EP1981553A2 - Kleber für medizinische anwendungen und mittel zur blutstillung - Google Patents

Kleber für medizinische anwendungen und mittel zur blutstillung

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EP1981553A2
EP1981553A2 EP07711497A EP07711497A EP1981553A2 EP 1981553 A2 EP1981553 A2 EP 1981553A2 EP 07711497 A EP07711497 A EP 07711497A EP 07711497 A EP07711497 A EP 07711497A EP 1981553 A2 EP1981553 A2 EP 1981553A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
adhesive
kit
dihydroxyaromatics
zeolite granules
individual components
Prior art date
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EP07711497A
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English (en)
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Andreas Werner Speitling
Philip Procter
Joachim Schomburg
Christian Schultz
Wolf-Dieter JÜLICH
Ulrike Lindequist
Frieder Schauer
Anett Mikolasch
Katrin Manda
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Stryker European Holdings I LLC
Original Assignee
Stryker Trauma GmbH
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Publication date
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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • the invention relates to adhesives for medical applications and agents for hemostasis.
  • the invention relates to a kit for producing an adhesive which is suitable for bonding together hard and soft tissues, sealing wounds, and the adhesive itself and its uses in the medical field.
  • the kit or the associated adhesive comprises, as individual components, substrates of polyphenol oxidase and polyphenol oxidases as such.
  • the invention is directed to new hemostyptics, as well as to the combined use of hemostyptics and adhesives in wound closure.
  • EP 0 947 142 discloses increasing the molecular weight of proteins by their cross-linking by multi-copper enzymes. The described increase in the molecular weight of the substrate proteins occurred after 17 hours of incubation.
  • the proteins crosslinked by means of the method according to EP 0 947 142 are particularly suitable for use in foods, e.g. to change the consistency of sausage. Cross-linking of proteins by substituted dihydroxyaromatics is not disclosed in EP 0 947 142.
  • microporous biopolymers or biopolymers with a large internal surface These absorb water, resulting in a concentration of blood cells and coagulation factors.
  • Polysaccharides which consist of poly-N-acetyl-glucosamines or chitosan have proved to be particularly advantageous. These are included, for example, in the skeleton of insects, but also in algae.
  • Biopolymers such as gelatin, collagen, fibrin sponges or oxidized cellulose have a large internal surface area. Due to the absorption to this large area, a concentration of coagulation factors occurs.
  • the aluminosilicate synthesis products hitherto used for haemostasis are alkali metal and alkaline earth aluminum silicates of different composition
  • Synthetic lithium aluminosilicates (EP 1176991 A1, WO 00/69480) have been developed especially for wound care and are sold under the trade name CERDAC.
  • CERDAC Synthetic lithium aluminosilicates
  • the present problem now is to solve the problems mentioned in the prior art by products which have efficient adhesive properties for hard and soft tissue.
  • systems such as adhesives, should be provided, which make it possible to quench severely bleeding wounds and / or to connect bone parts to each other or to bone sections with implants.
  • adhesives that allow soft tissue to be associated with bone, such as cartilage grafts.
  • the possibilities for wound closure found should preferably also be transferable to chronic and infected wounds.
  • the finding of the present invention is that polymers which have at least one free amino group can be crosslinked by means of bridge molecules using (lignolytic) polyphenol oxidases to form covalent bonds with one another and / or with the body's own tissue and thus can be used as hard and soft tissue adhesives.
  • a further finding of the present invention is that specifically prepared natural zeolites cause rapid hemostasis.
  • the present invention is directed in a first embodiment to a kit which comprises the following individual components: a) polymers having at least one free amino group, b) bridging molecules selected from the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics , polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatics, bicyclic trihydroxyaromatics, polycyclic trihydroxyaromatics, and mixtures thereof, and c) polyphenol oxidases, in particular lignolytic polyphenol oxidases, the two individual components (components b) and c)), ie the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics , polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatic
  • Bridge molecules are not in contact with the polyphenol oxidases, particularly lignolytic polyphenol oxidases.
  • a kit is understood to mean, in particular, a packaging which makes it possible to store the individual components next to one another in such a way that they are not in contact.
  • at least the bridging molecules (component b)) must be separated from the (lignolytic) polyphenol oxidases (component c)), so that an early and undesired reaction is avoided. Consequently, a mixture of components a) and b) and / or components a) and c) is possible.
  • both individual components can preferably be stored in different vessels or chambers. This also applies to the case if one or both of the individual components b) and c) is mixed with the polymer a).
  • a syringe is conceivable which makes it possible to deliver the two individual components, ie the bridge molecules and the (lignolytic) polyphenol oxidases, separately from one another via two cannulas. It is preferred that the two individual components, ie the bridge molecules and the (lignolytic) polyphenol oxidases, are present in the syringe in different chambers.
  • the kit comprises at least two syringes, one containing the bridge molecules and the other the (lignolytic) polyphenol oxidases.
  • the kit is a two-component syringe, preferably already with an attached mixing extruder. This allows a particularly accurate dosage and easy handling.
  • kits comprises as individual component a) polymers which contain at least one free amino group.
  • free amino group in the present invention is meant an amino group which is not part of the polymer chain but represents a residue of the polymer chain. After these polymers are present in the kit, they are not part of the human body.
  • the polymers are preferably polymers which comprise more than one amino group, ie polymers containing amino groups, such as peptides.
  • the peptides ie in oligopeptides and proteins
  • the peptides are lysine-containing.
  • lysine-containing oligopeptides are used. It is also conceivable that the peptide is collagen.
  • the polymer is a peptide
  • the compound formed by reaction of the components is biodegradable.
  • peptide sequences that contain the amino acids relevant for an adhesive effect By linking peptide sequences that contain the amino acids relevant for an adhesive effect, a very strong bond is formed, which can however be absorbed in the course of the healing process.
  • the initial hardening phase, combined with high adhesive properties, and the time-dependent slow absorption in the body in advanced healing processes are of particular advantage, since in the splice increasingly endogenous tissue is incorporated.
  • the peptide used is both an oligopeptide (2 to about 100 amino acids in length, preferably about 4 to about 20 amino acids in length or about 6 to about 10 amino acids in length) and a protein (protein, about 100 up to about 5000 amino acids in length, preferably 100-1000 or 100-200 amino acids in length).
  • the peptide has a length of 10-1000 amino acids.
  • the peptide may have a molecular weight of about 1 to about 100 or about 200 kDa, more preferably about 2 to about 50 kDa, or about 5 to about 20 kDa. It may be modified or substituted, e.g. glycosylated.
  • modified or atypical amino acids such as hydroxyoxy may also be present in the oligopeptide.
  • D-amino acids instead of or in addition to L-amino acids is possible and slows down the degradation of the peptide.
  • the amino groups may preferably be primary or secondary amino groups. However, especially reactive are primary amino groups. At least one of the reactive groups of the peptide is preferably part of a diamino acid, eg from lysine.
  • the peptide therefore preferably comprises at least one diamino acid, preferably at least 2, 3, 4, 5 or more diamino acids.
  • lysine-containing peptides oligopeptides or proteins are used.
  • amino acids such as arginine, asparagine, glutamine or histidine, carry reactive amino groups that can react with the dihydroxyaromatic.
  • the amino groups are particularly suitable for the crosslinking reaction between peptide and bridging molecule.
  • hydroxyl groups or mercapto groups in the peptide may also contribute to the crosslinking reaction.
  • the peptide therefore preferably comprises at least one amino acid with a hydroxyl group, ie in particular serine, threonine or tyrosine or a mercapto group, e.g. Cysteine.
  • Hydroxylysine or polyphenolic amino acid building blocks, as present in the MAPs can also be present in the peptides used according to the invention.
  • an advantage of the present invention is that the presence of these specific amino acid building blocks and thus the use of MAPs is not absolutely necessary. Therefore, in a preferred embodiment, the polymer is free of polyphenolic amino building blocks, i. free from MAPs.
  • the peptides used can therefore be e.g. be made recombinantly without further ado.
  • the crosslinking resulting from reaction of the bridging molecules with the peptide also depends on how high the proportion of available reactive groups in the peptide is.
  • Good adhesive properties can be achieved from a proportion of amino acids of the peptide carrying a reactive amino group (eg diamino acids such as lysine) of at least 10%.
  • the proportion of polymer structure elements carrying an amino group is preferably at least about 10%. Even more preferably, however, the proportion of these amino acids or structural elements is higher, at least 20%, at least 30%, at least 40 or at least 50% or even at least 80 to 100%.
  • Naturally occurring peptides and proteins, eg albumin or casein can be used, for example MAPs are particularly suitable.
  • amino acids of the peptide are lysine.
  • Lysine and another amino acid can e.g. be arranged as a repeating dipeptide unit.
  • a different sequence or the inclusion of other amino acids in particular arginine, asparagine, glutamine or histidine (instead of lysine or in addition), serine or threonine (instead of tyrosine or in addition), of cysteine or other amino acids is possible.
  • a length of the peptide of about 10-20 amino acids or a mixture of peptides of different chain length is particularly preferred.
  • nj values between 5 and 40, such as 5, 10 or 20 can assume.
  • kit comprises bridging molecules which cause crosslinking of polymers having at least one free amino group (such as diamino acids) as defined above.
  • substituted dihydroxyaromatics and / or substrates of the (lignolytic) polyphenol oxidases, such as laccases, are suitable as bridging molecules.
  • monocyclic ortho-dihydroxyaromatics monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics, polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatic, polycyclic Dihydroxyaromaten, bicyclic Trihydroxyaromaten, polycyclic Trihydroxyaromaten, or their mixtures used.
  • the hydroxyaromatic compounds according to the invention are not part of a polymer chain.
  • aromatics are further substituted.
  • Preferred functional groups are substituents selected from the group consisting of halogen, sulfo, sulfonic, sulfamino, sulfanyl, amino, amido, azo, imino and hydroxy. It is observed in particular that substituted aromatics, in particular substituted dihydroxyaromatics, surprisingly have particularly favorable polymerization properties, in particular a rapid polymerization, a lower self-coupling and a good strength of the bond is achieved. A suitable substitution of the aromatics can even lead to monohydroxyaromatics being suitable for crosslinking as bridging molecule. Substituted means in the context of this invention, in particular, that in addition to the hydroxyl groups 1, 2, 3 or 4 further radicals are attached to the aromatic compounds. On the other hand, monohydroxylated biaryl compounds are also suitable.
  • n 0-10, preferably 0 or 1, in particular 0,
  • Alkyl means branched or unbranched aliphatic hydrocarbon chains, preferably of 1-20, more preferably 1-6 carbons, e.g. Methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, n-pentyl, n-hexyl
  • the phenyls of the formula 5 may be substituted, for example in the ortho position to an OH group with CH 3 , CHO, COCH 3 , CONH 2 , CON-alkyl, CON-alkyl-OH, COOH, COO-alkyl, alkyl, substituted aromatic, in particular CON-alkyl or COO-alkyl, and / or in the metha position to an OH group with CH 3 , alkyl, substituted aromatic, in particular CH 3 .
  • kits comprise as further individual component polyphenol oxidases, such as lignolytic polyphenol oxidases, in particular laccase (EC 1.10.3.2).
  • Laccases are known in the art. They can be derived from plants, fungi, bacteria or insects or derived from natural enzymes. The laccases used in the invention may be recombinantly produced or purified. In this case, a particular purity of the laccase is generally not required, given if supernatants lignolytic fungi can be used. For medical applications, however, is a significant separation of microbiological substances such as
  • laccases from the genera Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Coprinus, Psatyrella, Myceliophthora, Schtalidium, Polyporus, Phlebia or Coriolus.
  • laccases are disclosed, for example, in EP 0 947 142.
  • the kit is characterized in particular by the fact that the adhesive reaction is not restricted to specific naturally occurring peptides acting as a bridging molecule, but rather to a broad spectrum of bridging molecules, on the one hand, and of peptides, such as oligopeptides or proteins, on the other hand, can be used.
  • kits pre-optimized in proportions appropriate to the particular use.
  • the combination used in the kit may contain other additives and adjuvants, e.g. Fillers such as collagen, albumin, hyaluronic acid or the like.
  • Fillers such as collagen, albumin, hyaluronic acid or the like.
  • the total amount of single component a), such as peptide, and bridging molecule is about 50-90%.
  • the essential components of the kit are preferably dissolved with one or more aqueous solvents.
  • the solvent is non-toxic and biocompatible.
  • Preferred as a solvent for biological applications is a phosphate buffer such as
  • Calcium phosphate or sodium phosphate buffer or PBS may also be an organic solvent such as DMSO or a mixture of an aqueous and an organic solvent.
  • organic solvent such as DMSO or a mixture of an aqueous and an organic solvent.
  • the combination or its components can only be included in the solvent prior to use and introduced into the kit.
  • the consistency of the components used in the kit does not have to be liquid, but may have a pasty consistency.
  • the viscosity and flowability of the individual components used can be adjusted depending on, for example, the length of the wound to be fixed and the wound gap depth or the substrates to be bonded. In addition to the length of the peptides / polymers used, the amount of solvent also has an influence on these parameters. Also additives such as thixotropic agents can be used to adjust viscosity and flowability be used. Typically, for bonding hard tissue, a combination of higher viscosity is used than for gluing soft tissue.
  • the pH is preferably 2-10, especially 5-7.
  • the reaction can proceed at about 2-80 ° C, but preferably a temperature of about 20-37 ° C or 25-3O 0 C.
  • the adhesive reaction can be carried out using a kit at room temperature / body temperature.
  • the (lignolytic) polyphenol oxidase such as laccase
  • Sterilization of the kit or its individual components can advantageously be achieved without structural change. It is possible, e.g. a sterile filtration of solutions. However, sterilization by way of gamma radiation is preferred since it can already be packed and therefore no aseptic filling is necessary. The loss of activity of the (lignolytic) polyphenol oxidase, such as laccase, by the gamma sterilization, which can be up to 50%, can be easily compensated by a correspondingly higher starting concentration.
  • the above-defined kit is used as a medicament.
  • the present invention relates to an adhesive with the individual components described above. Consequently, the adhesive comprises the following individual components: a) polymers having at least one free amino group, where the polymers are not part of the human body, b) bridging molecules selected from the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para
  • Dihydroxyaromatics bicyclic monohydroxyaromatics, polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatics, bicyclic trihydroxyaromatics, polycyclic trihydroxyaromatics, and mixtures thereof, and c) polyphenol oxidases, in particular lignolytic polyphenol oxidases, wherein the two individual components (components b) and c)), i. the bridging molecules are in contact with the polyphenol oxidases, in particular the lignolytic polyphenol oxidases, i. are mixed together.
  • the adhesive comprises as individual component a) polymers which contain at least one free amino group.
  • free amino group in the present invention is meant an amino group which is not part of the polymer chain but represents a residue of the polymer chain.
  • the polymers of the adhesive are polymers that are not part of the human body are.
  • the polymers are polymers comprising more than one amino group, ie, amino group-rich polymers such as peptides.
  • the peptides are lysine-containing.
  • lysine-containing oligopeptides are used. It is also conceivable that the peptide is collagen.
  • the polymer is a peptide
  • the compound formed by reaction of the components is biodegradable.
  • Amino acids contain, creates a very strong bond, but which can be absorbed in the course of the healing process.
  • the initial hardening phase, combined with high adhesive properties, and the time-dependent slow absorption in the body in advanced healing processes are of particular advantage, since in the splice increasingly endogenous tissue is incorporated.
  • the peptide used is both an oligopeptide (2 to about 100 amino acids in length, preferably about 4 to about 20 amino acids in length or about 6 to about 10 amino acids in length) and a protein (protein, about 100 up to about 5000 amino acids in length, preferably 100-1000 or 100-200 amino acids in length).
  • the peptide has a length of 10-1000 amino acids.
  • the peptide may have a molecular weight of about 1 to about 100 or about 200 kDa, more preferably about 2 to about 50 kDa, or about 5 to about 20 kDa. It may be modified or substituted, e.g. glycosylated.
  • modified or atypical amino acids such as hydroxyoxy may also be present in the oligopeptide.
  • D dioethylated amino acids
  • the amino groups may preferably be primary or secondary amino groups. However, especially reactive are primary amino groups. At least one of the reactive groups of the peptide is preferably part of a diamino acid, for example of lysine.
  • the peptide therefore preferably comprises at least one diamino acid, preferably at least 2, 3, 4, 5 or more diamino acids.
  • lysine-containing peptides oligopeptides or proteins are used.
  • amino acids such as arginine, asparagine, glutamine or histidine, carry reactive amino groups that can react with the dihydroxyaromatic.
  • amino groups in particular the amino groups provided by the diamino acid, are responsible for the crosslinking reaction between peptide and
  • hydroxyl groups or mercapto groups in the peptide may also contribute to the crosslinking reaction.
  • the peptide therefore preferably comprises at least one amino acid with a hydroxyl group, ie in particular serine, threonine or tyrosine or a mercapto group, e.g. Cysteine.
  • Hydroxylysine or polyphenolic amino acid building blocks, as present in the MAPs can also be present in the peptides used according to the invention.
  • an advantage of the present invention is that the presence of these specific amino acid building blocks and thus the use of MAPs is not absolutely necessary. Therefore, in a preferred embodiment, the polymer is free of polyphenolic amino building blocks, i. free from MAPs.
  • the peptides used can therefore be e.g. be made recombinantly without further ado.
  • the crosslinking resulting from reaction of the bridging molecules with the peptide also depends on how high the proportion of available reactive groups in the peptide is.
  • Good adhesive properties can be achieved from a proportion of amino acids of the peptide carrying a reactive amino group (eg diamino acids such as lysine) of at least 10%.
  • the proportion of polymer structural elements bearing an amino group is preferably at least about 10%. Even more preferably, however, the proportion of these amino acids or structural elements is higher, at least 20%, at least 30%, at least 40 or at least 50% or even at least 80 to 100%.
  • Naturally occurring peptides and proteins, eg albumin or casein can be used, for example MAPs are particularly suitable.
  • amino acids of the peptide are lysine.
  • Lysine and another amino acid can e.g. be arranged as a repeating dipeptide unit.
  • a different sequence or the inclusion of other amino acids in particular arginine, asparagine, glutamine or histidine (instead of lysine or in addition), serine or threonine (instead of tyrosine or in addition), of cysteine or other amino acids is possible.
  • a length of the peptide of about 10-20 amino acids or a mixture of peptides of different chain length is particularly preferred.
  • these are polymers consisting exclusively of two amino acids, for example (lysine-tyrosine) n , where n values between 5 and 40, such as 5, 10 or 20, can be assumed.
  • the adhesive comprises bridging molecules which cause crosslinking of polymers having at least one free amino group (such as diamino acids) as defined above.
  • substituted dihydroxyaromatics and / or substrates of the (lignolytic) polyphenol oxidases, such as laccases are suitable as bridging molecules. Accordingly, monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics, polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatics, bicyclic trihydroxyaromatics, polycyclic trihydroxyaromatics or mixtures thereof are used. In contrast to the known shell adhesives, the hydroxyaromatic compounds according to the invention are not part of a polymer chain.
  • aromatics are further substituted.
  • Preferred functional groups are substituents selected from the group consisting of halogen, sulfo, sulfonic, sulfamino, sulfanyl, amino, amido, azo, imino and hydroxy. It is observed in particular that substituted aromatics, in particular substituted dihydroxyaromatics, surprisingly have particularly favorable polymerization properties, in particular a rapid polymerization, a lower self-coupling and a good strength of the bond is achieved. A suitable substitution of the aromatics can even lead to monohydroxyaromatics being suitable for crosslinking as bridging molecule. Substituted means in the context of this invention, in particular, that in addition to the hydroxyl groups 1, 2, 3 or 4 further radicals are attached to the aromatic compounds. On the other hand, monohydroxylated biaryl compounds are also suitable.
  • n 0-10, preferably 0 or 1, in particular 0,
  • Ri OH or NH 2 or Hal, preferably OH, Cl or Br, in particular OH,
  • R 2 H, CH 3 , CHO, COCH 3 , CONH 2 , CON-alkyl, CON-alkyl-OH, COOH, COO-
  • Alkyl alkyl, substituted aromatic, in particular CON-alkyl or COO-alkyl, and
  • R 3 H, CH 3 , alkyl, substituted aromatic, especially H or CH 3 .
  • Alkyl means branched or unbranched aliphatic hydrocarbon chains, preferably of 1-20, more preferably 1-6 carbons, e.g. Methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, n-pentyl, n-hexyl
  • the phenyls of the formula 5 may be substituted, for example in the ortho position to an OH group with CH 3 , CHO, COCH 3 , CONH 2 , CON-alkyl, CON-alkyl-OH, COOH, COO-alkyl, alkyl, substituted aromatic, in particular CON-alkyl or COO-alkyl, and / or in the metha position to an OH group with CH 3 , alkyl, substituted aromatic, in particular CH 3 .
  • the adhesive comprises, as a further individual component, polyphenol oxidases, such as lignolytic polyphenoloxydases, in particular laccase (EC 1.10.3.2).
  • Laccases are known in the art. They can be derived from plants, fungi, bacteria or insects or derived from natural enzymes. The laccases used in the invention may be recombinantly produced or purified. In this case, a particular purity of the laccase is generally not required, given if supernatants lignolytic fungi can be used. For medical applications, however, is a significant separation of microbiological substances such as
  • laccases from the genera Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fontes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Coprinus, Psatyrella, Myceliophthora, Schtalidium, Polyporus, Phlebia or Coriolus.
  • laccases from the genera Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fontes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Coprinus, Psatyrella, Myceliophthora, Schtalidium, Polyporus, Phlebia or Coriolus.
  • laccases from the genera Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fontes, Lentinus, Pleu
  • the adhesive is characterized in particular by the fact that the adhesive reaction is not restricted to specific naturally occurring peptides acting as a bridging molecule, but rather to a broad spectrum of bridging molecules, on the one hand, and of peptides, such as oligopeptides, or proteins, on the other hand, can be used.
  • the adhesive can be adapted to the respective specific task by the optimization of the quantity ratios to be carried out in preliminary tests.
  • the constituents of the adhesive are present in a previously optimized ratio which is appropriate for the particular use.
  • the combination used in the adhesive may contain other additives and adjuvants, e.g. Fillers such as collagen, albumin, hyaluronic acid or the like.
  • Fillers such as collagen, albumin, hyaluronic acid or the like.
  • the total amount of single component a), such as peptide, and bridging molecule is about 50-90%.
  • the essential components of the adhesive are preferably dissolved with one or more aqueous solvents.
  • the solvent is non-toxic and biocompatible.
  • Preferred as a solvent for biological applications is a phosphate buffer such as
  • Calcium phosphate or sodium phosphate buffer or PBS may also be an organic solvent such as DMSO or a mixture of an aqueous and an organic solvent.
  • organic solvent such as DMSO or a mixture of an aqueous and an organic solvent.
  • the combination or its components can only be included in the solvent prior to use.
  • the consistency of the individual components of the adhesive used need not be liquid, but may have a pasty consistency.
  • the viscosity and flowability of the individual components used and / or of the adhesive can be adjusted depending on, for example, the length of the wound to be fixed and the wound gap depth or the substrates to be bonded. In addition to the length of the peptides / polymers used, the amount of solvent also has an influence on these parameters. Also additives such as thixotropic agents can be used to adjust of viscosity and flowability can be used. Typically, for bonding hard tissue, a combination of higher viscosity is used than for gluing soft tissue.
  • the pH is preferably 2-10, especially 5-7.
  • the reaction may proceed at about 2-80 ° C, but is preferably a temperature of about 20-37 ° C or 25-30 0 C.
  • the adhesive reaction can be carried out by means of adhesive at room temperature / body temperature.
  • the (lignolytic) polyphenol oxidase such as laccase
  • a sterilization of the adhesive or its individual components can be advantageously achieved without structural change. It is possible, e.g. a sterile filtration of solutions. However, sterilization by way of gamma radiation is preferred since it can already be packed and therefore no aseptic filling is necessary.
  • the loss of activity of the lignolytic) polyphenol oxidase, such as laccase, by the gamma sterilization, which can be up to 50%, can be easily compensated by a correspondingly higher starting concentration.
  • the above-defined adhesive is used as a medicament.
  • Classification as a pharmaceutical preparation or as a medical device is also possible, depending on national law. These terms are interchangeable for the purposes of describing the invention.
  • the uses of the kit and adhesive according to the invention are explained in more detail below.
  • a finding of the present invention is that by means of bridging molecules using (lignolytic) polyphenol oxidases, such as laccase, with formation of covalent bonds with polymers containing at least one free
  • the present invention is directed to the use of a kit as defined above for sealing wounds.
  • the kit or the adhesive has only the individual components b) and c) to cause sticking of wounds or the like, as described below.
  • the present invention is also directed to the use of a kit comprising the individual components a) bridging molecules selected from the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic
  • Monohydroxyaromatics polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatics, bicyclic trihydroxyaromatics, polycyclic trihydroxyaromatics, and mixtures thereof, and b) polyphenol oxidases, especially lignolytic ones
  • Polyphenol oxidases the two individual components (components a) and b)), i. the bridge molecules are not in contact with the polyphenol oxidases, in particular lignolytic polyphenol oxidases, for the preparation of an adhesive for
  • kits or an adhesive is understood as meaning a kit or an adhesive comprising the two individual components “bridge molecules” and “polyphenol oxidases” or the three individual components “polymers having at least one free amino group", “bridging molecules” and “polyphenol oxidases”. comprises, wherein a kit or an adhesive with the three individual components just mentioned is preferred.
  • the kit and / or adhesive can be used to glue hard or soft tissue.
  • connective tissue, skin, tendon, organ, blood vessel and / or nerve (soft tissue) and / or tooth and / or bone (hard tissue) may be adhered.
  • various tissues can be glued together, e.g. Tendons and bones.
  • a particularly preferred application is in the bonding of wound edges or in the adhesion of ruptures of various organs, such as liver, kidney or spleen.
  • the care of surgically placed wounds e.g. after the removal of tumors, is possible with the kit and / or adhesive according to the invention.
  • Further fields of use are in plastic, reconstructive and / or cosmetic surgery, in particular for preventing the formation of scars, which is induced when suturing wounds
  • kits and / or adhesive are flexible, over a certain time resorbable sealing of anastomoses and patches on vessels or on hollow organs.
  • the kit and / or adhesive is also suitable for the fixation of drug-delivery devices and porous support structures or membranes for potential use in regenerative medicine (tissue engineering).
  • a bond can also be made with surfaces of non-biogenic origin, provided they carry free amino groups.
  • Free amino groups can be obtained on such surfaces of non-biogenic origin by processes known in the art, eg plasma processes (Schröder, et al., Im proved low-pressure plasma-assisted amino functionalization of polymers, Weinheim, Germany, Weinheim: Wiley-VCH, 2005; Schröder et al., Plasma-Induced Surface Functionalization of Polymeric Biomaterials in Ammonia Plasma, Contrib. Plasma Phys. 41, 2001, 562-572; Meyer-Plath et al, Current trends in biomaterial surface functionalization - nitrogen-containing plasma-assisted processes with enhanced selectivity, Vacuum 71, 2003, 391-406).
  • the surfaces e.g. implants or drug-delivery devices to be attached to the kit and / or adhesive to surrounding tissue should have a content of at least about 2% free amino groups.
  • the term surface describes not only flat surfaces, but boundary layers of a solid substrate in any shape. Substrates can thus e.g. also be beads or complex shaped surfaces.
  • the invention likewise relates to an adhesive method that can be used in an aqueous environment using the above-mentioned kit and / or adhesive, which leads to a solid, crosslinked resorbable compound.
  • a solid compound is formed by a (lignolytic) polyphenol oxidase-induced, such as laccase-induced, crosslinking via free amino acid-carrying polymers and bridging molecules, as defined above.
  • the invention relates to the method of bonding soft and hard tissue through a kit and / or adhesive as defined above.
  • the bonding of soft and hard tissue can be, among other things, the bonding of bone to bone.
  • kits and / or adhesive according to the invention small bony fragments, which can not be fixed with screws because of their size or only insufficiently, are fixed with the kit and / or adhesive according to the invention.
  • no second operation after healing of the fracture is required in the bonding by means of the kit and / or adhesive according to the invention.
  • bones can be fixed to soft tissue.
  • Cartilage grafts (e.g., from tissue culture), e.g. for the treatment of osteoarthritis, can be sufficiently fixed by means of the kit and / or adhesive according to the invention until it grows on the articular surface. It is particularly advantageous in this context that the kit and / or adhesive is gradually absorbed.
  • bones can also be fixed to implants by means of the kit and / or adhesive according to the invention. Especially with osteoporotic bone, the holding power of screws is very reduced. By a large-area bonding of the outside of the bone with the implant (for example plate) by means of the kit and / or adhesive according to the invention, the holding force of the screws can be supported or screws can even be completely dispensed with. Cell vitality studies revealed good biocompatibility of the crosslinked product.
  • the invention also encompasses in particular the use of the kit according to the invention, either with the two individual components “bridging molecules” and “polyphenol oxidases” or particularly preferably with the three individual components “polymers with at least one free amino group",
  • the invention also includes, in particular, the use of the kit according to the invention for the production of the adhesive for the bonding of soft and hard tissue as well as the bonding of bone with implants (eg plate), as described above.
  • Crosslinking by means of the combination according to the invention, in particular the linking of peptide sequences which contain the amino acids relevant for an adhesive action, with the aid of the enzyme system (lignolytic) polyphenol oxidase, such as laccase, produces a very strong bond in various fields of use, but in the course of the healing process can be absorbed.
  • the initial hardening phase, combined with high adhesive properties, and the time-dependent slow absorption in the body in advanced healing processes are of particular advantage.
  • the adhesive or kit can be used for bone fractures, for fixation of vascular prostheses, biodegradable implants, catheters, stents and other materials.
  • the invention also encompasses the use of the kit according to the invention, either with the two individual components "bridging molecules” and “polyphenol oxidases” or particularly preferably with the three individual components “polymers having at least one free amino group", “bridging molecules” and “polyphenol oxidases” as defined above for the preparation of an adhesive for bonding fractures and / or for fixation of vascular prostheses, biodegradable implants, catheters, stents and other materials.
  • the acceptance of the implanted material by the bone cells is of fundamental importance.
  • this also applies to the adhesive used. Due to the rapid colonization with osteoblasts and their subsequent maturation promotes new bone formation and shortens the healing process. Implants are therefore manufactured with microstructured surfaces.
  • the kit or adhesive according to the invention preserves this structure and supports the formation of new bone.
  • collagen which is indispensable for bone healing, the amino acids lysine and proline are necessary.
  • (lysine-tyrosine) n used as a polymer.
  • lysine is present at the splice site in high concentration. This results in a positive influence on bone formation.
  • the extracellular matrix formed is recognized by integrins such as ⁇ l ⁇ 1 or ⁇ 3 ⁇ 1 from the RDG sequence (Arg-Gly-Asp). This initiates a signal cascade that triggers changes in the cytoskeleton in the cell and switches between the proliferative stage and the stage of differentiation.
  • the protein matrix formed also serves to store calcium salts.
  • the invention is directed to novel zeolite granules which are suitable for haemostasis and can be used singly or supplementarily in the kit according to the invention.
  • the novel zeolite granules in particular achieve a rapid bonding of wound edges.
  • the novel zeolite granules are zeolite granules which have at least 70% by weight of zeolite, in particular with fractions of clinoptilolite, chabazite and mordenite, and a micropore space with an average pore size of 0.3 to 0.5 nm.
  • these are zeolite granules hydrate-free, this state is preferably achieved after drying and pre-crushing by a gentle dehydration at temperatures below 200 ° C. In the case of gentle dehydration, in particular different temperature intervals below 200 ° C are used.
  • Particular preference is given to using zeolite granules which originate from the fraction with grain size 0.8-0.2 mm.
  • the present invention also encompasses the zeolite granules according to the invention as a medical device or as a medicament and the use of the zeolite granules according to the invention for producing a medical device and / or a medicament for haemostasis.
  • classification as a pharmaceutical preparation or as a medical device, depending on national law, is possible.
  • Mineral substance can be completely removed in, for example, by detachment of the scab-like wound cover and suction of the residues. It is possible in this embodiment of the invention to coat the zeolites in an envelope e.g. based on cellulose or on a textile basis or based on a collagen fleece. Thus, the subsequent complete removal is particularly easy.
  • the invention also encompasses the use of the zeolite granules according to the invention for producing the adhesive according to the invention for bonding wounds and for sealing anastomoses and patches on vessels or on hollow organs.
  • the tear strength of the wound closure is lower than with conventional fibrin adhesives.
  • the present invention is directed in a further embodiment to a kit which comprises the following individual components: a) polymers having at least one free amino group, b) bridging molecules selected from the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics , polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic dihydroxyaromatics, bicyclic trihydroxyaromatics, polycyclic trihydroxyaromatics, and mixtures thereof, c) polyphenol oxidases, in particular lignolytic polyphenol oxidases, and d) hemostatic minerals, in particular zeolite granules as described above, where the group consisting of monocyclic ortho-dihydroxyaromatics, monocyclic para-dihydroxyaromatics, bicyclic monohydroxyaromatics , polycyclic monohydroxyaromatics, bicyclic dihydroxyaromatics, polycyclic di
  • the kit is based in particular on natural zeolite fine granules and on polyphenol oxidases (in particular laccase) with which the poly- or oligopeptides can be crosslinked.
  • the natural zeolite fine granules are not in contact with the other individual components of the kit, ie it is preferred that the zeolites are separately packaged and thus used separately.
  • the natural zeolite fine granules ensure concentration due to their high capillary power of coagulation factors for rapid wound closure. Thereafter, the zeolites can be easily removed again. A blood-free, clear surgical field is obtained.
  • a further advantage is that correction possibilities, for example before the addition of the uncrosslinked polymers - if desired - still exist.
  • the kit of the invention is an alternative to both electrocoagulation and wound closure with needle and suture.
  • the present invention also encompasses the use of the kit according to the invention, which comprises the individual components b) to d) or more preferably a) to d), for the production of an adhesive for the closure of wounds.
  • the invention also includes, in particular, the use of the kit according to the invention, which comprises the individual components b) to d) or more preferably a) to d), for the production of the adhesive for the bonding of soft and hard tissue and the bonding of bones with implants (eg plate) as described above.
  • the present invention is also directed to an adhesive comprising components b) to d) or more preferably a) to d), as described above, wherein at least components b) to c) or a) to c) , Preferably all individual components b) to d) or a) to d), are in contact with each other.
  • the high capillary force of the natural zeolite fine granules is also of particular importance for use in wound care, in particular for the treatment of wounds that are difficult to heal and have already become chronic. Particularly indicated is the use of the natural zeolite fine granules, in wounds with an exudation, ie a leakage of blood components to an inflamed wound. Often, exudation is an indication of infection from an injury.
  • the microporous structure of the zeolite granules obtained according to the invention enables the uptake of wound exudate to be released in excess in the case of "weeping" wounds a moist atmosphere over the wound, which is important for wound healing.
  • zeolites with a pore size of 0.3 to 0.5 nm, in particular in a ratio of 1:10 to 10: 1 can be mixed with the biomass from aquatic organisms, as defined below, without haemostatic action or capillary action to lose.
  • the use of the novel zeolite granules can be extended by substituting these materials with biomass. Consequently, the present invention also encompasses the zeolite granules according to the invention which additionally contain biomass, in particular in the ratio of zeolite to biomass of from 1:10 to 10: 1.
  • the biomass is lyophilized and ground and / or according to the technical teaching of Lukowski et al .: Pharmaceutically or cosmetically active agents obtained from lipid-containing marine organisms. US 10 / 507,061 is processed.
  • Polysaccharides advantageously of poly-N-acetyl-glucosamines or chitosan, have a large internal surface area. Due to absorption to this large area, there is a synergistic effect in the concentration of coagulation factors as well as in the uptake of wound secretions as well as bacterial toxins. In addition, these polysaccharides have an immunostimulating effect.
  • freeze-dried biomasses of the green alga Chlamydomonas and / or the microalgae Spirulina and / or Anabaena are used.
  • activation of the fibrin system results in a solid scab-like covering that reliably protects the wound from bacterial infection. This cover is repelled in the course of wound healing.
  • the fine granules of natural zeolites and microalgae biomass can also be used to treat highly infectious, weeping wounds.
  • kit and / or adhesive may contain the inventive combination of zeolite granules and biomass in all embodiments described in detail above.
  • Example 1 Preparation of the natural zeolite fine granules
  • Selective minerals with> 70% zeolite content preferably clinoptilo- lite, chabazite and mordenite, are obtained after drying and pre-comminution by fractionation with grain size 0.8-0.2 mm.
  • the requirements are US Pharmacop. or Europ. Pharmacorp. to fulfill.
  • gentle thermal treatment at selected temperature intervals at temperatures ⁇ 200 ° C a partial dehydration takes place to obtain the crystal lattice structure.
  • Example 2 Testing of the microporous volume and the particle size distribution
  • the products prepared according to Example 1 have 25-50% micropore space (based on the total volume) and average nanopore diameters in the range 0.3-0.5 nm.
  • Nanopore size and fine granulate structure allow maximum blood adsorption and rapid penetration of the adsorbent granules.
  • the capillary force effect is 5 to 10 times higher than in the comparatively investigated commercial preparation CERDAC
  • Example 3 Testing the fine granules for suitability for haemostasis
  • Rats were anesthetized for this purpose. After opening of the abdominal cavity was made with the scalpel about a 1 cm long incision. The bleeding was filmed. The time to hemostasis was measured.
  • hemostasis is achieved within 1 min (control without treatment up to 8 min). It forms a scab-like encrustation that protects the wound.
  • Example 4 In vitro examination of the fine granules for suitability for haemostasis
  • Acetate tissue as used for the preparation of wound dressings, is dripped with 2 mg of extract equivalent amount of extract solution and allowed to dry.
  • the extracts were prepared using freeze-dried biomasses of the green alga Chlamydomonas, the microalgae Spirulina (B lue Biotech Büsum) and Anabaena (strain collection of the Institute of Pharmacy of the Ernst Moritz Arndt University Greifswald).
  • the extractor DIONEX ASE 200 used for extraction with n-hexane.
  • the extract solution was freed from the solvent by means of a rotary evaporator.
  • no methicillin-resistant strains of Staphylococcus triggers (MRSA) which are feared as causative agents of wound infections, can be detected.
  • MRSA methicillin-resistant strains of Staphylococcus triggers
  • germ growth was reduced to 10 to 20% of the starting bacterial count.
  • Example 6 Production of fine granules from natural zeolites and the biomass of microalgae
  • the mineral granules produced according to Example 1 microalgae biomass with a lipid content> 20% in the ratio 1:10 to 10: 1 are added. This prevents the germ colonization of the wounds.
  • Example 7 Testing the fine granules for suitability for haemostasis and wound closure
  • Rats were anesthetized for this purpose. After opening the abdomen, the scalpel was used to make a cut of about 1 cm. The bleeding was filmed. The time to hemostasis was measured. The wound closure was assessed visually. Result:
  • hemostasis is achieved within 1 min (control up to 8 min). It forms a scab-like encrustation that protects the wound.
  • wound closure is better with fine granules on mineral / algae biomass basis than with the use of the exclusively mineral-based preparations.
  • Example 8 Preparation of the adhesive prepolymers and performing the adhesive reaction for soft tissue and hard tissue adhesion
  • bridging molecule 2 2,5-dihydroxy-N- (2- hydroxyethyl) benzamide
  • laccase 5 the enzyme laccase
  • Adhesion occurs through the enzymatic reaction of the laccase with the bridging molecule linked to the oligopeptide.
  • the tissue parts to be examined had to be fixed beforehand. Porcine soft tissue was fixed to polymethylmethacrylate (PMMA) specimen holders with cyanoacrylate adhesive, or bone plates of bovine bone were clamped in mechanical clamps. Subsequently, the adhesive mixture to be examined (see Example 6) was applied to the fabric. The soft tissue was after 10 minutes the strength of the adhesive joint under tensile stress on the testing machine Zwick BZ2.5 / TN1 S (test speed: 10 mm / min) determined. The mechanical testing of the adhesive joint after hard tissue bonding was carried out under tensile shear stress at a test speed of 5 mm / min.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • Example 10 Diffusion-inhibition test with the inventively doped collagen fleece in comparison to a nonwoven doped with a conventional antibiotic.
  • Polymer biomaterials (1 cm 2 each) are named after Contrib. Plasma Phys. 41, 2001, 562-572 functionalized in ammonia plasma. Thereafter, the reaction with 2,5-dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl) benzamide (12.5 mM) under the Influence of laccase (0.32 U (156 nmol ml "1 min " 1 ).) The solvent content of methanol was 10% (v / v).
  • the control counts 120 germs / cm. Under the coated surfaces no germs can be detected.
  • Example 12 Use of the combination according to the invention for the treatment of bleeding wounds.
  • Rats are anesthetized as in Example 7, the abdominal cavity opened and one
  • Collagen film (DOT GmbH) was fixed on a flat surface.
  • the collagen film was divided into 8 segments (4 each in two rows) and the adhesive was mixed together directly on the film (taking advantage of the surface tension).
  • the glue was dissolved in phosphate citrate buffer.
  • the adhesive protein had an MW of about 4000D
  • the bonding also takes place without the addition of adhesive proteins.
  • the adhesive proteins increase the binding force.
  • Example 14 Mixture of a collagen solution with the adhesive Microscopically, a strong structuring can be seen after mixing the collagen solution with the adhesive. The dissolved and random collagen molecules are parallelized to form fibers.
  • citrate-phosphate buffer control
  • adhesive solution buffer, laccase, laccase substrate
  • the collagen has been permanently bonded to the ground.
  • the cell adhesion was carried out on 60 mm TCPS cell culture dish, which was coated according to Example 15 with collagen. After staining the cells with crystal violet, the evaluation was carried out with the CellExplorer
  • the FL cells are bound more strongly (see Figure 1)

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Description

Kleber für medizinische Anwendungen und Mittel zur Blutstillung
Die Erfindung betrifft Kleber für medizinische Anwendungen und Mittel zur Blutstillung. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Kit zur Herstellung eines Klebers, der geeignet ist, Hart- und Weichgewebe miteinander zu verkleben, Wunden zu verschließen, sowie den Kleber selbst als auch dessen Verwendungen im medizinischen Bereich. Der Kit bzw. der dazugehörige Kleber umfasst als Einzelkomponenten Substrate der Polyphenoloxidase sowie Polyphenoloxidasen als solche.- Darüber hinaus richtet sich die Erfindung auf neue Hämostyptika, sowie auf den kombinierten Einsatz von Hämostyptika und Kleber beim Wundverschluss.
Stand der Technik
Die Entwicklung neuer Gewebekleber, die insbesondere für Problemfälle eingesetzt werden können, hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen. Bisher eingesetzte Gewebekleber auf Acrylat-Basis können nur auf oberflächlichen Wunden eingesetzt werden, da die Acrylate biologisch nicht abgebaut werden und eine toxische Gefährdung bedeuten können. Ein Augenmerk liegt deshalb vor allem auf der biologischen Abbaubarkeit der eingesetzten Materialien. Aus diesem Grund spielen für die Klebstoffherstellung beispielsweise Polymere pflanzlichen bzw. tierischen Ursprungs eine große Rolle. Muscheln sind z. B. in der Lage, unter Wasser besonders feste Verbindungen mit verschiedenen Trägersubstraten einzugehen. Grund dafür ist die Bildung/ Ausscheidung von MAPs (mussei adhesive proteins). MAPs bestehen aus einer Vielzahl von Proteinen, die je nach Muschelart variieren kann. Im US 5015 677 A wird ein Gewebekleber geschützt, der ein ganz spezielles aus Muscheln isoliertes Dekapeptid als essentielle Komponente nutzt. Dieses Dekapeptid enthält Dihydroxy-Aromaten als Substituenten von sehr speziellen Aminosäuren, die als essentieller Bestandteil der Peptid-Kette anzusehen sind. Die Peptid-Ketten werden dann unter dem Einfluss einer Tyrosinase miteinander verknüpft. Darüber hinaus sind keine befriedigenden Lösungen bekannt, die es ermöglichen Knochen mit Implantaten mittels Kleber zu fixieren.
EP 0 947 142 offenbart die Erhöhung des Molekulargewichts von Proteinen durch ihre Vernetzung durch Multi-Kupfer-Enzyme. Die beschriebene Erhöhung des Molekulargewichts der Substratproteine trat nach 17 Stunden Inkubation auf. Die mit Hilfe des Verfahrens nach EP 0 947 142 vernetzten Proteine sind vor allem zur Verwendung in Nahrungsmitteln geeignet, z.B. zur Veränderung der Konsistenz von Wurst. Eine Kreuzvernetzung von Proteinen durch substituierte Dihydroxyaromaten wird in EP 0 947 142 nicht offenbart.
Wenn Wundkleber bei stark blutenden Wunden eingesetzt werden sollen, besteht die Gefahr, dass Klebekomponenten mit dem Blutstrom weggespült werden und die Verklebung an einem unerwünschten Ort eintritt. Damit wird die Thrombose-Gefahr stark erhöht. Die akute Versorgung stark blutender Wunden ist auch heute noch ein unbefriedigend gelöstes Problem. Eine Blutstillung kann nach dem Stand der Technik erreicht werden durch
a) Proteindenaturierung z.B. durch Metallsalze
b) mikroporöse Biopolymere bzw. Biopolymere mit großer innerer Oberfläche. Diese absorbieren Wasser, dadurch kommt es zu einer Konzentration der Blutzellen sowie der Gerinnungsfaktoren. Als besonders vorteilhaft haben sich Polysaccharide erwiesen, die aus Poly-N-Acetyl-Glucosaminen oder Chitosan bestehen. Diese sind z.B. im Skelett von Insekten, aber auch in Algen enthalten. Biopolymere wie Gelatine, Collagen, Fibrinschwämme oder oxidierte Cellulose haben eine große innere Oberfläche. Aufgrund der Absorption an diese große Fläche kommt es zu einer Konzentration der Gerinnungsfaktoren. c) Enzyme, insbesondere durch Thrombin oder proteolytische Enzyme mit thrombinähnlicher Wirkung mit oder ohne Zusatz von Calcium
d) hochkonzentrierte Gerinnungsfaktoren
e) Kombinationen von c) und d)
f) Calzium-Alginate
g) alumosilikatische Syntheseprodukte mit Mikroporenstruktur
Die bisher zur Blutstillung eingesetzten alumosilikatische Syntheseprodukte sind Alkali- und Erdalkalialuminiumsilicate unterschiedlicher Zusammensetzung
Auf der Basis von synthetisierten und bei über 400 °C vollständig dehydratisierten Erdalkalialuminiumsilicaten wurde von der Firma Z-Medica, U.S. für die Sofortbehandlung von Kriegsverletzungen und zur Notversorgung ein Syntheseprodukt einwickelt. Durch eine starke exotherme Reaktion wird dem Blut Wasser entzogen und es kommt so zur Blutstillung. Das Syntheseprodukt wird direkt in Granulatform auf die Wunde appliziert. Es wird unter der Bezeichnung "Quikclot" vertrieben. Nachteilig wurde bei diesem Produkt beschrieben, dass durch die exothermen Reaktion (Temperaturen bis 60 0C) Schädigungen des angrenzenden Gewebes auftreten. (Journal of Trauma 54 (2003) 6, 1077 - 1082).
Synthetische Lithiumalumosilikate (EP 1176991 Al, WO 00/69480) wurden speziell für die Wundversorgung entwickelt und werden unter dem Handelsnamen CERDAC vertrieben. Im Falle von CERDAC wird unter Aufwendung hoher Temperaturen (> 1000 0C) ein mikroporosiertes keramisches Produkt hergestellt, um eine optimale Wundversorgung zu erreichen.
Abgesehen von der z.T. aufwändigen Herstellung ist die Kapillarkraftwirkung zu gering, um allen Anforderungen zu genügen. Ein großes Problem besteht weiterhin in einer möglichen Chronifizierung der Wunden, insbesondere bei Risikopatienten. Diese kann bisher nicht sicher vermieden werden, und die Behandlung solcher Wunden ist nach wie vor sehr schwierig. Mit der Chronifizierung ist oft eine Keimbesiedlung der Wunde verbunden.
Allein in Deutschland leiden 4 Millionen Patienten an chronisch offenen Wunden. Die jährlichen Kosten betragen 1,7 bis 3,2 Milliarden Euro. Für die Versorgung chronischer Wunden wurde bisher keine befriedigende Lösung erreicht.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass sowohl für das Problem der Verklebung von Hart- und Weichteilgewebe als auch eine schnelle Verschließung, die Versorgung von stark blutenden als auch vor allem für die Versorgung chronischer Wunden bisher noch keine in jeder Hinsicht befriedigenden Lösungen erreicht wurden.
Die vorliegende Aufgabe besteht nun darin, die im Stand der Technik aufgeführten Probleme durch Produkte, die effiziente Klebstoffeigenschaften für Hart- und Weichteilgewebe aufweisen, zu lösen. Insbesondere sollten Systeme, wie Klebstoffe, bereitgestellt werden, die es ermöglichen stark blutende Wunden zu stillen und / oder Knochenpartien miteinander oder Knochenpartien mit Implantaten fest zu verbinden. Wünschenswert wären auch Klebstoffe, die es ermöglichen, Weichgewebe mit Knochen zu verbinden, wie bei Knorpeltransplantaten. Die gefundenen Möglichkeiten für einen Wundverschluss sollten vorzugsweise auch auf chronische und infizierte Wunden übertragbar sein.
Die Erkenntnis der vorliegenden Erfindung ist, dass Polymere, die mindestens eine freie Aminogruppe aufweisen, mittels Brückenmolekülen unter Einsatz von (lignolytischen) Polyphenoloxidasen unter Ausbildung kovalenter Bindungen untereinander und / oder mit körpereigenem Gewebe vernetzt werden und somit als Hart- und Weichteilgewebekleber eingesetzt werden können. Eine weitere Erkenntnis der vorliegenden Erfindung ist, dass spezifisch aufbereitete Naturzeolithe eine rasche Blutstillung bewirken.
Insofern richtet sich die vorliegende Erfindung in einer ersten Ausführungsform auf ein Kit, welches die folgenden Einzelkomponenten umfasst: a) Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para- Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und c) Polyphenoloxidasen , insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, wobei die beiden Einzelkomponenten (Komponenten b) und c)), d.h. die
Brückenmoleküle mit den Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, nicht in Kontakt stehen.
Unter einem Kit wird in der vorliegenden Erfindung insbesondere eine Verpackung verstanden, die es ermöglicht die Einzelkomponenten so nebeneinander aufzubewahren, dass sie nicht in Kontakt stehen. Im vorliegenden Fall müssen zumindest die Brückenmoleküle (Komponente b)) von den (lignolytischen) Polyphenoloxidasen (Komponente c)) getrennt sein, damit eine frühzeitige und unerwünschte Reaktion vermieden wird. Folglich ist eine Mischung der Komponenten a) und b) und / oder der Komponenten a) und c) möglich.
Um einen Kontakt zwischen den Brückenmolekülen und den (lignolytischen)
Polyphenoloxidasen zu vermeiden, können beide Einzelkomponenten vorzugsweise in unterschiedlichen Gefäßen oder Kammern aufbewahrt werden. Dies gilt auch für den Fall, falls eine oder beide Einzelkomponenten b) und c) mit dem Polymer a) vermischt ist. Denkbar ist eine Spritze, die es ermöglicht, über zwei Kanülen die beiden Einzelkomponenten, d.h. die Brückenmoleküle und die (lignolytischen) Polyphenoloxidasen, getrennt voneinander abzugeben. Dabei wird bevorzugt, dass die beiden Einzelkomponenten, d.h. die Brückenmoleküle und die (lignolytischen) Polyphenoloxidasen, in der Spritze in unterschiedlichen Kammern vorliegen. Denkbar ist natürlich auch, dass der Kit mindestens zwei Spritzen umfasst, wobei eine die Brückenmoleküle enthält und die andere die (lignolytischen) Polyphenoloxidasen.
In einer Ausfuhrungsform stellt der Kit eine Zweikomponentenspritze dar, bevorzugt bereits mit angesetztem Mischextruder. Dies erlaubt eine besonders exakte Dosierung und einfache Handhabung. Bevorzugt ist eine Doppelkammerspritze etwa vom Typ Mixpac (Mixpac Systems AG, Rotkreuz, Schweiz).
Es ist selbstverständlich, dass im Rahmen der Erfindung unabhängig voneinander ein oder mehrere verschiedene Einzelkomponenten a), b) und c) eingesetzt werden können. Einzahl und Mehrzahl wird daher in Bezug auf alle Komponenten synonym gebraucht.
Eine zwingende Voraussetzung ist, dass der Kit als Einzelkomponente a) Polymere umfasst, die mindestens eine freie Aminogruppe enthalten. Unter freier Aminogruppe wird in vorliegender Erfindung eine Aminogruppe verstanden, die nicht Bestandteil der Polymerkette ist, sondern ein Rest der Polymerkette darstellt. Nachdem diese Polymere in dem Kit vorliegen sind diese nicht Bestandteil des menschlichen Körpers. Bei den Polymeren handelt es sich vorzugsweise um Polymere, die mehr als eine Aminogruppe umfassen, d.h. um aminogruppenreiche Polymere, wie Peptide. Bei den Peptiden (d.h. bei Oligipetiden und Proteinen) besteht naturgemäß eine Amidbindung zwischen den Aminosäuren. Vorzugsweise sind die Peptide Lysin- haltig. Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden Lysin- haltige Oligopeptide verwendet. Denkbar ist auch, dass das Peptid Kollagen ist.
Ist das Polymer ein Peptid ergibt sich als besonderer Vorteil, dass die durch Reaktion der Komponenten entstandene Verbindung biologisch abbaubar ist. Durch die Verknüpfung von Peptidsequenzen, die die für eine Klebewirkung relevanten Aminosäuren enthalten, entsteht eine sehr feste Verklebung, die aber im Verlauf des Heilungsprozesses resorbiert werden kann. Die anfängliche Härtungsphase, verbunden mit hohen Klebeigenschaften, und die zeitabhängig langsame Resorption im Körper bei fortgeschrittenen Heilungsprozessen sind von besonderem Vorteil, da in die Klebestelle zunehmend körpereigenes Gewebe eingelagert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird als Peptid sowohl ein Oligopeptid (2 bis ca. 100 Aminosäuren Länge, bevorzugt ca. 4 bis ca. 20 Aminosäuren Länge oder ca. 6 bis ca. 10 Aminosäuren Länge) als auch ein Protein (Eiweiß, etwa 100 bis etwa 5000 Aminosäuren Länge, bevorzugt 100-1000 oder 100-200 Aminosäuren Länge) bezeichnet. Bevorzugt weist das Peptid eine Länge von 10-1000 Aminosäuren auf. Das Peptid kann ein Molekulargewicht von etwa 1 bis etwa 100 oder bis etwa 200 kDa, insbesondere etwa 2 bis etwa 50 kDa oder etwa 5 bis etwa 20 kDa aufweisen. Es kann modifiziert bzw. substituiert sein, z.B. glykosyliert. Neben den üblichen proteinogenen Aminosäuren können auch modifizierte bzw. untypische Aminosäuren wie Hydoxylysin in dem Oligopeptid enthalten sein. Der Einsatz von D- Aminosäuren anstelle von L- Aminosäuren oder zusätzlich dazu ist möglich und verlangsamt den Abbau des Peptids.
Die Aminogruppen können vorzugsweise primäre oder sekundäre Aminogruppen sein. Besonders reaktiv sind jedoch primäre Aminogruppen. Mindestens eine der reaktiven Gruppen des Peptids ist bevorzugt Bestandteil einer Diaminosäure, z.B. von Lysin. Bevorzugt umfasst das Peptid daher mindestens eine Diaminosäure, bevorzugt mindestens 2, 3, 4, 5 oder mehr Diaminosäuren. Bevorzugt werden, wie oben erwähnt, Lysin-haltige Peptide (Oligopeptide oder Eiweiße) eingesetzt.
Auch andere Aminosäuren, wie Arginin, Asparagin, Glutamin oder Histidin, tragen reaktive Aminogruppen, die mit dem Dihydroxyaromaten reagieren können.
Die Aminogruppen, insbesondere die durch die Diaminosäure bereitgestellten Aminogruppen, sind für die Vernetzungsreaktion zwischen Peptid und Brückenmolekül besonders geeignet. Auch Hydroxylgruppen oder Merkaptogruppen in dem Peptid können jedoch zu der Vernetzungsreaktion beitragen. Bevorzugt umfasst das Peptid daher mindestens eine Aminosäure mit einer Hydroxylgruppe, also insbesondere Serin, Threonin oder Tyrosin oder einer Merkaptogruppe, z.B. Cystein. Auch Hydroxylysin oder polyphenolische Aminosäurebausteine, wie sie in den MAPs vorliegen, können in den erfindungsgemäß eingesetzten Peptiden vorkommen. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass die Anwesenheit dieser spezifischen Aminosäurebausteine und damit die Verwendung von MAPs nicht zwingend notwendig ist. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Polymer frei von polyphenolischen Aminobausteinen, d.h. frei von MAPs. Die verwendeten Peptide können daher z.B. ohne weiteres rekombinant hergestellt werden.
Die durch Reaktion der Brückenmoleküle mit dem Peptid entstehende Vernetzung hängt auch davon ab, wie hoch der Anteil der zur Verfügung stehenden reaktiven Gruppen in dem Peptid ist. Gute Klebeeigenschaften können ab einem Anteil an Aminosäuren des Peptids, die eine reaktive Aminogruppe (z.B. Diaminosäuren wie Lysin) tragen, von mindestens 10 % erreicht werden. Ist das Polymer kein Peptid, so beträgt der Anteil an Polymerstrukturelementen, die eine Aminogruppe tragen, vorzugsweise mindestens etwa 10%. Noch mehr bevorzugt liegt der Anteil dieser Aminosäuren oder Strukturelemente jedoch höher, bei mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40 oder mindestens 50% oder sogar bei mindestens 80 bis 100%. Natürlich vorkommende Peptide und Proteine, z.B. Albumin oder Casein, können verwendet werden, besonders geeignet sind z.B. MAPs.
Es können jedoch auch weitere kürzere, leicht künstlich herstellbare Peptide eingesetzt werden. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung sind etwa 50% der Aminosäuren des Peptids Lysin. Lysin und eine weitere Aminosäure können z.B. als sich wiederholende Dipeptid-Einheit angeordnet sein. Auch eine andere Abfolge oder die Aufnahme weiterer Aminosäuren, insbesondere von Arginin, Asparagin, Glutamin oder Histidin (anstelle von Lysin oder zusätzlich), Serin oder Threonin (anstelle von Tyrosin oder zusätzlich), von Cystein oder anderen Aminosäuren ist jedoch möglich. Eine Länge des Peptids von ca. 10-20 Aminosäuren oder eine Mischung von Peptiden verschiedener Kettenlänge ist besonders bevorzugt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ausschließlich aus zwei Aminosäuren bestehende Polymere, beispielsweise (Lysin-Thyrosin)nj wobei n = Werte zwischen 5 und 40, wie 5, 10 oder 20, annehmen kann.
Eine weitere zwingende Voraussetzung der vorliegenden Erfindung ist, dass der Kit Brückenmoleküle umfasst, die eine Vernetzung von Polymeren, die mindestens eine freie Aminogruppe (wie Diaminosäuren) aufweisen, wie weiter oben definiert, bewirken.
Als Brückenmoleküle eignen sich grundsätzlich substituierte Dihydroxyaromaten und/oder Substrate der (lignolytischen) Polyphenoloxidasen, wie Laccasen.
Folglich werden monocyclische ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclische para- Dihydroxyaromaten, bicyclische Monohydroxyaromaten, polycyclische Monohydroxyaromaten, bicyclische Dihydroxyaromaten, polycyclische Dihydroxyaromaten, bicyclische Trihydroxyaromaten, polycyclische Trihydroxyaromaten, oder deren Mischungen eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Hydroxyaromaten sind im Gegensatz zu den bekannten Muschelklebstoffen nicht Bestandteil einer Polymerkette.
Denkbar ist auch, dass diese Aromaten weiter substituiert sind. Bevorzugte funktionelle Gruppen sind Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Sulfo-, Sulfon-, Sulfamindo, Sulfanyl-, Amino-, Amido-, Azo-, Immino- und Hydroxy. Dabei wird insbesondere beobachtet, dass substituierte Aromaten, insbesondere substituierte Dihydroxyaromaten, überraschenderweise besonders günstige Polymerisationsegenschaften aufweisen, insbesondere wird eine schnelle Polymerisation, eine geringere Eigenkopplung und eine gute Festigkeit der Verklebung erreicht. Eine geeignete Substitution der Aromaten kann sogar dazu führen, dass nunmehr als Brückenmolekül auch Monohydroxyaromaten zur Vernetzung geeignet sind. Substituiert bedeutet im Rahmen dieser Erfindung insbesondere, dass an den Aromaten neben den Hydroxylgruppen noch 1, 2, 3 oder 4 weitere Reste gebunden sind. Andererseits sind auch monohydroxylierte Biarylverbindungen geeignet.
Besonders bevorzugt sind Phenolderivate, die eine Hydroxygruppe oder eine Methoxygruppe an der ortho- oder para-Position aufweisen. Folglich sind folgende Verbindungen der Formel 3 und 4 bevorzugt:
wobei n = 0 - 10, bevorzugt 0 oder 1, insbesondere 0,
Ri = OH oder NH2 oder HaI, bevorzugt OH, Cl oder Br, insbesondere OH, R2 - H, CH3, CHO, COCH3, CONH2, CON-Alkyl, CON-Alkyl-OH, COOH, COO- Alkyl, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CON-Alkyl oder COO-Alkyl, und R3 = H, CH3, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere H oder CH3, ist.
Alkyl bedeutet verzweigte oder unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffketten, bevorzugt mit 1-20, mehr bevorzugt 1-6 Kohlenstoffen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, n-Pentyl, n-Hexyl
Möglich sind Verbindungen der Formel 3 und davon das Hydrochinon, welches weiter substituiert sein kann. Unter dem Aspekt einer möglichst schnellen Klebereaktion sind substituierte Dihydroxyaromaten mit geringer Eigenkopplung erfindungsgemäß besonders geeignet. Bevorzugt werden 2,5-Dihydroxybenzamide eingesetzt, besonders bevorzugt wird 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid.
Im Fall der Trihydroxyaromaten ist es bevorzugt, dass nicht mehr als zwei Hydoxygruppen pro Benzoleinheit vorliegen. Besonders bevorzugt sind Polyphenyle, d.h. Biphenyl oder Triphenyl, folgender Formel 5:
wobei n = 0 - 10, bevorzugt 0 oder 1 und Ri = H und R2 = OH oder Ri = OH und R2 = H ist.
Dabei können die Phenyle der Formel 5 substituiert sein, z.B. in ortho-Position zu einer OH-Gruppe mit CH3, CHO, COCH3, CONH2, CON-Alkyl, CON-Alkyl-OH, COOH, COO-Alkyl, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CON-Alkyl oder COO-Alkyl, und / oder in metha-Position zu einer OH-Gruppe mit CH3, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CH3.
Des Weiteren ist erforderlich, dass der Kit als weitere Einzelkomponente Polyphenoloxidasen, wie lignolytische Polyphenoloxidasen, insbesondere Laccase (EC 1.10.3.2), umfasst. Laccasen sind im Stand der Technik bekannt. Sie können aus Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder Insekten stammen oder von natürlichen Enzymen abgeleitet sein. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Laccasen können rekombinant hergestellt oder aufgereinigt sein. Dabei ist eine besondere Reinheit der Laccase im allgemeinen nicht erforderlich, gegebenen falls können auch Überstände lignolytischer Pilze eingesetzt werden. Für medizinische Anwendungen ist jedoch eine wesentliche Abtrennung von mikrobiologischen Substanzen wie
Lipopolysacchariden oder anderen Zellwandbestandteilen oft wünschenswert. Beispiele sind Laccase aus den Gattungen Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Coprinus, Psatyrella, Myceliophthora, Schtalidium, Polyporus, Phlebia oder Coriolus. Die Herstellung von Laccasen ist z.B. in EP 0 947 142 offenbart.
Durch den Einsatz von Polyphenoloxidasen, wie lignolytischen Polyphenoloxidasen, vorzugsweise Laccase (EC 1.10.3.2) im Kit kann deren breites sowie besonderes Substratspektrum für die Klebereaktion ausgenutzt werden. Daher zeichnet sich der Kit insbesondere dadurch aus, dass die Klebereaktion nicht auf spezielle in der Natur gefundene Peptide, die als Brückenmolekül fungieren, beschränkt ist, sondern ein weites Spektrum von Brückenmolekülen, einerseits, sowie von Peptiden, wie Oligopeptiden, oder Proteinen, andererseits, eingesetzt werden kann.
Variationen der Mengenverhältnisse sind sowohl bei der Einzelkomponente a), insbesondere dem Peptid, als auch beim Brückenmolekül etwa von 1-50 mM möglich. Für jede Anwendung ist das optimale Mengenverhältnis in Vorversuchen zu ermitteln.
Dabei muss beachtet werden, dass je nach dem ausgewählten Brückenmolekül auch eine Eigenreaktion des Brückenmoleküls stattfindet, die die Bildung von Vernetzungsprodukten mindert. Zu geringe Konzentration der Brückenmoleküle führen zu einer zu langsamen Reaktion, zu hohe Konzentrationen zu stärkeren Nebenreaktionen durch Eigenkopplung. Wenn ein geringerer Anteil an Peptid vorliegt, werden reaktive Amino-, Merkapto und/oder Hydroxylgruppen von zu verklebenden Substraten verstärkt in die Vernetzung einbezogen,. Die Menge an Polyphenoloxidase beeinflusst die Geschwindigkeit der Rektion, wobei, je nach Anwendung, ein schnelles Erreichen des Gelpunkts oder vollständiges Aushärten oder eine längere Verarbeitbarkeit der Kombination erreicht werden kann. Durch die in Vorversuchen durchzuführende Optimierung der Mengeverhältnisse kann daher der Kit an die jeweilige konkrete Aufgabenstellung angepasst werden. Es ist ein besonderer Vorteil des Kit, dass die Bestandteile im Kit in einem vorher optimierten Mengenverhältnis vorliegen, das für die jeweilige Verwendung angemessen ist. Eine bevorzugtes Mengenverhältnis für des Verkleben von Weichteilgeweben ist beispielsweise [Tyr-Lys]n, n=4-35, 8,5 raM; 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl)-benzamid 12,5 mM; Polyphenoloxidase: 0,32 U (156 nmol ml"1 min'1). Dieses Mengenverhältnis kann im Kit vorgegeben werden und erspart ein umständliche Einzeldosierung der Zutaten.
Die im Kit eingesetzte Kombination kann weitere Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten, z.B. Füllmittel wie Collagen, Albumin, Hyaluronsäure oder ähnliches. Bevorzugt beträgt der Gesamtanteil von Einzelkomponente a), wie Peptid, und Brückenmolekül etwa 50-90%.
Die essentiellen Bestandteile des Kit werden bevorzugt mit einem oder mehreren wässrigen Lösungsmittel gelöst. Für medizinische Anwendungen ist das Lösungsmittel nicht toxisch und biologisch verträglich. Bevorzugt ist als Lösungsmittel für biologische Anwendungen ein Phosphatpuffer wie
Calciumphosphat oder Natriumphosphatpuffer oder PBS. Für andere Anwendungen kann es aber auch ein organisches Lösungsmittel wie DMSO oder eine Mischung aus einem wässrigen und einem organischen Lösungsmittel sein. Alternativ kann die Kombination oder ihre Bestandteile erst vor der Verwendung in dem Lösungsmittel aufgenommen werden und in den Kit eingeführt werden.
Die Konsistenz der eingesetzten Komponenten im Kit muss jedoch nicht flüssig sein, sondern kann eine pastöse Konsistenz aufweisen. Die Viskosität und Fließfähigkeit der verwendeten Einzelkomponenten kann, abhängig z.B. von der Länge der zu fixierenden Wunde und der Wundspalttiefe bzw. den zu verklebenden Substraten angepasst werden. Neben der Länge der verwendeten Peptide/Polymere hat auch die Menge an Lösungsmittel einen Einfluss auf diese Parameter. Auch Zusatzstoffe wie Thixotropiemittel können zur Anpassung von Viskosität und Fließfähigkeit verwendet werden. Typischerweise wird zum Kleben von Hartgewebe eine Kombination mit höherer Viskosität verwendet als zum Kleben von Weichgewebe.
Der pH ist bevorzugt 2-10, insbesondere 5-7. Die Reaktion kann bei ca. 2-80°C ablaufen, bevorzugt ist jedoch eine Temperatur von ca. 20-37°C oder 25-3O0C. Damit kann die Klebereaktion mittels Kit bei Raumtemperatur/Körpertemperatur durchgeführt werden.
Besondere Anforderungen an die Lagerung wie bei tiefgekühlten Fibrinklebern bestehen nicht. Die (lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, kann in gelöster Form eingesetzt werden, wobei eine Lagerung bei Kühlschranktemperatur ausreichend ist. Es ist auch möglich, die (lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, in Pulverform zu liefern und vor einer absehbaren Anwendung zu lösen.
Eine Sterilisierung des Kits bzw. seiner einzelnen Komponenten kann vorteilhafterweise ohne Strukturveränderung erreicht werden. Möglich ist z.B. eine Sterilfiltrierung von Lösungen. Bevorzugt ist jedoch eine Sterilisierung über Gamma-Strahlung, da diese bereits verpackt erfolgen kann und somit keine aseptische Abfüllung nötig ist. Der Aktivitätsverlust der (lignolytischen) Polyphenoloxidase, wie Laccase, durch die Gammasterilisation, der bis zu 50 % betragen kann, kann durch eine entsprechend höhere Ausgangskonzentration leicht kompensiert werden.
Vorzugsweise wird der oben definierte Kit als Medikament verwendet. Eine
Klassifizierung als pharmazeutisches Präparat oder als Medizinprodukt ist, abhängig von nationalem Recht, ebenfalls möglich. Diese Begriffe sind für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung austauschbar.
In einen weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kleber mit den oben beschriebenen Einzelkomponenten. Folglich umfasst der Kleber die folgenden Einzelkomponenten: a) Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, wobei die Polymere nicht Bestandteil des menschlichen Körpers sind, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para-
Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und c) Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, wobei die beiden Einzelkomponenten (Komponenten b) und c)), d.h. die Brückenmoleküle mit den Polyphenoloxidasen, insbesondere den lignolytische Polyphenoloxidasen, in Kontakt stehen, d.h. miteinander vermischt sind.
Bezüglich der einzelnen Komponenten wird auf die Ausführungen bezüglich dem Kit verwiesen.
Demnach ist es selbstverständlich, dass im Rahmen der Erfindung unabhängig voneinander ein oder mehrere verschiedene Einzelkomponenten a), b) und c) eingesetzt werden können. Einzahl und Mehrzahl wird daher in Bezug auf alle Komponenten synonym gebraucht.
Eine zwingende Voraussetzung ist, dass der Kleber als Einzelkomponente a) Polymere umfasst, die mindestens eine freie Aminogruppe enthalten. Unter freier Aminogruppe wird in vorliegender Erfindung eine Aminogruppe verstanden, die nicht Bestandteil der Polymerkette ist, sondern ein Rest der Polymerkette darstellt. Bei den Polymere des Klebers handelt es sich um Polymere die nicht Bestandteil des menschlichen Körpers sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Polymeren um Polymere, die mehr als eine Aminogruppe umfassen, d.h. um aminogruppenreiche Polymere, wie Peptide.
Bei den Peptiden (d.h. bei Oligipetiden und Proteinen) besteht naturgemäß eine Amidbindung zwischen den Aminosäuren. Vorzugsweise sind die Peptide Lysin- haltig. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Lysin- haltige Oligopeptide verwendet. Denkbar ist auch, dass das Peptid Kollagen ist.
Ist das Polymer ein Peptid ergibt sich als besonderer Vorteil, dass die durch Reaktion der Komponenten entstandene Verbindung biologisch abbaubar ist. Durch die Verknüpfung von Peptidsequenzen, die die für eine Klebewirkung relevanten
Aminosäuren enthalten, entsteht eine sehr feste Verklebung, die aber im Verlauf des Heilungsprozesses resorbiert werden kann. Die anfängliche Härtungsphase, verbunden mit hohen Klebeigenschaften, und die zeitabhängig langsame Resorption im Körper bei fortgeschrittenen Heilungsprozessen sind von besonderem Vorteil, da in die Klebestelle zunehmend körpereigenes Gewebe eingelagert wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird als Peptid sowohl ein Oligopeptid (2 bis ca. 100 Aminosäuren Länge, bevorzugt ca. 4 bis ca. 20 Aminosäuren Länge oder ca. 6 bis ca. 10 Aminosäuren Länge) als auch ein Protein (Eiweiß, etwa 100 bis etwa 5000 Aminosäuren Länge, bevorzugt 100-1000 oder 100-200 Aminosäuren Länge) bezeichnet. Bevorzugt weist das Peptid eine Länge von 10-1000 Aminosäuren auf. Das Peptid kann ein Molekulargewicht von etwa 1 bis etwa 100 oder bis etwa 200 kDa, insbesondere etwa 2 bis etwa 50 kDa oder etwa 5 bis etwa 20 kDa aufweisen. Es kann modifiziert bzw. substituiert sein, z.B. glykosyliert. Neben den üblichen proteinogenen Aminosäuren können auch modifizierte bzw. untypische Aminosäuren wie Hydoxylysin in dem Oligopeptid enthalten sein. Der Einsatz von D-
Aminosäuren anstelle von L- Aminosäuren oder zusätzlich dazu ist möglich und verlangsamt den Abbau des Peptids. Die Aminogruppen können vorzugsweise primäre oder sekundäre Aminogruppen sein. Besonders reaktiv sind jedoch primäre Aminogruppen. Mindestens eine der reaktiven Gruppen des Peptids ist bevorzugt Bestandteil einer Diaminosäure, z.B. von Lysin. Bevorzugt umfasst das Peptid daher mindestens eine Diaminosäure, bevorzugt mindestens 2, 3, 4, 5 oder mehr Diaminosäuren. Bevorzugt werden, wie oben erwähnt, Lysin-haltige Peptide (Oligopeptide oder Eiweiße) eingesetzt.
Auch andere Aminosäuren, wie Arginin, Asparagin, Glutamin oder Histidin, tragen reaktive Aminogruppen, die mit dem Dihydroxyaromaten reagieren können.
Die Aminogruppen, insbesondere die durch die Diaminosäure bereitgestellten Aminogruppen, sind für die Vernetzungsreaktion zwischen Peptid und
Brückenmolekül besonders geeignet. Auch Hydroxylgruppen oder Merkaptogruppen in dem Peptid können jedoch zu der Vernetzungsreaktion beitragen. Bevorzugt umfasst das Peptid daher mindestens eine Aminosäure mit einer Hydroxylgruppe, also insbesondere Serin, Threonin oder Tyrosin oder einer Merkaptogruppe, z.B. Cystein. Auch Hydroxylysin oder polyphenolische Aminosäurebausteine, wie sie in den MAPs vorliegen, können in den erfindungsgemäß eingesetzten Peptiden vorkommen. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist jedoch, dass die Anwesenheit dieser spezifischen Aminosäurebausteine und damit die Verwendung von MAPs nicht zwingend notwendig ist. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform das Polymer frei von polyphenolischen Aminobausteinen, d.h. frei von MAPs. Die verwendeten Peptide können daher z.B. ohne weiteres rekombinant hergestellt werden.
Die durch Reaktion der Brückenmoleküle mit dem Peptid entstehende Vernetzung hängt auch davon ab, wie hoch der Anteil der zur Verfügung stehenden reaktiven Gruppen in dem Peptid ist. Gute Klebeeigenschaften können ab einem Anteil an Aminosäuren des Peptids, die eine reaktive Aminogruppe (z.B. Diaminosäuren wie Lysin) tragen, von mindestens 10 % erreicht werden. Ist das Polymer kein Peptid, so beträgt der Anteil an Polymerstrukturelementen, die eine Aminogruppe tragen, vorzugsweise mindestens etwa 10%. Noch mehr bevorzugt liegt der Anteil dieser Aminosäuren oder Strukturelemente jedoch höher, bei mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40 oder mindestens 50% oder sogar bei mindestens 80 bis 100%. Natürlich vorkommende Peptide und Proteine, z.B. Albumin oder Casein, können verwendet werden, besonders geeignet sind z.B. MAPs.
Es können jedoch auch weitere kürzere, leicht künstlich herstellbare Peptide eingesetzt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind etwa 50% der Aminosäuren des Peptids Lysin. Lysin und eine weitere Aminosäure können z.B. als sich wiederholende Dipeptid-Einheit angeordnet sein. Auch eine andere Abfolge oder die Aufnahme weiterer Aminosäuren, insbesondere von Arginin, Asparagin, Glutamin oder Histidin (anstelle von Lysin oder zusätzlich), Serin oder Threonin (anstelle von Tyrosin oder zusätzlich), von Cystein oder anderen Aminosäuren ist jedoch möglich. Eine Länge des Peptids von ca. 10-20 Aminosäuren oder eine Mischung von Peptiden verschiedener Kettenlänge ist besonders bevorzugt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ausschließlich aus zwei Aminosäuren bestehende Polymere, beispielsweise (Lysin-Thyrosin)n, wobei n = Werte zwischen 5 und 40, wie 5, 10 oder 20, annehmen kann.
Eine weitere zwingende Voraussetzung der vorliegenden Erfindung ist, dass der Kleber Brückenmoleküle umfasst, die eine Vernetzung von Polymeren, die mindestens eine freie Aminogruppe (wie Diaminosäuren) aufweisen, wie weiter oben definiert, bewirken.
Als Brückenmoleküle eignen sich grundsätzlich substituierte Dihydroxyaromaten und/oder Substrate der (lignolytischen) Polyphenoloxidasen, wie Laccasen. Folglich werden monocyclische ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclische para- Dihydroxyaromaten, bicyclische Monohydroxyaromaten, polycyclische Monohydroxyaromaten, bicyclische Dihydroxyaromaten, polycyclische Dihydroxyaromaten, bicyclische Trihydroxyaromaten, polycyclische Trihydroxyaromaten, oder deren Mischungen eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Hydroxyaromaten sind im Gegensatz zu den bekannten Muschelklebstoffen nicht Bestandteil einer Polymerkette.
Denkbar ist auch, dass diese Aromaten weiter substituiert sind. Bevorzugte funktionelle Gruppen sind Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Sulfo-, Sulfon-, Sulfamindo, Sulfanyl-, Amino-, Amido-, Azo-, Immino- und Hydroxy. Dabei wird insbesondere beobachtet, dass substituierte Aromaten, insbesondere substituierte Dihydroxyaromaten, überraschenderweise besonders günstige Polymerisationsegenschaften aufweisen, insbesondere wird eine schnelle Polymerisation, eine geringere Eigenkopplung und eine gute Festigkeit der Verklebung erreicht. Eine geeignete Substitution der Aromaten kann sogar dazu führen, dass nunmehr als Brückenmolekül auch Monohydroxyaromaten zur Vernetzung geeignet sind. Substituiert bedeutet im Rahmen dieser Erfindung insbesondere, dass an den Aromaten neben den Hydroxylgruppen noch 1, 2, 3 oder 4 weitere Reste gebunden sind. Andererseits sind auch monohydroxylierte Biarylverbindungen geeignet.
Besonders bevorzugt sind Phenolderivate, die eine Hydroxygruppe oder eine Methoxygruppe an der ortho- oder para-Position aufweisen. Folglich sind folgende Verbindungen der Formel 3 und 4 bevorzugt:
wobei n = 0 — 10, bevorzugt 0 oder 1 , insbesondere 0,
Ri = OH oder NH2 oder HaI, bevorzugt OH, Cl oder Br, insbesondere OH,
R2 = H, CH3, CHO, COCH3, CONH2, CON-Alkyl, CON-Alkyl-OH, COOH, COO-
Alkyl, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CON-Alkyl oder COO-Alkyl, und
R3 = H, CH3, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere H oder CH3, ist.
Alkyl bedeutet verzweigte oder unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffketten, bevorzugt mit 1-20, mehr bevorzugt 1-6 Kohlenstoffen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, n-Pentyl, n-Hexyl
Möglich sind Verbindungen der Formel 3 und davon das Hydrochinon, welches weiter substituiert sein kann. Unter dem Aspekt einer möglichst schnellen Klebereaktion sind substituierte Dihydroxyaromaten mit geringer Eigenkopplung erfindungsgemäß besonders geeignet. Bevorzugt werden 2,5-Dihydroxybenzamide eingesetzt, besonders bevorzugt wird 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid.
Im Fall der Trihydroxyaromaten ist es bevorzugt, dass nicht mehr als zwei Hydoxygruppen pro Benzoleinheit vorliegen. Besonders bevorzugt sind Polyphenyle, d.h. Biphenyl oder Triphenyl, folgender Formel 5:
wobei n = 0 - 10, bevorzugt 0 oder 1 und Ri = H und R2 = OH oder Ri = OH und R2 - H ist.
Dabei können die Phenyle der Formel 5 substituiert sein, z.B. in ortho-Position zu einer OH-Gruppe mit CH3, CHO, COCH3, CONH2, CON-Alkyl, CON-Alkyl-OH, COOH, COO-Alkyl, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CON-Alkyl oder COO-Alkyl, und / oder in metha-Position zu einer OH-Gruppe mit CH3, Alkyl, substituierter Aromat, insbesondere CH3.
Des Weiteren ist erforderlich, dass der Kleber als weitere Einzelkomponente Polyphenoloxidasen, wie lignolytische Polyphenoloxydasen, insbesondere Laccase (EC 1.10.3.2), umfasst. Laccasen sind im Stand der Technik bekannt. Sie können aus Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder Insekten stammen oder von natürlichen Enzymen abgeleitet sein. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Laccasen können rekombinant hergestellt oder aufgereinigt sein. Dabei ist eine besondere Reinheit der Laccase im allgemeinen nicht erforderlich, gegebenen falls können auch Überstände lignolytischer Pilze eingesetzt werden. Für medizinische Anwendungen ist jedoch eine wesentliche Abtrennung von mikrobiologischen Substanzen wie
Lipopolysacchariden oder anderen Zellwandbestandteilen oft wünschenswert. Beispiele sind Laccase aus den Gattungen Aspergillus, Neurospora, Podospora, Botrytis, Collybia, Fontes, Lentinus, Pleurotus, Pycnoporus, Pyricularia, Trametes, Rhizoctonia, Coprinus, Psatyrella, Myceliophthora, Schtalidium, Polyporus, Phlebia oder Coriolus. Die Herstellung von Laccasen ist z.B. in EP 0 947 142 offenbart.
Durch den Einsatz von Polyphenoloxidasen, wie lignolytischen Polyphenoloxidasen, vorzugsweise Laccase (EC 1.10.3.2) im Kleber kann deren breites sowie besonderes Substratspektrum für die Klebereaktion ausgenutzt werden. Daher zeichnet sich der Kleber insbesondere dadurch aus, dass die Klebereaktion nicht auf spezielle in der Natur gefundene Peptide, die als Brückenmolekül fungieren, beschränkt ist, sondern ein weites Spektrum von Brückenmolekülen, einerseits, sowie von Peptiden, wie Oligopeptiden, oder Proteinen, andererseits, eingesetzt werden kann.
Variationen der Mengenverhältnisse sind sowohl bei der Einzelkomponente a), insbesondere dem Peptid, als auch beim Brückenmolekül etwa von 1-50 mM möglich. Für jede Anwendung ist das optimale Mengenverhältnis in Vorversuchen zu ermitteln.
Dabei muss beachtet werden, dass je nach dem ausgewählten Brückenmolekül auch eine Eigenreaktion des Brückenmoleküls stattfindet, die die Bildung von Vernetzungsprodukten mindert. Zu geringe Konzentration der Brückenmoleküle führen zu einer zu langsamen Reaktion, zu hohe Konzentrationen zu stärkeren Nebenreaktionen durch Eigenkopplung. Wenn ein geringerer Anteil an Peptid vorliegt, werden reaktive Amino-, Merkapto und/oder Hydroxylgruppen von zu verklebenden Substraten verstärkt in die Vernetzung einbezogen,. Die Menge an Polyphenoloxidase beeinflusst die Geschwindigkeit der Rektion, wobei, je nach Anwendung, ein schnelles Erreichen des Gelpunkts oder vollständiges Aushärten oder eine längere Verarbeitbarkeit der Kombination erreicht werden kann. Durch die in Vorversuchen durchzuführende Optimierung der Mengeverhältnisse kann daher der Kleber an die jeweilige konkrete Aufgabenstellung angepasst werden. Es ist ein besonderer Vorteil des Klebers, dass die Bestandteile des Klebers in einem vorher optimierten Mengenverhältnis vorliegen, das für die jeweilige Verwendung angemessen ist. Eine bevorzugtes Mengenverhältnis für des Verkleben von Weichteilgeweben ist beispielsweise [Tyr-Lys]n, n=4-35, 8,5 mM; 2,5-Dihydroxy-N- (2-hydroxyethyl)-benzamid 12,5 mM; Polyphenoloxidase: 0,32 U (156 nmol ml'1 min'1). Dieses Mengenverhältnis kann im Kleber vorgegeben werden und erspart ein umständliche Einzeldosierung der Zutaten.
Die im Kleber eingesetzte Kombination kann weitere Zusatz- und Hilfsstoffe enthalten, z.B. Füllmittel wie Collagen, Albumin, Hyaluronsäure oder ähnliches. Bevorzugt beträgt der Gesamtanteil von Einzelkomponente a), wie Peptid, und Brückenmolekül etwa 50-90%.
Die essentiellen Bestandteile des Klebers werden bevorzugt mit einem oder mehreren wässrigen Lösungsmittel gelöst. Für medizinische Anwendungen ist das Lösungsmittel nicht toxisch und biologisch verträglich. Bevorzugt ist als Lösungsmittel für biologische Anwendungen ein Phosphatpuffer wie
Calciumphosphat oder Natriumphosphatpuffer oder PBS. Für andere Anwendungen kann es aber auch ein organisches Lösungsmittel wie DMSO oder eine Mischung aus einem wässrigen und einem organischen Lösungsmittel sein. Alternativ kann die Kombination oder ihre Bestandteile erst vor der Verwendung in dem Lösungsmittel aufgenommen werden.
Die Konsistenz der eingesetzten Einzelkomponenten des Klebers muss jedoch nicht flüssig sein, sondern kann eine pastöse Konsistenz aufweisen. Die Viskosität und Fließfähigkeit der verwendeten Einzelkomponenten und/oder des Klebers kann, abhängig z.B. von der Länge der zu fixierenden Wunde und der Wundspalttiefe bzw. den zu verklebenden Substraten angepasst werden. Neben der Länge der verwendeten Peptide/Polymere hat auch die Menge an Lösungsmittel einen Einfluss auf diese Parameter. Auch Zusatzstoffe wie Thixotropiemittel können zur Anpassung von Viskosität und Fließfähigkeit verwendet werden. Typischerweise wird zum Kleben von Hartgewebe eine Kombination mit höherer Viskosität verwendet als zum Kleben von Weichgewebe.
Der pH ist bevorzugt 2-10, insbesondere 5-7. Die Reaktion kann bei ca. 2-80°C ablaufen, bevorzugt ist jedoch eine Temperatur von ca. 20-37°C oder 25-300C.
Damit kann die Klebereaktion mittels Kleber bei Raumtemperatur/Körpertemperatur durchgeführt werden.
Besondere Anforderungen an die Lagerung wie bei tiefgekühlten Fibrinklebern bestehen nicht. Die (lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, kann in gelöster Form eingesetzt werden, wobei eine Lagerung bei Kühlschranktemperatur ausreichend ist. Es ist auch möglich, die (lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, in Pulverform zu liefern und vor einer absehbaren Anwendung zu lösen.
Eine Sterilisierung des Klebers bzw. seiner einzelnen Komponenten kann vorteilhafterweise ohne Strukturveränderung erreicht werden. Möglich ist z.B. eine Sterilfϊltrierung von Lösungen. Bevorzugt ist jedoch eine Sterilisierung über Gamma-Strahlung, da diese bereits verpackt erfolgen kann und somit keine aseptische Abfüllung nötig ist. Der Aktivitätsverlust der lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, durch die Gammasterilisation, der bis zu 50 % betragen kann, kann durch eine entsprechend höhere Ausgangskonzentration leicht kompensiert werden.
Vorzugsweise wird der oben definierte Kleber als Medikament verwendet. Eine Klassifizierung als pharmazeutisches Präparat oder als Medizinprodukt ist, abhängig von nationalem Recht, ebenfalls möglich. Diese Begriffe sind für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung austauschbar. Im folgenden werden die Verwendungen des erfindungsgemäßen Kits und Klebers genauer erläutert.
Eine Erkenntnis der vorliegenden Erfindung ist, dass mittels Brückenmolekülen unter Einsatz von (lignolytischen) Polyphenoloxidasen, wie Laccase, unter Ausbildung kovalenter Bindungen mit Polymeren, die mindestens eine freie
Aminogruppe aufweisen, eine Vernetzung herbeigeführt werden kann. Daher richtet sich die vorliegende Erfindung zum einem auf die Verwendung eines Kits bzw. Klebers wie oben definiert zum Verschließen von Wunden. Jedoch ist es ausreichend, dass der Kit bzw. der Kleber nur die Einzelkomponenten b) und c) aufweist um ein Verkleben von Wunden oder Ähnlichen, wie weiter unten beschrieben, bewirken kann. Folglich richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung eines Kit umfassend die Einzelkomponenten a) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para-Dihydroxyaromaten, bicyclischen
Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und b) Polyphenoloxidasen , insbesondere lignolytische
Polyphenoloxidasen, wobei die beiden Einzelkomponenten (Komponenten a) und b)), d.h. die Brückenmoleküle mit den Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, nicht in Kontakt stehen, zur Herstellung eines Klebers zum
Verkleben von Wunden, insbesondere von Hart und Weichgewebe, wie weiter unten im Detail beschrieben. Im folgenden wird daher unter einen Kit bzw. einen Kleber ein Kit bzw. ein Kleber verstanden, der die zwei Einzelkomponenten „Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen" oder die drei Einzelkomponenten „Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe", „Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen" umfasst, wobei ein Kit bzw. ein Kleber mit den drei eben genannten Einzelkomponenten bevorzugt ist.
Bezüglich der einzelnen Komponenten und ihren bevorzugten Ausführungsformen wird auf den oben definierten Kit bzw. Kleber verwiesen.
Der Kit und/oder der Kleber kann zum Kleben von Hart- oder Weichgewebe verwendet werden. Zum Beispiel kann Bindegewebe, Haut, Sehne, Organ, Blutgefäß und/oder Nerv (Weichgewebe) und/oder Zahn und/oder Knochen (Hartgewebe) geklebt werden. Selbstverständlich können auch verschiedene Gewebe miteinander verklebt werden, z.B. Sehnen und Knochen. Eine besonders bevorzugte Anwendung findet sich beim Verkleben von Wundrändern oder beim Kleben von Rupturen verschiedener Organe, wie Leber, Niere oder Milz. Auch die Versorgung von chirurgisch gesetzten Wunden, z.B. nach der Entfernung von Tumoren, ist mit dem erfindungsgemäßen Kit und/oder Kleber möglich. Weitere Einsatzgebiete sind in der plastischen, rekonstruktiven und/oder kosmetischen Chirurgie, insbesondere zur Verhinderung der Narbenbildung, die beim Nähen von Wunden induziert wird
Verschluss und Abdichtung von Flüssigkeit- und Luftleckagen z. B. Abdichtung von Stichkanalblutungen in der Gefäßchirurgie, bei arteriellen Bypassoperationen oder zur Abdichtung von Lungenleckagen in der Thoraxchirurgie.
Eine weitere vorteilhafte Anwendung des Kits und/oder Klebers ist die flexible, über einen gewissen Zeitraum resorbierbare Abdichtung von Anastomosen und Patchen an Gefäßen bzw. auf Hohlorganen. Der Kit und/oder Kleber ist auch für die Fixierung von Drug-Delivery Devices und von porösen Trägerstrukturen bzw. Membranen für den potentiellen Einsatz in der regenerativen Medizin (Tissue Engineering) geeignet. Hier ist von besonderem Vorteil, dass eine Verklebung auch mit Oberflächen nicht biogenen Ursprungs erfolgen kann, sofern sie freie Aminogruppen tragen. Freie Aminogruppen können auf solchen Oberflächen nicht biogenen Ursprungs nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, z.B. Plasmaverfahren, erhalten werden (Schröder, et al., Im- proved low-pressure microwave plasma assisted amino functionalization of polymers, Plasma processes and polymers, Weinheim, Deutschland, Weinheim: Wiley-VCH, 2005; Schröder et al., Plasma-Induced Surface Functionalization of Polymerie Biomaterials in Ammonia Plasma, Contrib. Plasma Phys. 41, 2001, 562- 572; Meyer-Plath et al, Current trends in biomaterial surface functionalization - nitrogen-containing plasma assisted processes with enhanced selectivity, Vacuum 71, 2003, 391-406).
Die Oberflächen z.B. von Implantaten oder von Drug-Delivery Devices, die mit dem Kit und/oder Kleber mit umgebenden Gewebe verbunden werden sollen, sollte einen Gehalt von mindestens etwa 2% freien Aminogruppen aufweisen. Der Begriff Oberfläche beschreibt dabei nicht nur flache Flächen, sondern Grenzschichten eines festen Substrats in jeder Form. Substrate können also z.B. auch Kügelchen (beads) oder komplex geformte Oberflächen sein.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein in einem wässerigen Milieu einsetzbares Klebeverfahren unter Verwendung des oben bezeichneten Kits und/oder Klebers, das zu einer festen, vernetzten resorbierbaren Verbindung führt. Dabei erfolgt insbesondere eine feste, Verbindung durch eine (lignolytische) Polyphenoloxidase- induzierte, wie Laccase-induzierte, Vernetzung über freie Aminosäuren tragende Polymere und Brückenmoleküle, wie oben definiert. Insbesondere betrifft die Erfindung das Verfahren zur Verklebung von Weich- und Hartgewebe durch einen Kit und/oder Kleber wie oben definiert. Bei dem Verkleben von Weich- und Hartgewebe kann es sich unter anderem um das Verkleben von Knochen an Knochen handeln. Dabei werden insbesondere kleine knöcherne Fragmente, die wegen ihrer Größe nicht oder nur unzureichend mit Schrauben fixiert werden können, mit dem erfindungsgemäßen Kit und/oder Kleber fixiert. Im Vergleich zu den metallischen Implantaten ist bei dem Verkleben mittels des erfindungsgemäßen Kit und/oder Klebers keine zweite Operation nach Ausheilung der Fraktur erforderlich. Des Weiteren können mit dem erfindungsgemäßen Kit und/oder Kleber Knochen an Weichgewebe fixiert werden. Insbesondere
Knorpeltransplantate (z.B. aus Gewebekulturen), z.B. zur Behandlung von Arthrose, können mittels des erfindungsgemäßen Kit und/oder Klebers bis zum Anwachsen an der Gelenkfläche ausreichend fixiert werden. Besonders vorteilhaft ist in diesem Zusammenhang, dass der Kit und/oder Kleber allmählich resorbiert wird. Darüber hinaus lassen sich mittels der erfindungsgemäßen Kit und/oder Kleber auch Knochen an Implantate fixieren. Speziell bei osteoporotischem Knochen ist die Haltekraft von Schrauben sehr herabgesetzt. Durch eine grossflächige Verklebung der Knochenaußenseite mit dem Implantat (z.B. Platte) mittels des erfindungsgemäßen Kits und/oder Klebers kann die Haltekraft der Schrauben unterstützt werden oder auf Schrauben sogar ganz verzichtet werden. Zeilvitalitätsuntersuchungen ergaben eine gute Biokompatibilität des Vernetzungsproduktes.
Demnach umfasst die Erfindung insbesondere auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits, entweder mit den zwei Einzelkomponenten „Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen" oder besonders bevorzugt mit den drei Einzelkomponenten „Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe",
„Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen", wie oben definiert, zur Herstellung des erfindungsgemäßen Klebers für das Verschließen von Wunden. Unter Wunden werden Kontinuitätsunterbrechungen von Körperober- oder -innenflächen, wie z.B. bei Schnittwunden und Brüchen, bezeichnet. Folglich umfasst die Erfindung insbesondere auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kit zur Herstellung des Klebers für das Verkleben von Weich- und Hartgewebe sowie das Verkleben von Knochen mit Implantaten (z.B. Platte), wie oben beschrieben.
Durch die Vernetzung mittels der erfindungsgemäßen Kombination, insbesondere die Verknüpfung von Peptidsequenzen, die die für eine Klebewirkung relevanten Aminosäuren enthalten, mit Hilfe des Enzymsystems (lignolytische) Polyphenoloxidase, wie Laccase, entsteht bei verschiedenen Einsatzgebieten eine sehr feste Verklebung, die aber im Verlauf des Heilungsprozesses resorbiert werden kann. Die anfängliche Härtungsphase, verbunden mit hohen Klebeigenschaften, und die zeitabhängig langsame Resorption im Körper bei fortgeschrittenen Heilungsprozessen sind von besonderem Vorteil.
Der Kleber bzw. der Kit kann bei Knochenbrüchen, zur Fixierung von Gefäßprothesen, bioabbaubaren Implantaten, Kathetern, Stents und anderer Materialien genutzt werden.
Demnach umfasst die Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits, entweder mit den zwei Einzelkomponenten „Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen" oder besonders bevorzugt mit den drei Einzelkomponenten „Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe", „Brückenmoleküle" und „Polyphenoloxidasen", wie oben definiert, zur Herstellung eines Klebers für Verkleben von Knochenbrüchen und / oder zur Fixierung von Gefäßprothesen, bioabbaubaren Implantaten, Kathetern, Stents und anderer Materialien.
Für das Verkleben von Knochen sowie für die schnelle Integration von Implantaten insbesondere im Bereich der Knochen ist die Akzeptanz des implantierten Materials durch die Knochenzellen von fundamentaler Bedeutung. Dies trifft natürlich auch auf die verwendeten Kleber zu. Durch die schnelle Besiedlung mit Osteoblasten und deren anschließender Ausreifung wird die Knochenneubildung gefördert und der Heilungsprozess verkürzt. Implantate werden daher mit mikrostrukturierten Oberflächen gefertigt. Der erfindungsgemäße Kit oder Kleber erhält diese Struktur und unterstützt die Knochenneubildung. Für die Produktion von Kollagen, das für die Knochenheilung unentbehrlich ist, sind die Aminosäuren Lysin und Prolin notwendig.
Bevorzugt wird deshalb für dieses Einsatzgebiet (Lysin-Thyrosin)n als Polymer verwendet. Bei Verwendung von (Lysin-Thyrosin)n als Polymer ist Lysin ist an der Klebestelle in hoher Konzentration vorhanden. Daraus resultiert eine positive Beeinflussung der Knochenbildung. Die gebildete extrazelluläre Matrix wird über Integrine, wie z.B. αlßl oder α3ßl, anhand der RDG-Sequenz (Arg-Gly-Asp) erkannt. Dadurch wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die in der Zelle Veränderungen am Zytoskelett auslöst und zwischen Proliferationsstadium und Differenzierungsstadium umschaltet. Die gebildete Proteinmatrix dient außerdem der Einlagerung von Calciumsalzen.
Das ermöglicht die Anwendung bei komplizierten Brüchen und die Einfügung von Knochensplittern. Gerade bei der Operation komplizierter Brüche sind die Vorteile der erfindungsgemäßen Kombination von Blutstillung und hoher Klebekraft von großer Bedeutung.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Erfindung auf neuartige Zeolithgranulate, die sich zur Blutstillung eignen und sowohl einzeln eingesetzt als auch ergänzend in dem erfindungsgemäßen Kit verwendet werden können.
Durch die neuartigen Zeolithgranulate wird insbesondere eine rasche Verklebung von Wundrändern erreicht. Bei den neuartigen Zeolithgranulate handelt es sich um Zeolithgranulate, die mindestens 70 Gew.-% an Zeolith, insbesondere mit Anteilen von Klinoptilolith, Chabasit und Mordenit, und einen Mikroporenraum mit einer mittleren Porengröße von 0,3 bis 0,5 nm aufweisen. Vorzugsweise sind dies Zeolithgranulate hydratfrei, wobei dieser Zustand vorzugsweise nach Trocknung und Vorzerkleinerung durch eine schonende Dehydration bei Temperaturen unter 200 °C erreicht wird. Bei der schonenden Dehydration werden insbesondere verschiedene Temperaturinterwalle unter 200 °C angesetzt. Besonders bevorzugt werden Zeolithgranulate eingesetzt, die aus der Fraktion mit Kornband 0,8 - 0,2 mm stammen.
Bezüglich Reinheit dieser Zeolithgranulate sind die Anforderungen nach US Pharmacop. bzw. Europ. Pharmacop. zu erfüllen.
Es hat sich herausgestellt, dass im Mikroporenraum dieser Zeolithgranulate bestimmte an der Blutgerinnung beteiligte Faktoren selektiv angereichert werden. Das führt zu einer Aktivierung der physiologischen Blutgerinnung, die zu einer den herkömmlichen Hämostyptika deutlich überlegenen Blutstillung führt. Von besonderem Vorteil ist dabei, dass keinerlei toxische Stoffe an die Wunde abgegeben werden. Bei der beschriebenen erfindungsgemäßen Aufbereitung wird ein Zeolithgranulat mit starken elektrostatischen Feldern im Kristallgitter erhalten, das selbst schwere Blutungen innerhalb 1 min stoppen kann. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate, die am Markt befindlichen Produkten auf Basis mikroporosierter synthetischer Lithiumsilikate (EP 1176991 Al, WO 00/69480, US 6833486 Bl) z. B. CERDAC durch eine 5 bis 10-fach höhere Kapillarkraftwirkung überlegen sind. In Folge der partiellen Dehydratisierung tritt keine exotherme Reaktion auf, die Gewebeschäden durch Verbrennung verursachen kann.
Durch die beschriebene erfinddungsgemäße Aufbereitung können nunmehr Naturzeolithe erstmals auf kostengünstigen direkten Weg als blutstillende Mittel und Mittel zur Wundversorgung bereitgestellt werden. Demnach umfasst die vorliegende Erfindung auch die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate als Medizinprodukt oder als Arzneimittel und die Verwendung der erfindungsgemäßen Zeolithgranulatezur Herstellung eines Medizinproduktes und/oder eines Arzneimittels zur Blutstillung. Wie bei dem Kit ist eine Klassifizierung als pharmazeutisches Präparat oder als Medizinprodukt, abhängig von nationalem Recht, möglich. Diese Begriffe sind für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung austauschbar.
Wie oben bereits erwähnt hat sich herausgestellt, dass durch die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate nicht nur eine Blutstillung sondern auch eine rasche Verklebung der Wundränder erreicht wird. Nach der dem Verkleben der Wundränder kann der
Mineralstoff in beispielsweise durch Ablösung der schorfähnlichen Wundabdeckung und Absaugung der Reste vollständig entfernt werden. Es ist bei dieser Ausführungsform der Erfindung möglich, die Zeolithe in einer Umhüllung z.B. auf Zellulosebasis oder auf textiler Basis oder auf Basis eines Collagenvlieses anzuwenden. Damit ist die anschließende vollständige Entfernung besonders problemlos möglich.
Durch die Aktivierung des Fibrinsystems sind die Wundränder miteinander verklebt. Demnach umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zeolithgranulate zur Herstellung des erfindungsgemäßen Klebers zum Verkleben von Wunden sowie zum Abdichten von Anastomosen und Patchen an Gefäßen bzw. auf Hohlorganen.
Die Reißfestigkeit des Wundverschlusses ist aber geringer als bei herkömmlichen Fibrinklebern.
Um die Reißfestigkeit zu erhöhen, ist es zweckmäßig die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate in dem oben beschriebenen Kit oder Kleber einzusetzen. Durch diese Kombination lassen sich besonders wirkungsvolle hämostatische Wundkleber zur Wundbehandlung, Wundversiegelung und Blutstillung bereitstellen. Insofern richtet sich die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform auf ein Kit, welches die folgenden Einzelkomponenten umfasst: a) Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para- Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, c) Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, und d) blutstillende Mineralien, insbesondere Zeolithgranulate wie oben beschrieben wobei die beiden Einzelkomponenten b), c)und d), d.h. die Brückenmoleküle mit den lignolytische Polyphenoloxidasen und die blutstillende Mineralien, nicht miteinander in Kontakt stehen.
Bezüglich der einzelnen Komponenten und ihren bevorzugten Ausführungsformen wird auf die obigen Ausführungen verwiesen. Demnach basiert der Kit insbesondere auf Naturzeolith-Feingranulaten und auf Polyphenoloxidasen (insbesondere Laccase) mit denen die PoIy- bzw. Oligopeptiden vernetzt werden können.
Dabei ist bevorzugt, dass die Naturzeolith-Feingranulate nicht in Kontakt mit den anderen Einzelkomponenten des Kits stehen, d.h. es ist bevorzugt, dass die Zeolithe, gesondert abgepackt und damit gesondert verwendet werden. Dabei sorgen die Naturzeolith-Feingranulate auf Grund ihrer hohen Kapillarkraft durch Konzentration von Gerinnungsfaktoren für einen raschen Wundverschluss. Danach können die Zeolithe problemlos wieder entfernt werden. Es wird ein blutfreies übersichtliches Operationsfeld erhalten. Vorteilhaft wirkt sich weiterhin aus, dass Korrekturmöglichkeiten z.B. vor der Zugabe der unvernetzten Polymere - falls gewünscht - noch gegeben ist.
Wird in diese zunächst provisorisch verschlossene Wunde die Einzelkomponenten a) bis c) des Kites gegeben, kommt es unter Ausbildung kovalenter Bindungen zu einem dauerhaften, belastbaren, andererseits aber auch resorbierbaren Wundverschluss.
Natürlich sind auch anderen Mittel zur Blutstillung als die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate denkbar, die es ermöglichen den Blutaustritt stark zu senken und dadurch einen Abtransport der (lignolytische) Polyphenoloxidasen, insbesondere Laccase, am Einsatzort zu verhindern. Ebenso ist es möglich, nach der Blutstillung mit den Naturzeolit-Feingranulaten andere Gewebekleber einzusetzen. Jedoch zeigt das beschriebene Vorgehen - erst Blutstillung und Wundverschluss mit Naturzeolithfeingranulaten und anschließend dauerhafte Verklebung unter Einwirkung der Polyphenoloxidase, wie Laccase - viele Vorteile und ist konkurrierenden Verfahren auch unter Kostengesichtpunkten überlegen. Der erfindungsgemäße hämostatische Kit zur Wundbehandlung, Wundversiegelung sowie zum Einkleben von Hart- und Weichteilgewebe und von Implantaten ist darüber hinaus weitaus leichter handhabbar. Vorteilhaft einsetzbar sind die hämostatischen Kleber
in der plastischen, rekonstruktiven und/oder kosmetischen Chirurgie, insbesondere zur Verhinderung der Narbenbildung, die beim Nähen von Wunden induziert wird
Verschluss und Abdichtung von Flüssigkeit- und Luftleckagen z. B. Abdichtung von Stichkanalblutungen in der Gefäßchirurgie, bei arteriellen Bypassoperationen oder zur Abdichtung von Lungenleckagen in der Thoraxchirurgie.
Der erfindungsgemäße Kit ist eine Alternative sowohl zur Elektrokoagulation als auch zum Wundverschluss mit Nadel und Faden.
Folglich umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kits, welcher die Einzelkomponenten b) bis d) oder mehr bevorzugt a) bis d) umfasst, zur Herstellung eines Klebers für das Verschließen von Wunden. Des Weiteren umfasst die Erfindung insbesondere auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Kit, welcher die Einzelkomponenten b) bis d) oder mehr bevorzugt a) bis d) umfasst, zur Herstellung des Klebers für das Verkleben von Weich- und Hartgewebe sowie das Verkleben von Knochen mit Implantaten (z.B. Platte), wie oben beschrieben.
Darüber hinaus richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf einen Kleber der die Komponenten b) bis d) oder mehr bevorzugt a) bis d), wie oben beschrieben, umfasst, wobei mindestens die Komponenten b) bis c) bzw. a) bis c), vorzugsweise alle Einzelkomponenten b) bis d) bzw. a) bis d), miteinander in Kontakt stehen.
Die hohe Kapillarkraft der Naturzeolith-Feingranulate ist auch für den Einsatz zur Wundversorgung, insbesondere zur Versorgung von schwer heilenden und bereits chronifizierten Wunden von besonderer Bedeutung. Besonders angezeigt ist der Einsatz der der Naturzeolith-Feingranulate, bei Wunden mit einer Exsudation, d.h. einem Austritt von Blutbestandteilen an einer entzündeten Wunde. Oft ist eine Exsudation ein Anzeichen für eine Infektion an einer Verletzung. Die erfindungsgemäße erhaltene Mikroporenstruktur der Zeolithgranulate, ermöglicht die Aufnahme von Wundexsudat, dass bei „nässenden" Wunden im Überschuss abgegeben wird. Gleichzeitig sorgt die Aufnahme des überschüssigen Exsudats für eine feuchte Atmosphäre über der Wunde, was für die Wundheilung von Bedeutung ist.
Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sind: - als Mittel zur Ersten Hilfe nach Unfällen zur Wundsanierung bei infizierten Wunden
Völlig überraschend wurde gefunden, dass Zeolithe mit der Porenweite 0,3 bis 0,5 nm insbesondere im Verhältnis 1 : 10 bis 10 : 1 mit der Biomasse aus aquatischen Organismen, wie weiter unten definiert, gemischt werden können, ohne an blutstillender Wirkung oder Kapillarkraft zu verlieren.
Demnach kann der Einsatz der neuartigen Zeolithgranulate erweitert werden, indem man diese Materialien mit Biomasse substituiert. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung auch die erfindungsgemäßen Zeolithgranulate die zusätzlich Biomasse, insbesondere im Verhältnis Zeolith zu Biomasse von 1 : 10 bis 10 : 1, enthalten. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Mikroalgen mit antibakterieller Aktivität ausgewählt, deren Biomassen lyophilisiert und gemahlen und/oder gemäß der technischen Lehre von Lukowski et al.: Pharmaceutically or cosmetically active agents obtained from lipid-containing marine organisms. US 10/507,061 aufbereitet wird.
Durch Mischen der Naturzeolith-Feingranulate mit derartig aufbereiteten Biomassen, die antimikrobielle Wirkstoffe enthalten, gelingt es, eine Kombination bereitzustellen, die die Aufnahme des überschüssigen Wundexsudats gewährleistet, die Wunde feucht hält, die Keimbesiedlung der Wunde verhindert, entzündungshemmend und immunstimulierend wirkt und die Zeilproliferation fördert. Vorzugsweise werden bei der Aufbereitung gemäß US 10/507,061
Mikroalgen mit einem Lipidanteil > 20 % und vielen ungesättigten Fettsäuren, und/oder mit einem hohen Anteil an Poly-N-Acetyl-Glucosamine ausgewählt. Damit kann die antibaktakterielle Aktivität der Fettsäuren vorteilhaft für diese Aufgabenstellung genutzt werden. Polysaccharide, vorteilhafterweise aus PoIy-N- Acetyl-Glucosaminen oder Chitosan haben eine große innere Oberfläche. Aufgrund der Absorption an diese große Fläche kommt es zu einer synergistischen Wirkung bei der Konzentration von Gerinnungsfaktoren ebenso wie bei der Aufnahme von Wundsekret sowie von bakteriellen Toxinen. Darüber hinaus haben diese Polysacharide eine immunstimulierende Wirkung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden gefriergetrocknete Biomassen der Grünalge Chlamydomonas und / oder der Mikroalgen Spirulina und / oder Anabaena eingesetzt. Bei der Anwendung der Zeolithe mit oder ohne Biomasse auf einer blutenden Wunde entsteht durch die Aktivierung des Fibrinsystems eine feste schorfähnliche Abdeckung, die die Wunde zuverlässig vor einer bakteriellen Infektion schützt. Diese Abdeckung wird im Laufe der Wundheilung abgestoßen.
In einer geeigneten Anwendungsform können die Feingranulate aus Naturzeolithen und Mikroalgenbiomassen auch eingesetzt werden, um stark infektiöse, nässende Wunden zu therapieren.
Bei verschiedenen Einsatzgebieten kann der Kit und/oder Kleber die erfindungsgemäße Kombination von Zeolithgranulat und Biomasse in allen im Detail oben beschriebenen Ausführungsformen enthalten.
Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der
Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die erfinderischen Schritte sind einzeln nutzbar.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein. Beispielc
Beispiel 1: Herstellung der Naturzeolithfeingranulate
Selektiv abgebaute Mineralien mit > 70 % Zeolithanteilen, vorzugsweise Klinoptilo- lith, Chabasit und Mordenit werden nach Trocknung und Vorzerkleinerung durch Fraktionierung mit Kornband 0,8 - 0,2 mm gewonnen. Bezüglich Reinheit sind die Anforderungen nach US Pharmacop. bzw. Europ. Pharmacop. zu erfüllen. Durch schonende thermische Behandlung in ausgewählten Temperaturintervallen bei Temperaturen < 200 °C erfolgt eine Teildehydratisierung unter Erhalt der Kristallgitterstruktur.
Beispiel 2: Prüfung des Mikroporenvolumens und der Korngrößenverteilung
Die nach Beispiel 1 hergestellten Produkte verfügen über 25 - 50% Mikroporenraum (bezogen auf das Gesamtvolumen) und durchschnittliche Nanoporendurchmesser im Bereich 0,3 - 0,5 nm.
Nanoporengröße und Feingranulataufbau ermöglichen eine maximale Blutadsorption und schnelle Durchdringung des Adsorberfeingranulates.
Die Kapillarkraftwirkung ist 5 bis lOfach höher als bei dem vergleichsweise untersuchten Handelspräparat CERDAC
Beispiel 3: Prüfung der Feingranulate auf Eignung zur Blutstillung
Methodik:
Es wurden 2 Feingranulate, hergestellt nach Beispiel 1, geprüft.
Die Untersuchungen erfolgten an der Rattenleber als einem Prototyp für ein stark durchblutetes Organ. Zu diesem Zweck wurden Ratten narkotisiert. Nach Öffnung des Bauchraums wurde mit dem Skalpell ein etwa 1 cm langer Schnitt gemacht. Die Blutung wurde gefilmt. Die Zeit bis zur Blutstillung wurde gemessen.
Ergebnis:
Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Granulate wird eine Blutstillung innerhalb von 1 min erreicht (Kontrolle ohne Behandlung bis zu 8 min). Es bildet sich eine schorfähnliche Verkrustung, die die Wunde schützt.
Beispiel 4: In vitro-Prüfung der Feingranulate auf Eignung zur Blutstillung
Bei Untersuchungen an verschiedenen Blutplasmen wurden folgende Ergebnisse erzielt:
a) Normalplasma (mit Vorinkubation von 2 min)
Clot= Gerinnung
b) Mangelplasma
Ohne Granulat erfolgte keine Gerinnung. c)Heparinplasma (mit 2 und 3 min Vorinkubation)
Die Ergebnisse belegen, dass das endogene Gerinnungssystem aktiviert wird, wobei der Mangelfaktor F - VII und Gewebsfaktor zu verstärkter Trombin- und Fibrinbildung führen. Es erfolgt eine relative Fibrinkonzentrationserhöhung durch die mineralische Wundauflage nach Beispiel 1.
Beispiel 5: Prüfung von Extrakten aus Mikroalgen auf antibakterielle Wirksamkeit
Methodik:
Verschiedene Staphylokokken-Stämme wurden mittels Whitley Automatic Spiral- Plater im linearen Modus gleichmäßig auf der Agarplatte (Müller-Hinton-II-Agar Fertigplatten von Becton Dickinson) verteilt.
Acetatgewebe, wie es für die Herstellung von Wundauflagen verwendet wird, wird mit 2 mg Extrakt entsprechenden Menge Extraktlösung betropft und trocknen gelassen.
Zur Herstellung der Extrakte wurden gefriergetrocknete Biomassen der Grünalge Chlamydomonas, der Mikroalgen Spirulina (B lue Biotech Büsum) und Anabaena (Stammsammlung des Instituts für Pharmazie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald) verwendet. Zur Extraktion mit n-Hexan wurde der Extraktor DIONEX ASE 200 genutzt. Die Extraktlösung wurde mittels Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit.
Ergebnis:
2
Bei der Kontrolle werden 70- 120 Keime/cm gezählt. Unter den beschichteten Wundauflagen lassen sich keine als Erreger von Wundinfektionen gefürchteten Methicillin resistenten Staphylokkus-ausreus-Stämme (MRSA) nachweisen. Bei anderen Staphylokokken war das Keimwachstum auf 10 bis 20 % der Ausgangskeimzahl reduziert.
Beispiel 6: Herstellung von Feingranulaten aus Naturzeolithen und der Biomasse von Mikroalgen
Den nach Beispiel 1 hergestellten Mineralfeingranulaten können Mikroalgen- biomassen mit einem Lipidanteil > 20 % im Verhältnis 1 : 10 bis 10:1 zugemischt werden. Hierdurch wird die Keimbesiedlung der Wunden verhindert.
Beispiel 7: Prüfung der Feingranulate auf Eignung zur Blutstillung und zum Wundverschluss
a) Methodik:
Es wurden 2 Feingranulate, hergestellt nach Beispiel 1, , geprüft.
Die Untersuchungen erfolgten an der Rattenleber als einem Prototyp für ein stark durchblutetes Organ. Zu diesem Zweck wurden Ratten narkotisiert. Nach Öffnung des Bauchraums wurde mit dem Skalpell ein etwa 1 cm langer Schnitt gemacht. Die Blutung wurde gefilmt. Die Zeit bis zur Blutstillung wurde gemessen. Der Wundverschluss wurde visuell beurteilt. Ergebnis:
Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Granulate wird eine Blutstillung innerhalb von 1 min erreicht (Kontrolle bis zu 8 min). Es bildet sich eine schorfähnliche Verkrustung, die die Wunde schützt.
b) In weiteren Versuchen, wurde die Verkrustung nach 1 min mit dem Skalpell entfernt.
Ergebnis:
Es wird eine nicht mehr blutende, oberflächlich geschlossene Wunde mit visuell gutem Wundverschluss erhalten. Der Wundverschluss ist bei Feingranulaten auf Mineralstoff/Algenbiomasse-Basis besser als bei der Verwendung der ausschließlich auf mineralischer Basis hergestellter Präparate.
c) In weiteren Versuchen wurden die Feingranulate durch ein Zellulosetuch von der Wunde getrennt.
Ergebnis:
Auch unter diesen Bedingungen wird eine Blutstillung in weniger als einer Minute erreicht. Es entsteht ein sehr übersichtliches Operationsgebiet, so dass eine feste Verklebung der Wunde mit dem erfindungsgemäßen Gewebekleber problemlos erfolgen kann.
Beispiel 8. Herstellung der Kleberpräpolymere und Durchführung der Klebereaktion für die Weichgewebe- und Hartgewebeklebung
Der entwickelte Kleber resultiert aus einer Mischung der einzelnen Komponenten Oligopeptid 1 (Aminosäuresequenz aus sich wiederholenden Dipeptideinheiten von Tyrosin und Lysin mit n = 5 oder n = 10), Brückenmolekül 2 (2,5-Dihydroxy-N-(2- hydroxyethyl)-benzamid) und dem Enzym Laccase (Schema 5). Die Untersuchungen wurden in Phosphatpuffer durchgeführt.
Schema 5:
H
Die Klebewirkung erfolgt durch die enzymatische Reaktion der Laccase mit dem Brückenmolekül, das mit dem Oligopeptid verknüpft wird.
Es wurden folgende Mischungsverhältnisse eingesetzt:
[Tyr-Lys]n, n=4-3s, 8,5 mM; 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid 12,5 mM; Enzym: 0,32 U (156 nmol ml"1 min"1). Der Lösungsmittelanteil an Methanol betrug 10% (v/v).
Beispiel 9: Prüfung der Festigkeit der Klebefuge
Zur Prüfung der Festigkeit der Klebefuge im Zugversuch mussten die zu untersuchenden Gewebeteile vorher fixiert werden. Porcines Weichgewebe wurde mit Cyanacrylatkleber an Probenhaltern aus Polymethylmethacrylat (PMMA) fixiert bzw. Knochenplatten aus Knochen bovinen Ursprungs wurden in mechanischen Klemmen eingespannt. Anschließend wurde die zu untersuchende Klebermischung (s. Bsp. 6) auf das Gewebe aufgetragen. Bei der Weichgewebeklebung wurde nach 10 Minuten die Festigkeit der Klebefuge unter Zugbeanspruchung an der Prüfmaschine Zwick BZ2.5/TN1 S (Prüfgeschwindigkeit: 10 mm/min) ermittelt. Die mechanische Testung der Klebefuge nach Hartgewebeklebung erfolgte bei Zug- Scherbeanspruchung mit einer Prüfgeschwindigkeit von 5 mm/min.
Ergebnis: Es wird ein doppelt so starke Festigkeit erreicht wie bei den vergleichend untersuchten kommerziellen Fibrinklebern.
Beispiel 10: Diffusionshemmtest mit dem erfindungsgemäß dotierten Collagenvlies im Vergleich zu einem mit einem konventionellen Antibiotikum dotiertem Vlies.
Methodik:
Es wurde der Agardiffusionstest nach Burkhardt (Burkhardt, F. (Hrsg.)
Mikrobiologische Diagnostik. Georg-Thieme Verlag Stuttgart, New York 1992, S 724) durchgeführt. Für 15 die Testung wurden Mueller-Hinton II-Agar in Stacker- Petrischalen (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, USA) eingesetzt. Als Teststamm wurden S. aureus Stamm ATCC 6538 ausgewählt. Die Einsaat dieses Teststamms wurde so gewählt, daß sich nach 1620 h Bebrütung dicht stehende, jedoch nicht konfluierende Einzelkolonien entwickeln. Nach dem Trocknen der beimpften Nährböden werden die dotierten Collagenvliese auf die Agaroberfläche aufgelegt. Nach 18 + 2 h Bebrütung bei 36 0 C werden die Hemmhöfe gemessen
Ergebnisse:
Das erfindungsgemäße Vlies weist folgende Vorteile auf:
• verbesserte antimikrobielle Wirksamkeit, auch bei multiresistenten Keimen • sehr gute hämostyptische Wirkung
• gute Haftung auf der Wunde bei einfacher Applikation.
Beispiel 11 : Prüfung von erfindungsgemäß mit Polyphenolen dotierten Oberflächen auf antibakterielle Wirksamkeit
Methodik:
Verschiedene Staphylokokken-Stämme wurden mittels Whitley Automatic Spiral- Plater im linearen Modus gleichmäßig auf der Agarplatte (Müller-Hinton-II- Agar Fertigplatten von Becton Dickinson) verteilt.
Polymere Biomaterialien (jeweils 1 cm2) werden nach Contrib. Plasma Phys. 41, 2001, 562-572 im Ammonik-Plasma funktionalisiert. Danach erfolgte die Umsetzung mit 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamid (12,5 mM) unter dem Einfluss der Laccase (0,32 U (156 nmol ml"1 min"1). Der Lösungsmittelanteil an Methanol betrug 10% (v/v).
Nach dem Trocknen werden die Platten auf den Agar gelegt
Ergebnis:
2 Bei der Kontrolle werden 120 Keime/cm gezählt. Unter den beschichteten Oberflächen lassen sich keine Keime nachweisen.
Beispiel 12: Verwendung der erfindungsgemäßen Kombination zur Versorgung blutender Wunden.
Methodik:
Ratten werden wie in Beispiel 7 narkotisiert, der Bauchraum geöffnet und eine
Schnitt in der Leber gesetzt. Die Blutung wird wie in Beispiel 7 c gestillt. Die sich bildende Kruste wird entfernt. Anschließend wird der Schnitt mit Wundkleber geklebt.
Dafür werden die in Beispiel 6 beschriebenen Oligopeptide in PBS (Phosphate
Buffered Saline, 2,7 M NaCl, 54 raM KCl, 87 mM Na2HPO4, 30 mM KH2PO4, pH 7.4) aufgenommen und Laccase zugegeben (Komponente 1). 2,5-Dihydroxy-N-(2- hydroxyethyl)-benzamid wird in PBS gelöst (Komponente 2). Es werden verschiedene Verhältnisse von Oligopeptid/2, 5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benz- amid/Laccase getestet, z.B. 1/1/0,1 ; 1/2/0,5; 1/10/1) Die Menge an Lösungsmittel wird minimal gewählt, um eine möglichst konzentrierte Lösung der Komponenten zu erreichen. Die Komponenten werden in eine Zweikomponentenspritze mit Mischextruder vom Typ Mixpac (Mixpac Systems, Rotkreuz, Schweiz) gegeben und in den Wundspalt eingebracht.
Ergebnis: Bereits durch das Hämostyptikum erfolgt ein guter Wundverschluss. Der Kleber kann direkt in den resultierenden engen Spalt gegeben werden. Es resultiert eine sehr feste Verklebung der Wundränder.
Beispiel 13: Verklebung von Collagen
Methodik:
Collagenfolie (DOT GmbH) wurde auf einer ebenen Unterlage fixiert.
Die Collagenfolie wurde in 8 Segmente (je 4 in zwei Reihen) unterteilt und der Kleber direkt auf der Folie (unter Ausnutzung der Oberflächenspannung) zusammengemischt. Der Kleber war in Phosphat-Citrat-Puffer gelöst.
Es wurden unterschiedliche Konzentrationen Brückenmoleküls (Laccase-Substrat) getestet. Das Kleberprotein hatte ein MW von ca. 4000D)
Anschließend wurden kleine Collagenfolienstücke aufgebracht, leicht angedrückt und trocknen gelassen.
Ergebnis:
Es wurde beim Verkleben von Collagen eine feste Bindung erreicht.
Die Verklebung erfolgt auch ohne Zugabe von Kleberproteinen. Durch die Kleberproteine wird jedoch die Bindungskraft verstärkt.
Beispiel 14: Mischung einer Collagenlösung mit dem Kleber Mikroskopisch ist nach dem Vermischen der Collagenlösung mit dem Kleber eine starke Strukturierung zu erkennen. Die gelösten und zufallig angeordneten Collagenmoleküle werden parallelisiert - unter Ausbildung von Fasern.
Beispiel 15: Verkleben von Collagen und Polystyren
Methodik:
Ein Tropfen (20μl) Citrat-Phosphat-Puffer (Kontrolle) bzw. Kleberlösung (Puffer, Laccase, Laccase-Substrat) wurde auf die Oberfläche einer 60mm TCPS- Zellkulturschale aufgebracht und je ein kleines Stück Collagenfolie (8x4mm) aufgesetzt und leicht angedrückt und dann trocknen gelassen.
Ergebnis:
Trotz der absolut glatten und inerten Oberfläche wurde eine Verklebung erreicht. Das Collagen wurde dauerhaft mit dem Untergrund verbunden.
Beispiel 16: Zelladhäsion an den mit Collagen beladenen Oberflächen
Methodik:
Die Zelladhäsion wurde mit einer Fibroblasten-Zelllinie (FL-Zellen) untersucht.
Die Zelladhäsion erfolgte an 60 mm TCPS-Zellkulturschale, die nach Beispiel 15 mit Collagen beschichtet war. Nach Anfärbung der Zellen mit Kristallviolett erfolgte die Auswertung mit dem CellExplorer
Ergebnis:
Die FL-Zellen werden stärker gebunden (siehe Abbildung 1)

Claims

Patentansprüche
1. Kit umfassend die Einzelkomponenten a) Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para- Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen
Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und c) Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische
Polyphenoloxidasen, wobei die Einzelkomponenten b) und c) nicht in Kontakt stehen.
2. Kit nach Anspruch 1, worin die freie Aminogruppe durch eine
Diaminosäure erhalten wird.
3. Kit nach Anspruch 1 oder 2, worin die Polymere mit den
Dihydroxyaromaten und/oder den lignolytische Polyphenoloxidasen in Kontakt stehen.
4. Kit nach einen der Ansprüche 1 bis 3, worin der Kit eine Spritze darstellt, die zwei Kanülen aufweist, über die die Dihydroxyaromaten und die lignolytischen Polyphenoloxidasen getrennt abgegeben werden können.
5. Kleber umfassend die Einzelkomponenten a) Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, wobei die Polymere nicht Bestandteil des menschlichen Körpers sind, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para- Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und c) Polyphenoloxidasen, insbesondere lignolytische Polyphenoloxidasen, wobei die Einzelkomponenten b) und c) in Kontakt stehen.
6. Kleber nach Anspruch 5, worin die Einzelkomponenten a) bis c) in Kontakt stehen.
7. Zeolithgranulat mit einen Zeolithanteil von mindestens 70 Gew.-% und einer mittleren Porengröße von 0,3 bis 0,5 nm, wobei das Zeolithgranulat durch die Schritte Vermählen, Fraktionierung und Dehydratisierung bei Temperaturen unter 200 °C erhalten wird.
8. Zeolithgranulat nach Anspruch 7, wobei das Zeolithgranulat eine mittlere
Korngröße von 0,2 bis 0,8 hat.
9. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 8, worin das Zeolithgranulat Biomassen aus aquatischen Organismen umfasst.
10. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 9, worin die Biomasse einen Lipidanteil > 20 % besitzt.
11. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 10, worin die aquatischen Organismen antibakterielle Aktivität besitzen und/oder Poly-N-Acetyl-Glucosamine enthalten.
12. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 1 1, worin gefriergetrocknete Biomassen der Grünalge Chlamydomonas und / oder der Mikroalgen Spirulina und / oder Anabaena eingesetzt werden.
13. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 12, worin die Biomasse und das Zeolithgranulat im Verhältnis von 1 : 10 bis 10: 1 gemischt sind.
14. Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche 7 bis 13, worin sich das Zeolithgranulat und optional die Biomasse in einer Umhüllung, vorzugsweise auf Zellulosebasis oder auf textiler Basis oder einem Collagenvlies, befindet(befinden).
15. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, worin der Kit oder Kleber als weitere Einzelkomponente d) ein Zeolithgranulat nach einem der Ansprüche 7 bis 14 umfasst.
16. Kit nach Anspruch 15, worin das Zeolithgranulat nicht in Kontakt mit den anderen Einzelkomponenten a) bis c) steht.
17. Kleber nach Anspruch 15, worin das Zeolithgranulat in Kontakt mit den anderen Einzelkomponenten steht.
18. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 17, worin die Aromaten substituiert sind.
19. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 18, worin die Dihydroxyaromaten 2,5-Dihydroxybenzamide sind.
20. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 19, worin die Dihydroxyaromaten 2,5-Dihydroxy-N-(2-hydroxyethyl)- benzamid sind.
21. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 20, worin die lignolytischen Polyphenoloxidasen Laccasen sind.
22. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 21 , worin die Polymere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligopeptide, Peptide und Eiweiße.
23. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 22, worin die Polymere Lysin-haltig sind.
24. Kit oder Kleber nach einen der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6 und 15 bis 23, worin die Polymere Lysin-haltige Oligopeptide oder Kollagen sind.
25. Kit, Kleber, oder Zeolithgranulat nach einen der vorhergehenden Ansprüche als Arzneimittel.
26. In einem wässerigen Milieu einsetzbares Klebeverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass unter Verwendung des Klebers nach einen der Ansprüche 5, 6, 15, 17 bis 24 eine feste, vernetzte resorbierbare
Verbindung erfolgt.
27. Verwendung eines Kits umfassend die Einzelkomponenten a) optional Polymere mit mindestens einer freien Aminogruppe, b) Brückenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monocyclischen ortho-Dihydroxyaromaten, monocyclischen para-
Dihydroxyaromaten, bicyclischen Monohydroxyaromaten, polycyclischen Monohydroxyaromaten, bicyclischen Dihydroxyaromaten, polycyclischen Dihydroxyaromaten, bicyclischen Trihydroxyaromaten, polycyclischen Trihydroxyaromaten, und deren Mischungen, und c) Polyphenoloxidasen, wobei die Einzelkomponenten b) und c) nicht in Kontakt stehen, zur
Herstellung eines Klebers für das Verschließen von Wunden.
28. Verwendung nach Anspruch 27, worin der Kit zusätzlich nach einen der Ansprüche 2 bis 4, 15, 16 und 18 bis 24 definiert ist.
29. Verwendung eines Kits umfassend Zeolithgranulate nach einen der Ansprüchen 7 bis 14 zur Herstellung eines Klebers für das Verschließen von Wunden.
30. Verwendung nach einen der Ansprüche 27 bis 29 zur Vernetzung von Kollagen.
31. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 30 zur Schaffung eines blutfreien Operationsfelds.
32. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 30 zur Abdichtung von Anastomosen und Patchen an Gefäßen bzw. auf Hohlorganen.
33. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 32, worin die Abdichtung über einen Gewissen Zeitraum resorbiert wird.
34. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 33, worin die Abdichtung flexibel ist.
35. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 34zur
Wundheilung chronischer Wunden.
36. Verwendung nach einen der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 35 zur Wundsanierung bei infizierten Wunden.
37. Verwendung nach der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 36 zum Verkleben von Organen, Geweben oder Knochen sowie Knochen mit Implantaten.
38. Verwendung des Zeolithgranulats nach irgendeinen der Ansprüchen 7 bis 14 zur Herstellung eines Hämostyptika zum Verschließen von Wunden.
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