JP3135919B2

JP3135919B2 - 超音波検査法のための強化剤としての安定性微小泡懸濁液

Info

Publication number: JP3135919B2
Application number: JP06507577A
Authority: JP
Inventors: シュナイダー，ミヒャエル; ブロショ，ジャン; プジニエール，ジェローム; ヤン，フェング
Original assignee: ブラッコインターナショナルベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1992-11-02
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 2001-02-19
Anticipated expiration: 2016-02-19
Also published as: HU9401409D0; AU3431795A; HU227043B1; AU681812B2; US20030129137A1; FI943167A; WO1994009829A1; US5686060A; EP0619743B1; DE69307124D1; IS1625B; EP0619743A1; KR100216138B1; FI115953B; DE10199055I1; AU666238B2; AU5336294A; IS4089A; US6187288B1; ATE146972T1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、その中の少なくとも１つが時間及び圧力に
よる崩壊に対するリン脂質安定剤である両親媒性化合物
を含んで成る水性担体中のガス充填微小泡（microbubbl
es）の注射可能な懸濁液に関する。このリン脂質安定剤
は、ラメラ又は薄層の形態であることができる。また、
本発明は、超音波検査法（ultrasonic echography）に
おける造影剤（contrast agents）として使用すること
ができる微小泡の安定した懸濁液の製造方法をも含んで
成る。

発明の背景効果的な超音波反射体（reflectors）としての担体液
体中のガス微小泡の懸濁液の使用は、本分野においてよ
く知られている。超音波画像形成の強化のためのエコー
医薬（echopharmaceuticals）としての微小泡懸濁液の
開発は、速い静脈内の注射が、可溶化ガスが泡形成溶液
から放出することを生じさせることができるという初期
の観察の後に生じた。血液に比較しての音波妨害（acou
stic impedance）におけるそれらの実質的な差異のため
に、これらの静脈ガス泡は、超音波の優れた反射体であ
るであることが見つかっている。担体液体中のガス微小
泡の懸濁液の生きた生物の血流中への注射は、超音波検
査法画像形成を強く増強し、これ故、内部の臓器の可視
化を増強する。臓器及び深所（deep seated）組織の画
像形成が医学的診断においては不可欠なものであること
ができるので、高く濃縮されたガス微小泡であって同時
に調製及び投与が簡単であり、不活性核種の最小量を含
み、長期間保存及び簡単な分配が可能であるような微小
泡の安定した懸濁液の開発に多くの努力が捧げられてい
る。これらの限界を満足するであろう溶液に向けての多
くに企てが行われてきたが、いずれも、完全に満足する
結果を提供していない。

ガス微小泡の懸濁液が界面活性剤の水溶液と安定剤と
しての増粘剤の溶液との混合により作られることができ
ることは、EP−Ａ−0 077 752（Schering）から公知で
ある。このガス泡は、小孔を通して試薬と空気との混合
物を押し出すことにより、その混合物に導入される。CO
₂微小泡の懸濁液は、界面活性剤及び２炭酸ナトリウム
を含んで成る溶液並びに増粘剤の溶液から得られた混合
物に酸を添加することにより得られることができる。し
かしながら、その成分の混合は、使用直前に行われるべ
きであり、そしてその溶液は、ちょうど調製の間に消費
／注射されるべきである。開示された界面活性剤（tens
ides）は、レシチン；ソルビトール、グリコール及びグ
リセロール、コレステロールのようなポリオキシエチレ
ン及びポリオキシエチル化ポリオールと脂肪酸及び脂肪
アルコールとのエステル及びエーテル；及びポリオキシ
−エチレン−ポリオキシプロピレン・ポリマーを、含ん
で成る。懸濁液中のtensidesの開示された濃度は、0.01
重量％と10重量％との間にあり、そして好ましい範囲が
0.5％〜５％間と請求されている。増粘及び安定化合物
は、例えば、単及び多糖類（グルコース、ラクトース、
シュクロース、デキストラン、ソルビトール）；ポリオ
ール、例えば、グリセロール、ポリグリコール；及び蛋
白、ゼラチン、オキシポリゼラチン、血漿蛋白糖のよう
なポリペプチドを、含む。増粘剤の全体量は、0.5及び5
0％に制限されている。増粘剤としてのポリオキシプロ
ピレン−ポリオキシエチレン・ポリマー（例えば、Plur
onicＦ−68）の使用も、開示されていた。好ましい例
においては、tenside、PluronicＦ−68（ポリオキシ
プロピレン−ポリオキシエチレン・コポリマー）の0.5
重量％、溶液、増粘剤（10％ラクトース溶液）の等容量
を、無菌条件下一緒に激しく振とうし、微小泡の懸濁液
を提供する。得られた懸濁液は、２分間以上にわたり持
続し、そして50μｍ未満のサイズをもつ泡の50％近くま
で含んでいた。上記書面に従えば、界面活性剤及び／又
は増粘剤の50％を超えるものが使用されることがでえき
るが、特定の例は、約１％と４％との間のPluronicＦ
−68を使用している。

超音波検査法における画像形成剤として使用すること
ができる簡単に製造できる水性懸濁液は、WO−91/15244
（Schneider et.al.）中に開示されている。この懸濁液
は、薄層及び／又はラメラ形態におけるフィルム形成界
面活性剤を、そして場合により、親水性安定剤を含む。
薄層化界面活性剤は、リポソーム、すなわち、一般的に
は球状の微小な小胞、の形態で存在することができる。
これらの小胞は、普通には、両親媒性化合物、すなわ
ち、親水性と疎水性の部分をもつ化合物の１以上の同心
円状に整列された２分子層から、形成される。この２層
内の分子は、その疎水性部分が向かい合った関係にあ
り、その親水性部分がその水相に向かって突き出す、よ
うに組織化されている。この懸濁液は、水相との混合に
先立ち又はその後に空気又はガスにその薄層化界面活性
剤を晒すことにより得られる。フィルム形成界面活性剤
のラメラ形態への変換は、高圧均質化又は音波又は超音
波周波数下での音波処理を含む様々なリポソーム形成技
術に従って行われる。請求されたリン脂質の濃度は、0.
01％と20％との間であり、そして微小泡の濃度は、10⁸
と10⁹泡/mlとの間である。この微小球懸濁液は、数カ月
間安定して残存する。実施例１中のリン脂質の濃度は、
0.5％である。

安定したエコー原性（ecogenic）懸濁液に向けての企
ては、WO−92/11873（Beller et.al.）中に開示されて
いる。超音波造影剤としての使用のための微小泡を吸収
し且つ安定化するように設計された水性調製物は、ポリ
キシエチレン／ポリキシプロピレン・ポリマー及び負電
荷のリン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノー
ルアミン、ホスファチジルセリン、並びにそれらの溶解
形態（lysoforms）により、作られている。この調製物
中のリン脂質の濃度範囲は、0.01容量又は重量％と５容
量又は重量％との間であることができるが、１％のジパ
ルミトイルホスファチジル・グリセロール（DPPG）を含
む調製物が特に開示されそして請求されている。負電荷
のリン脂質に加えて、この組成物は、0.1％と10％との
間のポリマー材料（PluronicＦ−68）を含まなければ
ならない。この調製物中の溶質の全体量は、5.1％と10.
4％との間である。微小泡の濃度は、報告されていない
が、与えられた結果に従って、約10⁷泡/mlであると推定
することができる。この懸濁液の安定性は、EP−Ａ−0
077 752のものよりも良好であることが報告されてい
る。

従来技術の組成物は利点をもっているけれども、それ
らは、未だ、それらの実際の使用をじゃまする幾つかの
欠点に悩まされている。第一に、幾つかの従来技術の組
成物は、比較的短い寿命をもち、そして第二に、それら
は、例えば、10⁴と10⁵との間の、比較的低い初期泡計数
をもつ。これは、このような組成物により行われる超音
波テストの再現性及び分析を、かなり困難にしている。
さらに、幾つかの技術は、特定の用途（例えば、左心の
超音波検査）における超音波検査剤としてのそれらの使
用を妨害する（50μｍまでの）広いレンジの直径におい
て泡を作る。

血流中の圧力変動に耐え、そして良好な保存寿命をも
つであろう微小泡の安定した配合物についての必要性
が、幾つかの最高技術水準の貧しい安定性により、さら
に増幅されている。それらの分配及び保存が問題を提供
しない微小泡配合物が、特に重要である。

他の欠点は、これまでに知られた組成物の多くが高い
量の様々な溶質、例えば、ポリマー、リン脂質、電解
質、及びそれらの実際の使用をさらに困難にする他のも
のを含むということである。例えば、特定の患者による
ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン・ポリマー
（Pluronic）の使用が不所望の副作用を引き起こすこ
とができることが知られている（例えば、G.M.Vercello
tti et.al.Blood（1982）59,1299の参照のこと。）特定
の場合において高いリン脂質含量をもつ調製物も、不所
望のものであることができる。いずれにしても、高程度
の様々な溶質を含む組成物が、しぶしぶ投与され、そし
てそれらの広範な使用は、望ましいものでないと考えら
れるようになっている。実際に、医薬産業における傾向
は、様々な医薬配合物中の活性及び不活性成分の濃度を
それらの可能な限り最も低いレベルに減少させ、そして
必要でないすべてのものをその調製物から取り除くこと
である。他の方法を見つけ、そしてより有効な組成物を
配合することが引き続き重要である。これは、超音波検
査において使用される微小泡懸濁液においては特にそう
である。なぜなら、ここで、その成分が治療的効果を全
くもたず、そして結果後可能な限り低くもっていかれる
べきであるからである。しかしながら、先に述べたよう
に、１重量％と４重量％のレンジ内の典型的な濃度をも
つ最高技術水準の調製物及び従来技術の教示は、リン脂
質及び他のリン脂質添加物の減少された量の使用を思い
とどまらせる。この思いとどまらせることについての理
由は、最もおそらくは、日常的な実験の経過において成
分の濃度におけるさらなる減少がいずれかの実際の用途
をもち又は公知のレンジのより低い終点をさらにいじく
りまわすことを助長するのに十分に安定である懸濁液を
全く作り出さないという事実の内に、潜んでいる。

発明の要約本発明は、少なくとも１ミリリッター当たり10⁷微小
泡を含んで成るガス充填微小泡の非常に安定した懸濁液
がたとえそれらの非常に低い濃度が使用される場合でさ
えも安定剤としてリン脂質を使用して得られることがで
きるという予想外の発見に基づいている。超音波検査法
における造影剤として使用することができる懸濁液は、
時間及び圧力による崩壊に対する微小泡の安定剤として
少なくとも１のリン脂質を水性担体中に懸濁させること
により、得られ、そのリン脂質の濃度は0.01重量％未満
であるが、そのリン脂質分子が単にそのガス微小泡−液
体界面において存在する場合はそれ以上である。

ごく僅かな量のリン脂質としてここに含まれる（単独
で又は比較的小部分の他の両親媒性物質と共に使用され
る）界面活性剤が微小泡を効果的に安定化するというこ
との発見は、全く予想外のことであった。他の両親媒性
化合物（例えば、Pluronic）の存在中で、安定剤分子
間の相互付着が減少し、そして単分子リン脂質フィルム
の形成が阻害されるということが、仮定される。しかし
ながら、多量の他の両親媒性剤の非存在中では、リン脂
質分子間の非妨害性結合力（静電引力又は水素結合）
は、崩壊又は合着（coalescence）に対してその泡を安
定化する安定フィルム−様構造の形成を確保するのに十
分なものである。

本発明に従って、高い微小泡濃度、高安定性、長期間
保存能力及び調製の容易性の、懸濁液が、懸濁液中の界
面活性剤及び他の添加物の濃度が最高技術水準の配合に
おいて使用されるレベルよりもかなり低く保たれる場合
にさえ、得られることができる。本発明の組成物中で使
用されるリン脂質の量は、その懸濁液中の泡の濃度を１
ミリリッター当たり10⁷を超える微小泡を維持しなが
ら、そのガス微小泡の周りに界面活性剤の単一の単層を
形成するために必要なものとほとんど同程度に低くある
ことができる。本発明においては、界面活性剤のリポソ
ーム−様二重層をもつ微小泡（ガス充填リポソーム）
は、存在しないようであり、そして観察されていない。

比較的高い安定性及び長期間の保存能力を有する高い
微小泡濃度、例えば、10⁹と10¹⁰泡/mlとの間をもつ懸濁
液は、たとえそのリン脂質界面活性剤の濃度が本分野に
おける公知レベルをかなり下回って保たれたときでさ
え、調製されることができる。ml当たり１μｇのリン脂
質と同程度に少ない懸濁液は、使用される界面活性剤の
量がそのガス微小泡の周りのその脂質の単一単層の形成
に必要なものを下回る限り、そしてそれらが、本明細書
中で開示する方法の中の１つに従って作られる限り、調
製されることができる。

その微小泡のサイズ分布に依存する10⁸泡/mlの泡濃度
については、この濃度は、１μg/ml又は0.0001％と同程
度に低くあることができるが、0.0002％と0.01％までと
の間のリン脂質濃度が好ましいという計算が、示されて
いる。より好ましくは、本発明の微小泡の安定した懸濁
液中のリン脂質の濃度は、0.001％と0.009％との間にあ
る。その懸濁液中のリン脂質の量のさらなる減少が可能
であるけれども、0.0001重量％未満により調製された懸
濁液は、不安定であり、それらの全泡計数は、低く、そ
してそれらの注射の間の超音波応答は、満足できるもの
ではない。他方において、注射の間0.01％を超えるリン
脂質により調製された懸濁液は、より良好には働かな
い、すなわち、それらの安定性及び超音波応答は、その
濃度によりさらに良くならない。したがって、より高い
濃度は、従来技術の討議において述べられたような不所
望の副作用の可能性を増加させるだけである。ラメラ又
は薄層形態にある界面活性剤のセグメントのみがその泡
を適当に安定化するために組織化された分子を効果的に
放出することができるということが、仮説として仮定さ
れる。これは、なぜ界面活性剤の濃度がガス泡の安定性
を弱めることなく非常に低くなることができるかについ
て説明することができる。本発明の懸濁液は、その低い
リン脂質含量によるだけではなく注射された溶質、すな
わち、脂質及び／又は合成ポリマー及び他の添加物の全
量が今までよりも1,000と50,000倍との間にあるという
ことにより、従来技術の組成物を超える重要な利点を提
供する。これは、微小泡濃度、すなわち、その生成物の
エコー原性又は安定性のいかなる損失を伴わずに達成さ
れる。溶質の非常に低い濃度に加えて、本発明は、超音
波検査シグナルへのその貢献が比較的大きなものである
微小泡のみを含むことができる懸濁液、すなわち、画像
形成過程に活性に参加しない微小泡のいずれをも含まな
い懸濁液を、提供する。

本発明の注射可能な組成物中の溶質のこのように低い
濃度により、不所望の副作用の可能性はかなり減少さ
れ、そしてその注射剤の除去は、かなり改善されている
ことは、言うまでもないことである。

本発明の低いリン脂質含量をもつ微小泡懸濁液は、便
利なやり方で、例えば、好適な溶媒中の粗リン脂質の溶
液を凍結乾燥又はスプレー・ドライすることにより、そ
れらの構造が修飾されているフィルム形成リン脂質から
調製されることができる。水性担体中の分散による懸濁
液の形成に先立って、凍結乾燥又はスプレー・ドライさ
れたリン脂質粉末を、空気又は他のガスと接触させる。
水性担体と接触するとき、その構造が破壊されている粉
末リン脂質は、その中に分散されたガスの微小泡を安定
化させるであろうラメラ又は薄層のセグメントを形成す
るであろう。便利には、本発明の低いリン脂質含量をも
つ懸濁液は、空気又は他のガスとのそれらの接触に先立
ってラメラ化又は薄層化されたリン脂質により調製され
ることもできる。これ故、空気又は他のガスとリン脂質
を接触させることは、そのリン脂質が乾燥粉末形態又は
水性担体中の薄層リン脂質の分散形態にあるときに、行
われることができる。

用語、ラメラ又は薄層形態は、その界面活性剤が１以
上の分子層を含む薄いフィルム又はシートの形態にある
ことを示している。この形態においては、構造物内に組
織化された界面活性剤分子は、リポソーム小胞内に存在
するものと類似している。WO−Ａ−91/15244中に記載す
るように、フィルム形成界面活性剤のラメラ形態への変
換は、リポソーム形成法のいずれかにより、例えば、高
圧均質化又は音波又は超音波周波数下の音波処理によ
り、容易に行われることができる。ラメラ形態への変換
は、リン脂質により水溶性担体固体（NaCl、シュクロー
ス、ラクトース又は他の炭水化物）の微粒子（10μｍ以
下）のコーティングし、次に、水相中にそのコート担体
を溶解させることにより、行われることもできる。同様
に、不溶性粒子、例えば、ガラス又は樹脂のマイクロビ
ーズは、有機溶媒中のリン脂質の溶液中で湿らせ、その
後、その溶媒を蒸発させることにより、コートされるこ
とができる。脂質コートされたマイクロビーズは、その
後、水性担体相と接触され、これにより、リポソーム小
胞が、その担体相中に形成されるであろう。また、リン
脂質は、限界温度（critical temperature（Tc））を僅
かに上に加熱し、そして穏やかに攪拌することにより、
ラメラ化されることができる。この限界温度は、そのリ
ン脂質のゲル〜液体の転移の温度である。

実際には、本発明に従って低いリン脂質含量の微小泡
の懸濁液を作るためえに、ある者は、そのリポソーム小
胞が“充填されていない（unloaded）”、すなわち、そ
れらが、その溶液の水相それ自体を除き外来物質のいず
れをもその中に包み込んでいない限り、公知技術のいず
れかにより調製されたリポソーム懸濁液又は溶液から開
始することができる。

リポソーム溶液中への空気又はガスの導入は、普通の
手段、インジェクト、すなわち、そのリポソーム溶液中
に小さなオリフィスを通して空気又はガスを送り込み、
又は圧力を加えそして次にその圧力を解放することによ
り溶液中にガスを単に溶解させることにより、行われる
ことができる。他の方法は、空気又は他の生理学的に許
容されるガスの存在中でリポソーム溶液を攪拌又は音波
処理することである。また、ある者は、リポソームの溶
液それ自体の中で、例えば、ガス放出化学反応、例え
ば、酸により溶解された炭酸塩又は２炭酸塩を分解する
ことにより、ガス形成を作りだすことができる。

薄層の界面活性剤が水溶液担体中に懸濁され、そして
空気又は他のガスが微小泡を提供するために導入される
とき、その微小泡は、リポソーム小胞の場合におけるよ
うな二重層ではなく界面活性剤分子の単分子層により、
だんだんに取り囲まれ、そして安定化される。この界面
活性剤分子の構造的再配置は、機械的に（攪拌により）
又は熱的に活性化されることができる。必要なエネルギ
ーは、合着解放剤、例えば、Pluronicの存在中で、よ
り低くなる。他方においては、その微小泡配合物中の合
着解放剤の存在は、リン脂質分子間の自然のアフィニテ
ィーを減少させ、これは、直接の結果として外圧（例え
ば、20−30Torr超え）に対する微小泡の減少された安定
性をもつ。

既に述べたように、リン脂質溶液の代わりに、本発明
の低いリン脂質含量の懸濁液を調製するために、ある者
は、ラメラ化され又はされないことができる乾燥リン脂
質から出発することができる。ラメラ化されるとき、こ
のようなリン脂質は、例えば、リポソーム、すなわち、
水溶液の形態において慣用の技術により正常には調製さ
れ、そしてその後普通の手段により脱水されたリポソー
ムを脱水することにより得られることができる。リポソ
ームを脱水する方法の中の１つは、凍結乾燥（freeze−
drying（lyophilization））であり、すなわち、好まし
くは親水性化合物を含むリポソーム溶液を、凍結し、そ
して減圧下で蒸発（昇華）させることにより乾燥させ
る。

他のアプローチにおいては、非ラメラ化又は非薄層化
リン脂質は、有機溶媒中のリン脂質を溶解させ、そして
リポソーム形成を経ずにその溶液を乾燥させることによ
り、得られることができる。言い換えれば、これは、親
水性安定剤物質、例えば、PVP、PVA、PEG等のようなポ
リマー、又は有機溶媒及び水中の両方に可溶性の化合物
と一緒に好適な有機溶媒中でリン脂質を溶解させ、そし
てその溶液を凍結乾燥又はスプレー・ドライすることに
より、行われることができる。水及び有機溶媒中に可溶
性の親水性安定剤化合物のさらなる例は、リンゴ酸、グ
リコール酸、マルトール等である。好適な有機溶媒のい
ずれかが、その沸点が十分に低く、そしてその融点がそ
の後の乾燥を容易にするのに十分に高い限り、使用され
ることができる。典型的な有機溶媒は、例えば、ジオキ
サン、シクロヘキサノール、第三ブタノール、テトラク
ロロジフルオロ・エチレン（C₂Cl₄F₂）又は２−メチル
−２−ブタノールであろうが、第三ブタノール、２−メ
チル−２−ブタノール及びC₂Cl₄F₂が好ましい。この変
法においては、親水性安定剤の選択のために使用される
限界は、選ばれた有機溶媒中のその溶解度である。微小
泡の懸濁液は、薄層化リン脂質の粉末によるのと同じ段
階を使用してこのような粉末から製造される。

同様に、前ラメラ化又は前薄層化リン脂質溶液の凍結
乾燥の実施に先立ち、親水性安定剤化合物を、その溶液
中に溶解させる。しかしながら、ここで、この親水性安
定剤の選択は、非常に大きい。なぜなら、ラクトース又
はシュクロースのような炭水化物並びにデキストラン、
澱粉、PVP、PVA、PEG等のような親水性ポリマーを使用
することができるからである。これは、本発明において
有用である。なぜなら、このような親水性化合物は、ま
た、その微小泡サイズの均一化において助け、そして保
存下の安定性を強化するからである。例えば、ポリエチ
レングリコール対脂質の10:1〜1000:1重量比により安定
化された凍結乾燥リン脂質の非常の希釈された水溶液
（0.0001−0.01重量％）の実際の製造は、長期間保存さ
れるときでさえ、有意な観察され得る変化を伴わない、
安定した水性微小泡懸濁液計数10⁹−10¹⁰泡/ml（主に0.
5−10μｍ）のサイズ分布）を作り出すことを可能にす
る。これは、振とう又はいかなる激しい攪拌を伴わずに
保存乾燥薄層リン脂質を単に溶解させることにより、得
られる。減圧下の凍結乾燥技術は、非常に有用である。
なぜなら、それは、生理学的に許容されるガス、すなわ
ち、窒素、CO₂、アルゴン、メタン、フレオン、SF₆、CF
₄、等のいずれかにより乾燥粉末上の圧力を回復させ、
それによりそのような条件下で処理されたリン脂質の再
分散の後に、上記ガスを含む微小泡の懸濁液を得ること
を可能にするからである。

本発明において便利な界面活性剤は、水及びガスの存
在中で安定したフィルムを形成することができる両親媒
性化合物から選ばれることができる。好ましい界面活性
剤は、レシチン（ホスファチジルコリン）及び他のリン
脂質、とりわけ、ホスファチド酸（PA）、ホスファチジ
ルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン（P
E）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルグ
リセロール（PG）、カルジオリピン（CL）、スフィンゴ
ミエリンを含む。好適なリン脂質の例は、天然又は合成
のレシチン、例えば、卵又は大豆のレシチン、又は飽和
の合成レシチン、例えば、ジミリストイルホスファチジ
ルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジス
テアロイルホスファチジルコリン又はジアラキドイルホ
スファチジルコリン又は不飽和の合成レシチン、例え
ば、ジオレイルホスファチジルコリン又はジリノレイル
ホスファチジルコリンであり、飽和のレシチンが好まし
い。

コレステロール及び他の物質のような添加物が、０か
ら50重量％までの範囲の割合で先に述べた１以上の脂質
に添加されることができる。このような添加物は、フィ
ルム形成界面活性剤との混合において使用されることが
でき、そしてそれらのほとんどが公知である他の非リン
脂質界面活性剤を含むことができる。例えば、ポリオキ
シプロピレン・グリコール及びポリオキシエチレン・グ
リコール並びにそれらの様々なコポリマー、ホスファチ
ジルグリセロール、ホスファチド酸、ジセチルホスフェ
ート、脂肪酸、エルゴステロール、フィトステロール、
シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プ
ロピル・ガレート（propyl gallate）、アスコルビル・
パルミテート及びブチル化ヒドロキシ−トルエンのよう
な化合物である。これらの非フィルム形成界面活性剤の
量は、普通には、界面活性剤の全量の50重量％までであ
るが、好ましくは０と30％との間にある。更に、これ
は、本発明の低リン脂質含有懸濁液中の様々な添加物の
濃度が今までの公知の組成物におけるよりも100倍を超
える程少ない０−0.05％の範囲内にあるということを意
味している。

本発明の懸濁液の他の特徴がその微小泡の比較的“高
い”ガス捕獲能力、すなわち、界面活性剤の量と捕獲さ
れたガスの全量との間の高い比であるということも、述
べられるべきである。これ故、微小泡が１〜５μｍレン
ジにおけるサイズをもつ懸濁液により、ガス泡−液体界
面活性剤において存在するリン脂質対標準条件下で捕獲
されたガスの容量の重量比が0.1mg/mlと100mg/mlとの間
であることが、仮説として推定される。

実際に、また、すべての注射可能な組成物は、血液と
可能な限り等張性であるべきである。これ故、注射前
に、少量の等張性剤を、本発明の懸濁液に添加すること
もできる。この等張性剤は、医薬において一般的に使用
される生理学的な溶液であり、そしてそれらは、生理食
塩水溶液（0.9％NaCl）、2.6％グリセロール溶液、５％
デキストロース溶液等を含んで成る。

本発明は、超音波検査法における造影剤として使用す
ることができる請求項１に記載の微小泡の安定した懸濁
液の製造方法に関する。基本的には、本方法は、請求の
範囲の中で述べる限定内の選択された値に、上記リン脂
質により安定化された微小泡の懸濁液中のリン脂質の濃
度を合わせることを含んで成る。普通には、ある者は、
所望の値よりも多くのリン脂質を含む微小泡懸濁液から
出発するであろうし、そしてある者は、エコー生成泡の
計数を実質的に減少させずにその微小泡内に捕獲された
ガス又は空気の容量に比較してそのリン脂質の量を減少
させるであろう。これは、例えば、空気／液体界面にお
いて直接に含まれないリン脂質を含む担体液体の部分を
除去し、そしてより多くの新たな担体液体によりその懸
濁液を希釈することにより、行われることができる。こ
れを行うために、ある者は、その懸濁液内に、エコー生
成泡が集まるであろう領域（ａ）及びその泡が強く希釈
されている領域（ｂ）を作りだすことができる。次に、
領域（ｂ）内の液体を、普通の手段（デカンテーショ
ン、サイホン処理（siphoning）等）により分離するこ
とにより取り出すことができ、そして新たな担体液体の
相当容量を、その懸濁液に補給するために供給する。こ
の操作は、１回以上繰り返されることができ、これによ
り、その泡の安定化において直接係わらないリン脂質の
含量を、だんだんと減少させる。

泡ガス／液体界面に存在しないリン脂質分子の完全な
除去を達成することは、平衡からの幾つかの不均衡が生
じることができるとき、一般的には望ましくない。すな
わち、消耗がかなり進められた場合に、そのガス／液体
界面におけるいくらかの界面活性剤分子がその結果とし
て起こる泡の脱安定化により解放されることができる。
実験は、担体液体中のリン脂質の濃度が、性質における
有意な変化及び逆の効果を伴わずに請求項中に述べられ
た、より低い限界の傍の内まで減少されることができる
ことを、示した。これは、実際には、（与えられた限界
内の）最適なリン脂質濃度が、適用のタイプにより、む
しろ命ぜられるであろうということを、すなわち、比較
的高いリン脂質濃度が許容される場合に、理想的な濃度
値がそのレンジの上限近くになるであろうということ
を、意味している。他方において、診断されるべき患者
の症状に依存する場合には、リン脂質の絶対値は、され
に減少されなければならず、これは、微小泡計数及びエ
コー原性効果に関する逆効果をともなわずに行われるこ
とができる。

本法の１つの態様は、フィルム形成界面活性剤を選択
し、そして場合により、それを、本分野において公知で
あり又はこれまでに開示した方法の中の１つを使用し
て、ラメラに変換することを含んで成る。次に、界面活
性剤を、空気又は他のガスと接触させ、そして密閉容器
中で水溶液担体と混合し、これにより、微小泡の懸濁液
が形成されるであろう。この懸濁液は、しばらく放置さ
れ、そして形成されたガス充填微小泡の層は、その容器
の上方に昇らせる。この母液の下方部分を、次に除去
し、そして微小泡の上澄層を、微小泡の調製において使
用したガスで飽和した水溶液により洗浄する。この洗浄
を、実質的にすべての未使用又は遊離の界面活性剤分子
を除去するまで、数回繰り返すことができる。未使用又
は遊離の分子は、そのガス微小泡の周りの単分子層を安
定化する配合を参加しないすべての界面活性剤分子を意
味する。

低リン脂質含量懸濁液を提供することに加えて、この
洗浄技術は、それが、すなわち、注射された懸濁液の超
音波検査応答に対するその貢献が比較的小さいすべての
又はほとんどすべての微小泡の除去により、本発明の懸
濁液のさらなる精製を可能にするという、追加の利点を
提供する。これ故、この精製は、積極的に選択された微
小泡、すなわち、超音波検査シグナルの反射において注
射の間に等しく参加するであろう微小泡だけを含んで成
る懸濁液を提供する。これは、非常に低い濃度のリン脂
質及び他の添加物だけを含み、さらにその画像形成過程
において活性には参加しない微小泡のいずれをも含んで
いない懸濁液を導く。

本方法の別法においては、場合によりラメラ形態であ
ることができる界面活性剤が、空気又は他のガスとの接
触に先立って水溶液担体と混合される。

図面の簡単な説明図１は、本発明に従って新たに調製された懸濁液につ
いての微小泡濃度の関数としての超音波検査応答のグラ
フ表示である。

本発明の懸濁液及び本発明の低リン脂質含量懸濁液の
製造方法を、以下の実施例によりさらに説明する：実施例１多ラメラ小胞（MLVs）を、50mlのヘキサン／エタノー
ル（8/2、v/v）中に240mgのジアラキドイルホスファチ
ジルコリン（Avanti Polar LipidsからのDAPC）及び10m
gのジパルミトイル−ホスファチド酸（Avanti Polar Li
pidsからのDPPA酸）を溶解させ、次にロータリー・エバ
ポレーターを使用して丸底フラスコ中で乾燥するまでそ
の溶媒を蒸発させることにより、調製した。この残渣脂
質フィルムを、真空デシケーター中で乾燥させた。水
（5ml）の添加の後、その懸濁液を、攪拌下、90℃にお
いて30分間インキュベートした。得られたMLVsを、0.8
μｍのポリカーボネート・フィルター（Nucleopore）
を通して85℃において押し出した。2.6mlの得られたMLV
調製物を、水中のデキストラン10′000MW（Fluka）の16
7mg/ml溶液の47.4mlに添加した。得られた溶液を、よく
混合し、500mlの丸底フラスコ中に移し、−45℃におい
て凍結し、そして0.1Torr下で凍結乾燥した。その氷の
完全な昇華物を、一夜で得た。その後、空気圧を、真空
容器内で回復させた。得られた粉末の様々な量を、ガラ
ス・バイアル（表を参照のこと）内に導入し、そしてそ
のバイアルを、ゴム栓により蓋をした。真空を、その栓
を通して針を介して適用し、そしてその空気を、バイア
ルから除去した。脱気の間、その粉末を、６フッ化硫黄
ガスSF₆に晒した。

泡懸濁液を、それぞれのバイアル内に10mlの、水中の
３％グリセロール溶液を（栓を通して）注射することに
より得て、その後、穏やかに混合した。得られた微小泡
懸濁液を、血球計を使用して計数した。その平均泡サイ
ズ（容量）は、2.2μｍであった。

調製物を、ウサギに（頚静脈を介して）並びにミニ豚
（耳静脈を介して）、1ml/5kgの投与量において注射し
た。インビボにおいて、超音波検査法を、Acuson XP128
超音波装置（Acuson Corp.USA）及び7MHzセクター変換
器を使用して行った。この動物を、麻酔し、そしてその
変換器を、配置し、そして次に、その胸の左側上の場所
内に固定し、ウサギの場合には、心臓の右及び左の心室
の視界を、そしてミニ豚の場合には、長さ方向の４つの
室の視界を、提供した。0.5mg/mlの乾燥重量を含む調製
物は、ウサギ及びミニ豚における右並びに左の心室の僅
かな不透明度を与えた。しかしながら、この不透明度
は、１、５及び10mg/調製物mlにより、より優れてい
た。

実施例２凍結乾燥物を、気相中の（SF₆の代わりの）空気によ
り、実施例１中に記載したように調製した。次に、この
凍結乾燥物を、（３％グリセロール溶液の代わりに）0.
9％生理食塩水中に懸濁させた。類似の泡濃縮物を得
た。しかしながら、ウサギ又はミニ豚の注射の後、その
効果の持続性は、例えば、120秒間の代わりに10−20秒
間、より短かかった。その上、ミニ豚においては、左心
室の不透明度は、10mg/調製物mlによってさえも、貧弱
であった。

実施例３ MLVリポソームを、240mgのPAPC及び10mgのDPPA（モル
比95:5）を使用して実施例１中に記載したように調製し
た。２ミリリッターのこの調製物を、20mlのポリエチレ
ングリコール（PEG2′000）溶液（82.5mg/ml）に添加し
た。室温において10分間混合後、得られた溶液を、−45
℃において５分間凍結させ、そして0.2mbarにおいて５
時間凍結乾燥させた。得られた粉末（1.6g）を、ゴム栓
を備えたガラス・バイアル中に移した。粉末を、（実施
例１中に記載したように）SF₆に晒し、そして次に、20m
lの蒸留水中に溶解させた。得られた懸濁液は、5.5μｍ
の容量平均直径をもつ1ml当たり5x10⁹泡の泡濃度を示し
た。この懸濁液を、20mlのシリンジ中に導入し、そのシ
リンジを、密封し、そして24時間水平の位置において放
置した。その液相の大部分（〜16−18ml）を、抜き取
り、一方、そのシリンジを、水平の位置において維持
し、そして等容量の新たなSF₆−飽和水を、導入した。
このシリンジを、次に、その泡をその水相中で均一化す
るためにしばらくの間、振とうした。第二デカンテーシ
ョンを、８時間後同一条件下で行い、その後、さらに３
回のデカンテーションを４時間間隔において行った。最
後の泡相（バッチP145）を、3mlの蒸留水中に懸濁させ
た。それは、1ml当たり1.8x10⁹泡を含み、容量平均直径
は6.2μｍであった。この懸濁液（2ml）のアリコット
を、0.2mbarにおいて６時間、凍結乾燥させた。得られ
た粉末を、0.2mlのテトラヒドロフラン／水（9/1 v/v）
中に溶解させ、そしてこの溶液中に存在するリン脂質
を、光散乱検出器を使用してHPLCにより分析した。この
溶液は、1ml当たり0.7mgのDAPCを含み、それ故、10⁸泡
当たり3.9μｇのリン脂質に対応する。バッチP145中の
実際の泡サイズ分布のCoulterカウンター分析は、10⁸泡
当たり4.6x10⁷μm²の全表面積を与えた。DAPCの１分子
は、50Å^２の表面を占有するであろうと推定され、ある
者は、10⁸泡当たり1.3のDAPCがそれぞれの泡の周りの単
層のリン脂質を形成するのに必要であろうことを計算す
ることができる。懸濁液P145を、次に４℃において放置
し、そしてガス泡の濃度を、規定に基づき測定した。10
日後、その生成物は、その調製後と同様に良好に見ら
れ、そして未だ1ML当たり１−1.2x10⁹泡を含んでいた。
この例外的な安定性は、その懸濁液中の非常に低い量の
リン脂質を考慮すれば非常に驚くべきことが見つかっ
た。

先に記載した実験を、好ましくはより大きな泡（バッ
チp132）を回収するために、より短いデカンテーション
時間を使用して微小泡の第二バッチについて繰り返し
た。得られた容量平均直径は、8.8μｍであり、そしてC
oulterカウンターにより測定された全表面は、10⁸泡当
たり22x10⁸μm²であった。その計算は、10⁸泡のための
６μｇのDAPCがDAPCの単層によりその泡集団を被覆する
ために必要であろうことを、示した。HPLCにより測定さ
れたDAPCの実際量は、10⁸泡当たり20μｇであった。そ
の泡集団の全表面の正確な推定を得ることの困難性を考
慮すれば、実験誤差内において、得られた結果が１のリ
ン脂質層によるその微小泡の被覆と矛盾しないようであ
る。

様々な洗浄された泡調製物により行われた超音波検査
測定は、分離の間、下相が、上相又は新たに調製された
サンプルよりもかなり弱い超音波シグナルを与えること
を示した。一見すると、これは、正常に見えた。なぜな
ら、そのシリンジの頂上の上の白色層がいずれにしても
そのガス微小泡の大部分を含んでいたからである。しか
しながら、図１中に示すように、泡計数は、下層中にも
かなり高い微小球の集団を示した。Coulter測定にのみ
基づき、その微小泡が0.5μｍ以下のサイズをもつこと
が明らかとなり、それは、高い濃度にあるときさえ小さ
な泡により、超音波シグナルの適当な反射が全くないこ
とを示唆している。

３％グリセロール溶液中の調製物P132の４倍希釈物
を、ミニ豚（0.2ml/kg）中に注射した。1ml当たり2.5x1
0⁷泡を含む洗浄泡及び1ml当たり５μｇのリン脂質の調
製物は、際立った心臓内の縁取り描写により左及び右心
室における素晴らしい不透明度を提供した。また、良好
な不透明度を、1kg当たり0.2μｇのリン脂質に対応する
（３％グリセロール中に希釈した）調製物P145のアリコ
ットをミニ豚に注射することにより得た。コントラスト
は、さらに、0.02μg/kgの注射後に左心室内で検出可能
であった。その上、腎臓動脈において、造影効果の存在
は、0.005μg/kgと同様に低いリン脂質投与量における
パルス化Dopplerにより検出されることができるであろ
う。

薄層化リン脂質がガス微小泡の周りの単一の単層にお
いて整列される限り、作られた懸濁液は、適当な安定性
をもつであろう。これ故、現在予想しない発見について
の説明を提供し、そしてリン脂質の量がその懸濁液中に
存在する微小泡の周りの単層の形成に必要なものよりも
大きくなってはならないということを、証明している。

実施例４ヘキサン／エタノール8/2（v/v）中に48mgのDAPC及び
2mgのDPPAを含む溶液を、調製し、そしてその溶媒を、
乾燥するまで（実施例１中に記載するように）蒸発させ
た。5mgの得られた粉末及び375mgのポリエチレングリコ
ールを、60℃において5gのtert−ブタノール中に溶解さ
せた。次に、透明溶液を、−45℃まで急速に冷却し、そ
して凍結乾燥させた。80mgの凍結乾燥物を、ガラス・バ
イアル中に導入し、そして粉末を、SF₆に晒した（実施
例１を参照のこと）。次に、３％のグリセロール溶液
（10ml）を、そのバイアル中に導入し、そしてその凍結
乾燥物を、穏やかにかき混ぜることにより、溶解させ
た。得られた懸濁液は、1ml当たり1.5x10⁸泡をもち、
（容量における）平均直径は9.5μｍであった。この溶
液を、ウサギに注射し、右及び左心室のハッキリした視
界を提供した。この懸濁液の10倍希釈さえ、強い造影強
化を示した。

実施例５実施例４の手順を、繰り返した。但し、ヘキサン／エ
タノール溶液中のリン脂質の最初の溶解を、省略した。
言い換えれば、粗リン脂質を、第三ブタノール中のポリ
エチレン・グリコールと一緒に溶解させ、そしてその溶
液を、凍結乾燥させ；その後、その残渣を、水に懸濁さ
せた。幾つかのリン脂質及び他の脂質とリン脂質との粗
み合わせを、これらの実験において調査した。次の表中
に示す結果において、リン脂質を、100mg/mlのPEG2′00
0を含む第三ブタノール溶液中に溶解させた。凍結乾燥
後に得られた残渣を、SF₆により飽和させ（実施例１を
参照のこと）、次に、1ml当たり100mg乾燥重量の濃度に
おいて蒸留水中に溶解させた。

すべての場合において、得られた懸濁液は、高い微小
泡濃度を示し、これは、リポソーム中へのリン脂質の最
初の変換が必要でなかったことを示していた。これの懸
濁液を、0.15M NaCl中で希釈し、そして実施例３中に記
載したようにミニ豚に注射した。すべての場合におい
て、右及び左の心室の際立った不透明度並びに心臓内の
縁取りの良好な描写を、体重当たり10−50μｇ以下の投
与量において得た。

実施例６ PEG−2000（2g）、DAPC（9.6mg）及びDPPA（0.4mg）
を、20mlの第三ブタノール中に溶解させ、そしてその溶
液を、0.2mbarにおいて一夜凍結乾燥した。得られた粉
末を、SF₆に晒し、そして次に20mlの蒸留水中に溶解さ
せた。（血球計により測定されるような）1ml当たり1.4
x10⁹泡を含む懸濁液を、20mlのシリンジ中に導入し、こ
れを、密封し、そして16時間、水平位置に放置した。泡
の白色層を、その溶液の頂上の上に見ることができた。
その下相（16−18ml）を、廃棄し、一方、そのシリンジ
を水平に維持した。新たなSF₆−飽和蒸留水の等容量
を、そのシリンジ中に吸引し、そしてその泡を、攪拌に
より、その水相中で均一化した。微小泡の２つの異なる
集団、すなわち、大きなサイズと中間のサイズを、短期
間にわたる反復デカンテーションにより、得て、その大
きな泡を、デカンテーションのほんの10−15分後に回収
し、そしてその中間サイズの泡を30−45分後に回収し
た。これらのデカンテーションを、２つのタイプの集団
のついての狭い泡サイズ分布を得て、そしてその微小泡
と関係しない。すべてのリン脂質を取り除くために、10
回、繰り返した。大きな泡を含むすべての相を、プール
した（“大きなサイズの泡”）。同様に、中間サイズの
泡を含む画分を、合わせた（“中間サイズの泡”）。２
つの泡集団のアリコットを、凍結乾燥し、そして次に、
それぞれの画分中に存在するリン脂質の量を測定するた
めに、HPLCにより分析した。大きなサイズの泡画分は、
1ml当たり2.5x10⁷泡を含み、数平均直径が11.3μｍであ
り、そして10⁷泡当たり13.7μｇのリン脂質であった。
この結果は、それぞれの泡の周りの単層のリン脂質及び
リン脂質分子当たり50Åの表面を仮定して、その理論
量、10⁷泡当たり11.5μｇと素晴らしく一致して、計算
された。この中間サイズの泡画分は、1ml当たり8.8x10⁸
泡を含み、数平均直径は3.1μｍであり、そして10⁷泡当
たり1.6μｇのリン脂質であった。後者の値は、再び、
理論的な量、10⁷泡当たり1.35μｇと素晴らしく一致し
ている。これらの結果は、本明細書中で開示した微小泡
の安定性が、もっともおそらくは、その微小泡の周りの
リン脂質の単層の形成を原因とすることを、さらに示し
ている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者プジニエール，ジェロームフランス国，エフ―74160 ルシャブル―ボーモン，プラスドゥランシエンヌメリー（番地なし) (72)発明者ヤン，フェングスイス国，ツェーハー―1217 メイリン，リュドゥラプルーレイ，52 (56)参考文献国際公開91／15244（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 49/00 A61K 9/127 A61K 47/24 ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】１ミリリッター当たり少なくとも10⁷の微
小泡を、そして両親媒性化合物であってその中の少なく
とも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるも
のを含んで成る、超音波検査法における造影剤として使
用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁
液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス−液
の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以
上、かつ、0.01重量％未満であることを特徴とする、前
記注射用懸濁液。
【請求項２】１ミリリッター当たりの微小泡の濃度が10
⁸と10¹⁰の間にある、請求項１に記載の注射用懸濁液。
【請求項３】前記リン脂質の濃度が0.00013重量％を超
える、請求項１に記載の注射用懸濁液。
【請求項４】前記担体液が、安定剤として水溶性の多糖
類及びオリゴ糖類、糖及び親水性ポリマーをさらに含
む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の注射用懸濁
液。
【請求項５】前記親水性ポリマーがポリエチレン・グリ
コールである、請求項４に記載の注射用懸濁液。
【請求項６】前記リン脂質が少なくとも部分的にラメラ
又は薄層の形態であり、そしてホスファチド酸、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルイノシトール、カルジオリピン及びスフィ
ンゴミエリンから選ばれる、請求項１〜５のいずれか１
項に記載の注射用懸濁液。
【請求項７】ホスファチジルグリセロール、ホスファチ
ド酸、ジセチルホスフェート、コレステロール、エルゴ
ステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノ
ステロール、トコフェロール、プロピルガレート、アス
コルビル・パルミテート及びブチル化ヒドロキシ・トル
エンから選ばれるリン脂質の性質に影響を及ぼす物質を
さらに含む、請求項５又は６に記載の注射用懸濁液。
【請求項８】前記リン脂質が凍結乾燥又はスプレー−ド
ライにより得られた粉末の形態にある、請求項１、２又
は３に記載の注射用懸濁液。
【請求項９】１ミリリッター当たり10⁸−10⁹微小泡を含
み、その微小泡のサイズが0.5−10μｍ間にあり、保存
下で僅かに変化し又は全く変化しない、請求項１に記載
の注射用懸濁液。
【請求項１０】前記担体液が、脂肪酸、脂肪酸と、ポリ
アルキレン・グリコール、ポリアルキレン化糖及び他の
炭水化物並びにポリアルキレン化グリセロールの如きポ
リオールを含むアルコールとの、エステル及びエーテル
から選ばれる50重量％までの非薄層化界面活性剤をさら
に含む、請求項１に記載の注射用懸濁液。
【請求項１１】前記微小泡がSF₆、CF₄、フレオン又は空
気で充填された、請求項１〜10のいずれか１項に記載の
注射用懸濁液。
【請求項１２】少なくとも１のフィルム形成性界面活性
剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末を
空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性
剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含
む、請求項１に記載の空気又はガス充填微小泡懸濁液の
製造方法であって、その懸濁液を容器内に導入し、その
容器の上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、そ
の形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡を
その微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄するこ
とを特徴とする方法。
【請求項１３】粉末への変換に先立って、フィルム形成
性界面活性剤が少なくとも部分的にラメラ化される、請
求項12に記載の方法。
【請求項１４】空気又は他のガスによる接触に先立っ
て、前記の部分的にラメラ化された界面活性剤が水性担
体液と混合される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】前記担体液が、水溶性蛋白、ポリペプチ
ド、糖、多糖類及びオリゴ糖類並びに親水性ポリマーか
ら選ばれた安定化化合物をさらに含む、請求項13又は14
に記載の方法。
【請求項１６】前記界面活性剤を可溶性又は不溶性材料
の粒子上にコーティングし、そのコートされた粒子をし
ばらくの間、空気又はガスの下で放置し、そしてそのコ
ートされた粒子を水性担体液と混合することにより、前
記変換が行われる、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】前記変換が、高圧下、フィルム形成性脂
質の水溶液を音波処理又は均質化することにより行わ
れ、少なくとも部分的に、この操作がリポソームの形成
を導く、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】少なくとも部分的にラメラ化された界面
活性剤を空気又は他のガスと接触させることに先立っ
て、前記リポソーム含有溶液が凍結乾燥される、請求項
17に記載の方法。
【請求項１９】前記フィルム形成性脂質の水溶液が、含
有脂質に比較して10:1と1000:1の間の重量比において親
水性ポリマー及び炭水化物から選ばれた増粘剤又は安定
剤をさらに含む、請求項17及び18に記載の方法。
【請求項２０】フィルム形成性界面活性剤、親水性安定
剤及び水性担体液を含んで成る、請求項１に記載の空気
又はガス充填微小泡の懸濁液の製造方法であって、その
フィルム形成性界面活性剤及びその親水性安定剤を有機
溶媒中に溶解させ、その溶液を凍結乾燥させて乾燥粉末
を形成させ、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、
そしてその粉末をその水性担体と混合することを特徴と
する、前記方法。
【請求項２１】前記親水性安定剤が、ポリエチレン・グ
リコール、ポリビニル・ピロリドン、ポリビニル・アル
コール、グリコール酸、リンゴ酸、又はマルトールであ
る、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】前記有機溶液が、第三ブタノール、２−
メチル−２−ブタノール又はC₂Cl₄F₂である、請求項20
又は21に記載の方法。
【請求項２３】請求項１に記載のガス充填微小泡の注射
用懸濁液の製造方法であって、薄層化リン脂質、及び場
合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そ
のリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小
泡の濃度がその懸濁液中で形成されるような条件下で、
懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そ
のリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作ること
を可能にし、そしてその後、微小泡の安定化に関係しな
い過剰のリン脂質の担体液を消耗させることを含む、前
記方法。