途将是具有互补效果或互补作用模式的组合。例如，IBAT抑制剂通过抑制胆汁酸在回肠中的再吸收控制血清胆固醇水平。相反，CETP抑制剂抑制胆固醇酯和甘油三酯在血液中的各种脂蛋白之间的移动。
可用于本发明的化合物包括许多治疗性化合物。可用于本发明的一些IBAT抑制剂公开于专利申请号PCT/US95/10863，其通过引用结合到本文中。PCT/US97/04076描述了更多的IBAT抑制剂，通过引用结合到本文中。可用于本发明的另外一些IBAT抑制剂描述于美国申请序号08/816,065，其通过引用结合到本文中。WO 98/40375描述了更多的可用于本发明的IBAT抑制剂，通过引用结合到本文中。可用于本发明的另外的IBAT抑制化合物描述于美国申请序号08/816,065，其通过引用结合到本文中。可用于本发明的另外的IBAT抑制化合物公开于美国专利号5,994,391，其通过引用结合到本文中。本发明的特别重要的IBAT抑制剂包括示于表1中的那些，以及表1中的IBAT抑制剂的非对映体、对映体、外消旋体、盐和互变异构体。
                    表1
 化合物号   结构
   B-1
Figure A9981626800181
Figure A9981626800201
Figure A9981626800251
Figure A9981626800281
Figure A9981626800291
可用于本发明的一些CETP抑制剂在下列各专利申请被分别描述，其中的每一篇分别通过引用结合到本文中。
R9. 美国专利申请序号60/101661
R10.美国专利申请序号60/101711
R11.美国专利申请序号60/101660
R12.美国专利申请序号60/101664
R13.美国专利申请序号60/101668
R14.美国专利申请序号60/101662
R15.美国专利申请序号60/101663
R16.美国专利申请序号60/101669
R17.美国专利申请序号60/101667
R18.美国专利申请序号09/401,916
R19.美国专利申请序号09/405,524
R20.美国专利申请序号09/404,638
R21.美国专利申请序号09/404,638
R22.美国专利申请序号09/400,915
R23.美国专利号5,932,587
R24.美国专利号5,925,645
本发明的特别重要的CETP抑制剂化合物包括示于表2中的那些，以及表2中的CETP抑制剂的非对映体、对映体、外消旋体、盐和互变异构体。
                     表2
 化合物号     结构
Figure A9981626800311
Figure A9981626800321
Figure A9981626800331
Figure A9981626800341
可用于本发明的化合物(例如，回肠胆汁酸转移抑制化合物或CETP抑制化合物)可以没有不对称碳原子，或者，作为替代，有用的化合物可具有一个或多个不对称碳原子。当有用的化合物具有一个或多个不对称碳原子时，它们因此包括外消旋体和立体异构体，例如，非对映体和对映体，以纯净形式存在或为混合物。这样的立体异构体可采用常规技术，例如，通过对映体原料的反应，或通过分离本发明化合物的异构体来制备。
异构体可包括几何异构体，例如双键两端的顺式-异构体或反式-异构体。所有这些异构体都计划在可用于本发明的化合物中。
可用于本发明的化合物也包括互变异构体。
如以下所讨论的，可用于本发明的化合物包括它们的盐、溶剂化物和前药。剂量、制剂和给药途径
可通过使这些化合物与它们在体内(如哺乳动物例如人的回肠、血浆或肝中)的作用部位产生接触的任何方式，优选口服，给予本发明的组合物，用于预防或治疗高脂血症或疾病。
为预防或治疗上述疾病，可用于本发明的组合物和方法中的化合物可以作为化合物本身使用。药学上可接受的盐特别适合于医学应用，因为相对于母体化合物，它们的水溶性更大。这样的盐显然必须具有药学上可接受的阴离子或阳离子。可能时，本发明化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐包括衍生自无机酸，例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、磺酸和硫酸的盐，及衍生自有机酸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、羟基乙酸、异连多硫酸、乳酸、乳糖酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、琥珀酸、甲苯磺酸、酒石酸和三氟乙酸的盐。氯化物盐特别优选用于医学目的。合适的药学上可接受的碱盐包括铵盐、碱金属盐如钠盐和钾盐，及碱土金属盐如镁盐和钙盐。
当然，可用于本发明的阴离子也必需是药学上可接受的并且也可选自上表中。
可用于本发明的化合物可与可接受的载体以药用组合物的形式存在。当然，载体必须是可接受的，即与组合物中的其它成分相容且必须对接受者无害。载体可以是固体或液体，或两者皆可，且优选与所述化合物配制为单位-剂量组合物，例如片剂，其可含有0.05％-95％(重量)的活性化合物。也可存在其它的药理学活性物质，包括本发明的其它化合物。本发明的药用组合物可通过制药的任何熟知的技术，主要包括将各成分混合来制备。
本发明的组合可任选包括包含回肠胆汁酸转移抑制化合物和CETP抑制化合物的组合物。在这样的组合物中，回肠胆汁酸转移抑制化合物和CETP抑制化合物可以以单一剂型，例如丸剂、胶囊，或含有两种化合物的液体存在。
这些化合物可以通过任何现有的常规方式，与其它药物联合使用，或者作为单个的治疗性化合物或者作为治疗性化合物的组合给药。
获得所需生物学效果需要的化合物量当然应取决于多种因素，例如选用的具体化合物、打算的用途、给药方式和接受者的临床病况。
一般来说，IBAT抑制剂的总日剂量可在约0.01-约1000mg/天的范围内，优选约0.1-约50mg/天，更优选约1-约10mg/天。
对于CETP抑制剂，约0.01-约100mg/kg体重/天的日剂量通常可能是适宜的，优选约0.5-约20mg/kg体重/天。
对于各种治疗性化合物来说，上面段落描述的日剂量可以以单一剂量，或以按比例的多个亚剂量给予患者。每日可给予2-6次亚剂量。可以以缓释的形式给药，以有效获得所需效果。
在药学上可接受的盐的情况下，以上指明的重量指由该盐衍生的治疗性化合物的酸相当物或碱相当物的重量。
如本领域所熟知的，本发明组合的口服传递可包括通过任何各种机理提供将药物延长或持续传递至胃肠道的制剂。这些包括(但不限于)基于小肠的改变pH的剂型的pH敏感释放，片剂或胶囊的缓慢溶蚀，基于制剂的物理特性在胃中的保留，剂型对肠道粘膜内表面的生物粘附，或活性药物从剂型中的酶释放。对于可用于本发明的某些治疗性化合物(如IBAT抑制剂或CETP抑制剂)来说，预期的效果是通过剂型的控制延长活性药物分子传递至作用部位(如回肠)的时间。因此，肠衣制剂和肠衣控释制剂均在本发明范围内。合适的肠包衣包括纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、聚乙烯基乙酸邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯以及异丁烯酸和异丁烯酸甲酯的阴离子聚合物。
本发明的组合可以以固体、半固体或液体形式经口服传递。当为液体或半固体的形式时，本发明的组合可以，例如，为液体、糖浆的形式，或装入凝胶胶囊(如gel cap)中。在一个实施方案中，当IBAT抑制剂用于本发明的组合时，所述IBAT抑制剂可以以液体、糖浆的形式提供，或装入凝胶胶囊中。在另一个实施方案中，当CETP抑制剂用于本发明的组合时，所述CETP抑制剂可以以液体、糖浆的形式提供，或装入凝胶胶囊中。
这些治疗性化合物中的任何化合物的剂量可以方便地作为每分钟约10ng/kg体重-约100ng/kg体重的输注液给予。适合于该目的的输注液每毫升可含有，例如，约0.1ng-约10mg，优选约1ng-约10mg。单位剂量可含有，例如，约1mg-约10g的本发明化合物。因此，注射用安瓿可含有，例如，约1mg-约100mg。
根据本发明的药用组合物包括适合于口服、直肠、局部、口腔含化(如舌下)和胃肠外(如皮下、肌内、皮内或静脉内)给予的组合物，虽然在任何给定的情况下，最合适的途径将取决于所治疗疾病的性质和严重程度，以及所用具体化合物的性质。在大多数情况下，优选的给药途径为口服。
适合于口服给药的药用组合物可以以分散的单位，例如，胶囊、扁囊剂、糖锭剂或片剂存在，每个单位含有预定量的至少一种可用于本发明的治疗性化合物；如散剂或颗粒剂，如在含水或非水液体中的溶液或悬浮液，或如水包油或油包水乳剂。如同指明的那样，这样的组合物可以通过制药的任何合适的方法制备，其包括将活性化合物和载体(其可组成一种或多种辅助成分)混合在一起的步骤。一般来说，通过将活性化合物与液体载体或细分散的固体载体或这两种载体均匀地和紧密地混合，然后(如果需要)成型为产品，制备所述组合物。例如，通过对所述化合物的粉末或颗粒，任选与一种或多种辅助成分一起压制或模压，可以制备片剂。通过在合适的机器中压制自由-流动形式(如粉末或颗粒)的所述化合物(任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合)，可以制备压制片。模压片可以通过在合适的机器中，将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物模压制备。
适合于口腔含化(舌下)给药的药用组合物包括糖锭剂，其含有在调味基质(通常为蔗糖、和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的本发明化合物，以及锭剂，其包括在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的所述化合物。
适合于胃肠外给药的药用组合物方便地包括本发明化合物的无菌含水制剂。这些制剂优选经静脉内给药，虽然也可通过皮下、肌内或皮内注射给药。这些制剂可方便地通过将所述化合物与水混合，并使生成的溶液灭菌及与血液等渗来制备。根据本发明的注射组合物一般含有0.1-5％(w/w)的在此公开的化合物。
适合于直肠给药的药用组合物优选作为单位-剂量的栓剂存在。这些栓剂可通过将本发明化合物与一种或多种常规固体载体，例如，可可脂混合，然后使产生的混合物成型来制备。
适合于局部应用于皮肤的药用组合物优选采取软膏、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油的形式。可以使用的载体包括矿脂(如凡士林)、羊毛脂、聚乙二醇、醇及其两种或多种的组合。活性化合物通常以组合物的0.1-50％(w/w)，例如，0.5-2％的浓度存在。
透皮制剂也是可能的。适合于透皮给药的药用组合物可作为适于与接受者的皮肤在延长的时间段内保持紧密地接触的分开的贴剂存在。这样的贴剂适当地含有在任选缓冲的、含水溶液中，或溶解于和/或分散于胶粘剂，或分散于聚合物中的本发明化合物。活性化合物的合适的浓度为约1％-35％，优选约3％-15％。作为一个特殊的可行性，该化合物可经电转运或离子电渗疗法，如在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中所述，从贴剂传递。
在任何情况下，可以与载体物质结合以生产给药的单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的宿主和给药的具体方式而变化。
上述包括胶囊、片剂、丸剂、散剂、gel caps和颗粒剂的用于口服给予的固体剂型包含与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合的一种或多种可用于本发明的化合物。这样的剂型还可包括(如在正常实践中)除惰性稀释剂以外的其它物质，例如，润滑剂如硬脂酸镁或加溶剂如环糊精。在胶囊、片剂、散剂、颗粒剂、gel caps和丸剂的情况下，所述剂型还可包含缓冲剂。片剂和丸剂可用肠溶衣另外制备。
用于口服给予的液体剂型可包括药学上可接受的含有本领域常用的惰性稀释剂如水的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。这样的组合物也可包括辅助剂，例如，湿润剂、乳化剂和悬浮剂，以及甜味剂、矫味剂和芳香剂。
注射制剂，例如，无菌注射水性或油性悬浮液，可根据已知的技术，采用合适的分散剂或定形剂(setting agents)和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是在非毒性的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，如1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的溶媒和溶剂中，有水、Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可应用于注射剂的制备。
药学上可接受的载体包括所有前述的及诸如此类的载体。
在联合疗法中，给予两种或多种可用于本发明的治疗剂可以以分开的制剂顺序进行，或可通过以单一的制剂或分开的制剂同时给予来实现。给药可通过口服途径，或通过静脉内、肌内或皮下注射来实现。制剂可以是大剂量的形式，或含水的或非水等渗注射溶液或悬浮液。这些溶液和悬浮液可以由含有一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂或粘合剂如明胶或羧丙基甲基纤维素的无菌粉末或颗粒，与一种或多种润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂一起来制备。
对于口服给药，药用组合物可以为，例如，片剂、胶囊、悬浮液或液体。胶囊、片剂等可通过本领域熟知的常规方法制备。药用组合物优选以含有特定量的一种或多种活性成分的剂量单位的形式来制备。剂量单位的实例为片剂或胶囊。这些可以有利地含有一种或多种上述量的治疗性化合物。例如，在IBAT抑制剂的情况下，剂量范围可以为约0.01mg/天-约500mg/天或任何其它剂量，如本领域已知的，这取决于具体的抑制剂。在胆汁酸螯合剂的情况下，剂量范围可以为约1,000mg/天-约30,000mg/天或任何其它剂量，如本领域已知的，这取决于具体的胆汁酸螯合剂。
活性成分也可作为组合物经注射给予，其中，例如，盐水、右旋糖或水可以用作合适的载体。每种活性治疗性化合物的合适的日剂量为达到如上所述经口服给药所产生的相同血清水平的量。
所述治疗性化合物还可通过任何口服/口服、口服/胃肠外或胃肠外/胃肠外途径的组合给予。
用于本发明治疗方法的药用组合物可以以口服的形式给予或经静脉给予。优选口服给药的联合疗法。对于口服给予的给药可以采用要求单一日剂量，或单一的隔日剂量，或一日多次的间隔剂量的方案。组成联合疗法的治疗性化合物可以以合并的剂型或者以打算大致同时口服给予的分开的剂型同时给予。组成联合疗法的治疗性化合物也可以通过要求两步摄食的方案给予任一种治疗性化合物来顺序给予。因此，方案可以要求采用间隔摄入分开的活性剂来顺序给予治疗性化合物。多次摄入步骤之间的时间间隔可以为数分钟至数小时，这取决于每种治疗性化合物的性质如治疗性化合物的药效、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学分布，也取决于食物摄入的影响和患者的年龄和疾病。靶分子浓度的昼夜变化也可决定最佳的给药间隔。是同时、基本同时还是顺序给予联合疗法的治疗性化合物可涉及要求经口服途径给予一种治疗性化合物而经静脉内途径给予另一种治疗性化合物的方案。无论联合疗法的治疗性化合物经口服或静脉内途径分开或同时给予，每种这样的治疗性化合物都将被包含在药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其它制剂成分的合适的药用制剂中。口服给予的、含有所述治疗性化合物的、合适的药学上可接受制剂的实例已在上文中给出。
               治疗方案
根据各种不同的因素，选择使用本发明的化合物和/或组合物的方案，以预防、缓解或改善具有高脂血症作为疾病要素的病症例如动脉粥样硬化或防止或治疗其它高胆固醇血浆或血液水平的疾病。这些因素包括患者的类型、年龄、体重、性别、饮食习惯和医学疾病状况，疾病的严重程度、给药途径、药理学上的考虑如所用具体化合物的活性、药效、药代动力学和毒理学模式，是否使用药物传递系统以及该化合物是否作为药物组合的一部分给药。因此，实际采用的给药方案可以在宽的范围内变化，并因此而偏离上面提出的优选给药方案。
患有高脂血症的患者的初始治疗可用以上指明的剂量开始。如果必要，治疗一般应持续数周至数月或数年，直至高脂血症被控制或消除。对用在此公开的化合物或组合物治疗的患者可通过，例如，用本领域熟知的任何方法测量血清LDL和总胆固醇水平来常规监测，以确定联合疗法的有效性。在治疗期间对这些数据连续进行分析，可使治疗方案得到改进，以便在任何时间点给予每一类型的治疗性化合物的最佳有效量，并且还可确定疗程。这样，通常可在治疗过程中合理地修改治疗方案/给药程序，以便给予在一起显示出满意效果的最少量的各治疗性化合物，并连续给药至成功治疗高脂血症仅需的疗程长度。
在此公开的联合疗法的潜在优点是可减少任何单个治疗性化合物或所有治疗性化合物有效治疗高脂血症如动脉粥样硬化和高胆固醇血症的剂量。降低的剂量将提供包括减少与单一治疗比较时单个治疗性化合物的副作用的优点。
本发明的几个实施方案中的一种包括包含使用第一个量的IBAT抑制剂和第二个量的另一种心血管治疗剂的联合疗法，可用于预防或治疗高脂血症、动脉粥样硬化或高胆固醇血症，其中所述第一个量和第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量、抗动脉粥样硬化症的有效量或抗高胆固醇血症的有效量。例如，许多本发明实施方案中的一种为包含治疗剂量的IBAT抑制剂和CETP抑制剂的联合疗法。本发明的一个优选的实施方案为包括治疗剂量的苯并噻氮杂IBAT抑制剂和CETP抑制剂的联合疗法。
本发明的实施方案可包括使用在此描述的或结合到本文中的两种或更多种治疗性化合物的联合疗法。所述联合疗法可包含两种或更多种来自不同类的化学物质的治疗性化合物，例如，IBAT抑制剂可以在治疗学上与CETP抑制剂合用。治疗性组合可包括两种以上的治疗性化合物。例如，所述疗法可包括使用IBAT抑制剂、CETP抑制剂和HMG CoA还原酶抑制剂。或者，来自同类化学物质的两种或更多种治疗性化合物可组成所述疗法，例如，包括两种或更多种IBAT抑制剂或两种或更多种CETP抑制剂的联合疗法。
本发明的另一实施方案包括使用在此描述的任何心血管联合疗法，以预防或治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化或高脂血症。
下列非限制性实施例旨在说明本发明的各个方面。c.实施例
表3说明本发明的许多组合中的一些实施例，其中所述组合包括第一个量的IBAT抑制剂和第二个量的CETP抑制剂，其中所述第一个量和第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量、抗动脉粥样硬化症的有效量或抗高胆固醇血症的有效量。
         表3
  实施例号    成分1    成分2
    1     B-1     C-1
    2     B-1     C-2
    3     B-1     C-3
    4     B-1     C-4
    5     B-1     C-5
    6     B-1     C-6
    7     B-1     C-7
    8     B-1     C-8
    9     B-1     C-9
    10     B-1     C-10
    11     B-1     C-11
    12     B-1     C-12
    13     B-1     C-13
    14     B-1     C-14
    15     B-1     C-15
    16     B-1     C-16
    17     B-1     C-17
    18     B-1     C-18
    19     B-1     C-19
    20     B-1     C-20
    21     B-2     C-1
    22     B-2     C-2
    23     B-2     C-3
    24     B-2     C-4
    25     B-2     C-5
    26     B-2     C-6
    27     B-2     C-7
    28     B-2     C-8
    29     B-2     C-9
    30     B-2     C-10
    31     B-2     C-11
    32     B-2     C-12
    33     B-2     C-13
    34     B-2     C-14
    35     B-2     C-15
    36     B-2     C-16
    37     B-2     C-17
    38     B-2     C-18
    39     B-2     C-19
    40     B-2     C-20
    41     B-3     C-1
    42     B-3     C-2
    43     B-3     C-3
    44     B-3     C-4
    45     B-3     C-5
    46     B-3     C-6
    47     B-3     C-7
    48     B-3     C-8
    49     B-3     C-9
    50     B-3     C-10
    51     B-3     C-11
    52     B-3     C-12
    53     B-3     C-13
    54     B-3     C-14
    55     B-3     C-15
    56     B-3     C-16
    57     B-3     C-17
    58     B-3     C-18
    59     B-3     C-19
    60     B-3     C-20
    61     B-4     C-1
    62     B-4     C-2
    63     B-4     C-3
    64     B-4     C-4
    65     B-4     C-5
    66     B-4     C-6
    67     B-4     C-7
    68     B-4     C-8
    69     B-4     C-9
    70     B-4     C-10
    71     B-4     C-11
    72     B-4     C-12
    73     B-4     C-13
    74     B-4     C-14
    75     B-4     C-15
    76     B-4     C-16
    77     B-4     C-17
    78     B-4     C-18
    79     B-4     C-19
    80     B-4     C-20
    81     B-5     C-1
    82     B-5     C-2
    83     B-5     C-3
    84     B-5     C-4
    85     B-5     C-5
    86     B-5     C-6
    87     B-5     C-7
    88     B-5     C-8
    89     B-5     C-9
    90     B-5     C-10
    91     B-5     C-11
    92     B-5     C-12
    93     B-5     C-13
    94     B-5     C-14
    95     B-5     C-15
    96     B-5     C-16
    97     B-5     C-17
    98     B-5     C-18
    99     B-5     C-19
    100     B-5     C-20
    101     B-6     C-1
    102     B-6     C-2
    103     B-6     C-3
    104     B-6     C-4
    105     B-6     C-5
    106     B-6     C-6
    107     B-6     C-7
    108     B-6     C-8
    109     B-6     C-9
    110     B-6     C-10
    111     B-6     C-11
    112     B-6     C-12
    113     B-6     C-13
    114     B-6     C-14
    115     B-6     C-15
    116     B-6     C-16
    117     B-6     C-17
    118     B-6     C-18
    119     B-6     C-19
    120     B-6     C-20
    121     B-7     C-1
    122     B-7     C-2
    123     B-7     C-3
    124     B-7     C-4
    125     B-7     C-5
    126     B-7     C-6
    127     B-7     C-7
    128     B-7     C-8
    129     B-7     C-9
    130     B-7     C-10
    131     B-7     C-11
    132     B-7     C-12
    133     B-7     C-13
    134     B-7     C-14
    135     B-7     C-15
    136     B-7     C-16
    137     B-7     C-17
    138     B-7     C-18
    139     B-7     C-19
    140     B-7     C-20
    141     B-8     C-1
    142     B-8     C-2
    143     B-8     C-3
    144     B-8     C-4
    145     B-8     C-5
    146     B-8     C-6
    147     B-8     C-7
    148     B-8     C-8
    149     B-8     C-9
    150     B-8     C-10
    151     B-8     C-11
    152     B-8     C-12
    153     B-8     C-13
    154     B-8     C-14
    155     B-8     C-15
    156     B-8     C-16
    157     B-8     C-17
    158     B-8     C-18
    159     B-8     C-19
    160     B-8     C-20
    161     B-9     C-1
    162     B-9     C-2
    163     B-9     C-3
    164     B-9     C-4
    165     B-9     C-5
    166     B-9     C-6
    167     B-9     C-7
    168     B-9     C-8
    169     B-9     C-9
    170     B-9     C-10
    171     B-9     C-11
    172     B-9     C-12
    173     B-9     C-13
    174     B-9     C-14
    175     B-9     C-15
    176     B-9     C-16
    177     B-9     C-17
    178     B-9     C-18
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    663     B-34     C-3
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    666     B-34     C-6
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    672     B-34     C-12
    673     B-34     C-13
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    678     B-34     C-18
    679     B-34     C-19
    680     B-34     C-20
    681     B-35     C-1
    682     B-35     C-2
    683     B-35     C-3
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    685     B-35     C-5
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    687     B-35     C-7
    688     B-35     C-8
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    700     B-35     C-20
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    739     B-37     C-19
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    741     B-38     C-1
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    757     B-38     C-17
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    759     B-38     C-19
    760     B-38     C-20
    761     B-40     C-1
    762     B-40     C-2
    763     B-40     C-3
    764     B-40     C-4
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    779     B-40     C-19
    780     B-40     C-20
生物学测定
通过下列测定可以显示本发明的组合的用途。这些测定在体外和在动物模型中，基本上采用已知的程序进行，以表明本发明的用途。在H14细胞中抑制IBAT-介导的[14C]-牛磺胆酸盐(TC)摄取的化合物的体外测定
将用人IBAT(H14细胞)的cDNA转染的幼仓鼠肾细胞(BHK)以60,000个细胞/孔的浓度接种到96孔Top-Count组织培养板中，在接种24小时内进行测定，以30,000个细胞/孔接种，在48小时内进行测定，及以10,000个细胞/孔接种，在72小时内进行测定。
在测定的当天，用100μl测定缓冲液(含有4.5g/L葡萄糖+0.2％(w/v)无脂肪酸牛血清白蛋白-(FAF)BSA的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基)温和洗涤细胞单层一次。向在每孔中加入50μl测定缓冲液中的两倍浓度的试验化合物以及50μl测定缓冲液中的6μM[14C]-牛磺胆酸盐(终浓度3μM[14C]-牛磺胆酸盐)。于37℃温育细胞培养板2小时，然后用含0.2％(w/v)(FAF)BSA的100μl4℃的Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(PBS)温和洗涤每孔两次。再用100μl4℃的无(FAF)BSA的PBS温和洗涤各孔一次。向每孔中加入200μl液体闪烁计数液，热封培养板，于室温下振摇30分钟，然后在Packard Top-Count仪器上测定每孔的放射活性量。抑制[14C]-丙氨酸摄取的化合物的体外测定
以与牛磺胆酸盐测定相同的方式进行丙氨酸摄取测定，但不同之处是用标记的丙氨酸代替标记的牛磺胆酸盐。大鼠粪便胆汁酸浓度(FBA)的测定
收集单独关养的大鼠24或48小时的总粪便，在氮气流下干燥、粉碎、混合并称量。称出约0.1g并提取到有机溶剂(丁醇/水)中。分离和干燥后，使残留物溶于甲醇中，采用3α-羟基类固醇类固醇脱氢酶与胆汁酸反应以还原NAD来酶法测定存在的胆汁酸的量。(见Mashige，F等，Clin.Chem.，27，1352(1981)，通过引用结合到本文中)。大鼠管饲法测定
采用经口管饲法给予雄性Wister大鼠(275-300g)IBAT抑制剂。以在每公斤体重2ml终体积中的不同剂量，给予药物或溶媒(0.2％吐温80水溶液)，一天一次(上午9时至10时)，持续4天。(吐温80是由ICISpecialty Chemcals，Wilmington，Delaware，U.S,A生产的20M聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯表面活性剂)。在处理期的最后48小时收集所有的粪便样品，并用下述的酶法测定法分析胆汁酸含量。通过比较处理的大鼠粪便胆汁酸(FBA)浓度对溶媒组大鼠的平均FBA浓度的增加，测定化合物的效力。在兔刷状缘膜囊泡(BBMV)中[3H]-牛磺胆酸盐的摄取
通过Malathi等(Biochimica Biophvsica Acta，554，259(1979)，通过引用结合到本文中)描述的钙沉淀法，从冷冻的回肠粘膜制备兔回肠刷状缘膜。测定牛磺胆酸盐的方法基本如Kramer等(BiochimicaBiophvsicaActa，1111，93(1992)，通过引用结合到本文中)所述，但测定体积用200μl代替100μl。简言之，于室温下，将190μl含有2μM[3H]-牛磺胆酸盐(0.75μCi)、20mM tris、100mM氯化钠、100mM甘露醇(pH7.4)的溶液与10μl刷状缘膜囊泡(60-120μg蛋白质)一起温育5秒钟。通过加入BBMV开始温育，同时涡流混合，通过加入5ml冰冷的缓冲液(20mM Hepes-tris，150mM氯化钾)停止反应，接着立即通过尼龙滤器(0.2μm孔)过滤，用另外5ml终止缓冲液洗涤。肝胆固醇浓度(HEPATIC CHOL)的测定
将肝组织称重并在氯仿∶甲醇(2∶1)中匀浆。匀浆和离心后，分离上清液并在氮气下干燥。使残留物溶于异丙醇中，如Allain，C.A.等(Clin.Chem.，20，470(1974)，通过引用结合到本文中)所述，采用胆固醇氧化酶和过氧化物酶的组合，酶法测定胆固醇含量。肝HMG CoA-还原酶活性(HMG CoA)的测定
通过在磷酸盐/蔗糖缓冲液中将肝样品匀浆，接着离心分离来制备肝微粒体。使最终的沉淀物质再悬浮于缓冲液中，并通过使等份液在14C-HMG-CoA(Dopont-NEN)存在下，于37℃温育60分钟，对其测定HMG CoA还原酶的活性。通过加入6N HCl停止反应，接着离心。经薄层层析分离等份的上清液，刮下板上相应于酶产物的斑点，提取并通过闪烁计数测定放射活性。(参考文献：Akerlund，J和Bjorkhem，I，(1990)J.Lipid Res.31，2159)。肝胆固醇7-α-羟化酶活性(7a-OHase)的测定
通过在磷酸盐/蔗糖缓冲液中匀浆肝样品，接着离心分离来制备肝微粒体。使最终的沉淀物质再悬浮于缓冲液中，并通过使等份液在NADPH存在下，于37℃温育5分钟，对其测定胆固醇7-α-羟化酶活性。提取到石油醚中后，蒸发有机溶剂，并使残留物溶于乙腈/甲醇中。通过将提取液的等份液注射到C18反相HPLC柱中分离酶产物，采用于240nm处的UV检测对洗脱的物质定量(参考文献：Horton，J.D等，(1994)J.Clin.Invest.93，2084)。血清胆固醇(SER CHOL、HDL-CHOL、TGI和VLDL+LDL)的测定
用购自Wako Fine Chemicals(Richmond，VA)的市售试剂盒；胆固醇Cll，目录号276-64909经酶法测定总血清胆固醇(SER.CHOL)。用Sigma Chemical Co.HDL胆固醇试剂，目录号352-3，进行VLDL和LDL沉淀(硫酸葡聚糖方法)后，用相同的试剂盒测定HDL胆固醇(HDL-CHOL)。用Sigma Chemical Co.GPO-Trinder，目录号337-B，经酶法测定总血清甘油三酯(空白的)(TGI)。以总胆固醇和HDL胆固醇之间的差异，计算VLDL和LDL(VLDL+LDL)胆固醇浓度。仓鼠粪便胆汁酸浓度(FBA)的测定
收集单独关养的仓鼠24或48小时的总粪便，在氮气流下干燥、粉碎并称量。称出约0.1g并提取到有机溶剂(丁醇/水)中。分离和干燥后，使残留物溶于甲醇中，采用3α-羟基类固醇类固醇脱氢酶与胆汁酸反应以还原NAD，来酶法测定存在的胆汁酸的量。(见Mashige，F等，Clin.Chem.，27，1352(1981)，通过引用结合到本文中)。评价降脂药的犬模型
将从出售商例如Marshall农场购得的称重为6-12kg的雄性beagle犬每日喂食一次，持续2小时，自由饮水。将这些犬随机分配到各给药组中，每组6-12只犬，例如：溶媒，i.g.，1mg/kg，i.g.；2mg/kg，i.g；4mg/kg，i.g.；2mg/kg，p.o.(在胶囊中的粉末)。可以采用管饲法经胃内给予溶于水溶液(例如，0.2％吐温80溶液[聚氧乙烯一油酸酯，Sigma，Chemical Co.，St.Louis，MO])的治疗性物质。在开始给药前，可在早晨喂食前从头静脉抽血样，以评价血清胆固醇(总胆固醇和HDL胆固醇)和甘油三酯。连续几天在早晨喂食前对动物给药。在移出任何剩余的食物前，让动物进食2小时。在研究结束时收集2天时间的粪便并分析粪便的胆汁酸含量或脂质含量。在处理期结束时也取血样，用于与研究前血清脂质水平进行比较。采用标准student’s T-检验，测定统计学的显著性(p＜.05)。犬的血清脂质测定
从禁食犬的头静脉采血到血清分离器的管(Vacutainer SST，BectonDickinson and Co.，Franklin Lakes，NJ)中。将血于2000rpm离心20分钟并倾出血清。
使用Wako酶诊断试剂盒(胆固醇CII)(Wako Chemicals，Richmond，VA)，利用胆固醇氧化酶的反应产生可经比色法测量的过氧化氢，可在96孔板中测量总胆固醇。在该板的头两列中绘制从0.5至10μg胆固醇的标准曲线。将血清样品(20-40μl，取决于预期的脂质浓度)或已知的血清对照样品一式两份加入分开的孔中。加入水以使每孔体积至100μl。将100μl等份的着色剂加入每孔中，于37℃温育15分钟后，于500nm读取该板。
用Sigma试剂盒号352-3(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)可测定HDL胆固醇，该试剂盒使用硫酸葡聚糖和Mg离子以选择性地沉淀LDL和VLDL。将150μl体积的各血清样品加入各微量离心管中，接着加入15μl HDL胆固醇试剂(Sigma 352-3)。将样品混合并于5000rpm离心5分钟。然后使50μl等份上清液与200μl盐水混合，采用如总胆固醇测量相同的方法测定。
用Sigma试剂盒号337在96孔板中测量甘油三酯。该方法将在通过甘油三酯与脂蛋白脂酶反应释放甘油后，测量甘油。使用范围1-24μg的甘油(Sigma 339-11)标准溶液，以产生标准曲线。将血清样品(20-40μl，取决于预期的脂质浓度)一式两份加入孔中。加入水以使每孔体积至100μl，将100μl的着色剂也加入每孔中。混合并温育15分钟后，于540nm读取该板，从标准曲线计算甘油三酯值。一个复份板也采用空白酶试剂进行，以校正血清样品中的任何内源性甘油。犬粪便胆汁酸的测定
可收集粪便样品，以确定每只动物的粪便胆汁酸(FBA)浓度。收集研究最后48小时期间的粪便，即在给药和喂食前每日9：00am和10：00am之间的两个连续24小时。对每只动物分开的两天收集物称重，混合并在处理器(Cuisinart)中用蒸馏水匀化，以生成均匀的淤浆。在37℃水浴中将约1.4g匀浆在终浓度50％叔丁醇/蒸馏水(2∶0.6)中提取45分钟，以2000×g离心13分钟。采用96孔酶测定体系(1，2)可测定胆汁酸浓度(mmoles/天)。将20μl等份粪便提取物加入两套各一式三份的96孔测定板的孔中。对标准化的牛磺胆酸钠溶液和标准化的粪便提取物的溶液(先前由汇合的样品制备并对其胆汁酸浓度进行了标定)也进行分析，以测定质量控制。将20微升等份的牛磺胆酸钠(系列稀释以生成标准曲线)类似地加入到两套一式三份孔的孔中。将含1M肼水合物、0.1M焦磷酸盐和0.46mg/ml NAD的230μl反应混合物加入到每孔中。然后将50μl等份3a-羟基类固醇脱氢酶(HSD；0.8单位/ml)或测定缓冲液(0.1M焦磷酸钠)加入两套一式三份测定板的一份中。所有的试剂可从Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO获得。于室温下温育60分钟后，测定340nm处的光密度，计算每套一式三份样品的平均值。光密度±HSD酶的差异被用来基于牛磺胆酸钠标准曲线确定每份样品的胆汁酸浓度(mM)。提取物的胆汁酸浓度、粪便匀浆的重量(g)和动物的体重被用来计算每只动物的相应的FBA浓度(moles/kg/天)。从每一处理组的FBA浓度减去溶媒组的平均FBA浓度(moles/kg/天)来确定FBA浓度的增加(Δ值)，作为处理的结果。兔的血浆脂质测定
通过J.R.Schuh等(J.Clin.Invest.，91，1453-1458(1993)，通过引用结合到本文中)报道的标准方法，可以测定血浆脂质。用补充有0.3％胆固醇和2％玉米油(Zeigler Bothers，Inc.，Gardners，PA)的标准食物(100g/天)喂食雄性新西兰白兔组。水可自由获得。处理1和3个月后，杀死对照组和处理组动物。取出组织，用于动脉粥样硬化损伤的特征鉴定。取血样以测定血浆脂质浓度。血桨脂质
通过从耳静脉抽血到含有EDTA的管(Vacutainer；BectonDickinson&Co.，Rutherford，NJ)中，获得用于脂质分析的血浆，接着通过离心分离细胞。采用胆固醇氧化酶反应(C.A.Allain等，Clin.Chem..，20，470-475(1974)，通过引用结合到本文中)，经酶法测定总胆固醇。在用硫酸葡聚糖与镁选择性地沉淀LDL和VLDL后，HDL胆固醇也用酶法测定(G.R.Warnick等.，Clin.Chem.，28，1379-1388(1982)，通过引用结合到本文中)。通过酶联测定法测定由脂蛋白脂酶释放的甘油的量来确定血浆甘油三酯水平(G.Bucolo等.，Clin.Chem.，19，476-482(1973)，通过引用结合到本文中)。动脉粥样硬化
通过注射戊巴比妥杀死动物。迅速取出胸主动脉，浸泡固定在10％中性缓冲的福尔马林中，用油红O(0.3％)染色。沿着相对于主动脉口的血管壁单一纵向切开后，将血管用别针翻开，以评估斑块面积。通过采用与安装于解剖显微镜上的彩色摄像机(Toshiba 3CCD)接口的真彩色图象分析仪(Videometric 150；American Innovision，Inc.，San Diego，CA)的阈值分析，从被检查的总面积和染色面积的值确定斑块覆盖的百分率。根据Folch等(J.Biol.Chem，226，497-509(1957)，通过引用结合到本文中)的方法，在用氯仿/甲醇混合物(2∶1)提取后，如所述经酶法测定组织胆固醇。体外血管应答
注射戊巴比妥钠后，迅速切开腹主动脉，并置于充氧的Krebs-碳酸氢盐缓冲液中。去除外周血管组织后，切割3-mm的环状片段，置于37℃的含Krebs-碳酸氢盐溶液的肌肉浴中，并悬于两根不锈钢线之间，其中一根连接压力传感器(Grass Instrument Co.，Quincy，MA)。对加入该浴中的血管紧张素II应答的压力变化将被记录在图形记录仪上。人血浆的CETP活性测定(氚标记胆固醇酯)
从健康志愿者中获得血液。将血液收集在含有EDTA的试管(EDTA血浆汇集物)中。将先前于-20℃贮存的EDTA人血浆汇集物于室温下解冻，离心5分钟，以除去任何颗粒的物质。将如Morton和Zilversmit (J.Biol.Chem，.256，11992-95(1981))所述在胆固醇酯部分放射标记的氚标记HDL([3H]CE-HDL)加入到血浆中，使终浓度至(25μg/ml胆固醇)。如下将抑制剂化合物加入到血浆中：通过移液管将含[3H]CE-HDL(396μl)的等体积血浆加入到微型管(Titertube，bio-Redlaboratories，Hercules，CA)。将通常溶于DMSO中作为20-50mM贮存液的化合物在DMSO(或在相同情况下的替代溶剂，如二甲基甲酰胺或乙醇)中系列稀释。然后将抑制剂化合物的系列稀释液或单独的DMSO各4μl加入每一血浆管中。立即将管中内容物混合。然后将从每一血浆管中的一式三份的等份液(100μl)转移至96孔圆底聚苯乙烯微量滴定板(Coming，Coming，NY)各孔中。用塑料薄膜密封各板，于37℃温育4小时。试验孔含有具有抑制剂化合物的稀释液的血浆。对照孔含有只具有DMSO的血浆。空白孔含有只具有DMSO的血浆，其在微型管中于4℃温育4小时，并在温育期结束时加入到微量滴定板孔中。通过将10μl沉淀试剂(1％(w/v)硫酸葡聚糖(Dextralip50)/0.5M氯化镁，pH 7.4)加入到所有孔中使VLDL和LDL沉淀。在板混合器上混合孔，然后于室温下温育10分钟。然后于10℃以1000×g离心30分钟。然后将每孔中的上清液(50μl)转移至含有250∶1的MicroscintTM-40(Packard，Meriden，CT)的PicoplateTM 96孔板(Packard，Meriden，CT)孔中。根据制造商的指示，热封该板(TopSealTM-P，Packatd，Meriden，CT)并混合30分钟。在微量板闪烁计数器(TopCount，Packard，Meriden，CT)上测定放射活性。测定作为抑制剂化合物对[3H]CE从上清液[3H]CE-HDL向沉淀的VLDL和LDL转移的抑制达50％(与在对照孔获得的转移比较)的浓度的IC50值。用下列公式确定最大转移百分率(在对照孔中)：
Figure A9981626800701
如下测定含抑制剂化合物的孔中测定的对照转移的百分率：
由％对照对抑制剂化合物的浓度绘图来计算IC50值。体外的CETP活性
采用测定放射标记的胆固醇酯([3H]CE)从HDL供体颗粒向HDL受体颗粒转移的速率的体外测定法，可评价化合物抑制CETP活性的能力。该测定法的细节由Glenn等提供。(Glenn和Melton，“胆固醇酯转移蛋白(CETP)的定量测定：A)CETP活性和B)CETP蛋白的免疫化学测定”，Meth.Enzymol.，263，339-351(1996))。从用CETP的cDNA转染的CHO细胞的无血清条件培养基可获得CETP(Wang，S等，J.BiolChem.，267，17487-17490(1992))。为测定CETP活性，将[3H]CE-标记的HDL、LDL、CETP和测定缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷，pH7.4；150mM氯化钠；2mM乙二胺-四乙酸；0.1％牛血清白蛋白)以200μl的体积在96孔板中于37℃温育2小时。通过加入50μl 1％(w/v)硫酸葡聚糖/0.5M氯化镁对LDL进行差别沉淀，经涡流混合，于室温下温育10分钟。将溶液(200μl)转移至滤板(Millipore)中。过滤后，通过液体闪烁计数测定存在于沉淀的LDL中的放射活性。通过包括不含有CETP的样品来进行对非特异性的转移或沉淀的校正。采用这种测定法的[3H]CE转移的速率与时间和CETP浓度呈线性关系，高达25-30％的[3H]CE被转移。
通过在各种浓度的试验化合物存在下，进行上述测定和确定[3H]CE从HDL向LDL转移的50％抑制所需的浓度，可以测定试验化合物的效力。该值被定义为IC50。当IC50大于10nM时，由该测定所确定的IC50值是精确的。在化合物具有更大的抑制效力的情况下，采用更长的温育时间(长达18小时)和更低终浓度的CETP(＜50nM)，可以确定IC50的精确测量值。体内CETP活性的抑制
通过经静脉内注射或经口管饲给予动物试验化合物，测定氚标记的胆固醇酯([3H]CE)从HDL至VIDL和LDL颗粒转移的量，以及将这种转移的量与从对照动物观察到的转移的量进行比较，可以测定该化合物对CETP活性的抑制。
研究前用含有0.24％胆固醇的食物谱维持雄性金黄Svrian仓鼠至少两周。对接受静脉内给药的动物，在试验前立即用戊巴比妥麻醉动物。在整个试验过程中维持麻醉。将留置导管插入颈静脉和颈动脉。试验开始时，所有的动物将接受进入颈静脉的0.2ml含[3H]CE-HDL的溶液。[3H]CE-HDL为含氚标记的胆固醇酯的人HDL的制剂，并可根据Glenn等(Meth.Enzvmol.，263，339-351(1996))的方法制备。使试验化合物溶于溶媒(2％乙醇：98％PEG 400，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)中，使成为80nM的贮存液并通过大剂量注射或通过连续输注给予。给予[3H]CE-HDL后两分钟，动物经颈静脉内注射接受0.1ml试验溶液。对照动物接受无试验化合物的0.1ml静脉内溶媒溶液。5分钟后，从颈动脉取第一份血样(0.5ml)并收集到含乙二胺四乙酸的标准microtainer管中。注射盐水以充满导管并代替血液体积。随后于2小时和4小时用同样的方法取血样。充分混合血样并于冰上保存直至试验完成。于4℃经离心血样获得血浆。用5μl沉淀试剂(硫酸葡聚糖10g/l；0.5M氯化镁)处理血浆以除去VIDL/LDL。离心后，采用液体闪烁计数器分析得到的含HDL的上清液的放射活性。
以沉淀前在等量血浆样品中获得的总放射活性为基础，计算[3H]CE从HDL向LDL和VLDL转移的百分率(％转移)。在对照动物中，从HDL向LDL和VLDL转移的量一般在4小时后为20％-35％。
或者，使清醒的、非麻醉动物经口管饲接受为在0.1％甲基纤维素的水溶液中的悬浮液的试验化合物的剂量。口服给药后，在测定每种化合物的试验物质的血浆水平达到其峰值(Cmax)时，用戊巴比妥麻醉动物，然后如上所述用进入颈静脉的0.2ml含[3H]CE-HDL的溶液给予。对照动物经口管饲接受无试验化合物的0.25ml溶媒溶液。4小时后，处死动物，收集血样，如上所述测定[3H]CE从HDL向LDL和VLDL转移的百分率(％转移)。
或者，通过给予小鼠化合物可测定试验化合物对CETP活性的抑制作用，所述小鼠已被选择经转基因操作表达人CETP(hCETP小鼠)。试验化合物可通过静脉内注射或经口管饲给予，测定氚标记的胆固醇酯[3H]CE)从HDL至VIDL和CIDL颗粒转移的量，以及与从对照动物观察到的转移的量进行比较。如Nishina等(J.Lipid Res.，31，859-869(1990))所述，在研究前用高脂肪的食物谱，例如TD88051维持C57B1/6小鼠至少两周，所述小鼠是hCETP基因纯合的。小鼠接受为在0.1％甲基纤维素的水溶液中的悬浮液的试验化合物的经口管饲剂量或静脉内大剂量的试验化合物的10％乙醇和90％聚乙二醇溶液。对照动物经口管饲或静脉内大剂量注射接受无试验化合物的溶媒溶液。在试验开始时，所有的动物接受进入尾静脉的0.05ml含[3H]CE-HDL的溶液。[3H]CE-HDL为含氚标记的胆固醇酯的人HDL的制剂，并可根据Glenn等(Meth.Enzymol.，263，339-351(1996))的方法制备。30分钟后，使动物放血，将血样收集到含乙二胺四乙酸的标准microtainer管中。充分混合血样并于冰上保存直至试验完成。于4℃经离心血样获得血浆。分离血浆，经凝胶过滤色谱分析血浆并确定[3H]CE在VLDL、LDL和HDL区域的相对比例。
以沉淀前在等量血浆样品中的总放射活性为基础，计算[3H]CE从HDL向LDL和VLDL转移的百分率(％转移)。在对照动物中，从HDL向LDL和VLDL转移的量一般在半小时后为20％-35％。肠胆固醇吸收测定
多种化合物表现出抑制肠道对胆固醇的吸收。这些化合物通过减少来自外源性来源(食物胆固醇)和内源性胆固醇(由胆囊分泌进入肠道)的胆固醇的肠道吸收，降低血清胆固醇水平。
如Turley等(J.Lipid Res.35，329-339(1994)，通过引用结合到本文中)所述，已经完善和评价了测定仓鼠的肠胆固醇吸收采用的二元-同位素血浆比率方法。
在12小时轮流明暗周期的室中，使体重80-100g的雄性仓鼠自由接近食物和水。进入照明期4小时，首先静脉给予每只仓鼠2.5μCi悬浮于Intralipid(20％)中的[1，2-3H]胆固醇，然后口服给予在中等长度链的甘油三酯(MCT)的油中的[4-14C]胆固醇。通过将0.4ml体积的Intralipid混合物注射进入远端股静脉给予静脉剂量。通过聚乙烯管经胃内管饲导入0.6ml体积的MCT油混合物给予口服剂量。72小时后给仓鼠放血，通过液体闪烁光谱测定法测定血浆中和给予的原始量的标记中的3H和14C的量。胆固醇的吸收将根据下面的等式计算：胆固醇吸收的百分率＝
Figure A9981626800731
通过用概述或具体描述的治疗性化合物或惰性成分代替上述实施例中使用的治疗性化合物或惰性成分，可实施本文的实施例。
如此描述了本发明，很明显，本发明可以以多种方式变化。这样的变化不应认为是背离本发明的精神和范围，并且对本领域技术人员来说是显而易见的所有这些修改和等同变化均打算包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的胆固醇酯转运蛋白抑制化合物的治疗性组合，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量、抗动脉粥样硬化症的有效量或抗高胆固醇血症的有效量。
2.权利要求1的治疗性组合，其中所述回肠胆汁酸转运抑制化合物具有式B-2结构：
Figure A9981626800021
或其对映体或外消旋体。
3.权利要求1的治疗性组合，其中所述回肠胆汁酸转运抑制化合物具有式B-12结构：
Figure A9981626800022
或其对映体或外消旋体。
4.权利要求1的治疗性组合，其中所述回肠胆汁酸转运抑制化合物具有式B-29结构：
Figure A9981626800031
或其对映体或外消旋体，其中PEG为约3000-约4000分子量的聚乙二醇聚合物链。
5.权利要求1的治疗性组合，其中所述回肠胆汁酸转运抑制化合物具有式B-7结构：
Figure A9981626800032
或其对映体或外消旋体。
6.权利要求1的治疗性组合，其中所述组合包括包含所述回肠胆汁酸转运抑制化合物和所述胆固醇酯转运蛋白抑制化合物的组合物。
7.一种预防或治疗高脂血症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的胆固醇酯转运蛋白抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗高脂血症的有效量。
8.一种预防或治疗动脉粥样硬化症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的胆固醇酯转运蛋白抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗动脉粥样硬化症的有效量。
9.一种预防或治疗高胆固醇血症的方法，包括将单位剂量形式的组合给予需要此种治疗的患者，其中所述组合包括第一个量的回肠胆汁酸转运抑制化合物和第二个量的胆固醇酯转运蛋白抑制化合物，其中所述第一个量和所述第二个量一起组成所述化合物的抗高胆固醇血症的有效量。
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