DK162388B - Thioler til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af cephalosporansyrederivater - Google Patents

Description

i

DK 162388 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte thioler til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af cephalosporansyrederi-vater med den almene formel (I) 5 g ! ,^Snn _

R-CH-CO-NH-C-CH CHo N N

* /-K 1

0 *1 (CHJnCOOH

C-OU 2 n

II

O

10 hvori R betegner R2~0'R2“Oei^e7^^' hvor R2 betegner hydrogen, hydroxy eller en eventuelt substitueret ami-15 nomethylgruppe, Y betegner hydrogen, hydroxy eller en eventuelt substitueret aminogruppe, R3 betegner hydrogen eller methoxy, og n er et helt tal fra 1-9 inkl., eller let hydrolyserbare estere eller ikke-toksiske farmaceutisk acceptable salte deraf, med den begrænsning, at når n er 2-9, har R - CH - betydningen 20 I ØTc“f-2

Y

og R3 betegner hydrogen.

Thiolerne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel (II) 25 U-Il

II II

HS-C. Λ\

X II

1 (II) C,,2 nC02H 30 hvori n er et helt tal fra 1-9 inkl., eller de er ikke-toksiske salte deraf.

Forbindelserne med den almene formel (I) er hidtil ukendte forbindelser, der er værdifulde som antibakterielle midler, og de har i forhold 35 til kendte, nært beslægtede cephalosporansyrederivater vist sig at have forbedret vandopløselighed og i almindelighed give en højere blodspejls-, værdi ved parenteral administrering ad intramuskulær vej.

Forbindelserne med formel (I), hvori n er 2 til 9, og deres værdi-

DK 162388 B

2 fulde egenskaber er beskrevet og dokumenteret i dansk frem!æggel ses-skrift nr. 147483, mens de øvrige forbindelser med formel (I) og deres værdifulde egenskaber er beskrevet og dokumenteret i dansk fremlæggelsesskrift nr. 145262.

5 Thi olerne med formel (II) kan fremstilles ved, at man (a) behandler et isocyanat med formlen 0

II

10 Rioo.o-C-(CH2)n-N=C=S

hvori n har den ovenfor anførte betydning, og R100 betegner al kyl med 1 til 6 carbonatomer, phenyl, phenylalkyl eller substitueret phenyl eller phenylalkyl, med natriumazid til dannelse af thiolesteren med formlen 15 n_n i '1 »S-- (in^nGo/00 20 hvori n og R100 har den ovenfor anførte betydnining, og (b) hydrolyserer thiolesteren til dannelse af den ønskede thiolsy-re med formel (II).

En thiol med formlen (Ila) 25

N-N

I n ns-LNy (I la) CH COOH 30 kan fremstilles ved, at man (a) behandler 1-methyl-5-mercaptotetrazol med en organolithiumfor-bindelse til fremstilling af det tilsvarende lithiumderivat, og (b) behandler det resulterende lithiumderivat med carbondioxid og 35 efterfølgende hydrolyserer til dannelse af forbindelsen med formlen (Ha).

Cephalosporansyrederivaterne med formel (I) kan fremstilles ud fra mellemprodukterne med formel (II) ved, at man omsætter et sådant mellem-

DK 162388 B

3 produkt med en forbindelse med den almene formel R3

R1- NH- C-^ S N

I I 1 s (III) 5 o*-N>s^CII2OCCIl3 COOll hvori R1' betegner H eller R-CHY-CO-, hvor R, Y og R3 har de ovenfor anførte betydninger, eller et salt eller en let hydrolyserbar ester deraf, og, når R1' betegner H, behandler den resulterende forbindelse med et 10 acyleringsmiddel med formlen

R-CH-CO-X

Y

15 hvori X betegner halogen eller et funktionelt ækvivalent deraf, og R og Y har den ovenfor angivne betydning, som når Y er fri amino eller hydroxyl, beskyttes på disse grupper ved hjælp af konventionelle beskyttende grupper, som senere fjernes til frembringelse af en forbindelse med for-20 mel (I), og at man om ønsket omdanner en resulterende fri syre eller et salt af en forbindelse med formel (I) til en let hydrolyserbar ester eller et ikke-toxisk farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller omdanner et resulterende salt eller en let hydrolyserbar ester af en forbindelse med formel (I) til den tilsvarende frie syre med formlen (I).

25 Som acyleringsmiddel anvendes som nævnt et halogenid eller et funktionelt ækvivalent deraf.

Sådanne funktionelle ækvivalenter omfatter de tilsvarende syreanhy-drider, herunder blandede anhydrider og især de blandede anhydrider fremstillet ud fra stærkere syrer såsom de lavere alifatiske monoestere 30 af carbonsyre, eller al kyl- og arylsul fonsyrer og af mere hindrede syrer såsom diphenyl eddikesyre. Et særligt værdifuldt anhydrid er et N-carb-oxyanhydrid (også kaldet et Leuch's anhydrid; se US patentskrifter nr. 3.080.356 og 3.206.455) inklusive, men ikke begrænset til D-mandelsyre-carboxyanhydrid (US patentskrift nr. 3.167.549) eller det tilsvarende 35 substituerede D-mandelsyrecarboxyanhydrid. Endvidere kan anvendes et sy-reazid eller en aktiv ester eller thioester (fx. med p-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, thiophenol, thioeddikesyre) eller selve den frie syre kan kobles med forbindelsen (III) efter forudgående omsætning af den frie

DK 162388 B

4 syre med Ν,Ν'-dimethylchlorformiminiumchlorid (GB patentskrift nr.

I. 008.170 og Novak og Weichet, Experientia XXI, 6, 360 (1965)) eller ved anvendelse af enzymer eller af en Ν,Ν'-carbonyldiimidazol eller en N,N'-carbonylditriazol (jvf. sydafrikansk patentskrift nr. 63/2684) eller et 5 carbodiimidreagens (især Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-diisopropyl-carbodiimid eller N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimid; jvf.

Sheehan og Hess, J. Amer. Chem. Soc., 77, 1967, (1955)) eller af al kyl-ylaminreagens (jvf. R. Buijle og H.G. Viehe, Angew. Chem. International Edition 3, 582, (1964) eller af et isoxasoliumsaltreagens (jvf. R.B.

10 Woodward, R.A. Olofson og H. Mayer, J. Amer. Chem. Soc., 83, 1010 (1961)), eller af et keteniminreagens (jvf. C.L. Stevens og M.E. Munk, J. Amer. Chem. Soc., 80, 4065 (1958)) eller af hexachlorcyclotriphos-phatriazin eller hexabromcyclotriphosphatriazin (US patentskrift nr. 3.651.050) eller af diphenylphosphorylazid (DPPA; J. Amer. Chem. Soc., 15 94, 6203-6205 (1972)) eller af di ethylphosphorylcyanid (DEPC; Tetrahedron Letters nr. 18, pp. 1595-1598 (1971)) eller af diphenylphosphit (Tetrahedron Letters nr. 49, pp. 5047-5050 (1972)). Et andet ækvivalent af syrechloridet er et tilsvarende azolid, dvs. et amid af den tilsvarende syre, hvis amidnitrogen indgår i en quasi-aromatisk 5-leddet ring 20 indeholdende mindst to nitrogenatomer, dvs. imidazol, pyrazol, triazo-lerne, benzimidaol, benzotriazol og deres substituerede derivater. Som et eksempel på den almene fremgangsmåde til fremstilling af et azolid omsættes Ν,Ν'-carbonyldiimidazol med en carboxylsyre i ækvimolære mængder ved stuetemepratur i tetrahydrofuran, chloroform, dimethyl formamid 25 eller et tilsvarende inert opløsningsmiddel til dannelse af carboxylsy-reimidazolidet i praktisk taget kvantitativt udbytte under frigørelse af carbondioxid og et mol imidazol. Dicarboxyl syrer danner diimidazolid. Biproduktet, imidazol, udfælder og kan fraskilles og imidazolidet isoleres, men dette er ikke væsentligt. Fremgangsmåderne til udførelse af 30 disse omsætninger til fremstilling af en cephalosporin, og fremgangsmåderne, som anvendes til isolering af den således fremstillede cephalosporin, er i og for sig kendte.

Ovenfor omtaltes anvendelsen af enzymer til kobling af den frie syre med forbindelse (III). Inden for rammerne af sådanne fremgangsmåder 35 falder anvendelsen af en ester, fx. methyl esteren, af den pågældende frie syre med enzymer tilvejebragt af forskellige mikroorganismer, fx. de som er beskrevet af T. Takahashi et al., J. Amer. Chem. Soc., 94(11), 4035-4037, og af T. Nara et al., J. Antibiotics (Japan) 24(5), 321-323

DK 162388 B

5 (1971), og i US patentskrift nr. 3.682.777.

Til kobling af den organiske carboxylsyre, inklusive, men ikke begrænset til, en substitueret eller usubstitueret D-mandelsyre (med eller uden en beskyttende gruppe på α-hydroxylgruppen) som beskrevet ovenfor 5 med forbindelse (III) (eller et salt eller fortrinsvis en let hydrolyseret ester eller Schiff-base såsom med benzaldehyd, deraf) er det også hensigtsmæssigt og effektivt som koblingsmiddel at benytte phosphoni-trilchloridtrimer (J. Org. Chem., 33(7), 2979-81, 1968) eller N-ethoxy- 1,2-dihydroquinolin (EEDQ) som beskrevet i J. Amer. Chem. Soc., 90, 823-10 824 og 1652-1653 (1968) og US patentskrift nr. 3.455.929. Omsætningen udføres fortrinsvis ved 30-35°C i benzen, ethanol eller tetrahydrofuran under anvendelse af omtrentlig ækvimolære mængder af alle 3 reagenser efterfulgt af konventionel isolering og fjernelse af eventuelle tilstedeværende blokerende grupper ved hjælp af konventionelle metoder.

15 Omsætningen af thiolen med 7-acylaminocephalosporansyren kan udfø res i opløsning såsom i vand eller vandig acetone ved en temperatur på mindst stuetemperatur og fortrinsvis i intervallet fra ca. 50° til ca.

100°C i nærværelse af en mild base såsom natriumhydrogencarbonat, fx. fortrinsvis nær neutralitet såsom ved en pH-værdi på ca. 6. Et overskud 20 af thiolen foretrækkes fortrinsvis. Reaktionsproduktet isoleres ved forsigtig surgøring af reaktionsblandingen efterfulgt af ekstraktion med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel.

Når den organiske carboxylsyre indeholder en funktionel gruppe såsom amino eller hydroxyl, er det ofte ønskeligt først at blokere (eller 25 beskytte) amino- eller hydroxygruppen, dernæst udføre koblingsreaktionen og endelig underkaste den resulterende forbindelse kemisk fjernelse af den beskyttende gruppe, dvs. underkaste den resulterende forbindelse en elimineringsreaktion for den beskyttende gruppe.

Udtrykket "(lavere)al kyl" betegner i den her anvendte betydning så-30 vel ligekædede som forgrenede alifatiske carbonhydridgrupper med fra 1-10 carbonatomer såsom methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, amyl, hexyl, 2-ethylhexyl, heptyl, decyl, etc. Tilsvarende henviser udtrykket "(lavere)", hvor det anvendes som del af beskrivelsen af en anden gruppe, fx. "(lavere)alkoxy", til alkyldelen af en sådan grup-35 pe, som derfor har den ovenfor i forbindelse med "(lavere)al kyl" anførte betydning.

De omtalte salte omfatter de ikke-toxiske carboxyl syresal te deraf, herunder ikke-toxiske metalsalte såsom med natrium, kalium, calcium og

DK 162388 B

6 aluminium, ammoniumsaltet og de substituerede ammoniumsalte, fx, salte af ikke-toxiske aminer såsom tri al kyl aminer, herunder triethylamin, pro-cain, dibenzylamin, N-benzyl-beta-phenethylamin, 1-ephenamin, Ν,Ν'-di-benzylethylendiamin, dehydroabietylamin, N,Ν'-bis-dehydroabietylethylen-5 diamin, N-(lavere)-alkylpiperidin, fx. N-ethylpiperidin og andre aminer, som hår været anvendt til at danne salte med benzyl penicillin, endvidere de ikke-toxiske syreadditionssalte deraf (dvs. aminsalte), herunder mineral syreadditionssal te såsom hydrogenchloridet, hydrogenbromidet, hy-drogeniodidet, sulfatet,- sulfamatet og phosphatet og de organiske syre-10 additionssalte såsom maleatet, acetatet, citratet, oxalatet, succinatet, benzoatet, tartratet, fumaratet, malatet, mandelatet, ascorbatet og lignende.

I de forbindelser (anvendt enten som mellemprodukter eller metaboliske prækursorer), hvori aminogruppen er "blokeret", kan fx. anvendes 15 substituenter såsom 2-iodethoxycarbonyl (GB patentskrift nr. 1.349.673), t-butoxycarbonyl, carbobenzyloxy, formyl, o-nitrophenylsulfenyl, trichlorethoxycarbonyl, 4-oxo-2-pentenyl-2, l-carbomethoxy-l-propenyl-2 og lignende. Navnlig omfatter sådanne blokerende grupper ketonerne (specielt acetone) og aldehyderne (specielt formaldehyd og acetaldehyd), som 20 eksempelvis er omhandlet i US patentskrifterne nr. 3.198.804 og 3.347.851, samt jS-ketoestrene og Ø-diketonerne, der fx. er omhandlet i US patentskrift nr. 3.325.479, og /i-ketoamiderne, som er omhandlet i japansk patentskrift nr. 71/24714 (Farmdoc 47.321S).

De foretrukne estere af cephalosporansyrederivaterne fremstillet ud 25 fra thiolerne ifølge den foreliggende opfindelse er pivaloyloxymethyl-, acetoxymethyl-, methoxymethyl-, acetonyl- og phenacylestrene. Alle er værdifulde mellemprodukter til fremstilling af cephalosporinen med en fri carboxyl syregruppe, og de 3 førstnævnte er endvidere af interesse, fordi de ved oral administrering tilvejebringer forskellige absorptions-30 hastigheder og -mængder og giver varierende koncentrationer af det aktive antibakteriel le middel i blod og væv.

Som antydet ovenfor fremstilles hver af disse 5 estere af 7-amino-cephalosporansyre ved hjælp af i og for sig kendte fremgangsmåder. En særlig god fremgangsmåde er den i US patentskrift nr. 3.284.451 omhand-35 lede, ifølge hvilken natriumcephalothin esterificeres ved omsætning med den tilsvarende aktive chlor- eller bromforbindelse (fx. phenacylbromid, chloracetone, chlormethylether, pivaloyloxymethylchlorid (også kaldet chlormethylpivalat) acetoxymethylchlorid), hvorefter thienyl eddikesyre-

7 DK 162388 B

sidekæden fjernes enzymatisk, fx. som beskrevet i samme patentskrift, eller kemisk, som beskrevet i US patentskrift nr. 3.575.970 og i Journal of Antibiotics, XXIV, 811), 767-773 (1971). En anden god fremgangsmåde består i, at triethyl aminsaltet af 7-aminocephalosporansyre omsættes di-5 rekte med den aktive halogenforbindelse såsom i GB patentskrift nr.

1.229.453.

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved udførelseseksempler. Eksempel 1 og 2 illustrerer fremstillingen af forbindelserne ifølge opfindelsen, mens de øvrige eksempler illustrerer omdannelsen af forbind-10 eiserne ifølge opfindelsen til de værdifulde slutprodukter. Alle temperaturer er i grader Celcius. 7-aminocephalosporansyre forkortes til 7-ACA; -ACA- betegner den del, som har strukturen

S

15 -NH-CH—CH ^CH- o^C~N\c^C"CH2~

COOH

20 0 og 7-ACA kan derfor betegnes H-ACA-O-C-CH^.

Methyl isobutylketon betegnes MIBK.

"Skel lysol ve B" er en petroleumsetherfraktion med kogepunkt 60-68°C 25 bestående i det væsentlige af n-hexan.

"LA-1" harpiks er en blanding af sekundære aminer, hvori hver sekundær amin har formlen R1 I , 30 CH3(CH2)10CH2NHC - R2 3 2

R

DK 162388 B

8 lationsinterval ved 10 mm, indtil 170°C - 0,5%, 170-220°C - 3%, 220-230°C - 90% og over 230°C - 6,5%.

"IR-120" kaldes også "Amber!ite IR-120" og er en stærk kationbyt-terharpiks indeholdende sulfonsyreradikaler. "Amberlite IR-120" er en i 5 handelen tilgængelig kationbytterharpiks af polystyrensulfonsyretypen, og den er mere specielt en kernesulfoneret polystyrenharpiks tværbundet med divinylbenzen opnået ved den. fremgangsmåde, som er anført af Kunin,

Ion Exchange Resins, 2. udgave (1958), John Wiley and Sons, Inc. Der henvises fx. til siderne 84 og 87.

10 Reagenserne, som anvendes til fremstilling af de her omhandlede forbindelser eller de deraf fremstillede slutprodukter, syntetiseres enten som beskrevet i den kendte teknik (som fx. i de ovenfor nævnte patentskrifter og publikationer) eller ved hermed helt analoge fremgangsmåder. Når der eksempelvis anvendes en D-(-)-<*-aminosyre, fremstilles 15 den i henhold til de fremgangsmåder, der er omtalt i US patentskrifterne nr. 3.198.804, 3.342.677 eller 3.634.418 eller af Friis et al., Acta Chem. Scand. 17, 2391-2396 (1966) eller af Neims et al., Biochemistry (Wash.) 5, 203-213 (1966) eller i andre publikationer om dette emne.

Nogle specifikke eksempler på sådanne synteser er anført i det tidligere 20 omtalte DK fremlæggelsesskrift nr. 145.262.

Eksempel 1

l-carboxymethyl-5-mercaptotetrazol oc n-N

I! I!

HS - C N

ch2cooh 30 a) Omkrystallisation af 1-methyl-5-mercaptotetrazol Fremgangsmåde 1. 110 g 1-methyl-5-mercaptotetrazol opslæmmes i 350 ml kogende 35 chloroform. Der opnås næsten fuldstændig opløsning. 1

Den varme opløsning (50-60°) filtreres hurtigt ved hjælp af vakuum gennem en opvarmet Buchner-tragt (11 cm SS nr. 604 papir inde- 9

DK 16238 8 B

holdende ca. 6,4 til ca. 8,5 mm pakket filtreringshjælpemiddel ("Super-cel"). Filtreringspuden udvaskes med 50 ml 50-60°C chloroform, som sættes til filtratet.

5 3. Filtratet afkøles til ca. 0-6°C og holdes ved 0-6°C i to ti mer. Krystallerne, som er dannet, opsamles ved filtrering ved 0-6°C og vaskes med 60 ml 0-6°C chloroform, som sættes til filtratet. Krystallerne (portion A) lufttørres ved 37-45°C i 18 timer.

10 4. Filtratet koncenteres på vakuumrotationsfordamper (60°C bad) til ca. halvt volumen. Denne opslæmning afkøles til 0-6°C og holdes ved

0-6°C i 2 timer. Krystallerne opsamles ved filtrering ved 0-6°C, vaskes med 40 ml 0-6°C chloroform, som sættes til filtratet. Krystallerne (portion B) lufttørres ved 37-45°C i 18 timer. Krystal portionerne A og B

15 blandes til opnåelse af et udbytte på ca. 65 vægtprocent.

5. Filtratet fra portion B, trin 4, kan oparbejdes to gange som beskrevet i trin 4 til opnåelse af yderligere 15% udbytte.

20 b) Fremstilling af di natriumsaltet af l-carboxymethyl-5- mercaptotetrazol

Fremgangsmåde 25 1. 500 ml praktisk taget tør og ren tetrahydrofuran i en 2 1 3- halset kolbe med omrører afkøles i et salt-acetone-isbad til ca. -10°C.

Tør nitrogengas blæses på væskeoverfladen.

2. 500 ml 15,06% (1,6 N) butyl 1 i thi um i hexan (Foote Mineral Co.) 30 sættes til tetrahydrofuranen over et tidsrum af 10 minuter under tør nitrogen, og der omrøres. Den praktisk taget fuldstændige opløsning afkøles til -5 til -10°C.

3. 46,4 g 1-methyl-5-mercaptotetrazol (omkrystalliseret som oven- 35 for) opløses i 200 ml i det væsentlige ren og tør tetrahydrofuran. Opløsningen filtreres, hvis den er uklar, og afkøles dernæst til 5-10°C.

4. Den afkølede opløsning fra trin 3 sættes over et tidsrum af

DK 16238 8 B

10 10 minutter under omrøring og under tør nitrogen til butyllithiumopløs-. ningen. Temperaturen bør holdes på -5°C til højst +10°C. Et bundfald kan dannes.

5 5. Blandingen omrøres under tør nitrogen og 0°C til +10°C i en halv time.

6. Vandig carbondioxidgas bobles ved stor hastighed og under hurtig omrøring igennem i 15-20 minutter ca. ved omgivelsernes temperatur 10 (0-10°C) og ikke over 120°C.

7. Det hvide bundfald, som dannes, opsamles på passende måde ved filtrering i et område med lav fugtighed. Bundfaldet udvaskes med ca. 75 ml tetrahydrofuran.

15 8. Bundfaldet opløses i 250 ml vand (pH-værdi 8,5-9,5). Et andet lag tetrahydrofuran kan være til stede. Dette fjernes på vakuumrotationsfordamperen (50°C bad).

20 9. Den vandige opløsning indstilles på pH-værdien 1,6-2,0 med koncentreret saltsyre.

10. Den sure vandige opløsning ekstraheres to gange med 250 ml portioner ethyl acetat. Hver 250 ml ethyl acetatekstrakt modstrømsekstra- 25 heres med 100 ml portioner vand. Vandekstrakterne kasseres. Ethyl acetatekstrakterne (uden noget vandlag) filtreres og blandes.

11. De forenede ethyl acetatekstrakter koncentreres til tørhed på vakuumrotationsfordamperen (60°C bad).

30 12. Krystallerne i kolben koges med 300 ml chloroform i ca. 2 minutter. Den varme opslæmning (50-60°C) vakuumfiltreres gennem en opvarmet Buchner-tragt (11 cm-SS-604 papir). Krystallerne vaskes med ca. 75 ml. - 50°C chloroform. Krystallerne lufttørres ved stuetemperatur i ca.

35 3 timer og bringes dernæst til ca. 100-200 mesh.

13. De 100-200 mesh store krystaller behandles med kogende chloroform nøjagtig som beskrevet i trin 12 (den varme chloroform fjerner det

DK 162388 B

π meste af den uomsatte l-methyl-5-mercaptotetrazol). Udbytte: ca. 45-50 g krystallinsk l-carboxymethyl-5-mercaptotetrazol. Disse krystaller kan indeholde 0,02-0,05 mol 1-methyl-5-mercaptotetrazol.

5 14. Krystallerne fra trin 13 opslæmmes med 250 ml ethyl ether ved stuetemperatur i 3-5 minutter. Blandingen filtreres. De uopløselige stoffer (0,5-5%) kan være en forurenende symmetrisk mercaptotetrazolketon med følgende formodede struktur:

N -N .. N — N

10 I I i’ I I

N /N - C1I_ - C - CH_ - N . M

I I

SH SH

15 ADVARSEL: Denne forbindelse EKSPLODERER ved ca. 205-210°C.

15. Etherfiltratet fra trin 14 inddampes til tørhed på vakuumrotationsfordamperen (50°C bad). Ca. 42 til ca. 48 g krystallinsk 1-carboxy-methyl-5-mercaptotetrazol indeholdende ca. 0,01 til ca. 0,05 mol 1-me- 20 thyl-5-mercaptotetrazol udvindes.

16. Krystallerne opløses i 420 ml absolut ethanol (ca. 100 mg/ml). Opløsningen opvarmes til 50-60°C.

25 17. Til den varme opløsning fra trin 16 sættes 310 ml af en 41% natrium-2-ethylhexanoat (SEH) opløsning i isopropanol under meget hurtig omrøring over et tidsrum af 10 minutter. Et krystallinsk bundfald dannes. Blandingen opslæmmes ved 50-60°C i 20 minutter.

30 18. Blandingen filtreres varm (50-60°C) gennem en opvarmet

Buchner-tragt (11 cm-SS-nr. 604 papir). Krystallerne vaskes med 75 ml 50°C ethanol.

19. De ethanol fugtige krystaller fra trin 18 opslæmmes i 200-300 35 ml ethanol. Opslæmningen ledes gennem en 200 mesh sigte. Opslæmningen opvarmes til 50-60°C i 5 minutter under hurtig omrøring (uomsat natrium-, 1-methyl-5-mercaptotetrazol er meget opløselig i varm ethanol).

DK 162388 B

12 20. Krystallerne opsamles ved 50-60°C på et 11 cm-SS nr. 604 papir i en opvarmet Biichner-tragt. Krystallerne vaskes med 75-100 ml ethanol og vakuumtørres ved 50-60°C i 24-48 timer. Udbytte: 40-48 g dinatrium-1-carboxymethyl-5-mercaptotetrazol (uden l-methyl-5-mercaptotetrazol på-5 vist ved NMR).

Alternativ syntese af l-carboxymethyl-5-mercaptotetrazol 10 ch co_c,H_

1U....... 2 2 2 5 + CS- + NaN

2 3 j vandig NaOH ^ H2 15 N =

N CH2C02H + Na S + C,H OH

N *= ^

^SH

20 Til en omrørt blanding af 13,95 g (0,10 M giycinethylesterchlorid, 8,0 g (0,20 M) natriumhydroxid og 8,17 g (0,11 M) carbondisulfid sattes en opløsning af 7,47 g (0,115 M) natriumazid i 125 ml vand. Opløsningen opvarmedes ved tilbagesvaling i 6 1/2 time og opbevaredes i 16 timer ved 25°. Den mørkebrune blanding filtreredes, og filtratet surgjordes til en 25 pH-værdi på 1,5 med koncentreret saltsyre. Opløsningen blev behandlet med carbon, og det gule filtrat ekstraheredes med 4 x 100 ml ethyl acetat. Ethyl acetatet vaskedes med vand, tørredes over magnesiumsulfat og inddampedes ved 40° (15 mm) til en olie. Olien tritureredes med methy-lenchlorid, og produktet opsamledes. Prøven tørredes i vakuum over 30 phosphorpentoxid i 16 timer ved 25°. IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen.

Eksempel 2

Fremstilling af 1-carboxyethyltetrazol-5-thiol 35 N_N

II

HS—-^n/N

(iii2)2-co2H

13

DK 16238 8 B

A) 2-carboethox.yethyl i soc.yanat /8-alani nethyl ester, hydrochloric! (93,6 g), tri ethyl amin (123,5 g) og methylenchlorid (400 ml) sammenblandedes og afkøledes til -10°C. Carbon-di sul fid (46,5 g) opløst i 150 ml chloroform sattes til ovennævnte op-5 løsning over et tidsrum af 2 timer, mens temperaturen holdtes på ca.

-10°C. Da tilsætningen var afsluttet, lod man temperaturen stige til 10°C i ca. 10 minutter. Opløsningen afkøledes igen til -10°C, og 66,8 g ethylchlorformiat i 60 ml chloroform tilsattes dråbevis over et tidsrum af 40 minutter med omrøring. Temperaturen fik lov at stige til stuetem-10 peratur i 30 minutter, og der afkøledes igen til 0°C og tilsattes yderligere 61,6 g triethylamin ved 0°C, hvorefter opløsningen omrørtes ved stuetemperatur i 3 timer.

Blandingen behandledes med vand, og den organiske fase opsamledes, vaskedes med 2 x 250 ml 2N HC1, dernæst med 2 x 250 ml NaHCO, dernæst 15 med 2 x 250 ml vand. Den organiske fase tørredes over Na2$04, og opløsningsmidlet fjernedes i vakuum til dannelse af 93,7 g af en olie, som viste sig at være det ønskede produkt. IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen.

20 B) l-carboxyethyltetrazol-5-thiol

Natriumazid (29,7 g) opløstes i 400 ml vand og opvarmedes til 60°C i en nitrogenatmosfære. 2-carboethoxyethylisocyanat (46,9 g) opløst i 50 ml "Skellysolve B" (i det væsentlige n-hexan) sattes til den opvarmede natriumazidopløsning. Opløsningen omrørtes i ca. 150 minutter ved ca.

25 70-72°C, og afkøledes dernæst til 30°C på et isbad. 50% natriumhydroxidopløsning tilsattes, indtil pH-værdien var 12. Blandingen opvarmedes i 40 minutter ved 70°C og afkøledes til 15°C i et isbad. pH-værdien indstilledes til 2 ved anvendelse af koncentreret HC1, og dernæst ekstrahe-redes med ethyl acetat (4 x 150 ml). Ethyl acetatekstrakterne vaskedes med 30 vand, tørredes derefter over natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdampedes i vakuum, og produktet opsamledes som krystaller fra methylenchlorid til dannelse af 19,5 g af produktet nævnt i overskriften.

Eksempel 3 35 7-amino-3-(l-carboxymethy1tetrazol-5-yl-thiomthyl)-3-cephem-4-carboxys.y-re

DK 162388 B

14

HoN g 2 N 0

Il I1 + J—NL J-CHp-O-C-CH, 5 y-:N -CH2C02Na # 2 3

NaS 'co2h 10

V — ,/S

-d -dl CO H

o i d

15 COgH

1. I en 3-halset kolbe forsynet med omrører, temperaturregulator, termometer og nitrogentilførselsrør anbringes 18 g (0,066 mol) 7-amino-cephalosporansyre og 300 ml 0,1 M pH 6,4 phosphatpuffer (20,7 g monoba- 20 sisk natriumphosphat, 1 Η£θ + 8,5 g dibasisk vandfrit natriumphosphat, q.s. til 2 liter).

2. Under omrøring af den i trin 1 beskrevne blanding tilsættes 1,5 g natriumbi sul fit og 16 g (0,078 mol) l-carboxymethyl-5-mercaptote- 25 trazoldinatrium.

3. Under fortsat omrøring bobles nitrogen gennem blandingen i 10 minutter.

30 4. Under opretholdelse af omrøring og nitrogentilførsel opvarmes opslæmningen over en 20 minutters periode til 56°C. I løbet af dette tidsrum tilsættes 6,5 g natriumbicarbonat i små portioner.

5. Under fortsat omrøring og nitrogentilførsel holdes opløsning- 35 ens temperatur på 56°C i 4 timer. pH-værdien bør forblive mellem 6,2 og 6,6.

6. Reaktionsblandingen afkøles i et isbad til 5°C.

DK 162388 B

15 7. Der tilsættes 50 ml 1:1 phosphorsyre/vandopløsning til blandingen eller koncentreret HC1 til en pH-værdi på 2,0-3,0.

5 8. Produktet opsamles ved filtrering. Filterkagen udvaskes med 20 ml koldt vand efterfulgt af 200 ml kold methanol.

9. Det faste stof lufttørres til konstant vægt. (Et typisk forsøg gav 14,5 g produkt). Dette produkt kan variere i farve fra gult til mør- 10 kebrunt.

10. Produktet ledes gennem en 200 mesh rustfri stål sigte.

11. 10 g af 200 mesh pulveret suspenderes i 200 ml n-propanol und- 15 er kraftig omrøring.

12. 2,0 ml koncentreret saltsyre tilsættes, og der omrøres kraftigt i 0,5 time ved stuetemperatur.

20 13. Opslæmningen filtreres. De brune faste stoffer udvaskes med 20 ml n-propanol, og vaskevæsken sættes til filtratet (filterkagen gemmes til eventuel udvinding af yderligere produkt).

14. 1,5 g trækul ("Darco G-60") sættes til n-propanolfiltratet fra 25 trin 13. Der opslæmmes i 0,5 time. Carbonet fjernes ved filtrering. Car- bonet vaskes med 20 ml n-propanol, og vaskevæsken sættes til filtratet.

15. Under kraftig omrøring sættes triethylamin til n-propanolfiltratet til en tilsyneladende pH-værdi på 3,0. Der dannes krystaller. Der 30 opslæmmes i 10 minutter.

16. De hvide krystaller opsamles ved filtrering og vaskes med 30 ml n-propanol, 50 ml methanol og vakuumtørres ved 40° i 24 timer. Udbytte: 4-8 g 7-amino-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4- 35 carboxylsyre.

17. En alternativ fremgangsmåde til rensning af 7-amino-3-(l-car-boxy1methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre er følgende:

DK 162388 B

16 a) 10 g af 200 mesh produktet (fra trin 10) opslæmmes i 75 ml 1 N saltsyre i 10-15 minutter ved stuetemperatur. Der filtreres til fjernelse af mørkebrune stoffer.

5 b) 2,5 g trækul ("Darco G-60") tilsættes, og der opslæmmes i 0,5 time.

• c) Carbonet fjeres ved filtrering. Carbonet vaskes med 15 ml 10 vand, og vaskevæsken sættes til filtratet.

d) Under kraftig omrøring sættes koncentreret ammoniakvand til filtratet til pH-værdi 2,5-3,0. Krystaller dannes.

15 e) Krystalmassen opslæmmes i 25 minutter. Krystallerne fjernes ved filtrering. Krystallerne vaskes med 30 ml vand, 50 ml methanol og vakuumtørres ved stuetemperatur. Udbytte: 4-7 g næsten hvide krystaller.

Eksempel 4 20 7-amino-3-(l-carboxyethyltetrazol-2-y1thiomethy1)-3-cephem-4-carboxy1sy-re

Til en suspension af 5 g (0,029 mol) l-carboxyethyltetrazol-5-thiol, 7 g (0,026 mol) 7-aminocephalosporansyre og 500 mg natriumbi sulfit i 300 ml IM phosphatpuffer med pH 6,4 sattes fast natriumbicarbonat, 25 indtil der opnåedes en klar opløsning. Opløsningen opvarmedes til 55°C under nitrogen i 3 1/2 time. Derefter køledes opløsningen til 5°C og gjordes sur til pH 2 med 1:1 phosphorsyre. Det rå faste stof opsamledes, vaskedes med vand og overførtes til en kolbe indeholdende 200-300 ml methanol. Opslæmningen behandledes dråbevis med koncentreret saltsyre, 30 indtil det faste stof gik i opløsning. Efter dråbevis tilsætning af koncentreret ammoniumhydroxid til pH 7 fældede produktet ud, og det vejede 5 g. Produktet omkrystalliseredes fra fortyndet saltsyre (pH 1,5), behandledes med carbon og indstilledes til pH 5 med koncentreret ammoniumhydroxid, hvilket gav ialt 2 g af det ønskede produkt. IR (KBr) 1810 35 (s), 1725 (s), 1725 (s), 1620 (m), 1550 (s), 1420 (s), 1355 (m) cm"1. *H NMR (CD30D/DC1) 5,2-5,4 (d,2), 4,4-4,8 (m, 4), 3,9 (s,2), 3,1-3,3 (m,2). Analyse beregnet for C^H^NgOgSg H^O: C, 35,66, H, 3,99, N, 20,70 fundet: C, 36,09, H, 3,85, N, 20,12

DK 162388 B

17

Eksempel 5 7 - (2 - ami nometh.yl phenyl acet ami do) -3 - (1 - carboxymethyl tetrazol-5-ylth i orne-th,yl)-3-cephem-4-carboxylsyre 5 CHpNII0 _/ 2 ^

\\ /)-CH2C0NHT—r > N-N

10 CO OH CHgCOOH

1. I en 3-hal set kolbe indeholdende 100 ml afioniseret vand og forsynet med en omrører og termometer tilsættes 7,6 g (0,021 mol) 7-ami-no-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre og 15 3,4 g (0,034 mol) N-methylmorpholin. Der afkøles til 0°C. Med omrøring holdes opløsningen på 0°C ved anvendelse af isbad.

2. I en separat kolbe forsynet med en omrører anbringes 9,6 g (0,03 mol) natrium-2-(1-methoxycarbonyl-l-propen-2-ylaminomethyl)phenyl - 20 acetat og 184 ml tetrahydrofuran. Med omrøring afkøles suspensionen til -30°C ved anvendelse af et tøris-acetonebad. Under fortsat omrøring og temperaturen på -30°C tilsættes 20 dråber dimethyl benzylamin og 4,4 g (0,03 mol) isobutylchlorformiat. Den fremkomne blanding omrøres i 5 minutter.

25 3. Tilsæt hele blandingen fra trin 2 til omrøringsopløsningen i trin 1 på én gang. Den resulterende opløsning holdes på 3°C med omrøring 1 time.

30 4. Afdamp tetrahydrofuranen fra reaktionsblandingen ved 30°C ved at anvende vakuum (15 mm).

5. Indstil pH-værdien af den tilbageblevne vandige opløsning til 4,0 ved anvendelse af koncentreret saltsyre.

35 6. Tilsæt 2,5 g trækul ("Darco G-60") til opløsningen og bland i 20 minutter. Fjern carbonet ved filtrering.

DK 162388 B

18 7. Filtratet lagdeles med 120 ml ethylacetat, og med omrøring sænkes pH-værdien til 3,8 med koncentreret saltsyre. Lyst tanfarvet fast stof kan udskille og fjernes ved filtrering. (Gemmes til oparbejdning og genindvinding).

5 8. Ved anvendelse af isbad afkøles filtratet til 5°C, og med omrøring sænkes pH-værdien til 2,5-2,8 med koncentreret saltsyre. Temperaturen holdes ved 5°C, og omrøringen fortsættes 1 time.

10 9. Produktet opsamles ved filtrering. Filterkagen vaskes med 5 ml koldt afioni seret vand efterfulgt af 5 ml kold methanol.

10. Den faste 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyl-tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre lufttørres til konstant 15 vægtmængde. (Ved et typisk forsøg opnåedes 4,1 g af produktet).

11. Det opnåede produkt fra trin 10 ledes gennem en 200 mesh rustfri stål sigte.

20 12. 10 g af dette 200 mesh produkt opslæmmes i 100 ml chloroform, 5 ml tri ethylamin tilsættes, og blandingen opvarmes til 50°C med hurtig omrøring. Blandingen opslæmmes ved 50°C i 5 minutter.

13. Blandingen filtreres varm (7-ACA, 7-amino-3-(l-carboxymethyl-25 tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, pigmenter og andre urenheder er opløselige i den varme chloroformtriethylaminopløsning). Filterkagen vaskes med 25 ml chloroform og lufttørres i 2 timer. Udbytte: 1-8 g 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

30 14. Produktet, der opnåedes i trin 13, ledes gennem en 200 mesh sigte.

15. 10 g af dette 200 mesh produkt opslæmmes i 75 ml 0,1 N saltsy-35 re i 10-15 minutter. Blandingen filtreres, og filterkagen vaskes med 25 ml vand, 50 ml methanol og lufttørres ved stuetemperatur i 2-3 timer.

Udbytte: Der opnåedes op til 10 g.

DK 162388 B

19 16. 10 g 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetra-zol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, der opnåedes i trin 15, op-slæmmes i 65 ml methanol.

5 a) Der tilsættes 2 ml koncentreret saltsyre. Der opnås en opløs ning eller næsten opløsning. Der omrøres i 5 minutter.

b) Til opløsningen a) ovenfor sættes hurtigt 130 ml vand med kraftig omrørring. Der opnåedes en øjeblikkelig udfældning (indeholdende 10 det meste af farven). (Det er nødvendigt med en pH-værdi på 1,3 til 1,6).

c) Blandingen opslæmmes i 1 minut og filtreres hurtigt. (Det faste stof gemmes til oparbjedning og genindvinding).

15 d) Filtratet podes og omrøres moderat. Krystalliseringen vil indtræde efter 15-30 minutter.

e) Blandingen omrøres ved omgivende stuetemperatur eller ved 4°C

20 i 2 timer efter krystalliseringen er begyndt.

f) Krystallerne fjernes ved filtrering, vaskes med 25 ml 65% vand-, 35% methanol bl ånding (v/v), 50 ml methanol og vakuumtørres ved 50°C i 24 timer. Udbytte: Op til 9 g renset, hvidt 7-(2-aminomethy1phe- 25 nylacetamido)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-car-boxylsyre opnås.

17. I det følgende belyses to alternative fremgangsmåder til krystal i seri ng af 7-(2-ami nomethyl phenylacetami do)-3-(1-carboxymethyltetra- 30 zol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

A.

1. 10 g af det opnåede produkt i trin 15 opslæmmes i 100 ml me- 35 thanol.

2. Der tilsættes 2 ml koncentreret saltsyre, og der opnås en opløsning eller næsten opløsning.

DK 162388 B

20 3. Der tilsættes 1,5 g trækul ("Darco G-60", og blandingen op-slæmmes i 0,5 time.

5 4. Carbonet fjernes ved filtrering og vaskes med 20 ml methanol.

Methanol vaskevæsken tilsættes filtratet.

5. 120 ml vand tilsættes filtratet. (En lille mængde udfældning kan vise sig. Denne fjernes ved filtrering og gemmes til oparbejdning og 10 genindvinding).

6. Opløsningen fra trin 5 omrøres hurtigt og indstilles til en pH-værdi 2,5-3,0 med 10% natriumhydroxid. Der dannes krystaller.

15 7. Blandingen opslæmmes i 0,5 time. Krystallerne fjernes ved kry stallisering, vaskes med 20 ml 50% methanol vand (v/v), 30 ml methanol og vakuumtørres ved 50°C i 24 timer. Udbytte: der opnås op til 9 g renset 7-(2-ami nomethyl phenylacetami do)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylth i ome-thyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

20 B.

1. 10 g af det opnåede produkt i trin 15 opslæmmes i 75 ml vand.

25 2. 10% natriumhydroxid tilsættes til en fastholdt pH-værdi på 6,8-7,2. Der kan opnås en opløsning eller delvis opløsning.

3. Der tilsættes 1,5 g trækul ("Darco G-60"), og blandingen opslæmmes i 0,5 time ved en fastholdt pH-værdi på 6,8-7,2 (fortsat til sæt- 30 ning af 0,1 til IN natriumhydroxid).

4. Carbonet fjernes ved filtrering. Carbonet vaskes med 20 ml vand, som tilsættes filtratet.

35 5. pH 6,8-7,2 opløsningen i trin 4 kan krystalliseres ved en pH- værdi på 2,5-3,0, som beskrevet under A, trin 6 og 7 ovenfor, eller ved en pH-værdi på 1,2-1,5 (ved tilsætning af saltsyre) og som beskrevet i d, e og f i trin 16. I begge tilfælde opnås op til 9 g krystallinsk 7-

DK 162388 B

21 (2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiome-thyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

Dette produkt opnås ofte som et krystallinsk monohydrat. Når denne 5 forbindelse administreredes intramuskulært ved injektion i en dosis på 10 mg/kg legemsvægt i mus, opnåedes på 15 minutter en blodspejlsværdi på 19,7 mg/ml.

Den dosis af titel forbindelsen, som beskyttede 50% af de udsatte dyr mod en lethal intramuskulær dosis af E. coli A 15119, K. pneumoniae 10 A 9997 og E. cloacae A21020 i mus, var 0,39^-0,42, 1,5-25 og 1-3,2 mg/kg.

Eksempel 6

Di kal i utn-7- (D-o:-hydroxyphenyl acetamido) -3- (l-carboxymethyl tetrazol -5-,ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxy1at 15

<Γ>ΟΗΟΟ,ΝΗΓγΝ M-H

0H /.0

0 C "OK ClIpC-OK

20 o D“ A) 7-(D-ft-formyloxyphenylacetamido)-3-(l-carboxymethylotetrazol-5-yl-thiometh.yl )-3-cephem-4-carbox.yl syre

Til en opløsning af 500 mg (0,0134 mol) 7-amino-3-(l-carboxymethyl-25 tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre i 10 ml vand ved 0° sattes med omrøring 200 mg natriumbicarbonat. Såsnart opløsningen var færdig, tilsattes på én gang 340 mg (0,0172 mol) D-(-)-2-formyloxy-2-phenylacetylchlorid i 10 ml acetone. Såsnart der var dannet bundfald, tilsattes fast natriumbicarbonat, og opløsningen omrørtes ved en pH-vær-30 di på 8 i 1 time. Acetonen afdampedes ved 15 mm tryk og 30°, og opløsningen lagdeltes med 20 ml ethyl acetat og surgjordes med 1:1 phosphorsy-re. Efter ekstraktion med ethyl acetat filtreredes blandingen, og det organiske lag fraskiltes og inddampedes til dannelse af det, der identificeredes som så godt som ren 7-(D-a-formyloxyphenylacetamido)-3-(1-carb-35 oxymethyltetrazol-5-ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

B) Di kali um-7-(D-a-hydroxyphenylacetami do)-3-(1-caboxymeth.yltetrazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxy1at

DK 162388 B

22

Det faste stof isoleret i trin A) opløstes i 5 ml methanol og 5 dråber koncentreret saltsyre. Opløsningen behandledes med carbon og opvarmedes i 3 minutter på dampbad. Blandingen filtreredes og fortyndedes med 15 ml vand. Det gummiagtige faste stof tritureredes med koldt vand 5 og til sidst med vandfri ether. Det faste stof opløstes i 5 ml acetone og behandledes med 50 mg kalium-2-ethylhexanoat. Dikalium-7-(D-a-hydro-xyphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem- 4-carboxylat opsamledes som et hvidt fast stof og vejede 90 mg, smp.

375°, langsom dekomp.

10

Analyse beregnet for CjgHjgKgHgO^Sg: C, 39,19, H, 2,77, N, 14,42 fundet: C, 39,87, H, 3,50, N, 12,58 Når denne forbindelse administreredes intramuskulært ved injektion 15 i en dosis på 10 mg/kg legemsvægt i mus, opnåedes en blodspejlsværdi på 21,4 mg/ml på 15 minutter.

Den dosis af titel forbi ndel sen, som beskyttede 50% af de udsatte dyr mod en lethal intramuskulær dosis af E. coli A 15119, var 0,8 mg/kg.

20 Eksempel 7 7-(D-tt-ami nophenylacetami d)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthi omethyl)- 3-cephem-4-carboxylsyre « ^-ai-CONH-p^S {f v—7 m2 y-JiyL. cii2-s\n^

D- 0 COOH CHjjCOOH

30 En opløsning af 0,55 g (0,0022 mol) D-(-)-a-tert.-butoxycarboxami- dophenyleddikesyre og 0,22 g (0,0022 mol) triethylamin (TEA) i 17 ml tetrahydrofuran (THF) omrørtes kraftigt ved 0° med 0,300 g (0,0022 mol) isobutylchlorformiat. Blandingen omrørtes i 30 minutter ved 0°, og en opløsning af 0,0022 mol 7-amino-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiome- 35 thyl)-3-cephem-4-carboxylsyre og 0,445 g (0,0044 mol) TEA i 6,8 ml 50% THF tilsattes. Den resulterende opløsning omrørtes i 2 timer ved 25°, og dernæst afdampedes THF ved 40° ved 15 mm tryk til opnåelse af en olie.

Olien vaskedes med 2 x 50 ml ether, fortyndedes til halvdelen med vand

DK 162388 B

23 og surgjordes til en pH-værdi på 3,0 med fortyndet saltsyre. Blandingen omrørtes i 1 time på et isbad, og produktet ekstraheredes i 75 ml ethyl -acetat. Ekstrakten vaskedes med 2 x 20 ml vand og 2 x 50 ml mættet na-triumchloridopløsning. Ethylacetaten afdampedes ved 15 mm tryk og 35° 5 til opnåelse af en olie, og der tritureredes med "Skellysolve B" til dannelse af 480 mg (35,3%) 7-(D-ft-tert.-butoxycarboxamidophenylacetami-do)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

Denne prøve sattes til 1 ml tri fluoreddikesyre, og opløsningen omrørtes en time ved 0° og fortyndedes dernæst med 50 ml ether. Saltet opsamle-10 des, opløstes i 10 ml HgO og indstilledes til en pH-værdi på 4,0 med fortyndet ammoniumhydroxid (NH^OH). Produktet opsamledes, vaskedes med vand og acetone og tørredes i vakuum over PgOg i 18 timer ved 25° til dannelse af 150 mg (23,96%) 7-(D-a!-aminophenylacetamido)-3-(l-carboxy-methyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, smp. >180°, 15 langsom dekomp. IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen.

Analyse beregnet for ci9H29N7°gS2 1 H20: C, 42,84, H, 4,16, N, 18,41 fundet: C, 43,12, H, 4,12, N, 16,74 20

Eksempel 8 7-(2-ami nomethyl -1,4-cyclohexadi envlacetami do)-3-(1-carboxymethyltetrazol -5-yl thiomth.yl) -3-cephem-4-carboxvl svre 25 I JJ_CH2C0NH-|—f ^ 0 COOH CHgCOOH.

30

En opløsning af 0,80 g (0,003 mol) 2-t-butoxycarbonylaminomethyl- 1,4-cyclohexadienyleddikesyre og 0,303 g (0,003 mol) tri ethylamin i 19,2 ml THF omrørtes ved 0°, og 0,41 g (0,003 mol) isobutylchlorformiat tilsattes. Blandingen omrørtes i 30 minutter ved 0° og sattes til en opløs-35 ning af 0,003 mol 7-amino-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre og 0,61 g (0,006 mol) TEA i 9,2 ml 50% THF. Den resulterende opløsning omrørtes i l 1/2 time ved 25°. Tetrahydrofuranen afdampedes ved 15 mm tryk og 30°, og remanensen vaskedes 2 x 30 med

DK 162388 B

24 ether og fortyndedes dernæst til halvdelen med vand. Opløsningen surgjordes til en pH-værdi på 3,5 med fortyndet saltsyre, og produktet opsaml edes, tørredes i 18 timer i vakuum over PgOg ved 25° til dannelse af 1,55 g (54,0%) hvidt pulver. Der sattes ialt 3,4 ml tri fluoreddikesyre 5 til ovenstående 7-(a-(2-t-butoxycarbonylaminomethyl-l,4-cyclohexadienyl-acetamido)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carb-oxylsyre og omrørtes i 1 time ved 0°. Opløsningen fortyndedes med 150 ml ether, og bundfaldet opsamledes ved filtrering. Trifluoracetatsaltet suspenderedes i 3,4 ml vand og indstilledes til en pH-værdi på 4,5 med 10 fortyndet ammoniumhydroxid. Den gummiagtige remanens tritureredes med vand, opsamledes og vaskedes med vand og acetone. Produktet tørredes i 18 timer i vakuum over PgOg til dannelse af 53 mg (15,72%) 7-(2-amino-methyl-1,4-cyclohexadi enylacetamido)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, smp. >160°, langsom dekomp.

15 Analyse beregnet for C20H23N7°6S2 */2 H20: C, 45,18, N, 4,55, N, 18,44 fundet: C, 45,46, H, 4,68, N, 17,09 IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen.

20

Eksempel 9 7-(a-amlno-4-hydroxyphenylacetamido)-3-(1-carboxymeth.yltetrazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl syre HO—/)—CH-CONH-i—]]-jf

^ )J

χ>- 0 COOH CH2C00H

30 Til en opløsning af 2,7 g (0,01 mol) D-(-)-N-tert.-butoxycarbonyl-p-hydroxyphenylglycin i 92 ml tetrahydrofuran sattes 1,1 g (0,01 mol) N-methylmorpholin. Opløsningen afkøledes til 0°, og 1,4 g (0,01 mol) iso-butylchlorformiat tilsattes straks på én gang. Omrøringen fortsatte i 10 minutter, og den blandede anhydridopløsning sattes til en 0° opløsning 35 af 3,7 g (0,01 mol) 7-amino-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)- 3-cephem-4-carboxylsyre og 1,1 g (0,01 mol) N-methylmorpholin i 50 ml vand. Opløsningen omrørtes i 1 time, og tetrahydrofuranen afdampedes ved 30° (15 mm) til et totalt volumen på 45 ml. Opløsningens pH-værdi sænke-

DK 162388 B

25 des til 2 med 1:1 phosphorsyre, og der ekstraherees med ethyl acetat, vaskedes med vand, og opløsningsmidlet azeotropdestilleredes til et glasagtigt fast stof ved 30° (15 mm). Remanensen tri tureredes med ether for at fjerne eventuel udgangssyre og opsamledes ved filtrering. Den var 5 hydroskopisk og blev øjeblikkelig overført til 5 ml tri fluoreddikesyre og omrørt i 1 time ved 27°. Opløsningen fortyndedes med 25 ml ether, og produktet opsamledes ved filtrering og suspenderedes i 5 ml vand. Blandingen indstilledes til en pH-værdi på 3 med koncentreret ammoniumhydroxid og fortyndedes med 10 ml isopropanol. Det lyse tanfarvede faste stof 10 opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum over P20g i 24 timer til dannelse af 300 mg 7-(a-amino-4-hydroxyphenylacetamido)-3-(l-carboxyme-thyltetrazol-5-ylthiomethyl-3-cephem-4-carboxylsyre, smp. 175°, langsom dekomp.

15 Analyse beregnet for (λςΗιςΝ707$? 3/4 i-C-H70: C, 42,78, H, 4,44, N, 17,32 fundet: C, 42,86, H, 4,55, N, 15,39 IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen. NMR-20 spektret viste dog tilstedeværelsen af 0,75 mol isopropyl al kohol i produktet.

Eksempel 10

Natrium-7-(D-Q!-r3-(2-furoyl)ureido]-4-hydroxyphenylacetamido)cephalospo-25 ranat

Triethylamin (6,4 ml, 0,0454 mol) og 12,7 g (0,1039 mol) 2-furoyl-isocyanat tilsattes en isafkølet suspension, 20,8 g (0,0413 mol) 7-(D-a-amino-4-hydroxyphenylacetamido)cephalosporansyre (som et dimethylforma-midvandsolvat) i 175 ml tør dimethyl formamid. Efter ca. 1 minut fjerne-30 des isbadet, og blandingen omrørtes i en time. Den mørke opløsning fortyndedes med 600 ml vand, lagdeltes med ethylacetat, og den vandige fase surgjordes til en pH-værdi på 2,5 med 42% phosphorsyre. Faserne adskiltes, og den vandige dimethylformamidfase ekstraheredes 4 gange til med ethylacetat. De forenede organiske ekstrakter vaskedes 5 gange med vand, 35 behandledes med carbon, filtreredes og koncentreredes ved reduceret tryk for at fjerne tilbageblivende vand. Frisk ethylacetat tilsattes, og den omrørte opløsning behandedes langsomt med 15,1 ml (0,0408 mol) natrium- 2-ethylhexanoat i 1-butanol, hvilket fik produktet til at krystallisere,

DK 162388 B

26 18,1 g, 75,5%. IR-spektret var i overensstemmelse med det ønskede produkt.

7-(D-g-Γ3-(2-furoyl)ureido]-4-hydroxyphenylacetamido)-3-(1-caboxymethyl-5 tetrazol-5-ylthiomethyl)-cephem-4-carboxylsyredinatriumsalt

En blanding af 4,0 g (0,0069 mol) natrium-7-{D-a-[3-(2-furoyl)urei-do]-4-hydroxyphenylacetamido}-cephalosporanat, 1,83 g (0,00895 mol) 5-mercapto-l-tetrazoleddikesyredinatriumsalt og 200 ml 0,1 M phosphatpuf-fer med pH-værdi 6,4 opvarmedes ved 75° i 6 timer under en nitrogenat-10 mosfære. Reaktionsblandingen, som var henstillet i køleskab natten over, filtreredes for at fjerne en lille smule bundfald. Filtratet indstilledes til en pH-værdi på 2 med 6 N HC1, og blandingen ekstraheredes 3 gange med ethyl acetat. Blandingen filtreredes under den første ekstraktion for at fjerne en lille smule uopløseligt stof. De forenede ethyl-15 acetatekstrakter (volumen = 500 ml) vaskedes 2 gange med vand, tørredes (natriumsulfat), filtreredes og behandledes med 5,1 ml (0,0138 mol, 2 ækv.) natrium-2-ethylhexanoat i 1-butanol, hvilket fik en olie til at udskilles. Opløsningsmidlet koncentreredes noget for at fjerne vand, og blandingen henstilledes i køleskab. Opløsningsmidlet dekanteredes, og 20 det gummiagtige produkt tritureredes med acetone, der gav et filtrerbart fast stof; udbytte 2,0 g. Produktet tørredes i vakuum over phosphorpent-oxid. IR-spektret var i overensstemmelse med det ønskede produkt.

Prøver af forbindelserne fremstillet i eksemplerne 5, 6, 7, 8, 9 og 10 viste sig efter opløsning i vand og fortynding med næringssubstrat at 25 udvise følgende minimale inhibitoriske koncentrationer (M.I.K) i mcg/ml over for de anførte mikroorganismer bestemt ved inkubering natten over ved 37°C ved seriefortyndingsmetode.

DK 162388 B

b 27 o o 2

o M

%— HMHW'd'd'dl^^WWWWCocnwcnc/icn o I 333(1>ίη33··*·3 rtrt 3

Z_ 7773··· M 3 3 iQ

'—\ .... TiOno'rororororo·· ro M Λ rosgasooroccccc^^ 3 2 “Λ\ V 000300 P-lD(DMM333 333 ¾¾ 3- o v_/ ^^(-.pji-jnKccH'p-f+fDrororonj^tJ ro O 000^CiQP)3g fDCCCCCOffi 3 — I Cj&ipntQQj&oo U3wwwrowiQg ro !*7 X 3 Π Π Π O Π) H* 3 H* 3 3 —* 3 3* I Φ 3 3 ? .C * J £DffiiliW3l-'-MH-H-M3'rt2Cl)C0UiCn3g 01 _ æ rororooo3-3-rorooM3-ro:><xo3ro3 rom ro ro ro i (1/ rt m i— cd p· tn ρω „ „ 3 cu .—. η· 7 ro 01 rt-τΚΡ) L—w |__» f—i t/ϊ M —s -— M 07 I LO LO U7 3* Π) π.-y T ooo — o μ μ m c ϊ ω ω it — , — " ι ι i — μ i o o o i— ro 3 — m /

^ v,—i, ,1*. ,ϋ ,ϋ M O *>-1 I I .C.MW — — CMO

NJ 3—E | JS. 1&. ^ O Μ M 3 O I —

o I ib. --- w — O O I Lo H

n iJt^- j—' i i — o

X. W ^ O tO OO M w I

o I —' ^ o Lo LO I “ „ æ '—' ^ y γ 33 -o y - > > - > a* > > > > > > > > > > > > > !* >

f£)fOf£7tOLQMLDMLDLØMLDMLQLDL£7lDLOlD

3 II 0'iC'C3OOTlnlOlnl3(TlCnlnlnCriCr'LnOnCnin

D7 Ln on Ln O iL. M O i—1 Ό I—1 OO O O O 00 OO O CD

^ LQ^JCnMOoinOlo-JtnMMLQCncnOOitiLn LO D> (O O LO Ό

V v/ ro Vi— W

O μ- MM O (O O tt

VVV LO tO (O (O LO M — — ^ ^ S

\f~) MOOnOnCnNJOMOCnOO^IOMJb.l-'OO^OHro H

% * ” “ ίο μ η ro o pj H ro 3 ro *o 3 in low σι w ω -M3 id ro >ro to Ζ ro \ μ M <j 2 m i W V 3 η· pi H y. hi £ > < o ^3 ® ro 3^ iVVVV Dijj, &μ· O—O . I—· i— 1—' I—' . 3 μ· w. ►•n lo Γ0 (O ΓΟ M LO OO I 1 -o.

„υ Α 7 LnrjinincnCLOtoMto^oaj^toijoMooroti rt 3 μ- 1 . . . · · · M ro p- lO o Ln Ο0ΠΙοσισΐΙΒ(7 rt cd eti 3 £u ro H. ® 1 fc* c·1 w i v v/ v rt

?r z o i—. i—. i—i (D

ro σι toioroLo m Μ M ^ lo 7M H

3¾ ro i wi-,ononontoi-,CDhJcnæocncn(ofo(oooa)?r ρ- υ „ · · · · · M ro m ro 2 (ooninmoiro^ SS f^\ -1' s s LA s y-r· ·θ h-’h-'l·-' \/ LJ.

σ „ Li lo lo (o to μ-1 v Ό W 5 ro Om loOlnCntnCDOtoocnMO^IOMOOOOffitr s r+ 3 (j . . · ·< ......... H- r+H to 2 lo lo lo oom on oo ln Ln M O ffl (7 C P, I a σι ιησιοοΒφ 3 rt (O 1 rt 3 + π: ^ V v w ΐ2· ro qi_.i_jm m . · rt ^ /V toOLforoMoo to mm ο^ σι^ο '3Ξ Η rt o. /Λ i ιηοοοπίησίΜοοπΜσισιοιοωιοιοΜοσιο^ .

ro <*> I J iri on MM^ro W

2 'Vs*Nr/^ w w 3 · . 3 o-z-n-z-rT g 1

0 IV o tt. O K K

^31 W V/ V ^ ro μ. M v. Λ M h. M V 7 $ H 3 O ^1 O. to (O to (o to Lo DJ M ^ '3 W 2> ,t) \jr uiioLnononinMCDMtooocotoCDCOcnMMOrot. 3 !n (Κ^Ί in (O ^ ro ϋ

ro [UJ υ, ioU

ro z-o rt æ ffi 1 M 1 Γ+ + in cf° ro ro 3

DK 162388 B

28

Eksempel 11

Trihydrat af mononatriumsalt af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carbox.ymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre 5 1. 10 g krystallinsk 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carb- oxymethyltetrazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (som omhandlet og fremstillet i eksempel 5) suspenderedes i 50 ml afioniseret vand.

2. 10% natriumhydroxid tilsættes langsomt med hurtig omrøring til 10 en stadig eller konstant pH-værdi på 7,4-7,7. Der opnås en opløsning eller næsten opløsning.

3. Der tilsættes 2 g aktiveret trækul ("Darco G-60"), og blandingen opslæmmes i 0,5 time. pH-værdien holdes på 7,4-7,7 med 1 N natri- 15 umhydroxid.

4. Carbonet fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml vand. Vaskevæsken tilsættes filtratet.

20 5. Opløsningen fra trin 4 med pH-værdien 7,4-7,4 gøres steril og pyrogenfri ved hjælp af passende aseptisk filtrering og teknik.

Den nødvendige tid til færdiggørelse af trin 3, 4 og 5 skulle ikke overstige 5 timer ved omgivende stuetemperatur.

25 6. Ved anvendelse af den sterile teknik sættes et omtrent lige så stort volumen (65 ml) steril, pyrogenfri acetone til den hurtigt omrørte sterile opløsning i trin 5 over en 5 minutters periode.

30 7. Baseret på det omtrentlige oprindelige vandige volumen tilsæt tes yderligere 2 volumener (120 ml) steril, pyrogenfri acetone under hurtig omrøring i 15-20 minutter. Der dannes krystaller, 1 2

Blandingen opslæmmes i 10 minutter.

35 2

Der tilsættes yderligere 3 volumener (180 ml) steril acetone over et 15 minutters interval. Blandingen opslæmmes i 0,5 time.

DK 162388 B

29 10. Krystallerne opsamles ved filtrering, vaskes med 75 ml steril acetone og vakuumtørres ved 45-50°C eller lufttørres ved 50-56°C i 24 timer. Udbytte: ca. 8,8 g.

5 Egenskaber for trihydrat af mononatriumsalt af 7-(2-aminomethylphe- nylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre: % vand (KF) = 9,2 (teori = 9,05%) 10 % natrium (flammefotometer) = 4,0 (teori = 3,86%) opløselighed i vand = 500 mg/ml stabilitet i vand = stabil i mindst 24 timer ved stuetemperatur ved 250 mg/ml.

15 Formulering af i n.iekt i onsprodukter

In situ fremstilling af mononatriumsalt af 7-(2-aminomethylphenyl-acetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl-3-cephem-4-carb-oxylsyre: 20 A) 2,5 g af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyl-tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (zwitterion) suspenderes i 8,5 ml vand under hurtig omrøring, natriumcitrat eller NagHPO^ eller Na^PO^ eller andre passende "baser" tilsættes, indtil der opnås en opløsning (pH-værdien bør ikke være over 7,8). Mængden af tilsat "base" 25 noteres.

B) Der fremstilles en fysisk blanding af 2,5 g 7-(2-aminomethyl-phenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre og den faste "base" i forhold bestemt under "A" ovenfor.

30 Den senere tilsætning af vand til opnåelse af forskellige koncentrationer af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carobxylsyre giver en opløsning af in situ fremstillet mononatriumsalt af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

35

Denne fremgangsmåde kan være ønskelig, fordi trihydratet af mono-natri umsaltet af 7-(2-ami nomethyl phenylacetamido)-3-(1-carboxymethylte-trazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre ikke er så stabilt ved

3Q

DK 162388 B

forøgede temperaturer som den fri syre 7-(2-aminomethylphenylacetamido)- 3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (zwitterion) i form af monohydrat.

Med hensyn til stabiliteten af 7-(o-aminomethylphenylacetamido)-3-5 (1-methyl-1,2,3,4-tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyreopløsninger ved stuetemperatur og en pH-værdi på 10,3 (den laveste pH-værdi, der er i stand til at opløse 150 mg/ml) bemærkes et næsten øjeblikkeligt 50% tab af bioaktivitet. I løbet af de næste 30 minutter tabes yderligere 21% aktivitet.

10 Som modsætning viste en opløsning, der indeholdt 125,0 mg/ml af trihydratet af mononatriumsaltet af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre med en pH-værdi på 7,0 intet særligt tab ved stuetemperatur over i det mindste 24 timer.

15 Forbindelsen kaldet 7-(o-aminomethylphenylacetamido)-3-(1-methyl- 1,2,3,4-tetrazol-5-ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre i følge eksempel 1 og krav 1 i US patentskrift nr. 3.766.175 er en meget kraftigt virkende cephalosporin, som udviser et særlig ønskeligt aktivitetsspektrum, især over for visse gram-negative organismer. Desværre udviser denne 20 zwitterion imidlertid en meget lav opløselighed i vand og især i blodstrømmen, hvilket vil sige ved en pH-værdi på ca. 7,2 eller deromkring.

Mere specielt gav forsøg på at måle denne opløselighed resultater i intervallet ca. 1,0-3,0 mg/ml i både forpufret vandigt medium og i hundeurin ved stuetemperatur. pH-værdien af frisk beagle hundeurin er 7,6.

25 Dette rejser det spørgsmål, hvorvidt der er en eventuel toxisk effekt ved indgivelse af denne zwitterion i mennesker, fordi det kan antages, at den vil udfælde på krystallinsk form i nyrerne, når den koncentreres heri under udskillelse. Dette ville hos mennesker være særdeles uønsket. Konventionelle forsøg på at løse dette mulige problem ved anvendelse af 30 sædvanlige vandopløselige former og derivater af 7-(o-aminomethylphenyl-acetami do)-3-(1-methyl-1,2,3,4-tetrazol-5-ylthi omethyl)-3-cephem-4-car-boxylsyre har været uden resultat på grund af omdannelse i legemet af saltet eller derivatet til zwitterionen, der så udviser sin naturlige lave opløselighed i vandige medier og blod. Den foreliggende opfindelse 35 har til formål at løse dette problem uden tab af den værdifulde biologiske aktivitet af 7-(o-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-methyl-l,2,3,4-tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. Efter forskellige mislykkede forsøg løstes problemet ved tilvejebringelsen af 7-(2-aminome- 31

DK 16238 8 B

thyl phenylacetamido)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthi omethyl)-3-ce-phem-4-carboxylsyre, der har de ønskede egenskaber. Mere specielt udviser en prøve af 7-(2-aminomethylphenylacetamido)-3-(l-carboxymethylte-trazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre i phosphatpuffer med pH-5 værdi 7,0 ved 25°C en opløselighed i mg/ml på mindre end 15,3 og mere end 13,6. I dette tilfælde var pufferens kapacitet ikke tilstrækkelig, og pH-værdien faldt til 6,48. Således er 7-(2-aminomethylphenylacetamido) -3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre tilvejebragt ud fra mellemproduktet ifølge den foreliggende opfindelse 10 selv på zwitterionformen for opløselig i blodstrømmen til at krystallisere i nyrerne og herved bevirke risiko for toxiske resultater hos i det mindste visse patienter.

Trihydratet af mononatriumsaltet af 7-(2-aminomethylphenylacetami-do)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre 15 udviser ønsket opløselighed ved pH-værdier, som er egenede til injektion i mennesker såsom pH-værdi ca. 7 og udviser stadig tilfredsstillende opløselighed i blodstrømmen og i nyrevæskerne selv efter omdannelse i legemet til zwitterionformen.

I overensstemmelse med det foregående er fordelen ved de her om-20 handlede forbindelser således deres forbedrede vandopløselighed i forhold til mange andre kendte forbindelser og endvidere de i almindelighed højere blodspejlsværdier, som opnås med forbindelserne ved parenteral administrering ad den intramuskulære vej.

25 Eksempel 12 7-(3-aminomethyl-2-thi enylacetamido)-3-(1-carboxymethyltetrazol-5-yl-thi omethyl) -3-cephem-4-carbox.y1 syre A) 7-(3-t-butoxycarbonylaminomethyl-2-thienylacetamido)-3-(1-30 carboxymethyl tetrazol -5-,yl thi omethyl) -3-cephem-4-carboxyl syre

En blanding af 3-t-butoxycarbonylaminomethyl-2-thienyleddikesyre (542 mg, 2 mmol), 2,4 dinitrophenol (368 mg, 2 mmol) og dicyclohexylcar-bodiimid (412 mg, 2 mmol) i tetrahydrofuran (THF) omrørtes ved stuetem-35 peratur i 1,5 time. Det udfældede urinstof fjernedes, og filtratet inddampedes under reduceret tryk. Den resulterende aktive ester (1,0 g) opløstes i 10 ml THF og sattes til en blanding af 7-amino-3-(l-carboxyme-thyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (656 g, 2 mmol) og

DK 162388 B

32 triethylamin (816 g, 8 mmol) i vand (5 ml) ved 0°C under omrøring. Omrøringen fortsattes i 3,5 time ved stuetemperatur, og reaktionsblandingen sattes til vand (20 ml) og vaskedes med ether (4 x 20 ml). Den vandige opløsning skiltes med ethyl acetat og indstilledes til en pH-værdi på 2 5 med koncentreret HC1 ved 5°C. Det organiske lag fraskiltes, og det vandige lag ekstraheredes med ethyl acetat (2 x 50 ml). Ethyl acetatekstrakterne forenedes, vaskedes med mættet vandigt natriumchlorid, tørredes over HgSO^ og inddampedes under reduceret tryk. Den tilbageblevne olie kromatograferedes på silicagel (10 g). Kolonnen udvikledes successivt 10 med chloroform (150 ml) og 3% methanol-chloroform (100 ml). Fra chloro-formeluatet udvandtes 2,4-dinitrophenol (50 mg), og titelcephalosporinen i soleredes ved inddampning af methanol-chloroformeluatet.

Udbytte: 29%, smp. 185-188°C med dekomponering.

15

Analyse beregnet for ^23^27^7^3: C, 42,91, H, 4,54, N, 15,23, S, 14,94 fundet: C, 43,02, H, 4,17, N, 15,07, S, 15,04 20 B) 7-(3-aminomethyl-2-thionyl acetamido)-3-(l- carbox,ymethy1tetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl syre

Tri fluoreddikesyre (0,6 ml) sattes til den blokerede cephalosporin, der var opnået i trin A (610 mg, 1,05 mmol) og 0°C, og blandingen omrør-25 tes ved stuetemperatur i 15 minutter. Til reaktionsblandingen sattes vandfri ether (15 ml) for at udskille bundfaldet, som opsamledes ved filtrering, vaskedes med vandfri ether (2 x 10 ml) og opløstes i aceto-nitri 1 (10 ml). Til opløsningen sattes 2 dråber koncentreret ammoniumhydroxid. Det udskilte faste stof opsamledes ved filtrering, vaskedes med 30 acetonitril (2 x 10 ml) og tørredes ved 75°C/1 mmHg i 7 timer til dannelse af titel produktet, der opsamledes som monoammoniumsaltet efter behandling med et ækvivalent ammoniumhydroxid.

Udbytte: 83%, smp. 174-178°C med dekomponering.

35

Analyse beregnet for ci8^21^8°6S3 ^20: C, 38,56, H, 4,32, N, 19,98, S, 17,16 fundet: C, 38,89, H, 4,06, N, 18,83, S, 15,24

DK 162388 B

33 IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med strukturen.

Eksempel 13 7-(2-ami nometh.ylphenylacetamido)-3-(1-carboxyethyltetrazol-2-ylthi ome-5 th.yl) -3-cephem-4-carbox.yl syre A) Kai ium-0-f-carbomethoxypropen-2-ylaminomethyl)-phenyl acetat (Enamin) 10 1. Anbring 1000 g 0-aminomethylphenyl eddikesyre, 340 g kaliumhy droxid, 1412 g methylacetoacetat og 32.40Q ml absolut methanol i en tank.

2. Opvarm blandingen til tilbagesvaling i 4 timer under omrøring.

15 3. Koncentrer reaktionsblandingen under reduceret tryk ved <50°C til ca. 1/5 af udgangsvolurnenet.2 4. Sæt 10.000 ml MIBK til koncentratet og fortsæt koncenteringen 20 ved reduceret tryk, indtil methanol en er fjernet.

5. Tilsæt 10.000 ml MIBK eller en hvilken som helst mængde, der er nødvendig til at fremstille en bearbejdelig opslæmning af koncentratet.

25 6. Omrør og afkøl blandingen til 5-10°C i 30 minutter.

7. Filtrer opslæmningen og vask kagen med 5000 ml MIBK og dernæst med 5000 ml acetone.3 30 8. Tør produktet i en luftcirkuleringsovn ved »40°C.

9. Udbyttet er 1605-1680 g eller 88-92% hvidt krystallinsk produkt. Smp. 140-142°C.

35 B) 7-(2-ami nomethylphenylacetami d)-3-(1-carboxyethyltetrazol-2-ylthi omethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre

DK 162388 B

34 A1) Enamin (4,09 g) fra trin A og 90 ml tetrahydrofuran blandedes i en 3-halset kolbe forsynet med en omrører, tørrerør og afkøledes på et tøris-acetonebad. Der tilsattes 8 dråber Ν,Ν-dimethylbenzylamin, og blandingen afkøledes til -38°C. Der tilsattes isobutylchlorformiat (1,95 5 g) og omrørtes i 15 minutter.

B1) 7-amino-3-(l-carboxyethyltetrazol-2-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (3,5 g) opløstes i 50 ml vand og 2,29 g N-methylmorpholin og afkøledes til 2°C. Anhydridet fra trin A1 tilsattes opløsningen under 10 omrøring. Blandingen omrørtes i 1,5 time ved 2°C. Tetrahydrofuranen fjernedes i vakuum, det tilbageblevne skiltes med ethyl acetat og indstilledes til en pH-værdi på 3. Efter omrøring på et isbad opsamledes produktet; 250 mg, smp. 140°C med dekomponer!ng.

15 IR- og NMR-spektrene var i overensstemmelse med titel produktet, men antydede ca. 20% urenheder, først og fremmest udgangsmateriale. Når denne forbindelse blev indgivet intramuskulært ved injektion ved en dosis på 10 mg/kg legemsvægt i mus, opnåedes en blodspejlsværdi på 22,3 mg/ml efter 15 minutter.

20

Eksempel 14 7β-(o-N-t-butoxycarbonyl ami nomethyl phenyl acetamido) -7o:-methox.y-3- (1-carboxymethyltetrazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre 25 ..ciymecc Γ I H oHe |j "Il

J,_CH2Si^,,^N

0 I ch„co9h 30 io2H 2 2

En blanding af 7β-(O-N-t-butoxycarbonylaminomethylphenylacetamido)-7a-methoxycephalosporansyre (549 mg, 1 mmol), natriumbicarbonat (84 mg, 35 1 mmol) og l-carboxymethyl-5-mercaptotetrazoldinatriumsalt (816 mg, 4 mmol) i 0,1 M pH-værdi 7,0 phosphatpuffer (5 ml) opvarmedes i en time ved 85°G. Efter afkøling surgjordes blandingen til en pH-værdi på 1 med fortyndet HC1 og ekstraheredes med ethyl acetat (3 x 20 ml). De forenede 35

DK 162388 B

ekstrakter vaskedes med vand, tørredes og inddampedes under reduceret tryk til dannelse af en olieagtig remanens, som kromatograferedes på en sil icagelkolonne (Wako-gel, C-200, 10 g). Kolonnen elueredes med chloroform-methanol (50:1). Det første eluat indeholdt udgangsmercaptanen 5 (0,30 g). Det andet eluat (50 ml), der indeholdt det ønskede produkt, behandledes med en lille smule carbon og inddampedes under reduceret tryk og gav titel produktet som amorft pulver (140 mg, 22%), smp. 110-120°C (dekomp.) 10 IR: *max 3600“2400> 1780> 1690> 1520> 1385> 1250> 1160 cm’ UV: AmaxH 246 nm 630°)> 274 nm 6700) 15 NMR: 5ppm°"d6 1,35 (9H’ s’ t"Bu'H)» 3»38 (3H> s> 0CH3), 3,65 (2H, s, CHgCO), 4,13 (IH, d, 14 Hz, 3-H), 4,16 (2H, d, 6 Hz, et singlet med D20, CH2N), 4,50 (IH, d, 14 Hz, 3-H), 5,01 (IH, s, 6-H), 5,26 (2H, s, tetrazol-CH2C0), 7,20 (4H, s, phenyl-H), 9,20 (IH, s, C0NH, 20 forsvandt ved tilsætning af D20).

Analyse beregnet for C26^31^7°9S2’2^20: C, 45,54, H, 5,14, N, 14,30 fundet: C, 45,71, H, 4,51, N, 13,65 25 45,73 4,42 13,91

Eksempel 15 7/Mo-ami nomethyl phenyl acetami do) -7tt-methoxy-3 - (1 -carboxymethyl tetrazol - iiZlthiomethyl)-3-cephem-4-carboxy1syre 30 CH0NH0 ' H 01e /“S i1’—'i ^ ch2con--' ^ Jl l)

35 ^4 J-CH2S-kNXN

ty I i

I CH„CO„H

co2h Z δ

DK 162388 B

36

En kold blanding af det produkt, der opnåedes i eksempel 14 (120 mg, 0,18 mmol) og trifluoreddikesyre (TFA) (0,3 ml), omrørtes ved stuetemperatur i 20 minutter og gav en viskos opløsning. Tilsætningen af ether (20 ml) til opløsningen gav TFA-saltet af produktet, som opsamle-5 des ved filtrering og opløstes i acetonitril-vand (50:1, 20 ml). Opløsningen behandledes med en lille smule carbon. En blanding af koncentreret NH^OH-acetonitril (1:2) tilsattes dråbevis til filtratet under omrøring, indtil der ikke viste sig bundfald. Det gummiagtige bundfald opsamledes og tritureredes i acetonitril (20 ml) til dannelse af titelpro-10 duktet, som opsamledes ved filtrering, vaskedes med acetonitril (5 ml) og tørredes. Udbytte 62 mg (63%), smp. 185-190°C (dekomp.).

IR: *max 360°-2600> 1700> 1605> 1380> 1300> 1110’ 1085 cm~ 15 UV: AmaxaHC°3 238 ntn 830°)’ 270 nm 910°)

Analyse beregnet for C2iH23N7°7S2 ^2¾^ 20 C, 45,15, H, 4,23, N, 17,55 fundet: C, 45,26, H, 4,81, N, 18,51

Claims (5)

1. Thi oler til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af cephalosporansyrederivater med den almene formel (I)

5 K3 i R-CH-CO-NH-C-CH CH0 N--M . i i I ^ ti il Y >C —^.C-CH?-S-C i o' 2 ' é-on (CH2)nCOOH II 10 o hvori R betegner ^ Rljr~l r~Q'r~ijene7^sJ ' 15 hvor R2 betegner hydrogen, hydroxy eller en eventuelt substitueret ami-nomethylgruppe, Y betegner hydrogen, hydroxy eller en eventuelt substitueret aminogruppe, R3 betegner hydrogen eller methoxy, og n er et helt tal fra 1-9 inkl., eller let hydrolyserbare estere eller ikke-toksiske farmaceutisk acceptable salte deraf, med den begrænsning, at når n er 2-20 9, har R - CH - betydningen ^--ch2nh2 I \jh CH2- Y og R3 betegner hydrogen, KENDETEGNET ved, AT de har den almene formel (Π)

25 II-II II II HS-c^ /H I (Π) <™2>nC°2H 30 hvori n er et helt tal fra 1-9 inkl., eller de er ikke-toksiske salte deraf.

2. Thiol ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT n er et helt tal fra 35 1-4 inkl.

3. Thiol ifølge krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, AT n er det hele tal 1 eller 2, idet forbindelsen evt. er i form af et kalium- eller na- DK 162388 B triumsalt.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af en thiol med den almene formel (II) 5 N____N I 11 "s V (II) (CII ) -COOI! 2 η. 10 hvori n har den i krav 1 anførte betydning, KENDETEGNET ved, AT man (a) behandler et isocyanat med formlen 0 15 1 Rioo_0-C-(CH2)n-N=C=S hvori n har den ovenfor anførte betydning, og R100 betegner al kyl med 1 til 6 carbonatomer, phenyl, phenylalkyl eller substitueret phenyl eller 20 phenylalkyl, med natriumazid til dannelse af thiolesteren med formlen N_N i 'i HS J* 25 (CH ) CO_R100 2 n 2 hvori n og R100 har den ovenfor anførte betydnining, og (b) hydrolyserer thiolesteren til dannelse af den ønskede thiol syre med formel (II). 30

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en thiol med formlen (Ila) N-N I II, 35 hs-J-^n^ (Ha) ClljCOOll KENDETEGNET ved, AT man DK 162388 B (a) behandler 1-methyl-5-mercaptotetrazol med en organolithiumfor-bindel se til fremstilling af det tilsvarende 1ithiumderivat, og (b) behandler det resulterende 1ithiumderivat med carbondioxid og efterfølgende hydrolyserer til dannelse af forbindelsen med formlen 5 (Ila). 10 15