NO975317L - Gassemulsjoner stabilisert med fluoretere etere med lave ostwald-koeffisienter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av stabile emulsjoner med lang levetid for ultralydkontrastforbedring og andre anvendelser og preparater av de således fremstilte gassemulsjoner. I tillegg omfatter oppfinnelsen forløpere for fremstilling av slike emulsjoner.

Ultralydteknologien tilveiebringer et betydelig og med økonomisk alternativ til bildeteknikken som benytter ioniseringsstråling. Mens tallrike konvensjonelle bildetekno-logier er tilgjengelige, f.eks. magnetisk resonansbildetaking (MRI), datastyrt tomografi (CT) og positronemisjonstomografi (PET), krever hver av disse teknikker ekstremt kostbart utstyr. I tillegg benytter CT og PET ioniseringsstråling. Til forskjell fra disse teknikker er ultralydbildetakingsutstyr relativt lite kostbart. I tillegg krever ultralyd ikke bruk av ioniserende stråling.

Ultralydbildetaking gjør bruk av differanser i vevdensitet og sammensetning som påvirker refleksjonen av lydbølger fra disse vev. Bilder er spesielt skarpe der det er distinkte variasjoner i vevdensiteten eller kompressibiliteten som ved vevgrenseflater. Grenseflater mellom fast vev, skjelett-systemet, og forskjellige organer og/eller tumorer, kan lett avbildes med ultralyd.

I mange bildetakingsanvendelser er derfor ultralyd meget egnet uten bruk av kontrastforbedringsmidler, for andre anvendelser som f.eks. visualisering av strømmende blod, har det vært stadige forsøk på å utvikle slike midler for å forbedre kontrasten. En spesielt signifikant anvendelse for slike kontrastmidler er på området perfusjonsbildetaking. Slike ultralydkontrastmidler kan forbedre bildetaking av strømmende blod i hjertemuskelen, nyrer, lever og annet vev. Dette vil i sin tur lette forskning, diagnose, kirurgi og terapi relatert til dette avbildede vev. Et blodansamlings-kontrastmiddel vil også tillate bildetaking på basis av blodinnholdet (f.eks. tumorer og betent vev) og vil under- støtte visualiseringen av placenta og fetus ved å øke kun den maternale sirkulasjon.

Et antall ultralydkontrastmidler er foreslått. De mest vellykkede har generelt bestått av dispersjoner av små bobler av gass som kan injiseres intravenøst. Boblene injiseres i blodstrømmen i et levende legeme som skal avbildes for derved å tilveiebringe en emulsjon i det strømmende blod som så har en annen densitet og en meget høyere kompressibilitet enn det omgivende fluide vev og blod. Som et resultat kan disse bobler lett avbildes med ultralyd.

Uheldigvis har dannelsen av bobler som er effektive ultralyd-spredere in vivo, vært vanskelig. Flere forklaringer er åpenbare. For det første har slike bobler en tendens til hurtig å krympe på grunn av diffusjonen av innfanget gass inn i den omgivende, væske. Dette gjelder særlig bobler som inneholder luft eller dens komponentgasser (som nitrogen) som er meget oppløselige i vann. Det skulle ventes at boblelevetiden ville forbedres ved ganske enkelt å øke størrelsen av boblene slik at mere gass kan unnslippe før boblene forsvinner. Denne måte har imidlertid vist seg lite tilfredsstillende fordi bobler med en størrelse mer enn rundt 10 pm i diameter fjernes fra blodstrømmen ved hjelp av lungene og deres videre sirkulasjon forhindres. I tillegg er store bobler ikke i stand til å sirkulere gjennom mindre blodkar og kapillarer.

Mikrobobler med tilfredsstillende in vivo-ytelse må også ha fordelaktige biologiske karakteristika. For det første må forbindelsene som utgjør gassen i mikroboblene, være biokompatible. Til slutt vil mikroboblene inneholdende gassfase forsvinne og gassfasen vil avgis til blodet enten som en oppløst gass eller som submikrondråper av den kondenserte væske. Derfor vil gassene primært fjernes fra legemet gjennom lungerespirasjon eller gjennom en kombinasjon av respirasjon og andre metabolske veier i det retikulo endotelia system. Selv når boblene forblir i tilstrekkelig mengde til å tillate flere passasjer gjennom sirkulasjonssystemet hos et menneske eller et dyr, kan mikrobobleopptaket hos de retikuloendotelia fagocytiske celler i leveren, begrense effektiviteten for kontrastmidlet. Ugunstige immunsystemreaksjoner kan også redusere in vivo-levetiden for boblen og bør unngås. F.eks. har "nakne" mikrobobler vist seg å gi ugunstige responser som aktivering av komplement (se f.eks. K.A. Shastri et al. (1991), "Undersea Biomed. Res.", 18, 157). Som kjent i teknikken kan imidlertid disse uønskede responser reduseres ved bruk av egnede innkapslingsmidler.

I henhold til dette har forsøk på å forbedre in vivo-levetiden for mikrobobler inkludert bruken av stabilitets- og således forskjellige innkapslingsmaterialer. F.eks. har gelatiner eller albuminmikrosfærer som til å begynne med dannet seg i væskesuspenjon og som innfanger gass under størkning, vært brukt. Bruken av surfaktanter som stabili-seringsmidler for gassbobledispersjoner er også undersøkt, se f.eks. US 4 466 442 i navnet Hilmann et al. og US 5 352 436 i navnet Wheatley et al. Noen surfaktantholdige kontrastforbedringsmidler fanger inn gasser i den vandige kjerne av liposomer som beskrevet i US 5 334 381 i navnet Unger og US 4 900 540 i navnet Ryan et al.

I den senere tid har virkningene av innfanget gass på boblelevetiden, vært viet betydelig oppmerksomhet. Bortsett fra luft og dennes komponenter har det vært benyttet forskjellige edelgasser som krypton og argon. Oppmerksomheten er nu fokusert på biokompatible gasser som har lave vann-oppløseligheter. Lav oppløselighet er vist teoretisk å være en viktig faktor ved gassboblestabiliteten. Epstein og Plesset avledet i "On the Stability of Gas Bubbles in Liquid-Gas Solutions", (1950), "J. Chem. Phys.", 18(11), 1505-1509, hastigheten for gassboblekrymping som en funksjon av gassdensitet, oppløselighet og diffusivitet i det omgivende medium. Stabiliteten for væske-væske-emulsjoner er også vist å øke med synkende oppløselighet for den dispergerte fase (Kabalnov og Shchukin, "Ostwald Ripening Theory: Applications to Fluorocarbon Emulsion Stability", "Advances in Colloid and Interface Science", 38:69-97, 1992).

Med visse forenklende forutsetninger hører Epstein og Plessets formel til formelen for boblelevetiden (t) som gitt av Quay i US 5 393 524:

der p er densiteten for den innfangede gass, D er diffusiviteten for gassen i det omgivende medium og C er oppløselig-heten for gassen i det omgivende medium. Basert på denne formel danner Quay bobler ved bruk av gasser som er valgt på basis av å være en gass ved atmosfærisk trykk og kroppstemperatur (37°C) og med redusert vannoppløselighet, høyere densitet og redusert gassdiffusivitet i oppløsning sammenlignet med luft. I samme retning beskriver Schneider et al. i EP 0554213A1 gasser som er valgt på basis av lavere vann-oppløselighet og høyere molekylvekt. Spesifikt beskrevne gasser er SF^, og SeF^så vel som perfluorerte hydrokarboner.

Selv bm redusert vannoppløselighet og diffusivitet kan påvirke hastigheten ved hvilken gassene forlater boblen (som opprinnelig forutsagt av Epstein og Plesset), er gass-seleksjonskriteriene til Quay og Schneider unøyaktige idet de resulterer i inklusjonen av visse uegnede gasser og eksklu-sjonen av visse optimalt egnede gasser. F.eks. foreslår Quay i US 5 393 524 å velge mikroboblegasser basert på en beregning av Q-verdien for den foreslåtte gass, der:

hvor p er gassdensiteten i kg/m5 , C er vannoppløseligheten for gassen (M) og D er diffusiviteten for gassen i oppløsning i cm<2>/s. Quay lærer at Q-verdien må være minst 30 for at

gassen skal kunne være nyttig for ultralydkontrastforbedring. Et enkelt estimat ved bruk av litteratur-vannoppløselighets-data (E. Wilhelm, R. Battino og R.J. Wilcock, "Chemical Reviews", 1977, v. 77, s. 219) viser at Q-verdiene for så å si alle kjente gasser (bortsett fra hydrogen og helium) nærmer seg eller overskrider denne verdi. Ved 25°C har f.eks. oksygen en Q-verdi på 20, og nitrogen har en Q-verdi på 35. Quay-beskrivelsen gir derfor få ledetråder for valget av effektive mikroboblegasser.

I tillegg svikter Quay Q-koeffisientkriteriet så vel som Schneiders beskrivelse i EP 0554213A1 når det gjelder å betrakte visse hovedgrunner for boblekrymping, nemlig virkningen av bobleoverflatespenningen, surfaktant- og gassosmotiske effekter samt potensialet for fylling av gasskondensasjon i en væske. Således må partialtrykket for fyllingsgassen være høyt nok til å stå imot det overskytende Laplace-overtrykk i boblene. Hvis det mettede vanndamptrykk er lavt, kan fyllingsgassen kondensere i væsken og kontrast-evnen vil gå tapt. I henhold til dette foreligger det et behov i teknikken for stabiliserte kontrastforbedringsmidler som er biokompatible, er lette å fremstille og tilveiebringer overlegne in vivo-kontrastforbedringer ved ultralydbildetaking. Det foreligger også et behov for mikrobobleforløpere og fremgangsmåter for fremstilling og bruk av slike kontrastforbedringsmidler.

Foreliggende oppfinnelse benytter lave Ostwald-koeffisient-fluoreterforbindelser for å tilveiebringe lengevarende gassemulsjoner omfattende mikroboblepreparater for ultralyd-og magnetisk resonansbildetakingskontrastforbedring. Når mikroboblepreparatet fremstilles ved bruk av oppfinnelsens forbindelser, kan det oppnås lengevarende bilder av hjerte og andre indre organer enn det som tidligere har vært mulig. Ifølge oppfinnelsen beskrives det gassemulsjoner omfattende en tidligere, ikke-betraktet klasse forbindelser som kombinerer en redusert vannoppløselighet uten signifikant redusert mettet damptrykk (og således overraskende lave Ostwald-koeffisienter). Det høye damptrykk understøtter 1 tillegg en reduksjon av tapet av kontrast på grunn av fyllgassens kondensasjon til væske. Disse forbindelser er de fluorerte mono- og polyetere. Når perfluorpolyetere sammenlignes med sine perfluorkarbonanaloger med det samme antall karbonatomer, påvirker en tilføyelse av eteroksygen ikke damptrykket i vesentlig grad, mens vannoppløseligheten synker med en faktor på ca. 2-3. Dette er uventet og overraskende idet at omdanningen av hydrokarbon til etere resulterer i en betydelig økning av vannoppløseligheten.

Således beskrives det en gassemulsjon for ultralydkontrastforbedring omfattende et antall gassbobler i et flytende medium der gassen omfatter en fluormono- eller fluorpolyeter eller en blanding derav. I enkelte utførelsesformer omfatter gassen en forbindelse med en Ostwald-koeffisient på mindre enn rundt 100 x IO"<6>ved 37°C, noe som fører til spesielt lang in vivo-kontrastforbedring. Damp av perfluordietyleter, perfluordimetyleter, perfluormetyletyleter, perfluormonoglym, perfluordiglym, C4<F>10<0>3» c5^ i2°i> C6F14°5er finnet å være spesielt fordelaktig.

Gassboblene ifølge oppfinnelsen kan omgis av et surfaktantsjikt som fortrinnsvis omfatter en første og en andre surfaktant der den første i det vesentlige består av et fosfolipid eller en blanding av fosfolipider med minst en acylkjede som omfatter minst 10 karbonatomer og som omfatter minst rundt vekt-# total surfaktant, mens den andre surfaktant er mere vannoppløselig enn den første. Aller helst omfatter den første surfaktant et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 12 til 18 karbonatomer, og der den andre surfaktant omfatter et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 6 til 12 karbonatomer.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen i et generelt aspekt mikrobobleforløpere og fremgangsmåter for fremstilling av gassemulsjoner. Fagmannen vil erkjenne at mikroboblepreparatene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å benytte et antall forskjellige teknikker. F.eks. kan mikrobobler dannes ved bruk av de beskrevne fluoreterforbindelser i forbindelse med pulvere, proteinmikrosfaerer, spraytørkede mikrosfærer, hulromholdige partikler, partikkelformig materiale, liposomer, mettede sukkeroppløsninger, osv. Hvert av disse strukturmaterialer kan benyttes videre for å tilveiebringe tørkede mikrobobleforløpere når en fluoreter dispergeres deri. Ved tilsetning av et flytende medium og fortrinnsvis vann, kan det dannes gassemulsjoner.

I en foretrukken utførelsesform fremstilles mikroboblene ved spraytørking av en væskeformulering inneholdende et bio-kompatibelt, membrandannende materiale for derved å danne et mikrosfærepulver, å kombinere mikrosfærene med de lave Ostwald-koeffisient fluoreterforbindelser som her beskrevet og blanding av en vandig fase med pulveret. Mikrosfære-pulveret oppløses i det vesentlige i den vandige fase og danner mikrobobler. Fortrinnsvis er mikroboblene belagt med et monosjikt av surfaktant.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for bildetaking inkludert harmonisk ultralydbildetaking, ved bruk av de beskrevne gassemulsjoner.

Andre gjenstander, trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå for fagmannen i lys av de følgende betraktninger, basert på de vedlagte illustrerende eksempler i forbindelse med figurene der: figur 1 er et diagram av den in vivo-pulsede Doppler- signalintensitet som en funksjon av tiden fra to fluoretergassemulsjoner ifølge oppfinnelsen, mot luft;

figurene 2a, 2b og 2c er grafiske representasjoner av forfallet av ultralydsignaler med tiden etter injeksjon av gassemulsjonskontrastmedier i en kanin. Hver individuelle grafiske presentrasjon er arrangert slik at mikroboblepreparatene omfattende fluoretere sammenlignes med kjent mikroboblepreparater omfattende fluorkarbonanaloger; og

figurene 3a, 3b og 3c viser alle to ultralydbilder av et svinehjerte før injeksjon av boblekontrastmedier (fig. 3a), 1 minutt (fig. 3b) og 6 minutter (fig. 3c) etter injeksjon. I figurene dannes toppbildet (andre enn kontrollbildet) ved bruk av et mikroboblepreparat omfattende en perfluorpolyeter, ^ 5^ 12°^' mens bunnbildet ble generert ved bruk av et mikroboblepreparat omfattende perfluorheksan, C^F-j^.

I. Generelt

Som her benyttet anses mikroboblene å være bobler av gass i et vandig medium, med en diameter mellom 0,5 og 300 pm og fortrinnsvis med en diameter på ikke mer enn 200, 100 eller 50 pm. Mikrobobler kan eventuelt ha et sjikt eller belegg på gass/væskeflaten. Hvis det er til stede, kan belegget være ett eller flere molekyler tykt. I tillegg kan mikroboblene fanges av et biomolekylært sjikt (slik tilfellet er ved multilamellære liposomer) eller de kan fanges av flere sjikt av bisjikt (multilamellære vesikler). Mikroboblene ifølge oppfinnelsen kan også omgis av mere permanente, skall-lignende strukturer som denaturerte proteiner.

Da emulsjoner generelt karakteriseres som en dispersjon av to eller flere ublandbare fluider, stabilisert ved en surfak-tantgrenseflate, er de surfaktantholdige utførelsesformer av oppfinnelsen i det vesentlige gassemulsjoner der den diskontinuerlige fasen i emulsjonen er en gass og ikke en væske. Som et resultat omfatter uttrykket "gassemulsjon" slik det her benyttes, en dispersjon av et antall mikrobobler av gass i et vandig medium med eller uten en surfaktantgrense-flate. Det betyr at gassemulsjonene ifølge oppfinnelsen ganske enkelt er mikroboblepreparater omfattende en fluoreter.

For intravaskulær anvendelse bestemmes den optimale boble-størrelse av to konkurrerende betraktninger. Små bobler er effektive med henblikk på sirkulering gjennom små blodkar og kapillarer, men ultralyd-ekogenisiteten er sterkt avhengig av boblestørrelsen. Egnede mikrobobler for vaskulær ultralydkontrastforbedring er derfor fortrinnsvis 1 til 10 pm i diameter, der 3 til 5 pm er foretrukket.

II. Valg av mikroboblegasser og — gasskombinas. 1 oner

Den korte levetid for de fleste mikroboblepreparater forårsakes delvis av det økede gasstrykk inne i boblen, noe som resulterer fra overflatespenningskreftene som virker på boblen. Dette økede indre trykk øker når diameteren i boblen reduseres. Det økede, indre gasstrykk tvinger gassene i boblen til oppløsning, noe som resulterer i en boblekollaps når gassen tvinges i oppløsning. Laplace-ligningen,AP=2a/r, (der AP er det økede gasstrykk i boblen, a er overflatespen-ningen for boblefilmen og r er radien for boblen) beskriver trykket som utøves på en gassboble av den omgivende boble-overflate eller film. Laplace-trykket er omvendt propor-sjonalt med bobleradien og når således boblene krymper, øker Laplace-trykket, noe som øker diffusjonshastigheten for gass ut av boblen og hastigheten for boblekrymping.

Quays formel for boblelevetiden (ligning 1) ignorerer denne faktor. Forskjellige konklusjoner med henblikk på gassegnet-het oppstår når man betrakter virkningen av boble-Laplace-trykket i forbindelse med det faktum at blodet naturligvis inneholder visse gasser som nitrogen, ved et trykk nær det atmosfæriske. Mere spesielt fører dette til den konklusjon at en gassblanding av en "primær modifiserende gass" som nitrogen, eller luft, eller en annen gass som naturlig er rikelig i blodet, i kombinasjon med et "gassosmotisk middel" med lav vannoppløselighet og lavt damptrykk, resulterer i optimal boblelevetid. Enkelte utførelsesformer av slike gassblandinger er beskrevet i de paralleltløpende US-SN 08/099 951; 98/284 083; og 08/395 680.

Den stabiliserende innflytelse av egnede gasskombinasjoner vil lettere forstås ved en diskusjon av visse hypotetiske bobler i vandig oppløsning. Boblene som diskuteres kan alle betraktes som å være omgitt av et sjikt av overflatespen-ningsreduserende surfaktant. Imidlertid vil virkningene av gass eller gasskombinasjoner med differerende oppløselig-heter, surfaktantmembransjiktpermeabiliteter og eksterne konsentrasjoner, betraktes.

De fysikalske interaksjoner av den primære, modifiserende gass, det sekundære, osmotiske middel og mediet, kan innarbeides i en generell teori for bobleoppførsel. I en oppløsning inneholdende en relativt høy konsentrasjon av den primære, modifiserende gasse (sammenlignet med konsentrasjonen i oppløsning av det gassosmotiske middel), kan boblelevetiden bestemmes teoretisk som en funksjon av visse fysikalske karakteristika for det sekundære gassosmotiske middel.

Man betrakter en mikroboble med radius r, inneholdende to ideelle gasser: luft (nitrogen) (na-mol) og osmotisk middel (np-mol). Mikroboblen er i et uendelig vannmedium som ikke inneholder noe osmotisk middel og som er mettet med et uendelig forråd av luft. Luft er meget mer oppløselig i vann og diffunderer hurtig ut av mikroboblen. Behandler man mikroboblen på en måte analogt en semipermeabel membran, kan man se at det kjemiske potensialet for luft i mikroboblen er det samme som i uendeligheten, mens det kjemiske potensiale for fluorkarbonet i mikroboblen er høyere enn det I uendeligheten. Mekanisk ekvillbrering til trykkgradienten over grenseflaten, antas å være hurtig. Således er det diffusjonen av osmotisk middel ut av mikroboblen som bestemmer mikro-boblelevetiden. Trykket Inne I mikroboblen er summen av partialtrykkene av luft og fluorkarbon:

Fordi luft er meget oppløselig i vannmediet, og hurtig diffunderer inn i og ut av boblen, er nettomassestrømmen av luft liten og partialtrykket for luften i mikroboblen er omtrent lik det atmosfæriske lufttrykk som legges på vannmediet. Dette betyr at det overskytende Laplace-trykk kun skyldes osmotisk middel:

Videre er den diffusjonene massestrøm J i mol/s for stabil tilstand, av det osmotiske trykk fra en sfærisk partikkel til mediet med null konsentrasjon i mediet, lik:

Her er D den osmotiske middel-i-vann-diffusjonskoeffisient og Cr, „, ,-er likevekts-underoverflate osmotisk middel-i-F,subsurf vann-konsentrasjon. Man antar at konsentrasjonen av osmotisk - middel under overflaten i vann er i likevekt med fluorkarbonet i mikroboblen. Fordi dampen er umettet, er under-overflatekonsentrasjonen av mikroboble-osmotisk middel lavere enn dens mettede konsentrasjon og er relatert til det indre damptrykk for det osmotiske middel som følger:

Fra ligningene 4, 5 og 6 følger at:

Skal her merke seg at kombinasjonen er dimensjonsløs

P

F, sat

og i seg har forholdet mellom damptrykket for mettet osmotisk middel og den tilsvarende vannoppløselighet ved ekvilibrium for osmotisk middel. Dette forhold er kjent som Ostwald-koef f isienten (ofte angitt som "L"). Kvadratet av mikroboble-radien synker med tiden i en hastighet proporsjonal med Ostwald-koeffisienten for det gassosmotiske middel. I henhold til dette gir gassosmotiske midler med lav Ostwald-koeffisient overlegen boblelevetid. Ostwald-koeffisienten for det gassosmotiske middel er fortrinnsvis mindre enn rundt 500 x IO-<6>, 100 x IO-<6>eller 50 x IO-<6>, aller helst mindre enn ca. 40 x IO-<6>, 30 x IO"<6>, 20 x IO-<6>, 10 x IO"<6>, 5 x IO-<6>eller 1 x IO-<6>.

Tabell 1 viser oppløselighetene, damptrykkene og Ostwald-koef f isientene for diverse forbindelser, inkludert visse biokompatible fluorkarboner. Tabell 1 illustrerer at perfluorbutan og perfluorpentan som er gasser ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk, og som er ansett som boblegasser av Quay og Schneider, har lave Ostwald-koeffisienter og derfor egner seg som gassosmotiske middel i forbindelse med en primær modifiserende gass. Imidlertid tillater muligheten av å anse kandidatforbindelser som er væsker ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk, seleksjon av visse optimale lav-Ostwald-koeffisientforbindelser som tidligere ikke har vært ansett på noen måte å være egnet for mikroboblepreparater.

Man skal huske på at ligning 7 gjelder for bobler inneholdende gasskombinasjoner der en av gassene allerede er til stede i blodstrømmen og der denne gass (den "primære modifiserende gass") kan diffundere gjennom gass/væskegrense-flaten meget hurtigere enn den andre gass (det "gassosmotiske middel") i kombinasjonen. Kun da er partialtrykket for det gassosmotiske middel i boblen lik kun Laplace-trykket og ikke det totale trykk I boblen. Fordi Laplace-trykket kan være mindre enn 1 atmosfære (i det minste for en stor andel av boblens levetid) er det mulig å benytte gassosmotiske midler som er væsker ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk. Slike forbindelser vil ikke danne bobler i det hele tatt uten det ytterligere nærvær av den primære modifiserende gass.

Selv om på den annen side det gassosmotiske middel kan være en væske ved kroppstemperatur, må mettingsdamptrykket være stort nok slik at Laplace-trykket ikke umiddelbart tvinger det gassosmotiske middel i boblen til å kondensere til en væske. Mettingsdamptrykket for det gassosmotiske middel er fortrinnsvis større enn rundt 100 torr. Perfluorerte hydrokarboner, tidligere ansett som mikroboblefyllgasser, har generelt korrelerte vannoppløseligheter og mettet damptrykk. Dette vil si at å velge et fluorkarbon med redusert vann-oppløselighet også betyr å velge fluorkarbon med redusert mettet damptrykk.

Ifølge oppfinnelsen beskrives det en tidligere ikke-betraktet klasse av forbindelser som kombinerer en redusert vann-oppløselighet uten noen signifikant redusert mettet damptrykk, og således har disse forbindelser overraskende lave Ostwald-koeffisienter. Disse forbindelser er de fluorerte mono- og polyetere. Fluorerte mono- og polyetere er kjente for å være sikre og ikke-toksiske. De er også kjent i teknikken (D.D. Lawson et al., "J. Fluorine Chem.", 12, s. 221 (1978)) at disse forbindelser har et meget høyt damptrykk og lavt kokepunkt ved et gitt antall karbonatomer. Således er kokepunktet og det mettede damptrykket for en fluorert polyeter så å si det samme som de til fluorkarbonanalogen med det samme karbontall.

Imidlertid er vannoppløseligheten, og derved Ostwald-koef f isienten , for fluoretrene lavere enn den til fluorkarbonanalogen og verdien synker med en faktor 2-3 for hvert ytterligere oksygenatom. Vanligvis skulle det ventes at tilføynlng av et oksygenatom i stand til hydrogenbinding til vann ville være til en økning i oppløseligheten. Det er funnet eksperimentelt at spesielt lengevarende kontrast-forbedringsgassemulsjoner kan fremstilles når gassboblene inneholder luft eller nitrogen blandet med fluormono- eller polyeter. I henhold til dette er perfluordiglym, CF3(OCF2CF2)20CF3»perfluormonoglym, CF30CF2CF2CF3, perfluordietyleter, C2F50C2F5, perf luoretylmetyleter, CF3OC2F5 , perfluordimetyleter, CF3OCF3og perfluorpolyetere som CF30CF20CF3, CF3(0C<F>2)20CF3, CF3(0C<F>2)30CF3og CF3(0CF2)40CF3funnet å være spesielt egnede gassosmotiske midler.

Et vidt spektrum av fluorerte etere har de ovenfor beskrevne egenskaper som gjør dem særlig egnet som gassosmotiske midler for stabilisering av gassemulsjoner. Avhengig av antallet karbonatomer kan de fluorerte etere være enten gasser eller væsker ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk. Disse fluorerte etere som er gasser ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk er også brukbare som den eneste gassformige komponent av et gassemulsjonspreparat. En primær modifiserende gass er, selv om den forbedrer effektiviteten for gassemulsjoner fremstilt med alle gassosmotiske midler, ikke krevet hvis den fluorerte eter som benyttes er en gass ved kroppstemperatur og atmosfærisk trykk. Videre kan brukbare fluorerte eterosmotiske midler være enten fullstendig eller kun partielt fluorert. Enkelte av de partielt hydrogenerte, fluorerte etere som er brukbare som gassosmotiske midler ifølge oppfinnelsen er: CH3CH20CF2CHF2, CH3CH2OCF2CF3, CHF2CH20CF2CHF2, CF3CH20CF2CH2F, CF3CH20CH2CF2, CF3CH2OCF2CHF2, CHF2CH20CF2CF3, CHF3CH2OCF2CF3, CH30CH2CF2CHF2, CH30CH2CF2CF3, CH30CF2CF2CHF2, CH30CF2CHDCF3,

CH3OCF2CF2CF3 , CHF20CH2CF2CHF2, CHF20CH2CF2CF3, CF30CH2CF2CHF2, CF3OCH2CF2CF3, CH30CH(CF3)2, CH30CF(CF3 )2, CHF20CH(CF3)2, CH30CH2CHF2, CH3OCF2CH2F, CH3OCH2CF3, CH30CF2CHF2, CHD20CH2CHF2, CHD2OCF2CH2F, CHF2OCH2CF3 , CHF20CHFCF3, CF30CH2CHF2, CH30CF2CF3, CF3OCH2CF3og CF3OCHFCF3.

Når først en gass med lav Ostwald-koef f isient er valgt, fortrinnsvis en fluorert eter, kan mikrobobler med gassen dannes på et antall måter, både med og uten et skall av surfaktantgrenseflatesjikt, som beskrevet i større detalj nedenfor.

III. Mlkroboblefremstllling og innkapsling

Mlkroboblefremstillingsmetoder inkluderer dannelse av partikkelformige mikrosfærer ved ultrasonikering av albumin eller et annet protein som beskrevet i EP-søknad 0 359 246 og 0 633 030 fra Molecular Biosystems, Inc.; bruken av tensider og viskositetsøkende midler som beskrevet i US 4 446 442; lipidbelagte, ikke-liposomale mikrobobler som beskrevet i US 4 684 479; liposomer med Innfangede gasser som beskrevet i US

5 088 499 og 5 123 414; bruken av amfipatiske forbindelser som beskrevet i US 5 445 813; bruken av lipidsuspensjoner som beskrevet i WO 96/08234; bruken av laminariserte surfaktanter som beskrevet i US 5 271 928 og 5 380 519; bruken av mikropartikler som beskrevet i US 4 442 843, 5 141 738 og 4 657 756; samt bruken av albuminpartikkelformige mikrosfærer som beskrevet i US 4 718 433.

Fagmannen vil videre erkjenne at gassemulsjonene ifølge oppfinnelsen inkluderer preparater av frie gassmikrobobler omfattende fluoretere. Det vil si at i utvalgte utførelses-former kan gassemulsjoner ifølge oppfinnelsen dannes uten bruk av noen surfaktant som beskrevet i US 5 393 524 og 5 049 688.

I foretrukne utførelsesformer kan mikroboblepreparatene fremstilles ved bruk av sonikering. Sonikering kan gjennom-føres på et antall måter. F.eks.kan en ampulle inneholdende en surfaktantoppløsning og gassen i topprommet av ampullen sonikeres gjennom en tynn membran. Fortrinnsvis er membranen mindre enn rundt 0,5 eller 0,5 mm tykk og aller helst mindre enn ca. 0,3 eller sogar 0,2 mm tykk, dvs. tynnere enn bølgelengden for ultralyden i materialet, for å gi akseptabel transmisjon og minimal membranoppvarming. Membranen kan være laget av materialer som gummi, teflon, mylar, uretan, aluminisert film eller en hvilken som helst annen sonikat transparent, syntetisk eller naturlig polymerfilm eller filmdannende materiale. Sonikeringen kan skje ved kontakt eller sogar å presse membranen med en ultralydsonde eller med en fokusert ultralyd-"stråle". Ultralydsonden kan være av engangstypen. I ethvert tilfelle kan sonden anbringes mot eller innføres gjennom membranene og Inn i væsken. Når først sonikeringen er gjennomført, kan mikrobobleoppløsningen trekkes av fra ampullen og avgis til pasienten.

Sonikeringen kan også gjennomføres med en sprøyte med et lavenergetisk, ultrasonisk vibrert aspireringsenhet på sprøyten tilsvarende en blekkstråleprinter. Videre kan en sprøyte eller ampulle anbringes i og sonikeres med et 1avenergi-ultralydbad som fokuserer sin energi på et punkt i beholderen.

Det er også tenkt på mekanisk dannelse av mikrobobler. Bobler kan f.eks. dannes ved en mekanisk ventil med høy skjærkraft (eller dobbeltsprøytenål) og to sprøyter, eller en aspirator-enhet på en sprøyte. Selv enkel rysting kan benyttes. Krympebobleteknikkene som beskrevet nedenfor er særlig egnet for mekanisk dannede bobler med lavere energitilførsel enn sonikerte bobler. Slike bobler vil karakteristisk ha en diameter som er meget større enn de til slutt ønskede, biokompatible bildemidler, men kan bringes til å krympe til en egnet størrelse i henhold til oppfinnelsen.

Ved en annen metode kan mikrobobler dannes ved bruk av en flytende osmotisk middelemulsjon, overmettet med en modifiserende gass med forhøyet temperatur, Innført i en surfak-tantoppløsning. Denne produksjonsmetode arbeider på samme måte som åpning av en sodabeholder der gass skummer ved frigivning av trykket som danner boblene.

I en annen metode kan bobler dannes på tilsvarende måte som skumming av barberkrem, med perfluorbutan, freon eller et annet lignende materiale som koker når trykker avlastes. Imidlertid er det ved denne metode ønskelig at de emulgerte væsker koker tilstrekkelig lavt eller at den inneholder tallrike boblenukleeringsseter for derved å forhindre overheting og overmetting av den vandige fase. Denne overmetting vil. føre til generering av et lite antall store bobler på et begrenset antall nukleeringsseter i stedet for det ønskede store antall små bobler (en for hver liten dråpe).

I alternativet kan en lyofilisert kake av surfaktant og massegivende reagenser, fremstilt med en finpore- eller tomromholdig struktur anbringes i en ampulle med en steril oppløsning og et topprom med en osmotisk gassblanding. Oppløsningen kan fryses hurtig for derved å gi en fin krystallstruktur og danner derfor, ved lyofilisering, fine porer (hulrom der iskrystallene ble fjernet).

Alternativt kan det benyttes hvilke som helst oppløsbare eller oppløselige, hulrom-dannende strukturer eller materialer som pulverformige eller granulerte sukkere. Det er ikke nødvendig at slike strukturmaterialer definerer et antall hulrom før tilsetning av et flytende medium. Mens det videre er foretrukket at de hulrom-dannende strukturer omfatter en surfaktant, er dette ikke nødvendig for å praktisere oppfinnelsen. Der det hulrom-dannende materialet ikke fremstilles fra eller inneholder surfaktant, blir i denne utførelsesform både surfaktant og væske matet til beholderen med strukturene og den eller de ønskede gasser. Ved rekonstituering innfanger disse hulrom den osmotiske gass og, med oppløsning av den faste kake eller pulver, dannes mikrobobler med gassen eller.gassene.

I nok en metode kan tørre, hulromholdige partikler eller andre strukturer (som hule sfærer eller bikuber) som hurtig oppløses eller hydratiseres, fortrinnsvis i vandig medium, f.eks. albumin, mikrofine sukkerkrystaller, hule spraytørkede sukkeré, salter, hule surfaktantsfærer, tørre, porøse polymersfærer, tørr, porøs hyaluronsyre eller substituerte hyaluronsyresfærer, eller sogar kommersielt tilgjengelige tørkede laktosemikrosfærer, stabiliseres med et gassosmotisk middel. Mens I tillegg denaturerte proteinmikrosfærer ikke er spesielt oppløselige, er de forenelige med foreliggende oppfinnelse og kan benyttes som hulromholdige strukturer i henhold til den her gitte lære.

I et bredt aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes det i henhold til dette mlkrobobleforløperpreparater som karakteriseres ved at de omfatter: et strukturmateriale som definerer et antall hulrom;

en gass eller en gassblanding omfattende en fluoreter dlspergert i hulrommene; og

en surfaktant der strukturmaterialet, gassen eller gassblandingen og surfaktanten sammen er tilpasset dannelse av mikrobobler ved tilsetning av en væske til beholderen.

Man vil erkjenne at uttrykket "strukturmateriale" slik det her benyttes, skal tolkes til å bety et hvilket som helst materiale som definerer et antall hulrom som fremmer dannelsen av bobler etter kombinasjon med et flytende medium. Slike strukturmaterialer som inkluderer både hulromholdige og hulrom-dannende strukturer, kan være oppløselige eller uoppløselige i en vandig omgivelse. Eksempler på strukturmaterialer som er kompatible med oppfinnelsens tanke inkluderer, men er ikke begrenset til spraytørkede pulvere, pulverformige eller granulerte sukkere, proteinmikrosfærer inkludert denaturerte proteinmikrosfærer, lyofiliserte kaker, lyofiliserte pulver, salter, hule surfaktantsfærer, tørkede porøse polymersfærer og tørr porøs hyaluronsyre. I særlig foretrukne utførelsesformer omfatter strukturmaterialet en surfaktant.

Fortrinnsvis fremstilles gassemulsjonspreparater med gasser med lav Ostwald-koeffisient ved spraytørking av en vandig dispersjon som inneholder en hydrofil monomer eller polymer eller en kombinasjon derav. Denne prosedyre er også beskrevet i den paralleltløpende US-SN 08/405 477. I dette tilfellet dannes et boble-dannende preparat ved spraytørking av en vandig dispersjon av en hydrofil del som stivelse, fortrinnsvis også omfattende en surfaktant, under dannelse av et strukturmateriale. Mere spesielt dannes det et pulver med tørre, hule, omtrent mikrosfæriske, porøse skall med en diameter rundt 1 til 10 pm og med en skalltykkelse på rundt 0,2 pm. Kommersielt tilgjengelige spraytørkere er velkjente i teknikken og egnede oppsett for hvilke som helst spesielle stivelse/surfaktantdispersjoner kan lett bestemmes ved standard empirisk prøving under henvisning til eksemplene nedenfor. Etter dannelse bringes den ønskede gass til å permeere det strukturelle materialet eller de tørre mikrosfærer ved å anbringe mikrosfærene i en egnet beholder og evakuere luften og erstatte den med den ønskede gass eller gassblanding.

Den hydrofile del i oppløsningen som skal spraytørkes kan f.eks. være et karbohydrat som glukose, laktose eller stivelse. Polymerer som PVA eller PVP er også tatt med i betraktning. Forskjellige stivelse og derivatiserte stivelser er funnet å være spesielt egnet. Særlig foretrukne stivelser for anvendelse ved fremstilling av mikrobobler inkluderer de med en molekylvekst større enn rundt 500 000 dalton eller en dekstroseekvivalent, DE, på mindre enn rundt 12. DE-verdien er en kvantitativ måling på graden av stivelsespolymer-hydrolyse. Den er et mål på den reduserende kraft sammenlignet med en dekstrosestandard på 100. Jo høyere DE-verdi, jo større er graden av stivelseshydrolyse. Slike foretrukne stivelser inkluderer vegetabilske stivelser av næringskvalitet av den type som er kommersielt tilgjengelig i næringsmiddelindustrien, inkludert de som markedsføres under varemerket N-LOK og CAPSULE av National Starch and Chemical Co., (Bridgewater, NJ); derivatiserte stivelser som hydroksyetylstivelse (tilgjengelig under varemerket HETASTARCH og HESPAN fra du Pont Pharmaceuticals, M-hydroksyetylstivelse fra Ajinimoto, Tokyo, Japan). På grunn av spesielt fordelaktige stabiliseringskarakteristika er imidlertid stivelser med en molekylvekt på 500 000 eller derover foretrukket (Bemerk at kortkjedestivelser spraytørker godt og kan benyttes for å fremstille mikrobobler ifølge oppfinnelsen). Den hydrofili-serte monomer eller polymer er til stede i denne utførelses-form av forløperoppløsningen i et område fra 0,1$ til 10% vekt/volum av oppløsningen, der 1% til 5% vekt/volum er funnet å være spesielt egnet.

Fortrinnsvis inkluderer den vandige dispersjon også en eventuell surfaktant eller en blanding av surfaktanter, tilveiebragt i en mengde av rundt 0,01% til 20% vekt/volum av oppløsningen. Mange surfaktanter og surfaktantblandinger er velkjente og kan benyttes. Surfaktanter kan velges fra gruppen omfattende fosfolipider, fosfokoliner, lysofosfolipider, ikke-ioniske surfaktanter, nøytrale eller anioniske surfaktanter, fluorerte surfaktanter som kan være nøytrale eller anioniske, samt kombinasjoner av slike emulgerings- eller skummingsmidler. Andre spesifikke eksempler på surfaktanter er blokk-kopolymerer av polyoksypropylen og polyoksyetylen (et eksempel på en slik klasse forbindelser er Pluronic, som Pluronic F-68), sukkerestere, fettalkoholer, alifatiske aminoksyder, hyaluronsyre-alifatiske estere, hyaluronsyre-alifatiske estersalter, dodecyl-poly(etylenoksy)etanol, nonylfenoksypoly(etylenoksy)etanol, deriverte stivelser, hydroksyetylstivelse-fettsyreestere, salter av fettsyrer, vegetabilske stivelser av kommersiell næringskvalitet, dekstran-fettsyreestere, sorbitol-fettsyreestere, gelatin, serumalbuminer og kombinasjoner derav. Også er det tatt sikte på polyoksyetylenfettsyreestere som polyoksyetylenstearater, polyoksyetylenfettalkoholetere, polyoksyetylerte sorbitanfettsyreestere, glycerolpolyetylen-glykolbksystearat, glycerolpolyetylenglykolricinoleat, etoksylerte soyabønnesteroler, etoksylerte ricinusoljer og de hydrogenerte derivater derav. I tillegg ligger ikke-ioniske alkylglukosider som Tweens®, Spans® og Brijs® også innenfor rammen av oppfinnelsen. "Spans" inkluderer soritantetraoleat, sorbitantetrastearat, sorbitantrlstearat, sorbitan-tripalmitat, sorbitantrioleat og sorbitandistearat."Tweens" inkluderer polyetoksyetylensorbitantristearat, polyetoksy-etylensorbitantripalmitat, polyetoksyetylensorbitantrioleat. "Brij"-familien er en annen, brukbar kategori av stoffer som inkluderer polyetoksyetylen-10-stearyleter. Anioniske surfaktanter, særlig fettsyrer (eller deres salter) med 6 til 24 karbonatomer, kan også benyttes. Et eksempel på en egnet, anionisk surfaktant er oleinsyre eller dens salt, natrium- oleat. Også egnet er kationiske surfaktanter og deres salter som dodecyltrimetylammoniumklorid.

Fra det foregående vil det være klart at vidt spektrum av surfaktanter kan benyttes. Så å si enhver surfaktant (inkludert de som fremdeles må utvikles) eller surfaktant-kombinasjon kan benyttes ifølge oppfinnelsen. Den optimale surfaktant for en gitt anvendelse kan bestemmes ved empiriske studier som ikke krever urimelig eksperimentering. Som en konsekvens kan fagmannen velge en surfaktant primært basert på egenskaper som biokompatibilitet.

Det er funnet særlig egnet for oppløsningen at den inneholder en blanding av surfaktanter inkludert et hydrofobt fosfolipid som en første surfaktant og minst en ytterligere hydrofil, andre surfaktant. Fortrinnsvis har det hydrofobe fosfolipid minst en acylkjede med tilsammen minst 10 karbonatomer (f.eks. didecanoylfosfolipid). I enkelte utførelsesformer vil den første fosfolipidsurfaktant ha acylkjeder med fra 10 eller 14 til 20 eller 24 karbonatomer. For eksempel kan man benytte dipalmitoylfosfatidylkolin (omfattende to acylkjeder, hver omfattende 16 karbonatomer). Acylkjeden kan hydrogeneres eller fluoreres. Andre fosfolipid-hodegrupper er også tatt med i betraktning. For eksempel vil fosfatidylserinene, fosfatidylglycerolene eller fosfatidyletanolaminene ha egenskaper som er egnet for oppfinnelsens kontekst. Kombinasjoner av slike fosfolipider kan også omfatte den "første surfaktant" på samme måte som naturlige avledede fosfolipid-produkter som egg- eller soyalecitin, eller lungesurfak-tanter. I tillegg kan den første fosfolipidsurfaktant supplementeres med andre vannoppløselige surfaktanter som sukrosedi-, -tri- og -tetraestere. Kolesterol kan også supplere den første surfaktant og er funnet brukbar med henblikk på å fremme stabilitet ved nærvær i en mengde av 0,0i til 0,5 vekt-% kolesterol, beregnet på fosfolipid. Fortrinnsvis er acylkjedene av fosfolipidet mettet, selv om umettede acylgrupper også ligger innenfor rammen av oppfin nelsen. Den første surfaktant tilveiebringes fortrinnsvis i området 0,005% til 20% vekt/volum av oppløsningen, helst i området 0,02% til 10% vekt/volum.

Det er funnet å være fordelaktig å benytte en fosfolipidblanding omfattende et relativt hydrofobt, langacylkjede-fosfolipid i kombinasjon med et korterekjede fosfolipid som er mere hydrofilt enn det første fosfolipid. Som et spesifikt eksempel kan et første fosfolipid med acylkjeder med 12 eller 14 karbonatomer tilveiebringes med et andre fosfolipid som en ko-surfaktant med acylkjeder med 8 eller 10 karbonatomer.

Det er funnet særlig fordelaktig å tilveiebringe fosfolipid med 12 karbonatom-acylkjeder som enten den første eller andre surfaktant. For eksempel kan et fosfolipid med 12 karbonatomer i acylkjedene omfatte den første surfaktant og en sukkerester eller en Pluronic-forbindelse kan utgjøre den andre surfaktant. Som en annen mulighet kan et fosfolipid med 16 karbonatom-acylkjeder utgjøre den første surfaktant og et fosfolipid med 12 karbonatom-acylkjeder utgjøre den andre surfaktant.

Det spraytørkede produkt som til slutt fremstilles er en mer effektiv bobleprodusent hvis et drivmiddel, fortrinnsvis et fluorkarbon som Freon 113, dispergeres i den ovenfor beskrevne oppløsning av stivelse og surfaktant. Drivmidlet kan være et hvilket som helst materiale som konverteres til gass under spraytørkingsprosessen. Drivmidlet dispergeres i surfaktantoppløsningen, f.eks. ved bruk av en kommersielt tilgjengelig mikrofluidisør ved et trykk på 5000 til 15 000 psi. Denne prosess gir en konvensjonell emulsjon bestående av submikrondråper av vannublandbart Freon (eller et annet drivmiddel), belagt med et monomolekylært surfaktantsjikt. Dispergering ved hjelp av denne eller andre teknikker er velkjent på området.

Inklusjonen av et drivmiddel i oppløsningen som skal spraytørkes resulterer i et større ultralydsignal pr. gram spraytørket pulver ved tildanning av et større antall hule mikrosfærer. Drivmidlet nukleerer dampbobledannelse i de atomiserte dråper av oppløsning som går inn i spraytørkeren når disse dråper blandes med varmluftstrømmen i tørkeren. Egnede drivmidler er de som overmetter oppløsningen i de forstøvede dråper med gass eller damp ved temperaturen for de tørkende dråper (vanligvis 100°C). Egnede drivmidler er: 1. Oppløste lavtkokende (under 100°C) oppløsningsmidler med begrenset blandbarhet med vandige oppløsninger, eksempler er metylenklorid, aceton og karbondisulfid, som benyttes for å mette oppløsningen ved romtemperatur. 2. En gass, f.eks. CO2eller N2, benyttet for å mette oppløsningen ved romtemperatur og forhøyet trykk (f.eks. 3 bar). Dråpene blir så overmettet med gassen ved 1 atmosfære og 100°C. 3. Emulsjoner av ublandbare, lavtkokende (under 100°C) væsker som Freon 113, perfluorpentan, perfluorheksan, perfluorbutan, pentan, butan, FC-11, FC-11B1, FC-11B2, FC-12B2, FC-21, FC-21B1, FC-21B2, FC-31B1, FC-113A, FC-122, FC-123, FC-132, FC-133, FC-141, FC-141B, FC-142, FC-151, FC-152, FC-1112, FC-1121 og FC-1131.

Drivmidler settes til stivelse/surfaktantoppløsningen i mengder på rundt 0,5 til 10 volum-% av surfaktantoppløs-ningen. Omtrent 3 volum-% drivmiddel er funnet å gi et spraytørket pulver som gir egnede mikrobobler. Drivmidlet fordampes vanligvis under spraytørkeprosessen og er således ikke til stede i det endelige, spraytørkede pulver i mer enn spormengder.

Andre eventuelle komponenter for oppløsningen er forskjellige salter eller andre midler i den vandige fase. Slike midler kan fortrinnsvis inkludere konvensjonelle viskositets-modifiserere, buffere som fosfatbuffere eller andre konvensjonelle, biokompatible buffere eller pH-justeringsmidler som syrer eller baser, osmotiske midler (for å gi isotonisitet, hyperosmolaritet eller hyposmolaritet). Foretrukne oppløs-ninger har en pH-verdi rundt 7 og er isotoniske. Disse ytterligere bestanddeler omfatter hver karakteristisk mindre enn 5% vekt/volum av oppløsningen. Eksempler på egnede salter er natriumfosfat (både monobasiske og dibasiske), natriumklorid, kalsiumfosfat og andre fysiologisk godtagbare salter.

Etter spraytørkingen omfatter de forskjellige, individuelle komponenter av mikrosfærene fortrinnsvis de følgende andeler av det endelige spraytørkede produkt i vekt-%:

Hydrofilt strukturmateriale 1% til 100%

Surfaktant 0% til 90% Salter, buffere, osv. 0% til 90%

I særlig foretrukne utførelsesformer har blandingen følgende andeler i vekt-%:

Hydrofilt strukturmateriale 10% til 60%

Surfaktant 0,1% til 10% Salter, buffere, osv. 10% til 60%

Som nevnt ovenfor tildannes den ønskede gass for å permeere de tørre mikrosfærer ved å anbringe mikrosfærene i en ampulle som er anbragt i et vakuumkammer for å evakuere luften. Luften blir så erstattet med den ønskede gass eller gassblanding. Gassen vil så diffundere inn i hulrommene i sfærene. Diffusjonen kan understøttes ved trykk- eller vakuumcyklisering. Ampullen blir så krympeforseglet og fortrinnsvis sterilisert ved gammastråling eller varme.

Fortrinnsvis er den første, primære, modifiserende gass (som kan være luft eller en hvilken som helst av luftens kompo nenter som nitrogen) og den andre, osmotiske stabiliserings-gass (fortrinnsvis med en lav Ostwald-koeffisient) respektivt til stede i et molforhold på rundt 1:100, 1:75, 1:50, 1:30, 1:20 eller 1:10 til ca. 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 75:1 eller 50:1. I en særlig foretrukne utførelsesform er gassen nitrogen som er mettet med perfluordiglym ved 20"C.

IV. Pakking og bruk

Det vil erkjennes at sett kan fremstilles for bruk ved fremstilling av mikrobølgepreparatene ifølge oppfinnelsen. Disse sett eller kitts kan inkludere en beholder som inneholder gassen eller gassene som beskrevet ovenfor for tildanning av mikroboblene, væsken og surfaktanten. Beholderen kan inneholde alle de sterile, tørre komponenter og gassen i et kammer, den sterile, vandige væske i et andre kammer av den samme beholder. Alternativt kan surfaktanten oppløseliggjøres I væsken før tilsetning.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i et bredt aspekt en fremgangsmåte for fremstilling av en gassemulsjon som omfatter: å tilveiebringe en beholder med et strukturmateriale som definerer et antall hulrom, en surfaktant og en gass eller en gassblanding omfattende en fluoreter dispergert i hulrommene;

tilsetning av vandig væske til beholderen; og

blanding av strukturmaterialet, surfaktanten og den vandige væske for derved å danne en gassemulsjon i beholderen idet gassemulsjonen omfatter bobler av gassen eller gassblandingen, omgitt av et sjikt av surfaktanten.

Egnede to-kammer-arapullebeholdere er f.eks. tilgjengelige under varemerkene WHEATON RS17FLW eller S-1702FL fra Wheaton Glass Co., (Millville, NJ). Et annet eksempel tilveiebringes fra B-D HYPAK Liquid/Dry 5+5 ml Dual Chamber forfylte sprøytesystemer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ; beskrevet i US 4 613 326). Fordelene ved dette system er: 1. Hensiktsmessighet i bruk; 2. det vannuoppløselige gassosmotiske middel er tettet i et kammer av vandig oppløsning på den ene side og et ekstremt lite areale av elastomerpakning i nålen på den annen side;

og

3. en filtreringsnål som Monoject #305 (Sherwood Medical, St. Louis, MO) kan tilpasses på sprøyten på fremstillings-tidspunktet for å sikre at ingen uoppløste faststoffer inj iseres.

Bruken av to-kammer-sprøyten for å danne mikrobobler er beskrevet i eksempel VIII.

Fagmannen vil erkjenne at to-kammer-rekonstitueringssystemet som kan kombinere det spraytørkede pulver med den vandige oppløsning på steril måte også ligger innenfor rammen av oppfinnelsen. I slike systemer er det særlig fordelaktig hvis den vandige fase kan anbringes mellom den vannoppløselige, osmotiske gass og omgivelsen, for derved å øke produktets hylletid. Der et materiale som er nødvendig for tildanning av mikroboblene ikke allerede er til stede i beholderen, kan det pakkes med de andre komponenter I denne kitt, fortrinnsvis i en form eller en beholder tilpasset til rett kombinasjon med de andre komponenter i kitten.

Eksempler på særlig, anvendelser for mikrobobler ifølge oppfinnelsen inkluderer perfusjonsavbildning av hjerte, det myokardiale vev og bestemmelse av perfusjonskarakteristikk for hjerte og dets vev under belastning eller øvelse, eller perfusjonsdefekter eller endringer på grunn av myokardialt infarkt. På samme måte kan myokardialt vev betraktes etter oral eller venøs administrering av medikamenter ment for å øke en blodstrøm til et vev. Videre visualisering av endringer i det myokardiåle vev på grunn av eller under forskjellige intervensjoner som koronar vevvenepoding, koronar angioplasi eller bruken av trombolytiske midler (TPA eller streptokinase), kan også økes. Da disse kontrastmidler hensiktsmessig kan administreres via en perifer vene for å forbedre visualiseringen av hele sirkulasjonssystemet, vil de også understøtte diagnosen av generelle, vaskulære patologier og evnen til å overvåke viabiliteten for placentalt vev ultrasonisk.

I en særlig foretrukken utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for harmonisk ultralyd-avbildning ved bruk av de beskrevne gassemulsjoner som kontrastmidler. Boblene ifølge oppfinnelsen er særlig brukbare ved harmoniske bildemetoder som de som er beskrevet i US-SN 08/314 074. Ved optimalisering av evnen for de beskrevne mikrobobler til å transformere frekvensen av ultralydstrålingen, hvortil de underkastes (den fundamen-tale), forbedrer bildetakingen. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse med fordel anvendelsen av mikrobobler som er i stand til å generere harmoni ved medisinsk brukbare ultralydeksiteringsamplityder.

Det skal også påpekes at foreliggende oppfinnelse har anvendelser utover ultralydbildeteknikk. Således er oppfinnelsen tilstrekkelig bred til å omfatte bruken av fosfolipidholdige gassemulsjoner i et hvilket som helst system inkludert ikke-biologiske anvendelser.

Det vil videre være. klart at andre komponenter kan innarbeides i mlkrobobleformuleringene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan osmotiske midler, stabilisatorer, chelatorer, buffere, viskositetsmodulatorer, luftoppløselighetsmodif1-serere, salter og sukkere tilsettes for å modifisere mikroboblesuspensjonene med henblikk på maksimal levetid og kontrastforbedringseffektivitet. Slike betraktninger som sterilitet, isotonisitet og biokompatibilitet kan styre bruken av slike konvensjonelle additiver i injiserbare blandinger. Bruken av slike midler vil være klart for fagmannen på området, og de spesifikke mengder, forhold og typer av midler kan bestemmes empirisk uten urimelig eksperimentering.

Et hvilket som helst av mikroboblepreparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et hvirveldyr som fugler eller pattedyr, som kontrastmiddel for ultrasoniske bildetaking av hvirveldyret. Fortrinnsvis er hvirveldyret et menneske og den del det tas bilde av, vaskulaturen. I denne utførelsesform blir en liten mengde mikrobobler (f.eks. 0,1 ml/kg [2 mg/kg spraytørket pulver] basert på hvirveldyrets kroppsvekt) innført intravaskulært i dyret. Andre mengder av mikrobobler som fra 0,005 ml/kg til 1,0 ml/kg, kan også benyttes. Bildetaking av hjerte, arterier, vener og blodrike organer som lever og nyrer, kan gjøres på ultrasonisk måte med denne teknikk.

V. Eksempler

Beskrivelsen ovenfor vil lettere forstås i forbindelse med de følgende eksempler som skal illustrere oppfinnelsen nærmere.

Eksempel I

Fremstilling av mikrobobler ved sonikering

Mikrobobler med en tallmidlere størrelse på 5 mikron ble fremstilt ved sonikering av en isotonisk vandig fase inneholdende 2% Pluronic F-68 og 1% sukrosestearat som surfaktanter, luft som modifiserende gass og perfluorheksan som gassosmotisk middel.

I dette forsøk ble 1,3 ml av en steril vannoppløsning inneholdende 0,9% NaCl, 2% Pluronic F-68 og 1% sukrosestearat satt til en 2,0 ml ampulle. Ampullen hadde et gjenværende topprom på 0,7 ml, til å begynne med inneholdende luft. Luft mettet med perfluorheksandamp (220 torr pr. perfluorheksan med 540 torr luft) ved 25°C ble benyttet for å spyle topprommet 1 ampullen. Ampullen ble forseglet med en tynn 0,22 mm polytetrafluoretylen (PTFE) septum. Ampullen ble snudd horisontalt og en 3 mm sonikerlngssonde festet til en 50 watt sonikator modell VC50, tilgjengelig fra Sonics & Materials, ble presset forsiktig mot septum. I denne posisjon separerte septum sonden fra oppløsningen. Energi ble så lagt på sonden og oppløsningen ble sonikert i 15 sekunder og det ble dannet en hvit oppløsning av fint oppdelte mikrobobler med en tallmidlere størrelse på 5 mikron, målt ved hjelp av en laserlys-spredningspartikkelanalysør av typen Horiba LA-700.

Eksempel II

Spraytørking av fosfolipidholdig oppløsning

1 liter av den følgende oppløsning ble preparert i vann for injeksjon: 2,0% vekt/volum Maltrin M-100 maltodekstrin (Grain Processing Corp., Muscatine, IA), 0,95% vekt/volum natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO), 1,0% Superonic F-68 (Serva, Heidelberg, Tyskland), 1% vekt/volum Ryoto sukrosestearat S-1670 (Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japan) og 0,5% Lipoid E-100-3 hydrogenert fosfolipid (Ludwigshafen, Tyskland).

Denne oppløsning ble så spraytørket i en "Niro Atomizer Portable Spray Dryer" utstyrt med to fluidatomisører (Niro Atomizer, København, Danmark) ved bruk av følgende innstillinger: varmluftstrømningshastighet 39,5 ft<5>/min. innløpslufttemperatur 245°C

utløpslufttemperatur 100°C

atomisørluftstrøm 350 liter/min.

væskematehastighet 1 liter/time

Det tørre, hule, sfæriske produkt hadde en diameter mellom 1 pm og 15 pm og ble samlet ved hjelp av den cyklonseparator som standard er denne tørker. Pulveraliquoter på 250 mg ble velet Inn i 10 ml rørampuller, evakuert og spylt med perfluorheksan-mettet nitrogen ved 13" C og forseglet. Nitrogenet ble mettet med perfluorheksan ved føring gjennom tre perfluorheksan-fylte gassvaskeflasker nedsenket i et vannbad av 13°C.

Ved rekonstituering med 5 ml vann for injeksjon ble tallrike bobler observert ved lysmikroskopi og i størrelsesområdet 1 til 20 mikron. Det faktum at mange ca. 1 mikrons bobler kunne observeres i et betydelig tidsrom, viste den økede stabilitet som var oppnådd ved å inkludere et fosfolipid i formelen som en ytterligere, ikke-ionisk, viskoelastisk surfaktant.

Eksempel III

Perf luordlgl. vmgassemuls. 1on med sukr osees ter/ pol oksamer-surfaktant 1 liter av hver av de følgende to oppløsninger ble preparert med de følgende bestanddeler for injeksjon:

Oppløsning 1:

3,9% vekt/volum m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajinimoto, Tokyo, Japan) 3,25% vekt/volum natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

2,83% vekt/volum natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO) 0,42% vekt/volum natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Oppløsning 2:

2,11% vekt/volum Poloxamer 188 (BASF, Parispany, NJ)

0,32% vekt/volum Ryoto sukrosestearat S-1670

(Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japan)

0,16% vekt/volum Ryoto sukrosestearat S-570

(Mitsubishi-Kasei Food Corp., Tokyo, Japan)

Oppløsning 2 ble satt til en høyskjærblander og avkjølt i et isbad. En grovsuspensjon av 30 ml 1,1,2-triklortrifluoretan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) ble fremstilt i 1 liter av oppløsning 2. Denne suspensjon ble emulgert ved bruk av en Microfluidizer (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modell M-110F) ved 10 000 psi og 5°C for fem gjennomføringer. Den resulterende emulsjon ble satt til oppløsning 1. Denne ble så spraytørket i en "Niro Atomizer Portable Spray Dryer" utstyrt med en to-fluidatomisør (Niro Atomizer, København, Danmark) ved bruk av de følgende innstillinger: varmluftstrømningshastighet 31 ft<J>/min. innløpslufttemperatur 370°C

utløpslufttemperatur 120"C

atomisørluftstrøm 290 liter/min. væskematehastighet 1,5 liter/time

Det tørre, hule, sfæriske produkt hadde en diameter mellom rundt 1 um og rundt 15 um og ble samlet ved den cyklonseparator som er standard for denne tørker. Pulveraliquoter på 200 mg ble veiet inn i 10 ml rørampuller, spylt med perfluordiglym-mettet nitrogen ved-20*C og forseglet. Nitrogenet ble mettet med perfluordiglym ved føring gjennom tre perfluordiglym-fylte gassvaskeflasker nedsenket i et 20°C vannbad. Mengden perfluordiglymdamp pr. ampulle var 12-14 mg. ;Ampullene ble rekonstituert med 5 ml vann for injeksjon etter innføring av en nål nr. 18 som ventil for å avlaste trykket etter hvert som vann ble injisert, for derved å danne ca. 6 x IO* bobler pr. ml som var stabile in vitro i flere dager. 1 ml av den resulterende mikroboblesuspensjonen ble injisert intravenøst i en kanin på ca. 3 kg, instrumentert for å overvåker Doppler-ultralydsignalet fra karotidarterien. En 10 MHz strømningsmansjett (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modell ES-10-20) forbundet til en system 6 Doppler-strømningsmodul (Tritron Technology Inc.) matet RF Doppler-signalet til et LeCroy 9410-oscilloskop (Le Croy, Chestnut Ridge, NY). Den rotmidlere kvadrat (RMS) spenning for signalet som ble beregnet av oscilloskopet ble overført til en computer og resultantkurven tilpasset for å oppnå peak- ekogenisk signalintensitet og halveringstid for mikroboblene i blodet. Signalene før kontrast var mindre enn 0,1 Volt RMS. 60 sekunder etter injeksjon var signal intensiteten 1,1 Volt RMS med en konstant reduksjon på ca. 0,00859 s-<1>.

Eksempel IV

Perf luordiglymgassemuls. ion med fosfolipid/ poloksamer-surfaktant 1 liter av hver av de to følgende oppløsninger ble fremstilt med følgende bestanddeler for injeksjon:

Oppløsning 1:

36 g m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajinimoto, Tokyo, Japan)

30 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

26 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3,9 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Oppløsning 2:

4,5 g Poloxamer 188 (BASF, Parispany, NJ)

4,5 g dipalmitoylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

Oppløsning 2 ble satt til en høyskjærblander og avkjølt i et isbad. En grovsuspensjon på 30 ml 1,1,2-trlklortrifluoretan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) ble fremstilt i den ene liter av oppløsning 2. Denne suspensjon ble emulgert ved bruk av en Microfluidizer (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modell M-110F) ved 10 000 psi og 5<e>C ved fem gjennom-føringer. Den resulterende emulsjon ble satt til oppløsning 1. Denne blanding ble så spraytørket i en "Niro Atomizer Portable Spray Dryer" utstyrt med en to-fluidforstøver (Niro Atomizer, København, Danmark) ved bruk av de følgende innstillinger: varmluftstrømningshastighet 31 ft<5>/min. innløpslufttemperatur 325"C

utløpslufttemperatur 120°C

atomisørluftstrøm 290 liter/min. vaeskematehastighet 1,5 liter/time

Det tørre, hule, sfæriske produkt hadde en diameter mellom rundt 1 um og rundt 15 um og ble samlet på den cyklonseparator som er standard for denne tørker. Pulveraliquoter på 200 mg ble veiet inn i 10 ml rørampuller, spylt med perfluordiglym-mettet nitrogen ved 20°C og forseglet. Nitrogenet ble mettet med perf luordiglym ved å føre det gjennom tre perfluordiglym-fylte gassvaskeflasker nedsenket i et 20°C vannbad. Mengden perfluordiglymdamp pr. ampulle var 12-14 mg.

Ampullene ble rekonstituert med 5 ml vann for injeksjon etter innføring av en nål nr. 18 som lufting for å avlaste trykket etter hvert som vann ble injisert, og det ble dannet ca. 3 x 10^ bobler pr. ml som var stabile in vitro i flere dager. 1 ml av den resulterende mikroboblesuspensjonen ble injisert intravenøst i en kanin på ca. 3 kg, som var instrumentert for å overvåker Doppler-ultralydsignalet fra karotidarterien. En 10 MHz strømningsmansjett (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modell ES-10-20) forbundet til en system 6 Doppler-strømningsmodul (Tritron Technology Inc.) matet RF Doppler-signalet til et LeCroy 9410-oscilloskop (Le Croy, Chestnut Ridge, NY). Den rotmidlere kvadrat (RMS) spenning for signalet som ble bearbeidet av oscilloskopet ble overført til en computer og resultantkurven tilpasset for å oppnå en peak-ekogenisk signallntensitet og halveringstid for mikroboblene i blodet. Signalene før kontrast var mindre enn 0,1 Volt RMS. 60 sekunder etter injeksjon var signalintensiteten 0,4 Volt RMS med en konstant nedbrytning på ca. 0,01835 s-<1>.

Eksempel V

Perfluordiglvmgassemulsjon med fosfolipidblandlng/ surfaktant 1 liter av hver av de følgende to oppløsninger ble fremstilt med følgende bestanddeler for injeksjon:

Oppløsning 1:

36 g m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajinimoto, Tokyo, Japan)

30 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

26 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3,9 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Oppløsning 2:

4,8 g dipalmitoylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) 3,4 g dioktanoylfosfatidylkolin (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

Oppløsning 2 ble satt til en høyskjærblander og avkjølt i et isbad. En grovsuspensjon på 30 ml 1,1,2-triklortrifluoretan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) ble fremstilt i den ene liter av oppløsning 2. Denne suspensjon ble emulgert ved bruk av en Microfluidizer (Microfluidics Corporation, Newton, MA; modell M-110F) ved 10 000 psi og 5°C ved fem gjennom-føringer. Den resulterende emulsjon ble satt til oppløsning 1. Denne blanding ble spraytørket i en "Niro Atomizer Portable Spray Dryer" utstyrt med en to-fluidforstøver (Niro Atomizer, København, Danmark) ved bruk av de følgende innstillinger: varmluftstrømnlngshastighet 31 ft<J>/min. innløpslufttemperatur 325"C

utløpslufttemperatur 120°C

atomisørluftstrøm 290 liter/min. vaeskematehastighet 1,5 liter/time

Det tørre, hule, sfæriske produkt hadde en diameter mellom rundt 1 pm og rundt 15 um og ble samlet ved den cyklonseparator som er standard for denne tørker. 200 mg aliquoter ble veiet inn i 10 ml rørampuller, spylt med perfluordlglym-mettet nitrogen ved 13"C og forseglet. Nitrogenet ble mettet med perfluordiglym ved å føre det gjennom tre perfluordiglym-fylte gassvaskeflasker nedsenket 1 et 13°C vannbad. Mengden perfluordiglymdamp pr. ampulle var 12-14 mg.

Ampullene ble rekonstituert med 5 ml vann for injeksjon etter innføring av en nål nr. 18 som lufting for å avlaste trykket etter hvert som vann ble injisert, og det ble dannet ca. 2 x IO<8>bobler pr. ml som var stabile in vitro i flere dager. 1 ml av den resulterende mikroboblesuspensjonen ble injisert intravenøst i en kanin på ca. 3 kg, som var instrumentert for å overvåker Doppler-ultralydsignalet fra karotidarterien. En 10 MHz strømningsmansjett (Triton Technology Inc., San Diego, CA; modell ES-10-20) forbundet til en system 6 Doppler-strømningsmodul (Tritron Technology Inc.) matet RF Doppler-signalet til et LeCroy 9410-oscilloskop (Le Croy, Chestnut Ridge, NY). Den rotmidlere kvadrat (RMS) spenning for signalet som ble bearbeidet av oscilloskopet ble overført til en computer og resultantkurven tilpasset for å oppnå en peak-ekogenisk slgnalintensitet og halveringstid for mikroboblene i blodet. Signalene før kontrast var mindre enn 0,1 Volt RMS. 60 sekunder etter injeksjon var signal intens!teten 0,2 Volt RMS med en konstant nedbrytning på ca. 0,00387 s"<1>.

Eksempel VI

Blokompatibilltet for gassemulsjoner fremstilt fra blandede langkjede/kortkjede fosfoliplder

1 liter av den følgende emulsjon ble fremstilt for spray-tørking som beskrevet i eksempel II: 3,6% vekt/volum m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajiniinoto, Tokyo, Japan) 3,0% vekt/volum natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

2,6% vekt/volum natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO) 0,39% vekt/volum natriumfosfat, monobasisk

(Mallinckrodt, St. Louis, MO)

0,22% vekt/volum dipalmitoylfosfatidylkolin

(Syngena Ltd., Cambridge, MA)

0,31% vekt/volum dioktanoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)

3,0% vekt/volum 1,1,2-triklortrifluoretan

(Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ)

Ved disse forhold mellom dipalmitoylfosfatidylkolin og dioktanoylfosfatidylkolin danner surfaktantene kun blandede miceller. Ved rekonstitusjon med 5 ml vann, ble det observert ca. 51 million gassemulsjonsdråper pr. ml med en størrelse i området 1 til 20 mikron. Første ordens nedbrytningskonstant for det ekogene signal for gassemulsjonen i kaniner ved en dose på 5 mg/kg ble bestemt til å være 0,0029 s-<1>. Dette tilsvarer en intravaskulær halveringstid på 4 minutter.

Gassemulsjonen ble analysert på komplementaktivering ved bruk av en in vitro-C3a-diagnostisk kitt, markedsført av Ouidel Corp. (San Diego, CA). Det ble ikke observert noen forskjell mellom gassemulsjonen og den negative kontroll (saltoppløs-ning), noe som indikerer at gassemulsjonen ikke aktiverer komplement. Det er velkjent at nakne mikrobobler aktiverer komplement.

Gassemulsjonen ble også analysert med henblikk på endringer i hemodynamikken hos anestetiserte hunder i en dose på 20 mg/kg. Det ble ikke observert noen endringer i det midlere arterietrykk eller det pulmonære arterietrykk. Disse resultater antyder det ikke observeres noen hemodynamiske effekter i gassemulsjonen ved 10-100 ganger den kliniske relevante dose.

Således tilveiebringes det utmerket effektivitet og biokompatibilitet i de samme gassemulsjonsformuleringer.

Eksempel VII

Mikrobobledannelse ved bruk av en to- kammerampulle

800 mg spraytørket pulver ble veiet inn i det nedre kammer av en 20 ml Wheaton RS-177FLW-to-kammerampulle. Ampullen ble fylt med perfluorheksan-mettet nitrogen ved 13°C før innføring av interkammerpakningen. Det øvre kammer ble fylt med 10 ml sterilt vann for injeksjon. Den øvre kammerpropp ble innført for å eliminere alle luftbobler i det øvre kammer. Ved nedtrykking av den øvre propp ble interkammerpakningen tvungen inn i det nedre kammer og tillot vann å strømme inn i det nedre kammer og rekonstituere pulveret. Det ble dannet tallrike, stabile mikrobobler som påvist ved lysmikroskopi. Denne prosedyre viser hensiktsmessigheten for denne pakningsform og eliminering av behovet for å tilveiebringe en lufting for å fjerne trykkoppbygning når den vandige fase settes til pulveret.

Eksempel VIII

Mikrobobledannelse ved bruk av to- kammersprøyte

100 mg spraytørket pulver ble veiet inn i en 5 ml + 5 ml HYPAK Liquid/Dry-dualkammersprøyte (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) og rystet inn i pulver (nåleenden)

kammeret. Interkammerpakningen ble så posisjonert akkurat over bypasskanalen. En 5 um filterholdig nål ble så satt på sprøyten. Det pulverholdige kammer ble så fylt med gassosmotisk middel ved å plassere det hele i et vakuumkammer, evakuering og fylling av kammeret igjen med det gassosmotiske middel, perfluorheksan-mettet nitrogen ved 13°C. Filternålen tillater evakuering og omfylling av atmosfæren i det pulverholdige kammer. Et tetningsnållokk ble så anbragt på nålen. Væskekammeret ble så fylt med 4 ml vann for injeksjon og plungeren ble bragt på plass ved bruk av en temporær lufting (wire innført mellom glass-sprøyteløpet og plungeren) for å eliminere alle luftbobler.

For rekonstituering ble nåletetningslokket fjernet for å eliminere trykkoppbygning i pulverkammeret. Plungeren ble så trykket ned og tvang interkammertetningen til bypass-posisjonen som tillot at vann strømmet rundt interkammerpakningen inn i det pulverholdige kammer. Plungerbevegelsen ble stoppet når alt vannet befant i pulverkammeret. Sprøyten ble agitert for å oppløse pulveret. Overskytende gass og tilstedeværende store bobler ble fjernet ved å holde sprøyten med nåleenden opp og så å presse plungeren ytterligere inn. Oppløsningen inneholdende tallrike stabiliserte mikrobobler (som observert ved lysmikroskopi) ble så presset ut fra sprøyten ved å presse plungeren til anslag.

Eksempel IX

In vlvo- effektivitet for fluoreterholdige gassemulsjoner i forhold til luft og fluoralkanholdige gassemulsjoner 1 liter av dispersjon A ble fremstilt og spraytørket som beskrevet i eksempel III og 1 liter av dispersjonene B og C ble fremstilt og spraytørket som beskrevet i eksempel V.

A. Sukroseeter-mikroboble-dannelse ("AF0145" i tabellen)

36 g m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajinimoto, Tokyo, Japan)

30 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

26 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3,9 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

4,5 g sukroseester 11025003

(Alliance Pharmaceutical Corp., San Diego, CA)

19,5 g Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

30 ml 1,2,2-triklortrifluoretan (Freon 113; EM Science, Gibbstown, NJ) Vann for injeksjon: 490 ml

B. Fosfolipidblanding-mikrobobledannelse ("24b" i tabellen) 36 g m-HES-hydroksyetylstivelse (AJinimoto, Tokyo, Japan)

30 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

26 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3,9 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

4,5 g dimyristoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

4,5 g dioktanoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

5.8 volum-% perfluorheksan (3M)

Vann for injeksjon: 490 ml

C. Fosfolipidblanding^mikrobobledannelse ("24f" i tabellen) 36 g m-HES-hydroksyetylstivelse (AJinimoto, Tokyo, Japan)

30 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

26 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3.9 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

3,4 g dimyristoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

4,8 g dioktanoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

5,8 volum-% perfluorheksan (3M)

Vann for injeksjon: 490 ml

100 mg prøver av det spraytørkede pulver ble anbragt i 10 ml ampuller og gassbehandlet med perfluoreter-luft-blanding i gjentatte evakuering-gassfyllingscykler ved hjelp av en sprøytenål utstyrt med en tre-velsventll. Som fyllgasser benyttet man perfluordimetyleter (85%, Exfluor Research,

Texas, Austin), perfluor(metyletyleter) (80%, Exfluor Research, Texas, Austin), perfluor(dietyleter) (90%, Strem Chemicals, Newburyport, MA) n-perfluorprpan og n-perfluorbutan (97%, PCR Incorporated). Mengden perfluoreter- og fluorkarbondamper pr. ampulle er vist i tabellen.

Etter rekonstituering med 5 ml vann ble boblene dannet og de var stabile in vitro i flere dager. Deres ekogene egenskaper in vivo ble evaluert ved bruk av en pulset Doppler-signalforbedrings-kaninmodell som beskrevet i eksempel III. Egenskapene for bobledispersjonene er oppsummert i tabellen.

Alle perfluoreterprøvene ga et signifikant ultralydsignal opptil 300 sekunder etter injeksjon i blodstrømmen. De samme preparater fylt med luft viste ikke noen ekogenisitet 5 sekunder etter injeksjon. Videre hadde perfluoreter-fylte prøver en 20-30% bedre effektivitet enn fluorkarbonanalogene med det samme antall karbonatomer, selv anvendt i mindre mengder. Figuren illustrerer det pulsede Doppler-signal i volt som en funksjon av tiden for forsøkene 1 og 2 som vist i

tabellen ovenfor.

Eksempel X

In vivo- ekogenisitet for hjerte og lever etter administrering av fluoretergassemulsjon versus fluoralkanholdig gassemulsjon Prøvene 2 og 3 som vist i tabellen i eksempel IX ble injisert i ørevenen hos en kanin, hvoretter ultralydspredd signal ble målt ved hjelp av et ACUSON 128XP-instrument med en 7 MHz transduser. Akkurat etter injeksjon, førte begge blandingene til en vesentlig utkontrastering av blodkarene og hjertet. Denne kontrast forsvant gradvis (over en tidsskala på flere minutter) og ble erstattet ved utkontrastering av leveren som varte i 10 minutter med perfluorbutan (prøve 3) og rundt 15 minutter med perfluor(metyletyleter) (prøve 2).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en stabil gass-dispersjon eller emulsjon som er egnet for bruk som ultralyd-og magnetisk resonansbildetakings(MRI)kontrastforbedrings-middel der boblene har en lengere levetid in vivo. Typisk ultralydkontrastforbedringsmidler viser kun kontrast-forbedringspotensial for ca. en gjennomføring gjennom arteriesystemet eller få sekunder til ca. 1 minutt. I henhold til dette blir slike midler generelt ikke sirkulert forbi aorta hos en pasient etter intravenøs injeksjon. Som sammenligning fortsetter stabile kontrastmidler som er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse å vise kontrast-forbedringsvarighet tilstrekkelig til flere passasjer gjennom hele sirkulasjonssystemet hos en pasient etter intravenøs injeksjon. In vivo-boblelevetider på flere minutter kan lett påvises. En slik utvidelse av det kontrastforbedrende potensial under ultralyd er meget fordelaktig. I tillegg gir kontrastforbedringsmidlene ifølge oppfinnelsen forbedret bildetaking. For eksempel er det oppnådd klare, tydelige og distinkte bilder av blodstrømmen gjennom hjertet, lever og nyrer. Således kan små, ikke-toksiske doser av blandingene Ifølge oppfinnelsen administreres til en perifer vene og benyttes for å forbedre bildeopptakene for hele legemet.

Eksempel XI

In vivo- effektivitet av perfluoreterholdige gassemulsjoner mot perfluoralkanholdlge gassemulsjoner: Kanin- modell 1 liter av dispersjon D ble fremstilt og spraytørket som beskrevet i eksempel V:

Sammensetning av dispersjon D:

43,2 g m-HES-hydroksyetylstivelse (Ajinimoto, Tokyo, Japan)

31,32 g natriumfosfat, dibasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

4,68 g natriumfosfat, monobasisk (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

1,2 g Poloxamer 188 (BASF, Parsipany, NJ)

6 g dimyristoylfosfatidylkolin

(Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama)

61,2 g perfluorheksan (3M)

4,4 g natriumklorid (Mallinckrodt, St. Louis, MO)

Vann for injeksjon: 945 g

200 mg prøver av det spraytørkede pulver ble anbragt i 20 ml ampuller og gassbehandlet med en blanding av osmotisk middel og nitrogen, fremstilt på forhånd i en 1 liter luftpose. Ampullene med pulver ble evakuert gjentatte ganger og fylt med blandingen av osmotisk middel og nitrogen under et totaltrykk på 1 atm. og partialtrykket av det osmotiske middel utgjorde 0,13±0,03 atm. De osmotiske midler som ble studert er oppsummert i tabell III.

Etter rekonstituering av pulveret med 10 ml vann ble boblene dannet. Deres ekogene egenskaper ln vivo ble bedømt ved anvendelse av en pulset Doppler-signalforbedrings-kaninmodell som beskrevet i eksempel III, bortsett fra den injiserte dose ble redusert til 0,2 ml (ca. 1 mg tørrpulver pr. kg kanin). Figurene 2a, 2b og 2c sammenligner nedbygningen av ultralydsignalet over tid for forskjellige gasser ved nære partialtrykk. De angitte data er anordnet i par slik at mikroboblepreparater omfattende perfluoretere (tykke linjer) sammenlignes direkte med sine perfluorkarbon-analoger (tynne linjer). Fra diagrammene er det klart at perfluoreter-fylte bobler har en lengere persistens i blodstrømmen enn deres fluorkarbon-analoger.

Eksempel XII

In vivo- effektlvitet for perfluoreterholdige gassemulsjoner versus perfluoralkanholdlge gassemulsjoner: Grise- modell

Pulver D ble fremstilt som beskrevet i eksempel XI og fylt med perfluorheksan-N2-blanding (28 mg av osmotisk middel pr. ampulle, partialtrykk 0,16 atm.) og C5FjL204-<N>2-blandIng (22 mg osmotisk middel pr. ampulle, partialtrykk 0,12 atm.). Etter rekonstituering av pulveret med 10 ml vann, ble boblene dannet.

Anestetiserte griser med en kroppsvekt på 14-16 kg ble utstyrt med innebygde katetere i femoralarterien og femoral-og jugulærvenene for hemodynamisk overvåking og kontrast-middeladministrering. Parasternale kort-akse kardialbilder på nivået for papillærmusklene ble oppnådd ved bruk av en HP Sonos 2500-ultralydmaskin. Bilder ble tilveiebragt på "Second Harmonic" måte med en lineærfaset analysesonde med bred båndbredde som emitterte ved 2 MHz og mottok ved 4 MHz. Bildetakingen har intermittent (portet), utløst ved ende-diastolen av hver kardialcyklus. 0,5 ml rekonstituert kontrastmiddel ble fortynnet med 0,5 ml steril saltoppløsning og infusert i løpet av 1 minutt via jugulærvenen.

Figurene 3a, 3b og 3c representerte et bilde av hjertet før infusjon av kontrastmidlet (3a), 1 minutt (3b) og 6 minutter (3c) etter injeksjon.

Substansiell kontrast for hjertet er åpenbar (fig. 3b) for begge fyllgasser 1 minutt etter injeksjon. Mens det imidlertid fremdeles er en stor del vevkontrast' i bilde som ble oppnådd ved bruk av mikroboblepreparatet omfattende en perfluoreter ved 6 minutter (fig. 3c), hadde kontrasten i bildet som ble oppnådd ved bruk av et mikroboblepreparat omfattende perfluorheksan avtatt betydelig. Dette viser at perfluorpolyeter-fylte mikrobobler klart gir klinisk brukbare kontrastbilder i lengere tid.

Den foregående beskrivelse detaljerer visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen og beskriver også den antatt beste utførelsesform. Det skal imidlertid allikevel være klart at beskrivelsen kun er illustrerende.

Claims (42)

1. Gassemulsjon for ultralydkontrastforbedring omfattende et antall gassbobler i et flytende medium, karakter 1-sert ved at gassboblene omfatter en forbindelse med en Ostwald-koef f isient på mindre enn rundt 500 x 10~ <6> ved 37°C.

2. Gassemulsjon ifølge krav 1, karakterisert ved at gassboblene omfatter en fluoreter.

3. Gassemulsjon ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen har et damptrykk på mindre enn rundt 760 mm Hg ved 37°C.

4. Gassemulsjon ifølge krav 1, karakterisert ved at gassboblene er omgitt av et surfaktantsjikt.

Gassemulsjon ifølge krav 4, karakterisert ved at surfaktantsjiktet omfatter en surfaktant valgt blant fosfolipider, fosfokoliner, lysofosfolipider, ikke-ioniske surfaktanter, nøytrale surfaktanter, anioniske surfaktanter, nøytrale, fluorerte surfaktanter, anioniske, fluorerte surfaktanter og kombinasjoner derav.

6. Gassemulsjon ifølge krav 4, karakterisert ved at surfaktantsjiktet omfatter minst en første og en andre surfaktant, der den første surfaktant i det vesentlige består av et fosfolipid eller en blanding av fosfolipider med minst en acylkjede omfattende minst 10 karbonatomer, og utgjørende minst rundt 5 vekt-% av den totale surfaktant, og den andre surfaktant er mere vannoppløselig enn den første surfaktant.

7. Gassemulsjon ifølge krav 6, karakterisert ved at den andre surfaktant er valgt fra gruppen bestående av fettsyrer, salter av fettsyrer, sukkerestere av fettsyrer, polyoksypropylen-polyoksyetylenkopolymerer, ikke-ioniske alkylglukosider, polysorbat og kombinasjoner derav.

8. Gassemulsjon ifølge krav 6, karakterisert ved at den andre surfaktant er valgt fra gruppen omfattende fosfolipider, fosfokolin, lysofosfolipid og kombinasjoner derav, der hver acylkjede ikke omfatter mer enn 14 karbonatomer.

9. Gassemulsjon ifølge krav 6, karakterisert ved at den første surfaktant omfatter et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 12 til 18 karbonatomer, og at den andre surfaktant omfatter et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 6 til 12 karbonatomer.

10. Gassemulsjon for ultralydkontrastforbedring omfattende et antall gassbobler I et flytende medium, karakterisert ved at gassboblene omfatter en fluoreter. li.

Gassemulsjon ifølge krav 10, karakterisert ved at fluoreteren er en polyfluoreter valgt blant CF3 0CF2 0CF3 , CF3 (0C <F>2 )2 0CF3 , CF3 (0C F2 )3 0CF3 og CF3 (0C F2 )4 0CF3 .

12. Gassemulsjon ifølge krav 10, karakterisert ved at fluoreteren er valgt blant perfluordietyletere, perfluordimetyletere, perfluordiglymer, perfluormetyletyletere og perfluormonoglymer.

13. Gassemulsjon Ifølge krav 10, karakterisert ved at gassen i tillegg omfatter luft eller nitrogen.

14. Gassemulsjon ifølge krav 11, karakterisert ved at gassen i tillegg omfatter luft eller nitrogen.

15. Gassemulsjon ifølge krav 10, karakterisert ved at gassboblene er omgitt av et surfaktantsjikt.

16. Gassemulsjon Ifølge krav 15, karakterisert ved at surfaktantsjiktet omfatter en surfaktant valgt blant fosfolipider, fosfokoliner, lysofosfolipider, ikke-ioniske surfaktanter, nøytrale surfaktanter, anioniske surfaktanter, nøytrale, fluorerte surfaktanter, anioniske, fluorerte surfaktanter og kombinasjoner derav.

17. Gassemulsjon ifølge krav 15, karakterisert ved at surfaktantsjiktet omfatter minst en første og en andre surfaktant, der den første surfaktant i det vesentlige består av et fosfolipid eller en blanding av fosfolipider med minst en acylkjede omfattende minst 10 karbonatomer, og utgjørende minst rundt 5 vekt-% av den totale surfaktant, og den andre surfaktant er mere vannoppløsellg enn den første surfaktant.

18. Gassemulsjon ifølge krav 17, karakterisert ved at surfaktanten er valgt fra gruppen bestående av fettsyrer, salter av fettsyrer, sukkerestere av fettsyrer, polyoksypropylen-polyoksyetylenkopolymerer, ikke-ioniske alkylglukosider, polysorbat og kombinasjoner derav.

19. Gassemulsjon ifølge krav 17, karakterisert ved at den andre surfaktant er valgt fra gruppen omfattende fosfolipider, fosfokolin, lysofosfolipid og kombinasjoner derav, der hver acylkjede ikke omfatter mer enn 14 karbonatomer.

20. Gassemulsjon ifølge krav 15, karakterisert ved at den første surfaktant omfatter et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 12 til 18 karbonatomer, og at den andre surfaktant omfatter et fosfatidylkolin med en eller flere acylkjeder, der minst en kjede omfatter 6 til 12 karbonatomer.

21. Gassemulsjon ifølge krav 10, karakterisert ved at gassboblene er frie gassbobler.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av en gassemulsjon omfattende: å tilveiebringe en beholder inneholdende et strukturelt materiale som definerer et antall hulrom, en surfaktant og en gass eller en gassblanding omfattende en fluoreter dispergert i hulrommene; tilsetning av vandig væske til beholderen; og blanding av det strukturelle materialet, surfaktanten og den vandige væske for derved å danne en gassemulsjon i beholderen hvorved gassemulsjonen omfatter bobler av luften og gassblandingen, omgitt av et sjikt av surfaktant.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det strukturelle materialet er I det vesentlige vannoppløselig.

24 . Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at fluoreteren er en polyfluoreter valgt fra gruppen omfattende CF3 0CF2 0CF3 , CF3 (0CF2 )20CF3 , CF3 (OCF2 )3<O> CF3 og CF3(0CF2 )4OCF3.

25 . Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at fluoreteren er valgt blant perfluordietyletere, perfluordimetyletere, perfluormetyletyletere, perfluormonoglymer og perfluordiglymer.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det strukturelle materialet omfatter nevnte surfaktant.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at surfaktanten er valgt blant fosfolipider, fosfokoliner, lysofosfolipider, ikke-ioniske surfaktanter, nøytrale surfaktanter, anioniske surfaktanter, nøytrale, fluorerte surfaktanter, anioniske, fluorerte surfaktanter og kombinasjoner derav.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at materialet er valgt blant hulromholdige strukturer og oppløselige, hulrom-dannende strukturer.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det strukturelle materialet er valgt sukkere, spraytørkede mikrosfærer, lyofiliserte pulvere, lyofilisert kake, pulveriserte og granulerte sukkere, proteinmikrosfærer og tørr, porøs hyaluronsyre.

30. Mlkrobobleforløperblanding, karakterisert ved at den omfatter: et strukturelt materiale som definerer et antall hulrom; en gass eller en gassblanding omfattende en fluoreter dispergert i hulrommene; og en surfaktant der materialet, gassen eller gassblandingen og surfaktanten sammen kan danne mikrobobler ved tilsetning til beholderen av en væske.

31. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at det strukturelle materialet er i det vesentlige vannoppløselig.

32. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at fluoreteren er en fluorpolyeter valgt fra gruppen omfattende CF3 0CF2 0CF3 , CF3 (0CF2 )2<0> CF3 , CF3 (0CF2 )3 <0> CF3 og CF3 (0C F2 )4 0CF3 .

33. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at fluoreteren er valgt blant perfluordietyletere, perfluordimetyletere, perfluormetyletyletere, perfluormonoglymer og perfluordiglymer.

34. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at det strukturelle materialet omfatter nevnte surfaktant.

35. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at surfaktanten er valgt blant fosfolipider, fosfokoliner, lysofosfolipider, ikke-ioniske surfaktanter, nøytrale surfaktanter, anioniske surfaktanter, nøytrale, fluorerte surfaktanter, anioniske, fluorerte surfaktanter og kombinasjoner derav.

36. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at det strukturelle materialet er valgt blant hulromholdige strukturer og vannoppløselige, hulrom-dannende strukturer.

37. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at det strukturelle materialet er valgt spraytørkede mikrosfærer, granulerte og pulveriserte sukkere, lyofiliserte pulvere, lyofiliserte kaker, proteinmikrosfærer og tørr, porøs hyaluronsyre.

38. Blanding ifølge krav 37, karakterisert ved at det strukturelle materialet omfatter spraytørkede mikrosfærer og at disse omfatter en forbindelse valgt blant stivelser, derivatiserte stivelser og sukkerestere.

39. Blanding ifølge krav 30, karakterisert ved at det strukturelle materialet omfatter en forbindelse valgt blant karbohydrater og proteiner.

40. Fremgangsmåte for ultralydbildetaking av en gjenstand eller et legeme, karakterisert ved at den omfatter: innføring av kontrastmediet i krav 10 i gjenstanden eller legemet; og avbildning av minst en del av gjenstanden eller legemet.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 40, karakterisert ved at bildetakingstrinnet omfatter ultralydharmonisk bildetaking.

42. Fremgangsmåte for magnetisk resonansbildetaking av en gjenstand eller et legeme, karakterisert ved at den omfatter trinnene: innføring av kontrastmediet ifølge krav 10 I legemet eller gjenstanden; og avbildning av minst en del av gjenstanden eller legemet.