ES2269262T3

ES2269262T3 - Emulsiones de gas estabilizador con fluoroeter que tiene coeficientes bajos de ostwald.

Info

Publication number: ES2269262T3
Application number: ES01119824T
Authority: ES
Inventors: Alexey Kabalnov; Ernest George Schutt; Jeffrey Greg Weers
Original assignee: Imcor Pharmaceutical Co
Current assignee: Imcor Pharmaceutical Co
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: CN1087954C; NO975317D0; EP1174153B1; EP1174153A2; JPH11506782A; DE69636486T2; DE69621015D1; WO1996040281A3; WO1996040281B1; MX9709564A; EP0833669B1; AU712946B2; DK0833669T3; KR100401429B1; DE69636486D1; US6193952B1; AU6048796A; HUP9900848A3; PL185883B1; HUP9900848A2

Abstract

Una composición precursora de microburbujas in- cluyendo un agente osmótico de gas fluoroéter dispersado en una pluralidad de microesferas secadas por pulveriza- ción donde las microesferas secadas por pulverización in- cluyen un surfactante.

Description

Emulsiones de gas estabilizador con fluoroéter que tiene coeficientes bajos de Ostwald.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención incluye precursores para preparar tales emulsiones.

2. Antecedentes de la invención

La tecnología ultrasónica proporciona una alternativa importante y más económica a las técnicas de formación de imágenes que utilizan radiación ionizante. Aunque están disponibles numerosas tecnologías convencionales de formación de imágenes, por ejemplo, formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), tomografía computarizada (TC), y tomografía por emisión de positrones (TEP), cada una de estas técnicas usa equipo sumamente caro. Además, TC y TEP utilizan radiación ionizante. A diferencia de estas técnicas, el equipo de formación de imágenes por ultrasonido es relativamente barato. Además, la formación de imágenes por ultrasonido no usa radiación
ionizante.

La formación de imágenes por ultrasonido hace uso de las diferencias de densidad y composición de los tejidos que afectan a la reflexión de ondas sonoras por los tejidos. Las imágenes son especialmente nítidas donde hay claras variaciones en la densidad o compresibilidad del tejido, tal como en las interfaces de tejidos. Las interfaces entre tejidos sólidos, el sistema esquelético, y varios órganos y/o tumores se representan fácilmente en imágenes con
ultrasonido.

Por consiguiente, el ultrasonido funciona adecuadamente en muchas aplicaciones de formación de imágenes sin uso de agentes de mejora de contraste; sin embargo, para otras aplicaciones, tal como visualización de la circulación de la sangre, se ha realizado esfuerzos continuos por desarrollar tales agentes para proporcionar una mejora del contraste. Una aplicación especialmente significativa de tales agentes de contraste es en el campo de la formación de imágenes de perfusión. Tales agentes de contraste de ultrasonido podrían mejorar la formación de imágenes de sangre circulante en el músculo cardiaco, riñones, hígado y otros tejidos. Esto, a su vez, facilitaría la investigación, el diagnóstico, la cirugía y la terapia relacionados con los tejidos representados en imágenes. Un agente de contraste de remanso de sangre también permitiría la formación de imágenes en base a la sangre contenida (por ejemplo, tumores y tejidos inflamados) y contribuiría a la visualización de la placenta y el feto mejorando solamente la circulación
materna.

Se han propuesto varios agentes de mejora del contraste por ultrasonido. El más exitoso consistía en general en dispersiones de pequeñas burbujas de gas que se puede inyectar por vía intravenosa. Las burbujas se inyectan al flujo sanguíneo de un cuerpo vivo a representar en imágenes proporcionando por ello una emulsión en la sangre circulante que es de una densidad diferente y una compresibilidad mucho más alta que el tejido fluido y sangre circundante. Como resultado, estas burbujas se pueden representar fácilmente con imágenes con ultrasonido.

Por desgracia, la creación de burbujas que son efectivos dispersadores de ultrasonido in vivo ha sido difícil. Varias explicaciones son evidentes. Primera: tales burbujas tienden a encogerse rápidamente debido a la difusión del gas atrapado en el líquido circundante. Esto es especialmente cierto de las burbujas que contienen aire o sus gases componentes (tal como nitrógeno) que son altamente solubles en agua. Cabría esperar mejorar la duración de las burbujas aumentando simplemente el tamaño de las burbujas de manera que tenga que escapar más gas antes de que las burbujas desaparezcan. Este acercamiento ha demostrado ser insatisfactorio, sin embargo, porque las burbujas de más de aproximadamente 10 \mum de diámetro salen del flujo sanguíneo por los pulmones, evitando su circulación adicional. Además, las burbujas más grandes no son capaces de circular por vasos sanguíneos menores y
capilares.

Las microburbujas con funcionamiento satisfactorio in vivo deberán tener también características biológicas ventajosas. Primera: los compuestos que forman el gas dentro de las microburbujas deberán ser biocompatibles. En último término, las microburbujas conteniendo la fase gas se desintegrarán y la fase gas se liberará a la sangre como un gas disuelto o como gotitas submicrométricas del líquido condensado. Por lo tanto, los gases saldrán primariamente del cuerpo mediante respiración pulmonar o mediante una combinación de respiración y otros recorridos metabólicos en el sistema reticuloendotelial. Incluso cuando la persistencia de las burbujas es suficiente para permitir varios pasos a través del sistema circulatorio de un animal o humano, la captación de microburbujas por las células fagocitas reticuloendoteliales del hígado puede limitar la efectividad del agente de contraste. Las reacciones adversas del sistema inmune también pueden reducir los tiempos de duración in vivo de la burbuja, y se deberán evitar. Por ejemplo, se ha demostrado que las microburbujas "desnudas" producen respuestas adversas tal como la activación de complemento (véase, por ejemplo, K. A. Shastri y otros (1991) Undersea Biomed. Res., 18, 157). Sin embargo, como es conocido en la técnica, estas respuestas indeseadas se pueden reducir mediante la utilización de agentes encapsulantes
apropiados.

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Por consiguiente, los esfuerzos por mejorar la duración in vivo de microburbujas han incluido el uso de estabilidad, y por lo tanto los varios materiales encapsulantes. Por ejemplo, se ha usado gelatinas o microesferas de albúmina que se forman inicialmente en suspensión líquida, y que atrapan gas durante la solidificación. También ha sido explorado el uso de surfactantes como agentes estabilizantes para dispersiones de burbujas de gas, como en las Patentes de Estados Unidos números 4.466.442 de Hilmann y otros, y 5.352.436 de Wheatley y otros. Algunos agentes de mejora de contraste conteniendo surfactante atrapan burbujas de gas en el núcleo acuoso de liposomas como en la Patente de Estados Unidos número 5.334.381 de Unger y la Patente de Estados Unidos número 4.900.540 de Ryan y
otros.

Recientemente, los efectos del gas atrapado en la duración de la burbuja han recibido atención considerable. Aparte del aire y sus componentes, se ha usado varios gases nobles tal como criptón y argón. La atención se ha centrado ahora en gases biocompatibles que tienen bajas solubilidades en agua. Se ha mostrado teóricamente que la solubilidad baja es un factor importante de la estabilidad de la burbuja de gas. En Epstein y Plesset, On the Stability of Gas Bubbles in Liquid-Gas Solutions, (1950) J. Chem. Phys. 18(11), 1505-1509, la velocidad de encogimiento de las burbujas de gas se derivó como una función de la densidad, solubilidad, y difusibilidad del gas en el medio circundante. También se ha demostrado que la estabilidad de las emulsiones líquido-líquido aumenta con la disminución de la solubilidad de la fase dispersada (Kabalnov y Shchukin, Ostwald Ripening Theory: Applications to Fluorocarbon Emulsion Stability, Advances in Colloid and interface Science, 38:69-97, 1992).

Con ciertos supuestos simplificantes, la fórmula de Epstein y Plesset conduce a la fórmula de la duración de la burbuja (\tau) dada por Quay en la Patente de Estados Unidos número 5.393.524:

(1)\tau \ \alpha \ \rho/DC

donde \rho es la densidad del gas atrapado, D es la difusividad del gas en el medio circundante, y C es la solubilidad del gas en el medio circundante. En base a esta fórmula, Quay forma burbujas usando gases seleccionados en base a que son un gas a presión atmosférica y temperatura corporal (37°C) y que tienen reducida solubilidad en agua, mayor densidad, y reducida difusividad del gas en solución en comparación con el aire. En el mismo sentido, Schneider y otros en EP0554213A1 describen gases seleccionados en base a baja solubilidad en agua y peso molecular alto. Específicamente, los gases descritos incluyen SF_{6}, y SeF_{6}, así como varios hidrocarbonos perfluorados.

Aunque la reducida solubilidad en agua y difusividad pueden afectar a la velocidad a la que el gas sale de la burbuja (como indicaron originalmente Epstein y Plesset), los criterios de selección de gas de Quay y Schneider son inadecuados porque dan lugar a la inclusión de algunos gases inadecuados y la exclusión de algunos gases óptimos adecuados. Por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos número 5.393.524, Quay sugiere elegir gases de microburbujas en base a un cálculo del valor Q para el gas propuesto, donde:

(2)Q=4 x 10^{-7} x \rho/DC,

\rho es la densidad de gas (kg/m^{3}), C es la solubilidad en agua del gas (M), y D es la difusividad del gas en solución (cm^{2}/s). Quay describe que el valor Q deberá ser al menos 30 para que sea un gas útil para mejora del contraste por ultrasonido. Una simple estimación usando los datos de solubilidad en agua expuestos en la literatura (E. Wilhelm, R. Battino, y R. J. Wilcock, Chemical Reviews, 1977, v. 77, p. 219) muestra que los valores Q virtualmente de todos los gases conocidos (con la excepción de hidrógeno y helio) se aproximan o exceden de este valor. A 25°C, el oxígeno, por ejemplo, tiene un Q de 20, y el nitrógeno tiene un Q de 35. Por lo tanto, la descripción de Quay proporciona poca guía para la selección de gases de microburbujas efectivos.

Además, el criterio del coeficiente Q de Quay así como la descripción de Schneider en EP0554213A1 no consideran algunas causas principales de encogimiento de las burbujas, a saber, los efectos de la tensión superficial de las burbujas, los surfactantes y los efectos osmóticos del gas, y el potencial de condensación del gas de llenado a un líquido. A saber, la presión parcial del gas de llenado debe ser suficientemente alta para hacer frente a la sobrepresión excesiva de Leplace dentro de las burbujas. Si la presión del vapor saturado es baja, el gas de llenado puede condensarse a líquido y se perderá la capacidad de contraste. Por consiguiente, se necesita en la técnica agentes estabilizados de mejora de contraste que sean biocompatibles, se preparen fácilmente, y proporcionen excelente mejora del contraste in vivo en la formación de imágenes por ultrasonido. También se necesita precursores de microburbujas y métodos para preparar y usar tales agentes de mejora de contraste.

Resumen de la invención

La presente invención utiliza compuestos de fluoroéter de bajo coeficiente de Ostwald para proporcionar emulsiones de gas duraderas incluyendo preparados de microburbujas para mejora de contraste en formación de imágenes por ultrasonido y resonancia magnética. Cuando se preparan preparados de microburbujas usando los compuestos de la presente invención, se puede obtener imágenes más duraderas del corazón y otros órganos internos de lo que antes era posible. En esta invención se describe emulsiones de gas incluyendo una clase previamente no considerada de compuestos que combinan una reducida solubilidad en agua sin una presión de vapor saturado considerablemente reducida (y por lo tanto coeficientes de Ostwald inesperadamente bajos). La alta presión de vapor contribuye además a reducir la pérdida de contraste debido a la condensación del gas de llenado a líquido. Estos compuestos son los mono- y poliéteres fluorados. Cuando se comparan perfluoroetiléteres con sus análogos de perfluorocarbono con el mismo número de átomos de carbono, la adición de éter oxígeno no afecta a la presión de vapor considerablemente, mientras que la solubilidad en agua disminuye un factor de aproximadamente 2-3. Esto es inesperado y sorprendente porque la conversión de hidrocarbono a éteres da lugar a aumentos considerables de la solubilidad en
agua.

Así, se describe una emulsión de gas para mejora del contraste por ultrasonido incluyendo una pluralidad de burbujas de gas en un medio líquido, incluyendo el gas un fluoromono o fluoropoliéter, o su mezcla. En algunas realizaciones, el gas incluye un compuesto que tiene un coeficiente de Ostwald de menos de aproximadamente 100 x 10^{-6} a 37°C, lo que da lugar a una mejora del contraste in vivo especialmente larga. Se ha hallado que son especialmente ventajosos vapor de perfluorodietiléter, perfluorodimetiléter, perfluorometiletiléter, perfluoromonoglime, perfluorodiglime, C_{4}F_{10}O_{3}, C_{5}F_{12}O_{4}, C_{6}F_{14}O_{5}.

Las burbujas de gas de la presente invención pueden estar rodeadas por una capa de surfactante que incluye preferiblemente un primer y un segundo surfactante, constando esencialmente el primer surfactante de un fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que tiene al menos una cadena acilo que incluye al menos 10 átomos de carbono, e incluyendo al menos aproximadamente 5% p/p de surfactante total, siendo el segundo surfactante más soluble en agua que el primer surfactante. Muy preferiblemente, el primer surfactante incluye una fosfatidicolina con una o varias cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena de 12 a 18 átomos de carbono, y dicho segundo surfactante incluye una fosfatidicolina con una o varias cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena de 6 a 12 átomos de carbono.

La presente invención proporciona composiciones precursoras de microburbujas. Los expertos en la materia apreciarán que los preparados de microburbujas se pueden preparar usando varias técnicas diferentes. Por ejemplo, se puede formar microburbujas usando los compuestos de fluoroéter descritos en unión con polvos, microesferas de proteínas, microesferas secadas por pulverización, partículas conteniendo vacíos, particulados, liposomas, soluciones de azúcar saturadas, etc. Cada uno de estos materiales estructurales se puede usar además para proporcionar precursores de microburbujas secos cuando se dispersa en ellos un fluororéter. A la adición de un medio líquido, preferiblemente agua, se puede formar emulsiones de gas.

Las microburbujas se pueden producir secando por pulverización una formulación líquida conteniendo un material formador de membrana biocompatible para formar un polvo de microesferas a partir del mismo, combinando las microesferas con los compuestos de fluoroéter de bajo coeficiente de Ostwald como se describe aquí, y mezclando una fase acuosa con el polvo. El polvo de microesferas se disuelve sustancialmente en la fase acuosa para formar microburbujas. Preferiblemente, las microburbujas se recubren con una monocapa de surfactante.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a los expertos en la materia por la consideración de la siguiente descripción detallada de sus realizaciones preferidas ejemplares tomada en unión con las figuras que se describirán brevemente en primer lugar.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico de la intensidad de señal Doppler pulsada in vivo en función del tiempo a partir de dos emulsiones de gas de fluoroéter según la invención en función del aire.

Las figuras 2a, 2b y 2c son representaciones gráficas de la desintegración de señales de ultrasonido en el tiempo después de la inyección de medios de contraste de emulsión de gas a un conejo. Cada representación gráfica individual está dispuesta de tal manera que los preparados de microburbujas incluyendo fluoroéteres se comparen con preparados de microburbujas de la técnica anterior incluyendo análogos de fluorocarbono.

Las figuras 3a, 3b y 3c muestran dos imágenes de ultrasonido de un corazón de cerdo antes de la inyección de los medios de contraste de burbuja (figura 3a), 1 minuto (figura 3b) y 6 minutos (figura 3c) después de la inyección. En las figuras, la imagen superior (distinta de las imágenes de control) se genera usando un preparado de microburbujas incluyendo un perfluoropoliéter, C_{5}F_{12}O_{4}, mientras que la imagen inferior se genera usando un preparado de microburbujas incluyendo perfluorohexano, C_{6}F_{14}.

Descripción detallada de la invención I. General

En el sentido en que se usa aquí, se considera que las microburbujas son burbujas de gas en un medio acuoso que tienen un diámetro entre aproximadamente 0,5 y 300 \mum, teniendo preferiblemente un diámetro no superior a aproximadamente 200, 100, o 50 \mum. Las microburbujas pueden tener o no una capa o recubrimiento en la interface gas/líquido. Si está presente, el recubrimiento puede tener una o varias moléculas de grosor. Además, las microburbujas pueden ser atrapadas por una capa bimolecular (como en el caso de liposomas unilamelares), o pueden ser atrapadas por varias capas de bicapas (vesículas multilamalares). Las microburbujas de la presente invención también puede estar rodeadas por estructuras más permanentes en forma de envoltura tal como proteínas desnaturalizadas.

Como las emulsiones se caracterizan en general como una dispersión de dos o más fluidos inmiscibles estabilizados por una interface de surfactante, las realizaciones de la presente invención conteniendo surfactante son en esencia emulsiones de gas, siendo la fase discontinua de la emulsión un gas, en vez de un líquido. En consecuencia, el término "emulsión de gas", en el sentido en que se usa en la presente memoria, incluye una dispersión de una pluralidad de microburbujas de gas en un medio acuoso con o sin una interface de surfactante. Es decir, las emulsiones de gas de la presente invención son simplemente preparados de microburbujas incluyendo un fluoroéter.

Para uso intravascular, el tamaño óptimo de burbuja se determina por dos cuestiones contrarias. Las burbujas más pequeñas son efectivas al circular a través de pequeños vasos sanguíneos y capilares, pero la ecogenicidad de ultrasonido depende fuertemente del tamaño de burbuja. Por lo tanto, las microburbujas adecuadas para mejora vascular del contraste por ultrasonido son preferiblemente de aproximadamente 1-10 \mum de diámetro, prefiriéndose especialmente 3-5 \mum.

II. Selección de gases de microburbujas y combinaciones de gases

La corta duración de la mayoría de los preparados de microburbujas se produce en parte por la mayor presión de gas dentro de la burbuja, que resulta de las fuerzas de tensión superficial que actúan en la burbuja. Esta elevada presión interna aumenta a medida que se reduce el diámetro de la burbuja. La mayor presión interna del gas obliga al gas dentro de la burbuja a disolverse, dando lugar a aplastamiento de burbujas cuando el gas se fuerza a solución. La ecuación de Laplace, \DeltaP=2\sigma/r, (donde \DeltaP es la mayor presión de gas dentro de la burbuja, \sigma es la tensión superficial de la película de burbuja, y r es el radio de la burbuja) describe la presión ejercida en una burbuja de gas por la superficie o película de burbuja circundante. La presión de Laplace es inversamente proporcional al radio de la burbuja; así, cuando la burbuja se encoge, aumenta la presión de Laplace, aumentando la velocidad de difusión de gas fuera de la burbuja y la velocidad de encogimiento de la burbuja.

La fórmula de Quay para la duración de la burbuja (Ecuación 1) ignora este factor. Se obtienen conclusiones diferentes con respecto a la idoneidad del gas cuando se considera el efecto de la presión Laplace de la burbuja en unión con el hecho de que la sangre contiene naturalmente algunos gases, tal como nitrógeno, a presión casi atmosférica. Más específicamente, conduce a la conclusión de que una mezcla de gases de un "gas modificador primario" tal como nitrógeno, o aire, u otro gas naturalmente abundante en la sangre, en combinación con un "agente osmótico de gas" de baja solubilidad en agua y alta presión de vapor da lugar a duración óptima de la burbuja. Algunas realizaciones de tales mezclas de gas se describen en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos, en tramitación, números de serie 08/099.951; 08/284.083; y 08/395.680 incorporadas a la presente memoria por referencia.

La influencia estabilizante de combinaciones adecuadas de gas se puede entender más fácilmente mediante una explicación de algunas burbujas hipotéticas en solución acuosa. Se puede considerar que todas las burbujas explicadas están rodeadas por una capa de surfactante reductor de la tensión superficial. Sin embargo, se considerará los efectos de gas o combinaciones de gases con diferentes solubilidades, permeabilidades de la capa de la membrana de surfactante, y concentraciones externas.

Las interacciones físicas del gas modificador primario, el agente osmótico secundario, y el medio se pueden incorporar a una teoría general del comportamiento de la burbuja. En una solución conteniendo una concentración relativamente alta del gas modificador primario (en comparación con la concentración en solución del agente osmótico de gas), las duraciones de la burbuja se pueden determinar teóricamente como una función de algunas características físicas del agente osmótico de gas secundario.

Considérese una microburbuja de radio r, conteniendo dos gases ideales: aire (nitrógeno) (n_{a} moles) y agente osmótico (n_{F} moles). La microburbuja está en un medio infinito de agua, que no contiene agente osmótico y está saturada con un suministro infinito de aire. El aire es mucho más soluble en agua y sale rápidamente de la microburbuja. Tratando la microburbuja de manera análoga a una membrana semipermeable, podemos considerar que el potencial químico de aire en la microburbuja es el mismo que en el infinito, mientras que el potencial químico del fluorocarbono en la microburbuja es más alto que en el infinito. El equilibrio mecánico al gradiente de presión a través de la interface se supone que es rápido. Así, la difusión del agente osmótico fuera de la microburbuja es lo que determina la duración de la microburbuja. La presión dentro de la microburbuja es la suma de las presiones parciales del aire y el
fluorocarbono:

(3)p^{b} = p_{F}{}^{b} + p_{a}{}^{b}

Dado que el aire es muy soluble en el medio acuoso, y se difunde a y de la burbuja rápidamente, el flujo másico neto de aire es pequeño, y la presión parcial del aire dentro de la microburbuja es aproximadamente igual a la presión del aire atmosférico aplicada al medio acuoso. Esto significa que la presión Laplace excesiva se debe al agente osmótico solamente:

(4)p_{F}^{b} = \frac{2\sigma}{r} = \frac{n_{F}}{\frac{4}{3}\pi \ r^{3}} RT

Además, el flujo másico difusional de estado de régimen J (mol/s) del agente osmótico de una partícula esférica al medio con concentración cero en el medio es igual a:

(5)J = 4\pi \ r^{2} \ D \frac{C_{F,subsurf}}{r}

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Aquí D es el coeficiente de difusión del agente osmótico en agua, y C_{F,subsurf} es la concentración subsuperficial de equilibrio de agente osmótico en agua. Suponemos la concentración subsuperficial de agente osmótico en agua está en equilibrio con el fluorocarbono en la microburbuja. Dado que el vapor es subsaturado, la concentración subsuperficial del agente osmótico de microburbuja es menor que su concentración saturada, y se refiere a la presión interna de vapor del agente osmótico como sigue:

(6)C_{F,subsurf} = C_{F,sat}(T)\frac{p_{F}^{b}}{p_{F,sat}(T)} = C_{F,sat}(T)\frac{2\sigma}{p_{F,sat}(T)r}

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De las ecuaciones 4, 5, y 6, se sigue que:

(7)\frac{d}{dt} r^{2} = 3 DRT\frac{C_{F,sat}}{p_{F,sat}}

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Obsérvese que la combinación

RT\frac{C_{F,sat}}{p_{F,sat}}

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es adimensional y tiene dentro de ella la relación de la presión de vapor de agente osmótico saturado a la correspondiente solubilidad de equilibrio de agente osmótico en agua. Esta relación se denomina el coeficiente de Ostwald (denominado frecuentemente "L"). El cuadrado del radio de microburbuja disminuye con el tiempo a una velocidad proporcional al coeficiente de Ostwald del agente osmótico de gas. Por consiguiente, los agentes osmóticos de gas con bajos coeficientes Ostwald proporcionan excelente longevidad de la burbuja. El coeficiente de Ostwald del agente osmótico de gas es preferiblemente menos de aproximadamente 500 x 10^{-6}, 100 x 10^{-6}, o 50 x 10^{-6}, muy preferiblemente menos de aproximadamente 40 x 10^{-6}, 30 x 10^{-6}, 20 x 10^{-6}, 10 x 10^{-6}, 5 x 10^{-6}, o 1 x 10^{-6}.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Coeficientes de Ostwald y presiones de vapor a 25°C

1

2

La Tabla 1 muestra las solubilidades, presiones de vapor y coeficientes Ostwald de varios compuestos, incluyendo algunos fluorocarbonos biocompatibles. La Tabla 1 ilustra que el perfluorobutano y perfluoropentano, que son gases a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica, y que Quay y Schneider contemplan como gases de burbuja, tienen bajos coeficientes Ostwald, y por lo tanto también funcionan adecuadamente como agentes osmóticos de gas en unión con un gas modificador primario. Sin embargo, la capacidad de considerar compuestos candidatos que son líquidos a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica permite la selección de algunos compuestos óptimos de bajo coeficiente de Ostwald que no se han considerado previamente de ninguna forma adecuada para preparados de microburbujas.

Deberá recordarse que la Ecuación 7 es válida para burbujas conteniendo combinaciones de gas, donde uno de los gases ya está presente en el flujo sanguíneo, y donde dicho gas (el "gas modificador primario") se puede difundir a través de la interface gas/líquido mucho más rápidamente que el otro gas (el "agente osmótico de gas") en la combinación. Solamente entonces la presión parcial del agente osmótico de gas en la burbuja es igual a solamente la presión Laplace en vez de la presión total dentro de la burbuja. Dado que la presión Laplace puede ser inferior a 1 atmósfera (al menos para gran porcentaje de la duración de burbuja), es posible usar agentes osmóticos de gas que son líquidos a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica. Tales compuestos no formarían burbujas sin la presencia adicional del gas modificador primario.

Por otra parte, aunque el agente osmótico de gas puede ser un líquido a la temperatura del cuerpo, su presión de vapor saturado debe ser suficientemente grande de manera que la presión Laplace no fuerce inmediatamente el agente osmótico de gas en la burbuja a condensarse a un líquido. La presión de vapor saturado del agente osmótico de gas es preferiblemente superior a aproximadamente 100 torr. Los hidrocarbonos perfluorados, previamente contemplados como gases de llenado de microburbujas tienen en general solubilidades en agua y presiones de vapor saturado correlacionadas. Es decir, elegir un fluorocarbono con reducida solubilidad en agua también significa elegir un fluorocarbono con reducida presión de vapor saturado.

En esta invención, describimos una clase previamente no considerada de compuestos que combinan una reducida solubilidad en agua sin una presión de vapor saturado considerablemente reducida, y así estos compuestos tienen coeficientes de Ostwald inesperadamente bajos. Estos compuestos son los mono- y poliéteres fluorados. Se sabe que los mono- y poliéteres fluorados son seguros y no tóxicos. También se conoce en la técnica (D. D. Lawson y otros, J. Fluorine Chem. 12, p 221 (1978)) que estos compuestos tienen una presión de vapor muy alta y bajo punto de ebullición a un número dado de átomos de carbono. Así, el punto de ebullición y presión de vapor saturado de un poliéter fluorado son casi los mismos que los de su análogo de fluorocarbono con el mismo número de carbonos.

Sin embargo, la solubilidad en agua, y por lo tanto el coeficiente de Ostwald, de los fluoroéteres es menor que la de los análogos de fluorocarbono - el valor disminuye un factor de 2-3 con cada átomo de oxígeno añadido. Normalmente, cabría esperar que la adición de un átomo de oxígeno capaz de unión de hidrógeno a agua condujese a un aumento de solubilidad. Se ha hallado experimentalmente que se puede preparar emulsiones de gas de mejora del contraste de duración especialmente larga cuando las burbujas de gas contienen aire o nitrógeno mezclado con un fluoromono- o poliéter. Por consiguiente, se ha hallado que perfluorodiglime, CF_{3}(OCF_{2}CF_{2})_{2}OCF_{3}, perfluoromonoglime, CF_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, perfluorodietiléter, C_{2}F_{5}OC_{2}F_{5}, perfluoroetilmetiléter, CF_{3}OC_{2}F_{5}, perfluorodimetiléter, CF_{3}OCF_{3}, y perfluoropoliéteres tales como CF_{3}OCF_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{3}OCF_{3} y CF_{3}(OCF_{2})_{4}OCF_{3} son agentes osmóticos de gas especialmente adecuados.

Una amplia variedad de éteres fluorados tienen las propiedades antes descritas que los hacen especialmente adecuados como agentes osmóticos de gas para estabilizar emulsiones de gas. Dependiendo del número de átomos de carbono, los éteres fluorados pueden ser gases o líquidos a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica. Los éteres fluorados que son gases a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica también son útiles como el único componente gaseoso de un preparado de emulsión de gas. No se requiere un gas modificador primario, aunque mejora la eficacia de las emulsiones de gas hechas con todos los agentes osmóticos de gas, si el éter fluorado usado es un gas a la temperatura del cuerpo y presión atmosférica. Además, los agentes osmóticos de éter fluorado útiles pueden estar completamente o sólo parcialmente fluorados. Algunos de los éteres fluorados parcialmente hidrogenados que son útiles como agentes osmóticos de gas según la presente invención son: CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CF_{3}CH_{2}OCH_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}
CHF_{2}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CHFCF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, CHF_{2}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}
OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CF_{3}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}OCF(CF_{3})_{2}, CHF_{2}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}O
CH_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CH_{2}F, CH_{3}OCH_{2}CF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCH_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CHF_{2}OCH_{2}CF_{3},
CHF_{2}OCHFCF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CF_{3} y CF_{3}OCHFCF_{3}.

Una vez elegido un gas adecuado de bajo coeficiente de Ostwald, preferiblemente un éter fluorado, se puede formar de varias formas microburbujas que incorporan el gas, con y sin una envuelta o capa interfacial de surfactante, como se describe con detalle a continuación.

III. Formación y encapsulado de microburbujas

Los métodos de preparación de microburbujas incluyen la formación de microesferas particuladas mediante la ultrasonicación de albúmina u otra proteína como se describe en las Solicitudes de Patente Europea 0.359.246 y 0.633.030 de Molecular Biosystems, Inc.; el uso de agentes tensioactivos y agentes de aumento de la viscosidad como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.446.442; microburbujas no liposómicas, recubiertas de lípido, como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.684.479; liposomas que tienen gases atrapados como se describe en las Patentes de Estados Unidos números 5.088.499 y 5.123.414; el uso de compuesto anfipáticos como se describe en la Patente de Estados Unidos número 5.445.813; el uso de suspensiones lípidas como se describe en la Solicitud publicada PCT WO 96/06234; el uso de surfactantes laminarizados como se describe en las Patentes de Estados Unidos números5.271.928 y 5.380.519; el uso de microparticulados como se describe en las Patentes de Estados Unidos números 4.442.843, 5.141.738 y 4.657.756; y el uso de microesferas particuladas de albúmina como se describe en la Patente de Estados Unidos número 4.718.433. La descripción de cada una de las patentes y solicitudes anteriores se incorpora a la presente memoria por referencia.

También apreciarán los expertos en la materia que las emulsiones de gas de la presente invención incluyen preparados de microburbujas de gas libres incluyendo fluoroéteres. Es decir, en realizaciones seleccionadas, las emulsiones de gas de la presente invención se pueden formar sin el uso de un surfactante como se describe en las Patentes de Estados Unidos números 5.393.524 y 5.049.688 que se incorporan aquí por referencia.

Los preparados de microburbujas se pueden preparar usando sonicación. La sonicación se puede realizar de varias formas. Por ejemplo, un vial conteniendo una solución surfactante y gas en el espacio superior del vial puede ser sonicado mediante una membrana fina. Preferiblemente, la membrana tienen menos de aproximadamente 0,5 o 0,4 mm de grosor, y más preferiblemente menos de aproximadamente 0,3 o incluso 0,2 mm de grosor, es decir, más fina que la longitud de onda de ultrasonido en el material, para realizar la transmisión aceptable y minimizar el calentamiento de la membrana. La membrana se puede hacer de materiales tal como caucho, Teflon, mylar, uretano, película aluminizada, o cualquier otra película de polímero natural o sintético sónicamente transparente o material peliculígeno. La sonicación se puede hacer contactando o incluso presionando la membrana con una sonda ultrasónica o un "haz" de ultrasonidos enfocado. La sonda ultrasónica puede ser desechable. En cualquier caso, la sonda se puede colocar contra o introducir a través de la membrana y al líquido. Una vez que se lleva a cabo la sonicación, la solución de microburbuja se puede retirar de un vial y administrar al paciente.

La sonicación también se puede realizar dentro de una jeringa con un conjunto aspirante con vibración ultrasónica de baja potencia en la jeringa, parecido a una impresora de chorro de tinta. Además, una jeringa o vial se puede colocar en y sonicar dentro de un baño ultrasónico de potencia baja que enfoca su energía en un punto dentro del recipiente.

También se describe la formación mecánica de microburbujas. Por ejemplo, se puede formar burbujas con una válvula mecánica de alta cizalladura (o jeringa de aguja doble) y dos jeringas, o un conjunto aspirador en una jeringa. Se puede usar incluso agitación simple. Las técnicas de burbujas de encogimiento descritas a continuación son especialmente adecuadas para burbujas formadas mecánicamente, que tienen menor entrada de energía que las burbujas sonicadas. Tales burbujas tendrán típicamente un diámetro mucho más grande que el agente biocompatible de formación de imágenes deseado en último término, pero se puede hacer que se encojan a un tamaño apropiado según la presente invención.

También se puede formar microburbujas mediante la utilización de una emulsión de agente osmótico líquida supersaturada con un gas modificador a presión elevada introducido en una solución surfactante. Este método de producción funciona de forma similar a la apertura de una bebida de soda, donde el gas forma espuma a la liberación de la presión formando las burbujas.

También se puede formar burbujas de forma parecida a la formación de espuma de espuma de afeitar, con perfluorobutano, freon, u otro material análogo que hierva cuando se libere la presión. Sin embargo, aquí es deseable que el líquido emulsionado hierva suficientemente bajo o que contenga numerosos lugares de nucleación de burbujas para evitar el supercalentamiento y la supersaturación de la fase acuosa. Esta supersaturación conducirá a la generación de un pequeño número de burbujas grandes en un número limitado de lugares de nucleación en vez del gran número deseado de burbujas pequeñas (una por cada gotita).

En alternativa, se puede poner una torta liofilizada de surfactante y reactivos de abultamiento producida con una estructura fina de poros en un vial con una solución estéril y un espacio superior con una mezcla de gases osmóticos. La solución se puede congelar rápidamente para producir una estructura fina de cristales de hielo y, por lo tanto, a la liofilización produce poros finos (vacíos de donde se extrajeron los cristales de hielo).

Se puede usar alternativamente cualesquiera estructuras o materiales disolubles o solubles de formación de vacíos, tal como azúcares en polvo o granulados. No es necesario que tales materiales estructurales definan una pluralidad de vacíos antes de la adición de un medio líquido. Además, aunque es preferible que las estructuras de formación de vacío incluyan un surfactante, no se requiere para llevar a la práctica la presente invención. En esta realización, donde el material formador de vacíos no se hace de o no contiene surfactante, se suministra surfactante y líquido al recipiente con las estructuras y el gas o gases deseados. A la reconstitución, estos vacíos atrapan el gas osmótico y, con la disolución de la torta sólida o polvo, forman microburbujas con el gas o gases que contienen.

En otro método, se puede estabilizar partículas secas conteniendo vacíos u otras estructuras (tal como esferas huecas o panales de miel) que se disuelven o hidratan rápidamente, preferiblemente en una solución acuosa, por ejemplo, albúmina, cristales microfinos de azúcar, azúcar hueco secado por pulverización, sales, esferas de surfactante huecas, esferas de polímero porosas secadas, ácido hialurónico poroso secado, o esferas ácido hialurónico sustituidas, o incluso microesferas de lactosa secadas comercializadas con un agente osmótico de gas. Además, aunque las microesferas de proteína desnaturalizada no son especialmente solubles, son compatibles con la presente invención y se pueden usar como estructuras conteniendo vacíos según las ideas de la presente invención.

Por consiguiente, en un aspecto amplio, la presente invención proporciona composiciones precursoras de microburbujas incluyendo:

un material estructural que define una pluralidad de vacíos;

un gas o una mezcla de gases incluyendo un fluoroéter dispersado en dichos vacíos; y

un surfactante, donde dicho material estructural, dicho gas o mezcla de gases y dicho surfactante están adaptados para formar microburbujas a la adición de un líquido a dicho recipiente.

Se apreciará que, en el sentido en que se usa aquí, el término "material estructural" significará cualquier material que defina una pluralidad de vacíos que promueva la formación de burbujas a la combinación con un medio líquido. Tales materiales estructurales, que incluyen tanto estructuras conteniendo vacíos como formadoras de vacíos, pueden ser solubles o insolubles en un entorno acuoso. Los materiales estructurales ejemplares que son compatibles con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, polvos secados por pulverización, azúcares en polvo o gránulos, microesferas de proteínas incluyen microesferas de proteínas desnaturalizadas, tortas liofilizadas, polvos liofilizados, sales, esferas de surfactante huecas, esferas poliméricas porosas secadas y ácido hialurónico poroso secado. En realizaciones especialmente preferidas, el material estructural incluye un surfactante.

Preferiblemente, las composiciones de emulsión de gas que incorporan gases de bajo coeficiente de Ostwald se preparan secando por pulverización una dispersión acuosa que contiene un monómero o polímero hidrófilo o su combinación. Este procedimiento también se describe con detalle en la Solicitud de Patente de Estados Unidos, en tramitación, número de serie 08/405.477. En este caso, se forma una composición formadora de burbujas secando por pulverización una dispersión acuosa de un radical hidrófilo tal como almidón, incluyendo también preferiblemente un surfactante, para formar un material estructural. Más en concreto, para formar polvo de vainas porosas secas, huecas, aproximadamente microesféricas de aproximadamente 1 a 10 \mum de diámetro, con espesores de vaina de aproximadamente 0,2 \mum. Las secadoras por pulverización comercializadas son conocidas por los expertos en la materia, y los parámetros adecuados para cualquier dispersión concreto de almidón/surfactante se pueden determinar fácilmente mediante verificación empírica estándar, con la debida referencia a los ejemplos que siguen. Después de la formación, se hace que el gas deseado permee el material estructural o las microesferas secas poniendo las microesferas en un vial, extrayendo el aire, y sustituyéndolo por el gas o mezcla de gases deseados.

El radical hidrófilo en la solución a secar por pulverización puede ser, por ejemplo, un hidrato de carbono, tal como glucosa, lactosa, o almidón. También se contempla polímeros tal como PVA o PVP. Se ha hallado que varios almidones y almidones derivados son especialmente adecuados. Los almidones especialmente preferidos para uso en la formación de microburbujas incluyen los que tienen un peso molecular superior a aproximadamente 500.000 daltons o un valor de equivalencia de dextrosa (DE) de menos de aproximadamente 12. El valor DE es una medición cuantitativa del grado de hidrólisis del polímero de almidón. Es una medida de potencia reductora en comparación con un estándar de dextrosa de 100. Cuanto más alto sea EL DE valor, tanto mayor es el grado de hidrólisis de almidón. Tales almidones preferidos incluyen almidones vegetales de calidad alimenticia del tipo comercializado en la industria alimentaria, incluidos los comercializados bajo las marcas comerciales N-LOK y CAPSULE por National Starch and Chemical Co., (Bridgewater, NJ); almidones derivados, tal como almidón de hidroxietilo (disponible bajo las marcas comerciales HETASTARCH y HESPAN de Du Pont Pharmaceuticals, M-Hidroxietilalmidón de Ajinimoto, Tokyo, Japón). Sin embargo, debido a las características de estabilización especialmente ventajosas, se prefieren los almidones con un peso molecular de 500.000 o más (obsérvese que los almidones de cadena corta se secan bien por pulverización y se pueden usar para producir microburbujas según la presente invención). El monómero o polímero hidrófilo está presente en esta realización de la solución precursora en un rango de aproximadamente 0,1% a 10% p/v de solución, habiéndose hallado que de aproximadamente 1% a 5% p/v es especialmente adecuado.

Preferiblemente, la dispersión acuosa también incluye un surfactante opcional o mezcla de surfactantes, previsto en aproximadamente 0,01% a 20% p/v de solución. Se conoce y se puede usar muchos surfactantes y mezclas de surfactantes. Los surfactantes se pueden seleccionar del grupo que consta de fosfolípidos, fosfocolinas, lisofosfolípidos, surfactantes iniónicos, surfactantes neutros o aniónicos, surfactantes fluorados, que pueden ser neutros o aniónicos, y combinaciones de tales agentes emulsionantes o espumantes. Otros ejemplos específicos de surfactantes incluyen copolímeros bloque de polioxipropileno y polioxietileno (un ejemplo de tal clase de compuestos es Pluronic, tal como Pluronic F-68), ésteres de azúcar, alcoholes grasos, óxidos de aminas alifáticas, ésteres alifáticos de ácido hialurónico, sales de éster alifático de ácido hialurónico, dodecil poli(etilenoxi)etanol, nonilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, almidones derivados, ésteres de ácidos grasos de hidroxi etil almidón, sales de ácidos grasos, almidones vegetales para alimentos comerciales, ésteres de dextrano ácido grasos, ésteres de sorbitol ácido graso, gelatina, albúminas de suero, y sus combinaciones. También se contempla ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, tal como estearatos de polioxietileno, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán polioxietilado, oxiestearato de glicerol polietilen glicol, ricinoleato de glicerol polietilen glicol, esteroles de semilla de soja etoxilados, aceites de ricino etoxilados, y sus derivados hidrogenados. Además, alquilglucósidos iniónicos tal como Tweens®, Spans® y Brijs® también caen dentro del alcance de la presente invención. Los Spans incluyen tetraoleato de sorbitán, tetraestearato de sorbitán, triestearato de sorbitán, tripalmitato de sorbitán, trioleato de sorbitán, y distearato de sorbitán. Tweens incluyen polioxietileno triestearato de sorbitán, polioxietileno tripalmitato de sorbitán, polioxietileno trioleato de sorbitán. La familia Brij es otra categoría útil de materiales, que incluye polioxietileno 10 estearil éter. También se puede usar surfactantes aniónicos, en particular ácidos grasos (o sus sales) que tienen de 6 a 24 átomos de carbono. Un ejemplo de un surfactante aniónico adecuado es ácido oleico, o su sal, oleato de sodio. También son adecuados surfactantes catiónicos y sus sales, tal como cloruro de dodeciltrimetilamonio.

Se apreciará por lo anterior que se puede usar una amplia gama de surfactantes. En efecto, se puede usar en la presente invención virtualmente cualquier surfactante (incluyendo los todavía por desarrollar) o combinación de surfactantes. El surfactante óptimo para una aplicación dada se puede determinar mediante estudios empíricos que no requieren experimentación excesiva. En consecuencia, al poner en la práctica la técnica de la presente invención, se podría seleccionar un surfactante primariamente en base a propiedades tal como la biocompatibilidad.

Se ha hallado especialmente adecuado que la solución contenga una mezcla de surfactantes incluyendo un fosfolípido hidrófobo como un primer surfactante y al menos un segundo surfactante más hidrófilo adicional. Preferiblemente, el fosfolípido hidrófobo tiene al menos una cadena acilo con un total de al menos aproximadamente 10 átomos de carbono (por ejemplo, un didecanoil fosfolípido). En algunas realizaciones, el primer surfactante fosfolípido tendrá cadenas acilo desde aproximadamente 10 o 14 a aproximadamente 20 o 24 átomos de carbono. Por ejemplo, se puede usar dipalmitoilfosfatidicolina (incluyendo dos cadenas acilo, incluyendo cada una 16 átomos de carbono). La cadena acilo puede ser hidrogenada o fluorada. También se contempla otros grupos fosfolípido principales. Por ejemplo, las fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, o fosfatidiletanolaminas tendrán propiedades adecuadas para la presente invención. Las combinaciones de tales fosfolípidos también pueden incluir el "primer surfactante", así como productos fosfolípidos derivados naturalmente tal como huevo o lecitina de soja, o surfactantes pulmonares. Además, el primer surfactante fosfolípido se puede complementar con otros surfactantes altamente insolubles en agua tal como di-, tri-, y tetra-ésteres de sacarosa. El colesterol también puede complementar el primer surfactante, y se ha hallado útil al promover la estabilidad cuando se facilita en un rango desde aproximadamente 0,01 a 0,5 p/p de colesterol a fosfolípido. Preferiblemente, las cadenas acilo del fosfolípido son saturadas, aunque los grupos acilo insaturados caen también dentro del alcance de la presente invención. El primer surfactante se facilita preferiblemente en un rango desde aproximadamente 0,005% a 20% p/v de la solución, muy preferiblemente del orden de 0,02% a 10% p/v.

Se ha hallado que es ventajoso utilizar una mezcla fosfolípida incluyendo un fosfolípido de cadena acilo larga relativamente hidrófobo en combinación con un fosfolípido de cadena más corta que es más hidrófilo que el primer fosfolípido. Como ejemplo específico, un primer fosfolípido que tiene cadenas acilo con 12 o 14 átomos de carbono puede estar provisto de un segundo fosfolípido como un cosurfactante que tiene cadenas acilo con ocho o diez átomos de carbono.

Se ha hallado especialmente ventajoso proporcionar fosfolípido incluyendo cadenas acilo de 12 átomos de carbono como el primer o segundo surfactantes. Por ejemplo, un fosfolípido con cadenas acilo de 12 átomos de carbono puede incluir el primer surfactante, y un éster de azúcar o compuesto Pluronic puede incluir el segundo surfactante. Como otra opción, un fosfolípido con cadenas acilo de 16 átomos de carbono puede incluir el primer surfactante, y un fosfolípido con cadenas acilo de 12 átomos de carbono puede incluir el segundo surfactante.

El producto secado por pulverización producido en último término es un productor más eficaz de burbujas si se dispersa un agente de inflado, preferiblemente un fluorocarbono tal como Freon 113, en la solución de almidón/surfactante descrita anteriormente. El agente de inflado puede ser cualquier material que se convierta en un gas durante el proceso de secado por pulverización. El agente de inflado se dispersa por toda la solución de surfactante, usando, por ejemplo, un microfluidizador comercializado a una presión de aproximadamente 5000 a 15.000 psi. Este proceso forma una emulsión convencional compuesta de gotitas submicrométricas de Freon inmiscible en agua (u otro agente de inflado) recubierto con una capa monomolecular de surfactante. La dispersión con esta y otras técnicas es común y conocida por los expertos en la materia.

La inclusión de un agente de inflado en la solución a secar por pulverización da lugar a una mayor señal de ultrasonido por gramo de polvo secado por pulverización formando un mayor número de microesferas huecas. El agente de inflado nuclea la formulación de burbujas de vapor dentro de las gotitas atomizadas de la solución que entra en la secadora por pulverización cuando estas gotitas se mezclan con la corriente de aire caliente dentro de la secadora. Agentes de inflado adecuados son los que supersaturan la solución dentro de las gotitas atomizadas con gas o vapor, a la temperatura elevada de las gotitas secantes (aproximadamente 100°C). Los agentes adecuados incluyen:

1.: Solventes de bajo punto de ebullición (inferior a 100°C) disueltos con miscibilidad limitada con soluciones acuosas, tal como cloruro de metileno, acetona y disulfuro de carbono usados para saturar la solución a temperatura ambiente.

2.: Un gas, por ejemplo CO_{2} o N_{2}, usado para saturar la solución a temperatura ambiente y presión elevada (por ejemplo 3 bar). Las gotitas se supersaturan después con el gas a 1 atmósfera y 100°C.

3.: Emulsiones de líquidos inmiscibles de bajo punto de ebullición (por debajo de 100°C) tal como Freon 113, perfluoropentano, perfluorohexano, perfluorobutano, pentano, butano, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12B2, FC-21, FC-21B1, FC-21B2, FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC-132, FC-133, FC-141, FC-141B, FC-142, FC-151, FC-152, FC-1112, FC-1121 y FC-1131.

Se añade agentes de inflado a la solución de almidón/surfactante en cantidades de aproximadamente 0,5% a 10% v/v de la solución surfactante. Se ha hallado que aproximadamente 3% v/v de agente de inflado produce un polvo secado por pulverización que forma microburbujas adecuadas. El agente de inflado se evapora sustancialmente durante el proceso de secado por pulverización y así no está presente en el polvo final secado por pulverización en cantidades superiores a trazas.

Otros componentes opcionales de esta solución son varias sales u otros agentes dentro de la fase acuosa. Tales agentes pueden incluir ventajosamente modificadores de viscosidad convencionales, soluciones tampón tal como soluciones tampón de fosfato u otras soluciones tampón biocompatibles convencionales o agentes reguladores del pH tal como ácidos o bases, agentes osmóticos (para proporcionar isotonicidad, hiperosmolaridad, o hiposmolaridad). Las soluciones preferidas tienen un pH de aproximadamente 7 y son isotónicas. Cada uno de estos ingredientes adicionales incluye típicamente menos de 5% p/v de solución. Los ejemplos de sales adecuadas incluyen fosfato de sodio (tanto monobásico como dibásico), cloruro de sodio, fosfato cálcico, y otras sales fisiológicamente
aceptables.

Después del secado por pulverización, los varios componentes individuales de las microesferas incluyen preferiblemente las proporciones siguientes del producto final secado por pulverización en % en peso:

Material estructural hidrófilo	1% a 100%
Surfactante	0% a 90%
Sales, solución tampón, etc	0% a 90%

En realizaciones especialmente preferidas, la composición tiene las proporciones siguientes en % en peso:

Material estructural hidrófilo	10% a 60%
Surfactante	0,1% a 10%
Sales, solución tampón, etc	10% a 60%

Como se ha mencionado anteriormente, el gas deseado se hace permear las microesferas secas colocando las microesferas en un vial, que se coloca en una cámara al vacío para evacuar el aire. El aire se sustituye después por el gas o mezcla de gases deseados. El gas se difundirá después a los vacíos de las esferas. La difusión puede ser favorecida por un ciclo de presión o vacío. El vial se sella después por rizado y esteriliza preferiblemente con radiación gamma o calor.

Preferiblemente, el primer gas modificador primario (que puede ser aire o cualquiera de sus gases componentes tal como nitrógeno) y el segundo gas estabilizante osmótico (que tiene preferiblemente bajo coeficiente Ostwald) están presentes respectivamente en una relación molar de aproximadamente 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20 o 1:10 a aproximadamente 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 o 50:1. En una realización especialmente preferida, el gas es nitrógeno que ha sido saturado con perfluorodiglime a 20°C.

Por consiguiente, la presente invención proporciona:

1. Una composición precursora de microburbujas incluyendo un agente osmótico de gas fluoroéter dispersado en una pluralidad de microesferas secadas por pulverización donde las microesferas secadas por pulverización incluyen un surfactante.

2. La composición precursora de microburbujas de 1, donde gas fluoroéter se selecciona del grupo que consta de CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CF_{3}CH_{2}OCH_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}
CHF_{2}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}CHF_{2}, CH_{3}OC
F_{2}CHFCF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, CHF_{2}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CF_{3}OCH_{2}CF_{2}CF_{3},
CH_{3}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}OCF(CF_{3})_{2}, CHF_{2}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}OCH_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CH_{2}F, CH_{3}OCH_{2}CF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CH
F_{2}, CHF_{2}OCH_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CHF_{2}OCH_{2}CF_{3}, CHF_{2}OCHFCF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}
CF_{3}, CF_{3}OCHFCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{3}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})4OCF_{3}, y sus mezclas.

3. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la composición incluye una pluralidad de vacíos.

4. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el surfactante se selecciona del grupo que consta de fosfolípidos, ácidos grasos y copolímeros bloque.

5. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el gas fluoroéter se selecciona del grupo que consta de perfluorodiglime, perfluoromonoglime, perfluoroetilmetiléter, perfluorodietiléter, perfluorodimetiléter, perfluorometiletiléter, C_{4}F_{10}O_{3}, C_{5}F1_{2}0_{4}, C_{6}F1_{4}O_{5}, CF_{3}(OCF_{2}CF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, C_{2}F_{5}OC_{2}F_{5}, CF_{3}OCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}
OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{3}OCF_{3} y CF_{3}(OCF_{2})_{4}OCF_{3}.

6. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la capa de surfactante consta esencialmente de un fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que tiene al menos una cadena acilo que incluye al menos 10 átomos de carbono, e incluyendo al menos aproximadamente 5% p/p de surfactante total, siendo el segundo surfactante más soluble en agua que el primer surfactante.

7. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el primer surfactante incluye una fosfatidilcolina con una o más cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena 12-18 átomos de carbono, y dicho segundo surfactante incluye una fosfatidilcolina con una o más cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena 6 a 12 átomos de carbono.

8. La composición precursora de microburbujas de 1, donde después de la adición de un medio acuoso a la composición precursora de microburbujas, se forman microburbujas de emulsiones de gas.

9. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la composición precursora de microburbujas también contiene gas nitrógeno.

10. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la composición precursora de microburbujas incluye además un gas modificador.

11. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el gas modificador es nitrógeno.

12. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la microburbuja incluye además un primer gas modificador primario donde la relación del primer gas modificador primario al segundo agente osmótico de gas perfluoroéter están presentes respectivamente en una relación molar de 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20, 1:10 a aproximadamente 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 o 50:1.

13. La composición precursora de microburbujas de 1, donde la estructura conteniendo vacíos incluye un polvo.

14. La composición precursora de microburbujas de 1-3, incluyendo además un gas modificador dispersado en la pluralidad de vacíos donde, después de la adición de un medio acuoso, en el que las estructuras conteniendo vacíos son sustancialmente solubles, se forman microburbujas incluyendo el agente osmótico de gas fluoroéter y gas modificador.

15. La composición precursora de microburbujas de 1, donde las microesferas incluyen un carbohidrato adicional.

16. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el carbohidrato adicional es un azúcar.

17. La composición precursora de microburbujas de 1, donde el surfactante se selecciona del grupo que consta de surfactantes no iónicos, surfactantes neutros, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutros y sus combinaciones.

18. La composición precursora de microburbujas de 1, donde las microesferas secadas por pulverización son huecas y esféricas.

19. La composición precursora de microburbujas de 1, donde las microesferas tienen un diámetro de entre 1 y 15 micras.

IV. Empaquetado y uso

Se apreciará que se puede preparar kits para uso al hacer los preparados de microburbujas de la presente invención. Estos kits pueden incluir un recipiente conteniendo el gas o gases descritos anteriormente para formar las microburbujas, el líquido y el surfactante. El recipiente puede contener todos los componentes estériles secos, y el gas, en una cámara, con el líquido acuoso estéril en una segunda cámara del mismo recipiente. Alternativamente, el surfactante se puede solubilizar en el líquido antes de la adición.

Los recipientes de vial de dos cámaras adecuados están disponibles, por ejemplo, bajo las marcas comerciales WHEATON RS177FLW o S-1702FL de Wheaton Glass Co., (Millville, NJ). Otro ejemplo lo ofrece el sistema de jeringa prellenada de cámara doble B-D HYPAK líquido/seco 5+5 ml (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; descrito en la Patente de Estados Unidos número 4.613.326). Las ventajas de este sistema incluyen:

1. Uso conveniente;

2. El agente osmótico de gas acuoso-insoluble está sellado por una cámara de solución acuosa en un lado y una zona sumamente pequeña de elastómero que sella la aguja en el otro lado; y

3. Se puede encajar una aguja de filtración tal como Monoject #305 (Sherwood Medical, St. Louis, MO) sobre la jeringa al tiempo de la fabricación para garantizar que no se inyecten sólidos disueltos.

El uso de la jeringa de dos cámaras para formar microburbujas se describe en el Ejemplo VIII.

Los expertos en la técnica pueden apreciar que también caen dentro del alcance de la presente invención otros sistemas de reconstitución de dos cámaras capaces de combinar el polvo secado por pulverización con la solución acuosa de manera estéril. En tales sistemas, es especialmente ventajoso que la fase acuosa se pueda interponer entre el gas osmótico insoluble en agua y el entorno, para aumentar duración en almacén del producto. Cuando ya no está presente en el recipiente un material necesario para formar las microburbujas, se puede envasar con los otros componentes del kit, preferiblemente en una forma o recipiente adaptado para facilitar la fácil combinación con los otros componentes del kit.

Los ejemplos de usos particulares de las microburbujas incluyen la formación de imágenes de perfusión del corazón, el tejido miocárdico, y la determinación de características de perfusión del corazón y sus tejidos durante pruebas de esfuerzo o ejercicio, o defectos o cambios de perfusión debidos a infarto de miocardio. Igualmente, el tejido miocárdico se puede ver después de la administración oral o venosa de drogas diseñadas para aumentar el flujo sanguíneo a un tejido. Además, también se puede mejorar la visualización de cambios de tejido miocárdico debidos a o durante varias intervenciones, tal como injerto de vena de tejido coronario, angioplastia coronaria, o el uso de agentes trombolíticos (TPA o estreptoquinasa). Cuando se pueda administrar convenientemente estos agentes de contraste mediante una vena periférica para mejorar la visualización de todo el sistema circulatorio, también contribuirán al diagnóstico de patologías vasculares generales y a la capacidad de supervisar ultrasónicamente la viabilidad del tejido placental.

La presente invención describe un método para formación de imágenes ultrasónica armónica usando las emulsiones de gas descritas como agentes de contraste. Las burbujas de la presente invención son especialmente útiles en métodos de formación armónica de imágenes como los descritos en la Solicitud de Patente de Estados Unidos, en tramitación, 08/314.074. Optimizando la capacidad de las microburbujas descritas de transformar la frecuencia de la radiación ultrasónica a la que se someten (la fundamental), se mejora la formación de imágenes. Así, la presente invención describe el uso de microburbujas capaces de generar armónicas a amplitudes de excitación ultrasónica médicamente útiles.

También se deberá recalcar que la presente invención tiene aplicaciones más allá de la formación de imágenes por ultrasonido. En efecto, la invención es suficientemente amplia para abarcar el uso de emulsiones de gas conteniendo fosfolípidos en cualquier sistema, incluyendo aplicaciones no biológicas.

Se entenderá además que se puede incluir otros componentes en las formulaciones de microburbuja de la presente invención. Por ejemplo, se puede añadir agentes osmóticos, estabilizantes, queladores, soluciones tampón, moduladores de viscosidad, modificadores de solubilidad en el aire, sales, y azúcares para modificar las suspensiones de microburbujas para máxima duración y efectividad de la mejora del contraste. Consideraciones tales como la esterilidad, isotonicidad, y biocompatibilidad puede controlar el uso de tales aditivos convencionales a composiciones inyectables. Los expertos en la técnica entenderán que el uso de tales agentes y las cantidades específicas, relaciones, y tipos de agentes se pueden determinar empíricamente sin experimentación excesiva.

Cualquiera de los preparados de microburbujas de la presente invención puede ser administrado a un vertebrado, tal como una ave o un mamífero, como un agente de contraste para formar imágenes ultrasónicas de porciones del vertebrado. Preferiblemente, el vertebrado es un humano, y la porción de la que se forman imágenes es la vasculatura del vertebrado. En esta realización, se introduce por vía intravascular en el animal una pequeña cantidad de microburbujas (por ejemplo, 0,1 ml/kg [2 mg/kg de polvo secado por pulverización] en base al peso del cuerpo del vertebrado). También se pueden utilizar otras cantidades de microburbujas, tal como desde aproximadamente 0,005 ml/kg a aproximadamente 1,0 ml/kg. La formación de imágenes del corazón, arterias, venas, y órganos ricos en sangre, tal como hígado y riñones se puede realizar ultrasónicamente con esta técnica.

V. Ejemplos

La descripción anterior se entenderá más plenamente con referencia a los ejemplos siguientes. Sin embargo, tales Ejemplos ejemplifican métodos preferidos de llevar a la práctica la presente invención y no limitan el alcance de la invención o las reivindicaciones anexas a la presente memoria.

Ejemplo I Preparación de microburbujas mediante sonicación

Se preparó microburbujas con un tamaño ponderado medio de 5 micras por sonicación de una fase acuosa isotónica conteniendo 2% de Pluronic F-68 y 1% de estearato de sacarosa como surfactantes, aire como un gas modificador y perfluorohexano como el agente osmótico de gas.

En este experimento, se añadió 1,3 ml de una solución de agua estéril conteniendo 0,9% de NaCl, 2% de Pluronic F-68 y 1% de estearato de sacarosa a un vial de 2,0 ml. El vial tenía un espacio superior restante de 0,7 ml conteniendo inicialmente aire. Se utilizó aire saturado con vapor de perfluorohexano (220 torr de perfluorohexano con 540 torr de aire) a 25°C para lavar el espacio superior del vial. El vial se selló con un tabique fino de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,22 mm. El vial se giró horizontalmente, y se presionó suavemente contra el tabique una sonda de sonicación de 3 mm (1/8 pulgada) unida a un sonicador de 50 vatios modelo VC50, que se puede adquirir de Sonics & Materials. En esta posición, el tabique separa la sonda de la solución. Después se aplicó potencia a la sonda y se sonicó la solución durante 15 segundos, formando una solución blanca de microburbujas finamente divididas, que tienen un tamaño ponderado medio de 5 micras medido por un analizador de partículas de dispersión de luz láser Horiba LA-700.

Ejemplo II Secado por pulverización de solución conteniendo fosfolípido

Se preparó un litro de la siguiente solución en agua para inyección: 2,0% p/v Maltrin M-100 maltodextrina (Grain Processing Corp. Muscatine, IA), 0,95% p/v cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO), 1,0% Superonic F-68 (Serva, Heidelberg, Alemania), 1,0% p/v Ryoto Estearato de sacarosa S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japón), y 0,5% Lipoid E-100-3 fosfolípido hidrogenado (Ludwigshafen, Alemania).

Después se secó esta solución por pulverización en un Niro Atomizer Portable Spray Dryer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhagen, Dinamarca) empleando los parámetros siguientes:

Caudal de aire caliente	39,5 CFM
Temperatura del aire de entrada	245°C
Temperatura del aire de salida	100°C
Flujo de aire del atomizador	350 l/minuto
Velocidad de alimentación de líquido	1 l/h

El producto esférico hueco seco tenía un diámetro entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 15 \mum y se recogió en el separador de ciclón como es estándar para esta secadora. Se pesaron alícuotas de polvo (250 mg) e introdujeron en viales de tubo de 10 ml, rarificaron y rociaron con nitrógeno saturado con perfluorohexano a 13°C y sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorohexano pasándolo por tres botellas de lavado de gas llenas de perfluorohexano sumergidas en un baño de agua a 13°C.

A la reconstitución con 5 ml de agua para inyección, se observó numerosas burbujas por microscopía óptica, de un tamaño del orden de 1 a 20 micras. El hecho de que se podía observar muchas burbujas de aproximadamente 1 micra durante un tiempo apreciable demuestra la estabilidad añadida adquirida incluyendo un fosfolípido en la fórmula como un surfactante viscoelástico no newtoniano adicional.

Ejemplo III Emulsión de gas de perfluorodiglime con surfactante de éster de sacarosa/Poloxamer

Se preparó un litro de cada una de las dos soluciones siguientes con los ingredientes siguientes para inyección:

Solución 1

: 3,9% p/v m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 3,25% p/v cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 2,83% p/v fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 0,42% p/v fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Solución 2

: 2,11% p/v Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

: 0,32% p/v Ryoto Estearato de sacarosa S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japón)

: 0,16% p/v Ryoto Estearato de sacarosa S-570 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japón)

Se añadió la solución 2 a mezcladora de alta cizalladura y enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión basta de 30 ml de 1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en 1 litro de la solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a 10.000 psi, 5°C durante 5 pasadas. La emulsión resultante se añadió a la solución 1. Esta mezcla se secó después por pulverización en un Niro Atomizer Portable Spray Dryer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhagen, Dinamarca) empleando los parámetros siguientes:

Caudal de aire caliente	31 CFM
Temperatura del aire de entrada	370°C
Temperatura del aire de salida	120°C
Flujo de aire del atomizador	290 l/minuto
Velocidad de alimentación de la emulsión	1,5 l/h

El producto esférico hueco seco tenía un diámetro entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 15 \mum y se recogió en el separador de ciclón como es estándar para esta secadora. Se pesaron alícuotas de polvo (200 mg) e introdujeron en viales de tubo de 10 ml, rociaron con nitrógeno saturado con perfluorodiglime a 20°C y sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorodiglime pasándolo por tres botellas de lavado de gas llenas de perfluorodiglime sumergidas en un baño de agua a 20°C. La cantidad de vapor de perfluorodiglime por vial era 12-14 mg.

Los viales se reconstituyeron con 5 ml DE agua para inyección después de introducir una aguja de calibre 18 como un agujero de ventilación para liberar la presión cuando se inyectó el agua, formando aproximadamente 6 x 10^{8} burbujas por ml que eran estables in vitro durante varios días.

Se inyectó por vía intravenosa un ml de la suspensión de microburbujas resultante a un conejo de aproximadamente 3 kg instrumentado para supervisar la señal ultrasónica Doppler de su arteria carótida. Un manguito de flujo de 10 MHz (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo System 6 Doppler (Triton Technology Inc.) alimentó la señal RF Dopller a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). El voltaje eficaz (RMS) de la señal calculado por el osciloscopio se transfirió a un ordenador y se ajustó la curva resultante para obtener la intensidad de señal ecogénica máxima y la vida media de las microburbujas en sangre. Las señales antes del contraste eran de menos de 0,1 voltios RMS.

Sesenta segundos después de la inyección, la intensidad de señal era 1,1 V rms, con una constante de desintegración de aproximadamente 0,00859 s^{-1}.

Ejemplo IV Emulsión de gas de perfluorodiglime con surfactante de fosfolípido/Poloxamer

Solución 1

: 36 g m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 30 g cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 26 g fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 3,9 g fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Solución 2

: 4,5 g Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

: 4,5 g Dipalmitoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

Se añadió la solución 2 a una mezcladora de alta cizalladura y enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión basta de 30 ml de 1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en 1 litro de la solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a 10.000 psi, 5°C durante 5 pasadas. La emulsión resultante se añadió a la solución 1. Esta mezcla se secó después por pulverización en un Niro Atomizer Portable Spray Dryer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhagen, Dinamarca) empleando los parámetros siguientes:

Caudal de aire caliente	31 CFM
Temperatura del aire de entrada	325°C
Temperatura del aire de salida	120°C
Flujo de aire del atomizador	290 l/minuto
Velocidad de alimentación de la emulsión	1,5 l/h

Los viales se reconstituyeron con 5 ml agua para inyección después de introducir una aguja de calibre 18 como un agujero de ventilación para liberar la presión cuando se inyectó el agua, formando aproximadamente 3 x 10^{8} burbujas por ml que eran estables in vitro durante varios días.

Se inyectó por vía intravenosa un ml de la suspensión de microburbujas resultante a un conejo de aproximadamente 3 kg instrumentado para supervisar la señal ultrasónica Doppler de su arteria carótida. Un manguito de flujo de 10 MHz (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo System 6 Doppler (Triton Technology Inc.) alimentó la señal RF Doppler a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). El voltaje eficaz (RMS) de la señal calculado por el osciloscopio se transfirió a un ordenador y se ajustó la curva resultante para obtener la intensidad de señal ecogénica máxima y la vida media de las microburbujas en sangre. Las señales antes del contraste eran inferiores a 0,1 voltios RMS.

Sesenta segundos después de la inyección, la intensidad de señal era 0,4 V rms, con una constante de desintegración de aproximadamente 0,01835 s^{-1}.

Ejemplo V Emulsión de gas de perfluorodiglime con surfactante de mezcla de fosfolípidos

Solución 1

: 36 g m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 30 g cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 26 g fosfato de sodio, dibásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 3,9 g fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Solución 2

: 4,8 g Dipalmitoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

: 3,4 g Dioctanoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

Se añadió la solución 2 a una mezcladora de alta cizalladura y enfrió en un baño de hielo. Se hizo una suspensión basta de 30 ml de 1,1,2-triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) en 1 litro de solución 2. Esta suspensión se emulsionó usando un microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modelo M-110F) a 10.000 psi, 5°C durante 5 pasadas. La emulsión resultante se añadió a la solución 1. Esta mezcla se secó después por pulverización en un Niro Atomizer Portable Spray Dryer equipado con un atomizador de dos fluidos (Niro Atomizer, Copenhagen, Dinamarca) empleando los parámetros siguientes:

El producto esférico hueco seco tenía un diámetro entre aproximadamente 1 \mum y aproximadamente 15 \mum y se recogió en el separador de ciclón como es estándar para esta secadora. Se pesaron alícuotas de polvo (200 mg) e introdujeron en viales de tubo de 10 ml, rociaron con nitrógeno saturado con perfluorodiglime a 13°C y sellaron. El nitrógeno se saturó con perfluorodiglime pasándolo por tres botellas de lavado de gas llenas de perfluorodiglime sumergidas en un baño de agua a 13°C. La cantidad de vapor de perfluorodiglime por vial era 12-14 mg.

Los viales se reconstituyeron con 5 ml agua para la inyección después de introducir una aguja de calibre 18 como un agujero de ventilación para liberar la presión cuando se inyectó el agua, formando aproximadamente 2 x 10^{8} burbujas por ml que eran estables in vitro durante varios días.

Se inyectó por vía intravenosa un ml de la suspensión de microburbujas resultante a un conejo de aproximadamente 3 kg instrumentado para supervisar la señal ultrasónica Doppler de su arteria carótida. Un manguito de flujo de 10 MHz (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modelo ES-10-20) conectado a un módulo de flujo System 6 Doppler (Triton Technology Inc.) alimentó la señal RF Dopller a un osciloscopio LeCroy 9410 (LeCroy, Chestnut Ridge, NY). El voltaje eficaz (RMS) de la señal calculado por el osciloscopio se transfirió a un ordenador y se ajustó la curva resultante para obtener la intensidad de señal ecogénica máxima y la vida media de las microburbujas en sangre. Las señales antes del contraste eran inferiores a 0,1 voltios RMS.

Sesenta segundos después de la inyección, la intensidad de señal era 0,2 V rms, con una constante de desintegración de aproximadamente 0,00387 s^{-1}.

Ejemplo VI Biocompatibilidad de emulsiones de gas preparadas a partir de fosfolípidos de cadena larga/cadena corta mezclados

Se preparó un litro de la emulsión siguiente para secado por pulverización como se describe en el Ejemplo II:

: 3,6% p/v m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 3,0% p/v cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 2,6% p/v fosfato de sodio dibásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 0,39% p/v fosfato de sodio monobásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 0,22% p/v Dipalmitoilfosfatidicolina (Syngena Ltd., Cambridge, MA)

: 0,31% p/v Dioctanoilfosfatidicolina (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL)

: 3,0% v/v 1,1,2-Triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ).

A estas relaciones de dipalmitoilfosfatidicolina a dioctanoilfosfatidicolina los surfactantes forman micelas mezcladas solamente. A la reconstitución con 5 ml de agua, se observó aproximadamente 51 millones de gotitas de emulsión de gas por ml, de un tamaño del orden de 1 a 20 micras. Se determinó que la constante de desintegración de primer orden de la señal ecogénica de la emulsión de gas en conejos a una dosis de 5 mg/kg era 0,0029 s^{-1}. Esto corresponde a una vida media intravascular de 4 minutos.

Se sometió a ensayo la activación de complemento de la emulsión de gas usando un kit de diagnóstico C3a in vitro suministrado por Quidel Corp. (San Diego, CA). No se observó diferencia entre la emulsión de gas y el control negativo (salina), indicando que la emulsión de gas no activa el complemento. Es sabido que las microburbujas desnudas activan el complemento.

Muestra comprobada	[C3a] (ng/ml)

Zymosan (control positivo)	43403
Salina (control negativo)	604
Emulsión de gas	412

La emulsión de gas también se sometió a ensayo para ver cambios en la hemodinámica en perros anestesiados a una dosis de 20 mg/kg. No se observó cambios de la presión arterial media o presión pulmonar arterial. Estos resultados indican que no se observan efectos hemodinámicos con la emulsión de gas a 10-100 veces la dosis clínicamente relevante.

Tiempo (minutos)	Presión arterial media (mmHg)	Presión arterial pulmonar (mmHg)

0	109,4	13,3
1	109,2	14,2
2	110,4	14,1
5	115,0	14,3
10	117,9	15,7
60	111,0	13,2
90	120,9	13,6

Así se obtienen excelente eficacia y biocompatibilidad en la misma formulación de emulsión de gas.

Ejemplo VII Formación de microburbujas usando un vial de dos cámaras

Se pesó 800 mg de polvo secado por pulverización a la cámara inferior de un vial de dos cámaras de 20 ml Wheaton RS-177FLW. El vial se lavó con nitrógeno saturado con perfluorohexano a 13°C antes de introducir el sello entre cámaras. La cámara superior se llenó con 10 ml de agua estéril para la inyección. Se introdujo el tope de cámara superior para eliminar todas las burbujas de aire en la cámara superior. A la depresión del tope superior, el sello entre cámaras se forzó a la cámara inferior, dejando que el agua entrase en la cámara inferior y reconstituyese el polvo. Se formaron numerosas microburbujas estables como demostró la microscopía óptica. Este procedimiento demuestra la conveniencia de esta forma de empaquetar y la eliminación de la necesidad de proporcionar un agujero de ventilación para eliminar la acumulación de presión cuando la fase acuosa se añade al polvo.

Ejemplo VIII Formación de microburbujas usando una jeringa de dos cámaras

Se pesó cien mg de polvo secado por pulverización a una jeringa de cámara doble de 5 ml+5 ml HYPAK líquido/seco (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y agitó a la cámara de polvo (extremo de aguja). Después se colocó el sello entre cámaras justo encima del canal de derivación. Después se encajó en la jeringa una aguja con filtro de 5 \mum. La cámara conteniendo polvo se llenó después del agente osmótico de gas colocando el conjunto en una cámara al vacío, rarificando y rellenando la cámara con el agente osmótico de gas, nitrógeno saturado con perfluorohexano a 13°C. La aguja de filtro permite la evacuación y el relleno de la atmósfera en la cámara conteniendo polvo. Después se puso sobre el agujero una cubierta hermética de aguja. La cámara de líquido se llenó después de 4 ml de agua para la inyección y se asentó el émbolo usando un agujero de ventilación temporal (hilo introducido entre el cañón de la jeringa de vidrio y el émbolo para eliminar todas las burbujas de aire.

Para la reconstitución, se quitó la cubierta hermética de aguja para eliminar la acumulación de presión en la cámara de polvo. Después se bajó el émbolo, forzando el sello entre cámaras a la posición de derivación que dejó que el agua fluyese alrededor del sello entre cámaras a la cámara conteniendo polvo. El movimiento del émbolo se paró cuando toda el agua estaba en la cámara de polvo. Se agitó la jeringa para disolver el polvo. Se expulsó el gas excesivo y las burbujas grandes manteniendo la jeringa, con el extremo de aguja hacia arriba, y empujando además el émbolo. La solución conteniendo numerosas microburbujas estabilizadas (observadas por microscopía óptica) se expulsó de la jeringa empujando el émbolo a su límite.

Ejemplo IX Eficacia in vivo de emulsiones de gas conteniendo fluoroéter en función de emulsiones de gas conteniendo aire y fluoroalcano

Se preparó un litro de la dispersión A y se secó por pulverización como se describe en el Ejemplo III, y se preparó un litro de dispersiones B y C y secó por pulverización como se describe en el Ejemplo V.

A. Formulación de microburbujas de éster de sacarosa ("AF0145" en la Tabla)

: 36 g de m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 30 g de cloruro de sodio (Mallincrodt, St. Luis, MO)

: 26 g fosfato de sodio dibásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 3,9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 4,5 g de éster de sacarosa 11025003 (Alliance Pharmaceutical Corp., San Diego, CA)

: 19,5 g de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

: 30 ml de 1,2,2-Triclorotrifluoroetano (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ)

: Agua: para inyección: 490 ml

B. Formulación de microburbujas de mezcla de fosfolípidos ("24b" en la Tabla)

: 36 g de m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 30 g de cloruro de sodio (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 26 g fosfato de sodio dibásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 3,9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 4,5 g de Dimiristoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

: 4,5 g de Dioctanoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

: 5,8% v/v perfluorohexano (3M)

: Agua: para inyección: 490 ml

C. Formulación de microburbujas de mezcla de fosfolípidos ("24f" en la Tabla)

: 36 g de m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 30 g de cloruro de sodio (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 26 g fosfato de sodio dibásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 3,9 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallincrodt, St. Louis, MO)

: 3,4 g de Dimiristoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

: 4,8 g de Dioctanoil fosfatidicolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

: 5,8% v/v perfluorohexano (3M)

: Agua: para inyección: 490 ml

Se puso muestras de 100 mg del polvo secado por pulverización en viales de 10 ml y gasearon por ciclos de rarificación-gasificación repetidos de la mezcla de perfluoroéter-aire con la ayuda de una aguja de jeringa equipada con una válvula de tres vías. Como los gases de llenado se usó perfluorodimetil éter (85%, Exfluor Research, Texas, Austin), perfluoro(metiletil éter) (80%, Exfluor Research, Texas, Austin), perfluoro(éter dietílico) (90%, Strem Chemicals, Newburyport, MA), n-perfluoropropano y n-perfluorobutano (97%, PCR Incorporated). La cantidad de vapores de perfluoroéter y fluorocarbono por vial se expone en la Tabla. Después de la reconstitución con 5 ml de agua, se formaron las burbujas, que eran estables in vitro durante varios días. Sus propiedades ecogénicas in vivo se evaluaron usando un Pulsed Doppler Signal Enhancement Rabbit Model como se describe en el Ejemplo III. Las propiedades de las dispersiones de burbuja se resumen en la tabla siguiente.

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Todas las muestras de perfluoroéter dieron una señal ultrasónica significativa hasta 300 s después de la inyección al flujo sanguíneo. Los mismos preparados llenos de aire no mostraron ecogenicidad 5 s después de la inyección. Además, las muestras llenas de perfluoroéter tenían una eficacia 20-30% mejor que sus análogos de fluorocarbono con el mismo número de átomos de carbono, incluso cuando se aplican en menores cantidades. La figura ilustra la señal Doppler pulsada en voltios como una función del tiempo para los experimentos 1 y 2 expuestos en la tabla anterior.

Ejemplo X Ecogenicidad in vivo del corazón e hígado después de la administración de emulsión de gas de fluoroéter en función de la emulsión de gas conteniendo fluroalcano

Se inyectó muestras 2 y 3 expuestas en la Tabla del Ejemplo IX a una vena auricular de un conejo, después de lo cual se midió la señal ultrasónica dispersada con un instrumento ACUSON 128XP con un transductor de 7 MHz. Justo después de la inyección, ambas composiciones condujeron a un contraste sustancial de los vasos sanguíneos y el corazón. Este contraste se desvaneció gradualmente (en la escala de tiempo de varios minutos) y se sustituyó por contraste del hígado, que duró aproximadamente -10 minutos con perfluorobutano (muestra 3) y aproximadamente -15 minutos con perfluoro(metil etil éter) (muestra 2).

La presente invención proporciona una dispersión o emulsión de gas estable que es adecuada para ser utilizado como agentes de mejora de contraste de formación de imágenes por ultrasonido y resonancia magnética (IRM) donde las burbujas tienen una longevidad prolongada in vivo. Los agentes típicos de mejora del contraste por ultrasonido solamente exhiben potencial de mejora del contraste durante aproximadamente un paso por el sistema arterial, o de unos pocos segundos a aproximadamente un minuto. Por consiguiente, tales agentes no circulan en general por la aorta en un paciente después de la inyección intravenosa. En comparación, los agentes de contraste estables preparados según la presente invención siguen mostrando una duración de la mejora del contraste suficiente durante múltiples pasadas por todo el sistema circulatorio de un paciente después de la inyección intravenosa. Las duraciones in vivo de la burbuja de varios minutos se demuestran fácilmente. Tal prolongación del potencial de mejora del contraste durante ultrasonido es muy ventajosa. Además, los agentes de mejora de contraste de la invención proporcionan excelentes imágenes. Por ejemplo, se logran imágenes claras, vivas y nítidas de la sangre que fluye por el corazón, el hígado y los riñones. Así se puede administrar pequeñas dosis no tóxicas de las composiciones de la presente invención en una vena periférica y usar para mejorar las imágenes de todo el cuerpo.

Ejemplo XI Eficacia in vivo de emulsiones de gas conteniendo perfluoroéter en función de las emulsiones de gas conteniendo perfluoroalcano: modelo conejo

Se preparó un litro de la dispersión D y se secó por pulverización como se describe en el ejemplo V:

Composición de la dispersión D

: 43,2 g de m-HES hidroxietilalmidón (Ajinimoto, Tokyo, Japón)

: 31,32 g de fosfato de sodio dibásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 4,68 g de fosfato de sodio, monobásico (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: 1,2 g de Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

: 6 g de dimiristoil fosfatidilcolina (Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

: 61,2 g de perfluorohexano (3M)

: 44,4 g de cloruro de sodio (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

: Agua para inyección: 945 g.

Se puso muestras de 200 mg del polvo secado por pulverización en viales de 20 ml y se gasearon con una mezcla de agente osmótico-nitrógeno, preparada preliminarmente en una bolsa de 1 l de aire. Los viales con polvo se rarificaron repetidas veces y llenaron con la mezcla de un agente osmótico y nitrógeno bajo una presión total de 1 atm; la presión parcial del agente osmótico ascendía a 0,13 ± 0,03 atm. Los agentes osmóticos estudiados se enumeran en la Tabla III siguiente.

TABLA III Agentes osmóticos usados en mezclas con nitrógeno con el polvo D

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Después de reconstituir el polvo con 10 ml de agua, se formaron las burbujas. Sus propiedades ecogénicas in vivo se evaluaron usando un Pulsed Doppler Signal Enhancement Rabbit Model, como se describe en el Ejemplo III, con la diferencia de que la dosis inyectada se redujo a 0,2 ml (ca. 1 mg de polvo seco por kg de conejo). Las figuras 2A, 2B y 2C comparan la desintegración de la señal ultrasónica en el tiempo para diferentes gases de llenado a presiones parciales próximas. Los datos se ordenan en pares de manera que los preparados de microburbujas incluyendo perfluoroéteres (líneas gruesas) se comparen directamente con sus análogos de perfluorocarbono (líneas finas). Es evidente por los gráficos que las burbujas llenas de perfluoroéter tienen una persistencia más larga en el flujo sanguíneo que sus análogos de fluorocarbono.

Ejemplo XII Eficacia in vivo de emulsiones de gas conteniendo perfluoroéter en función de emulsiones de gas conteniendo perfluoroalcano: modelo cerdo

Se preparó polvo D como se describe en el Ejemplo XI y se llenó con mezcla de perfluorohexano-N_{2} (28 mg de agente osmótico por vial, presión parcial 0,16 atm) y mezcla de C_{5}F_{12}O_{4}-N_{2} (22 mg de agente osmótico por vial, presión parcial 0,12 atm). Después de la reconstitución del polvo con 10 ml de agua, se formaron las burbujas.

Se instaló en cerdos anestesiados (14-16 kg) catéteres internos en la arteria femoral y las venas femoral y yugular para supervisión hemodinámica y administración de agente de contraste. Se obtuvieron imágenes cardíacas de eje corto parasternal al nivel de los músculos papilares usando una máquina de ultrasonido HP Sonos 2500. Se obtuvieron imágenes en el modo de segunda armónica con una sonda de matriz de fase lineal de anchura de banda ancha que emitía a 2 MHz y recibía a 4 MHz. La formación de imágenes era intermitente (conmutada), disparándose al final-diástole de cada ciclo cardíaco. Se diluyó 0,5 ml de agente de contraste reconstituido con 0,5 ml de salina estéril y se infundió durante 1 minuto mediante la vena yugular.

Las figuras 3a, 3b y 3b representan una imagen del corazón antes de infundir el agente de contraste (3a), un minuto (3b) y seis minutos (3b) después de la inyección.

El contraste sustancial del corazón es evidente (figura 3B) para ambos gases de llenado un minuto después de la inyección. Sin embargo, aunque todavía hay mucho contraste de tejido en la imagen obtenida usando el preparado de microburbujas incluyendo un perfluoroéter a los seis minutos (figura 3C), el contraste en la imagen obtenida usando un preparado de microburbujas incluyendo perfluorohexano ha decaído notablemente. Esto demuestra que las microburbujas llenas de perfluoropoliéter proporcionan claramente imágenes de contraste clínicamente útiles durante un período prolongado.

La descripción anterior detalla algunas realizaciones preferidas de la presente invención y describe el mejor modo contemplado. Se apreciará, sin embargo, que sin que importe el detalle con que lo anterior aparece en texto, la invención se puede llevar a la práctica de muchas formas y la invención se debe interpretar según las reivindicaciones anexas y sus equivalentes.

Claims

2. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde gas fluoroéter se selecciona del grupo que consta de CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CH_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CF_{3}CH_{2}OCH_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CF_{3}CH_{2}OCF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}
CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CHFCF_{3}, CH_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, CHF_{2}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CF_{2}CHF_{2}, CF_{3}
OCH_{2}CF_{2}CF_{3}, CH_{3}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}OCF(CF_{3})_{2}, CHF_{2}OCH(CF_{3})_{2}, CH_{3}OCH_{2}CHF_{2}, CH_{3}OCF_{2}CH_{2}F, CH_{3}OCH_{2}
CF_{3},CH_{3}OCF_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCH_{2}CHF_{2}, CHF_{2}OCF_{2}CH_{2}F, CHF_{2}OCH_{2}CF_{3}, CHF_{2}OCHFCF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CHF_{2}, CH_{3}O
CF_{2}CF_{3}, CF_{3}OCH_{2}CF_{3}, CF_{3}OCHFCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{3}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})4OCF_{3}, y sus mezclas.

3. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la composición incluye una pluralidad de vacíos.

4. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el surfactante se selecciona del grupo que consta de fosfolípidos, ácidos grasos y copolímeros bloque.

5. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el gas fluoroéter se selecciona del grupo que consta de perfluorodiglime, perfluoromonoglime, perfluoroetilmetiléter, perfluorodietiléter, perfluorodimetiléter, perfluorometiletiléter, C_{4}F_{10}O_{3}, C_{5}F1_{2}0_{4}, C_{6}F1_{4}O_{5}, CF_{3}(OCF_{2}CF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}CF_{2}CF_{3}, C_{2}F_{5}OC_{2}F_{5}, CF_{3}OCF_{3}, CF_{3}OCF_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{2}OCF_{3}, CF_{3}(OCF_{2})_{3}OCF_{3} y CF_{3}(OCF_{2})_{4}OCF_{3}.

6. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la capa de surfactante consta esencialmente de un fosfolípido o mezcla de fosfolípidos que tiene al menos una cadena acilo que incluye al menos 10 átomos de carbono, e incluyendo al menos aproximadamente 5% p/p de surfactante total, siendo el segundo surfactante más soluble en agua que el primer surfactante.

7. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el primer surfactante incluye una fosfatidilcolina con una o más cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena 12-18 átomos de carbono, y dicho segundo surfactante incluye una fosfatidilcolina con una o más cadenas acilo, incluyendo al menos una cadena 6 a 12 átomos de carbono.

8. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde después de la adición de un medio acuoso a la composición precursora de microburbujas, se forman microburbujas de emulsiones de gas.

9. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la composición precursora de microburbujas también contiene gas nitrógeno.

10. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la composición precursora de microburbujas incluye además un gas modificador.

11. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el gas modificador es nitrógeno.

12. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la microburbuja incluye además un primer gas modificador primario donde la relación del primer gas modificador primario al segundo agente osmótico de gas perfluoroéter están presentes respectivamente en una relación molar de 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20, 1:10 a aproximadamente 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 o 50:1.

13. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde la estructura conteniendo vacíos incluye un polvo.

14. La composición precursora de microburbujas de las reivindicaciones 1-3, incluyendo además un gas modificador dispersado en la pluralidad de vacíos donde, después de la adición de un medio acuoso, en el que las estructuras conteniendo vacíos son sustancialmente solubles, se forman microburbujas incluyendo el agente osmótico de gas fluoroéter y gas modificador.

15. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde las microesferas incluyen un carbohidrato adicional.

16. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el carbohidrato adicional es un azúcar.

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17. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde el surfactante se selecciona del grupo que consta de surfactantes no iónicos, surfactantes neutros, surfactantes aniónicos, surfactantes fluorados neutros y sus combinaciones.

18. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde las microesferas secadas por pulverización son huecas y esféricas.

19. La composición precursora de microburbujas de la reivindicación 1, donde las microesferas tienen un diámetro de entre 1 y 15 micras.