HU227043B1

HU227043B1 - Stabile microbubble suspension as enhancement agents for ultrasound echography

Info

Publication number: HU227043B1
Application number: HU9401409A
Authority: HU
Inventors: Michel Schneider; Jean Brochot; Jerome Puginier; Feng Yang
Original assignee: Bracco Int Bv
Priority date: 1992-11-02
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 2010-05-28
Also published as: FI943167A0; LU90837I2; AU704954B2; AU3431795A; AU681812B2; IS1625B; GR3022826T3; CN1069838C; US5908610A; US5686060A; KR100216138B1; DE69307124D1; AU666238B2; NO942476D0; IS4089A; HUT74561A; ZA938117B; NZ257115A; DK0619743T3; CA2125027C

Description

A találmány az olyan vizes alapú, gázzal töltött mikrobuborékokat tartalmazó, injektálható szuszpenziókra vonatkozik, amelyek olyan ampfipatikus vegyületeket tartalmaznak, melyek közül legalább egy a mikrobuborékok idő- és nyomás-nyomásállóságának növelésére alkalmas foszfolipid stabilizátor, ami a szuszpenzió össztömegére számítva 0,01 tömeg%-nál kisebb mennyiségben van jelen. A foszfolipid stabilizátort lamelláris vagy lamináris alakban alkalmazzuk.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti szuszpenziók előállítási eljárása is.

A folyékony hordozóban gázmikrobuborékokat tartalmazó szuszpenziók ultrahangvizsgálatokhoz hatásosan alkalmazható, jól ismert kontrasztszerek.

A mikrobuborék szuszpenziók akusztikus készítményként, azaz az ultrahangos képmegjelenítés kontrasztszerként való kifejlesztése azon a korábbi megfigyelésen alapul, hogy a gyors intravénás injekciók hatására az oldott gázok buborékfejlődés közben kiszabadulnak az oldatból. Ezek az intravaszkuláris gázbuborékok a vérhez viszonyított akusztikus impedanciájuk különbözősége miatt kiváló ultrahangos kontrasztszerek.

Ha élő szervezetek véráramába ilyen folyékony hordozós gázmikrobuborék szuszpenziót injektálunk, az ultrahangos vizsgálatoknál alkalmazott akusztikus képmegjelenítés jelentős mértékben felerősödik, és ezáltal a belső szervek vizuális megfigyelhetősége nagymértékben javul.

A belső szervek és a mélyen fekvő szövetek képmegjelenítése az orvosi diagnózis döntő eszköze lehet, ezért számos olyan kutatást végeznek, amely nagyon koncentrált stabil és ugyanakkor könnyen előállítható, minimális inaktív komponenst tartalmazó, hosszú ideig tárolható, és egyszerűen szétosztható gázmikrobuborék-szuszpenziók előállítására irányul.

Az ilyen oldatok előállítására irányuló számos erőfeszítés ellenére azonban eddig még nem sikerült teljesen kielégítő eredményeket elérni.

Az EP-A-0 077 752 számú európai közrebocsátási iratban (Schering) olyan eljárást ismertetnek, amelyben a gázmikrobuborék-szuszpenziókat egy felületaktív anyag vizes oldatának és egy stabilizálószerként alkalmazott viszkozitásjavító szer oldatának összekeverésével állítanak elő.

A gázbuborékokat úgy vezetik be az elegybe, hogy a reagenselegyet egy kis résen levegővel együtt átkényszerítik. Szén-dioxid-mikrobuborékszuszpenziót úgy állítanak elő, hogy egy felületaktív anyagot, nátrium-hidrogén-karbonátot és egy viszkozitásjavító szert tartalmazó oldathoz savat adnak. A komponensek összekeverését azonban közvetlenül az alkalmazás előtt kell végezni, és az oldatot az elkészítés után azonnal el kell fogyasztani vagy be kell injektálni. Az ismertetett felületaktív anyagok (tenzidek) lecitineket, észtereket és zsírsavak és zsíralkoholok poli(oxi-etilén)-nel és poli(oxi-etilén)-ezett poliolokkal, például szorbitollal, glikolokkal és glicerinnel, koleszterollal alkotott észtereit; és poli(oxi-etilén)-poli(oxi-propilén) polimereket tartalmaznak. A szuszpenziók tenzidkoncentrációja 0,01-10 tömeg%, előnyösen 0,5-5 tömeg%. A viszkozitásjavító és stabilizálóvegyületek közé tartoznak például a mono- és poliszacharidok (glukóz, laktóz, szukróz, dextrán és szorbitol); poliolok, például glicerin, poliglikolok, vagy polipeptidek, például a proteinek, zselatin, oxi-polizselatin és plazma-protein. A viszkozitásjavító szerek összes mennyisége 0,5-50%-ban korlátozott. A poli(oxi-propilén)—poli(oxi-etilén) polimerek (például Pluronic F—68) viszkozitásjavító szerként való alkalmazását is ismertetik.

Az egyik előnyös változatban úgy állítanak elő mikrobuborékszuszpenziót, hogy ekvivalens mennyiségű tenzidet [0,5 tömeg% Pluronic F-68 kereskedelmi nevű poli(oxi-propilén)—poli(oxi-etilén) kopolimer vizes oldatot] és viszkozitásjavító szert (10%-os laktózoldat) steril körülmények között alaposan összeráznak. így 2 perc elteltével olyan szuszpenziót kapnak, amely közel 50%, 50 pm alatti méretű buborékot tartalmaz. A leírás szerint a felületaktív anyag és/vagy viszkozitásjavító szer mennyisége 50%-ig is felmehet, a specifikus példákban azonban 1-4% Pluronic F-68 termék alkalmazását ismertetik.

Ultrahang akusztikus képmegjelenítő szerként alkalmazható, könnyen előállítható vizes szuszpenziót ismertetnek a WO-91/15 244 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírásban. Ezek a szuszpenziók lamináris és/vagy lamelláris filmképző felületaktív anyagot és adott esetben hidrofil stabilizátort tartalmaznak. A lamináris felületaktív anyagok lehetnek liposzómák formájában, azaz mikroszkópikus hólyagocskák, általában gömb alakú hólyagocskák lehetnek. Ezeket a hólyagocskákat általában egy vagy több koncentrikusan elrendezett, az amfipatikus vegyületekéből (hidrofil és hidrofób csoportokat egyaránt tartalmazó vegyületek) kialakult bimolekuláris réteg alkotja. A kettős rétegben a molekulák úgy helyezkednek el, hogy a hidrofób csoportok egymással szembenéznek, a hidrofil csoportok pedig a vizes fázis irányába mutatnak. A szuszpenziót úgy kapják, hogy a laminarizált felületaktív anyagot a vizes fázissal való összekeverés előtt vagy után levegővel érintkeztetik. A filmképző felületaktív anyagok lamellárissá való átalakulását különböző liposzómaképző eljárással, ezen belül nagynyomású homogenizálással vagy akusztikus vagy ultrahang-frekvenciás szonikálással végzik. Az ismertetett foszfolipidek koncentrációja 0,01-20%, és a mikrobuborékok koncentrációja 10⁸—10⁹ buborék/ml. A mikrobuborékszuszpenziók hónapokig stabilan eltarthatok. Az 1. példában a foszfolipidek koncentrációja 0,5%.

Stabil akusztikus vizsgálatokhoz alkalmas szuszpenzió-előállítási kísérletet ismertetnek a WO-92/11873 számon közzétett nemzetközi leírásban is. Az akusztikus vizsgálatokban kontrasztszerként alkalmazható, mikrobuborékok abszorbeálására és stabilizálására szánt vizes készítményeket poli(oxi-etilén)/poli(oxi-propilén) polimerek és negatívan töltött foszfolipidek, mint például foszfatidil-glicerin, foszfatidil-linozitol, foszfatidiletanol-amin, foszfatidil-szerin, valamint lizoformjaik alkalmazásával állítják elő. A készítmények foszfolipidkoncentrációja 0,01-5 térfogat vagy tömeg% lehet,

HU 227 043 Β1 azonban a leírásban és az igénypontokban ismertetett dipalmitoil-foszfatidil-glicerin (DPPG) koncentrációja 1%. A készítményeknek a negatívan töltött foszfolipidek mellett 0,1-10% polimert (Pluronic F-68) is kell tartalmazniuk. A készítmények összes oldottanyag-koncentrációja 5,1-10,4%. A mikrobuborékkoncentrációt nem ismertetik, de az eredményekből körülbelül 10⁷ buborék/ml koncentráció becsülhető. A szuszpenziók ismertetett stabilitása jobb, mint az EP-A-0077752 számú európai közrebocsátási iratban közölt eredmények.

Az eddig ismert készítmények másik hátránya, hogy nagy mennyiségű különböző oldott anyagokat, mint például polimert, foszfolipidet, elektrolitot és egyéb olyan oldott anyagot tartalmaz, amelyek miatt gyakorlati alkalmazásuk egyre bonyolultabbá válik. így például ismeretes, hogy bizonyos betegeknél a nagyobb koncentrációban alkalmazott poli(oxi-etilén)/poli(oxi-propilén)=Pluronic kereskedelmi nevű termék) kellemetlen mellékhatásokat idéznek elő [lásd például G. M. Vercelotti és munkatársai Blood (1982) 59, 1299. kiadvány]. Bizonyos esetekben a nagy foszfolipidtartalom sem kívánatos.

A nagyon sok különböző féle oldott anyagot tartalmazó készítményeket nem szívesen alkalmazzák, és széles körű elterjedésük sem kívánatos. A gyógyszeripar manapság gyakorlatilag azt tűzte ki célul, hogy a különböző gyógyászati és gyógyszer készítmények aktív és inaktív összetevőinek koncentrációját a lehető legkisebbre csökkentse, és minden olyan összetevőt elhagyjon, ami nem szükséges. A hatásosabb készítmények előállítására és formázására irányuló törekvések ma folyamatosan nagy fontossággal bírnak. Különösen így van ez az akusztikus vizsgálatokban alkalmazásra kerülő mikrobuborékos szuszpenzióknál, amelyek összetevői nem gyógyhatásúak.

Azonban amint azt a fentiekben ismertettük, a jelenleg alkalmazott ilyen készítmények tipikus koncentrációja 1-4 tömeg%, és a szakterületen nem javasolják a foszfolipidek és a foszfolipidtől eltérő adalék anyagok csökkentett mennyiségű alkalmazását. Ennek valószínűleg az az oka, hogy a szokásos rutinkísérletekben az adalék anyagok további koncentrációcsökkentése nem eredményezett a gyakorlati alkalmazáshoz megfelelő stabilitású szuszpenziókat, és nem mutatta a koncentrációhatár alsó értékének csökkentési lehetőségét sem.

Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy ha stabilizátorként foszfolipideket alkalmazunk, ezekkel legalább 10⁷ mikrobuborék/ml buborékszámú, gázzal töltött mikrobuborékszuszpenzió állítható elő. Az ultrahangos akusztikus vizsgálatokban kontrasztszerként alkalmazható szuszpenziókat úgy állíthatjuk elő, hogy egy vizes hordozóban a mikrobuborékok idő- és nyomásállóságának növelésére legalább egy foszfolipidet szuszpendálunk. A foszfolipid koncentrációja 0,01 tömeg% alatt van, azonban legalább olyan nagy vagy annál nagyobb koncentrációban van jelen a foszfolipid, amelynél a foszfolipidmolekulák a gázmikrobuborék-folyadék határfelületet önmagukban alkothatnák. Az alkalmazott foszfolipid felületaktív anyag már elhanyagolhatóan kis mennyiségben (akár önmagában, akár viszonylag kis mennyiségű egyéb amfifilekkel alkalmazva) is hatásosan alkalmazható a mikrobuborékok stabilizálására. Az egyéb amfipatikus vegyületek (például nagyobb mennyiségű (Pluronic®) alkalmazása esetén fennáll az a lehetőség, hogy a stabilizátormolekulák kölcsönös kohéziója csökken, és monomolekuláris foszfolipidfilmképződés nem jön létre. Azonban, ha a készítmény nem tartalmaz egyéb nagy mennyiségű amfifil anyagot, a foszfolipidmolekulák közötti intermolekuláris kötőerők (elektrosztatikus kölcsönhatás vagy hidrogénkötés) szabadon érvényesülnek, és elegendő mértékűek a buborékok összeomlás vagy egyesülés elleni stabilizálására alkalmas stabil filmszerű szerkezetek létrehozására.

A találmány tárgyát az olyan nagy mikrobuborékkoncentrációjú nagyon stabil, hosszú ideig tárolható és könnyen előállítható szuszpenziók képezik, amelyek jellemző tulajdonságaikat még akkor is megtartják, ha a szuszpenzióban alkalmazott felületaktív anyagok és egyéb adalék anyagok koncentrációja az eddig ismert ilyen készítményekéhez képest sokkal alacsonyabb. A találmány szerinti készítmények foszfolipidkoncentrációja akár olyan alacsony is lehet, hogy a gázmikrobuborékok körül lévő felületaktív anyag csak egyetlen réteget alkot, miközben az ilyen szuszpenziós készítmények buborékkoncentrációja 10⁷ mikrobuborék/ml marad. A találmány szerinti készítményekben nem találhatóak és nem is valószínű, hogy előfordulnak olyan mikrobuborékok, amelyek liposzómaszerű kettős réteget alkotó felületaktív anyagból (gázzal töltött liposzóma) épülnének fel.

Ezzel az eljárással nagy, például 10⁹-10¹° buborék/ml koncentrációjú, viszonylag nagy stabilitású és hosszú időn át tárolható szuszpenziók állíthatók elő még akkor is, ha a foszfolipid felületaktív anyag koncentrációja jóval az ismert készítményeké alatt van. A találmány szerinti eljárással előállított készítmények koncentrációja akár 1 pg foszfolipid/ml is lehet, biztosítva, hogy az alkalmazott felületaktív anyag mennyisége elegendő legyen a gázmikrobuborékok körül kialakuló egyrétegű lipidképződéshez.

A számításaink azt mutatják, hogy ez a foszfolipidkoncentráció 10® buborék/ml buborékkoncentráció esetén akár 1 pg/ml vagy 0,0001% is lehet, azonban előnyösebb a 0,0002%-tól 0,01 %-ig terjedő érték. A találmányszerinti stabil mikrobuborékszuszpenziókfoszfolipidkoncentrációja még előnyösebben 0,001-0,009%. A foszfolipidkoncentráció tovább is csökkenthető, azonban a 0,0001% alatti foszfolipidkoncentrációjú szuszpenziók nem stabilak, összes buborékkoncentrációjuk is alacsony, és az injektálás utáni akusztikus válaszuk sem kielégítő. Ha pedig a foszfolipidkoncentrációt 0,01% felé növeljük, a koncentráció növelésével az injektálás utáni jellemzőik, azaz stabilitásuk és akusztikus válaszuk nem javulnak tovább. A koncentráció növelése a korábbi készítményeknél ismert, nem kívánt mellékhatások előfordulásának valószínűségét növeli. Feltételezhetően csak a felületaktív anyagok lamelláris vagy lamináris alakú szegmensei képesek olyan mole3

HU 227 043 Β1 kularendezettség kialakítására, amely a buborékokat megfelelően stabilizálja. Ez azt is megmagyarázza, hogy a felületaktív anyagok koncentrációja az ismertetett alacsony érték mellett sem befolyásolja hátrányosan a gázbuborékok stabilitását.

A találmány szerinti készítmények előnyös tulajdonságai nemcsak az ismert készítményekhez viszonyított alacsony foszfolipidtartalomban mutatkozik, hanem abban is, hogy az injektált oldott anyagok, azaz lipidek és/vagy szintetikus polimerek és egyéb adalékok koncentrációja is 1000-50 000-szer kisebb. Ezt az eredményt a mikrobuborékkoncentráció csökkenés, azaz a termék akusztikus jellemzőinek vagy stabilitásának csökkenése nélkül érhetjük el.

A találmány szerinti készítmények további jellemzője, hogy a nagyon alacsony oldottanyag-koncentráció mellett csak az akusztikus jel előállításához szükséges mikrobuborékokat tartalmazza, azaz nem tartalmaz olyan mikrobuborékokat, amelyek a képmegjelenítésben nem vesznek részt.

Ezen túlmenően a találmány szerinti injektálható készítmények nagyon alacsony oldottanyag-koncentrációja nagymértékben csökkenti a nem kívánt mellékhatásokat is, és az injektált szer eltávozását is jelentősen növeli.

A találmány szerinti alacsony foszfolipidkoncentrációjú mikrobuborékszuszpenziók olyan filmképző foszfolipidekből állíthatók elő, amelyek szerkezetét valamilyen kényelmes eljárással, például a nyers foszfolipid megfelelő oldószeres oldataiból való fagyasztva szárítással vagy szórva szárítással módosítjuk. A fagyasztva vagy szórva szárított foszfolipidport a vizes hordozóban való diszpergálás előtt levegővel vagy más gázzal érintkeztetjük. A módosított (összetört) szerkezetű foszfolipidpor vizes hordozóval való érintkeztetésekor olyan lamellarizált vagy laminarizált szegmensek keletkeznek, amelyek a bennük diszpergált gázmikrobuborékokat stabilizálják. A találmány szerinti alacsony foszfolipidtartalmú szuszpenziókat kényelmesen úgy is előállíthatjuk, hogy a foszfolipideket levegővel vagy egyéb gázzal való érintkeztetés előtt lamellarizáljuk vagy laminarizáljuk. Ebben az esetben a foszfolipid levegővel vagy egyéb gázzal való érintkeztetését végezhetjük száraz por alakban vagy a vizes hordozóban diszpergált laminarizált foszfolipid alakjában.

A „lamelláris vagy lamináris alak” kifejezés azt jelenti, hogy a felületaktív anyag egy vagy két molekuláris rétegből felépülő vékony filmet vagy lemezt alkot. Az ilyen felületaktívanyag-molekulák a liposzómahólyagocskák szerkezetéhez hasonlóan szerveződnek.

Amint azt a WO-A-91/15244 számon közzétett nemzetközi közrebocsátási iratban ismertetik, a filmképző felületaktív anyag lamellárissá való átalakítását bármilyen liposzómaképző eljárással, például nagynyomású homogenizálással vagy akusztikus vagy ultrahang-frekvenciás szonikálással könnyen elvégezhetjük. A lamellárissá való átalakítás úgy is elvégezhetjük, hogy egy szilárd mikroszemcsés (10 pm-es vagy ettől kisebb méretű) hidrolizálva oldható hordozót (nátriumklorid, szukróz, laktóz vagy egyéb szénhidrát) bevonunk foszfolipiddel, majd a bevont hordozót valamilyen vizes fázisban oldjuk. Ehhez hasonlóan oldhatatlan szemcsés anyagokat, például üveg vagy gyanta mikrogyöngyöket is bevonhatunk szerves oldószerben oldott foszfolipiddel, majd az oldószert elpárologtatjuk. A lipidbevonatú mikrogyöngyöket ezután vizes hordozóval érintkeztetjük, és így a hordozóban liposzómahólyagocskák képződnek. A foszfolipidek lamellarizálását kevéssel a kritikus hőmérséklet (Te) feletti hőmérsékletre való melegítéssel és enyhe keveréssel is elérhetjük. A kritikus hőmérséklet a foszfolipidek gél-folyadék átalakulási hőmérséklete.

A találmány szerinti alacsony foszfolipidtartalmú mikrobuborékszuszpenziók előállításának gyakorlati kivitelezését bármilyen olyan ismert eljárással végezhetjük, amelyben „töltetlen” liposzómahólyagocskák képződnek, ami azt jelenti, hogy az oldat vizes fázisán kívül semmilyen idegen anyagot nem tartalmaznak.

A levegő vagy gáz liposzómaoldatba való bevezetését bármilyen szokásos injekciós eljárással végezhetjük úgy, hogy a liposzómaoldatba kis nyílásokon keresztül levegőt vagy gázt kényszerítünk, vagy az oldatban nyomás alatt egyszerűen feloldjuk a gázt, majd a nyomást hirtelen megszüntetjük.

Egy másik eljárással úgy járunk el, hogy a liposzómaoldatot levegő vagy egy másik fiziológiásán elfogadható gáz jelenlétében keverjük vagy szonikáljuk. A gázképződést magában a liposzómaoldatban is, például gázfejlesztő kémiai reakcióval, mint például oldott karbonát vagy hidrogén-karbonát savas bontásával is előidézhetjük. Ilyen eljárást ismertet a WO 91/09629 számú szabadalmi irat.

Ha vizes folyadék hordozóban laminarizált felületaktív anyagot szuszpendálunk, és a szuszpenzióba mikrobuborékképzésre megfelelő levegőt vagy egyéb gázt vezetünk be, a mikrobuborékokat feltételezhetően fokozatosan körülveszik és stabilizálják az olyan monomolekuláris rétegű felületaktívanyag-molekulák, amelyek a liposzómahólyagocskáktól eltérően nem képezhetnek kettős réteget. A felületaktívanyag-molekulák szerkezeti átrendezését mechanikus úton (keveréssel) vagy melegítéssel érhetjük el. A szükséges energiát valamilyen kohéziócsökkentő szer, például kis mennyiségű Pluronic kereskedelmi nevű szer alkalmazásával csökkenthetjük. Azonban a mikrobuborékkészítményekben lévő kohéziócsökkentő szer a foszfolipidmolekulák természetes egymás közötti affinitását is csökkenti, emiatt a mikrobuborékok külső nyomással (például 2,7-4,0.10³ Pa felett) szembeni stabilitása is csökken.

Amint azt a fentiekben ismertettük, a találmány szerinti alacsony foszfolipidtartalmú szuszpenzió előállításánál úgy is eljárhatunk, hogy a foszfolipidoldatok helyett adott esetben lamellarizált vízmentes foszfolipideket alkalmazunk. Ha lamellarizált foszfolipideket alkalmazunk, ezeket például a liposzómák dehidratálásával állítjuk elő, azaz valamilyen hagyományos eljárással előállított vizes oldat alakú liposzómát valamilyen szokásos eljárással dehidratálunk. A liposzómadehidratálás egyik módja a fagyasztva szárítás. Ebben az eljá4

HU 227 043 Β1 rásban az előnyös hidrofil vegyületeket tartalmazó liposzómaoldatot megfagyasztjuk, és ezután csökkentett nyomáson elpárologtatva (szublimálva) megszárítjuk.

Egy másik eljárásban nem lamellarizált vagy nem laminarizált foszfolipideket állítunk elő úgy, hogy a foszfolipidet szerves oldószerben oldjuk, és az oldatot liposzómaképzés nélkül megszárítjuk. Ilyenkor úgy járunk el, hogy a foszfolipideket megfelelő szerves oldószerben valamilyen hidrofil stabilizátor, például polimer, amely lehet például PVP, PVA, PEG, vagy a szerves oldószerben és a vízben egyaránt oldódó vegyület jelenlétében feloldjuk, majd az oldatot fagyasztva vagy szórva szárítással megszárítjuk. A vízben és a szerves oldószerben egyaránt oldható hidrofil stabilizátor lehet például almasav, glikolsav vagy maitól. Oldószerként bármilyen olyan szerves oldószert alkalmazhatunk, amelynek forráspontja elég alacsony és olvadáspontja elég magas a következő lépésben alkalmazott szárítás elősegítésére. Ilyen tipikus oldószerként alkalmazhatunk például dioxánt, ciklohexanolt, terc-butanolt, tetraklór-difluor-etilént (C₂CI₄F₂) vagy 2-metil-2butanolt, előnyösen terc-butanolt, 2-metil-2-butanolt vagy C₂CI₄F₂-t. A hidrofil stabilizátort az alkalmazott oldószerben való oldhatósága függvényében választjuk ki. Az ilyen porokból előállított mikrobuborékszuszpenziók előállítását a laminarizált foszfolipidek előállításánál ismertetettekhez hasonlóan állítjuk elő.

A fagyasztva szárított előlamellarizált vagy előlaminarizált foszfolipidoldátok aktivizálása előtt az oldatban a fentiekben ismertetettekhez hasonlóan valamilyen hidrofil stabilizátorvegyületet oldunk. Ebben az esetben azonban a hidrofil stabilizátorok választási lehetősége sokkal bővebb, mert itt szénhidrátokat, például laktózt vagy szukrózt, valamint hidrofil polimereket, például dextránt, keményítőt, PVP-t, PVA-t, PEG-t alkalmazhatunk. Az ilyen hidrofil vegyületek találmány szerinti készítményekben való alkalmazása nagyon előnyös, mert a mikrobuborékok részecskeeloszlását és tárolás alatti stabilizálását is elősegítik. A fagyasztva szárított foszfolipidből előállított nagyon híg vizes oldatok (0,0001-0,01 tömeg⁰/) például a lipidre számolt (10:1)-(1000:1) tömegarányú poli(etilénglikol) alkalmazásával stabilizálhatok. Az így kapott 1O⁹-1O¹⁰ buborék/ml (méreteloszlás 0,5-10 pm) buborékkoncentrációjú vizes mikrobuborékszuszpenziók hosszú időn át tárolva is stabil, lényeges változásokat nem szenvedő készítmények maradnak. Ezeket a készítményeket a levegőn tárolva szárított laminarizált foszfolipidek rázás vagy erős keverés nélkül végzett egyszerű feloldásával állíthatjuk elő. A csökkentett nyomáson végzett fagyasztva szárítás nagyon előnyös, mert a száraz por fölött bármilyen fiziológiailag elfogadható gáz, például nitrogén-, szén-dioxid-, argon-, metán-, freon-, SF₆-, CF₄-gáz nyomás kialakítható, és így az ilyen körülmények között kialakított foszfolipidek újradiszpergálásával a fenti gázokat tartalmazó mikrobuborékszuszpenziók állíthatók elő.

Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti készítményekhez jól alkalmazható felületaktív anyagok a víz és gázok jelenlétében stabil filmképzésre alkalmas amfipatikus vegyületek. Ilyen előnyös felületaktív anyagok a következők: lecitinek (foszfatidil-kolin) és egyéb foszfolipidek, például foszfatidinsav (PA), foszfatidil-inozitol, foszfatidil-etanol-amin (PE), foszfatidil-szerin (PS), foszfatidil-glicerin (PG), kardiolipin (CL) és spingomielinek. Megfelelő foszfolipidek a természetes és szintetikus lecitinek, például tojás vagy szója lecitin vagy a telített lecitinek, például dimirisztoil-foszfatidiIkolin, dipalmitoil-foszfatidil-kolin, disztearoil-foszfatidilkolin vagy diarachidoil-foszfatidil-kolin vagy telítetlen szintetikus lecitinek, például dioleil-foszfatidil-kolin vagy dilinoleil-foszfatidil-kolin. Előnyösek a telített lecitinek.

A fenti lipideken kívül egyéb adalék anyagot, például koleszterint és egyéb anyagokat is alkalmazhatunk. Ilyen adalék anyagok a filmképző felületaktív anyagokkal együtt alkalmazható egyéb, többnyire ismert nem foszfolipid felületaktív anyagok. Ilyen anyagok például a következők: poli(oxi-propilénglikol) és poli(oxi-etilénglikol) és ezek különböző kopolimerjei, foszfatidil-glicerin, foszfatidinsav, dietil-foszfát, zsírsavak, ergoszterin, fitoszterin, lanoszterinek, tokoferol, propil-gallát, aszkorbil-palmitát és butilezett hidroxi-toluol. Az ilyen nem filmképző felületaktív anyagok összes felületaktív anyagra számított mennyisége általában legfeljebb 50 tömeg⁰/, előnyösen 0-30 tömeg⁰/. Ez tehát azt jelenti, hogy a találmány szerinti alacsony foszfolipidtartalmú szuszpenziók különböző adalékanyag-tartalma O-tól 0,05 tömeg°/-ig terjed, amely az eddig ismert készítmények adalékanyag-tartalmának legfeljebb 1/100-a.

Megemlítjük, hogy a találmány szerinti szuszpenziók másik jellemzője a mikrobuborékok viszonylag nagy gázbefogadó kapacitása, ami az adott mennyiségű felületaktív anyagban foglalt gáz összes mennyiségének nagy mértékét jelenti. Emiatt az 1-5 pm mérettartományú mikrobuborékszuszpenziókban a gázbuborék-folyadék határfelületen jelen lévő foszfolipidek tömegének a bezárt gáz standard állapotú térfogatával képzett hányadosa 0,1 mg/ml-től 100 mg/ml-ig terjed.

Az injektálható készítményeknek a gyakorlatban a vérrel a lehető legnagyobb mértékben izotóniásnak kell lenniük. Emiatt a találmány szerinti készítményekhez az injektálás előtt kis mennyiségű izotonizálószert kell adni. Az izotonizálószerek olyan, a gyógyászatban szokásosan alkalmazott fiziológiás oldatok, amelyek vizes sóoldatot (0,9%-os NaCI-oldat), 2,6%-os glicerinoldatot és 5%-os dextrózoldatot tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezi az ultrahangos akusztikus vizsgálatokban kontrasztszerként alkalmazható találmány szerinti stabil mikrobuborékszuszpenziók előállítási eljárása is. Az eljárás alapvetően azon alapul, hogy a foszfolipidekkel stabilizált mikrobuborékszuszpenzió foszfolipidkoncentrációját a találmány szerinti készítményekre jellemző határértékek között állítjuk be.

Általában úgy járunk el, hogy a mikrobuborékszuszpenzió kiindulási foszfolipidkoncentrációját a kívánt értéknél magasabbra állítjuk be, majd a foszfolipidmikrobuborékban befogott gáz térfogatához viszonyított koncentrációját a hangképző buborékok számának lényeges csökkenése nélkül csökkentjük. Ezt például úgy érhetjük el, hogy a levegő/folyadék határfelületen közvet5

HU 227 043 Β1 lenül nem érintett foszfolipidet tartalmazó folyékony hordozó egy részét eltávolítjuk, majd a szuszpenziót friss folyékony hordozóval hígítjuk. Ezt végezhetjük a szuszpenziótartományban egyrészt

a) a jelképző buborékok gyülekezési helyén, másrészt

b) ahol a buborékok erőteljesen felhígulnak.

Ezután a (b) tartományban lévő folyadékot valamilyen szokásos eljárással (például dekantálással, leszívással) eltávolítjuk, és a szuszpenziót friss folyadékkal töltjük fel. Ezt a műveletet egy vagy több alkalommal megismételjük, és így a stabilizálásban közvetlenül részt nem vevő foszfolipideket eltávolítjuk.

Általában nemkívánatos a nem közvetlenül a buborékok gáz/folyadék határfelületén lévő foszfolipidmolekulák teljes eltávolítása, mert az egyensúlyi állapot felborulhat, azaz ha a kiürítés túl nagy, a gáz/folyadék határfelületről néhány felületaktív molekula felszabadulhat, és a buborék destabilizálódik. A kísérletek azt igazolják, hogy a folyékony hordozó foszfolipidkoncentrációja egészen a találmány szerinti készítményre jellemző alsó határig csökkenhet anélkül, hogy a tulajdonságok lényegesen megváltoznának, és mellékhatások lépnének fel. Ez azt jelenti, hogy az optimális foszfolipidkoncentrációt az adott határok között leginkább az alkalmazás típusa szabja meg, azaz ha viszonylag magas foszfolipidkoncentrációt alkalmazunk, az ideális koncentráció a felső határ közelében lesz. Ha pedig a diagnosztizálandó beteg állapotától függően a foszfolipidek mennyiségét tovább kell csökkenteni, ezt a csökkentést a mikrobuborékszám akusztikus vizsgálatban mutatott hatékonyságának befolyásolása nélkül végezhetjük.

A találmány szerinti eljárásban a kiválasztott filmképző felületaktív anyagot adott esetben valamilyen ismert vagy a leírásban ismertetett eljárással lamellárissá alakítjuk át. A felületaktív anyagot ezután levegővel vagy egyéb gázzal érintkeztetjük, és egy zárt tartályban egy folyékony hordozóval keverjük össze, és így mikrobuborékszuszpenzió képződik. A szuszpenziót állni hagyjuk, és a kialakult gázzal töltött mikrobuborékréteget hagyjuk a tartály tetejére emelkedni. Az anyalúg alsó részét eltávolítjuk, és a felülúszó mikrobuborékréteget a mikrobuborékok előállításánál alkalmazott gázzal telített vizes oldattal mossuk. A mosást addig ismételjük, míg az el nem használódott vagy szabad felületaktív molekulák lényegében teljesen eltávoznak. El nem használódott vagy szabad molekulák azokat a felületaktív molekulákat jelentik, amelyek a gázmikrobuborékok körül kialakuló monomolekuláris stabilizálóréteg képzésében nem vesznek részt.

Az alacsony foszfolipidtartalmú szuszpenziók előállítása mellett a mosási eljárás további előnye a találmány szerinti szuszpenziós készítmények további tisztítása. Ez azt jelenti, hogy majdnem minden olyan mikrobuborékot eltávolítunk, amelyek az injektált szuszpenzió akusztikus válaszában viszonylag kevés szerepet játszanak. A tisztítás eredményeként kapott szuszpenziók csak olyan pozitív hatású mikrobuborékokat tartalmaznak, amelyek az injektálás után az akusztikus jelre azonos refleksziót mutatnak. Ennek eredményeként olyan szuszpenziókat kapunk, amelyek foszfolipidkoncentrációja és egyéb adalékanyag-tartalma nagyon alacsony, és nem tartalmaznak olyan mikrobuborékokat, amelyek a képmegjelenítő eljárásban nem aktiválódnak.

A találmány egyik változatában az adott esetben lamelláris felületaktív anyagot a levegővel vagy egyéb gázzal való érintkeztetés előtt a folyékony vizes hordozóval érintkeztetjük.

A mellékelt 1. ábrán egy frissen készített találmány szerinti szuszpenzió akusztikus válaszát mutatjuk be a mikrobuborékkoncentráció függvényében. A görbék jelölésében D1 jelentése „felső fázis” és L1 jelentése „alsó fázis.

A következő példákat a találmány szerinti alacsony foszfolipidtartalmú szuszpenziók és előállítási eljárásuk részletesebb bemutatására ismertetjük.

1. példa

Multilamelláris hólyagocskákat (Multilamellar vesicle=MLV) állítunk elő úgy, hogy 50 ml 8:2 térfogatarányú hexán/etanol elegyben feloldunk 240 mg diarachidoilfoszfatidil-kolint (Avanti Polar Lipids gyártmányú DAPC termék) és 20 mg dipalmitoil-foszfatidinsavat (Avanti Polar Lipids gyártmányú DPPA-sav), majd az oldószereket forgóbepárlóban, gömblombikban lepároljuk. A kapott lipidfilmet egy vákuumexszikkátorban megszárítjuk. Az 5 ml víz hozzáadásával kapott szuszpenziót keverés közben 90 °C-on 30 percig inkubáljuk. A kapott MLV-t 85 °C-on 0,8 μΐτι-es polikarbonátszűrőn (Nuclepore kereskedelmi nevű termék) extrudáljuk. A kapott MLV készítmény 2,6 ml-ét 47,4 ml 167 mg/ml koncentrációjú, 10 000 molekulatömegű dextrán (Fluka) vizes oldathoz adjuk. A kapott oldatot alaposan összekeverjük, majd 500 ml-es gömblombikba tesszük, -45 °C-on megfagyasztjuk, és 1,44 Pa nyomáson liofilizáljuk. Ajég egy éjszaka alatt teljesen szublimál. Ezután a leszívatott tartály levegőnyomását helyreállítjuk. A kapott por különböző mennyiségeit üvegfiolákba töltjük (lásd táblázat), majd a fiolákat gumidugóval bedugjuk. A fiolákat dugóba szúrt tűn keresztül a levegő eltávolítására vákuummal leszívatjuk. A levegő leszívatása után a port kén-hexafluorid-gázzal (SF₆) érintkeztetjük. A fiolák mindegyikébe 10 ml 3%-os vizes glicerinoldatot adunk (a dugón keresztül), majd gyengén rázogatjuk. A kapott mikrobuborék szuszpenziók buborékszámát hemacitométerrel mérjük. Az átlagos buborékméret 2,2 pm. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Száraz tömeg (mg/ml)	Foszfolipidkoncentráció (pg/ml)	Koncentráció (buborék/ml)
0,5	8*	9,0><10⁶
1	16	1,3x10⁷
5	81	7,0x10⁷
10	161“	1,4x10⁸

* Nem éri el a találmány szerinti minimális buborékkoncentrációt.

** Túllépi a találmány szerinti maximális foszfolipidkoncentrációt.

HU 227 043 Β1

Hatásvizsgálat

A fentiekben ismertetett eljárással előállított készítmények hatásvizsgálatát úgy végeztük, hogy nyulakba a nyaki vénán keresztül 1 ml/5 kg dózisú készítményt injektáltunk.

Egy Acuson XP128 ultrahangos rendszerrel (Acuson Corp., Amerikai Egyesült Államok) és egy 7 MHz szektor transducerral in vivő akusztikus méréseket végeztünk. Az állatokat elaltattuk, és az átalakítót a mell bal oldalán rögzítettük úgy, hogy nyulak esetén a szív jobb és bal oldali kamrája, kismalacok esetén hosszirányú négy kamra képe legyen látható, a 0,5 mg/ml száraz anyagot tartalmazó készítmény a nyulaknál és kismalacoknál is a jobb és bal oldali kamrában egyaránt enyhe opálosodást mutatott.

Az 1 mg/ml, 5 mg/ml és 10 mg/ml-es készítmények esetén az opálosodás kiváló volt.

2. példa

Liofilizátumokat állítunk elő az 1. példában ismertetett eljárással azzal a különbséggel, hogy a gázfázis kialakítását az SF₆ helyett levegővel végezzük. A lipofilizátumokat ezután a 3%-os glicerinoldat helyett 0,9%-os sóoldatban szuszpendáljuk. így a fentiekhez hasonló buborékkoncentrációjú készítményeket kapunk.

A készítményeket nyulakba és kismalacokba injektálva azonban a hatás a fenti készítményekhez képest rövidebbnek mutatkozott, például 120 mp helyett 10-20 mp volt. Ezen túlmenően a kismalacok esetén még a 10 mg/ml koncentrációjú készítmény is csak gyenge bal oldali kamraopálosodást mutatott.

3. példa

MLV liposzómákat állítunk elő az 1. példában ismertetett eljárással úgy, hogy 240 mg DAPC-t és 10 mg DPPA-t (95:5 mólarány) oldunk fel, majd a kapott készítményt 20 ml 82,5 mg/ml-es vizes polietilénglikol- (PEG=2000) oldathoz adjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten rázzuk 10 percig, és az így kapott oldatot 5 percig -45 °C-on fagyasztjuk, majd 5 órán át 0,2 mbar nyomáson liofilizáljuk. A kapott 1,6 g port gumidugóval ellátott üvegfiolába töltjük, majd az 1. példában ismertetettek szerint SFg-tal érintkeztetjük, és 20 ml desztillált vízzel hígítjuk.

A kapott szuszpenzió buborékkoncentrációja 5*10⁹buborék/ml, és a buborékok átlagos átmérője 5,5 pm. A szuszpenziót felszívatjuk egy 20 ml-es fecskendőbe, a fecskendőt lezárjuk, és 24 órán át vízszintesen tartjuk. A fecskendőben lévő oldat felső részén fehér buborékréteg látható. A fecskendőt vízszintesen tartva a folyadék legnagyobb részét (körülbelül 16-18 ml) leszívatjuk, és a fecskendőbe azonos térfogatú friss SFg-tal telített vizet töltünk. A fecskendőt a buborékok vizes fázisban való homogenizálásáig rázzuk. A fentiekhez hasonló körülmények között 8 óra múlva egy második, majd négy óránként további három dekantálást végzünk. A kész buborékfázist (P145 sarzs) 3 ml desztillált vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzió 1,8><10⁹ buborék/ml koncentrációjú, és a buborékok átlagos átmérője 6,2 pm. A szuszpenzió aliquot mennyiségét (2 ml) 6 órán át 0,2 mbar nyomáson liofilizáljuk. A kapott port 0,2 ml 9:1 térfogatarányú tetrahidrofurán:víz elegyben oldjuk, és HPLC elemzéssel fényletapogató detektor alkalmazásával meghatározzuk az oldat foszfolipidtartalmát.

Az oldat 0,7 mg DAPC/ml koncentrációjú, így 10⁸buborékonként 3,9 pg foszfolipidet tartalmaz.

A P145 sarzs molekulaméret-eloszlását Coulterszámlálóval mérjük. A buborékok összes felülete 4,6χ10⁷ pm²/10⁸ buborék.

Feltételezve, hogy az egy molekula DAPC által elfoglalt felület 0,5 nm², kiszámolhatjuk, hogy ahhoz, hogy a buborékok mindegyike körül monorétegű foszfolipid alakuljon ki 1,3 pg DAPC/10⁸ buborék szükséges.

A P145 szuszpenziót ezután 4 °C-on tartjuk, és a szokásos eljárással meghatározzuk a buborékok koncentrációját.

A termék 10 nap múlva ugyanolyan jó minőségű, mint előállításakor, és még mindig (1—1,2)x10⁹ buborék/ml koncentrációjú. A nagyon alacsony foszfolipidkoncentráció ellenére a szuszpenzió rendkívül stabil.

A kísérletet egy másik mikrobuboréksarzzsal megismételjük úgy, hogy a dekantálás idejét előnyösen nagyobb buborékok létrehozásához meghosszabbítjuk (P132 sarzs). A kapott térfogatú készítményben lévő buborékok átlagos átmérője 8,8 pm, és a Coulterszámlálóval meghatározott összes felülete 22^10® pm²/10® buborék. A számítások szerint az ilyen buboréksűrűség esetén az egyrétegű DAPC-vel való bevonáshoz 6 pg DAPC szükséges. A kapott eredmények a kísérleti hibahatárokon belül megegyeznek a mikrobuborékok egy foszfolipidréteggel való bevonásához szükséges mennyiséggel, és ez az eredmény, tekintettel a buboréksűrűség-meghatározás nehézségeire, elfogadhatónak látszik.

A különböző mosott buborékkészítményekkel végzett akusztikus mérések azt mutatják, hogy az alsó fázissal kapott echográfiás jel sokkal gyengébb, mint a felső fázissal vagy a frissen készített mintával kapott jel. Első megközelítésre ez normálisnak tűnik, mert mindenképpen a fecskendő felső részén lévő fehér rétegben van a mikrobuborékok nagyobb része. Azonban, amint azt az 1. ábrán láthatjuk, a buborékszámlálás az alsó rétegben is meglepően nagy buboréksűrűséget mutat. Csak a Coulter-méréssel vált nyilvánvalóvá, hogy a mikrobuborékok mérete 0,5 pm alatt van. Ez azt mutatja, hogy a kisméretű buborékok még nagy koncentrációban sem képesek az ultrahangjel megfelelő visszatükrözésére.

A fenti P132 készítmény hatásvizsgálata

A hatásvizsgálatot úgy végeztük, hogy a P132 készítmény 3%-os glicerines oldattal négyszeresére hígított oldatát 0,2 ml/kg dózisban kismalacokba injektáltuk. A 2,5x10⁷ buborék/ml mosott buborékot és 5 pg/ml foszfolipidet tartalmazó készítmény a jobb és bal pitvarban egyaránt kiváló opálosodást mutatott jól kirajzolódó endokardiális határokkal. A P145 készítmény (3%-os

HU 227 043 Β1 glicerines oldat) aliquot mennyiségű injektálásával is jó opálosodást kaptunk. Ez a készítmény 0,2 pg/kg foszfolipidet tartalmaz. A kontrasztszer csak a bal pitvarban 0,02 pg/kg dózisú injekció alkalmazásával volt detektálható. Ezen túlmenően a veseartériában lévő kontraszt- 5 szer hatása 0,005 pg/kg dózisú foszfolipidkoncentrációnál csak pulzálódopplerrel detektálható.

Az eredményekből az következik, hogy a szuszpenziók megfelelő stabilitása attól függ, hogy a laminarizált foszfolipid gázmikrobuborékok körüli elhelyezke- 10 dése mennyire egyrétegű. Ez megmagyarázza a készítménnyel elért kiváló eredményeinket, valamint azt is igazolja, hogy a foszfolipidmennyiségnek valóban nem kell nagyobbnak lennie, mint amennyi a szuszpenzióban lévő mikrobuborékok körül kialakuló egy ré- 15 teg képzéséhez elegendő.

4. példa

Egy 8:2 térfogatarányú hexámetanol elegyben 48 mg DAPC-t és 2 mg DPPA-t tartalmazó oldatot állí- 20 tünk elő az 1. példa szerinti eljárással és az oldatot szárazra pároljuk. A kapott por 5 mg-ját és 375 mg polietilénglikolt 60 °C-on 5 g terc-butanolban oldunk.

A tiszta oldatot gyorsan 45 °C-ra hűtjük, és liofilizáljuk.

g liofilizátumot üvegfiolába töltünk, és a port SF₆-tal 25 érintkeztetjük (lásd 1. példa). A fiolába ezután 10 ml

3%-os glicerinoldatot adunk, és tartalmát enyhe rázással feloldjuk. A kapott szuszpenzió buborékkoncentrációja 1,5x10® buborék/ml, és a buborékok átlagos átmérője 9,5 pm.

A készítmény hatásvizsgálatát úgy végezzük, hogy a fenti készítményt nyulakba injektáltuk. A jobb és bal kamra egyaránt jól kirajzolt képet mutatott. Még a szuszpenzió tízszeres hígítása is erős kontrasztjavulást mutatott.

5. példa

A kísérletben előállított készítményt a 4. példa szerinti eljárással állítjuk elő azzal a különbséggel, hogy a foszfolipid kezdeti hexán/etanol oldatos hígítását elhagyjuk, azaz a polietilénglikollal és terc-butanollal együtt „nyers” foszfolipidet oldunk fel, majd a kapott oldatot fagyasztva szárítjuk, és ezután a maradékot vízben szuszpendáljuk.

Ezekben a kísérletekben számos foszfolipidet és foszfolipid- és egyéb lipidkombinációt vizsgálunk.

A következő táblázatban 100 mg/ml PEG 2000-t tartalmazó terc-butanolos foszfolipidkészítményekkel kapott eredményeket foglaljuk össze.

A fagyasztva szárítással kapott maradékokat SF₆tal telítjük (lásd 1. példa) majd desztillált vízzel 100 mg száraz tömeg/ml koncentrációjú oldatokat készítünk.

Lipidelegy (tömegarány)	terc-Butanolos foszfolipidkoncentráció (pg/ml)	Buborékkoncentráció (x10⁹/ml)	Átl. átm. (pm)
DSPC	2	1,3	10
DSPC/DPPG (100/4)	2	3,8	7
DSPC/Chol (2/1)	6	0,1	40
DAPC/Plur F68 (2/1)	6	0,9	15
DAPC/Palmsav (60/1)	2	0,6	11
DAPC/DPPA (100/4)	1	2,6	8
DAPC/Chol/DPPA (8/1/1)	8	1,2	19
DAPC/DPPA (100/4*)	5	2,4	18

A táblázatban:

DAPC=diarachidoil-foszfatidil-kolin;

DSPC=diszteraoil-foszfatidil-kolin;

DPPG=dipalmitoil-foszfatidil-glicerin (savforma);

DPPA=dipalmitoil-foszfatidinsav;

Chol=koleszterin;

Palm. sav=palmitinsav;

Plur F68=Pluronic ^RF-68.

*=Ebben a kísérletben a SF₆ helyett CF₄-et alkalmazunk gázként.

A kapott szuszpenziók mindegyikére jellemző a nagy mikrobuborékkoncentráció, ami azt mutatja, hogy a foszfolipid lipidekké való kezdeti konverziója nem szükséges.

A készítmények hatásvizsgálatát úgy végeztük, hogy a szuszpenziókat 0,15 mol/l-es NaCI-oldattal hígítottuk, és a 3. példában ismertetetteknek megfelelően kismalacokba injektáltuk.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a jobb és bal kamra egyaránt jól opálosodó képet mutat, és

10-50 pg lipid/test-kg vagy ettől kisebb dózissal alkalmazott készítménnyel jól körülrajzolt endokardiális határvonalat kapunk.

6. példa ml terc-butanolban 2 g PEG-2000-t, 9,6 mg DAPC-t és 0,4 mg DPPA-t oldunk, majd a kapott oldatot egy éjszakán át 0,2 mbar nyomáson fagyasztva szárítjuk. A kapott port SF₆-tal érintkeztetjük, majd

HU 227 043 Β1 ml desztillált vízben oldjuk. A hemacitometriás meghatározással 1,4*10⁹ buborék/ml koncentrációjú szuszpenziót 20 ml fecskendőbe töltjük, és a fecskendőt 16 órán át vízszintesen tartjuk. Az oldat felső részén fehér buborékréteget láthatunk. A fecskendőt vízszintes helyzetben tartjuk, és az alsó fázist (16-18 ml) leszívatjuk. A leszívatott folyadék helyére azonos térfogatú, friss SFg-tal telített desztillált vizet szívunk, és a vizes fázisban lévő buborékokat keveréssel homogenizáljuk. A rövid időközönként megismételt dekantálással két különböző sűrűségű mikrobuborékot, azaz egy nagyobb méretű és egy közepes méretű buborékokat tartalmazó szuszpenziót kapunk. A nagyobb buborékokat csak a dekantálás után 10-15 perc múlva, a közepes méretűeket 30-45 perc múlva gyűjtjük össze. A dekantálást tízszer megismételjük, hogy mindkét sűrűségű mikrobuborékot tartalmazó szuszpenzió méreteloszlását szűkítsük, és a mikrobuborékokhoz nem kapcsolódó foszfolipidet teljesen eltávolítsuk. A nagyméretű buborékokat tartalmazó (a továbbiakban nagyméretű buborékok) fázisokat összegyűjtjük. Ugyancsak egyesítjük a közepes méretű buborékokat (a továbbiakban közepes méretű buborékok) tartalmazó frakciókat is. A kétféle sűrűségű mikrobuborékszuszpenziók aliquot mennyiségét liofilizáljuk, majd a frakciókban lévő foszfolipid mennyiségének meghatározására a frakciókat egyenként HPLC elemzésnek vetjük alá.

A nagyméretű buborékfrakció buboréktartalma 2,5*10⁷ buborék/ml, a buborékok átlagos átmérője 11,3 pm, és a foszfolipidtartalom 13,7 pg/10⁷ buborék. Ez az eredmény kiváló egyezést mutat a mindegyik buborék körül egyetlen réteg foszfolipidet tartalmazó, foszfolipidmolekulánként 0,5 nm² felületű mikrobuborékra számolt 11,5 pg/10⁷ buborék elméleti értékkel.

A közepes méretű buborékfrakció buboréktartalma 8,8*10® buborék/ml, a buborékok átlagos átmérője 3,1 pm, és a foszfolipidtartalom 1,6 pg/10⁷ buborék.

Ez utóbbi érték ugyancsak kiváló egyezést mutat az 1,35 pg/10⁷ buborék elméleti értékkel.

Az eredmények azt is jelzik, hogy a találmány szerinti mikrobuborékszuszpenziók stabilitása feltehetően a mikrobuborékok körül kialakult egyrétegű foszfolipidképződés eredménye.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Ultrahang akusztikus vizsgálatokhoz kontrasztszerként alkalmazható vizes hordozós, gázzal töltött mikrobuborékokat tartalmazó, injektálható szuszpenzió, amely milliliterenként legalább 10⁷ mikrobuborékot és a mikrobuborékok összeomlása ellen stabilizátorként ható amfipatikus vegyületeket tartalmaz, melyek közül legalább egy foszfolipidstabilizátor, továbbá adott esetben jelen lévő egyéb segédanyagok is tartalmaz, ahol a szuszpenzióban a foszfolipid koncentrációja 0,01 tömeg% alatti érték a szuszpenzió össztömegére számolva; ez az érték azzal a koncentrációval azonos, vagy annál valamivel nagyobb, mint amelynél a foszfolipidmolekulák a gázmikrobuborék-folyadék határfelületet önmagukban alkotják.
2. Az 1. igénypont szerinti injektálható szuszpenzió, melyben a mikrobuborékkoncentráció 10⁸—10¹° mikrobuborék/ml.
3. Az 1. igénypont szerinti injektálható szuszpenzió, melyben foszfolipidkoncentráció 0,00013 tömeg%-nál nagyobb.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti injektálható szuszpenzió, melyben a folyékony hordozó stabilizátorként vízben oldható poli- és oligoszacharidot, cukrot és hidrofil polimert, mint például polietilénglikolt, tartalmaz.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti injektálható szuszpenzió, melyben a foszfolipid legalább részben lamelláris vagy lamináris formában van jelen, és azt a következők közül választjuk: lecitin, ezen belül foszfatidinsav, foszfatidil-kolin, foszfatidil-etanol-amin, foszfatidil-szerin, foszfatidil-glicerin, foszfatidil-inozit, kardiolipin vagy szfingomielin.
6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti injektálható szuszpenzió, mely egyéb segédanyagként foszfolipidek tulajdonságait befolyásoló anyagot tartalmaz, melyet a következők közül választunk: diacetil-foszfát, koleszterin, ergoszterin, fitoszterin, szitoszterin, lanoszterin, tokoferol, propil-gallát, aszkorbil-palmitát vagy butilezett hidroxi-toluol.
7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti injektálható szuszpenzió, mely a foszfolipidet fagyasztva vagy porlasztva szárított alakban tartalmazza.
8. Az 1. igénypont szerinti injektálható szuszpenzió, melyben mikrobuborékkoncentrációja körülbelül 10⁸-10⁹ mikrobuborék/ml, és a mikrobuborékok mérete 0,5-10 pm, mely értékek a tárolás alatt kismértékben vagy egyáltalán nem változnak.
9. Az 1. igénypont szerinti injektálható szuszpenzió, melyben a folyékony hordozó egyéb segédanyagként az összes felületaktív anyagra számított 50 tömeg%-ig terjedő mennyiségű nem lamináris felületaktív anyagot is tartalmaz, melyet a következők közül választunk: zsírsav, zsírsavak és alkoholok poliolokkal képzett észterei és éterei, ahol a poliol a következők közül választott: polialkilénglikólók, polialkilénezett cukrok és egyéb szénhidrátok, ezen belül poli- és oligoszacharidok, cukrok és vagy polialkilénezett glicerinek, mint például polietilénglikolok.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti injektálható szuszpenzió, melyben a mikrobuborékokat SF₆-tal, CF₄-gyel, freonokkal vagy levegővel töltjük.
11. Eljárás az 1. igénypont szerinti gázzal, töltött mikrobuborékokat tartalmazó injektálható szuszpenziók előállítására, melyben egy folyékony vizes hordozóban laminarizált foszfolipidet és adott esetben egyéb adalék anyagokat szuszpendálunk, a foszfolipidet a szuszpendálás előtt vagy után érintkeztetjük a gázzal, és a szuszpendáltatást olyan körülmények között végezzük, hogy a szuszpenzióban kialakult mikrobuborékok koncentrációja megfelelő akusztikus válasz kialakítására elegendő legyen és a foszfolipid egy része a buborékok körül stabilizált réteget alkosson, azzal jelle9

HU 227 043 Β1 mezve, hogy a szuszpenziót addig mossuk a mikrobuborékok stabilizálásában részt nem vevő feleslegben lévő foszfolipidek eltávolítása céljából, míg a szuszpenzió tömegére számolva a foszfolipidkoncentráció 0,01 tömeg% alá csökken.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a részlegesen lamellarizált felületaktív anyagot a levegővel vagy egyéb gázzal való érintkeztetés előtt elegyítjük a vizes hordozóval.
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes hordozó stabilizálóvegyülete5 két is tartalmaz, melyeket a következők közül választunk: hidrolizálva oldható fehérjék, polipeptidek, cukrok, poli- és oligoszacharidok és hidrofil polimerek.