JP2023512943A

JP2023512943A - 治療的使用のためのガス充填微小胞

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Publication number: JP2023512943A
Application number: JP2022544054A
Authority: JP
Inventors: ヴィクタージーンノット; アレクサンダーヘルバート
Original assignee: Bracco Suisse SA
Current assignee: Bracco Suisse SA
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2021-02-10
Publication date: 2023-03-30
Also published as: WO2021160659A1; KR20220140527A; CA3165200A1; US20230057224A1; CN115103667A; EP4103152A1

Abstract

治療的方法における、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の脂肪酸ジエステル、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ－ＰＥＧ）および脂肪酸を含むガス充填微小気泡の懸濁液の使用であって、該懸濁液は、継続ボーラスとして投与される。【選択図】図１

Description

本発明はガス充填微小胞の分野に関し、特に、治療的処置のためのそのような微小胞の使用に関する。

ガス充填微小胞の懸濁液と組み合わせた超音波の治療的使用は、多くの治療的処置において適用される新たな治療法（ｅｍｅｒｇｉｎｇｍｏｄａｌｉｔｙ）である。特定の処置によれば、ガス充填微小胞は、血流内に全身性に注入される。これらの処置は、例えば、超音波と組み合わせて血管の透過性を増大させるために、例えば医薬（参考文献１：Ｗａｎｇら）または遺伝子の送達を促進／増大させるために、血栓を壊すのを助けるために（参考文献２：Ａｕｂｏｉｒｅら）、血液脳関門を開くために（参考文献３：Ｈｕａｎｇら）、免疫調節のために（参考文献４：Ｔｕら）、神経調節のために（参考文献５：Ｂｌａｃｋｍｏｒｅら）、放射線増感のために（参考文献６：Ｄｅｎｇら）、または、非熱性の組織アブレーションを助けるためにも（参考文献７：Ａｒｖａｎｉｔｉｓら）、用いられ得る。

治療的処置は何分か続き得るので（処置される領域の位置および／またはサイズに応じて、例えば約１０分～１時間超）、処置の期間全体にわたって、ガス充填微小胞の懸濁液を持続して患者に投与する必要がある。そのような持続した投与は、懸濁液の連続的なインフュージョンにより、または特定の体積の懸濁液の２以上の継続（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）ボーラスを注入することにより達成され得る。

一般に、ボーラス投与は比較的単純な手順であり、ガス充填微小胞の特定の体積の懸濁液を数秒以内に、例えばシリンジおよび末梢静脈内に置かれたカテーテルを用いることにより、対象へ投与するステップを含む。インフュージョンは、より複雑な手順であり、専用デバイス、例えば、懸濁液を注入するためのインジェクターまたはポンプの使用、処置前のより長い調製時間、および、長期間中（処置前／後）の熟練した技師の存在を要する。さらに、長期間のインフュージョンは、シリンジ内のガス微小胞のデカンテーション現象を考慮しなければならず、専用デバイス（例えば回転シリンジ）または専用の手順（例えば微小胞懸濁液を含んでいる食塩水バッグの手動撹拌）を要する。概して、このことは、実質的な追加コストを表わしている。本出願人が観察したように、ガス充填微小胞の従来の製剤は、治療的適用においてボーラスとして投与した場合、処置中の解剖学的領域内に十分な量の微小胞が存在するのを可能にするために、比較的頻繁な間隔で投与される必要がある。例えば、Ｔｈｏｍａｓらは、リポソームの送達を高めるためのＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）の使用（４５秒以内に投与される２回のボーラス）を記載している（参考文献８：Ｔｈｏｍａｓら、２０１８）。さらに、参考文献９（Ｄｉｍｃｅｖｓｋｉら、２０１６）は、抗がん医薬（ゲムシタビン）を用いた、超音波が介在する送達治療的処置におけるＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）の使用を開示しており；この目的に関して、ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）のボーラスは３．５分ごとに注入された。

参考文献１０（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら）は、イメージング超音波造影剤としての使用のための、ＰＥＧ４０００、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００およびパルミチン酸を含む凍結乾燥組成物の再構成によって得られる、窒素とパーフルオロブタンの混合物が充填されたリン脂質安定化微小胞の懸濁液を開示している。

出願人は、上記成分を含むガス充填微小胞の懸濁液を使用することにより、１つのボーラスと継続ボーラスとの間の間隔を増大させることが可能であり、一方で、より短い間隔で投与される他の公知の製剤と実質的に同じ治療的効果を維持していることを見いだした。有利に、継続ボーラスの投与間のより長い時間間隔は、特定の期間を要する処置のために投与される必要のある微小胞の合計量の実質的な減少を可能にする。

本発明の一態様は、対象の治療的処置のための方法における使用のための、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の脂肪酸ジエステル、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ－ＰＥＧ）および脂肪酸を含むガス充填微小胞の懸濁液に関し、該懸濁液は、継続ボーラスとして投与される。

好ましくは、上記の継続ボーラスは、第一および第二のボーラスの間が少なくとも４分の間隔で投与される。

好ましくは、該組成物は、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ５０００およびパルミチン酸を含む。上記の微小気泡は、実質的に水不溶性の生理的に許容できるガス、好ましくはパーフルオロ化炭化水素、より好ましくはパーフルオロブタンが充填されている。

本発明の別態様は、上記成分を６０～９０／２～１０／５～３０、好ましくは７０～８０／３～９／１０～２５、より好ましくは約７２～７８／５～８／１５～２０の相対モル比（ＰＣ／ＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸）で含んでいるガス充填微小胞に関する。

実施例２ａ（高周波数、高音圧）における溢出実験の結果を示し、カラムａはＳｏｎｏｖｕｅ（登録商標）を用いたボーラス処置の有効性を示し、カラムｂはＤｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）を用いたボーラス処置の有効性を示し、カラムｃは本発明に係る製剤を用いたボーラス処置の有効性を示す。実施例２ｂ（低周波数、低音圧）における溢出実験の結果を示し、カラムａはＤｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）を用いたボーラス処置の有効性を示し、カラムｂは本発明に係る製剤を用いたボーラス処置の有効性を示す。

上述のように、本発明は、ガス充填微小胞の特定の製剤が、公知の製剤に対して有利により長い時間間隔で継続ボーラスとして投与することができるという知見に基づく。

本出願人が観察したように、従来技術の製剤は、比較的短い間隔でボーラスとして注入された場合に充分に作用し得るが、そのような間隔が増大すると（例えば４分以上）、処置の有効性は損なわれ得る。

本出願人は、ホスファチジルコリンの脂肪酸ジエステル、ペグ化ホスファチジルエタノールアミンおよび脂肪酸（好ましくはＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００およびパルミチン酸）を含んでおり、フッ素化ガス（好ましくは窒素およびパーフルオロブタンの混合物）を含むガスが充填されている微小胞製剤は、治療的処置の有効性を実質的に損なわずに互いの間が４分以上の間隔で継続ボーラスとして投与することが可能であることを見いだした。そのような間隔は、好ましくは少なくとも５分であり、例えば１５分まで、好ましくは１０分までである。

有利に、より長い投与ボーラス間隔の使用は、治療的処置の有効性を維持しながら、必要とされる投与回数を減らすことはもちろんのこと、注入材料の合計量を実質的に減少させることが可能である。

製剤
ホスファチジルコリンの脂肪酸ジエステルの例は、ジラウロイル－ホスファチジル－コリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル－ホスファチジル－コリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル－ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル－ホスファチジル－コリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（エチル－ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジル－コリン（ＰＯＰＣ）、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）を含む。ＤＰＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣが好ましく、ＤＳＰＣが特に好ましい。

ペグ化ホスファチジルエタノールアミンの例は、親水性エタノールアミン部分が可変分子量（例えば１０００～５０００ｇ／ｍｏｌ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に結合したホスファチジルエタノールアミン、例えばペグ化ジパルミトイルホスファチジルエーテルアミン（ＤＰＰＥ－ＰＥＧ）またはジステアロイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）を含む。好ましくは、ＰＥＧは、メトキシ末端ＰＥＧ（ＭＰＥＧとも示される）である。別段の指示がない場合は、本明細書において用いられる表現「ＰＥ－ＰＥＧ」は、その意味内にＰＥ－ＭＰＥＧ化合物も含む。約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥ－ＰＥＧ（またはＰＥ－ＭＰＥＧ）、例えばＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００またはＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ５０００が好ましい。

脂肪酸の例は、（Ｃ_１０－Ｃ_２２）－アルキルカルボン酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸；好ましくは飽和脂肪酸、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸；より好ましくはパルミチン酸を含む。

最適化された製剤では、上記成分は好ましくは、６０～９０／２～１０／５～３０の相対モル比（ＰＣ／ＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸）であり（すなわち６０～９０％モル量のＰＣ、例えばＤＳＰＣ；２～１０％モル量のＰＥ－ＰＥＧ、例えばＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００；および５～３０％モル量の脂肪酸、例えばパルミチン酸；成分の合計量が１００％である）、より好ましくは７０～８０／３～９／１０～２５、さらにより好ましくは約７２～７８／５～８／１５～２０である。

ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００およびパルミチン酸を上記相対モル比で含む製剤が特に好ましい。

微小胞の調製
本発明に係る微小胞は、当該分野における任意の公知の方法に従って製造することができる。典型的に、製造方法は、本発明の組成物を含む乾燥粉末化材料の調製を含み、好ましくは該組成物を含む水性または有機懸濁液の凍結乾燥（フリーズドライ）による。それからガス存在下で穏やかに撹拌して水性担体において凍結乾燥製剤を再構成することによって微小胞を得ることができる。

好ましくは、例えば国際特許出願ＷＯ２００４／０６９２８４において開示されるように、リン脂質と脂肪酸の混合物を含む組成物は、水非混和性有機溶媒（例えば分岐または直鎖アルカン類、アルケン類、シクロ－アルカン類、芳香族炭化水素類、アルキルエーテル類、ケトン類、ハロゲン化炭化水素類、パーフルオロ化炭化水素類またはそれらの混合物）と水のエマルション中に、撹拌下で、好ましくは凍結乾燥添加剤との混合で分散され得る（例えば、炭水化物、糖アルコール類、ポリグリコール類、ポリオキシアルキレングリコール類およびそれらの混合物；好ましくはポリエチレングリコールが凍結乾燥剤として用いられる、特にＰＥＧ４０００）。エマルションは、水性媒体および溶媒を、リン脂質および脂肪酸の存在下で、当技術分野で知られている任意の適切なエマルション生成技術、例えば、超音波処理、振とう、高圧均質化、微細混合、膜乳化、フローフォーカス乳化、高速撹拌または高剪断混合に供することによって得ることができる。好ましくは、リン脂質および脂肪酸を含む有機溶液が最初に調製され；別個に、凍結乾燥剤を含む水性溶液中にペグ化リン脂質が溶解され；それから、有機相および水相が混合されて、上述のように乳化される。そのようにして得られたマイクロエマルションは、凍結乾燥剤を含む溶液を用いて希釈されてもよい。リン脂質および脂肪酸を含む安定化層によって囲まれた溶媒の微小滴を含んでいるマイクロエマルションは、それから、従来の技術に従って凍結乾燥されて、凍結乾燥された材料が得られる。

凍結乾燥生成物は、一般に粉末またはケークの形状であり、（典型的に、密封されたバイアル内に）所望のガスと接触して保管され得る。凍結乾燥添加剤（例えばＰＥＧ４０００）は、典型的に組成物の最も大きな量を表わす（例えば、重量で、微小胞の成分（すなわちＰＣ／ＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸）の量の約５００～約１０００倍）。生成物は、適切な生理的に許容できる水性液体担体、例えば食塩水中に、穏やかに振とうすることによって容易に再構成される。

ガス
任意の生体適合性ガス、ガス前駆体またはそれらの混合物を用いて、本発明の微小胞を形成してよい（ここでは、「微小胞形成ガス」としても特定される）。

ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；希ガスまたは不活性ガス、例えばヘリウム、アルゴン、キセノンもしくはクリプトン；低分子量炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンもしくはイソペンタンなどのアルカン、シクロブタンもしくはシクロペンタンなどのシクロアルカン、プロペン、ブテンもしくはイソブテンなどのアルケン、または、アセチレンなどのアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス、例えばまたは、ハロゲン化、フッ素化もしくはパーフルオロ化低分子量炭化水素類（例えば７個までの炭素原子を含む）；または前述のいずれかの混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合、該化合物におけるハロゲン原子の好ましくは少なくとも一部、より好ましくは全てがフッ素原子である。

フッ素化ガスが好ましく、特にパーフルオロ化ガスが好ましい。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子を含む材料、例えば、フッ素化炭化水素（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはパーフルオロ化ケトン類、例えばパーフルオロアセトン；およびフッ素化、好ましくはパーフルオロ化エーテル類、例えばパーフルオロジエチルエーテルを含む。好ましい化合物は、パーフルオロ化ガス、例えばＳＦ_６またはパーフルオロカーボン（パーフルオロ化炭化水素）、すなわち、全ての水素原子がフッ素原子によって置換されている炭化水素類であり、例えば参考文献により本明細書中に援用されるＥＰ０５５４２１３に開示されるように、特に安定した微小気泡懸濁液を形成することが知られている。

用語「パーフルオロカーボン」は、飽和、不飽和、および環状パーフルオロカーボンを含む。生体適合性の、生理的に許容できるパーフルオロカーボンの例は以下である：パーフルオロアルカン類、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えばパーフルオロ－ｎ－ブタン、他の異性体、例えばパーフルオロ－イソブタンとの混合であってもよい）、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンまたはパーフルオロヘプタン；パーフルオロアルケン類、例えば、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えばパーフルオロブト－２エン）またはパーフルオロブタジエン；パーフルオロアルキン類（例えばパーフルオロブト－２－イン）；およびパーフルオロシクロアルカン類（例えばパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンおよびパーフルオロシクロヘプタン）。好ましい飽和パーフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ_４、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０およびＣ_５Ｆ_１２を含み、好ましくはＣ_４Ｆ_１０である。

任意の比で任意の上記のガスの混合物を用いることも有利であり得る。例えば、混合物は、従来のガス、例えば、窒素、空気または二酸化炭素、および、安定した微小気泡懸濁液を形成するガス、例えば、六フッ化硫黄または上記に示されたパーフルオロカーボンを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えば、参照により本明細書中に援用されるＷＯ９４／０９８２９に見ることができる。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）および（Ｂ）の混合物であって、ガス（Ｂ）が前に例示されたものの中から選択されるフッ素化ガスであり、その混合物を含み、（Ａ）が、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、合計の混合物の約０．５％～約９５％ｖ／ｖ、好ましくは約５％～８０％を示すことができる。

特に好ましいガスは、ＳＦ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０またはそれらの混合物であり、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物との混合であってもよい。Ｃ_４Ｆ_１０が特に好ましく、Ｃ_４Ｆ_１０と窒素の混合物がさらにより好ましく、好ましくは３５／６５（ｖ／ｖ）比である。

調剤キットおよび投与
本発明に係る微小胞懸濁液は、それ自体として保管することができ、または好ましくは、水性担体を用いて再構成することのできる凍結乾燥前駆体の形態で保管することができる。本発明によれば、微小胞懸濁液の前駆体はしたがって、好ましくは乾燥された粉末化形態で保管され、したがって、二成分の診断および／または治療的キットにおいて、好ましくは注入による投与のために、有利にパッケージすることができる。キットは、好ましくは、凍結乾燥された前駆体組成物を選択された微小胞形成ガスと接触して含んでいる第一のコンテナ、および、微小胞の懸濁液を再構成するための生理的に許容できる水性担体、特に食塩水を含んでいる第二のコンテナを備える。上記の二成分キットは、２つの別個のコンテナまたはデュアルチャンバーコンテナを備えることができる。前者の場合では、コンテナは、好ましくは従来のセプタムで密封されたバイアルであり、凍結乾燥された残留物を含んでいるバイアルがセプタムによって密封されており、セプタムを通して、任意にプレフィルド・シリンジを用いて担体液体が注入され得る。そのような場合では、第二の成分のコンテナとして用いられるシリンジは、微小胞の懸濁液を注入するためにも用いられる。後者の場合では、デュアルチャンバーコンテナは、好ましくはデュアルチャンバーシリンジであり、凍結乾燥生成物が再構成された時点で、適切に混合され、または穏やかに振とうされ、コンテナは、微小胞の懸濁液を注入するために直接用いられ得る。

再構成された懸濁液は、したがって、上述の成分（ＰＣ、ＰＥ－ＰＥＧおよび脂肪酸）を好ましくは上記に示した相対モル比で含んでいる安定化層を有するガス充填微小胞を含み、該ガス充填微小胞は、好ましくは窒素およびパーフルオロブタン（６５／３５ｖ／ｖ）の混合物を含んでいる。典型的に、再構成されたガス充填微小胞は、約２．５～４ミクロン、好ましくは３．０～３．５のメジアン体積濃度（Ｄｖ５０）、および、約１～２ミクロン、好ましくは１．２～１．８の数平均直径（Ｄｎ）を有する。典型的に、実質的に全ての微小胞（例えば少なくとも９８％、好ましくは９９％、より好ましくは１００％）は、８ミクロン未満の直径を有する。一般に、２～８ミクロンのガス充填微小胞の量は、懸濁液中の微小胞の合計数の約５％～約４０％（好ましくは１０～３０％）であり得る。再構成の体積に応じて、懸濁液中のガス充填微小胞の濃度は、約１×１０^８～約２×１０^９微小胞／ｍＬに変化し得る。

本発明の微小胞懸濁液は、超音波と組み合わせて血管の透過性を増大させるための様々な治療的技術において用いることができる。そのような治療的処置は、例えば、医薬の送達の促進／増大（例えば腫瘍または神経障害の処置において、薬物または遺伝子の治療的有効性を高めるため）、血栓の破壊、免疫調節、神経調節、放射線増感または非熱性の組織アブレーションを含む。

好ましい実施形態によれば、有効量の微小胞が、典型的に、その懸濁液の注入によって、好ましくは継続ボーラスとして、好ましくは医薬（例えば抗腫瘍性薬物）と組み合わせて、患者に投与される。微小胞の懸濁液の投与は、医薬の投与に対して同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）または継続（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）のいずれかであってよい。

本明細書において用いられる表現「ボーラス投与」は、例えばシリンジおよび末梢静脈内に置かれたカテーテルを用いた、特定の体積のガス充填微小胞懸濁液の単回の血管内注入を指す。ボーラス投与は通常、何秒か以内（例えば５～１２０秒、好ましくは６０秒以内）に行なわれ、「継続（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）」または「繰り返し（ｒｅｐｅａｔｅｄ）」ボーラスは、特定の期間後、例えば本発明によれば少なくとも４分後に、繰り返されるボーラス注入を指す。

それぞれの注入体積の懸濁液（ボーラス）に関する微小胞の合計量は、６×１０^５～２×１０^９微小胞／患者のｋｇ、好ましくは１×１０^７～１×１０^９微小胞／ｋｇ、さらにより好ましくは２×１０^７～４×１０^８微小胞／ｋｇに変化し得る。

それぞれの注入ボーラスの体積は、注入される微小胞の必要とされる合計量に適合され（通常、行なわれる特定の処置に依存する）、注入懸濁液中の微小胞の濃度および患者の体重を考慮する。全般的なルールとして、約１×１０^８～約２×１０^９個の微小胞／ｍＬの懸濁液中の微小胞の濃度について、ボーラス体積は、０．０１～１２０ｍＬ、好ましくは０．２～６０ｍＬ、さらにより好ましくは０．４～２０ｍＬに変化し得る。

本組成物は、任意の時間間隔で継続ボーラスとして投与することができるが、本出願人は、製剤を、公知の微小胞製剤よりも長い間隔で投与することにより、超音波と組み合わせて治療的処置において用いることができることを観察した。特に、２回の継続ボーラスの間の上記の時間間隔は、少なくとも４分、好ましくは５分、例えば１５分まで、好ましくは１０分までであってよい。他方で、当業者は、本発明の製剤を、ボーラスと継続ボーラスの間がより短い間隔で用いることにより、処置の有効性が、それにもかかわらず、同じ条件（すなわち微小胞の濃度および時間間隔）で注入されるガス充填微小胞の他の公知の製剤による有効性に対して改善されることを認識している。

微小胞の存在下で処置される体部分の適切な超音波照射は、例えば、ガス充填微小胞の懸濁液と組み合わせて投与される医薬の治療的有効性を増大させることにより、所望の増強された治療的効果を提供する。超音波照射は、通常の条件で行なうことができる。例えば、０．１ＭＨｚ～１５ＭＨｚ、好ましくは０．１５～５ＭＨｚ、より好ましくは０．２～２．５ＭＨｚの周波数の超音波照射を用いることができる。音圧は、５０ｋＰａ～１０ＭＰａ、好ましくは１００ｋＰａ～５ＭＰａ、より好ましくは１００ｋＰａ～３．５ＭＰａであってよい。パルス長は特定の処置および処置される臓器に適合され、例えば１μｓ～１２０秒、好ましくは６０秒まで、より好ましくは１秒まで変化することができる。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助ける。

実施例１
実験的製剤（Ｆ０１）の調製
後の実験で用いるために、ＷＯ２００４／０６９２８４の実施例に説明される手順を、実験的製剤（Ｆ０１）を調製するために用いた。

手短には、約９０ｍｇ／ｌのＤＳＰＣ、７ｍｇ／ｌのパルミチン酸、６０ｍｇ／ｌのＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００および１００ｇ／ｌのＰＥＧ４０００を含む、シクロオクタンおよび水（約１．５／１００ｖ／ｖ）のエマルションを調製し（ＭｅｇａｔｒｏｎＭＴ３０００、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ；１０’０００ｒｐｍ）、ＤＩＮ８Ｒバイアル中にサンプリングした（約１ｍｌ／バイアル）。

バイアルを－５０℃で真空下にて冷却し、それから凍結乾燥に供し、その後に、水および溶媒が完全に除去されるまで（０．５重量％未満）、室温よりも上で二次乾燥を行なった。凍結乾燥工程の最後に、バイアルのヘッドスペースをＣ_４Ｆ_１０／Ｎ_２の３５／６５混合物で飽和し、バイアルに栓をして密封した。

実験前に、バイアルを１ｍｌの食塩水で再構成した。

実施例２
実験的製剤Ｆ０１の治療的有効性
全般的セットアップ
ＣＹ（ｃ）５．５ＭｏｎｏＮＨＳエステルを、塩基性バッファー（リン酸１００ｍＭ、食塩水１５０ｍＭ、ｐＨ８）を用いて一晩室温で予め加水分解した。麻酔をした動物（雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット）に、加水分解されたＣｙ（ｃ）５．５（Ｃｙ５．５ｈ）の静脈内注入を投与して、最初の血漿濃度３．３μＭを得た。それから、ガス充填微小胞の連続的なボーラス注入（後の実施例において特定される）を行ない、左後肢の筋肉を治療的超音波照射に供した（周波数、音圧およびパルス特性は後の実施例において特定される）。

ボーラスは５分あいており、手順の合計持続時間は１０～２０分の範囲であった。

以下の実施例２ａおよび２ｂでは、本発明のガス充填微小胞（ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００およびパルミチン酸の混合物を含んでいる、Ｆ０１）がＣｙ５．５ｈ溢出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を誘導する能力を、同一条件下でＳｏｎｏｖｕｅ（登録商標）（ＤＳＰＣ、ＤＰＰＧ、パルミチン酸の混合物）およびＤｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）（ＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ５０００の混合物）と、異なる超音波条件下（周波数０．５ＭＨｚ～１．６ＭＨｚ；音圧１７０ｋＰａ～８００ｋＰａ）で比較した。

ガス充填微小胞および超音波の組み合わせの治療的効果を、注入の１２０分後に後肢筋肉におけるＣｙ５．５ｈの溢出レベルを測定することによって評価した。これは、新鮮な組織に対する近赤外線蛍光イメージング（Ｆｌｕｏｂｅａｍ（登録商標）７００ＦｌｕｏｐｔｉｃｓＧｒｅｎｏｂｌｅ）によるＣｙ５．５ｈ蛍光シグナルのエクスビボの定量的測定によって達成した。処置の有効性は、処置された筋肉とコントロールの筋肉（右後肢、超音波照射に曝されていない）の間の平均蛍光シグナル比が１．５よりも高い場合にポジティブと考えた。

実施例２ａ
各動物（上記「全般的なセットアップ」のセクションを参照）に、４回の継続ボーラス注入のＦ０１、ＳｏｎｏｖｕｅまたはＤｅｆｉｎｉｔｙを、各ボーラスについて約６×１０^７微小胞／動物のｋｇの濃度で、互いに５分の間隔で投与した。

５匹の動物を各製剤について試験した。

左後肢の筋肉を、８００ｋＰａ、１．６ＭＨｚ、１ｍｓＯＮ－４ｓｅｃＯＦＦで２０分間、超音波処理に供した。

図１（カラムｃ）の結果から観察されるように、Ｆ０１と組み合わせて超音波によって処置された筋肉における蛍光シグナルは、コントロールの筋肉において測定されたシグナルに対して少なくとも２倍であった。それとは対照的に、ＳｏｎｏＶｕｅまたはＤｅｆｉｎｉｔｙガス充填微小胞は、同一条件でそれぞれ５分注入した場合に、Ｃｙ５．５ｈ溢出を誘導することができなかった（それぞれカラムａおよびｂ）。

実施例２ｂ
Ｆ０１およびＤｅｆｉｎｉｔｙを用いて、２回の継続ボーラス（５分間隔）を、それぞれ約１×１０^９微小胞／動物のｋｇの濃度で投与することにより、実施例２ａと同一の実験を繰り返した。

３匹および４匹の動物をＦ０１およびＤｅｆｉｎｉｔｙについてそれぞれ試験した。

左後肢の筋肉を、１７０ＫＰａおよび０．５ＭＨｚ（１ｍｓＯＮ－４ｓｅｃＯＦＦ）で１０分間、超音波処理に供した。

図２における結果は、Ｆ０１および超音波で処置された筋肉における蛍光シグナル（カラムｂ）が、コントロールの筋肉において測定されたシグナルに対して２倍を超えたことを示す。それとは対照的に、Ｄｅｆｉｎｉｔｙガス充填微小胞は、同一条件下でそれぞれ５分注入した場合に、Ｃｙ５．５ｈ溢出を誘導することができなかった（カラムａ）。

上記実験的結果は、超音波照射の異なる条件で超音波処置と組み合わせて、血管の透過性の増大に関して、継続ボーラスとして投与した場合の本発明の組成物のより高い有効性（市販の微小胞組成物に対して）を示す。

Claims

治療的方法における使用のための、ホスファチジルコリン（ＰＣ）の脂肪酸ジエステル、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ－ＰＥＧ）および脂肪酸を含むガス充填微小胞の懸濁液であって、
前記懸濁液は、少なくとも２回の継続（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）ボーラスとして投与される、
懸濁液。
請求項１に記載の懸濁液であって、
前記少なくとも２回の継続ボーラスは、互いの間が少なくとも４分の間隔で投与される、
懸濁液。
請求項１に記載の懸濁液であって、
前記少なくとも２回の継続ボーラスは、互いの間が少なくとも５分の間隔で投与される、
懸濁液。
請求項１～３のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
相対モル比ＰＣ／ＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸が６０～９０／２～１０／５～３０である、
懸濁液。
請求項４に記載の懸濁液であって、
前記比が７０～８０／３～９／１０～２５である、
懸濁液。
請求項１～５のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
前記ガス充填微小胞が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ－５０００およびパルミチン酸を含む、
懸濁液。
請求項１～６のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
前記ガス充填微小胞が、フッ素化ガスを含む、
懸濁液。
請求項１～７のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
前記方法が、超音波を適用するステップを含む、
懸濁液。
請求項８に記載の懸濁液であって、
前記方法が、前記治療的方法を受ける対象における血管の透過性を増大させるステップを含む、
懸濁液。
請求項１～９のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
懸濁液のそれぞれの注入体積に関する微小胞の合計量が、前記治療的方法を受ける対象のｋｇあたり６×１０^５～２×１０^９微小胞である、
懸濁液。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
注入懸濁液中の微小胞の濃度が１×１０^８～２×１０^９微小胞／ｍＬである、
懸濁液。
患者の治療的処置の方法であって、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）の脂肪酸ジエステル、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ－ＰＥＧ）および脂肪酸を含むガス充填微小胞の懸濁液の２回の継続ボーラスを前記患者に投与するステップを含む、
方法。
請求項１２に記載の方法であって、
前記少なくとも２回の継続ボーラスは、互いの間が少なくとも４分の間隔で投与される、
方法。
請求項１３に記載の方法であって、
前記少なくとも２回の継続ボーラスは、互いの間が少なくとも５分の間隔で投与される、
方法。
請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法であって、
相対モル比ＰＣ／ＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸が、６０～９０／２～１０／５～３０である、
方法。
請求項１５に記載の方法であって、
前記比が７０～８０／３～９／１０～２５である、
方法。
請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ガス充填微小胞が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＥ－ＭＰＥＧ－５０００およびパルミチン酸を含む、
方法。
請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ガス充填微小胞が、フッ素化ガスを含む、
方法。
請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記方法が、超音波を適用するステップを含む、
方法。
請求項１９に記載の方法であって、
前記方法が、前記治療的処置を受ける患者における血管の透過性を増大させるステップを含む、
方法。
請求項１２～２０のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
懸濁液のそれぞれの注入体積に関する微小胞の合計量が、患者のｋｇあたり６×１０^５～２×１０^９微小胞である、
懸濁液。
請求項１２～２１のいずれか一項に記載の懸濁液であって、
注入懸濁液中の微小胞の濃度が、１×１０^８～２×１０^９微小胞／ｍＬである、
懸濁液。