DE69307124T2

DE69307124T2 - Stabile mikroblasensuspensionen wie verstärkungagenzien für ultraschall-echographie

Info

Publication number: DE69307124T2
Application number: DE69307124T
Authority: DE
Inventors: Jean Brochot; Jerome Puginier; Michel Schneider; Feng Yan
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco International BV
Priority date: 1992-11-02
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 1997-07-17
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: HU227043B1; FI943167A0; LU90837I2; AU704954B2; AU3431795A; AU681812B2; IS1625B; GR3022826T3; CN1069838C; US5908610A; US5686060A; KR100216138B1; DE69307124D1; AU666238B2; NO942476D0; IS4089A; HUT74561A; ZA938117B; NZ257115A; DK0619743T3

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft injizierbare Suspensionen von gasgefüllten Mikrobläschen in einem wäßrigen Träger enthaltend amphiphile Verbindungen, von denen mindestens eine ein Phospholipidstabilisator der Mikrobläschen gegen das Kollabieren mit der Zeit und unter Druck ist. Der Phospholipidstabilisator kann in lamellarer oder laminarer Form vorliegen. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung stabiler Suspensionen von Mikrobläschen, die als Kontrastmittel bei der Ultraschallsonographie geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Die Verwendung von Suspensionen von Gasmikrobläschen in einer Trägerflüssigkeit als effiziente Ultraschallreflektoren ist allgemein bekannt. Die Entwicklung von Mikrobläschensuspensionen als Pharmazeutika für die Sonographie zur Verstärkung bei bildgebenden Ultraschalluntersuchungen folgte frühen Beobachtungen, das schnelle intravenöse Injektionen das Ausperlen solubilisierter Gase unter Bildung von Bläschen aus der Lösung bewirken kann. Aufgrund des deutlichen Unterschiedes ihrer akkustischen Impedanz im Vergleich zu Blut erwiesen sich diese intravaskulären Gasbläschen als ausgezeichnete Reflektoren für den Ultraschall. Das Injizieren von Suspensionen von Gasmikrobläschen in einer Trägerflüssigkeit in den Blutstrom lebender Organismen verbessert bildgebende Ultraschallsonographie-Untersuchungen wesentlich und verbessert so die Sichtbarmachung innerer Organe. Da bildgebende Untersuchungen von Organen und tiefliegendem Gewebe zur Erstellung einer medizinischen Diagnose entscheidend sein können, wurden zahlreiche Versuche unternommen, um stabile Suspensionen hochkonzentrierter Gasmikrobläschen zu entwickeln, welche gleichzeitig leicht herzustellenund zu verabreichen sind, ein Minimum inaktiver Bestandteile enthalten, zur langen Lagerung geeignet und leicht zu vertreiben sind. Es wurden viele Versuche zum Auffinden einer Lösung, welche diese Kriterien erfüllt, unternommen, jedoch hat keiner ein vollständig befriedigendes Ergebnis ergeben.
Aus der EP-A-0 077 752 (Schering) ist bekannt, daß Suspensionen von Gasmikrobläschen durch Mischen einer wäßrigen Lösung eines oberflächenaktiven Stoffes mit einer Lösung eines Viskositätsverstärkers als Stabilisator hergestellt werden können. Die Gasblasen werden in die Mischung eingebracht, indem eine Mischung der Reagenzien und Luft durch eine schmale Öffnung gepreßt wird. Eine Suspension von CO&sub2;-Mikrobläschen kann durch Zusatz einer Säure zu einer Mischung erhalten werden, die aus einer Lösung erhalten wurde, die einen oberflächenaktiven Stoff und Natriumbicarbonat und eine Lösung des Viskositätsverstärkers enthält. Das Mischen der Komponenten muß jedoch direkt vor der Verwendung erfolgen, und die Lösung muß sofort nach der Herstellung verbraucht/injiziert werden. Die offenbarten oberflächenaktiven Stoffe (Tenside) umfassen Lecithine, Ester und Ether von Fettsäuren und Fettalkoholen mit Polyoxyethylen und polyoxyethylierten Polyolen, wie Sorbitol, Glykolen und Glycerin, Cholesterin, und Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polymeren. Die offenbarte Konzentration der Tenside in den Suspensionen liegt zwischen 0,01 und 10 Gew.-%, und es wird behauptet, daß ein bevorzugter Bereich zwischen 0,5 % und 5 % liegt. Die Verbindungen zur Viskositätserhöhung und Stabilisierung schließen z.B. Mono- und Polysaccharide (Glucose, Lactose, Saccharose, Dextran, Sorbitol), Polyole, z.B. Glycerin, Polyglykole, und Polypeptide wie Proteine, Gelatine, Oxypolygelatine, Plasmaprotein und dergleichen ein. Die Gesamtmenge des Viskositätsverstärkungsmittels ist auf 0,5 bis 50 % begrenzt. Die Verwendung von Polyoxypropylen- Polyoxyethylen-Polymeren (z.B. Pluronic F-68) als Viskositätsverstärkungsmittel ist ebenfalls offenbart. In dem bevorzugten Beispiel werden äquivalente Volumina an Tensid, eine 0,5-gewichtsprozentige wäßrige Lösung aus Pluronic F-68 (ein Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Copolymer) und der Viskositätsverstärker (eine 10%ige Lactoselösung) unter sterilen Bedingungen heftig zusammen geschüttelt, um eine Suspension von Mikrobläschen zu erhalten. Die erhaltene Suspension war für zwei Minuten stabil und enthielt nahezu 50 % Blasen mit einer Größe unter 50 µm. Gemäß diesem Dokument können bis zu 50 % oberflächenaktive Stoffe und/oder Viskositätsverstärkungsmittel verwendet werden, jedoch wird in den spezifischen Beispielen lediglich zwischen 1 % und 4 % Pluronic F-68 verwendet.
Leicht herstellbare wäßrige Suspensionen, die als bildgebende Mittel bei der Ultraschallsonographie verwendbar sind, werden in der WO-91/15244 (Schneider et. al.) offenbart. Die Suspensionen enthalten filmbildende oberflächenaktive Stoffe in laminarer und/oder lamellarer Form und gegebenenfalls hydrophile Stabilisatoren. Die laminarisierten oberflächenaktiven Stoffe können in Form von Liposomen vorliegen, d.h. mikroskopischen Vesikeln, die im allgemeinen sphärisch geformt sind. Diese Vesikel werden gewöhnlich durch eine oder mehr konzentrisch angeordnete bimolekulare Schichten von amphiphilen Verbindungen gebildet, d.h. Verbindungen mit einem hydrophilen und einem hydrophoben Rest. Die Moleküle in den Doppelschichten sind so angeordnet, daß sich die hydrophoben Reste gegenüberliegen und die hydrophilen Reste zur Wasserphase zeigen. Die Suspensionen werden erhalten, indem die laminarisierten oberflächenaktiven Stoffe vor oder nach dem Mischen mit einer wäßrigen Phase der Luft oder einem Gas ausgesetzt werden. Die Umwandlung der filmbildenden oberflächenakti- ven Stoffe in die laminare Form wird gemäß den verschiedenen Techniken zur Bildung von Liposomen ausgeführt, einschließlich dem Hochdruckhomogenisieren oder dem Beschallen mit akustischenoder Ultraschall-Frequenzen. Die Konzentration der beanspruchten Phospholipide liegt zwischen 0,01 % und 20 % und die Konzentration der Mikrobläschen liegt zwischen 10&sup8; und 10&sup9; Bläschen/ml. Die Mikrobläschensuspensionen waren für Monate stabil. Die Konzentration der Phospholipide in Beispiel 1 ist 0,5 %.
Ein Versuch zur Herstellung einer stabilen echoerzeugenden Suspension wird in der WO-92/11873 (Beller et. al.) offenbart. Wäßrige Zubereitungen, die zur Absorption und Stabilisierung von Mikrobläschen zur Verwendung als sonographische Kontrastmittel ausgelegt sind, werden mit Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Polymeren und negativ geladenen Phospholipiden, wie Phosphatidylglycerin, Phosphatidiylinositol, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin sowie deren Lysoformen hergestellt. Der Konzentrationsbereich der Phospholipide in den Zubereitungen kann zwischen 0,01 und 5 Vol.- oder Gewichtsprozent liegen, jedoch werden Zubereitungen mit 1 % Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG) speziell offenbart und beansprucht. Zusätzlich zu den negativ geladenen Phospholipiden müssen die Zusammensetzungen zwischen 0,1 % und 10 % polymeres Material (Pluronic F-68) enthalten. Die Gesamtmenge an gelösten Stoffen in den Zubereitungen liegt zwischen 5,1 % und 10,4 %. Die Konzentration der Mikrobläschen wird nicht angegeben, kann jedoch anhand der angeführten Ergebnissen auf etwa 10&sup7;-Bläschen/ml abgeschätzt werden. Die Stabilität der Suspensionen soll besser als die der EP-A-0 077 752 sein.
Obwohl die Zusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik Vorzüge haben, weisen sie immer noch verschiedene Nachteile auf, welche ihre praktische Verwendung erschweren. Zum einen haben einige Zusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik relativ geringe Stabilitätszeiten und zweitens haben sie eine relativ geringe anfängliche Blasenzahl. z.B. zwischen 10&sup4;- und 10&sup5;-Blasen/ml. Dies macht die Reproduzierbarkeit und Analyse von sonographischen Tests, die mit solchen Zusammensetzungen gemacht wurden, ziemlich schwierig. Zusätzlich ergeben einige Techniken Blasen mit einem großen Durchmesserbereich (bis zu 50 µm), was deren Verwendung als sonographische Mittel bei bestimmten Anwendungen (z.B. Sonographie des linken Herzens) verhindert.
Der Bedarf an stabilen Mikrobläschenformulierungen, welche den Druckschwankungen in den Blutströmen widerstehen und welche eine gute Lagerbeständigkeit aufweisen, wird weiterhin durch die geringe Stabilität einiger der Zusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik verstärkt. Mikrobläschenformulierungen, deren Vertrieb und Lagerung keine Probleme bereitet, sind besonders wichtig.
Ein anderer Nachteil ist, daß viele der bisher bekannten Zusammensetzungen eine große Menge verschiedener gelöster Stoffe wie Polymere, Phospholipide, Elektrolyte und andere enthalten, was deren praktische Verwendung mehr und mehr erschwert. Zum Beispiel ist bekannt, daß die Verwendung von Polyoxyethylen/ Polyoxypropylen-Polymeren (Pluronic ) bei bestimmten Patienten unangenehme Nebenwirkungen hervorrufen kann (siehe z.B. G.M. Vercellotti et. al., Blood (1982) 59, 1299). Zubereitungen mit einem hohen Phospholipidgehalt können in bestimmten Fällen ebenfalls unerwünscht sein. Auf jeden Fall werden Zusammensetzungen mit einer großen Menge an verschiedenen gelösten Stoffen widerwillig verabreicht und ihre weit verbreitete Anwendung wird zunehmend als unerwünscht betrachtet. Tatsächlich geht der Trend in der pharmazeutischen Industrie dahin, die Konzentrationen an aktiven und inaktiven Bestandteilen in verschiedenen medizinischen oder pharmazeutischen Formulierungen auf ihre geringst möglichen Werte zu reduzieren und aus den Zubereitungen alles zu entfernen, was nicht notwendig ist. Das Auffinden von alternativen Verfahren und das Formulieren von wirksameren Zusammensetzungen bleibt wichtig. Das gilt insbesondere für Mikrobläschensuspensionen, die bei der Sonographie angewendet werden, da hier die Bestandteile keinen heilenden Effekt haben und die geringst möglichen Nachwirkungen haben sollen. Wie jedoch oben ausgeführt wurde, halten die Zubereitungen gemäß dem Stand der Technik mit typischen Konzentrationen im Bereich von 1 Gew.-% und 4 Gew.-% und die Lehren des Standes der Technik von der Verwendung reduzierter Mengen von Phospholipiden und anderen Nicht-Phospholipidzusätzen ab. Der Grund für das Abhalten ist mit größter Wahrscheinlichkeit in der Tatsache verborgen, daß im Verlauf der Routineversuche ein weiteres Verringern der Konzentration der Bestandteile niemals Suspensionen ergab, welche stabil genug waren, um irgendeine praktische Verwendung zu haben oder um zu weiteren Versuchen am unteren Ende des bekannten Bereichs zu ermutigen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem unerwarteten Befund, das sehr stabile Suspensionen von gasgefüllten Mikrobläschen, die mindestens 10&sup7;-Mikrobläschen pro Milliliter enthalten, unter Verwendung von Phospholipiden als Stabilisatoren selbst dann erhalten werden können, wenn sehr geringe Konzentrationen davon verwendet werden. Die als Kontrastmittel bei der Ultraschallsonographie verwendbaren Suspensionen werden erhalten, indem in einem wäßrigen Träger mindestens ein Phospholipid als Stabilisator der Mikrobläschen gegen das Kollabieren mit der Zeit und unter Druck suspendiert wird, wobei die Konzentration des Phospholipids unter 0,01 Gew.-% liegt, aber gleich oder höher als die Konzentration ist, bei der die Phospholipidmoleküle allein an der Mikrobläschen/Flüssigkeitsgrenzfläche vorhanden sind.
Es war ziemlich unerwartet, festzustellen, daß so vernachlässigbare Mengen der oberflächenaktiven Phospholipidsubstanzen, wie sie hier verwendet werden (verwendet alleine oder zusammen mit relativ kleinen Mengen anderer amphiphiler Stoffe), Mikrobläschen so effektiv stabilisieren können. Es wird postuliert, daß in Gegenwart anderer amphiphiler Verbindungen (so wie Pluronic ) die Kohäsion zwischen den Stabilisatormolekülen verringert und die Bildung monomolekularer Phospholipidfilme unterdrückt wird. In Abwesenheit großer Mengen anderer amphiphiler Mittel sind die ungehinderten intermolekularen Bindungskräfte (elektrostatische Wechselwirkung oder Wasserstoffbrückenbindung) zwischen den Phospholipidmolekülen jedoch ausreichend, um die Bildung stabiler filmähnlicher Strukturen zu gewährleisten, welche die Blasen gegen Kollabieren oder Koaleszieren stabilisieren.
Gemäß der Erfindung können Suspensionen mit hoher Mikrobläschenkonzentration, hoher Stabilität, langer Lagerkapazität und leichter Herstellbarkeit erhalten werden, selbst wenn die Konzentrationen der oberflächenaktiven Stoffe und anderer Additive in den Suspensionen deutlich unter den Werten gehalten werden, die in den Formulierungen gemäß dem Stand der Technik verwendet werden. Die in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendeten Mengen an Phospholipiden können etwa so gering sein, wie die zur Bildung einer einzigen monomolekularen Schicht des oberflächenaktiven Stoffes um die Gasmikrobläschen herum erforderliche, während die Konzentration der Bläschen in den Suspensionen oberhalb von 10¹&sup7;-Mikrobläschen pro Milliliter gehalten wird. Es ist unwahrscheinlich, daß bei der vorliegenden Erfindung Mikrobläschen mit einer liposomenähnlichen Doppelschicht des oberflächenaktiven Stoffes (gasgefüllte Liposomen) existieren, und solche wurden nicht beobachtet.
Suspensionen mit hohen Mikrobläschenkonzentrationen, beispielsweise zwischen 10&sup9;- und 10¹&sup0;-Bläschen/ml, mit relativ hoher Stabilität und langer Lagerkapazität können hergestellt werden, selbst wenn die Konzentration der oberflächenaktiven Phospholipidsubstanzen deutlich unter den Werten gehalten wird, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Suspensionen können mit so wenig wie 1 µg Phospholipide/ml hergestellt werden, solange die Menge der verwendeten oberflächenaktiven Stoffe nicht unter derjenigen liegt, welche zur Bildung einer einzelnen monomolekularen Schicht des Lipids um die Gasbläschen herum erforderlich ist und solange diese gemäß einem der hier offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Berechnungen haben gezeigt, daß für Bläschenkonzentrationen von 10&sup8; Bläschen/ml diese Konzentration, abhängig von der Größenverteilung der Mikrobläschen, so gering wie 1 µg/ml oder 0,0001 % sein kann, jedoch sind Phospholipidkonzentrationen zwischen 0,0002 % und bis zu 0,01 % bevorzugt. Die Konzentration der Phospholipide in den stabilen Mikrobläschensuspensionen gemäß der Erfindung liegt besonders bevorzugt zwischen 0,001 % und 0,009 %. Obwohl eine weitere Verringerung der Menge der Phospholipide in den Suspensionen möglich ist, sind Suspensionen, die mit weniger als 0,0001 Gew.-% hergestellt wurden, unstabil, ihre gesamte Blasenzahl ist gering, und ihr echographisches Verhalten nach Injektion ist nicht zufriedenstellend. Andererseits ergeben mit mehr als 0,01 % Phospholipiden hergestellte Suspensionen nach Injektion keine besseren Ergebnisse, d.h., ihre Stabilität und ihr echographisches Verhalten verbessern sich mit der Konzentration nicht weiter. Somit können höhere Konzentrationen lediglich die Wahrscheinlichkeit unerwünschter Nebenwirkungen erhöhen, wie sie bei der Diskussion des Standes der Technik dargelegt wurden. Es wird vorläufig postuliert, daß lediglich die Segmente der oberflächenaktiven Stoffe, welche in der lamellaren oder laminaren Form vorliegen, effektiv Moleküle freisetzen können, die zur Stabilisierung der Bläschen richtig angeordnet sind. Dies kann erklären, warum die Konzentration der oberflächenaktiven Stoffe so gering sein kann, ohne die Stabilität der Gasbläschen zu beeinträchtigen.
Die Suspensionen gemäß der Erfindung bieten wesentliche Vorteile gegenüber den Zusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik, nicht nur aufgrund des geringen Phospholipidgehalts, sondern auch, weil die Gesamtmenge der injizierten gelösten Stoffe, d.h. der Lipide und/oder der synthetischen Polymere und anderen Additive, zwischen 1 000 und 50 000 mal geringer als bisher ist. Dies wird ohne jeden Verlust der Mikrobläschenkonzentration, d.h. der echographischen Eigenschaften oder Stabilität des Produkts erreicht. Zusätzlich zu der sehr geringen Konzentration der gelösten Stoffe stellt die Erfindung Suspensionen bereit, die nur die Mikrobläschen enthalten können, deren Beitrag zu dem echographischen Signal relativ signifikant ist, d.h. Suspensionen, die frei von Mikrobläschen sind, welche nicht aktiv an dem bildgebenden Prozeß beteiligt sind.
Es ist überflüssig darauf hinzuweisen, daß mit so geringen Konzentrationen an gelösten Stoffen in der injizierbaren Zusammensetzung gemäß der Erfindung die Wahrscheinlichkeit unerwünschter Nebenwirkungen deutlich verringert wird, und die Eliminierung des injizierten Mittels wird wesentlich verbessert.
Die erfindungsgemäßen Mikrobläschensuspensionen mit geringem Phospholipidgehalt können aus filmbildenden Phospholipiden hergestellt werden, deren Struktur in geeigneter Weise modifiziert wurde, z.B. durch Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen von Lösungen der rohen Phospholipide in einem geeigneten Lösungsmittel. Vor der Bildung der Suspensionen durch Dispergieren in einem wäßrigen Träger werden die gefriergetrockneten oder sprühgetrockneten Phospholipide mit Luft oder einem anderen Gas in Berührung gebracht. Beim Inkontaktbringen mit dem wäßrigen Träger bilden die pulverisierten Phospholipide, deren Struktur zerstört wurde, lamellarisierte oder laminarisierte Segmente, welche die Mikrobläschen des darin dispergierten Gases stabilisieren. Die erfindungsgemäßen Suspensionen mit geringem Phospholipidgehalt können vorteilhaft auch mit Phospholipiden hergestellt werden, welche vor dem Inkontaktbringen mit Luft oder einem anderen Gas lamellarisiert oder laminarisiert wurden. Somit kann das Kontaktieren der Phospholipide mit Luft oder einem anderen Gas ausgeführt werden, wenn die Phospholipide in Form eines trockenen Pulvers oder in der Form einer Dispersion laminarisierter Phospholipide in dem wäßrigen Träger vorliegen.
Der Begriff lamellar oder laminarer Form zeigt, daß die oberflächenaktiven Stoffe in Form dünner Filme oder Schichten vorliegen, die eine oder mehr molekulare Schichten umfassen. In dieser Form ordnen sich die Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes in Strukturen an, die denen von liposomalen Vesikeln ähneln. Die Überführung von filmbildenden oberflächenaktiven Stoffen in lamellare Form kann, wie in der WO-91/15244 beschrieben wird, leicht durch jedes Verfahren zur Bildung von Liposomen erfolgen, z.B. durch Hochdruckhomogenisieren oder durch Beschallen mit akustischen oder Ultraschallfrequenzen. Die Umwandlung in lamellare Form kann auch durch das Beschichten von Mikropartikeln (10 µm oder weniger) eines wasserlöslichen Trägerfeststoffs (NaCL, Saccharose, Lactose oder andere Kohlenhydrate) mit einem Phospholipid und anschließende Auflösen des beschichteten Trägers in einer wäßrigen Phase erfolgen. Auf gleiche Weise können unlösliche Partikel, z.B. Glas oder Harz-Mikroperlen, durch Befeuchten in einer Lösung eines Phospholipids in einem organischen Lösungsmittel, gefolgt von dem Abdampfen des Lösungsmittels, beschichtet werden. Die lipidbeschichteten Mikroperlen werden danach mit einer wäßrigen Trägerphase in Kontakt gebracht, wobei sich liposomale Vesikel in der Trägerphase bilden. Phospholipide können auch durch das Erhitzen kurz über die kritische Temperatur (Tc) und leichtes Rühren lamellarisiert werden. Die kritische Temperatur ist die Temperatur des Gel/ Flüssigübergangs der Phospholipide.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrobläschensuspensionen mit geringem Phospholipidgehalt kann man praktisch mit Liposomensuspensionen oder Lösungen beginnen, die durch irgendeine bekannte Technik hergestellt wurden, solange, wie die liposomalen Vesikel "unbeladen" sind, d.h. sie kein anderes Fremdmaterial als die wäßrige Phase der Lösung selbst darin eingeschlossen haben.
Das Einbringen von Luft oder Gas in eine Liposomenlösung kann durch gewöhnliche Mittel erfolgen, durch Injektion, d.h. Pressen von Luft oder Gas durch kleine Öffnungen in die Liposomenlösung, oder einfach durch Lösen des Gases in der Lösung durch Anwenden von Druck und plötzliches Entspannen des Drucks. Ein anderer Weg besteht darin, die Liposomenlösung in Anwesenheit von Luft oder einem anderen physiologisch verträglichen Gas zu rühren oder zu beschallen. Man kann die Bildung eines Gases auch in der Liposomenlösung sölbst erzeugen, z.B. durch Gas freisetzende chemische Reaktionen, z.B. Zersetzen eines gelösten Carbonats oder Bicarbonats durch Säure.
Es wird angenommen, daß, wenn laminarisierte oberflächenaktive Stoffe in einem wäßrigen flüssigen Träger suspendiert worden und Luft oder ein anderes Gas zur Bildung von Mikrobläschen eingebracht wird, die Mikrobläschen zunehmend durch eine monomolekulare Schicht der Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes umschlossen und stabilisiert werden, und nicht durch eine Doppelschicht, wie im Fall der liposomalen Vesikel. Diese strukturelle Umordnung der Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes kann mechanisch (bewegen) oder thermisch aktiviert werden. Die erforderliche Energie ist in Anwesenheit von Stoffen, welche die Kohäsion herabsetzen, wie Pluronic , geringer. Andererseits verringert die Anwesenheit von Mitteln, welche die Kohäsion erniedrigen, die natürliche Affinität zwischen den Phospholipidmolekülen, was als direkte Konsequenz eine verringerte Stabilität der Mikrobläschen gegenüber äußeren Drucken zur Folge hat (z.B. oberhalb von 20 bis 30 Torr).
Wie bereits ausgeführt wurde, kann man zur Herstellung der erfindungsgemäßen Suspensionen mit niedrigem Phospholipidgehalt anstelle von Phospholipidlösungen von trockenen Phospholipiden ausgehen, welche in lamellarisierter Form vorliegen können oder nicht. Wenn lamellarisiert, können solche Phospholipide z.B. durch Dehydratisieren von Liposomen erhalten werden, d.h. Liposomen, welche normal mit Mitteln herkömmlicher Techniken in Form wäßriger Lösungen hergestellt und danach durch übliche Mittel dehydratisiert wurden. Ein Verfahren zum Dehydratisieren von Liposomen ist das Gefriertrocknen (Lyophilisieren), d.h., die Liposomenlösung, die vorzugsweise hydrophile Verbindungen enthält, wird gefroren und durch Evaporieren (Sublimieren) unter verringertem Druck getrocknet.
Gemäß einem anderen Ansatz können nicht-lamellarisierte oder nicht-laminarisierte Phospholipide durch Lösen des Phospholipids in einem organischen Lösungsmittel und Trocknen der Lösung ohne Bildung von Liposomen erhalten werden. Mit anderen Worten kann dies durch Lösen der Phospholipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, zusammen mit einer hydrophilen Stabilisatorsubstanz, z.B. einem Polymer wie PVC, PVA, PEG etc. oder einer Verbindung, die sowohl in dem organischen Lösungsmittel und Wasser löslich ist, und Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen der Lösung erfolgen. Weitere Beispiele für die hydrophilen Stabilisatorverbindungen, die in Wasser und dem organischen Lösungsmittel löslich sind, sind Äpfelsäure, Glykolsäure, Maltol und dergleichen. Jedes geeignete Lösungsmittel kann verwendet werden, solange sein Siedepunkt ausreichend niedrig und sein Schmelzpunkt ausreichend hoch ist, um das anschließende Trocknen zu erleichtern. Typische organische Lösungsmittel sind z. B. Dioxan, Cyclohexanol, tert. -Butanol, Tetrachlordifluorethylen (C&sub2;Cl&sub4;F&sub2;) oder 2-Methyl-2-butanol, wobei jedoch tert.-Butanol, 2- Methyl-2-butanol und C&sub2;Cl&sub4;F&sub2; bevorzugt sind. Bei dieser Variante ist das zur Auswahl des hydrophilen Stabilisators verwendete Kriterium seine Löslichkeit in dem gewählten organischen Lösungsmittel. Die Suspensionen der Mikrobläschen werden aus solchen Pulvern unter Verwendung derselben Schritte wie bei Pulvern laminarisierter Phospholipide hergestellt.
Ähnlich wird vor Ausführung der Gefriertrocknung prä-lamellarisierter oder prä-laminarisierter Phospholipidlösungen eine hydrophile Stabilisatorverbindung in der Lösung gelöst. Jedoch
ist hier die Auswahl der hydrophilen Stabilisatoren viel größer, da sowohl ein Kohlenhydrat wie Lactose oder Saccharose als auch ein hydrophiles Polymer, wie Dextran, Stärke, PVP, PVA, PEG und dergleichen, verwendet werden kann. Das ist bei der vorliegenden Erfindung nützlich, da solche hydrophilen Verbindungen auch ein Homogenisieren der Größenverteilung der Mikrobläschen begünstigen und die Stabilität bei Lagerung erhöhen. Das Herstellen sehr verdünnter wäßriger Lösungen (0,0001 bis 0,01 Gew.-%) gefriergetrockneter Phospholipide, die mit Polyethylenglykol und Lipid, z.B. in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 bis 1000:1 stabilisiert sind, gestattet tatsächlich die Produktion wäßriger Mikrobläschensuspensionen mit 10&sup9; bis 10¹&sup0; Blasen/ml (Größenverteilung überwiegend 0,5 bis 10 µm), welche ohne signifikante, beobachtbare Veränderung selbst dann stabil sind, wenn sie für lange Zeiträume gelagert werden. Dies wird durch einfaches Auflösen der unter Luft aufbewahrten, trockenen, laminarisierten Phospholipide ohne Schütteln oder heftiges Rühren erreicht. Die Gefriertrockungstechnik unter verringertem Druck ist sehr nützlich, da sie das Wiederherstellen des Drucks über den trockenen Pulvern mit jedem physiologisch verträglichen Gas gestattet, d.h. Stickstoff CO&sub2;, Argon, Methan, Freonen, SF&sub6;, CF&sub4; usw., wobei nach dem Redispergieren der unter solchen Bedingungen verarbeiteten Phospholipide Suspensionen von Mikrobläschen erhalten werden, welche die obigen Gase enthalten.
Es wurde gefunden, daß die oberflächenaktiven Stoffe, welche bei dieser Erfindung zweckmäßig sind, unter den amphiphilen Verbindungen ausgewählt werden können, die zur Bildung stabiler Filme in Anwesenheit von Wasser und Gasen fähig sind. Die bevorzugten oberflächenaktiven Stoffe umfassen Lecithine (Phosphatidylcholin) und andere Phospholipide, u.a. Phosphatitsäure (PA), Phosphatidylinositol, Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin (CL) und Sphingomyeline. Beispiele für geeignete Phospholipide sind natürliche oder synthetische Lecithine, wie Ei- oder Sojabohnen lecithin, oder gesättigte synthetische Lecithine, wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin oder Diarachidoylphosphatidylcholin, oder ungesättigte synthetische Lecithine, wie Dioleylphosphatidylcholin oder Dilinoleylphosphatidylcholin, wobei gesättigte Lecithine bevorzugt sind.
Additive, wie Cholesterin oder andere Substanzen können zu einem oder mehreren der vorangehenden Lipide in Anteilen von bis 50 Gew.-% zugesetzt werden. Solche Additive können andere nichtphospholipideoberflächenaktive Stoffe enthalten, die in Mischung mit den filmbildenden oberflächenaktiven Stoffen verwendet werden können und von denen die meisten bekannt sind, zum Beispiel Verbindungen wie Polyoxypropylenglykol und Polyoxyethylenglykol sowie verschiedene Copolymere davon, Phosphatidylglycerin, Phosphatidsäure, Dicetylphosphat, Fettsäuren, Ergosterin, Phytosterin, Sitosterin, Lanosterin, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertes Hydroxytoluol. Die Menge dieser nicht-filmbildenden oberflächenaktiven Stoffe beträgt gewöhnlich bis zu 50 Gew.-% der Gesamtmenge der oberflächenaktiven Stoffe, vorzugsweise aber zwischen 0 und 30 %. Noch einmal, das bedeutet, daß die Konzentration der verschiedenen Additive in den erfindungsgemäßen Suspensionen mit geringem Phospholipidgehalt im Bereich von 0 bis 0,05 % liegt, was mehr als 100 mal weniger als in den bisher bekannten Zusammensetzungen ist.
Es soll erwähnt werden, daß ein anderes Merkmal der Suspensionen eine relativ "hohe" Gaseinschlußkapazität der Mikrobläschen ist, d.h. ein hohes Verhältnis zwischen der Menge des oberflächenaktiven Stoffes und der Gesamtmenge des eingeschlossenen Gases. Somit wird bei Suspensionen, in welchen die Mikrobläschen Größen im Bereich von 1 bis 5 µm haben, vorläufig geschätzt, daß das Gewichtsverhältnis der an der Gasblasen/Flüssigkeitsgrenzfläche vorhandenen Phospholipide zu dem Volumen des eingeschlossenen Gases unter Standardbedingungen zwischen 0,1 mg/ml und 100 mg/ml liegt.
In der Praxis sollten alle injizierbaren Zusammensetzungen soweit wie möglich blutisotonisch sein. Somit können vor der Injektion auch kleine Mengen isotonischer Mittel zu den Suspensionen der Erfindung zugefügt werden. Die isotonischen Mittel sind physiologische Lösungen, wie sie gewöhnlich in der Medizin verwendet werden und sie umfassen wäßrige Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), 2,6 % Glycerinlösung, 5 % Dextroselösung etc..
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung stabiler Suspensionen von Mikrobläschen gemäß Anspruch 1, die als Kontrastmittel bei der Ultraschallsonographie geeignet sind. Im wesentlichen umfaßt das Verfahren die Anpassung der Konzentration der Phospholipide in der Suspension der durch die Phospholipide stabilisierten Mikrobläschen an einen ausgewählten Wert innerhalb der in den Ansprüchen angegebenen Grenzen. Gewöhnlich wird man mit einer Mikrobläschensuspension beginnen, welche mehr Phospholipide als den gewünschten Wert enthalten, und man reduziert die Menge dieser Phospholipide relativ zu dem Volumen des in die Mikrobläschen eingeschlossenen Gases oder Luft, ohne die Zahl der echoerzeugenden Bläschen wesentlich zu reduzieren. Dies kann z.B. durch Entfernen von Anteilen der Trägerflüssigkeit, die Phospholipide enthält, die nicht direkt an der Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche beteiligt sind, und Verdünnen der Suspension mit mehr frischer Trägerflüssigkeit erfolgen.
Hierzu kann man innerhalb der Suspension einen Bereich (a) schaffen, in dem sich die echoerzeugenden Blasen sammeln, und einen Bereich (b), wo diese Blasen stark verdünnt sind. Dann kann die Flüssigkeit im Bereich (b) durch Separation mit gewöhnlichen Mitteln (Dekantieren, Absaugen etc.) entfernt werden, und ein vergleichbares Volumen frischer Trägerflüssigkeit wird zur Ergänzung der Suspension zugefügt. Diese Operation kann einmal oder mehrfach wiederholt werden, wobei der Gehalt der Phospholipide, die nicht direkt an der Stabilisierung der Blasen beteiligt sind, zunehmend verringert wird.
Es ist im allgemeinen nicht erwünscht, die Phospholipidmoleküle, die nicht an der Gas/Flüssiggrenze der Blasen vorhanden sind, vollständig zu entfernen, da ein Abweichen vom Gleichgewichtswert eintreten kann, d.h., wenn die Verringerung zu weit getrieben wird, klnnen einige Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes an der Gas/Flüssiggrenze mit einer daraus folgenden Destabilisierung der Blasen freigesetzt werden. Experimente haben gezeigt, daß die Konzentration der Phospholipide in der Trägerflüssigkeit bis hinab in den Bereich der unteren Grenze, die in den Ansprüchen angegeben ist, ohne wesentliche Veränderung der Eigenschaften und nachteilige Effekte vermindert werden kann. Das bedeutet, daß die optimale Phospholipidkonzentration (innerhalb der gegebenen Grenzen) tatsächlich eher durch die Art der Anwendung vorgegeben ist, d.h., wenn relativ hohe Phospholipidkonzentrationen zulässig sind, liegt der ideale Konzentrationswert nahe der Obergrenze des Bereichs. Andererseits, wenn abhängig vom Zustand des zu untersuchenden Patienten der absolute Wert der Phospholipide weiter verringert werden muß, kann dies ohne nachteiligen Effekte bezüglich der Blasenzahl und der echographischen Effizienz erfolgen.
Eine Ausführungsform des Verfahrens umfaßt das Auswählen eines filmbildenden oberflächenaktiven Stoffes und gegebenenfalls dessen Umwandlung in lamellare Form, unter Verwendung einer der bekannten oder der oben offenbarten Verfahren. Der oberflächenaktive Stoff wird dann mit Luft oder einem anderen Gas kontaktiert und mit einem wäßrigen Träger in einem geschlossenen Behälter gemischt, wobei sich eine Suspension von Mikrobläschen bildet. Die Suspension wird für eine Weile stehengelassen, und eine gebildete Schicht gasgefüllter Mikrobläschen wird zum oberen Ende des Behälters aufsteigen gelassen. Der untere Teil der Mutterlösung wird dann entfernt und die überstehende Schicht der Mikrobläschen mit einer wäßrigen Lösung gewaschen, die mit dem zur Herstellung der Mikrobläschen verwendeten Gas gesättigt ist. Das Waschen kann mehrere Male wiederholt werden, bis im wesentlichen alle nicht verwendeten oder freien Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes entfernt sind. Nicht benutzte oder freie Moleküle bedeutet alle Moleküle des oberflächenaktiven Stoffes, die nicht an der Bildung der stabilisierenden monomolekularen Schicht um die Gasblasen herum beteiligt sind.
Neben dem Bereitstellen der Suspensionen mit niedrigem Phospholipidgehalt bietet die Waschtechnik den zusätzlichen Vorteil, daß es die weitere Aufreinigung der Suspensionen der Erfindung gestattet, d.h. durch Entfernen aller oder fast aller Mikrobläschen, deren Beitrag zu den echographischen Eigenschaften der injizierten Suspension relativ unbedeutend ist. Die Aufreinigung ergibt somit Suspensionen, die nur positiv ausgewählte Mikrobläschen enthalten, d.h., die Mikrobläschen, welche nach der Injektion gleichmäßig zu der Reflektion der echographischen Signale beitragen. Dies führt zu Suspensionen, die nicht nur eine sehr geringe Konzentration an Phospholipiden und anderen Additiven enthalten, sondern auch frei von allen Mikrobläschen ist, die nicht aktiv an dem bildgebenden Verfahren beteiligt sind.
Bei einer Varianten des Verfahrens wird der oberflächenaktive Stoff, welcher gegebenenfalls in lamellarer Form vorliegen kann, vor dem Kontaktieren mit Luft oder einem anderen Gas mit dem wäßrigen flüssigen Träger gemischt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine graphische Darstellung echographischer Signale als Funktion der Mikrobläschenkonzentration für eine frisch zubereitete Suspension gemäß der Erfindung.
Suspensionen und Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Suspensionen mit geringem Phospholipidgehalt werden durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht werden.

Beispiel 1

Durch Lösen von 240 mg Diarachidoylphosphatidycholin (DAPC, von Avanti Polar Lipids) und 10 mg Dipalmitoylphosphatitsäure (DPPA, Säureform, von Avanti Polar Lipids) in 50 ml Hexan/Ethanol (8/2, v/v) und Abdampfen der Lösungsmittel zur Trockene in einem Rundkolben unter Verwendung eines Rotationsverdampfers werden multilamellare Vesikel (MLV) hergestellt. Der zurückbleibende Lipidfilm wurde in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Nach Zusatz von Wasser (5 ml) wurde die Suspension bei 90 ºC für 30 Minuten unter Rühren inkubiert. Die resultierenden MLVS wurden bei 85 ºC durch einen 0,8 µm-Polycarbonatfilter (Nuclepore ) extrudiert. 47,4 ml einer Lösung von 167 mg/ml Dextran 10 000 MW (Fluka) in Wasser wurde mit 2,6 ml der resultierenden MLV-Zubereitung versetzt. Die resultierende Lösung wurde kräftig durchmischt, in einen 500 ml Rundkolben überführt, bei -45 ºC gefroren und bei 0,1 Torr lyophilisiert. Die vollständige Sublimation des Eises wurde über Nacht erreicht. Danach wurde der evakuierte Behälter mit Luft belüftet. Unterschiedliche Mengen des resultierenden Pulvers wurden in Glasgefäße gefüllt (siehe Tabelle) und die Gefäße mit Gummistopfen verschlossen. Mittels einer Nadel durch den Stopfen wurde Vakuum angelegt und die Luft aus den Gefäßen entfernt. Nach dem Evakuieren der Luft wurden die Pulver Schwefelhexafluoridgas SF&sub6; ausgesetzt.
Durch Injizieren von 10 ml einer 3%igen Glycerinlösung in Wasser in jedes Gefäß (durch den Stopfen), gefolgt von vorsichtigem Schütteln, wurden Blasensuspensionen erhalten. Die resultierenden Mikrobläschensuspensionen wurden unter Verwendung eines Hemacytometers ausgezählt. Die mittlere Blasengröße (im Volumen) betrug 2,2 µm.
Die Zubereitungen wurden sowohl Kaninchen (durch die Jugularvene) als auch Minischweinen (durch die Ohrvene) in einer Dosis von 1 ml/5 kg injiziert. In vivo sonographische Messungen wurden unter Verwendung eines Acuson XP128-Ultraschallsystems (Acuson Corp. USA) und eines 7 MHz-Sectortransducers durchgeführt. Die Tiere wurden anästhetisiert und der Transducer auf der linken Brustseite positioniert und dann fixiert, so daß er eine Ansicht der rechten und linken Herzkammern des Herzens im Fall der Kaninchen und eine longitudinale 4-Kammersicht im Fall der Minischweine lieferte. Die 0,5 mg/ml Trockengewicht enthaltende Zubereitung ergab eine leichte Opazifizierung sowohl der rechten als auch der linken Kammer bei den Kaninchen und Minischweinen. Die Opazifizierung war jedoch mit den 1, 5 und 10 mg/ml Zubereitungen besser.

Beispiel 2

Gemäß Beispiel 1 wurden Lyophilisate mit Luft (anstelle von SF&sub6;) als Gasphase hergestellt. Die Lyophilisate wurden dann in 0,9 % Kochsalzlösung (anstelle einer 3%igen Glycerinlösung) suspendiert. Ähnliche Blasenkonzentrationen wurden erhalten. Nach Injektion in Kaninchen oder Minischweine war die Dauer des Effekts jedoch kürzer, z.B. 10 bis 20 Sekunden anstelle von 120 Sekunden. Darüber hinaus war beim Minischwein die Opazifizierung der linken Kammer selbst mit der 10 mg/ml-Zubereitung schlecht.

Beispiel 3

MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung von 240 mg DAPC und 10 mg DPPA (molares Verhältnis 95:5) hergestellt. 20 ml Polyethylenglykol (PEG 2000)-Lösung wurden mit 2 ml dieser Zubereitung versetzt (82,5 mg/ml). Nach 10- minütigem Mischen bei Raumtemperatur wurde die resultierende Lösung innerhalb von 5 Minuten bei -45 ºC gefroren und innerhalb von 5 Stunden bei 0,2 mbar lyophilisiert. Das erhaltene Pulver (1,6 g) wurde in ein Glasgefäß mit einem Gummistopfen überführt. Das Pulver wurde mit SF&sub6; kontaktiert (wie in Beispiel 1 beschrieben) und dann in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Suspension hatte eine Blasenkonzentration von 5 x 10&sup9;-Blasen/ml mit einem mittleren Durchmesser im Volumen von 5,5 µm. Die Suspension wurde in eine 20 ml-Spritze aufgezogen, die Spritze verschlossen, in horizontaler Position für 24 Stunden aufbewahrt. Eine weiße Blasenschicht konnte auf der Lösung in der Spritze beobachtet werden. Der größte Teil der Flüssigphase (~16-18 ml) wurde abgepumpt, während die Spritze in horizontaler Position gehalten wurde, und ein äquivalentes Volumen frischen, SF&sub6;-gesättigten Wassers wurde eingebracht. Die Spritze wurde dann für eine Weile geschüttelt, um die Blasen in der wäßrigen Phase zu homogenisieren. Eine weitere Dekantation wurde unter denselben Bedingungen nach 8 Stunden durchgeführt, gefolgt von drei weiteren Dekantationen, die in 4 Stunden-Intervallen durchgeführt wurden. Die letzte Blasenphase (batch P145) wurde in 3 ml destilliertem Wassers suspendiert. Sie enthielt 1,8 x 10&sup9; Blasen pro Milliliter mit einem mittleren Durchmesser im Volumen von 6,2 µm. Ein Teil dieser Suspension (2 ml) wurde innerhalb von 6 Stunden bei 0,2 mbar lyophilisiert. Das resultierende Pulver wurde in 0,2 ml Tetrahydrofuran/Wasser (9/1, v/v) gelöst, und die in dieser Lösung vorhandenen Phospholipide mittels HPLC unter Verwendung eines Lichtstreuungsdetektors analysiert. Diese Lösung enthielt 0,7 mg DAPC/ml, was 3,9 µg Phospholipide pro 10&sup8; Blasen entspricht. Eine Analyse der aktuellen Blasengrößenverteilung in der Zubereitung P145 mit einem Coulter-Zähler ergab eine Gesamtoberfläche von 4,6 x 10&sup7; µm² pro 10&sup8; Blasen. Unter der Annahme, daß ein Molekül DAPC eine Fläche von 50 Å² belegt, kann man berechnen, daß 1,3 µg DAPC pro 10&sup8; Blasen erforderlich sind, um eine Monoschicht der Phospholipide um jede Blase zu bilden. Die Suspension P145 wurde dann bei 4 ºC aufbewahrt und die Konzentration der Gasblasen in regelmäßigen Abständen gemessen. Nach 10 Tagen sah das Produkt genauso gut wie nach seiner Herstellung aus und enthielt immer noch 1-1,2 x 10&sup9; Blasen pro Milliliter. Die außerordentliche Stabilität war in Anbetracht der extrem geringen Menge an Phospholipiden in der Suspension sehr überraschend.
Das oben beschriebene Experiment wurde mit einer zweiten Mikroblasenzubereitung unter Verwendung kürzerer Dekantationszeiten wiederholt, um vorzugsweise größere Blasen zu sammeln (Zubereitung P132). Der erhaltene Durchmesser im Volumen betrug 8,8 µm, und die mit dem Counter-Zähler bestimmte Gesamtoberfläche betrug 22 x 10&sup8; µm pro 10 Blasen. Die Berechnung zeigte, daß 6 µg DAPC pro 10&sup8; Blasen erforderlich sind, um diese Blasenpopulation mit einer Monoschicht DAPC zu bedecken. Die tatsächlich durch HPLC bestimmte Menge DAPC betrug 20 µg pro 10&sup8; Blasen. Unter Berücksichtigung der Schwierigkeiten bei der genauen Abschätzung der Gesamtoberfläche der Blasenpopulation, scheinen die erhaltenen Ergebnisse, innerhalb des experimentellen Fehlers, mit einer Bedeckung der Mikroblasen mit einer Phospholipidschicht übereinzustimmen.
Die mit verschiedenen gewaschenen Blasenzubereitungen durchgeführten echographischen Messungen zeigten, daß nach der Separation die untere Phase ein sehr viel schwächeres echographisches Signal als die obere Phase oder eine frisch zubereitete Probe ergab. Auf den ersten Blick scheint dies normal zu sein, da die weiße Schicht im oberen Teil der Spritze ohnehin die Hauptmenge der Gasmikroblasen enthielt. Wie jedoch in Figur 1 gezeigt ist, zeigte die Blasenzahl auch in der unteren Schicht eine überraschend hohe Mikrobläschenpopulation. Nach einer Coulter-Messung wurden offenbar, daß die Mikrobläschen eine Größe unter 0,5 µm hatten, was zeigt, daß mit kleinen Blasen selbst in hoher Konzentration keine ausreichende Reflektion des Ultraschallsignals erzielt werden kann.
Eine vierfache Verdünnung der Zubereitung P132 in 3%iger Glycerinlösung wurde in ein Minischwein injiziert (0,2 ml/kg). Die Zubereitung gewaschener Blasen enthaltend 2,5 x 10&sup7; Blasen pro Milliliter und 5 µg Phospholipide pro Milliliter ergab eine ausgezeichnete Opazifikation der linken und rechten Kammer mit hervorragender Darstellung der endokardialen Grenzen. Eine gute Opazifizierung wurde auch durch Injektion eines Minischweins mit einem Teil der Zubereitung P145 (verdünnt in 3 % Glycerin) erreicht, was 0,2 µg Phospholipiden pro kg entspricht. Ein Kontrast in der linken Kammer war selbst nach Injektion von 0,02 µg/kg nachweisbar. Darüber hinaus konnte in der renalen Arterie das Vorhandensein eines Kontrasteffekts durch eine gepulste Doppieruntersuchung bei Phospholipiddosen von 0,005 µg/kg nachgewiesen werden.
Daraus folgt, daß solange die laminarisierten Phospholipide als einzelne Monoschicht um die Gasmikrobläschen herum angeordnet sind, die hergestellten Suspensionen eine ausreichende Stabilität haben. Damit wird eine Erklärung für die vorliegende unerwartete Beobachtung gegeben und gezeigt, daß die Menge der Phospholipide nicht größer als die zu sein braucht, die zur Bildung einer Monoschicht um die in der Suspension vorhandenen Mikrobläschen herum erforderlich ist.

Beispiel 4

Eine Lösung enthaltend 48 mg DAPC und 2 mg DPPA in Hexan/ Ethanol 8/2 (v/v) wurde hergestellt und das Lösungsmittel zur Trockene eingedampft (wie in Beispiel 1 beschrieben). 5 mg des resultierenden Pulvers und 375 mg Polyethylenglykol wurden bei 60 ºC in 5 g tert.-Butanol gelöst. Die klare Lösung wurde dann schnell auf -45 ºC abgekühlt und lyophilisiert. 80 mg des Lyophilisates wurden in ein Glasgefäß eingebracht und das Pulver mit SF&sub6; kontaktiert (siehe Beispiel 1). Dann wurde eine 3%ige Glycerinlösung (10 ml) in das Gefäß eingebracht und das Lyophilisat durch sanftes Schwenken gelöst. Die resultierende Suspension enthielt 1,5 x 10&sup8; Blasen pro ml, mit einem mittleren Durchmesser (im Volumen) von 9,5 µm. Diese Lösung wurde Kaninchen injiziert, wobei hervorragende Ansichten der rechten und linken Kammer erhalten wurden. Selbst eine 10-fache Verdünnung dieser Suspension ergab eine starke Kontrastverstärkung.

Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 4 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die anfängliche Verdünnung der Phospholipide in Hexan/Ethanol-Lösung ausgelassen wurde. Mit anderen Worten wurden rohe Phospholipide zusammen mit Polyethylenglykol in tert.- Butanol gelöst und die Lösung gefriergetrocknet. Danach wurde der Rückstand in Wasser suspendiert. In diesen Experimenten wurden verschiedene Phospholipide und Kombinationen von Phospholipiden mit anderen Lipiden untersucht. Bei den in der folgenden Tabelle gezeigten Ergebnissen wurden die Phospholipide in einer tert.-Butanollösung gelöst, die 100 mg/ml PEG 2000 enthielt. Die nach Gefriertrocknung erhaltenen Rückstände wurden mit SF&sub6; (siehe Beispiel 1) gesättigt und dann in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 100 mg Trockengewicht pro Milliliter gelöst.
Legende
DAPC = Diarachidoylphosphatidylchloin
DSPC = Distearoylphosphatidylcholin
DPPG = Dipalmitoylphosphatidylglycerin (Säureform)
DPPA = Dipalmitoylphosphatidsäure
Chol = Cholesterin
Palm.ac. = Palmitinsäure
Plur F68 = Pluronic F-68
* In diesem Experiment wurde CF&sub4; anstelle von SF&sub6; als Gas verwendet.
In allen Fällen zeigten die erhaltenen Suspensionen hohe Mikrobläschenkonzentrationen, was zeigt, daß die anfängliche Umwandlung der Phospholipide in Liposomen nicht erforderlich war. Diese Suspensionen wurden mit 0,15 M NaCl verdünnt und Minischweinen, wie in Beispiel 3 beschrieben, injiziert. In allen Fällen wurde eine hervorragende Opazifizierung der rechten und linken Kammern sowie eine gute Darstellung der endokardialen Grenzen bei Dosen von 10 bis 50 µg Lipiden pro Kilogramm Körper gewicht oder weniger erzielt.

Beispiel 6

PEG-2000 (2 g), DAPC (9,6 mg) und DPPA (0,4 mg) wurden in 20 ml tert.-Butanol gelöst und die Lösung über Nacht bei 0,2 mbar gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde mit SF&sub6; kontaktiert und dann in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Suspension enthielt 1,4 x 10&sup9; Blasen pro Milliliter (bestimmt durch Hemacytometrie) und wurde in eine 20 ml Spritze eingebracht, welche verschlossen und in horizontaler Position für 16 Stunden aufbewahrt wurde. Eine weiße Blasenschicht konnte auf der Lösung beobachtet werden. Die untere Phase (16 bis 18 ml) wurde verworfen, während die Spritze horizontal gehalten wurde. Ein äquivalentes Volumen frischen, SF&sub6;-gesättigten, destillierten Wassers wurde in die Spritze aufgesaugt, und die Blasen wurden durch Bewegen in der wäßrigen Phase homogenisiert. Zwei verschiedene Populationen an Mikrobläschen, d.h. eine Population mit großen Blasen und eine mit mittleren Blasen, wurden durch wiederholtes Dekantieren über kurze Zeitperioden erhalten, wobei die großen Blasen nur 10 bis 15 Minuten nach dem Dekantieren und die mittleren Blasen nach 30 bis 45 Minuten gesammelt wurden. Diese Dekantationen wurden 10 mal wiederholt, um eine enge Verteilung der Blasengröße für die zwei Arten an Populationen zu erhalten und um alle Phospholipide zu eliminieren, welche nicht mit den Mikrobläschen assoziiert waren. Alle große Blasen enthaltenden Phasen wurden vereint ("große Blasen"). Auf ähnliche Weise wurden die mittlere Blasen enthaltenden Fraktionen vereinigt ("mittlere Blasen"). Anteile der zwei Blasenpopulationen wurden lyophilisiert und dann durch HPLC analysiert, um die in jeder Fraktion vorhandene Menge an Phospholipiden zu bestimmen. Die Fraktion der großen Blasen enthielt 2,5 x 10&sup7; Blasen pro Milliliter, mit einem mittleren Zahlendurchmesser von 11,3 µm und 13,7 µg Phospholipiden pro 10&sup7; Bläschen. Dieses Ergebnis stimmt ausgezeichnet mit der theoretischen Menge von 11,5 µg pro 10&sup7; Blasen überein, die unter Annahme einer Monoschicht von Phospholipiden um jede Blase herum und einer Fläche von 50 Å² pro Phospholipidmolekül errechnet wurde. Die Fraktion der mittleren Blasen enthielt 8,8 x 10&sup8; Blasen pro Milliliter, mit einem mittleren Zahlendurchmesser von 3,1 µm und 1,6 µg Phospholipiden pro Blasen. Der letztgenannte Wert stimmt wieder hervorragend mit der theoretischen Menge von 1,35 µg pro 10&sup7; Blasen überein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Stabilität der hier offenbarten Mikrobläschensuspensionen mit größter Wahrscheinlichkeit auf die Bildung von Phospholipidmonoschichten um die Mikrobläschen herum zurückzuführen ist.

Claims

1. Injizierbare Suspension von gasgefüllten Mikrobläschen in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit, geeignet als Kontrastmittel bei der Ultraschallsonographie, enthaltend mindestens 10&sup7; Mikrobläschen pro ml und amphiphile Verbindungen, von denen mindestens eine ein Phospholipidstabilisator der Mikrobläschen gegen Kollabieren ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Phospholipide in der Trägerflüssigkeit unter 0,01 Gew.-% liegt während sie gleich oder größer als diejenige ist, bei der die Phospholipidmoleküle ausschließlich an der Gas/Flüssiggrenze der Mikrobläschen vorhanden sind.

2. Injizierbare Suspension gemäß Anspruch 1, in welcher die Konzentration der Mikrobläschen pro ml zwischen 10&sup8; und 10¹&sup0; liegt.

3. Injizierbare Suspension gemäß Anspruch 1, in welcher die Konzentration des Phospholipids oberhalb von 0,00013 Gew.-% liegt.

4. Injizierbare Suspension gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in welcher der flüssige Träger zusätzlich wasserlösliche Poly- und Oligosaccharide, Zucker und hydrophile Polymere wie Polyethylenglykole als Stabilisatoren enthält.

5. Injizierbare Suspension gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in welcher die Phospholipide zumindest teilweise in lamellarer oder laminarer Form vorliegen und aus Lecithinen wie Phosphatidsäure, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinositol, Cardiolipin und Sphingomyelin ausgewählt sind.

6. Injizierbare Suspension gemäß Anspruch 4 oder 5, zusätzlich enthaltend Substanzen, welche die Eigenschaften der Phospholipide beeinflussen, die aus Phosphatitylglycerin, Phosphatidsäure, Dicetylphosphat, Cholesterin, Ergosterin, Phytosterin, Sitosterin, Lanosterin, Tocopherol, Propylgallat, Ascorbylpalmitat und butyliertem Hydroxytoluol ausgewählt sind.

7. Injizierbare Suspension gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, in der die Phospholipide in Form von durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung erhaltenen Pulvern vorliegen.

8. Injizierbare Suspension gemäß Anspruch 1, enthaltend etwa 10&sup8; bis 10&sup9; Mikrobläschen pro ml mit einer Mikroblischengröße zwischen 0,5 bis 10 µm, die bei Lagerung nur eine geringe oder keine Veränderung zeigt.

9. Injizierbare Suspension gemgß Anspruch 1, in welcher der flüssige Träger zusätzlich bis zu 50 Gew.-% nicht-laminare oberflächenaktive Stoffe enthält, die aus Fettsäuren, Estern und Ethern von Fettsäuren und Alkoholen mit Polyolen wie Polyalkylenglykolen, polyalkenylierten Zuckern und anderen Kohlenhydraten und polyalkenyliertem Glycerin ausgewählt sind.

10. Injizierbare Suspension gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in welcher die Mikrobläschen mit SF&sub6;, CF&sub4;, Freonen oder Luft gefüllt sind.

11. Verfahren zur Herstellung von Suspensionen von luft- oder gasgefüllten Mikrobläschen umfassend das Auswählen mindestens eines filmbildenden oberflächenaktiven Stoffes, Überführen des oberflächenaktiven Stoffes in ein Pulver, Kontaktieren des Pulvers mit Luft oder einem anderen Gas und Mischen des pulverförmigen oberflächenaktiven Stoffs mit einem wäßrigen flüssigen Träger, um die Suspension zu bilden, dadurch gekennzeichnet daß man die Suspension in einen Behälter einbringt, eine Schicht der gasgefüllten Mikrobläschen im oberen Teil des Behälters bildet, die Schicht der gebildeten Mikrobläschen abtrennt und die Mikrobläschen mit einer wäßrigen Lösung wäscht, die mit dem Mikrobläschen-Gas gesättigt ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, bei welchem man den filmbildenden oberflächenaktiven Stoff vor dem Überführen in ein Pulver zumindest teilweise lamellarisiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei welchem man den teilweise lamellarisierten oberflächenaktiven Stoff vor dem Kontaktieren mit Luft oder einem anderen Gas mit dem wäßrigen flüssigen Träger mischt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, bei welchem der flüssige Träger zusätzlich Stabilisatorverbindungen enthält, die aus wasserlöslichen Proteinen, Polypeptiden, Zuckern, Polyund Oligosacchariden und hydrophilen Polymeren ausgewählt sind.

15. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem man das Überführen bewirkt, indem man Partikel aus löslichen oder unlöslichen Materialien mit dem oberflächenaktiven Stoff beschichtet, die beschichteten Partikel für eine Weile unter Luft oder einem Gas beläßt und die beschichteten Partikel mit einem wäßrigen flüssigen Träger mischt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei dem man das Überführen bewirkt, indem man eine wäßrige Lösung aus filmbildenden Lipiden unter hohem Druck beschallt oder homogenisiert, wobei diese Operation zumindest teilweise zur Bildung von Liposomen führt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem man die liposomenhaltige Lösung vor dem Kontaktieren des zumindest teilweise lamellarisierten oberflächenaktiven Stoffes mit Luft oder einem anderen Gas gefriertrocknet.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, bei dem die wäßrige Lösung der filmbildenden Lipide auch Viskositätsverstärker oder Stabilisatoren, die aus hydrophilen Polymeren und Kohlenhydraten ausgewählt sind, in einem Gewichtsverhältnis relativ zu den Lipiden zwischen 10 : 1 und 1000 : 1 enthält.

19. Verfahren zur Herstellung einer Suspension von luft- oder gasgefüllten Mikrobläschen enthaltend einen filmbildenden oberflächenaktiven Stoff, einen hydrophilen Stabilisator und einen wäßrigen flüssigen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man den filmbildenden oberflächenaktiven Stoff und den hydrophilen Stabilisator in einem organischen Lösungsmittel löst, die Lösung gefriertrocknet, um ein trockenes Pulver zu bilden, das Pulver mit Luft oder einem anderen Gas kontaktiert und das Pulver mit dem wäßrigen Träger mischt.

20. Verfahren gemß Anspruch 19, bei dem der hydrophile Stabilisator Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Glykolsäure, Äpfelsäure oder Maltol ist.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, bei dem das organische Lösungsmittel tert-Butanol, 2-Methyl-2-butanol oder C&sub2;Cl&sub4;F&sub2; ist.

22. Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren Suspension von gasgefüllten Mikrobläschen gemäß Anspruch 11 bei dem man laminarisierte Phospholipide und gegebenenfalls andere Additive in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit supendiert, wobei die Phospholipide vor oder nach dem Suspendieren in Kontakt mit dem Gas gewesen sind, unter solchen Bedingungen, daß in der Suspension eine solche Konzentration der Mikrobläschen erzeugt wird, die ausreichend ist, um eine echographische Antwort zu erzeugen, man einen Teil der Phospholipide eine Stabilisierungsschicht um die Bläschen herum bilden läßt und danach die Trägerflüssigkeit des Überschusses an Phospholipiden verringert, die nicht an der Stabilisierung der Mikrobläschen beteiligt sind.