DE69308554T2

DE69308554T2 - Verbesserungen beim oder in zusammenhang mit analytnachweis

Info

Publication number: DE69308554T2
Application number: DE69308554T
Authority: DE
Inventors: Magnus Malmqvist; Gregory Winter
Original assignee: Biacore AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1992-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2013-06-12
Also published as: DK0645015T3; EP0645015A1; GB9212416D0; US5965456A; WO1993025909A1; JPH07507865A; DE69308554D1; EP0645015B1; ATE149689T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Nachweis eines Analyten, insbesondere Biasensoren, und ein Verfahren, das Vorliegen eines Analyten nachzuweisen.

Hintergrund der Erfindung

Es sind Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung der Bindung von Analyten an einen Rezeptor in Lösung bekannt. Es gibt eine solche Vorrichtung (und deren zugeordnete Computersteuerungs- und Datenverarbeitungseinheiten) mit der Bezeichnung BIAcore (BIAcore ist ein Warenzeichen der Pharmazia Biosensor AB, BIA steht fur biospezif ische interaktive Analyse); welche das Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) verwendet, um das Binden von Analyten an Rezeptoren, die auf einem Sensorchip immobilisiert sind, zu untersuchen. Die Vorrichtung und der theoretische Hintergrund sind vollständig in der Literatur beschrieben (z. B. Jönsson et al., 1991, Biotechniques 11 620-627). Im wesentlichen beinhaltet die Technik das Immobilisieren eines Rezeptors an der speziellen Oberfläche eines Sensorchips, das Inkontaktbringen des Chips mit einem Strom der Probe, die den gesuchten Analyten enthält, und dann das Messen der Veränderung der optischen Charakteristika der Oberfläche des Sensorchips, die durch das Binden des gesuchten Analyten hervorgerufen wird.
Die spezielle Natur der Antikörper/Antigen-Wechselwirkung führt dazu, daß solche Reaktionen insbesondere zu Untersuchungen mit dem BIAcoresystem geeignet sind. Z. B. offenbart Jösson et al., (1991, a.a.O.) die Verwendung von hochaffinen Antikörpern zu Konzentrationsbestimmungen. Bei diesem System ist es notwendig, den Sensorchip nach jedem Assay mit HCl zu regenerieren. Es wird von vielen anderen Studien berichtet, die z. B. die Wechselwirkung von synthetischen Peptiden mit immobilisierten monoklonalen Antikörpern (Altschuh et al., 1992, Biochemistry 31, 6298-6304) und Bindungsreaktionen zwischen immobilisierten monoklonalen Antikörpern und dem HIV Kernprotein p24 und umgekehrt (Karlsson et al., 1991, Journal of Immunological Methods 145, 229-240) beschreiben.
Sensoren für Anwendungen, wie die On-line-Beobachtung bei der Chromatographie, Fermentation oder sogar in vivo-Anwendung, sollten idealerweise schnell, reversibel und sensibel auf Veränderungen der Konzentrationen von Proteinen oder anderen Biomolekülen reagieren. Normalerweise binden Antikörper das Antigen fest und können nur als Dosimeter zum Beobachten der Konzentration verwendet werden. Für solche Anwendungen ist die Regeneration des Antikörpers (um wieder freie Antigenbindungsstellen zu gewinnen) oder die Verwendung von wegwerfartikeln notwendig. In manchen Umgebungen kann jedoch die Regeneration mit chemischen Mitteln nicht durchgeführt werden.
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß für einen Festphasen-Biosensor auf der Basis von Antikörpern, der in der Lage ist, reversibel zu messen (ohne die Notwendigkeit der Regeneration), der Antikörper beim Binden des Antigens eine hohe Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante ("Krück") (Anderson & Miller, 1988, Clinical Chemistry 34, 1417-1421) haben sollte, aber diese Autoren offenbaren keine Antikörper oder Fragmente davon, die materialbedingt hohe Dissoziationsgeschwindikeitskonstanten für einen kontinuierlichen On-line-Nachweis haben.
Es gibt jedenfalls erhebliche Schwierigkeiten, tatsächlich Rezeptormoleküle (wie Antikörper) mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Das kommt daher, weil praktisch alle Screening-Verfahren zur Suche nach geeigneten aussichtsreichen Molekülen einen Waschschritt benötigen. Ein derartiger Waschschritt neigt dazu, gerade die Moleküle zu entfernen, die die gewünschten Eigenschaften besitzen, nach denen gesucht wurde.
Die WO 90/11525 und WO 91/02981 (Amersham International PLC) beschreiben beide die Anwendung der Oberflächenplasmonenresonanz in einem Assay für einen gesuchten Analyten. Die WO 90/11525 betrifft insbesondere Assays, bei denen der Analyt ein Hapten ist, während die WO 91/02981 insbesondere Assay-Verfahren betrifft, die die Verwendung eines Antikörpers nicht einbeziehen. Diese Anmeldungen betreffen Erfindungen, die als Assay-Verfahren durch eine "kompetitive Verdrängung" charakterisiert sind. Keine der Publikationen lehrt oder betrifft in irgendeiner Weise die Möglichkeit eines Assay-Verfahrens, bei dem eine leicht reversible Reaktion einbezogen ist.
Somit betrifft der Stand der Technik im Hinblick auf Antikörper und deren Verwendung in Biosensoren die Verwendung "reifer" Antikörper, die als Ergebnis der primären Immunisierung und der durch erfolgten Aktivierung des betreffenden Labortieres (typischerweise einer Maus) erhalten werden. Deshalb binden diese Antikörper zu fest, als daß die Reaktion leicht reversibel sein könnte. Hinzu kommt, daß diese Antikörper typischerweise gegen Haptene gerichtet sind. Die kürzeste reversible Ansprechzeit, von der berichtet wurde (Anderson & Miller, a.a.O.), war im Bereich von 5-15 Minuten (für den verhältnismäßig hohen Konzentrationsbereich des Analyten von 5-100 mM), was nicht schnell genug ist, um Parametern für viele "Online/Echtzeit"-Anwendungen zu folgen. Darüber hinaus benötigt die dort offenbarte Vorrichtung die Verwendung eines Dialyseschlauchs. Das führt dazu, daß es strenge Grenzen bezüglich des Molekulargewichts des Analyten, der untersucht werden kann, gibt.

Zusammenfassung der Erfindung

Als einen ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis des Vorliegens in Lösung eines gesuchten Analyten in einer Probe zur Verfügung, die einen immobilisierten Bindungspartner, der einen festen Träger und einen reversibel bindenden Rezeptor umfaßt, welcher zur Bindung an den gesuchten Analyten fähig ist und dabei eine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des immobilisierten Bindungspartners hervorruft, und ein Nachweismittel zum Nachweis der meßbaren Veränderung umfaßt, wobei der reversibel bindende Rezeptor eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Krück) (für den jeweils gesuchten Analyten), von größer als 10&supmin;² pro Sekunde aufweist und die Halbwertszeit des Rezeptor/Analyt-Komplexes weniger als oder gleich 60 Sekunden beträgt, was ein schnelles Reagieren der Vorrichtung auf Veränderungen in der Analytenkonzentration gestattet.
Als einen weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines gesuchten Analyten in einer Probe zur Verfügung, bei dem die Probe mit einer Vorrichtung nach dem ersten Aspekt in Kontakt gebracht wird und eine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des Bindungspartners als Antwort auf die Bindung des Analyten an den Bindungspartner nachgewiesen wird.
Der reversibel bindende Rezeptor ist vorzugsweise ein ganzer Antikörper, kann aber auch ein Fragment davon sein, wie ein Fab-Fragment, ein Fv-Fragment, ein einkettiges Fv-Fragment (scFv), eine einzelne schwere Kette oder sogar ein Peptid (beruhend auf der Nukleotidsequenz des Antikörpergens) mit Bindungsaktivität. Andere Beispiele sind "Diabodies" ("bifunktionelle Körper"; Polypeptide mit bifunktionellen oder bivalenten Bindungseigenschaften (wie von Winter, 1993, Current Opinion in Immunology 5, 253-255, offenbart), wobei eine oder beide Bindungsstellen die notwendigen reversiblen Bindungseigenschaften aufweisen können). Der reversibel bindende Antikörper kann auch eine Nicht-Immunoglobulin-region besitzen, wie z. B. ein Fusionsprotein, bei dem andere Domänen des Moleküls verwendet werden können, um z. B. an das feste Trägermaterial zu binden oder eine andere Funktion zur Signaltransformation an dem Wandler auszuführen.
Alternativ kann der reversibel bindende Rezeptor auch gänzlich ein Nicht-Immunoglobulin sein. Z. B. kann der Rezeptor ein Peptid (das keine strukturelle Ähnlichkeit mit Immunoglobulinen hat, z. B. Lam et al., 1991 Nature 354, 82-84; Houghten et al., 1991 Nature 354, 84-86) oder sogar eine Nucleotidsequenz sein (z. B. Tuerk & Gold, 1990 Science 249, 505-510).
Es sei angenommen, daß eine reversible Reaktion zwischen einem reversibel bindenden Rezeptor (wie einem Antikörper "Ab") und einem Antigen "ag" (das der gesuchte Analyt ist) zwei Reaktionsgeschwindigkeiten besitzt: eine Geschwindigkeitskonstante (K&sub1;) für die Hin- und eine Geschwindigkeitskonstante (K&sub2;) für die Rückreaktion.
Die reversibel bindenden Rezeptoren der erfindungsgemäßen Vorrichtung haben überraschend große Geschwindigkeitskonstanten für die Rückreaktion (Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten). Ist z. B. der reversibel bindende Rezeptor ein Antikörper (oder ein Fragment davon), hat sich bei solchen Molekülen typischerweise keine Affinitätsreifung vollzogen.
Wenn die Rezeptoren dazu verwendet werden, das Vorliegen eines gesuchten Analyten nachzuweisen, bedeuten die sehr hohen Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten, daß bei einem Konzentrationsabfall des Analyten der immobilisierte Rezeptor leicht vom Analyten abdissoziiert, so daß die erfindungsgemäße Vorrichtung rasch auf Veränderungen der Analytenkonzentration reagieren kann. Im Ergebnis ist die Erfindung einwandfrei geeignet, "On line"- und "Echtzeit"-Messungen- sich verändernder Parameter durchzuführen, und sie kann für quantitative oder qualitative Messungen verwendet werden.
Antikörper oder Antikörperfragmente, die zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung geeignet sind, können aus Hybridomzellen oder insbesondere aus V-Genbatterien (Genrepertoires) gewonnen werden. Die Batterien können aus Bibliotheken von rearrangierten V-Genen (Ward et al., 1989, Nature 341, 544-546; Huse et al., 1989 Science 246, 1275-1281) aus den Lymphozyten von immunisierten (Huse et al., 1989; Clackson et al., 1991 Nature 352, 624-628) oder nicht immunisierten (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581-597) Menschen oder Tieren gewonnen werden. Es können Batterien einzelner Antikörperdomänen verwendet werden (Ward et al., 1989) oder Batterien von assoziierten VH- und VL-Domänen durch statistisches Rekombinieren der Batterien von VH- und VL-Domänen (Huse et al., 1989, a.a.O.). Alternativ können Antikörper-V-Gene in vitro (Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227, 381-388) aus V-Gensegmenten und synthetischen (statistischen) hypervariablen Schlaufenregionen rearrangiert werden. Die Batterien kodierter Antikörperfragmente können aus Bakterien sekretiert werden und durch Binden an das Antigen durchgemustert werden (z. B. Ward et al., 1989 a.a.O.; Huse et al., 1989 a.a.O.). Die Batterien können auch für das Display an der Oberfläche filamentöser Bakteriophagen kodiert sein, und ein Phage mit Bindungsaktivität kann durch Binden an das Antigen selektiert werden (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Marks et al., 1991, a.a.O.).
Egal ob die Antikörperbindungsspezifitäten aus Hybridomzellen oder Genbatterien stammen, ist es beim Screening oder der Selektierung notwendig, die Antikörper mit dem Antigen in Kontakt zu bringen, und es ist fast immer notwendig, danach einen Waschschritt folgen zu lassen. Da die gewünschten Antikörper eine schnelle Dissoziationsgeschwindigkeit haben, ist es notwendig, die Wechselwirkung mit dem Antigen zu verlängern. Dies kann dadurch erreicht werden, daß multivalente Wechselwirkungen herbeigeführt werden, indem z. B. das bivalente IgG oder pentavalente IgM aus Hybridomzellüberständen oder die multivalenten Phagenteile an eine in hoher Dichte mit Antigenen überzogene Festphase gebunden werden. Die Antikörper oder Phagenantikörper binden dann mit größerer Avidität als die einzelnen Antikörperenden alleine. Alternativ können sogar bei monovalenten Wechselwirkungen, z. B. bei der Verwendung von Fab-Fragmenten, dissoziierende Fragmente wieder an die Oberfläche binden, wenn die Festphase in hoher Dichte mit dem Antigen überzogen ist. Auf diese Weise können monomere Fragmente mit schnellen Dissoziationskinetiken trotz des Waschschritts identifiziert werden, indem entweder die Multivalenz ausgenutzt oder die erneute Bindung begünstigt wird, so daß die Nettorate der Dissoziation des Rezeptor-Antigenkomplexes vermindert wird (wobei das Antigen ähnlich oder gleich dem Analyten, der durch den Rezeptor nachgewiesen werden soll, ist).
Ein weiteres Vorgehen könnte darin bestehen, die bestehenden Gene für einen Antikörper oder ein antigenbindendes Antikörperfragment so zu verändern bzw. "maßzuschneidern", daß die gewünschten Charakteristika eingeführt werden. Solche Veränderungen erfordern wahrscheinlich Veränderungen in den CDRs der variablen Region, es können aber auch Veränderungen der Gerüste sein. Solche Veränderungen können durch bekannte Verfahren (z. B. Sequenzspezifische Mutagenese) eingeführt werden. Obgleich es nicht sofort offensichtlich ist, welche Aminosäurereste verändert werden sollten, um die gewünschten Charakteristika zu erhalten, sollte es mit durchschnittlichen Fachkenntnissen möglich sein, durch Ausprobieren geeignete Alternativen zu schaffen.
Vorzugsweise sind die reversibel bindenden. Rezeptoren. Antikörper oder antigenbindende Fragmente, die gegen "konventionelle" Polypetidantigene und nicht gegen Haptenantigene gerichtet sind.
Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung die Gundlage für einen Biosensor bilden kann. Vorzugsweise wird die Vorrichtung zur Durchführung von Assays mit den relevanten Instrumenten und Einheiten zur Computersteuerung und Datenverarbeitung verbunden. Geeignete Instrumente, Computersteuerungs- und Datenverarbeitungseinheiten sind gut bekannt (z. B. das BIAcore-System, Pharmacia Biosensor AB).
Vorzugsweise ist die Eigenschaft des immobilisierten Bindungspartners, die einer meßbaren Veränderung unterliegt, eine optische Eigenschaft. Am meisten bevorzugt ist die Eigenschaft der Oberflächenbrechungsindex, obwohl andere Detektionsrnittel bekannt sind, die z. B. auf der Messung von elektrischen, elektrochemischen oder piezoelektrischen Eigenschaften; der Schwingungsdämpfungs-Refraktrometrie, Schwingungsdämpfungs-Bildgebung; Transmissions-Refraktometrie oder der Messung von Oberflächenakustikwellen (SAW) beruhen.
Es ist gefunden worden, daß bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung in der Lage sind, einen Analyten im Konzentrationsbereich von 10-200 nM quantitativ nachzuweisen. Weiter ist gefunden worden, daß bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung eine reversible Ansprechzeit von etwa 25 Sekunden haben, was signifikant schneller ist als die der schnellsten Vorrichtungen, die aus dem Stand der Technik bekannt ist (Anderson & Miller, 1988, a.a.O.).
Vorzugsweise bedient sich das Nachweismittel der Anwendung der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), um die Bindung des Analyten an den immobilisierten Bindungspartner nachzuweisen, wie z. B. bei der BIAcore-Vorrichtung.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die folgenden illustrierenden Beispiele und Zeichnungen weiter beschrieben, wobei:
Figur 1a eine schematische Seitenansicht und Figur 1b eine schematische Draufsicht auf eine Ausführungsforrn der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt,
Figur 2 eine vergrößerte, schematische Seitenansicht eines Teils der Vorrichtung, der in Figur 1 gezeigt ist, zeigt,
Figur 3 eine Dosis/Reaktions-Kurve eines Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt, wobei die Reaktion gegen die Konzentration aufgetragen ist, Figur 4 eine Grafik der relativen Reaktion gegen die Zeit zeigt,
Figur 5 in einer Grafik drei Kurven der relativen Reaktion gegen die Zeit beim Nachweis rekombinanter Antikörperfragmente durch einen Sensor mit immobilisiertem Antigen zeigt,
Figur 6a in einer Grafik drei Kurven des Resonanzsignals gegen die Zeit zeigt, und
Figur 6b in einer Grafik zwei Kurven der Veränderungsrate des Resonanzsignals (dR/dt) gegen die Zeit zeigt.

Beisdiele und detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1a zeigt in Seitenansicht schematisch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Von einer lichtemittierenden Diode (LED) 10 emittiertes Licht passiert den Kollimator 12, eine fokussierende Linse 14 und ein Prisma 16, bevor es auf den Sensorchip 18 trifft. Aufgrund des großen Einfallswinkels erfährt das Licht eine innere Totalreflexion, verläßt das Prisma 16 und passiert eine Objektivlinse 20, eine Zylinderlinse 22 und einen Linearpolarisator 24, bevor es auf einen Fotodetektor 26 trifft. In dem System ist ein Bereich von Einfallswinkeln (66-69º) möglich, und der Fotodetektor ermöglicht es, die Veränderungen des Reflexionswinkels als Funktion der Zeit zu erfassen. Der Pfeil 28 deutet den hypothetischen Lichtweg beim Reflexionsminimum an. Die Vorrichtung umfaßt auch Einheiten zur Computersteuerung und Datenverarbeitung (nicht gezeigt).
Die gleiche Ausführungsform ist schematisch als Draufsicht in Figur 1b gezeigt. Die Vorrichtung ist ausführlicher durch Jönsson et al. (a.a.O.) beschrieben.
Figur 2 illustriert schematisch die Grenzfläche zwischen dem Sensorchip (18 in den Figuren 1a und 1b) und dem Flußkanal. Der Sensorchip 18 dient als immobilisierter Bindungspartner und umfaßt einen Glasträger 30, der mit einem dünnen (47 nm ± 15 nm) Goldfilm 32 überzogen ist. Ein flexibles hydrophiles Polymer (z. B. Dextran) 34 ist an dem Goldfilm 32 gebunden und ragt etwa 100 um (abhängig von den Pufferbedingungen) von dem Goldfilm 32 in den Flußkanal 36. Ein Antikörper 38 ist an das flexible hydrophile Polymer 34 mittels chemischer Standardverfahren gebunden. So umfaßt der immobilisierte Bindungspartner der Vorrichtung den festen Träger 30 und den Antikörper 38. Der Antikörper ist in der Lage, mit dem gesuchten Analyten 40 in der Probe, die den Flußkanal 36 passiert, in Wechselwirkung zu treten. Der Winkel θ zeigt den Einfallswinkel des Lichts. R ist der reflektierte Strahl.
Um die Zweckmäßigkeit der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren, ist eine Reihe von Versuchen unter Verwendung ähnlicher wie oben beschriebener Vorrichtungen durchgeführt worden. Es waren im wesentlichen zwei verschiedene Arten. Bei einer Gruppe der Versuche wurde ein rekombinantes Antikörperfragment verwendet, das an einem Sensorchip immobilisiert war, um verschiedene Konzentrationen eines Antigens, das an das Antikörperfragment bindet, nachzuweisen.
Bei einer zweiten Gruppe der Versuche wurden Antigene verwendet, die an einem Sensorchip immobilisiert waren, um die Bindung (und das Ablösen) rekombinanter, nativer Antikörperfragmente, die den Sensor als ausfließendes Medium einer Gelfiltrationssäure passierten, im Vergleich mit dem Verhalten eines "reifen" monoklonalen Antikörperfragments nachzuweisen.
Die erste Gruppe der Versuche wurde durchgeführt, um die Zweckmäßigkeit der Antikörperfragmente bei effektiven "Echtzeit"- Immunonachweisen zu demonstrieren.
Affinitätsgereinigtes Anti-Fog-1-scFv (938 RUs) wurde an einem CMS-Sensorchip mit dem Amin-Kopplungskit unter Verwendung einer Lösung von etwa 3 µM in 10 mM Acetatpuffer (pH 4,5) immobilisiert. Humanes IgG1 Kappa (das das Fog-1-Antigen trägt) wurde in Konzentrationen im Bereich von 10-200 nM in Eluierungspuffer in fünf Zyklen für jede Konzentration über das immobilisierte Anti-Fog-1-scFv ohne zwischenzeitliche Regeneration geleitet. Der Nachweis mit dem BIAcore-System erfolgte in PBS 0,2 mM EDTA/0,05% oberflächenaktive Substanz P20 (Pharmacia Biosensor AB) bei 10 µl/min.
Der nach 25 Sekunden nach der Injektion jeder Probe erreichte Reaktionspegel wurde als ein Dosis/Reaktions-Diagramm ausgedruckt. Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt. Die Grafik zeigt eine akzeptabel gerade Linie, was demonstriert, daß ünter den angewendeten Bedingungen die Reaktion proportional der Konzentration des Antigens ist, und daß sich diese Proportionalität tatsächlich über einen größeren Konzentrationsbereich erstrecken kann.
Um die Schnelligkeit der Reaktion zu illustrieren, wurden die gleichen Konzentrationen an Antigen über das immobilisierte Anti-Fog-1 durch sequentielle, manuelle Injektionen (durch Einreihen des Befehls in eine Warteschlange) geleitet. Die Injektionen wurden hierdurch so schnell ausgeführt, wie die Subroutinen (zum Waschen der Nadeln und Füllen der Schlaufe) von dem BIAcore-System verarbeitet werden können. Die Konzentrationsreihen waren 200, 10, 40, 20, 160, 80 und 120 nM. Die Zeitspanne zwischen den sequentiellen Injektionen betrug 130 Sekunden. Die gleichen Proben wurden als Kontrolle auch über einen blanken CM5-Chip geleitet (dünne Linie).
Die Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt, die eine Grafik der Reaktion (RU) gegen die Zeit (Sekunden) darstellt.
Aus der Grafik ist ersichtlich, daß für jede Konzentration der Reihen die Reaktion bis zur Basislinie abgefallen ist, bevor die nächste Konzentration an Antigen injiziert wurde. Das bedeutet, daß BIAcore der limitierende Faktor bei schnellen, reversiblen, semi-kontinuierlichen Konzentrationsbestimmungen ist.
Die zweite Gruppe der Versuche analysierte den Effekt unterschiedlicher Affinität in den On-line-Sensorgrammen von Gelfiltrationen zweier verschiedener rekombinanter Antikörperfragmente: eines scFv mit niedriger Affinität gegen das Hapten 2-Phenyloxazol-5-on (phOx), aus einer künstlichen Genbibliothek (beschrieben von Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-338), und eines scFv aus einer natürlichen Genbibliothek (beschrieben von Griffiths et al., (1993), EMBO J. 12, 725-734) gegen Fog-1 (d. h. ein humanes IgG 1-Kappa-Antigen). Deren Verhalten wurde verglichen mit dem eines scFv, das aus einem "reifen" monoklonalen Antikörper (MAb) D1.3 gewonnen wurde (gegen Hühnereilysozym, HEL, gerichtet).
Die Versuche wurden wie unten beschrieben durchgeführt und zeigen die Wichtigkeit des Aviditätseffekts.
Eine FPLC-Ausrüstung (Pharmacia-LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden) wurde so nah wie möglich an der im wesentlichen wie oben beschriebenen BIAcore-Vorrichtung (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) plaziert, und der Auslaß des UV-Detektors wurde mit dem Pumpenschlaucheinlaß im automatischen Probennehmer verbunden. Ein rostfreies Rohr mit 0,5 mm Durchmesser wurde mit dem Abfluß der Flußzelle verbunden, so daß die abfließende Flüssigkeit in einem Fraktionssammler gesammelt werden konnte. Eine Superdex 75-FPLC-Säule von 1,0 x 30 cm wurde mit PBS 0,2 mM EDTA bei einer Flußrate von 0,5 mL/min verwendet. Um eine Beschädigung der in der BIAcore-Vorrichtung integrierten Fluidikelemente (IFC) zu vermeiden, wurden keine größeren Flußraten verwendet. Der Abstand zwischen dem Auslaß des UV-Monitors und dem Einlaß der BIAcore-Vorrichtung betrug etwa 15 cm. Manuelle Sensorgramme wurden mittels der BIAcore-Vorrichtung erstellt, und Präsentationen wurden mit Hilfe der Excel-Software angefertigt (Figuren 5-6b).
Die relevanten Antigene wurden unter Verwendung des Amin-Kopplungskits auf einem CM5-Sensorchip immobilisiert (erhalten von Pharmacia Biosensor AB, beschrieben von Jönsson et al., (1991) Analytical Biochemistry 198, 268-277). Das Hapten phOX wurde mit BSA konjugiert, das resultierende Antigen wurde nach dem Verfahren, das von Marks et al. beschrieben wurde (1992, Bio/Technology 10, 779-783), in einer Konzentration von etwa 1300 relativen Resonanzeinheiten (RU) an den Sensor gebunden, und Hühnereilysozym wurde unter Verwendung einer 20 µg/ml-Lösung von HEL in 10 mM Acetatpuffer pH 5,0 in einer Konzentration von etwa 800 RU gebunden.
Die Größenkalibrierung der Säule wurde durchgeführt, indem die Säule zum Trennen einer Mischung aus BSA, Ovalbumin und HEL, jeweils mit einer OD von 0,5, verwendet wurde. Der Nachweis erfolgte durch Messen der Veränderung des Brechungsindex der von der Säule abfließenden Flüssigkeit mittels der BIAcore- Vorrichtung.
Die Ergebnisse dieses ersten Versuchs aus der zweiten Gruppe sind in Figur 5 dargestellt, die zeigt, wie verschiedene Affinitäten und kinetische Konstanten die Reaktion bei Verwendung des BIAcore-Systems beeinflussen.
Figur 5 ist eine Grafik der relativen Resonanzeinheiten (RU) gegen die Zeit (in Sekunden). Es gibt drei Kurven, die die spezifische Reaktion aufgrund der Bindung der Antikörperfragmente in abfließenden Flüssigkeiten von Gelfiltrationen an CM5-Chips, die mit dem geeigneten Antigen beschichtet sind, darstellen. Die dünne Linie zeigt die Kurve für die Bindung von affinitätsgereinigtem scFv von D1.3 (dem "reifen" anti-HEL-Antikörper). (Dieses scFv wurde durch Affinitätschromatographie aus dem Überstand mit dem immobilisierten Antikörper 9E10, unter Verwendung des C-terminalen Myc-tag, wie von Clackson et at., [1991], Nature 352, 624-628 beschrieben, gereinigt). Die unterste (gestrichelte Linie) ist diejenige für die Bindung des Anti-phOX-scFv-Klons 31, und die stärkste Linie ist diejenige für die Bindung von Anti-Fog-1-scFv. Die Ergebnisse zeigen, daß alle drei scFv-Fragmente in einem gewissen Ausmaß aggregiert waren, und daß die Adsorption der scFv-Fragmente zu Zeitpunkten erfolgte, die der Eluierung der scFv-Monomere und -Dimere entsprachen. Der hochaffine D1.3-scFv wurde an die Antigenoberfläche sowohl während der Elution der Dimere als auch der Monomere gebunden, aber die anderen beiden scFv- Fragmente hatten viel größere Dissoziationsgeschwindigkeiten nach Passieren des Dimer-Signals und wurden wieder an dem Punkt adsorbiert, der der Eluierung der Monomere entsprach.
Um die Spezifität des On-line-Nachweises mit dem BIAcore-Instrument zu beweisen, wurden zwei rekombinante Antikörperfragmente gegen phOX in Nährmedien einer Gelfiltration unterzogen. Ein scFv mit der Bezeichnung B2 wurde aus einer Bibliothek durch Kettenmischen erhalten, (Marks et al. 1992, a.a.O.). Das andere war ein als NQ10 bezeichnetes Fab-Fragment, erhalten von einem hochaffinen MAB, der als Größenmarker verwendet wurde.
Ein Wachstumskulturüberstand, der das scFv B2 enthielt, wurde fünffach durch Ultrafiltration mit Centricon 10-Konzentratoren (Amicon) konzentriert. Das Fab-Fragment NQ10 wurde direkt aus dem Kulturüberstand erhalten.
Die beiden bei der Gelfiltration abfließenden Flüssigkeiten wurden sowohl über die Oberfläche eines mit Antigen beschichteten Chips, als auch eines blanken CM5-Sensorchips geleitet. Weder an dem mit Antigen beschichteten Chip konnte eine Absorption aus dem Hohlraumvolumen erkannt werden, noch wurde Material an der blanken CM5-Oberfläche absorbiert. Jedoch bewirkten Peptide und andere farbige Substanzen eine Veränderung des Brechungsindex in späteren Stadien der Separation, sowohl bei dem spezifischen Nachweis als auch bei dem Kontrollauf. Diese Ergebnisse sind graphisch in den Figuren 6a und 6b illustriert. Figur 6a ist eine Grafik von Resonahzeinheiten gegen die Zeit (in Sekunden). Figur 6b ist eine Grafik der Geschwindigkeit der Veränderung des Resonanzsignals (RUs pro Sekunden) gegen die Zeit (in Sekunden).
Figur 6a zeigt on-line die spezifische Bindung des Anti-phOX(B2)-scFv (dicke Linie) und des Anti-phOX-NQ10-Fab-Fragments (dünne Linie) an eine mit phOX-BSA beschichtete Oberfläche, nachgewiesen mit der BIAcore-Vorrichtung. Beide Antikörper wurden in Nährmedium an Superdex 75 getrennt. Die gestrichelte Kurve in der Grafik unten zeigt die Kurve, die von NQ10 in Nährmedium hervorgerufen wurde, das über eine unbeschichtete Oberfläche eines CM5-Sensorchips geleitet wurde.
Das NQ10-Fab und das Dimer des B2 wurden an der gleichen Stelle eluiert und das Monomer von scFv B2 kann als zusätzliches Signal im Sensorgramm beobachtet werden. Die Dissoziation des Fab NQ10 von der Antigenoberfläche hat die Form eines logarithmischen Abfalls an der Stelle vom Maximum bis zur Eluierung kleiner Peptide und anderer Nährstoffe aus dem Medium (bei T = 2.000-2.500). Das ist verschieden vom Dissoziationsprofil des B2, welches eine gemischte Dissoziation mit einem raschen Abfall des monomeren scFv (aufgrund dessen reversibler Bindungseigenschaften) und einer langsamen Dissoziation, die ab etwa 1.500 beobachtet werden kann, aufweist. Das könnte ein Ergebnis der Stabilisierung des B2-Dimers sein, das an das haptenisierte BSA über zwei Bindungsstellen bindet.
Figur 6b zeigt die Ableitung des Signals (dR/dt) aus Figur 6a für das scFv B2 (durchgezogene Linie) und NQ10-Fab (gestrichelte Linie). Die maximalen Assoziationsgeschwindigkeiten treten sowohl für dimeres B2 als auch NQ10-Fab an der gleichen Eluierungsstelle auf, wobei ein weiteres Signal der Eluierung des monomeren B2 (basierend auf der Kalibrierung mit dem Albumin-, Ovalbumin- und Lysozymstandards) entspricht. Die rasche Dissoziation des scFv-Monomers kann als ein großer, negativer Wert erkannt werden.

Claims

1. Vorrichtung zum Nachweis des Vorliegens in Lösung eines gesuchten Analyten in einer Probe, umfassend einen immobilisierten. Bindungspartner, der einen festen Träger und einen reversibel bindenden Rezeptor umfaßt, welcher zur Bindung an den gesuchten Analyten fähig ist und dabei eine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des immobilisierten Bindungspartners hervorruft, und ein Nachweismittel zum Nachweis der meßbaren Veränderung, wobei der reversibel bindende Rezeptor eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante von größer als 10&supmin;² pro Sekunde aufweist und die Halbwertszeit des Rezeptor/Analyt-Komplexes weniger als oder gleich 60 Sekunden beträgt, was ein rasches Reagieren der Vorrichtung auf Veränderungen in der Analytenkonzentration gestattet.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, in der der reversibel bindende Rezeptor ein Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment hiervon, ein Peptid oder eine Nukleotidsequenz ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der der reversibel bindende Rezeptor durch ein Verfahren selektiert ist, bei dem die Nettodissoziationsgeschwindigkeit eines Rezeptor/Antigen- Komplexes herabgesetzt wird.

4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche! bei der der reversible Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigenbindendes Fragment hiervon ist, der/das eine Polypeptidsequenz umfaßt, die von einer aus einer V-Gen-Batterie gewonnenen Nukleotidsequenz kodiert wird.

5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon ist, der/das durch Selektion aus einer Bibliothek unter Verwendung des Phagen-Display-Verfahrens gewonnen ist.

6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der Rezeptor ein einkettiges Variable-Region-Fragment (scFv) umfaßt.

7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der eine optische Eigenschaft des immobilisierten Bindungspartners eine meßbare Veränderung erfährt.

8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der Oberflächenbrechungsindex des immobilisierten Bindungspartners eine meßbare Veränderung erfährt.

9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der das Nachweismittel die Messung der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) des immobilisierten Bindungspartners umfaßt.

10. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der die Vorrichtung zum quantitativen Nachweis eines gesuchten Analyten im Konzentrationsbereich von 10 bis 200 nM fähig ist.

11. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei der der reversibel bindende Rezeptor ein Antikörper oder ein Fragment hiervon ist, der/das gegen ein Polypeptidantigen gerichtet ist.

12. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einer reversiblen Ansprechzeit von deutlich weniger als 5 Minuten.

13. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche zum Einsatz beim qualitativen oder quantitativen Online-Nachweis eines gesuchten Analyten.

14. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines gesuchten Analyten in einer Probe, bei dem die Probe mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in Kontakt gebracht wird und eine meßbare Veränderung einer Eigenschaft des Bindungspartners als Antwort auf die Bindung des Analyten an den Bindungspartner nachgewiesen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, umfassend den qualitativen oder quantitativen Online-Nachweis eines gesuchten Analyten.