DE60213648T2

DE60213648T2 - Verwendung von thymulinähnlichen peptiden zur herstellung von schmerzmitteln

Info

Publication number: DE60213648T2
Application number: DE60213648T
Authority: DE
Inventors: Mireille Dardenne; Jean-Marie Pleau; Jean-Francois Bach; Nayef Saade; c/o Geminex Bared 1st floor SAFIEH-GARABEDIAN
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Saade Nayef Beirut Lb; Safieh-Garabedian Bared Beirut Lb; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2022-10-09
Also published as: JP2005515972A; IL161319A; US20050261194A1; WO2003030927A3; WO2003030927A2; US7309690B2; EP1450843A2; CA2463549A1; ATE334694T1; AU2002362710B2; FR2830451A1; JP4277684B2; FR2830451B1; ES2272811T3; IL161319A0; DE60213648D1; AU2002362710B8; CA2463549C; EP1450843B1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Peptidanaloga von Thymulin zur Herstellung von Medikamenten gegen Schmerzen.
Die meisten akuten oder chronischen Schmerzen resultieren aus einer Entzündungsreaktion. Die Behandlungen, die zur Linderung der Schmerzen empfohlen werden, bestehen oft darin, in erster Linie die Entzündungsreaktion zu reduzieren.
Es gibt zur Zeit zwei Hauptklassen von entzündungshemmenden Medikamenten:

– die nichtsteroidalen entzündungshemmenden Mittel (NSAID);
– die Corticosteroide.

Die NSAID und die Corticosteroide weisen den Nachteil auf, dass zu ihrer günstigen therapeutischen Wirkung (Verringerung der Entzündung und der Schmerzen) eine störende Nebenwirkung hinzukommt.
Tatsächlich rufen NSAID die Bildung von Geschwüren hervor, während Corticosteroide eine immunsupprimierende Wirkung haben.
Das ideale entzündungshemmende analgetische Medikament wäre also ein Medikament, das keine Nebenwirkung aufweist, weder auf die physiologischen Funktionen noch auf das Immunsystem.
Außerdem gibt es noch eine zweite Art von Schmerz, dessen Ursprung nicht die Entzündung ist. Diese neurogenen Schmerzen sind unter anderem durch ihre Resistenz gegen die traditionellen Behandlungen einschließlich Opiaten gekenn zeichnet. Verschiedene Behandlungen wurden ins Auge gefasst, wie die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln, Antiepileptika, Antidepressiva, Sympatholytika oder Kombinationen davon.
Die neurogenen Schmerzen sind jedoch sehr variabel und daher schwierig zu behandeln.
Aus diesen Betrachtungen geht hervor, dass die heute verfügbaren Medikamente zur Behandlung von Schmerzen in ihrer Anzahl begrenzt sind und sich zuweilen als unwirksam erweisen. Diese Unwirksamkeit kann auch aus einer Gewöhnung an das Produkt resultieren. Der Arzt ist dann gezwungen, sein Rezept zu modifizieren. Damit sich dies als wirkungsvoll erweist, muss er über eine andere Klasse von Medikamenten verfügen.
Dies erklärt die Wichtigkeit der Forschung auf diesem Gebiet.
Peptidanaloga von Thymulin gemäß der vorliegenden Erfindung wurden bereits in den Patenten bzw. dem ergänzenden Schutzzertifikat FR 7715963 , FR 7811870 und EP 0041019 als Medikamente für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die Stimulierung von T-Zellen und die Prävention von Transplantatsabstoßung beschrieben. Die Eigenschaften dieser Peptide bezüglich des Immunsystems haben sich als zinkabhängig erwiesen. Tatsächlich verleiht das in dem Peptid enthaltene Zink diesem eine tetraedrische Konformation, die der aktiven Form des Moleküls entspricht. In Abwesenheit von Zink besaßen die Peptidanaloga keinerlei Aktivität mehr. Außerdem hat sich in der Folge bei in-vivo-Versuchen erwiesen, dass diese Eigenschaften, die durch in-vitro-Versuche nachgewiesen wurden, keinerlei Wirkung auf das Immunsystem haben. Sie haben auch keine Nebenwirkungen hervorgerufen. Diese Peptide weisen eine perfekte Unschädlichkeit auf.
Zahlreiche Veröffentlichungen haben gezeigt, dass Thymulin je nach der injizierten Dosis eine Hyperalgesie hervorrufen oder reduzieren kann (Safieh-Garabedian et al., Neuroimmunomodulation, 6: 39-44, 1999). In niedriger Dosis (in der Größenordnung von Nanogramm pro Ratte oder 0,2 bis 20 μg/kg) induziert Thymulin Hyperalgesie, während es diese bei höheren Dosen (in der Größenordnung von Mikrogramm pro Ratte oder 50 bis 100 μg/kg) reduziert. Die Verwendung von Thymulin wäre also in Anbetracht seiner Wirkung auf das Immunsystem und dieser dosisabhängigen (oder zweiphasigen) Wirkung, die den Schmerz hervorruft oder ihn reduziert, unmöglich.
Daher haben sich die Erfinder für Peptidanaloga von Thymulin interessiert, die inaktiv gegenüber dem Immunsystem sind. Obwohl diese nicht die erhoffte Hauptwirkung aufwiesen, überprüften die Erfinder ihr Aktivitätsspektrum und stellten fest, dass sie gegen jede Erwartung nicht diese dosisabhängige ambivalente Wirkung aufweisen, dass sie ausschließlich eine schmerzstillende Aktivität haben, ohne zinkabhängig zu sein, und dass sie sich schließlich in vivo als aktiv erweisen.
Die Arbeiten der Erfinder haben sie also dazu geführt, ausgehend von diesen Peptiden, deren Unschädlichkeit außerdem bereits festgestellt wurde, eine neue Klasse von Schmerzmedikamenten zu entwickeln, die es erlauben, durch Entzündungen verursachte Schmerzen und/oder neurogene Schmerzen zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Peptidanaloga von Thymulin (PAT), die inaktiv gegenüber dem Immunsystem sind, kein Zink umfassen und eine Anti-Schmerz-Aktivität aufweisen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schmerzen.
Unter "Peptidanaloga von Thymulin, die inaktiv gegenüber dem Immunsystem sind" versteht man Peptidanaloga von Thymulin, die inaktiv gegenüber spezifischen Immunantworten der T-Lymphocyten sind. Insbesondere bilden diese Peptide zum Beispiel keine Komplexe mit Metallen wie Zink (Dardenne et al., PNAS, 79: 5370-5373, 1982).
Die Verwendung der Peptide gemäß der Erfindung hat den Vorteil, wirksam gegen den Schmerz zu sein, ohne störende Nebenwirkungen zu induzieren.
Diese Peptide sind außerdem in Dosen wirksam, die 10- bis 100mal niedriger sind wie bei den klassischen Analgetika. Bei der Ratte liegen die verwendeten Dosen zum Beispiel in der Größenordnung von 1 μg pro Ratte (oder 5 μg/kg) gegenüber 4 mg/kg bei nichtsteroidalen entzündungshemmenden Wirkstoffen und 200 mg/kg für steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe. Eine Aktivität wurde auch bei niedrigeren Dosen in der Größenordnung von 50 bis 200 ng/Ratte oder 0,25 bis 1 μg/kg festgestellt.

Insbesondere weisen die gemäß der Erfindung verwendeten Peptide die folgende Sequenz auf: X-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, wobei X für Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Glu-Ala-Lys-Ser, Gln-Ala-Lys-Ser, PyroGlu-Ala-Lys-Ser sowie jede davon abgeleitete Sequenz steht, die 1 oder 2 modifizierte Aminosäuren umfasst, wobei die möglichen Modifikationen von folgender Art sind:

PyroGlu:	D-PyroGlu, Glu, Gln
Gln:	Z-Gln, D-Gln, Pro, Cys (S-CONH₂), Met(O), Glu, Glu(γ-cyano), Glu(γCS-NH₂), D-Glu, Asn, NorVal
Ala:	D-Ala, Z-Ala, Ac-Ala
Lys:	Arg, D-Lys, N-γ-Z-Lys, Lys(N⁶-acetyl), Orn, Har, 2-Aminohexanoyl, 2,6-Diaminohexinoyl, 2,6-Diaminohexenoyl, Hep, D-Lys(N⁶-acetyl)
Ser:	Ala, (N-methyl)Ser, D-Ser, Thr
Gly:	Ala, Ser, D-Ala, D-Leu
Asn:	CyanoAla, Thio-Asn, Asp, Gln, Glu, β-Ala-NH₂, D-Asn, Asn-NH₂.

Wenn von "Analoga von Thymulin" die Rede ist, ist Thymulin, das Peptid mit der folgenden Sequenz: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn eindeutig ausgeschlossen.
Die Erfindung möchte insbesondere die Verwendung der folgenden Peptide schützen

(1) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(2) PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
(3) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln
(4) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂
(5) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn
(6) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂
(7) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn
(8) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn
(9) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp
(10) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(11) Gln-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
(12) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln
(13) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂
(14) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn
(15) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂
(16) Gln-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn
(17) Gln-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn
(18) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp
(19) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(20) Glu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
(21) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln
(22) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂
(23) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn
(24) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂
(25) Glu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn
(26) Glu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn
(27) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp
(28) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(29) Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
(30) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln
(31) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂
(32) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn
(33) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂
(34) Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn
(35) Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn
(36) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp
(37) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(38) Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
(39) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln
(40) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂
(41) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn
(42) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂
(43) Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn
(44) Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn
(45) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp.

Insbesondere möchte die Erfindung die Verwendung der folgenden Peptide schützen:

(19) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(1) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(10) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(28) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp
(37) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp.

Diese Peptide wurden in zwei Modellen für Entzündung und Hyperalgesie bei der Ratte untersucht, die entweder durch intraplantare (lokale) Injektionen oder durch intraperitoneale (systemische) Injektionen induziert wurden. Die Vorbehandlung durch diese Peptide hebt in dosisabhängiger Weise gleichzeitig die mechanische Hyperalgesie sowie die thermische Hyperalgesie auf. Außerdem reduziert die Vorbehandlung in signifikanter Weise die Überproduktion von IL-1β, IL-6, TNFα und NGF aufgrund einer intraplantaren Endotoxininjektion. Im Falle einer intraperitonealen Injektion, die einen Zustand zur Folge hat, der mit septischem Schock vergleichbar ist (Schmerz, Fieber, Schläfrigkeit und Appetitlosigkeit), verhindert die Vorbehandlung die Hyperalgesie und hält den Körper auf einer normalen Temperatur.
Schließlich haben diese Peptide analgetische Wirkungen, die denjenigen der anderen entzündungshemmenden Wirkstoffe gleich oder überlegen sind, wobei sie bei keiner der verwendeten Dosen eine merkliche Veränderung der physiologischen oder Verhaltensparameter induzieren.
Diese Peptide weisen also analgetische und/oder entzündungshemmende Eigenschaften auf.
Die analgetischen Eigenschaften dieser Peptide erstrecken sich auch auf neurogene Schmerzen (oder neuropathische Schmerzen). Mehrere Modelle wurden verwendet, um die neurogenen Schmerzen unterschiedlichen Ursprungs zu testen: zwei Tiermodelle der Mononeuropathie, ein anderes Schmerzmodell des somatischen oder viszeralen Typs. Diese Modelle erlaubten es, eine erhebliche Reduktion der mechanischen Allodynie und zuweilen auch der thermischen Allodynie festzustellen. Die neuropathischen Manifestationen erweisen sich als gehemmt, während das Verhalten, das mit dem durch die Injektion von reizenden Substanzen (Capsaicin) induzierten Schmerz verbunden ist, reduziert wird. In allen Fällen weisen diese Peptide hemmende Wirkungen auf, die genauso groß oder größer sind als diejenigen, die durch die anderen Behandlungen induziert werden, die im Fall von neurogenen Schmerzen verwendet werden.
In Anbetracht ihrer Eigenschaften ist die Verwendung dieser Peptide insbesondere zu empfehlen bei der Behandlung von Migräne, Ischias, Neuropathien und akuten oder chronischen Entzündungsschmerzen.
Für eine optimale Wirksamkeit müssen die Verabreichungsdosen zwischen 0,01 und 1 mg/kg liegen, wobei die Verabreichung über die verschiedensten Wege einschließlich parenteral, transkutan oder nasal erfolgt.
Weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung sind am besten anhand der folgenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die Figuren, die Folgendes zeigen, zu verstehen:
1 zeigt die dosisabhängige Reduktion der Hyperalgesie, die durch eine Injektion von Endotoxinen verursacht wird;
2 zeigt eine Vergleichsstudie der antihyperalgetischen Wirkungen der Peptide gemäß der Erfindung mit Steroiden, nichtsteroidalen entzündungshemmenden Mitteln und analgetischen Tripeptiden;
3 zeigt die entzündungshemmenden Wirkungen einer Vorbehandlung mit den Peptiden gemäß der Erfindung durch Reduktion der Konzentrationen von proinflammatorischen Cytokinen und von NGF;
4 zeigt die Wirkungen der Vorbehandlung auf den Schmerz (A und B) und auf das Fieber (C), die durch systemische Injektion von Endotoxinen, die einen septischen Schock simulieren, hervorgerufen wurden;
5 zeigt die Hemmung der Allodynie (anomaler Schmerz, der durch unschädliche Reize hervorgerufen wird) und der Hyperpathie (übertriebene Reaktion auf eine nozizeptive Stimulierung mäßiger Intensität) bei Ratten, die eine CCI-Mononeuropathie (durch chronisch konstriktive Läsion des Ischiasnervs) aufwiesen und mit den Peptiden gemäß der Erfindung vorbehandelt wurden;
6 zeigt die Hemmung der Allodynie und der Hyperpathie bei Ratten, die eine SNI-Mononeuropathie (spared nerve injury) aufwiesen und mit den Peptiden gemäß der Erfindung vorbehandelt wurden;
7 zeigt eine Studie der Dosierung der Peptide gemäß der Erfindung bei Ratten, die die beiden vorgenannten Typen der Mononeuropathie aufwiesen;
8 zeigt eine Studie der Dosierung der Peptide gemäß der Erfindung bei Ratten, die eine durch Injektion von Capsaicin induzierte Hyperalgesie (somatischer neurogener Schmerz) aufweisen;
9 zeigt die Dämpfung des viszeralen Schmerzes, der durch eine intraperitoneale Injektion von Capsaicin (viszeraler spasmodischer neurogener Schmerz) induziert wird, durch die Peptide gemäß der Erfindung;
10 zeigt den Vergleich von verschiedenen Wirkstoffen auf die Neuropathie; und
11 zeigt die Ergebnisse einer täglichen Behandlung mit PAT.
Beispiel 1: Analgetische und entzündungshemmende Eigenschaften der Peptide gemäß der Erfindung
1. Material und Verfahren:
Die Experimente wurde mit erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten von 200 bis 250 g durchgeführt. Die Tiere wurden unter optimalen Licht- und Temperaturbedingungen aufgezogen (Zyklus mit 12 h Licht und Dunkelheit, 22 ± 3 °C). Die Nahrung und das Wasser wurden ad libitum ausgegeben. Alle Experimente wurden im Einklang mit den ethischen Richtlinien zur Untersuchung experimenteller Schmerzen an nichtnarkotisierten Tieren (Zimmermann M., 1983, Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals, Pain, 16: 109-110) durchgeführt und wurden vom Tierschutzbund zugelassen.
Verhaltensmessungen
Während der 3 aufeinanderfolgenden Tage vor den Injektionen wurden Tests auf thermische und mechanische Schmerzen durchgeführt, um einen Referenzzustand zu erhalten.
Die Schwelle der mechanischen Nozizeption wurde durch den mechanischen Pfotendrucktest (PP) bestimmt, während die Schwelle der thermischen Nozizeption durch den Heizplattentest (HP), den Pfoteneintauchtest (PI) und den Schwanzbiegetest (TF) bestimmt wurde.
Der PP-Test wurde durchgeführt, indem man einen konstanten Druck von 0,20 g/cm² mit einem Intervall von 5 Minuten zwischen zwei aufeinanderfolgenden Druckvorgängen abwechselnd auf die hintere linke und rechte Pfote ausübte. Der Druck wird weggenommen, wenn das Tier eine typische Reaktion zeigt, die durch einen starken Beugereflex gekennzeichnet ist.
Im NP-Test werden die Tiere individuell auf eine Heizplatte (52,5 °C ± 0,3 °C) gesetzt. Die Schmerzschwelle wird gemessen anhand der Latenzzeit, die zwischen dem Moment, wenn das Tier auf die Heizplatte gesetzt wird, und dem ersten Schmerzanzeichen verstreicht, was dadurch angezeigt wird, dass das Tier sich die Pfote leckt oder springt.
Im PI-Test werden die Hinterpfoten abwechselnd in destilliertes Wasser von 48 °C getaucht, und die Latenzzeit, die bis zum ersten Anzeichen des Zurückziehens der Pfote verstreicht, wird aufgezeichnet.
Im TF-Test wird der Schwanz jedes Tiers in destilliertes Wasser von 50,5 °C eingetaucht. Die Latenzzeit, die das Tier benötigt, um den Schwanz herauszuziehen, wird aufgezeichnet. Die Ergebnisse beruhen auf 3 aufeinanderfolgenden Versuchen mit einem Intervall von 5 Minuten.
Verabreichung der Wirkstoffe
Die inflammatorische Hyperalgesie wurde ausgehend von zwei Tiermodellen festgestellt: eines für eine lokale Entzündung, das andere für eine systemische Entzündung.
Im sogenannten lokalen Modell erhielten die Ratten eine intraplantare Injektion einer Lösung (1,25 μg in 50 μl physiologischem Serum von 9‰) von Endotoxinen (Lipopolysaccharide von Salmonella typhasa, Sigma) in eine der Hinterpfoten, was gleichzeitig eine thermische und mechanische Hyperalgesie hervorruft, die auf die Pfote beschränkt ist, in welche injiziert wurde.
Im zweiten Modell erhalten die Ratten eine intraperitoneale Injektion von Endotoxinen (25 μg in 100 μl physiologischem Serum).
Danach sind verschiedene Behandlungen möglich:
Vorschrift 1(a): Verschiedene Gruppen von Ratten (n = 5 in jeder Gruppe) wurden in folgender Weise mit dem Peptidanalogon (PAT) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (synthetisiert von Quantum Biotechnologies Inc., Kanada) behandelt:

– entweder erhielten sie eine intraperitoneale Injektion (25 μg in 50 μl physiologischem Serum) dieses Peptids;
– oder sie wurden 30 Minuten vor der Injektion von Endotoxinen (ET) (1,25 μg in 50 μl physiologischem Serum in intraplantarer Injektion) mit verschiedenen Dosen dieses Peptids (1,5 und 25 μg in 50 μl Natriumchlorid) durch intraperitoneale Injektion vorbehandelt.

Vorschrift 1(b): Andere Experimente hatten zum Ziel, die Wirksamkeit der Peptidanaloga mit derjenigen von Steroiden, NSAID und Peptiden, die für ihren Antagonismus der durch IL-1β und Prostaglandine induzierten Hyperalgesie bekannt sind, zu vergleichen.
Eine Gruppe von Ratten wurde 30 Minuten vor der Injektion von PAT mit intraperitonealen Injektionen von Lys-D-Pro-Thr (10 mg/kg) in 100 μl physiologischem Serum vorbehandelt. Dieses Tripeptid ist für seinen Antagonismus der nur durch IL-1β induzierten Hyperalgesie bekannt.
In der zweiten Gruppe erhielten die Ratten 30 Minuten vor der Injektion von PAT intraperitoneale Injektionen des Tripeptids Lys-D-Pro-Val (10 mg/kg) in 100 μl Kochsalzlösung. Lys-D-Pro-Val ist ein Antagonist der durch IL-1β und PGE₂ induzierten Hyperalgesie.
Die für diese Tripeptide verwendeten Dosen sind diejenigen, die im Artikel von Safieh-Garabedian beschrieben sind (Safieh-Garabedian B., Kanaan S.A., Haddad J.J., Abou Jaoude P., Jabbur S.J., Saade N.E. 1997, Involvement of interleukin-1β, nerve growth factor and prostaglandin-E2 in endotoxin induced localized inflammatory hyperalgesia. Brit. J. Pharmacol. 121: 1619-1626).
Eine dritte und vierte Gruppe wurde mit Dexamethason und Indomethacin behandelt.
Unmittelbar vor und 3 Stunden nach der Injektion von ET wurde in einer 9‰-Lösung von Natriumchlorid gelöstes Dexamethasonphosphat in einer Konzentration von 200 μg/kg injiziert.
Indomethacin wurde hergestellt, indem man Indomethacin-Lactose in einer Puffersalzlösung (pH 7,4) löste, und unmittelbar vor sowie 3 Stunden nach der Injektion von ET in einer Konzentration von 4 mg/kg injiziert.
Alle Tests der folgenden Experimente wurden 9 Stunden nach der Injektion von ET durchgeführt. Dies fällt mit der Spitze der Hyperalgesie in diesem Modell zusammen. Die Injektionen von Kochsalzlösung (50-100 μl intraplantar) haben keine merkliche Veränderung der Schmerzschwelle gezeigt.
Vorschrift 2(a): Eine Gruppe von Ratten erhielt eine intraperitoneale Injektion von ET (50 μg), während die andere Gruppe 30 Minuten vor der Injektion von ET mit dem Peptidanalogon von Thymulin (PAT) vorbehandelt wurde (25 μg, intraperitoneale Injektion).
Dann wurden der TF- und der PP-Test 1 Stunde, 3 Stunden und 6 Stunden nach der Injektion von ET durchgeführt.
Vorschrift 2(b): Verschiedene Gruppen von Ratten (n = 5 in jeder Gruppe) wurden in folgender Weise behandelt:

– entweder erhielten sie eine intraperitoneale Injektion von 50 μg ET;
– oder sie wurden 30 Minuten vor einer Injektion von Endotoxin mit dem PAT-Peptid (25 μg, intraperitoneale Injektion) vorbehandelt.

Die rektale Temperatur wurde nach 1 Stunde, 3 Stunden und 6 Stunden gemessen.
Eine Kontrollgruppe erhielt eine intraperitoneale Injektion des PAT-Peptids (25 μg gelöst in 100 μl Kochsalzlösung).
Cytokine und Nervenwachstumsfaktor (NGF)
Diese Experimente erforderten die Entnahme von Geweben. Die Tiere werden anästhetisiert, bis sie tot sind (Natriumpenthiobarbital 50 mg/kg), und die Haut der Hinterpfoten wird entweder 1 h (für die Bestimmung des TNFα-Spiegels) oder 4 h (für die Bestimmung von IL-1β, IL-6 und NGF) nach der Injektion von Endotoxin entnommen.
Die Gewebeproben werden gewogen, dann schnell eingefroren und bei –70 °C aufbewahrt, um die Bewertung von IL-1β, TNF-α, IL-6 und NGF vorzunehmen.
In einer anderen Reihe von Experimenten werden die Gewebe so, wie es oben beschrieben ist, bei verschiedenen Gruppen von Ratten entnommen, von denen die einen 30 Minuten vor der ET-Injektion mit dem PAT vorbehandelt wurden und bei den anderen nur PAT injiziert wurde.
Die Gewebe werden in einer Phosphatpufferlösung (PBS, pH = 7,4) homogenisiert, die 0,4 M NaCl, 0,05% Tween-20^®, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,1 mM Benzethoniumchlorid, 10 mM EDTA und 20 KI/ml Aprotinin enthielt.
Anschließend wird das Gemisch 60 Minuten lang bei 4 °C mit 1200 × g zentrifugiert. Die Cytokine und der NGF, die im Überstand enthalten waren, wurden durch ELISA-Tests gemessen.
Der NGF wird mit einem immunologischen Kit (Promega) gemessen, indem man die vom Hersteller empfohlenen Anweisungen befolgt.
Die Messung der Cytokine IL-1β, TNF-α und IL-6 erfolgte gemäß den Vorschriften, die von Safieh-Garabedian beschrieben wurden (Safieh-Garabedian B., Dardenne M., Kanaan S.A., Atweh S.F., Jabbur S.J., Saade N.E. 2000. The role of cytokines and prostaglandin-E2 in thymulin induced hyperalgesia. Neuropharmacology 39: 1653-1661).
Statistische Analyse und Verarbeitung der Daten
Einen Wert für die Schmerzgrenze für die verschiedenen Nozizeptionstests wurde für jede Gruppe von Tieren definiert. Die für jeden getesteten Wirkstoff erhaltenen Daten wurden entweder mit dem Kontrollwert, der vor der Injektion festgestellt wurde, oder mit zwei Arten von Kontrollwerten verglichen: einer Reihe von Tieren, die eine ET-Injektion erhielten, und einer anderen Reihe von Tieren, die eine Injektion einer 9‰-Natriumchloridlösung erhielten.
Für die Bewertung der Konzentrationen der Cytokine und des NGF wurden die Werte, die bei Tieren, denen nur ET, nur Wirkstoff oder ET plus Wirkstoff injiziert wurde, erhalten wurden, mit den Werten verglichen, die bei Gruppen von Kontrolltieren erhalten wurden, denen eine 9‰-Natriumchloridlösung injiziert wurde.
Die Größe der Standardabweichung wurde durch ANOVA und einen anschließenden Bonferroni-Test festgestellt.
2. Ergebnisse
Wirkung des PAT-Peptids auf die durch intraplantare Injektion von ET hervorgerufene inflammatorische Hyperalgesie
Die intraplantare ET-Injektion (1,25 μg in 50 μl Kochsalzlösung) in die Hinterpfote von Ratten führte zu einer signifikanten Senkung der nozizeptiven Schwellen, die nach 9 h (Spitze der Hyperalgesie) gemäß dem PP-Test (0,87 ± 0,09 s gegenüber 2,06 ± 0,06 s für die Kontrollkochsalzlösung, P < 0,001) für die mechanische Hyperalgesie und gemäß dem PI-Test (1,25 ± 0,04 s gegenüber 1,97 ± 0,05 s für die Kontrollkochsalzlösung, P < 0,001), NP-Test (6,0 ± 0,18 gegenüber 9,24 ± 0,16 s für die Kontrollkochsalzlösung, P < 0,001) und TF-Test (2,40 ± 0,06 s gegenüber 3,19 ± 0,08 s für die Kontrollkochsalzlösung, P < 0,001) für die thermische Hyperalgesie gemessen wurden. Die Behandlung mit dem PAT-Peptid (1,5 und 25 μg) hat die durch Injektion von ET hervorgerufene Hyperalgesie in dosisabhängiger Weise reduziert (1). Mit der Dosis von 25 μg PAT betrugen die Latenzzeiten bis zur Auslösung verschiedener Reaktionen 2,05 ± 0,07 s, 1,94 ± 0,005 s, 9,12 ± 0,7 s bzw. 3,22 ± 0,09 s für den PP-, PI-, HP bzw. TF-Test (p > 0,05 für alle Werte im Vergleich mit dem Grundzustand oder mit den Werten, die mit der Salzlösung erhalten wurden). Die intraperitoneale Injektion von nur PAT (25 μg in 50 μl Kochsaltlösung) hat zu keiner signifikanten Veränderung der Latenzzeit bei den verschiedenen Schmerztests geführt.
Vergleich der Wirksamkeit des PAT-Peptids mit anderen Medikamenten und Analoga
Wenn man die Wirkung von PAT auf die durch eine intraplantare ET-Injektion (1,25 μg) hervorgerufene Hyperalgesie mit den Wirkungen vergleicht, die mit einem Steroid, einem NSAID und den Peptiden Lys-D-Pro-Val und Lys-D-Pro-Thr erhalten wurde, beweisen die erhaltenen Ergebnisse, dass PAT ein viel wirkungsvolleres Analgetikum ist als die Peptide Lys-D-Pro-Val und Lys-D-Pro-Thr (2). PAT hat ähnliche Wirkungen wie Indomethacin und Dexamethason, aber bei viel geringeren Konzentrationen (2).
Wirkung von PAT auf die Cytokine
Die Injektion von Endotoxinen in die Hinterpfote von Ratten führte zu einer signifikanten Erhöhung (P < 0,001) der Konzentrationen von vorentzündlichen Cytokinen und von NGF im Vergleich mit den Ratten, denen eine Kochsalzlösung injiziert wurde, oder mit den Pfoten derselben Ratten, die kein Produkt erhalten haben. Eine Stunde nach der ET-Injektion betrug die TNF-α-Konzentration 345,0 ± 61,0 pg/Pfote gegenüber 100,0 ± 8,00 pg/Pfote nach der Injektion von Kontrollkochsalzlösung. Drei Stunden nach der ET-Injektion betrug die IL-1β-Konzentration 2850,6 ± 255,4 pg/Pfote gegenüber 400,0 ± 45,0 pg/Pfote nach der Injektion der Kontrollkochsalzlösung, die Konzentration von IL-6 betrug 2831,0 ± 285,0 pg/Pfote gegenüber 250,0 ± 50,0 pg/Pfote für die Kontrollkochsalzlösung, und die Konzentration von NGF betrug 23,0 ± 1,73 ng/Pfote gegenüber 9,11 ± 1,6 ng/Pfote für die Kontrollkochsalzlösung.
Die vorherige Behandlung mit PAT verhinderte die Erhöhung der Konzentration von TNF-α und reduzierte signifikant die Konzentrationen von IL-1β (von 2850,6 ± 255,4 auf 1686,0 ± 266,0 pg/Pfote, P < 0,01), von IL-6 (von 2831 ± 285 auf 1158 ± 197,0 pg/Pfote, P < 0,001) und von NGF (von 23,0 ± 1,73 auf 16,73 ± 2,70 ng/Pfote, P < 0,001) (3A, B, C und D). PAT-Injektionen (25 μg) bei Kontrolltieren führten zu keiner signifikanten Veränderung der Konzentrationen von Cytokinen oder von NGF, wie 3 zeigt.
Wirkung von PAT auf die durch ET hervorgerufene systemische inflammatorische Hyperalgesie
ET-Injektionen (50 μg, i.p.) führten gemäß dem PP-Test (1,13 ± 0,06 gegenüber 2,03 ± 0,04 s für die Kontrollen, P < 0,001) und gemäß dem TF-Test (2,27 ± 0,06 gegenüber 3,08 ± 0,04 s für die Kontrollen, P < 0, 001) zu einer signifikanten Verringerung der nozizeptiven Schwellen auf eine Stunde. Die Hyperalgesie blieb nach der Injektion sechs bis neun Stunden lang erkennbar (4A und 4B). Eine vorherige Behandlung durch intraperitoneale Injektion von PAT (25 μg) dreißig Minuten vor der systemischen Verabreichung von ET beseitigte die durch ET erzeugte mechanische Hyperalgesie (4A) und thermische Hyperalgesie (4B).
Das Endotoxin ist ein bekanntes Pyrogen, und seine Injektion führte nach einer Stunde zu einer signifikanten Erhöhung der Körpertemperatur (38,43 ± 0,028 °C gegenüber 37,65 ± 0,16 °C für die Kontrollen). Die Temperatur ist anschließend sechs Stunden lang signifikant erhöht geblieben (4C). Eine vorherige Behandlung mit PAT in intraperitonealer Injektion (25 μg) verhinderte den durch ET hervorgerufenen Vorgang der Erhöhung der Körpertemperatur, und die Werte waren von denen der Kontrollen nicht signifikant verschieden (4C).
Beispiel 2: Analgetische Eigenschaften eines Peptids gemäß der Erfindung (PAT) bezüglich Schmerzen neurogenen Ursprungs
1. Material und Verfahren:
Für diese Versuche wurden erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g) verwendet. Während der Versuchsdauer wurden die Ratten Standardbedingungen ausgesetzt (4 bis 5 Individuen pro Käfig, Tag-Nacht-Zyklus von 12 Stunden, 22,2 °C), mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung. Die notwendigen chirurgischen Verfahren wurden unter tiefer Anästhesie durch Ketamin (Ketalar^®, 40-50 mg/kg, intraperitoneale Injektion) durchgeführt, der eine Voranästhesie mit Chlorpromazin (8 mg/kg, idem) und Atropin (0,05 mg/kg, idem) vorausging.
Diese Studie beruhte auf zwei experimentellen Vorschriften für die Induktion des Schmerzes neurogenen Ursprungs. Die erste Vorschrift verwendete zwei Tiermodelle der Mononeuropathie. Die zweite Vorschrift beruhte auf der Injektion von Capsaicin, eine Substanz, die bekanntermaßen spezifische Gruppen von afferenten Fasern aktiviert, die an der nozizeptiven Signalübertragung beteiligt sind.
a) Vorschrift I: Tiermodelle der Mononeuropathie
Induktion der Mononeuropathie:
Die Mononeuropathie wurde bei verschiedenen Gruppen von Ratten (n = 6 Ratten in jeder Gruppe) gemäß dem CCI-Modell (chronisch konstriktive Läsion, Bennet G.J. und Xie Y.K., 1988, A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man, Pain, 33: 87-107) oder gemäß dem SNI-Modell (spared nerve injury, Decosterd I. und Woolf C.J., 2000, Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain, Pain, 87: 149-158) hervorgerufen. Der Ischiasnerv wurde nach Durchschneiden des hinteren Teils des Schenkels und durch Einschneiden durch die Haut und Fettschicht, die die Kniekehle bedeckt, freigelegt. Für das CCI-Modell wurden vier lockere Ligaturen (Catgut Chrom 4,0) von der proximalen Seite der Trifurkation des Ischiasnervs her gesetzt. Für das SNI-Modell wurden der äußere Kniekehlen-Ischiasnerv und der innere Kniekehlen-Ischiasnerv isoliert, gerade unterbunden und durchschnitten, während der Suralnerv, der den seitlichen Aspekt der Pfote innerviert, intakt blieb.
Verhaltenstests:
Die Ratten wurden in individuelle Kompartimente eines Käfigs gebracht, dessen Boden aus einem Metallgitter bestand, das es erlaubte, den Sohlenballen und den seitlichen Aspekt der Pfote mit Filamenten zu erreichen.
Für die mechanische Allodynie wurde die Sohlenfläche der Hinterpfoten (seitliche Fläche für das SNI-Modell und mediane Sohlenfläche für das CCI-Modell) mit von-Frey-Filamenten (VFF 4,31 und 5,07, Stoelting Co., USA) berührt, was Kräften von 2,041 bzw. 11,749 g (18,5 bzw. 106,7 mN) entsprach. Die Biegekräfte dieser Filamente haben sich als ungenügend erwiesen, um bei normalen Tieren nozizeptive Rückzugsreflexe auszulösen. Die Zahl der Rückzüge der provozierten Pfote pro 10 Versuche wurde für jede Ratte bei jeder Hinterpfote vor (Grundzustand) und nach der Induktion der Mononeuropathie festgestellt. Bei normalen Ratten riefen die Filamente geringer Stärke (VFF 4,31) und großer Stärke (VFF 5,07) im Mittel 1,3 ± 0,2 bzw. 2,7 ± 0,3 Reaktionen/10 Versuche hervor.
Nach der Induktion der Neuropathie riefen die beiden Filamente mehr als 5 Reaktionen/10 Versuche hervor.
Das von Choi et al. beschriebene Verfahren (1994, Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain, Pain, 59: 369-376) wurde für die Bewertung der Allodynie in der Kälte verwendet. Es besteht darin, einige Tropfen (ungefähr 50 μl) einer Acetonlösung auf die Pfote aufzutragen und die Dauer der Rückzugsreaktion zu messen. Eine halbe Sekunde und 20 Sekunden sind willkürlich gewählte Werte für die minimale bzw. maximale Schwelle.
Die Dauer (D) des Rückzugs der Pfote (RP) als Reaktion auf einen nozizeptiven Wärmestrahl, der auf die Sohlenfläche gerichtet wurde, wurde bei der normalen Ratte festgestellt. Die Erhöhung der DRP nach der Induktion der Mononeuropathie wurde als Hinweis auf Hyperpathie angesehen. Jede Ratte wurde zwei RP-Tests pro Sitzung unterzogen, mindestens alle fünf Minuten.
Die neuropathischen Manifestationen waren sieben bis zehn Tage nach der Induktion der Neuropathie maximal. Während dieser Zeit, die dem Maximum der Neuropathie entspricht, wurden die Wirkungen der PAT-Injektionen getestet.
b) Vorschrift II: Chemische Reizung der nozizeptiven Affenenzen
Diese Vorschrift beruhte auf den festgestellten Eigenschaften von Capsaicin, das selektiv eine spezifische Gruppe von affenenten Fasern reizt (genannt "Capsaicinempfindliche primäre Afferenten" oder CSPA), die bekanntermaßen eine neurogene Entzündung hervorrufen und die nozizeptive Information weitergeben (wegen einer Übersicht siehe Szolcsanyi J., 1996, Neurogenic inflammation: revaluation of axon reflex theory, In: Geppetti P. und Holzer P. (Hrsg.), Neurogenic Inflammation, 5. 33-42. CRC Press, Boca Raton).
Unsere Gruppe hat zwei Verfahren entwickelt: intraplantare (i.pl.) und intraperitoneale (i.p.) Injektion von kleinen Mengen Capsaicin, um reversible somatische bzw. viszerale Schmerzen hervorzurufen.
Intraplantare Injektion von Capsaicin
Die Injektion von Capsaicin (10 μg in 50 μl einer 10%igen Lösung von Tween 20 in Olivenöl) rief eine Hyperalgesie hervor, deren Maximum drei bis sechs Stunden nach der Injektion stattfand und das nach 24 Stunden verschwunden war. Die mechanische Hyperalgesie wurde mit Hilfe des Pfotendrucktests (PP) bewertet, der darin bestand, einen konstanten Druck von 0,2 kg/cm auf den dorsalen Teil der Hinterpfote auszuüben. Die zwischen der Ausübung des Drucks und dem nozizeptiven Pfotenrückzugsreflex verstrichene Zeit wurde als Latenzzeit (oder Schwellenzeit) der mechanischen Nozizeption angesehen. Die thermische Hyperalgesie wurde mit Hilfe des Heizplattentests (HP) und des Pfoteneintauchtests (PI) bewertet.
Der HP- und der PI-Test wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die Heizplatte eine Temperatur von 52,5 ± 0,3 °C und der Behälter mit heißem Wasser eine Temperatur von 48 ± 0,3 °C hatte.
Der PP- und der PI-Test wurden nacheinander mit den beiden Hinterpfoten durchgeführt, wobei man ein Intervall von fünf Minuten zwischen zwei aufeinanderfolgenden Tests einhielt.
Die Ratten wurden eine Woche vor der Injektion ins Labor gebracht, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen, und die Tests wurden zwei oder drei Tage lang mit den Ratten durchgeführt, um vor jeder Behandlung den Ausgangswert für jeden Test festzustellen (ausführliche Beschreibung in Kanaan S.A. et al., 1996, Endotoxin-induced local inflammation and hyperalgesia in rats and mice: a new model for inflammatory pain, Pain, 66: 373-379).
Intraperitoneale Injektion von Capsaicin
Dieser Test bestand darin, den Ratten 20 μg Capsaicin in 100 μl einer 10%igen Lösung von Tween 20 in Olivenöl zu injizieren (i.p.) und das durch diese Injektionen hervorgerufene Verhalten zu beobachten. Eine Verhaltensskala von 4 Stufen wurde nach dem von Giesler GJ et al. beschriebenen Verfahren aufgestellt (1976, Inhibition of visceral pain by electrical stimulation of the periaqueductal gray matter, Pain 2: 43-48).
Die Stufen wurden wie folgt definiert: 0 = normales Verhalten; 1 = leichte Kontraktion der Bauchmuskeln; 2 = Kontraktion einer einzigen Seite und Verrenkung der Hüfte durch Eindrücken; 3 = starke Kontraktion der Bauchmuskeln und Strecken der beiden Hinterpfoten.
Für die Bewertung des Verhaltens der Tiere wurde jede Ratte in einen transparenten Käfig gesetzt, der sich zur optimalen Beobachtung selbst über einem um 45° geneigten Spiegel befand.
Das normale und das nozizeptive Verhalten wurden von einem Beobachter mit Hilfe eines Polygraphen aufgezeichnet, und die Zeit, die über einen Zeitraum von 30 Minuten jeder Stufe entsprach, wurde von einem anderen Beobachter an den Polygraphaufzeichnungen gezählt. Keiner der beiden Beobachter kannte die durchgeführte Injektion oder die erwarteten Wirkungen.
Injizierte Medikamente
Das verwendete PAT-Peptid ist dasselbe wie in Beispiel 1. Das PAT wurde in destilliertem Wasser gelöst und durch i.p. Injektion in einer Konzentration und gemäß einem Plan verabreicht, die je nach Art des Experiments geeignet waren.
Das Capsaicin (8-Methyl-N-vanillylnonanamid, Sigma Nr. M1022) wurde in einer 10%igen Lösung von Tween 20 in Olivenöl gelöst und in der geeigneten Konzentration i.p. oder i.pl. verabreicht.
Analyse der Daten
Im Verlauf von Experimenten an Ratten, die unter Neuropathie litten, wurden die Allodynie und die Hyperpathie in jeder Gruppe von Tieren in Bezug auf den Grundzustand bewertet, der vor der Induktion der Mononeuropathie festgestellt wurde. Zum Beispiel wurde der Mittelwert der Zahl der von jeder VFF hervorgerufenen Pfotenrückzüge für alle Ratten jeder Gruppe berechnet, und die Variation dieses Mittelwerts wurde nach Behandlung durch das PAT nach verschiedenen Zeitintervallen nach der Injektion bestimmt. Dasselbe Verfahren wurde für die Allodynie in der Kälte und die Hyperpathie in der Wärme befolgt.
Im Verlauf der Experimente, die die i.pl. Injektion von Capsaicin beinhalteten, wurde der Mittelwert der mit Hilfe jedes Schmerztests (PP, HP oder PI) durchgeführten Messungen für jede Gruppe von Ratten vor der Injektion des Capsaicins (Grundzustand) und nach verschiedenen Zeitintervallen nach der Injektion (3, 6, 9 und 24 Stunden) berechnet. Das PAT wurde (i.p.) dreißig Minuten vor dem Capsaicin injiziert, und die Latenzzeiten verschiedener Schmerztests wurden nach denselben Zeitintervallen nach der Injektion des Capsaicins gemessen.
Für die i.p. Injektion von Capsaicin wurde die Gesamtzeit, die jeder Verhaltensstufe entsprach, für die Tiere gemessen, die nur Capsaicin oder Capsaicin nach dem PAT erhalten hatten. Die Variation der neuropathischen Manifestationen oder der Schmerztests nach den Behandlungen wurden durch ANOVA und dann durch post-hoc-Tests nach Bonferroni bewertet. Die Variationen der Schmerzbewertungen mit oder ohne Behandlung wurden durch einen zweiseitigen Student-t-Test bewertet, wobei man 5% als Signifikanzgrenze annahm (P < 0,05).
2. Ergebnisse
Wirkungen der Injektion des PAT auf die neuropathischen Manifestationen
Die Injektion von PAT (5 μg in 100 μl, i.p.) in Ratten von zwei Gruppen (n = 6 Ratten pro Gruppe), die einer durch CCI oder SNI hervorgerufenen Neuropathie ausgesetzt waren, führte zu einer signifikanten Dämpfung aller neuropathischen Manifestationen (5 und 6). Diese Wirkung war bei der mechanischen Allodynie zwei Stunden nach der Injektion maximal. Sie war bei der Allodynie in der Kälte und die Hyperpathie im CCI-Modell und bei allen neuropathischen Manifestationen im SNI-Modell 75 Minuten nach der Injektion maximal. Die Allodynie in der Kälte wurde jedoch im SNI-Modell durch das PAT nur mäßig verringert. Die Reversibilität der Wirkungen des PAT wurde drei bis vier Stunden nach der Injektion beobachtet.
Die Wirkungen von PAT-Dosen von 1 und 25 μg wurden in anderen Gruppen von Ratten bewertet, wobei man die beiden Modelle befolgte. 7 zeigt, dass die Dämpfung der neuropathischen Manifestationen bei einer Dosis von 5 μg/Ratte maximal war.
Eine tägliche Behandlung mit PAT (1 μg in 100 μl) während 5 aufeinanderfolgender Tage erzeugt eine fortschreitende Verringerung der Manifestationen der Allodynie sowie eine Potenzierung der Wirkungen jeder Injektion. Der offensichtlichste Beweis dieser Potenzierung ist die verstärkte Hemmung der Allodynie in der Kälte, die durch eine einzige Injektion von PAT nur wenig verändert wurde (vgl. 11).
Die Wirkungen der Behandlung mit PAT auf die Manifestationen der Neuropathie wurden mit denjenigen verglichen, die bei Injektionen entweder von Meloxican (5 mg/kg i.p.) oder von Morphin (4 mg/kg i.p.) in zwei anderen Gruppen von Ratten (n = 6) beobachtet wurden. Die Behandlung mit PAT induziert eine stärkere Reduktion der taktilen Allodynie und der thermischen Hyperalgesie, als bei den anderen beiden Wirkstoffen beobachtet wurde, und zwar bei einer viel geringeren Dosis. 10 zeigt diesen Vergleich. Jeder Wirkstoff wurde einer anderen Gruppe (n = 6) von Ratten injiziert, die einer durch SNI hervorgerufenen Neuropathie ausgesetzt waren. Alle Messungen erfolgten am Aktivitätsmaximum jedes Wirkstoffs (45-60 min nach der Injektion). Die Kontrollen entsprechen den Messungen, die an Ratten vorgenommen wurden, die vor jeder Behandlung einer Neuropathie ausgesetzt waren.
Wirkungen der Behandlung mit PAT auf die durch i.pl. Injektion von Capsaicin hervorgerufene Hyperalgesie
Die intraplantare Injektion von Capsaicin (10 μg in 50 μl) führte zu einer signifikanten Verringerung der Latenzzeiten (Hyperalgesie), die bei verschiedenen Schmerztests beobachtet wurden. Diese Verringerung war nach drei bis sechs Stunden maximal und war 24 Stunden nach der Injektion verschwunden (Saade N.E., Massaad C.A., Ochoa-Chaar C.I., Atweh S.F., Safieh-Garabedian B., Jabbur S.J. 2000. Possible contribution of neuropeptides and histamine to the hyperalgesia induced by intraplantar injection of capsaicin. Eur. J. Neurosci. Abst. (suppl 11, Vol. 12: 123). Verschiedenen Gruppen von Ratten (n = 5 Ratten in jeder Gruppe) wurden entweder Capsaicin oder PAT (i.p.) und dann Capsaicin nach dreißig Minuten in Dosen von 1,5 oder 25 μg/Ratte injiziert. Die vorherige Behandlung mit PAT führte zu einer dosisabhängigen Dämpfung der durch das Capsaicin hervorgerufenen Hyperalgesie (8). Bei der höchsten Dosis führte die Injektion von PAT zu einer vollständigen Verhinderung der durch das Capsaicin hervorgerufenen Hyperalgesie. Die Injektion einer Dosis von 25 μg PAT führte nicht zu einer signifikanten Veränderung der Latenzzeiten, die bei den verschiedenen Schmerztests beobachtet wurden (8, Kontrollen).
Wirkungen der Injektion von PAT auf den von Capsaicin hervorgerufenen viszeralen Schmerz
Ratten (n = 6), die eine i.p. Injektion von Capsaicin (20 μg in 100 μl) erhalten hatten, zeigten eine Reaktion entsprechend Stufe 0 während 0,2 ± 0,3 Minuten, Stufe 1 während 2,51 ± 0,45 Minuten, Stufe 2 während 21,5 ± 0,8 Minuten und Stufe 3 während 11,84 ± 0,43 Minuten während einer Gesamtbeobachtungszeit von 36 Minuten (9).
In einer anderen Gruppe von Ratten (n = 6) führte die Injektion von PAT (50 μg in 200 μl/Ratte) vor der Injektion von Capsaicin (20 μg i.p.) zu den folgenden Schmerzbewertungen: 0,82 ± 0,18 Minuten entsprechend Stufe 0, 12,89 ± 2,5 Minuten entsprechend Stufe 1, 15,62 ± 0,9 Minuten entsprechend Stufe 2 und 6,67 ± 0,09 Minuten entsprechend Stufe 3. So führte die vorherige Behandlung mit PAT zu einer signifikanten Verschiebung der Bewertungen der durch Capsaicin hervorgerufenen Nozizeption zur linken Seite (9).
Beispiel 3: Verwendung von PAT zur Herstellung einer injizierbaren Lösung

– PAT: 0,05 mg
– pyrogenfreies steriles destilliertes Wasser: 1,0 ml.

Sterilfiltration, Verpackung in Ampullen, Fläschchen oder Fläschchen mit mehreren Dosen.
Mögliche Verabreichungswege sind intraperitoneale, subkutane, intrazerebrale, intramuskuläre und intradermale Injektionen.

Claims

Verwendung von Peptiden, die analog zu Thymulin sind, außer Thymulin, und die inaktiv gegenüber dem Immunsystem sind, kein Zink umfassen und eine Anti-Schmerz-Aktivität aufweisen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schmerzen.
Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide die folgende Sequenz aufweisen: X-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, wobei X für Ser, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser, Glu-Ala-Lys-Ser, Gln-Ala-Lys-Ser, PyroGlu-Ala-Lys-Ser sowie jede davon abgeleitete Sequenz steht, die 1 oder 2 modifizierte Aminosäuren umfasst, wobei die möglichen Modifikationen von folgender Art sind: PyroGlu: D-PyroGlu, Glu, Gln Gln: Z-Gln, D-Gln, Pro, Cys (S-CONH₂), Met(O), Glu, Glu(γ-cyano), Glu(γCS-NH₂), D-Glu, Asn, NorVal Ala: D-Ala, Z-Ala, Ac-Ala Lys: Arg, D-Lys, N-γ-Z-Lys, Lys(N⁶-acetyl), Orn, Har, 2-Aminohexanoyl, 2,6-Diaminohexinoyl, 2,6-Diaminohexenoyl, Hep, D-Lys(N⁶-acetyl) Ser: Ala, (N-methyl)Ser, D-Ser, Thr Gly: Ala, Ser, D-Ala, D-Leu

Asn: CyanoAla, Thio-Asn, Asp, Gln, Glu, β-Ala-NH₂, D-Asn, Asn-NH₂

mit Ausnahme der Sequenz PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.
Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide die folgenden sind: (1) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (2) PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (3) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (4) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂ (5) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (6) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂ (7) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (8) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (9) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp (10) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (11) Gln-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (12) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (13) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂ (14) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (15) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂ (16) Gln-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (17) Gln-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (18) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp (19) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (20) Glu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (21) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (22) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂ (23) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (24) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂ (25) Glu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (26) Glu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (27) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp (28) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (29) Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (30) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (31) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂ (32) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (33) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂ (34) Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (35) Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (36) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp (37) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (38) Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (39) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (40) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-β-Ala-NH₂ (41) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (42) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH₂ (43) Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (44) Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (45) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asp.
Verwendung der Peptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide die folgenden sind: (19) Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (1) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (10) Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (28) Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (37) Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp.
Verwendung der Peptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament analgetische und/oder entzündungshemmende Eigenschaften hat.
Verwendung der Peptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 zur Behandlung von Schmerzen, die durch Migräne, Ischias, Neuropathie und/oder akute oder chronische Entzündungsschmerzen hervorgerufen werden.
Verwendung der Peptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verabreichten Dosen 1 μg bis 10 mg/kg betragen.
Verwendung der Peptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die parenterale oder nasale Verabreichung zubereitet wird.