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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Imidazo[1,2-a]pyrazinverbindungen,
die als Proteinkinaseinhibitoren (wie beispielsweise Inhibitoren
der cyclinabhängigen
Kinase, mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK/ERK), Glykogensynthasekinase
3 (GSK3β)
und dergleichen) brauchbar sind, pharmazeutische Zusammensetzungen,
die die Verbindungen enthalten, und deren Verwendung zur Herstellung
eines Medikaments, das in Behandlungsverfahren unter Verwendung
der Verbindungen und Zusammensetzungen verwendet wird, um Erkrankungen
wie beispielsweise Krebs, Entzündung,
Arthritis, Viruserkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, wie
Morbus Alzheimer, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Pilzerkrankungen
zu behandeln. Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung
mit dem Aktenzeichen Nr. 60/412,997, eingereicht am 23. September
2002.
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Hintergrund der Erfindung
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Proteinkinaseinhibitoren
schließen
Kinasen wie beispielsweise die Inhibitoren der cyclinabhängigen Kinasen
(CDKs), mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK/ERK), Glykogensynthasekinase
3 (GSK3β)
und dergleichen ein. Die cyclinabhängigen Kinasen (CDKs) sind
Serin/Threonin-Proteinkinasen, die die treibende Kraft hinter dem
Zellzyklus und der Zellproliferation sind. Individuelle CDKs, wie
CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6 und CDK7, CDK8 und dergleichen, übernehmen
bestimmte Rol len in der Progression des Zellzyklus und können als
G1-, S- oder G2M-Phasenenzyme
klassifiziert werden. Unkontrollierte Proliferation ist ein Anzeichen
für Krebszellen,
und Fehlregulation der CDK-Funktion tritt mit großer Häufigkeit
bei vielen bedeutsamen soliden Tumoren auf. CDK2 und CDK4 sind von
besonderem Interesse, weil ihre Aktivitäten oft in einer weiten Vielfalt
von menschlichen Krebserkrankungen fehlreguliert werden. Die CDK2-Aktivität ist für die Progression
durch die G1- bis
S-Phase des Zellzyklus erforderlich, und CDK2 ist eine der Schlüsselkomponenten
des G1-Checkpunkts. Checkpunkte dienen dazu, die richtige Sequenz
der Ereignisse des Zellzyklus aufrechtzuerhalten und der Zelle die
Reaktion auf Verletzungen oder Proliferationssignale zu ermöglichen, während der
Verlust der richtigen Checkpunktkontrolle bei Krebszellen zur Tumorgenese
beiträgt.
Der CDK2-Stoffwechselweg beeinflusst die Tumorgenese auf der Ebene
der Tumorsuppressorfunktion (z. B. p52, RB und p27) und der Onkogenaktivierung
(Cyclin E). Viele Berichte haben gezeigt, dass sowohl der Coaktivator,
Cyclin E, als auch der Inhibitor, p27, von CDK2 bei Brust-, Kolon-,
nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Magen-, Prostata-, Blasenkrebs,
Non-Hodgkins Lymphom, Eierstockkrebs und anderen Krebsarten entweder
zu stark oder zu schwach exprimiert werden. Es ist gezeigt worden,
dass ihre geänderte
Expression mit erhöhten CDK2-Aktivitätsniveaus
und schlechten Gesamtüberlebensraten
korreliert. Diese Beobachtung macht CDK2 und seine Regulierungsstoffwechselwege
zu interessanten Zielen für
die Entwicklungsjahre, in der Literatur ist über eine Reihe Adenosin-5'-triphosphat (ATP)-kompetitiver kleiner
organischer Moleküle
sowie Peptide als CDK-Inhibitoren für die mögliche Behandlung von Krebserkrankungen
berichtet worden.
US 6,413,974 ,
Spalte 1, Zeile 23 bis Spalte 15, Zeile 10, gibt eine gute Beschreibung
der verschiedenen CDKs und ihrer Beziehung zu den verschiedenen
Krebstypen.
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CDK-Inhibitoren
sind bekannt. Flavopiridol (Formel I) ist beispielsweise ein unselektiver
CDK-Inhibitor, mit dem momentan klinische Versuche am Menschen durchgeführt werden,
A. M. Sanderowicz et al., J. Clin. Oncol. (1998) 16, 2986–2999.
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Andere
bekannte Inhibitoren für
die CDKs schließen
beispielsweise Olomoucin (J. Vesely et al., Eur. J. Biochem., (1994)
224, 771–786)
und Roscovitin (I. Meijer et al., Eur. J. Biochem., (1997) 243,
527–536)
ein.
US 6,107,305 beschreibt
bestimmte Pyrazolo[3,4-b]pyridinverbindungen als CDK-Inhibitoren.
Eine veranschaulichende Verbindung aus
US 6,107,305 hat die Formel II:
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K.
S. Kim et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 3905–3927 und
WO 02/10162 offenbaren bestimmte
Aminothiazolverbindungen als CDK-Inhibitoren.
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Pyrazolopyrimidine
sind bekannt.
WO 92/18504 ,
WO 02/50079 ,
WO 95/35298 ,
WO 02/40485 ,
EP 94304104.6 ,
EP 0628559 (entsprechen
US-Patenten 5,602,136 ,
5,602,137 und
5,571,813 ),
US 6,383,790 , Chem. Pharm. Bull. (1999)
47, 928, J. Med. Chem., (1977) 20, 296, J. Med. Chem. (1976) 19,
517 und Chem. Pharm. Bull. (1962) 10, 620 offenbaren verschiedene
Pyrazolopyrimidine.
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US 5,028,605 offenbart 8-Alkylaminoimidazo(1,2-α)pyrazine
und ihre Verwendung auf dem Gebiet der Antispastika, Uterusrelaxantien,
Bronchiodilatoren, Herzanaleptika und Neurosedativa.
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Vitse
et al. berichten zudem über
die Synthese von Imidazo[1,2-a]pyrazinderivaten mit Bronchiodilation
und cyclische Nukleotidphosphodiesterase inhibierenden Aktivitäten (Olivier
Vitse et al., Bioorganic & Medicinal
Chemistry 7 (1999), 1059–1065).
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Es
sind ferner Untersuchungen verschiedener Imidazo[1,2-α]pyrazinderivaten und ihrer
inhibierenden Potenz auf PDE-Isoenzyme,
die aus Dami-Zellen isoliert wurden, bekannt (Katja Zurbonsen et
al., Biochemical Pharmacology 54, 1997, 365–371; Katja Zurbonsen et al.,
European Journal of Pharmacology 320, 1997, 215–221).
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WO 02/060492 offenbart
außerdem
Verfahren zum Inhibieren von Proteintyrosinkinasen, wie JAK, unter
Verwendung von 6-Carba-8-amino-disubstituierten
Imidazo[1,2-α]pyrazinen.
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Es
besteht ein Bedarf an neuen Verbindungen, Formulierungen, Behandlungen
und Therapien zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen,
die mit CDKs zusammenhängen.
Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, Verbindungen zu liefern,
die zur Behandlung oder Prävention
oder Linderung derartiger Erkrankungen und Störungen brauchbar sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liefert in ihren vielen Ausführungsformen
eine neue Klasse von Imidazo[1,2-a]pyrazinverbindungen als Inhibitoren
von cyclinabhängigen
Kinasen, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, pharmazeutische
Zusammensetzungen, die eine oder mehrere derartige Verbindungen
enthalten, Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen,
die eine oder mehrere derartige Verbindungen enthalten, ihre Verwendung
zur Herstellung eines Medikaments, das in Verfahren zur Behandlung,
Prävention,
Inhibierung oder Linderung von einer oder mehreren Erkrankungen
verwendet wird, die mit den CDKs zusammenhängen, unter Verwendung dieser
Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen.
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Die
vorliegende Anmeldung offenbart in einem Aspekt eine Verbindung
oder pharmazeutisch annehmbare Salze oder Solvate der Verbindung,
wobei die Verbindung die in Formel III gezeigte allgemeine Struktur hat:
Formel
III worin:
R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Arylalkyl, Heterocyclyl, Heterocyclylalkyl,
Alkenyl, Alkinyl, -C(O)R
7,
wobei
jedes von dem Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Arylalkyl, Alkenyl,
Heterocyclyl und jede von den Heterocyclyleinheiten, deren Strukturen
unmittelbar oben für
R gezeigt sind, unsubstituiert oder gegebenenfalls unabhängig mit
einer oder mehreren Einheiten substituiert sein kann, die gleich
oder verschieden sein können,
wobei jede Einheit unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, Cycloalkyl, CF
3, CN, -OCF
3, -OR
6, -C(O)R
7, -NR
5R
6, -C(O
2)R
6, -C(O)NR
5R
6, -(CHR
5)
nOR
6,
-SR
6, -S(O
2)R
7, -S(O
2)NR
5R
6, -N(R
5)S(O
2)R
7,
-N(R
5)C(O)R
7 und
-N(R
5)C(O)NR
5R
6;
R
1 H, Halogen
oder Alkyl ist;
R
2 ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus R
9, Alkyl,
Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, Heterocyclyl, Alkenyl,
Alkinyl, Cycloalkyl, Cycloalkylalkyl, Heterocyclylalkyl, -CF
3, -C(O)R
7, mit 1
bis 6 R
9-Gruppen substituiertem Alkyl, wobei
die Gruppen gleich oder verschieden sein können, wobei jedes R
9 unabhängig
ausgewählt
ist aus
wobei jedes von dem Aryl,
Heteroaryl, Cycloalkyl, Arylalkyl und Heterocyclyl unsubstituiert
oder gegebenenfalls unabhängig
mit einer oder mehreren Einheiten substituiert sein kann, die gleich
oder unterschiedlich sein können,
wobei jede Einheit unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, Cycloalkyl, CF
3, CN, -OCF
3, -OR
6, -C(O)R
7, -NR
5R
6, -C(O
2)R
6, -C(O)NR
5R
6, -SR
6,
-S(O
2)R
7, -S(O
2)NR
5R
6, -N(R
5)S(O
2)R
7,
-N(R
5)C(O)R
7 und
-N(R
5)C(O)NR
5R
6;
R
3 ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus H, Aryl, Heteroaryl, Heterocyclyl,
-(CHR
5)
n-Aryl, -(CHR
5)
n-Heteroaryl, -(CHR
5)
n-Cycloalkyl, -(CHR
5)
n-Heterocycloalkyl,
-(CHR
5)
n-CH(aryl)
2,
-(CHR
5)
n-OR
6, -S(O
2)R
6, -C(O)R
6, -S(O
2) NR
5R
6, -C(O)OR
6, -C(O)NR
5R
6, Cycloalkyl, -CH(Aryl)
2 , -CH(Heteroaryl)
2,
-(CH
2)
m-NR
8,
und
wobei jedes von dem Aryl,
Heteroaryl und Heterocyclyl unsubstituiert oder gegebenenfalls mit
einer oder mehreren Einheiten substituiert sein kann, die gleich
oder verschieden sein können,
wobei jede Einheit unabhängig ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, CF
3, CN, -OCF
3, -OR
5, -NR
5R
6, -C(O
2)R
5, -O(O)NR
5R
6, -SR
6,
-S(O
2)R
6, -S(O
2)NR
5R
6,
-N(R
5)S(O
2)R
7, -N(R
5)C(O)R
7 und -N(R
5)C(O)NR
5R
6;
R
5 H oder Alkyl ist;
R
6 ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus H, Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl
und Heteroarylalkyl, wobei jedes von dem Alkyl, Heteroarylalkyl,
Aryl, Heteroaryl und Arylalkyl unsubstituiert ist;
R
7 ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl
und Heteroarylalkyl, wobei jedes von dem Alkyl, Heteroarylalkyl,
Aryl, Heteroaryl und Arylalkyl unsubstituiert ist;
R
8 ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus R
6, -C(O)NR
5R
6, -S(O
2)NR
5R
6,
-C(O)R
7, -C(O
2)R
6, -S(O
2)R
7 und -(CH
2)-Aryl;
R
9 ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, CN, NR
5R
6, -C(O
2)R
6, -C(O)NR
5R
6, -OR
6, -C(O)R
7, -SR
6, -S(O
2)R
7, -S(O
2)NR
5R
6,
-N(R
5)S(O
2)R
7, -N(R
5)C(O)R
7 und -N(R
5)C(O)NR
5R
6;
m 0 bis
4 ist;
n 1 bis 4 ist und
p 0 bis 3 ist.
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Die
Verbindungen der Formel III können
als Proteinkinaseinhibitoren brauchbar sein und können zur Behandlung
und Prävention
von proliferierenden Erkrankungen brauchbar sein, beispielsweise
Krebs, Entzündung
und Arthritis. Sie können
auch zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen brauchbar sein,
wie Morbus Alzheimer, kardiovaskulärer Erkrankungen, Viruserkrankungen
und Pilzerkrankungen.
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Detaillierte Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung offenbart in einer Ausführungsform Imidazo[1,2-a]pyrazinverbindungen,
die durch Strukturformel III wiedergegeben werden, oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz oder Solvat davon, wobei die verschiedenen Einheiten
wie oben beschrieben sind.
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R
ist in einer anderen Ausführungsform
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Aryl, Heteroaryl, Alkenyl und -C(O)R7, wobei jedes von dem Aryl und Heteroaryl
unsubstituiert oder gegebenenfalls unabhängig mit einer oder mehreren
Einheiten substituiert sein kann, die gleich oder verschieden sein
können,
wobei jede Einheit unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, CF3,
CN, -OCF3 und -OR6.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
ist R1 H oder niederes Alkyl.
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R2 ist in einer anderen Ausführungsform
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkenyl
und -C(O)R7, wobei jedes von dem Alkyl,
Aryl und Heteroaryl unsubstituiert oder gegebenenfalls unabhängig mit
einer oder mehreren Einheiten substituiert sein kann, die gleich
oder verschieden sein können,
wobei jede Einheit unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, CF3,
CN, -OCF3 und -OR6.
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R
3 ist gemäß einer
anderen Ausführungsform
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus H, Aryl, Heteroaryl, -(CHR
5)
n-Aryl, -(CHR
5)
n-Heteroaryl, -(CHR
5)
n-OR
6, -C(O)R
6 , Cycloalkyl, -CH(Aryl)
2,
wobei
jedes von dem Aryl oder Heteroaryl unsubstituiert oder gegebenenfalls
mit einer oder mehreren Einheiten substituiert sein kann, die gleich
oder unterschiedlich sein können,
wobei jede Einheit unabhängig
aus der Gruppe bestehend aus Halogen, Alkyl, Aryl, CF
3,
CN, -C(O
2)R
5 und
-S(O
2)R
6 ausgewählt ist.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
ist R5 H oder niederes Alkyl.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist m 0 bis 2.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist n 1 oder 3.
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R
ist gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und Heteroaryl.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist R1 H, Br oder Methyl.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist R2 F, Cl, Br, I, Aryl, Alkenyl, Heteroaryl
oder CF3.
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R3 ist gemäß einer
weiteren Ausführungsform
Phenyl, (Pyrid-2-yl)methyl, (Pyrid-3-yl)methyl, (Pyrid-4-yl)methyl,
2-[(Pyrid-3-yl)]ethyl,
2-[(Pyrid-4-yl)]ethyl, 2-Ylpropanol, 3-Ylpropyl-1-Pyrrolidin-2-on, oder -C(O)CH3, wobei das Pyridyl unsubstituiert oder
gegebenenfalls mit einer oder mehreren Einheiten substituiert sein
kann, die gleich oder verschieden sein können, wobei jede Einheit unabhängig ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, CF3,
niederem Alkyl, Methoxy und CN.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist R5 H.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist m 0.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist n 1 oder 2.
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In
Tabelle 1 ist eine erfindungsgemäße Gruppe
von Verbindungen gezeigt.
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Eine
weitere Ausführungsform
offenbart Verbindungen mit der Formel:
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Die
folgenden Begriffe haben, wenn nicht anders angegeben, oben und
in dieser Offenbarung die folgenden Bedeutungen: "Patient" schließt sowohl
Menschen als auch andere Tiere ein. "Säuger" bedeutet Menschen
und andere Säugetiere.
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"Alkyl" bedeutet eine aliphatische
Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig oder verzweigt sein kann und
etwa 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatome in der Kette enthält. Bevorzugte
Alkylgruppen enthalten etwa 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in der
Kette. Besonders bevorzugte Alkylgruppen enthalten etwa 1 bis etwa
6 Kohlenstoffatome in der Kette. Verzweigt bedeutet, dass eine oder
mehrere niedere Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder Propyl, an
eine lineare Alkylkette gebunden sind. "Niederes Alkyl" bedeutet eine Gruppe mit etwa 1 bis
etwa 6 Kohlenstoffatomen in der Kette, die geradkettig oder verzweigt
sein kann. Der Begriff "substituiertes Alkyl" bedeutet, dass die
Alkylgruppe mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein
kann, die gleich oder unterschiedlich sein können, wobei jeder Substituent
unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe be stehend aus Halogen, Alkyl, Aryl, Cycloalkyl,
Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino, -NH(Alkyl), -NH(Cycloalkyl),
-N(Alkyl)2, Carboxy und -C(O)O-Alkyl. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Alkylgruppen schließen
Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl und t-Butyl ein.
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"Alkinyl" bedeutet eine aliphatische
Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung
enthält
und geradkettig oder verzweigt sein kann und etwa 2 bis etwa 15
Kohlenstoffatome in der Kette enthält. Bevorzugte Alkinylgruppen
haben etwa 2 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in der Kette und insbesondere
etwa 2 bis etwa 4 Kohlenstoffatome in der Kette. Verzweigt bedeutet,
dass eine oder mehrere niedere Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder
Propyl, an eine lineare Alkinylkette gebunden sind. "Niederes Alkinyl" bedeutet etwa 2
bis etwa 6 Kohlenstoffatome in der Kette, die geradkettig oder verzweigt
sein kann. Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete Alkinylgruppen schließen
Ethinyl, Propinyl, 2-Butinyl und 3-Methylbutinyl ein. Der Begriff "substituiertes Alkinyl" bedeutet, dass die
Alkinylgruppe durch einen oder mehrere Substituenten substituiert
sein kann, die gleich oder unterschiedlich sein können, wobei
jeder Substituent unabhängig
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Aryl oder Cycloalkyl.
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"Aryl" bedeutet ein aromatisches
monocyclisches oder multicyclisches Ringsystem, das etwa 6 bis etwa
14 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatome
enthält.
Die Arylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren "Ringsystemsubstituenten" substituiert sein,
die gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert
sind. Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete Arylgruppen schließen
Phenyl und Naphthyl ein.
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"Heteroaryl" bedeutet ein aromatisches
monocyclisches oder multicyclisches Ringsystem, das etwa 5 bis etwa
14 Ringatome, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10 Ringatome enthält, wobei
ein oder mehrere der Ringatome ein von Kohlenstoff verschiedenes
Element ist, beispielsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel allein
oder in Kombination. Bevorzugte Heteroaryle enthalten etwa 5 bis
etwa 6 Ringatome. Das "Heteroaryl" kann gegebenenfalls
mit einem oder mehreren "Ringsystemsubstituenten" substituiert sein,
die gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert
sind. Der Präfix
Aza, Oxa oder Thia vor der Heteroarylstammbezeichnung bedeutet,
dass mindestens ein Stickstoff-, Sauerstoff- beziehungsweise Schwefelatom
als Ringatom vorhanden ist. Ein Stickstoffatom eines Heteroaryls
kann gegebenenfalls zu dem entsprechenden N-Oxid oxidiert werden.
Nicht einschränkende
Beispiele für
geeignete Heteroaryle schließen
Pyridyl, Pyrazinyl, Furanyl, Thienyl, Pyrimidinyl, Pyridon (einschließlich N-substituierter
Pyridone), Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Pyrazolyl,
Furazanyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Triazolyl, 1,2,4-Thiadiazolyl, Pyrazinyl,
Pyridazinyl, Chinoxalinyl, Phthalazinyl, Oxindolyl, Imidazo[1,2-a]pyridinyl,
Imidazo[2,1-b]thiazolyl, Benzofurazanyl, Indolyl, Azaindolyl, Benzimidazolyl,
Benzothienyl, Chinolinyl, Imidazolyl, Thienopyridyl, Chinazolinyl,
Thienopyrimidyl, Pyrrolopyridyl, Imidazopyridyl, Isochinolinyl,
Benzoazaindolyl, 1,2,4-Triazinyl, Benzothiazolyl und dergleichen ein.
Der Begriff "Heteroaryl" bezieht sich auch
auf teilweise gesättigte
Heteroaryleinheiten, wie beispielsweise Tetrahydroisochinolyl, Tetrahydrochinolyl
und dergleichen.
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"Aralkyl" oder "Arylalkyl" bedeutet eine Arylalkylgruppe,
in der das Aryl und Alkyl wie zuvor beschrieben sind. Bevorzugte
Aralkyle enthalten eine niedere Alkylgruppe. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Aralkylgruppen schließen Benzyl,
2-Phenethyl und Naphthenylmethyl ein. Die Bindung an die Stammeinheit
erfolgt über
das Alkyl.
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"Alkylaryl" bedeutet eine Alkylarylgruppe,
in der das Alkyl und Aryl wie zuvor beschrieben sind. Bevorzugte
Alkylaryle enthalten eine niedere Alkylgruppe. Ein nicht-einschränkendes
Beispiel für
eine geeignete Alkylarylgruppe ist Tolyl. Die Bindung an die Stammeinheit
erfolgt über
das Aryl.
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"Cycloalkyl" bedeutet ein nicht-aromatisches
monocyclisches oder multicyclisches Ringsystem, das etwa 3 bis etwa
10 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10 Kohlenstoffatome
enthält.
Bevorzugte Cycloalkylringe enthalten etwa 5 bis etwa 7 Ringatome.
Das Cycloalkyl kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren "Ringsystemsubstituenten" substituiert sein,
die gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert
sind. Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete monocyclische Cycloalkyle schließen Cyclopropyl, Cyclopentyl,
Cyclohexyl, Cycloheptyl und dergleichen ein. Zu nicht einschränkenden
Beispielen für
geeignete multicyclische Cycloalkyle gehören 1-Decalinyl, Norbornyl,
Adamantyl und dergleichen sowie teilweise gesättigte Spezies, wie beispielsweise
Indanyl, Tetrahydronaphthyl und dergleichen.
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"Halogen" bedeutet Fluor,
Chlor, Brom oder Iod.
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"Ringsystemsubstituent" bedeutet einen an
ein aromatisches oder nicht-aromatisches Ringsystem gebundenen Substituenten,
der beispielsweise einen verfügbaren
Wasserstoff an dem Ringsystem ersetzt. Die Ringsystemsubstituenten
können
gleich oder unterschiedlich sein und sind jeweils unabhängig ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl,
Aralkyl, Alkylaryl, Heteroaralkyl, Heteroarylalkenyl, Heteroarylalkinyl,
Alkylheteroaryl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Aryloxy, Aralkoxy,
Acyl, Aroyl, Halogen, Nitro, Cyano, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl,
Aralkoxycar bonyl, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Heteroarylsulfonyl,
Alkylthio, Arylthio, Heteroarylthio, Aralkylthio, Heteroaralkylthio,
Cycloalkyl, Heterocyclyl, -C(=N-CN)-NH
2,
-C(=NH)-NH
2, -C(=NH)-NH(alkyl), Y
1Y
2N-, Y
1Y
2N-Alkyl-, Y
1Y
2NC(O)-, Y
1Y
2NSO
2- und -SO
2NY
1Y
2, wobei Y
1 und Y
2 gleich oder
unterschiedlich sein können
und jeweils unabhängig
ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Aralkyl. "Ringsystemsubstituent" kann auch eine einzelne
Einheit bedeuten, die gleichzeitig zwei verfügbare Wasserstoffe an zwei
benachbarten Kohlenstoffatomen (ein H an jedem Kohlenstoff) an einem
Ringsystem ersetzt. Beispiele für
eine derartige Einheit sind Methylendioxy, Ethylendioxy, -C(CH
3)
2- und dergleichen,
die Einheiten wie beispielsweise die Folgenden bilden:
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"Heterocyclyl" bedeutet ein nicht-aromatisches
gesättigtes
monocyclisches oder multicyclisches Ringsystem, das etwa 3 bis etwa
10 Ringatome, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10 Ringatome enthält, wobei
ein oder mehrere der Atome des Ringsystems ein von Kohlenstoff verschiedenes
Element ist bzw. sind, beispielsweise Stickstoff, Sauerstoff oder
Schwefel allein oder in Kombination. In dem Ringsystem sind keine
benachbarten Sauerstoff- und/oder Schwefelatome vorhanden. Bevorzugte
Heterocyclyle enthalten etwa 5 bis etwa 6 Ringatome. Der Präfix Aza,
Oxa oder Thia vor der Heterocyclylstammbezeichnung bedeutet, dass
mindestens ein Stickstoff-, Sauerstoff- beziehungsweise Schwefelatom
als Ringatom vorhanden ist. Jegliches -NH in einem Heterocyclylring
kann in geschützter
Form vorliegen, wie beispielsweise als -N(Boc), -N(CBz), -N(Tos)-Gruppe
und dergleichen, und diese geschützten
Einheiten werden auch als Teil dieser Erfindung angesehen. Das Heterocyclyl
kann gegebenen falls mit einem oder mehreren "Ringsystemsubstituenten" substituiert sein,
die gleich oder verschieden sein können und wie oben definiert
sind. Das Stickstoff- oder Schwefelatom des Heterocyclyls kann gegebenenfalls
zu dem entsprechenden N-Oxid,
S-Oxid oder S,S-Dioxid oxidiert sein. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
monocyclische Heterocyclylringe schließen Piperidyl, Pyrrolidinyl,
Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Thiazolidinyl, 1,4-Dioxanyl,
Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothiophenyl, Lactam, Lacton und dergleichen
ein.
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Es
sei darauf hingewiesen, dass es in einem erfindungsgemäßen Heteroatom
enthaltenden Ringsystem keine Hydroxylgruppen an Kohlenstoffatomen
neben einem N, O oder S gibt, sowie keine N- oder S-Gruppen an Kohlenstoff
neben einem anderen Heteroatom gibt. In dem Ring
gibt es beispielsweise kein
-OH, das an Kohlenstoffatome mit den Bezeichnungen 2 und 5 gebunden
ist.
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Es
sei auch darauf hingewiesen, dass tautomere Formen, wie beispielsweise
die Einheiten:
in bestimmten Ausführungsformen
dieser Erfindung als Äquivalent
angesehen werden.
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"Alkinylalkyl" bedeutet eine Alkinylalkylgruppe,
in der das Alkinyl und Alkyl wie zuvor beschrieben sind. Bevorzugte Alkinylalkyle
enthalten eine niedere Alkinyl- und eine niedere Alkylgruppe. Die
Bindung an die Stammeinheit erfolgt über das Alkyl. Zu nicht einschränkenden
Beispielen für
geeignete Alkinylalkylgruppen gehören Propargylmethyl.
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"Heteroaralkyl" bedeutet eine Heteroarylalkylgruppe,
in der das Heteroaryl und Alkyl wie zuvor beschrieben sind. Bevorzugte
Heteroaralkyle enthalten eine niedere Alkylgruppe. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Aralkylgruppen schließen
Pyridylmethyl und Chinolin-3-ylmethyl ein. Die Bindung an die Stammeinheit
erfolgt über
das Alkyl.
-
"Hydroxyalkyl" bedeutet eine HO-Alkylgruppe,
in der Alkyl wie zuvor definiert ist. Bevorzugte Hydroxyalkyle enthalten
niederes Alkyl. Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete Hydroxyalkylgruppen schließen Hydroxymethyl und 2-Hydroxyethyl
ein.
-
"Acyl" bedeutet eine H-C(O)-,
Alkyl-C(O)- oder Cycloalkyl-C(O)-Gruppe,
in der die verschiedenen Gruppen wie zuvor beschrieben sind. Die
Bindung an die Stammeinheit erfolgt über das Carbonyl. Bevorzugte Acyle
enthalten ein niederes Alkyl. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete
Acylgruppen schließen
Formyl, Acetyl und Propanoyl ein.
-
"Aroyl" bedeutet eine Aryl-C(O)-Gruppe,
in der die Arylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Die Bindung an
die Stammeinheit erfolgt über
das Carbonyl. Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete Aralkenylgruppen schließen Benzoyl und 1-Naphthoyl
ein.
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"Alkoxy" bedeutet eine Alkyl-O-Gruppe,
in der die Alkylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Alkoxygruppen schließen
Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy und n-Butoxy ein. Die Bindung
an die Stammeinheit erfolgt über
den Ethersauerstoff.
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"Aryloxy" bedeutet eine Aryl-O-Gruppe,
in der die Arylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Aryloxygruppen schließen
Phenoxy und Naphthoxy ein. Die Bindung an die Stammeinheit erfolgt über den
Ethersauerstoff.
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"Aralkyloxy" bedeutet eine Aralkyl-O-Gruppe,
in der die Aralkylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Aralkyloxygruppen schließen
Benzyloxy und 1- und 2-Naphthalinmethoxy ein. Die Bindung an die
Stammeinheit erfolgt über
den Ethersauerstoff.
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"Alkylthio" bedeutet eine Alkyl-S-Gruppe,
in der die Alkylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Zu nicht-einschränkenden
Beispielen für
geeignete Alkylthiogruppen gehören
Methylthio und Ethylthio. Die Bindung an die Stammeinheit erfolgt über den
Schwefel.
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"Arylthio" bedeutet eine Aryl-S-Gruppe,
in der die Arylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete
Arylthiogruppen schließen
Phenylthio und Naphthylthio ein. Die Bindung an die Stammeinheit
erfolgt über
den Schwefel.
-
"Aralkylthio" bedeutet eine Aralkyl-S-Gruppe,
in der die Aralkylgruppe wie zuvor beschrieben ist. Ein nicht-einschränkendes
Beispiel für
eine geeignete Aralkylthiogruppe ist Benzylthio. Die Bindung an
die Stammeinheit erfolgt über
den Schwefel.
-
"Alkoxycarbonyl" bedeutet eine Alkyl-O-CO-Gruppe.
Nicht-einschränkende Beispiele
für geeignete Alkoxycarbonylgruppen
schließen
Methoxycarbonyl und Ethoxycarbonyl ein. Die Bindung an die Stammeinheit erfolgt über das
Carbonyl.
-
"Aryloxycarbonyl" bedeutet eine Aryl-O-C(O)-Gruppe.
Nicht-einschränkende
Beispiele für
geeignete Aryloxycarbonyl gruppen schließen Phenoxycarbonyl und Naphthoxycarbonyl
ein. Die Bindung an die Stammeinheit erfolgt über das Carbonyl.
-
"Aralkoxycarbonyl" bedeutet eine Aralkyl-O-C(O)-Gruppe
Ein nicht-einschränkendes
Beispiel für
eine geeignete Aralkoxycarbonylgruppe ist Benzyloxycarbonyl. Die
Bindung an die Stammeinheit erfolgt über das Carbonyl.
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"Alkylsulfonyl" bedeutet eine Alkyl-S(O2)-Gruppe. Bevorzugte Gruppen sind jene,
in denen die Alkylgruppe niederes Alkyl ist. Die Bindung an die
Stammeinheit erfolgt über
das Sulfonyl.
-
"Arylsulfonyl" bedeutet eine Aryl-S(O2)-Gruppe. Die Bindung an die Stammeinheit
erfolgt über
das Sulfonyl.
-
Der
Begriff "substituiert" bedeutet, dass ein
oder mehrere Wasserstoffe an dem angegebenen Atom durch eine Auswahl
aus der angegebenen Gruppe ersetzt wird, vorausgesetzt, dass die
normale Wertigkeit des angegebenen Atoms unter den bestehenden Bedingungen
nicht überschritten
wird und die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt. Kombinationen
von Substituenten und/oder Variablen sind nur dann zulässig, wenn
solche Kombinationen zu stabilen Verbindungen führen. Mit "stabiler Verbindung" oder "stabiler Struktur" ist eine Verbindung gemeint, die ausreichend
robust ist, um die Isolierung zu einem brauchbaren Reinheitsgrad aus
einer Reaktionsmischung und die Formulierung zu einem wirksamen
therapeutischen Mittel zu überstehen.
-
Der
Begriff "gegebenenfalls
substituiert" bedeutet
gegebenenfalls mit den angegebenen Gruppen, Resten oder Einheiten
substituiert.
-
Der
Begriff "isoliert" oder "in isolierter Form" bezieht sich bei
einer Verbindung auf den physischen Zustand dieser Verbindung, nachdem
sie aus einem Syntheseverfahren oder einer natürlichen Quelle oder Kombination
davon isoliert worden ist. Der Begriff "gereinigt" oder "in gereinigter Form" bezieht sich bei einer Verbindung auf
den physischen Zustand der Verbindung, nachdem sie aus einem oder
mehreren Reinigungsverfahren erhalten wurde, die hier beschrieben
sind oder dem Fachmann gut bekannt sind, in ausreichender Reinheit,
um durch Standardanalysetechniken charakterisierbar zu sein, die
hier beschrieben sind oder dem Fachmann gut bekannt sind.
-
Es
sei darauf hingewiesen, dass von jeglichem Heteroatom mit nicht
abgesättigten
Valenzen in dem Text, den Schemata, Beispielen und Tabellen hier
angenommen wird, dass es das Wasserstoffatom/die Wasserstoffatome
aufweist, um die Valenzen abzusättigen.
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Wenn
eine funktionale Gruppe in einer Verbindung als "geschützt" bezeichnet wird, bedeutet dies, dass
die Gruppe in modifizierter Form vorliegt, um unerwünschte Nebenreaktionen
an der geschützten
Stelle auszuschließen,
wenn die Verbindung einer Reaktion unterzogen wird. Geeignete Schutzgruppen
sind Fachleuten bekannt, wobei auf Standardlehrbücher wie beispielsweise T.
W. Greene et al., Protective Groups in organic Synthesis (1991),
Wiley, New York, verwiesen wird.
-
Wenn
irgendeine Variable (z. B. Aryl, Heterocyclus, R2,
usw.) mehr als ein Mal in irgendeinem Bestandteil oder in Formel
III vorkommt, ist ihre Definition bei jedem Vorkommen unabhängig von
ihrer Definition bei jedem anderen Vorkommen.
-
Der
Begriff "Zusammensetzung" soll ein Produkt
einschließen,
das die angegebenen Bestandteile in den spezifizierten Mengen enthält, sowie
jegliches Produkt, das direkt oder indirekt aus der Kombination
der spezifizierten Bestandteile in den spezifizierten Mengen resultiert.
-
Es
sind hier auch Solvate der erfindungsgemäßen Verbindungen eingeschlossen.
-
"Solvat" bedeutet eine physikalische
Assoziation einer erfindungsgemäßen Verbindung
mit einem oder mehreren Lösungsmittelmolekülen. Diese
physikalische Assoziation beinhaltet variierende Grade von ionischer
und kovalenter Bindung einschließlich Wasserstoffbrückenbindung.
In bestimmten Fällen
kann das Solvat isoliert werden, beispielsweise wenn ein oder mehr
Lösungsmittelmoleküle in das
Kristallgitter des kristallinen Feststoffs eingebaut werden. "Solvat" schließt sowohl
Lösungsphasensolvate
als auch isolierbare Solvate ein. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete
Solvate schließen
Ethanolate, Methanolate und dergleichen ein. "Hydrat" ist ein Solvat, wobei das Lösungsmittelmolekül H2O ist.
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"Wirksame Menge" oder "therapeutisch wirksame
Menge" soll eine
Menge der erfindungsgemäßen Verbindung
oder einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
beschreiben, die effektiv die CDK(s) inhibieren und somit den gewünschten
therapeutischen, lindernden oder prävantiven Effekt erzeugen.
-
Die
Verbindungen der Formel III können
Salze bilden, die auch innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen.
Die Bezugnahme auf eine Verbindung der Formel III soll hier die
Bezugnahme auf deren Salze einschließen, wenn nicht anders angegeben.
Der Begriff "Salz(e)" bezeichnet hier
saure Salze, die mit anorganischen und/oder organischen Säuren gebildet
sind, sowie basische Salze, die mit anorganischen und/oder organischen
Basen gebildet sind. Wenn eine Verbindung der Formel III zudem sowohl
eine basische Einheit wie, jedoch nicht begrenzt auf ein Pyridin
oder Imidazol, als auch eine saure Einheit enthält, wie eine Carbonsäure, jedoch
nicht darauf begrenzt, können
Zwitterionen ("innere
Salze") gebildet
werden und sind hier in den Begriff "Salz(e)" eingeschlossen. Pharmazeutisch annehmbare
(d. h. nicht-toxische, physiologisch annehmbare) Salze sind bevorzugt,
obwohl auch andere Salze brauchbar sind. Salze der Verbindungen
der Formel III können
beispielsweise gebildet werden, indem eine Verbindung der Formel
III mit einer Menge an Säure
oder Base, wie einer äquivalenten
Menge, in einem Medium umgesetzt werden, wie einem, in dem das Salz
ausfällt, oder
in einem wässrigen
Medium, gefolgt von Lyophilisierung.
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Zu
beispielhaften Säureadditionssalzen
gehören
Acetate, Ascorbate, Benzoate, Benzolsulfonate, Eisulfate, Borate,
Butyrate, Citrate, Camphorate, Kamphersulfonate, Fumarate, Hydrochloride,
Hydrobromide, Hydroiodide, Lactate, Maleate, Methansulfonate, Naphthalinsulfonate,
Nitrate, Oxalate, Phosphate, Propionate, Salicylate, Succinate,
Sulfate, Tartrate, Thiocyanate, Toluolsulfonate (auch als Tosylate
bekannt) und dergleichen. Säuren,
die allgemein für
die Bildung pharmazeutisch brauchbarer Salze aus basischen pharmazeutischen
Verbindungen als geeignet angesehen werden, sind zudem beispielsweise
in S. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66
(1) 1–19;
P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201–217; Anderson
et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press,
New York, und in The Orange Book (Fond & Drug Administration, Washington,
DC, auf ihrer Website) erörtert.
Auf diese Offenbarungen wird hier Bezug genommen.
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Beispielhafte
basische Salze schließen
Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze wie Natrium-, Lithium- und Kaliumsalze,
Erdalkalimetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit
organischen Basen (beispielsweise organischen Aminen) ein, wie Dicyclohexylaminen,
t-Butylaminen und Salzen mit Aminosäuren wie Arginin, Lysin und
dergleichen. Basische stickstoffhaltige Gruppen können mit
Mitteln wie niederen Alkylhalogeniden (z. B. Methyl-, Ethyl- und
Butylchloriden, -bromiden und -iodiden), Dialkylsulfaten (z. B.
Dimethyl-, Diethyl- und Dibutylsulfaten), langkettigen Halogeniden
(z. B. Decyl-, Lauryl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden),
Aralkylhalogeniden (z. B. Benzyl- und Phenethylbromiden) und anderen
quaternisiert werden.
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Alle
derartigen Säuresalze
und Basesalze sollen pharmazeutisch annehmbare Salze innerhalb des Umfangs
der Erfindung sein, und alle Säure-
oder Basensalze werden für
erfindungsgemäße Zwecke
als zu den freien Formen der entsprechenden Verbindungen äquivalent
angesehen.
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Verbindungen
der Formel III und Salze und Solvate und Prodrugs davon können in
ihrer tautomeren Form vorliegen (beispielsweise als Amid oder Iminoether).
Alle derartigen tautomeren Formen werden hier als Teil der vorliegenden
Erfindung angesehen.
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Alle
Stereoisomere (beispielsweise geometrische Isomere, optische Isomere
und dergleichen) der vorliegenden Verbindungen (einschließlich jene
der Salze, Solvate und Prodrugs der Verbindungen sowie der Salze
und Solvate der Prodrugs), wie jene, die aufgrund von asymmetrischen
Kohlenstoffatomen an verschiedenen Substituenten vorliegen können, einschließlich enantiomeren
Formen (die sogar in Abwesenheit asymmetrischer Kohlenstoffatome
vorliegen können),
rotameren Formen, Atropisomeren und diastereomeren Formen, sind
hier in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen, ebenso wie Positionsisomere
(wie beispielsweise 4-Pyridyl und 3-Pyridyl). Individuelle Stereoisomere
der erfindungsgemäßen Verbindungen
können
beispielsweise im Wesentlichen frei von anderen Isomeren sein, oder
können
beispielsweise als Racemate oder mit allen anderen oder anderen
ausgewählten
Stereoisomeren gemischt sein. Die chiralen Zentren der vorliegenden
Erfindung können
die S- oder R-Konfiguration haben, wie durch die Empfehlungen der
IUPAC von 1974 definiert. Die Verwendung der Betriffe "Salz", "Solvat", "Prodrug" und dergleichen
soll gleichermaßen
für das Salz,
Solvat und Prodrug von Enantiomeren, Stereoisomeren, Rotameren,
Tautomeren, Positionsisomeren, Racematen oder Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen
gelten.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
haben pharmakologische Eigenschaften; die Verbindungen der Formel
III können
insbesondere Inhibitoren von Proteinkinasen sein, wie beispielsweise
Inhibitoren der cyclinabhängigen
Kinasen, mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK/ERK), Glykogensynthasekinase
3 (GSK3β) und
dergleichen. Zu den cyclinabhängigen
Kinasen (CDKs) gehören
beispielsweise CDC2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7 und CDK8.
Es wird erwartet, dass die neuen Verbindungen der Formel III zur
Therapie proliferierender Erkrankungen brauchbar sind, wie Krebs,
Autoimmunerkrankungen, viralen Erkrankungen, Pilzerkrankungen, neurologischen/neurodegenerativen
Störungen,
Arthritis, Entzündung,
antiproliferierenden (z. B. Rethinopathie des Auges), neuronalen
Erkrankungen, Alopezie und Herz-Kreislauf-Erkrankung. Viele dieser
Erkrankungen und Störungen
sind in der bereits genannten
US
6,413,974 genannt, auf deren Offenbarung hier Bezug genommen
wird.
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Die
Verbindungen der Formel III können
spezieller zur Behandlung einer Vielzahl von Krebserkrankungen brauchbar
sein, einschließlich
der folgenden (jedoch nicht auf diese begrenzt): Karzinomen einschließlich jenen
der Blase, Brust, des Kolons, der Niere, Leber, Lunge einschließlich kleinzelligem
Lungenkrebs, Ösophagus,
Gallenblase, Ovar, Pankreas, Magen, Zervix, Schilddrüse, Prostata
und Haut einschließlich
Schuppenzellkarzinom;
hämatopoietischen
Tumoren des Lymphsystems einschließlich Leukämie, akuter Lymphozytenleukämie, akuter
Lymphoblastenleu kämie,
B-Zellen-Lymphom. T-Zellen-Lymphom, Hodgkins Lymphom, Non-Hodgkins-Lyphom,
Haarzellenlymphom und Burkett-Lymphom;
hämatopoietischen Tumoren des
Myeloidsystems, einschließlich
akuten und chronischen myelogenen Leukämien, myelodysplastischem Syndrom
und Promyelozytenleukämie;
Tumoren
mesenchymalen Ursprungs, einschließlich Fibrosarkom und Rhabdomyosarkom;
Tumoren
des zentralen und peripheren Nervensystems, einschließlich Astrozytom,
Neuroblastom, Gliom und Schwannomen, und
anderen Tumoren, einschließlich Melanom,
Seminom, Teratokarzinom, Osteosarkom, Xenoderoma pigmentosum, Keratoxanthom,
Schilddrüsenfollikelkrebs
und Kaposi-Sarkom.
-
Wegen
der Schlüsselrolle
von CDKs bei der Regulierung der zellulären Proliferation im Allgemeinen können Inhibitoren
als reversible zytostatische Mittel wirken, die zur Behandlung jeglichen
Krankheitsprozesses brauchbar sein können, der abnormale zelluläre Proliferation
zeigt, z. B. gutartige Prostatahyperplasie, familiäre adenomatöre Polyposis,
Neurofibromatose, Atherosklerose, Lungenfibrose, Arthritis, Psoriasis,
Glomerulonephtiritis, Restenose nach Angioplastik oder Gefäßchirurgie,
hypertrophe Narbenbildung, entzündliche Darmerkrankung,
Transplantatabstoßung,
Endotoxinschock und Pilzinfektionen.
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Verbindungen
der Formel III können
auch zur Behandlung von Morbus Alzheimer brauchbar sein, wie durch
die neuere Feststellung nahegelegt wird, dass CDK5 an der Phosphorylierung
von tau-Protein beteiligt ist (J. Biochem, (1995) 117, 741–749).
-
Verbindungen
der Formel III können
Apoptose induzieren oder inhibieren. Die apoptotische Reaktion erfolgt
bei einer Vielfalt von Krankheiten des Menschen irrtümlich. Verbindungen
der Formel III sind als Modulatoren der Apoptose zur Behandlung
von Krebs (einschließlich
der hier genannten Typen, jedoch nicht auf diese begrenzt), Virusinfektionen
(einschließlich,
aber nicht begrenzt auf Herpesvirus, Pockenvirus, Epstein-Barr-Virus,
Sindbisvirus und Adenovirus), Prävention
der AIDS-Entwicklung bei HIV-infizierten Individuen, Autoimmunerkrankungen
(einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf systemischen Lupus erythematosus, autoimmunvermittelte
Glomerulonephritis, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, entzündliche
Darmerkrankung und Autoimmun-Diabetes mellitus), neurodegenerative
Erkrankungen (einschließlich,
aber nicht begrenzt auf Morbus Alzheimer, mit AIDS zusammenhängender
Demenz, Morbus Parkinson, amyotropher Lateralsklerose, Retinitis
pigmentosa, spinaler Muskelatrophie und zerebellarer Degeneration),
myelodysplastischen Syndromen, aplastischer Anämie, ischämischer Verletzung im Zusammenhang
mit Herzinfarkt, Schlaganfall und Reperfusionverletzung, Arrhythmie,
Atherosklerose, toxininduzierten oder mit Alkohol zusammenhängenden
Lebererkrankungen, hämatologischen
Erkrankungen (einschließlich,
aber nicht begrenzt auf chronische Anämie und aplastische Anämie), degenerative
Erkrankungen des Muskel- und Skelettsystems (einschließlich, aber
nicht begrenzt auf Osteoporose und Arthritis), aspirin-sensitive
Rhinosinusitis, zystische Fibrose, multiple Sklerose, Nierenerkrankungen
und Krebsschmerz brauchbar.
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Verbindungen
der Formel III können
als Inhibitoren der CDKs das Niveau der zellulären RNA- und DNA-Synthese modulieren.
Diese Mittel wären
daher bei der Behandlung viraler Infektionen brauchbar (einschließlich, aber
nicht begrenzt auf HIV, humanes Papillomavirus, Herpesvirus, Pockenvirus,
Epstein-Barr-Virus, Sindbisvirus und Adenovirus).
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Verbindungen
der Formel III können
auch bei der Chemoprävention
von Krebs brauchbar sein. Chemoprävention ist definiert als Inhibierung
der Entwicklung von invasivem Krebs, indem entweder das initiierende
mutagene Ereignis blockiert wird oder die Progression der prämalignen
Zellen blockiert wird, die bereits eine Schädigung erlitten haben, oder
Inhibierung des Wiederauftretens des Tumors.
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Verbindungen
der Formel III können
auch zur Inhibierung von Tumorangiogenese und Metastase brauchbar
sein.
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Verbindungen
der Formel III können
auch als Inhibitoren anderer Proteinkinasen wirken, z. B. Proteinkinase
C, her2, raf1, MEK1, MAP Kinase, EGF Rezeptor, PDGF Rezeptor, IGF
Rezeptor, PI3 Kinase, wee1 Kinase, Src, Abl, und somit zur Behandlung
von Erkrankungen wirksam sein, die mit anderen Proteinkinasen assoziiert
sind.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
in einem Verfahren zur Behandlung eines Säugers (z. B. Menschen) mit
einer Erkrankung oder einem Zustand, die bzw. der mit den CDKs assoziiert
sind, verwendet werden, indem dem Säuger eine therapeutisch wirksame
Menge von mindestens einer Verbindung der Formel III oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz oder Solvat der Verbindung verabreicht wird.
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Eine
bevorzugte Dosis ist etwa 0,001 bis 500 mg/kg Körpergewicht/Tag der Verbindung
der Formel III. Eine besonders bevorzugte Dosis ist etwa 0,01 bis
25 mg/kg/Tag von einer Verbindung der Formel I oder einem pharmazeutisch
annehmbaren Salz oder Solvat der Verbindung.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch in Kombination (zusammen oder nacheinander verabreicht mit)
mit einer oder mehreren Antikrebsbehandlungen verwendet werden,
wie Strahlungstherapie und/oder einem oder mehreren Antikrebsmit teln
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus zytostatischen Mitteln, zytotoxischen
Mitteln (wie beispielsweise, ohne darauf begrenzt zu sein, DNA-interaktiven
Mitteln (wie Cisplatin oder Doxorubicin)); Taxanen (z. B. Taxoter,
Taxol); Topoisomerase II Inhibitoren (wie Etoposid); Topoisomerase
I Inhibitoren (wie Irinotecan (oder CPT-11), Camptostar oder Topotecan);
Tubulin-interagierenden Mitteln (wie Paclitaxel, Docetaxel oder
den Epothilonen); Hormonmitteln (wie Tamoxifen); Thymidilat-Synthaseinhibitoren
(wie 5-Fluoruracil); Antimetaboliten (wie Methoxtrexat); Alkylierungsmitteln
(wie Temozolomid (TEMODARTM von Schering-Plough
Corporation, Kenilworth, New Jersey, USA), Cyclophosphamid); Farnesylproteintransferaseinhibitoren
(wie SARASARTM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-Dibrom-8-chlor-6,11-dihydro-5H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-yl-]-1-piperidinyl]-2-oxoethyl]-1-piperidincarboxamid
oder SCH 66336 von Schering-Plough Corporation, Kenilworth, New
Jersey, USA), Tipifarnib (Zarnestra® oder
R115777 von Janssen Pharmaceuticals), L778.123 (ein Farnesylproteintransferaseinhibitor
von Merck & Company,
Whitehouse Station, New Jersey, USA), BMS 214662 (ein Farnesylproteintransferaseinhibitor
von Bristol-Myers
Squibb Pharmaceuticals, Princeton, New Jersey, USA); Signalweiterleitungsinhibitoren
(wie Iressa (von Astra Zeneca Pharmaceuticals, England), Tarceva
(EGFR-Kinaseinhibitoren), Antikörper
für EGFR
(z. B. C225), GLEEVECTM (C-abl-Kinaseinhibitor
von Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, New Jersey, USA); Interferone
wie beispielsweise Intron (von Schering-Plough Corporation), Peg-Intron (von
Schering-Plough Corporation); Hormontherapiekombinationen; Aromatasekombinationen;
Ara-C, Adriamycin, Cytoxan und Gemcitabin.
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Zu
anderen Antikrebsmitteln (auch als antineoplastische Mittel bekannt)
gehören,
ohne auf diese begrenzt zu sein Uracil-Lost, Chlormethin, Cyclophosphamid,
Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Pipobroman, Triethylenmelamin,
Triethylenthiophosphoramin, Busulfan, Carmustin, Lomustin, Streptozocin,
Dacarbazin, Floxuridin, Cytarabin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin,
Fludarabinphosphat, Oxaliplatin, Leucovirin, Oxaliplatin (ELOXATIN(tm)
von Sanofi-Synthelabo Pharmaceuticals, Frankreich), Pentostatin,
Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin,
Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin, Mithramycin, Deoxycoformycin,
Mitomycin-C, L-Asparaginase, Teniposid, 17α-Ethinylestradiol, Diethylstilbestrol,
Testosteron, Prednison, Fluoxymesteron, Dromostanolonpropionat,
Testolacton, Megestrolacetat, Tamoxifen, Methylprednisolon, Methyltestosteron,
Prednisolon, Triamcinolon, Chlortrianisen, Hydroxyprogesteron, Aminoglutethimid,
Estramustin, Medroxyprogesteronacetat, Leuprolid, Flutamid, Toremifen,
Goserelin, Cisplatin, Carboplatin, Hydroxyharnstoff, Amsacrin, Procarbazin,
Mitotan, Mitoxantron, Levamisol, Navelben, Anastrazol, Letrazol,
Capecitabin, Droloxifin und Hexamethylmelamin.
-
Diese
Kombinationsprodukte verwenden, wenn sie als feste Dosis formuliert
sind, die erfindungsgemäßen Verbindungen
in dem hier beschriebenen Dosierbereich und das andere pharmazeutisch
aktive Mittel oder die Behandlung innerhalb seines/ihres Dosierbereichs.
Es ist beispielsweise gefunden worden, dass der CDC2-Inhibitor Olomucin
synergistisch mit bekannten zytotoxischen Mitteln wirkt, um Apoptose
zu induzieren (J. Cell Sci., (1995) 108, 2897). Verbindungen der
Formel III können
auch sequentiell mit bekannten Antikrebs- oder zytotoxischen Mitteln
verabreicht werden, wenn eine Kombinationsformulierung unangebracht
ist. Die Erfindung ist hinsichtlich der Verabreichungsreihenfolge
nicht begrenzt; Verbindungen der Formel III können vor oder nach Verabreichung
des bekannten Antikrebs- oder
zytotoxischen Mittels verabreicht werden. Die zytotoxi sche Aktivität des cyclinabhängigen Kinaseinhibitors
Flavopiridol wird durch die Reihenfolge der Verabreichung mit Antikrebsmitteln
beeinflusst, Cancer Research, (1997) 57, 3375. Derartige Techniken
liegen innerhalb des Wissens von Fachleuten sowie behandelnden Ärzten.
-
Diese
Erfindung schließt
demnach in einem Aspekt Kombinationen ein, die eine Menge von mindestens
einer Verbindung der Formel III oder ein pharmazeutisch annehmbares
Salz oder Solvat davon sowie eine Menge von einer oder mehreren
Antikrebsbehandlungen und oben aufgeführten Antikrebsmitteln enthalten, wobei
die Mengen der Verbindungen/Behandlungen zu einer erwünschten
therapeutischen Wirkung führen.
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Die
pharmakologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen
können
durch eine Reihe pharmakologischer Assays bestätigt werden. Die beispielhaften
pharmakologischen Assays, die nachfolgend beschrieben werden, sind
mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
und ihren Salzen durchgeführt
worden.
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Diese
Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens
eine Verbindung der Formel III oder ein pharmazeutisch annehmbares
Salz oder Solvat der Verbindung und mindestens einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger
dafür enthalten.
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Inerte,
pharmazeutisch annehmbare Träger
zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen aus den in dieser
Erfindung beschriebenen Verbindungen können fest oder flüssig sein.
Zubereitungen in fester Form schließen Pulver, Tabletten, dispergierbare
Körner,
Kapseln, Oblatenkapseln und Zäpfchen
ein. Die Pulver und Tabletten können
aus etwa 5 bis etwa 95 aktivem Bestandteil zusammensetzt sein. Geeignete
feste Träger
sind in der Technik bekannt, z. B. Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat,
Talkum, Zucker oder Lactose. Tabletten, Pulver, Kapseln und Oblatenkapseln
können
als feste Dosierungsformen verwendet werden, die für die orale
Verabreichung geeignet sind. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare
Träger
und Fertigungsverfahren für
verschiedene Zusammensetzungen finden sich in A. Gennaro (Herausgeber),
Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18. Auflage (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania,
USA.
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Zubereitungen
in flüssiger
Form schließen
Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen ein. Wasser oder Wasser-Propylenglykol-Lösungen für die parenterale
Injektion oder Zugabe von Süßungsmitteln
oder Opazifizierungsmittel für
orale Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen können
beispielhaft genannt werden. Zubereitungen in flüssiger Form können auch
Lösungen
für intranasale
Verabreichung einschließen.
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Aerosolzubereitungen,
die zur Inhalation geeignet sind, können Lösungen und Feststoffe in Pulverform
einschließen,
die in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger wie
inertem komprimiertem Gas, z. B. Stickstoff, vorliegen können.
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Ebenfalls
eingeschlossen sind Zubereitungen in fester Form, die kurz vor Gebrauch
in Zubereitungen in flüssige
Form für
orale oder parenterale Verabreichungen überführt werden sollen. Solche flüssigen Formen schließen Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen ein.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch transdermal verabreichbar sein. Die transdermalen Zusammensetzungen
können
die Form von Cremes, Lotionen, Aerosolen und/oder Emulsionen annehmen,
und können
in ein Transdermalpflaster vom Matrix- oder Reservoirtyp eingeschlossen werden,
wie in der Technik zu diesem Zweck konventionell ist.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch subkutan verabreichbar sein.
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Die
Verbindung wird vorzugsweise oral verabreicht.
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Die
pharmazeutische Zubereitung liegt vorzugsweise in Einheitsdosisform
vor. In einer solchen Form wird die Zubereitung in geeignet bemessene
Einheitsdosen unterteilt, die geeignete Mengen der aktiven Komponente
enthalten, z. B. eine wirksame Menge, um den gewünschten Zweck zu erreichen.
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Die
Menge an aktiver Verbindung in einer Einheitszubereitungsdosis kann
gemäß der speziellen
Anwendung auf etwa 1 mg bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 1 mg
bis etwa 50 mg, insbesondere etwa 1 mg bis etwa 25 mg variiert oder
eingestellt werden.
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Die
tatsächlich
verwendete Dosis kann gemäß den Erfordernissen
des Patienten und dem Schweregrad des behandelten Zustands variiert
werden. Die Bestimmung des richtigen Dosierschemas für eine spezielle
Situation liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns. Der Bequemlichkeit
halber kann die gesamte Tagesdosis unterteilt und nach Bedarf portionsweise über den
Tag verabreicht werden.
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Die
Menge und Frequenz der Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
und/oder der pharmazeutisch annehmbaren Salze derselben werden gemäß der Beurteilung
des behandelnden Arztes unter Berücksichtigung von Faktoren wie
Alter, Zustand und Größe des Patienten
sowie dem Schweregrad der zu behandelnden Symptome festgelegt. Ein
typisches empfohlenes Tagesdosierschema für die orale Verabreichung kann
im Bereich von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 500 mg/kg/Tag, vorzugsweise
1 mg/Tag bis 200 mg/Tag, in zwei bis vier unterteilten Dosen liegen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit, der eine therapeutisch
wirksame Menge von mindestens einer Verbindung der Formel III oder
ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat der Verbindung und einen
pharmazeutisch annehmbaren Träger,
ein Vehikel oder Verdünnungsmittel
enthält.
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Ein
weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Kit, der eine Menge von
mindestens einer Verbindung der Formel III oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz oder Solvat der Verbindung und eine Menge von mindestens
einer Antikrebstherapie und/oder einem oben aufgeführten Antikrebsmittel
enthält,
wobei die Mengen der zwei oder mehr Bestandteile zu einer gewünschten
therapeutischen Wirkung führt.
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Die
hier offenbarte Erfindung wird durch die folgenden Zubereitungen
und Beispiele veranschaulicht, die nicht als den Umfang der Offenbarung
einschränkend
angesehen werden sollen. Alternative mechanistische Wege und analoge
Strukturen ergeben sich Fachleuten von selbst.
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Wenn
NMR-Daten angegeben sind, wurden 1H-Spektren
auf entweder einem Varian VXR-200 (200 MHz, 1H),
Varian Gemini-300 (300 MHz) oder XL-400 (400 MHz) erhalten und sind
als ppm in tieferem Feld als Me4Si angegeben,
wobei Anzahl der Protonen, Multiplizitäten und Kopplungskonstanten
in Klammern angegeben sind. Wenn LC/MS-Daten angegeben sind, wurden
die Analysen mit einem Applied Biosystems API-100 Massenspektrometer
und Shimadzu SCL-10A LC Säule
durchgeführt:
Altech platinum C18, 3 μm;
33 mm × 7 mm
Innendurchmesser; Gradientendurchfluss: 0 Min – 10% CH3CN,
5 Min – 95%
CH3CN, 7 Min – 95% CH3CN, 7,5
Min – 10%
CH3CN, 9 Min – Stopp. Angegeben sind die
Retentionszeit und das beobachtete Stammion.
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Die
folgenden Lösungsmittel
und Reagenzien können
hier durch ihre Abkürzungen
in Klammern bezeichnet werden:
Dünnschichtchromatographie: (DC),
Dichlormethan:
CH2Cl2
Ethylacetat:
(AcOEt oder EtOAc),
Methanol: (MeOH),
Trifluoracetat:
TFA
Triethylamin: (Et3N oder TEA),
Butoxycarbonyl:
n-Boc oder Boc
Kernmagnetresonanzspektroskopie: NMR
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie:
LCMS
hochauflösende
Massenspektroskopie: HRMS
Milliliter: ml
Millimol: mmol
Mikroliter: μl
Gramm:
g,
Milligramm: mg
Raumtemperatur oder RT (Umgebungstemperatur):
etwa 25°C.
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Beispiele
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Eine
Mischung von 1-Methylimidazol-2-carboxamid (3,00 g, 24 mmol) und
Phenacylbromid (5,73 g, 29 mmol) wurde in wasserfreiem CH3CN (90 ml) gerührt und einen Tag unter N2 unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde filtriert, der Feststoff auf dem Filter
mit CH3CN (2 × 30 ml) gewaschen und im Vakuum
getrocknet. Es wurde ein weißer
Feststoff (5,86 g, 80%) erhalten.
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Präparatives
Beispiel 1.1 und 1.2:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das im präparativen
Beispiel 1 beschrieben ist, können
die in Spalte 2 von Tabelle 1.1 wiedergegebenen Verbindungen hergestellt
werden, indem 1-Methylimidazol-2-carboxamid mit den in Spalte 1
gezeigten Bromketonen kombiniert wird.
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 1 beschrieben ist.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 1 (4,62 g, 15 mmol) und Imidazol (25,50 g, 375 mmol) wurde
20 Stunden lang bei 175°C
unter N2 gerührt, danach wurde sie auf 100°C abgekühlt und in
gerührtes
eiskaltes Wasser (400 ml) gegossen. Die Mischung wurde 15 Minuten
gerührt
und danach filtriert. Der Feststoff wurde auf dem Filter mit Wasser
(2 × 100
ml) gewaschen und bei 100°C
im Vakuum getrocknet. Es wurde ein weißer Feststoff (2,43 g, 77%)
erhalten.
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Präparatives
Beispiel 3.1 und 3.2:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das im präparativen
Beispiel 3 gezeigt ist, können
die in Spalte 2 von Tabelle 2.1 wiedergegebenen Verbindungen aus
den in Spalte 1 wiedergegebenen Verbindungen hergestellt werden.
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Verfahren 1:
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 3 beschrieben ist. LCMS: MH+ =
246.
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Verfahren 2:
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Pyridiniumhydrochlorid
(378,6 g, 3,28 Mol) wurde in einen 2 L Rundkolben gegeben und unter
Rückfluss
unter einem leichten Stickstoffstrom erwärmt, bis das gesamte Material
geschmolzen war. Die Titelverbindung aus dem präparativen Beispiel 2 [31,64
g Rohmaterial, hergestellt aus 1-Methylimidazol-2-carboxamid (10
g, 79,9 mmol), im Wesentlichen wie im präparativen Beispiel 2 beschrieben]
wurde in einer Portion zugegeben, und die Mischung wurde 15 Minuten
lang unter Rückfluss
auf 215°C
erwärmt.
Die heiße
Lösung
wurde in eine Mischung aus 1,6 L Eis und konz. NH4OH
(500 ml) gegossen. Der pH-Wert
betrug etwa 10,5. Die Mischung wurde zur Trockne eingedampft und
im Gefrierschrank gelagert. Das resultierende Material wurde mit MeOH
(4 L) trituriert, filtriert und die Feststoffe mit weiterem MeOH
(2 L) gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden zur Trockne eingedampft,
um einen Feststoff (49,75 g) zu ergeben. Letzterer wurde aufgebrochen
und mit destilliertem Wasser (250 ml) trituriert und danach filtriert.
Das Filtrat wurde verworfen und der Feststoff in heißem MeOH
(850 ml) gelöst
und zu Silikagel (etwa 800 ml) und Seesand (etwa 350 ml) gegeben,
und die Mischung wurde zur Trockne eingedampft. Die resultierende
Mischung wurde als Pfropfen auf eine Silikagelsäule (40 × 9 cm) gegeben, und letztere
wurde mit CH2Cl2 (4
L), gefolgt von 1% bis 2,5% MeOH in CH2Cl2 und danach reinem MeOH eluiert, um die
Titelverbindung zu ergeben (8,06 g, 41%). FABMS: m/z 246,0 (MH+); HRFABMS: m/z 246,0434 (MH+),
C12H9ClN3O erfordert: m/z 246,0434.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 3 (1,20 g, 5,71 mmol) und Pyridin (0,32 ml, 4,0 mmol) in
POCl3 (6,5 ml) wurde 5 Stunden lang unter
N2 gerührt
und unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde in 100 ml Eis gegossen, es wurde eine
Lösung
von NaOH (10 g) in H2O (100 ml) zugegeben und
die Mischung mit CH2Cl2 (4 × 50 ml)
extrahiert. Die Extrakte wurden über
Na2SO4 getrocknet,
filtriert und das Lösungsmittel verdampft.
Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/EtOAc
(2:1) ergab einen schmutzigweißen
Feststoff (520 mg, 40%).
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Präparatives
Beispiel 5.1 und 5.2:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das im präparativen
Beispiel 5 gezeigt ist, können
die in Spalte 2 von Tabelle 3.1 wiedergegebenen Verbindungen aus
den in Spalte 1 wiedergegebenen Verbindungen hergestellt werden.
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 5 beschrieben ist. Schmutzigweißer Feststoff; LCMS; MH+ = 264.
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Eine
Lösung
von N-Bromsuccinimid ("NBS" (180 mg, 1,0 mmol)
in wasserfreiem CH3CN (5 ml) wurde unter
N2 zu einer gerührten Lösung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 5 (230 mg, 1,0 mmol) in wasserfreiem CH3CN
(5 ml) und CH2Cl2 (3
ml) gegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 25°C gerührt und dann das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2/EtOAc (10:1) ergab einen weißen Feststoff
(294 mg, 96%).
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Präparatives
Beispiel 7.1 und 7.2:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das im präparativen
Beispiel 7 gezeigt ist, können
die in Spalte 2 von Tabelle 4.1 wiedergegebenen Verbindungen aus
den in Spalte 1 wiedergegebenen Verbindungen hergestellt werden.
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 7 beschrieben ist. Weißer
Feststoff; LCMS; MH+ = 342.
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Eine
Lösung
von N-Iodsuccinimid ("NIS") (450 mg, 2,0 mmol)
in wasserfreiem CH3CN (10 ml) wurde unter
N2 zu einer gerührten Lösung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 5 (460 mg, 2,0 mmol) in wasserfreiem CH3CN
(6 ml) und 1,2-Dichlorethan (10 ml) gegeben. Die Mischung wurde
30 Stunden unter Rückfluss
gehalten, und dann wurde das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2/EtOAc (10:1) ergab einen weißen Feststoff
(602 mg, 85%).
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Präparatives
Beispiel 10:
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 9 beschrieben ist. Weißer
Feststoff; LCMS: MH+ = 390.
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Präparatives
Beispiel 11:
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im präparativen
Beispiel 9 beschrieben ist. Weißer
Feststoff.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 10 (78 mg, 0,20 mmol), 3-(Aminomethyl)pyridin (24 mg, 0,22
mmol), Diisopropylethylamin (0,5 ml) und wasserfreiem Dioxan (1,0
ml) wurde 48 Stunden lang unter N2 bei 90°C gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (50:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein weißer Feststoff
(67 mg, 78%) erhalten. LCMS; MH+ = 462;
Schmelzpunkt = 173–175°C.
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Beispiele 11.1 und 11.2:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das im präparativen
Beispiel 11 gezeigt ist, können die
in Spalte 2 von Tabelle 5.1 wiedergegebenen Verbindungen aus den
in Spalte 1 wiedergegebenen Verbindungen hergestellt werden.
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Beispiel 12–25:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das in Beispiel 11 gezeigt
ist, wurden die in Spalte 3 von Tabelle 2 wiedergegebenen Verbindungen
hergestellt.
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Beispiele 25.1 und 25.2:
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Die
in Spalte 2 von Tabelle 6.1 wiedergegebenen Verbindungen wurden
aus den in Spalte 1 wiedergegebenen Verbindungen durch saure Hydrolyse
(HCl in H2O), anschließende Neutralisierung (K2CO3) und Säulenchromatographie
hergestellt.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 7 (81 mg, 0,20 mmol) und 4-Methylsulfonylanilinhydrochlorid
(55 mg, 0,32 mmol) in Diisopropylethylamin (1,5 ml) wurde 3 Tage
lang bei 110°C
gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (20:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein
weißer
Feststoff (22 mg, 20%) erhalten. Schmelzpunkt 251–254°C, LCMS:
(M+2H)+ = 445.
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das im obigen Beispiel beschrieben ist. Schmelzpunkt 169–170°C, LCMS:
(M+2H)+ = 367.
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Präparatives
Beispiel 28:
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Das
Produkt aus dem präparativen
Beispiel 7 (185 mg, 0,60 mmol) wurde mit konz. wässrigem NH4OH (3
ml) und 2 M NH3 in 2-Propanol (6 ml) in einem geschlossenen
Druckrohr 24 Stunden lang bei 90°C
gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (20:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein
gelblicher Feststoff (138 mg, 80%) erhalten. Schmelzpunkt 215–217°C, LCMS:
MH+ = 291.
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Präparatives
Beispiel 29:
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Eine
Mischung von 2-Amino-3,5-dibrompyrazin (Aldrich, 6,0 g, 24,0 mmol)
und eine 50 wässrige
Lösung
von Chloracetaldehyd (Aldrich, 4,8 ml) in 2-Propanol (30 ml) wurde
24 Stunden lang unter N2 gerührt und unter
Rückfluss
gehalten. CH2Cl2 (300
ml) und Triethylamin (12 ml) wurden zugefügt, und das Lösungsmittel wurde
verdampft. Der Rückstand
wurde in 10:1 H2O:2-Propanol (200 ml) suspendiert,
filtriert, und der Feststoff auf dem Filter mit 10:1 H2O:2-Propanol
(2 × 100
ml) gewaschen. Er wurde im Vakuum getrocknet, um blassbeigen Feststoff
(4,81 g, 74%) zu ergeben.
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Präparatives
Beispiel 30:
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 29 (1,80 g, 6,45 mmol) und konzentriertem wässrigem
NH4OH (27,0 ml) wurde in einem geschlossenen
Druckgefäß 24 Stunden
bei 90°C
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde verdampft, und der Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit EtOAc gereinigt. Es wurde ein weißer Feststoff
(1,01 g, 73%) erhalten. LCMS: MH+ = 213.
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Präparatives
Beispiel 31:
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 30 (500 mg, 2,36 mmol), Phenylboronsäure (431 mg, 3,53 mmol), Pd
(PPh3)4 (277 mg,
0,24 mmol) und Na2CO3 (2,50
g, 23,6 mmol) in 1,2-Dimethoxyethan (30 ml) und H2O
(8 mL) wurde 24 Stunden lang unter N2 gerührt und
unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde in H2O (500
ml) gegossen, mit CH2Cl2 (4 × 50 ml)
extrahiert und die Extrakte über
Na2SO4 getrocknet
und filtriert. Das Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit PhCH3/7 N NH3 in
MeOH (10:1) gereinigt. Dies ergab ein etwas unreines Produkt als
blassorangen Feststoff, der für
die nächste
Stufe verwendet wurde.
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Präparatives
Beispiel 32:
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 31 (210 mg, 1,0 mmol), Acetylchlorid (0,286 ml, 4,0 mmol)
und Pyridin (0,657 ml, 8,0 mmol) in 1,2-Dichlorethan (5 ml) wurde
72 Stunden lang gerührt und
unter Rückfluss
gehalten. Die Mi schung wurde in 10% wässriges Na2CO3 gegossen und mit CH2Cl2 (3 × 20
ml) extrahiert. Die Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit EtOAc als Eluierungsmittel
ergab 141 mg (56%) blassgelben Feststoff.
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Präparatives
Beispiel 33:
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Eine
Lösung
von NBS (72 mg, 0,40 mmol) in wasserfreiem CH3CN
(2,0 ml) wurde unter N2 zu einer gerührten Lösung des
Produkts aus dem präparativen
Beispiel 32 (100 mg, 0,40 mmol) in wasserfreiem CH3CN
(2,0 ml) und CH2Cl2 (6,0
ml) gegeben. Die Mischung wurde 48 Stunden bei 25°C gerührt und
dann das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2/EtOAc (4:1) ergab einen blassgelben Feststoff
(41 mg, 31%). Schmelzpunkt 163–165°C, LCMS:
(M+2H)+ = 333.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 17 (85 mg, 0,20 mmol), Phenylboronsäure (37
mg, 0,30 mmol), Pd(PPh3)4 (23
mg, 0,02 mmol) und Na2CO3 (212
g, 2,00 mmol) in 1,2-Dimethoxyethan (3,2 ml) und H2O (0,8
mL) wurde 24 Stunden lang unter N2 gerührt und
unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde in H2O (100
ml) gegossen, mit CH2Cl2 (4 × 15 ml)
extrahiert und die Extrakte über
Na2SO4 getrocknet
und filtriert. Das Lösungsmittel
wurde eingedampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit EtOAc/MeOH (30:1) gereinigt, um einen farblosen
wachsartigen Feststoff (46 mg, 61%) zu ergeben. Schmelzpunkt 138–140°C, LCMS:
(M+2H)+ = 378.
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Diese
Verbindung wurde nach im Wesentlichen dem gleichen Verfahren hergestellt,
das in Beispiel 34 beschrieben ist. Verbindung 35: Schmelzpunkt
168–169°C, LCMS:
MH+ = 384; Verbindung 36: Schmelzpunkt 154–156°C, LCMS:
MH+ = 384.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 17 (214 mg, 0,50 mmol), Tributyl(vinyl)zinn
(174 mg, 0,55 mmol) und Pd(PPh3)4 (58 mg, 0,05 mmol) in 1,4-Dioxan (10 ml)
wurde 24 Stunden lang unter N2 gerührt und unter
Rückfluss
gehalten. Das Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (40:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein
blassgelber Feststoff (123 mg, 75%) erhalten. Schmelzpunkt 138–141°C, LCMS:
MH+ = 328.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 17 (214 mg, 0,50 mmol), Tributyl(ethoxyvinyl)zinn
(199 mg, 0,55 mmol) und Pd(PPh3)4 (58 mg, 0,05 mmol) in 1,4-Dioxan (10 ml)
wurde 24 Stunden lang unter N2 gerührt und
unter Rückfluss
gehalten. Es wurde 5 M HCl (1,0 ml) zugefügt, die Mischung 5 Minuten
gerührt,
danach Triethylamin (5 ml) zugegeben und das Lösungsmittel verdampft. Der
Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit EtOAc/MeOH (10:1) gereinigt und danach mit Cyclohexan
(10 ml) trituriert. Es wurde ein blassgelber Feststoff (104 mg,
65%) erhalten. Schmelzpunkt 192–194°C, LCMS:
MH+ = 344.
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MeMgI
(3,0 M in Et2O, 0,20 ml, 0,60 mmol) wurde
zu einer gerührten
Lösung
des Produkts aus Beispiel 38 (51 mg, 0,15 mmol) in wasserfreiem
Et2O (3 ml) und CH2Cl2 (6 ml) gegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang
bei 25°C
gerührt,
danach in H2O (100 ml) gegossen und mit
CH2Cl2 (3 × 20 ml)
extrahiert. Die Extrakte wurden über
Na2SO4 getrocknet,
filtriert und das Lösungsmittel
verdampft. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2:MeOH
(20:1) gereinigt, um blassgelben Feststoff (27 mg, 50%) zu ergeben.
Schmelzpunkt 184–185°C, LCMS:
MH+ = 360.
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Präparatives
Beispiel 40:
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Diese
Verbindung wurde nach dem Literaturverfahren hergestellt (J. Med.
Chem. 1983, 26, 357, und J. Med. Chem. 1992, 35, 3845).
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 40 (50 mg, 0,30 mmol), 2-(Aminomethyl)pyridin (45 mg, 0,42
mmol) und Diisopropylethylamin (0,20 ml) in wasserfreiem Dioxan
(0,50 ml) wurde 24 Stunden lang unter N2 bei
100°C gerührt. Das
Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (2:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein weißer Feststoff
(45 mg, 63%) erhalten. Schmelzpunkt 125–127°C, LCMS: MH+ =
240.
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BEISPIELE 42–48:
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das in präparativen
Beispiel 41 gezeigt ist, wurden die in Spalte 3 von Tabelle 3 wiedergegebenen
Verbindungen hergestellt.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 28 (1,16 g, 4,00 mmol), Pyrimidin-5-carboxaldehyd (540
mg, 5,00 mmol) und Ti(OiPr)4 (4,54 g, 16,0
mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) wurde 3 Stunden lang unter N2 bei 50°C
gerührt.
Die Mischung wurde auf 25°C
abgekühlt,
NaBH3CN (1,26 g, 20,0 mmol) zugegeben und
die Mischung 30 Minuten lang bei 25°C gerührt. Die Mischung wurde in
5% wässrige
NaOH (500 ml) gegeben, es wurde gesättigte wässrige NaCl (500 ml) zugegeben
und die Mischung mit CH2Cl2 (3 × 100 ml)
extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel verdampft.
Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (20:1:0,1) gereinigt. Es wurde ein
blassgelber Feststoff (410 mg, 27%) erhalten. Schmelzpunkt 201–203°C, LCMS:
MH+ = 383.
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BEISPIEL 50:
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Es
wurde eine Vorratslösung
der Titelverbindung aus dem präparativen
Beispiel 8 (1,2 g) in wasserfreiem CH3CN
(120 ml) hergestellt, und in jede der Mulden eines X-Blocks, die
PS-DMAP-Harz (77,6
mg, 0,1164 mmol) enthielt, wurde eine Aliquote (1 ml, 10 mg, 0,0291
mmol) gegeben. In jede der 96 Mulden des X-Blocks wurden frisch
hergestellte 1 M Lösungen
einer Bibliothek von 96 primären
Aminen (0,0873 ml, 0,0873 mmol) gegeben. Die Einheit wurde versiegelt
und 26 Stunden lang auf 60 bis 70°C
erwärmt.
Der Block wurde abgekühlt,
geöffnet
und in einen neuen X-Block filtriert, der PS-Isocyanat-Harz (35
mg, 0,073 mmol) und PS-Trisamin-Harz (35 mg, 0,15 mmol) enthielt,
und das PS-DMAP-Harz wurde mit CH3CN (0,5
ml/Mulde) gewaschen. Der X-Block wurde versiegelt und 71 Stunden
lang bei 25°C
geschüttelt.
Der Block wurde geöffnet, filtriert,
und jede Mulde wurde mit CH3CN (0,5 ml)
gewaschen. Die Mulden wurden auf einem Speedvac-Konzentrator zur
Trockne eingedampft. Die Proben wurden durch LCMS analysiert, und
Proben, die < 90%
rein waren, wurden nach Bedarf weiter durch präparative LCMS gereinigt. Die
Proben wurden jeweils in 60% DMSO-CH3CN
(1 ml) gelöst,
und 0,8 ml von jeder wurden auf die präparative HPLC injiziert (wobei
eine Phenomenex Luna 5n C-18(2) Säule, 60 × 21,2 mm; 5n μm: Durchflussrate
20 ml/Min; Gradienteneluierung mit Wasser-CH3CN-1% wässrige Ameisensäure verwendet
wurde), und es wurden die Fraktionen aufgefangen, die dem gewünschten
Molekulargewicht des Produkts ± 1
Moleküleinheit
entsprachen. Die Endprodukte, die alle > 90% rein waren, sind in Tabelle 4 gezeigt.
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Präparatives
Beispiel 51:
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Eine
Lösung
von NBS (1 Äq.)
in wasserfreiem CH3CN (2,0 ml) wurde unter
N2 zu einer gerührten Lösung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 29 in wasserfreiem CH3CN und CH2Cl2 gegeben. Die
Mischung wurde 48 Stunden bei 25°C
gerührt
und dann das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2/EtOAc ergab das Produkt.
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Eine
Mischung des Produkts aus dem präparativen
Beispiel 51, 3-(Aminomethyl)pyridin (1,1 Äq.), Diisopropylethylamin (3,0 Äq.) und
wasserfreiem Dioxan wurde 48 Stunden lang bei 90°C unter N2 gerührt. Das Lösungsmittel
wurde verdampft und der Rückstand
durch Säulenchromatographie
an Silikagel mit CH2Cl2/MeOH/konz.
wässrigem
NH4OH (2:1:0,1) gereinigt, um das Produkt
zu ergeben.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 52, Acetylchlorid (4,0 Äq.) und
Pyridin (8,0 Äq.)
in 1,2-Dichlorethan wurde 72 Stunden lang gerührt und unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde dann in 10% wässrige Na2CO3 gegossen und mit CH2Cl2 extrahiert. Die Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet,
filtriert und das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit EtOAc als Eluierungsmittel
ergab das Produkt.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 53, dem Aminoalkohol (1,5 Äq.) und
Triethylamin (2,0 Äq.) in
Dioxan wurde 72 Stunden lang gerührt
und unter Rückfluss
gehalten. Die Mischung wurde dann in 10% wässrige Na2CO3 gegossen und mit CH2Cl2 extrahiert. Die Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet,
filtriert und das Lösungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2:MeOH als Eluierungsmittel ergab das Produkt.
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Tabelle 5
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das in Beispiel 54 gezeigt
ist, wobei Intermediate aus dem präparativen Beispiel mit den
in Spalte 1 wiedergegebenen Aminen kombiniert wurden, können die
in Spalte 2 gezeigten Verbindungen hergestellt werden.
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Eine
Mischung des Produkts aus Beispiel 54 und K2CO3 (2,0 Äq.)
in 1:1 EtOH:H2O wurde 2 Stunden lang bei
60°C gerührt. Die
Mischung wurde in H2O gegossen und mit CH2Cl2 extrahiert.
Die Extrakte wurden über
Na2SO4 getrocknet,
filtriert und das Lö sungsmittel
verdampft. Chromatographie an Silikagel mit CH2Cl2:MeOH:konz. NH4OH
ergab das Produkt.
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TABELLE 6
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Nach
im Wesentlichen dem gleichen Verfahren, das in Beispiel 58 gezeigt
ist, wobei von den in Spalte 1 gezeigten Verbindungen ausgegangen
wird, können
die in Spalte 2 gezeigten Verbindungen hergestellt werden.
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ASSAY:
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BACULOVIRUS-KONSTRUKTIONEN:
Die Cycline A und E wurden in pFASTBAC (Invitrogen) von PCR kloniert,
wobei eine GluTAG Sequenz (EYMPME) an das Amino-terminale Ende addiert
wurde, um Reinigung an Anti-GluTAG-Affinitätssäulen zu ermöglichen. Die exprimierten Proteine
waren ungefähr
46 kDa (Cyclin E) und 50 kDa (Cyclin A) groß. CDK2 wurde mit PCR in pFASTBAC
geklont, wobei am carboxyterminalen Ende ein Haemaglutinin-Epitoptag
zugefügt
wurde (YDVPD-YAS). Das exprimierte Protein hatte eine Größe von ungefähr 34 kDa.
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ENZYMPRODUKTION:
Rekombinante Baculoviren, die Cyclins A, E und CDK2 exprimieren,
wurden in einer gleichen Multiplizität der Infektion (MOI = 5) 48
Stunden lang in SF9-Zellen infiziert Die Zellen wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren
mit 1000 UpM geerntet. Cyclinhaltige (E oder A) Pellets wurden mit
EDK2 enthaltenden Zellpellets kombiniert und 30 Minuten auf Eis
in dem fünffachen
des Pelletvolumens an Lysepuffer lysiert, der 50 mM Tris-pH 8,0,
0,5% NP40, 1 mM DTT und Protease/Phosphatase-Inhibitoren (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) enthielt. Die Mischungen
wurden 30 bis 60 Minuten gerührt,
um die Bildung des Cyclin-CDK2-Komplexes zu fördern. Die gemischten Lysate
wurden dann 10 Min mit 15000 UpM geschleudert und der Überstand
behalten. 5 ml Anti-GluTAG-Perlen (für einen Liter SF9-Zellen) wurden
dann zum Einfangen der Cyclin-CDK2-Komplexe verwendet. Gebundene
Perlen wurden drei Mal in Lysepuffer gewaschen. Die Proteine wurden
kompetitiv mit Lysepuffer eluiert, der 100 bis 200 μg/ml des
GluTAG-Peptids enthielt. Das Eluat wurde über Nacht in 2 Litern Kinasepuffer
dialysiert, der 50 mM Tris pH 8,0, 1 mM DTT, 10 mM MgCl2,
100 μM Natriumorthovanadat
und 20% Glycerin enthielt. Das Enzym wurde in Aliquoten bei –70°C gelagert.
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IN
VITRO-KINASE-ASSAY: CDK2-Kinaseassays (entweder Cyclin A- oder E-abhängig) wurden
in 96-Mulden-Platten mit niedriger Proteinbindung (Corning Inc,
Corning, New York, USA) durchgeführt.
Das Enzym wurde in Kinasepuffer, der 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT und 0,1 mM Natriumorthovanadat enthielt,
auf eine Endkonzentration von 50 μg/ml
verdünnt.
Das in diesen Reaktionen verwendete Substrat war ein biotinyliertes
Peptid, das von Histon H1 (von Amersham, GB) abgeleitet war. Das
Substrat wurde auf Eis getaut und in Kinasepuffer auf 2 μM verdünnt. Die
Verbindungen wurden in 10% DMSO auf erwünschte Konzentrationen verdünnt. Für jede Kinasereaktion
wurden 20 μl
der 50 μg/ml
Enzymlösung
(1 μg Enzym)
und 20 μl
der 1 μM
Substratlösung
gemischt, danach in jeder Mulde zum Test mit 10 μl verdünnter Verbindung kombiniert.
Die Kinasereaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 4 μM ATP und 1 μCi 33P-ATP
(von Amersham, GB) gestartet. Die Reaktion wurde eine Stunde bei
Raumtemperatur laufen gelassen. Die Reaktion wurde gestoppt, indem
15 Minuten lang 200 μl
Stopppuffer, der 0,1% Triton X-100, 1 mM ATP, 5 mM EDTA und 5 mg/ml Streptavidin-beschichtete
SPA-Perlen (von
Amersham, GB) enthielt, zugefügt
wurde. Die SPA-Perlen
wurden danach auf einer 96 Mulden-GF/B Filterplatte (Packard/Perkin
Elmer Life Sciences) unter Verwendung eines Filtermate Universalernters
(Packard/Perkin Elmer Life Sciences.) eingefangen. Die unspezifischen
Signale wurden eliminiert, indem die Perlen zwei Mal mit 2 M NaCl,
danach zwei Mal mit 2 M NaCl mit 1% Phosphorsäure gewaschen wurden. Dann
wurde das radioaktive Signal mit einem TopCount 96 Mulden Flüssigszintillationszähler gemessen
(von Packard/Perkin Elmer Life Sciences).
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IC50-BESTIMMUNG: Dosis-Reaktions-Kurven wurden
aus Inhibierungsdaten aufgetragen, die jeweils doppelt aus seriellen
8-Punkt-Verdünnungen
der inhibierenden Verbindungen erzeugt wurden. Die Konzentrationen
der Verbindung wurden gegen % Kinaseaktivität aufgetragen, berechnet durch
CPM der behandelten Proben, geteilt durch CPM der unbehandelten
Proben. Um IC50-Werte zu erzeugen, wurden die Dosis-Reaktions-Kurven
dann an eine Sigmoid-Standardkurve angepasst, und die IC50-Werte wurden durch nicht-lineare Regressionsanalyse
abgeleitet. Die so erhaltenen IC50-Werte
für einige
der erfindungsgemäßen Verbindungen sind
in Tabelle 7 gezeigt. Die Kinaseaktivitäten wurden unter Verwendung
von Cyclin A oder Cyclin E unter Verwendung des oben beschriebenen
Assays erhalten.
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Wie
oben durch die Assaywerte gezeigt wird, zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen
hervorragende CDK inhibierende Eigenschaften.