-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher
Betäubung
und Schmerzfreiheit in einem Bereich des Nervengewebes eines Säugetiers
durch topische Verabreichung von Natriumkanalblockierverbindungen,
welche Tetrodotoxin und Saxitoxin umfassen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Schmerz
wird mit einer tatsächlichen
oder potenziellen Verletzung oder Gewebebeschädigung infolge einer Entzündung, Blutleere
und mechanischen oder anderen Irritation verbunden. Örtliche
Betäubungsmittel werden
verwendet, um Schmerz durch Blockieren der Neurotransmission zu
behandeln, und wirken sich sowohl auf die Sinnesempfindung als auch
den Schmerz aus. Schmerzstillende Mittel werden verwendet, um Schmerz
zu lindern, und können
außerdem
die Aktivität
von chemischen Übertragungssubstanzen,
welche Entzündung
verursachen, beeinflussen.
-
Die
Schädigung
oder Reizung eines Bereichs der Sinnesnerven, wie beispielsweise
des Zahnmarks, ist für
gewöhnlich
mit starkem Schmerz verbunden und kann von einer chemischen oder
physikalischen Ursache, zum Beispiel einem kariösen Zahn oder einer Zahnwurzelhautentzündung, und
zahnärztlichen
Eingriffen an einem Zahn herrühren.
-
Schmerz,
der durch Zahnmarkreizung ausgelöst
wird, ist zu stark, als dass die Patienten ihn ertragen könnten. Heutzutage
werden zwar örtliche
Betäubungsmittel
verwendet, um Schmerz zu lindern, aber infolge ihrer begrenzten
Wirksamkeit und kurzen Wirkungsdauer können sie bei den Patienten
keine zufrieden stellende Wirkung erzeugen. Zum Beispiel werden
Procain und Tetracain allgemein als topische Betäubungsmittel zur Zahnschmerzbehandlung
verschrieben. Diese topischen Betäubungsmittel stellen lediglich
eine teilweise Schmerzlinderung für kurze Zeiträume, z.B.
etwa 1 Stunde, bereit.
-
Auf
dem Fachgebiet besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Bewirkung
einer andauernden, wirksamen Betäubung
und Schmerzstillung ohne bedeutende Nebenwirkungen.
-
Tetrodotoxin
kann als ein örtliches
Betäubungsmittel
verwendet werden und ist zehntausend mal stärker als allgemein verwendete, örtliche,
nicht-narkotische Mittel, wie durch C.Y. Kao und F.A. Fulman, J.
Pharmacol., 140, S. 31–40
(1965) erörtert
wird. Tetrodotoxinpräparate
in Verbindung mit anderen gemeinhin verwendeten Betäubungsmitteln
wurden im US-Patent Nr. 4,022,899 und US-Patent Nr. 4,029,793 erwähnt. Gemäß US-Patent
Nr. 6,030,974 bezieht sich "Tetrodotoxin" oder "TTX" auf die Aminoperhydrochinazolinverbindungen
mit der Molekularformel C11H17N3O8 und Derivate
davon, welche Anhydrotetrodotoxin, Tetrodaminotoxin, Methoxytetrodotoxin,
Ethoxytetrodotoxin, Deoxytetrodotoxin und Tetrodonsäure (Kao)
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein. Beispiele für
TTX-Analogstoffe umfassen neuartige TTX-Analogstoffe, welche von verschiedenen
Organismen isoliert werden, sowie jene, welche teilweise oder zur
Gänze chemisch
synthetisiert werden, siehe z.B. Yotsu et al., Agric. Biol. Chem.,
53 (3): S. 893–895
(1989). Diese Analogstoffe binden sich an dieselbe Seite auf der
Alpha-Untereinheit von Natriumkanälen, wie das TTX.
-
Adams
et al., US-Patent Nr. 9,022,899 und 4,029,793 betrifft eine örtliche
Betäubungsmittelzusammensetzung,
welche eine Mischung eines bestimmten Toxins, nämlich Tetrodotoxin oder Desoxytetrodotoxin, mit
einer anderen Verbindung, im Allgemeinen eine herkömmliche, örtliche
Betäubungsmittelverbindung
oder ähnliche
Verbindung mit Nervenblockierungseigenschaften, in einer pharmazeutisch annehmbaren
Trägersubstanz
umfasst. Das herkömmliche, örtliche
Betäubungsmittel
kann ein Aminoacylanilid, wie beispielsweise Lidocain; ein Aminoalkylbenzoat,
wie beispielsweise Procain oder Cocain; ein Aminocarbamat, wie beispielsweise
Diperodon; ein N-Phenylamidin, wie beispielsweise Phenacin; ein
N-Aminoalkylamid, wie beispielsweise Dibucain; ein Aminoketon, wie
beispielsweise Falicain, oder ein Aminoether, wie beispielsweise
Pramoxin, sein.
-
US-Patent
Nr. 6,030,974 beschreibt ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher
Betäubung
bei einem Säugetier,
welches in einem Bereich des Epithelgewebes Schmerz empfindet. Das
Verfahren umfasst die topische Verabreichung einer effektiven Dosis
einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung in einem geeigneten,
pharmazeutischen Vehikel in dem Bereich. Die Natriumkanalblockierverbindung
von US-Patent Nr. 6,030,974 kann eine Tetrodotoxin- oder Saxitoxinformulierung
bei einer Konzentration von zwischen 0,001 und 10 mM sein.
-
Zapata
et al., Pain, 72: S. 41–49
(1997), erörtert
die Verwendung von Tetrodotoxin zur Hemmung der neuropathischen,
ektopischen Aktivität
bei Nervenfasergeschwülsten,
Hinterwurzelganglien und Hinterhornnervenzellen. Die neuronale Aktivität ist auf
ein Nervenfasergeschwulst zurückzuführen, welches
durch mechanische, chemische oder ischämische Verletzung verursacht
wird. Es wurde die Wirkung von intravenös verabreichtem TTX bei der
neuronalen Induktion durch Hüftnerven
bei männlichen
Ratten erforscht. Die Dosierungen und Wirkungen, welche von Zapata
et al. untersucht wurden, wurden jedoch bei Tieren unter Narkose und
bei künstlicher
Beatmung angewendet, weshalb diese Dosen über der höchsten, verträglichen
Dosis liegen und die Verabreichung unter Bedingungen erfolgte, welche
auf die zurzeit beabsichtigte, klinische Verwendung von Tetrodotoxin
nicht anwendbar sind.
-
Die
topische Verabreichung irgendeiner Natriumkanalblockierverbindung
in der Umgebung der Zähne wird
in keinem der zuvor erwähnten
Fälle beschrieben.
-
KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lösen den
auf dem Fachgebiet seit langem erkannten Bedarf an Verfahren zur
Bewirkung einer wirksamen, örtlichen
Betäubung
und Schmerzstillung von langer Dauer. In der konkreten Ausführungsform
zur Bewirkung einer lang dauernden wirksamen, örtlichen Betäubung und
Schmerzstillung am Zahn befassten sich die Erfinder mit einem Problem von
großer,
klinischer Bedeutung, wobei sie zum ersten Mal zeigten, dass Natriumkanalblockierverbindungen, wie
beispielsweise Tetrodotoxin und Saxitoxin, bei Schmerz, der durch
Zahnmarkreizung verursacht wird, wirksame, betäubende und schmerzstillende
Wirkungen von langer Dauer und ohne offensichtliche Nebenwirkungen
erzeugen können.
Außerdem
zeigten die Erfinder, dass die effektiven Dosen dieser Natriumkanalblockierverbindungen
eine große
Sicherheitstoleranz aufweisen.
-
Die
Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können für jede Bedingung, welche Zahnschmerz
mit sich bringt, einschließlich örtlicher
Betäubung
nach einem zahnärztlichen
Eingriff oder nach einer Verletzung des Zahns, verwendet werden.
Die Verfahren sorgen für
bedeutende Vorteile, welche die Bereitstellung örtlicher Betäubung und
Schmerzstillung von wenigstens 1 Stunde, vorzugsweise 2 Stunden
und insbesondere 6 Stunden ohne offensichtliche Nebenwirkungen umfassen.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Bewirkung einer wirksamen
lang dauernden, örtlichen
Betäubung
und Schmerzstillung, welche die Verabreichung einer pharmazeutisch
annehmbaren Zusammensetzung einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung
umfassen, wobei sich die Verbindung an die extrazelluläre Mündung des
Natriumkanals bindet. Auf diese Weise wird die Natriumkanalaktivität durch einen
Mechanismus gehemmt, welcher sich von dem örtlicher Betäubungsmittel,
wie beispielsweise Procain, Lidocain und Tetracain, unterscheidet.
Vorzugsweise erreichen diese Verfahren eine wirksame, örtliche Schmerzstillung
und Betäubung
von einer langen Dauer von bis zu 6 Stunden. Bevorzugte Verbindungen
umfassen Toxine oder Analogstoffe davon, welche sich speziell an
eine Stelle binden, die zum Teil durch einen extrazellulären Bereich
der Alpha-Untereinheit eines Natriumkanals gebildet wird. Die am
meisten bevorzugten Verbindungen umfassen die Klasse von Toxinen
und Analogstoffen, die sich speziell an eine Seite binden, welche
durch die extrazellulären
SSl und SS2-Bereiche der Alpha-Untereinheit eines Natriumkanals
gebildet werden, wobei diese Verbindungen Tetrodotoxin, Saxitoxin
und Analogstoffe davon umfassen. Überraschenderweise stellen
diese lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindungen, welche allgemein
bekannte, wirksame Neurotoxine sind, eine wirksame, lang dauernde, örtliche
Schmerzstillung und Betäubung
ohne offensichtliche Nebenwirkungen bereit.
-
Demgemäß ist es
eine Aufgabe der Erfindung, die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Bewirkung einer wirksamen, örtlichen
Schmerzstillung und Betäubung
bei Patienten, welche Schmerz empfinden, wie beispielsweise jenen,
der mit der Schädigung
des Zahnmarks verbunden ist, wie beispielsweise ein kariöser Zahn,
eine Zahnwurzelhautentzündung
und zahnärztliche
Eingriffe an einem Zahn.
-
In
einem Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bewirkung einer
wirksamen, örtlichen Schmerzstillung
und Betäubung
bei einem Versuchstier, das im Zahnmark Schmerz empfindet.
-
Das
Verfahren umfasst die topische Verabreichung einer effektiven Dosis
von Tetrodotoxin oder Saxitoxin oder Analogstoffen davon in einem
geeigneten, pharmazeutischen Vehikel in die Zahnmarkhöhle.
-
In
einer Ausführungsform
wird die wirksame Dosis von Tetrodotoxin oder Saxitoxin von einer
Formulierung verabreicht, welche Tetrodotoxin oder Saxitoxin bei
einer Konzentration von zwischen 1 mM bis 20 mM enthält, die
eine schmerzlindernde Wirkung für
bis zu 6 Stunden bewirkt.
-
Bei
dieser Anwendung wird das Tetrodotoxin normalerweise in einem Vehikel
mit einem pH-Wert von zwischen 3,5 bis 6,8 formuliert.
-
Bei
dieser Anwendung erzeugt die pharmazeutische Zusammensetzung keine
toxischen Wirkungen oder irgendwelche ersichtlichen, schädlichen
Nebenwirkungen.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch eine Zusammensetzung, die eine
herkömmliche, örtliche
Betäubungsmittelverbindung,
welche eine Natriumkanalblockierverbindung ist, und eine Verbindung,
welche sich an die SS1- und SS2-Untereinheit eines Natriumkanals
bindet, umfasst. Die Zusammensetzung der Erfindung sorgt für eine synergistische
Wirkung ihrer Teilverbindungen, um entweder einen wirksameren oder
längeren Betäubungseffekt
oder beides bereitzustellen.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 stellt
eine Zeit-Wirkung-Beziehung von TTX nach der Verabreichung in die
Zahnmarkhöhle
dar.
-
2 stellt
die synergistische Wirkung von TTX, wenn mit Tetracain verabreicht,
dar.
-
AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Wie
bereits erwähnt,
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bewirkung von örtlicher Schmerzstillung
und Betäubung
bei einem Versuchstier bereit, welches Schmerz in einer Bereich
der Sinnesnerven, normalerweise im Zahnmark, empfindet, welcher
durch eine chemische oder physikalische Ursache verletzt oder gereizt
wird, indem eine therapeutisch effektive Dosis einer Natriumkanalblockierverbindung,
normalerweise Tetrodotoxin, verabreicht wird.
-
Tetrodotoxin
ist ein Nicht-Protein-Nervengift, das in vielen verschiedenen Tierarten,
einschließlich
Kugelfisch, Meeresgrundel, Wassermolch, Frösche und der Blauringkrake,
vorkommt.
-
Saxitoxin
ist eine Verbindung, welche einen Tetrahydropurinanteil, bestehend
aus zwei Guanidineinheiten, die zu einer stabilen Azaketalbindung
vereinigt sind, umfasst und die Molekularformel C10H17N7O4 aufweist.
-
In
den hierin beschriebenen Beispielen wurde Tetrodotoxin topisch in
die Zahnmarkhöhle
verabreicht, wobei sich herausstellte, dass es eine wirksame, lang
wirkende Schmerzlinderung ohne Anzeichen systemischer oder örtlicher
Toxizität
bereitstellte. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur
Verwendung bei der Bereitstellung von örtlicher Schmerzstillung und
Betäubung
für Schmerzen
bestimmt, welche mit der Zahnmarkreizung, die aus verschiedenen
Zahnerkrankungen und zahnärztlichen
Eingriffen resultiert, verbunden sind.
-
Tetrodotoxin,
welches für
das Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich ist, kann aus Kugelfischorganen
gewonnen werden. Eine ausführliche
Beschreibung der Herstellung von Tetrodotoxin und Derivaten davon
wird in der am 18. September 2000 eingereichten, chinesischen Patentanmeldung
Nr. 00124516.3 bereitgestellt.
-
Formulierung und Dosierungen
von Tetrodotoxin und Saxitoxin
-
Zur
Verwendung im Zahnbereich werden Tetrodotoxin und/oder Saxitoxin
normalerweise in einer wässrigen
Lösung
verabreicht. Normalerweise wird der aktive Bestandteil Tetrodotoxin
oder Saxitoxin in geläutertes
Wasser oder eine physiologische Salzlösung als Hauptvehikel formuliert.
Es ist jedoch zu erkennen, dass die Dentalformulierung andere Komponenten
enthalten kann, welche Puffermittel zur Aufrechterhaltung oder Einstellung
des pH-Wertes, wie beispielsweise Acetatpuffer, Citratpuffer, Phosphatpuffer
und Boratpuffer, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein; die Verabreichung
von Tetrodotoxin wurde bei etlichen Tierarten gründlich untersucht, und die
tödliche,
orale Dosis beim Menschen wurde auf etwa 10 bis 18 μg/kg geschätzt. Für eine 70
kg schwere Person wäre
die tödliche
Dosis daher 0,7 bis 1,26 mg.
-
Bei
den Versuchen, die zur Unterstützung
der zuvor beschriebenen, vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden,
wurde eine 20-μL-Teilmenge
von 1 mM, 1,25 mM, 2,5 mM, 5 mM oder 10mM Tetrodotoxin topisch in
die Zahnmarkhöhle
von Kaninchen verabreicht. Dies entspricht einer Dosis von zwischen
6,4 und 64 μg
Tetrodotoxin. Wenn das Tetrodotoxin in 10 μL verabreicht wird, liegt die
Tetrodotoxindosis im Bereich von 3,2 bis 32 μg. Diese Dosen sind beträchtlich
unter der tödlichen,
oralen Dosis für
den Menschen und ergeben eine ausreichende Sicherheitstoleranz,
um jegliche Unterschiede bei der systemischen Aufnahme zwischen
topischer und oraler Verabreichung zu berücksichtigen.
-
Es
ist zu erkennen, dass die Dosierung und Konzentration des Tetrodotoxins
oder Saxitoxins, das verabreicht wird, auf individueller Basis bestimmt
wird, wobei solche Faktoren, wie das Alter und Körpergewicht des Patienten,
sowie der Applikationsweg und die klinischen Erfordernisse hinsichtlich
der Schmerzstillung und Betäubung,
berücksichtigt
werden.
-
Der
Natriumkanalblocker, vorzugsweise Tetrodotoxin oder Saxitoxin, wird
im schmerzenden Zahnbereich durch Anwenden einer Formulierung mit
einer Tetrodotoxin- oder Saxitoxinkonzentration von zwischen etwa
1 und 10 mM normalerweise topisch verabreicht. Die tatsächliche
Tetrodotoxin- oder Saxitoxindosis, die verabreicht wird, hängt natürlich von
der Formulierung, die angewendet wird, und der Oberfläche, auf
die sie angewendet wird, ab.
-
Aus
den vorstehenden Ausführungen
ist zu erkennen, wie verschiedene Merkmale und Ziele der Erfindung
erreicht werden können.
Das Verfahren der Erfindung stellt eine effektive, lang dauernde, örtliche Schmerzstillung
und Betäubung
durch topische Verabreichung einer lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindung
in einem schmerzenden Zahnbereich bereit. Die folgenden Beispiele
veranschaulichen unter Verwendung eines Versuchs mit Kaninchen,
dass eine einzige Dosis Tetrodotoxin bei einer Konzentration zwischen
1 mM und 10 mM eine wirksame, örtliche
Schmerzstillung und Betäubung
erreicht. Der Grad und die Dauer der Wirkungen hängen von der Tetrodotoxinkonzentration
ab.
-
Für den Fachmann
ist zu erkennen, dass jede der lang wirkenden Natriumkanalblockierverbindungen gemäß den Verfahren
und Prozeduren, die hierin beschrieben werden, verwendet werden
können,
um pharmazeutisch oder dental effektive Dosen und andere Aspekte
der Erfindung zu bestimmen.
-
Synergistische
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen wenigstens eine Verbindung,
die sich speziell an die SS1- oder die SS2-Untereinheit eines Natriumkanals
bindet, zusammen mit wenigstens einem herkömmlichen, örtlichen Betäubungsmittel.
In solchen synergistischen Verbindungen ist die Verbindung, welche
sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet,
vorzugsweise Saxitoxin oder Tetrodotoxin und insbesondere Tetrodotoxin.
-
Das
herkömmliche, örtliche
Betäubungsmittel
ist eine Natriumkanalblockierverbindung, vorzugsweise Tetracain.
In den Zusammensetzungen der Erfindung ist die Verbindung, welche
sich an die SS1- oder SS2-Untereinheit eines Natriumkanals bindet,
normalerweise in einer Menge von 1 bis 10 mM und vorzugsweise in
einer Menge von 1 bis 3 mM gegenwärtig. Das herkömmliche
Betäubungsmittel
ist normalerweise in einer Menge gegenwärtig, welche ein halbes bis
zwei Mal ihre effektive Konzentration darstellt, für gewöhnlich eine
Menge von 0,2 bis 5 Gewichtsprozent der Zusammensetzung. In Abhängigkeit
von den Komponenten, welche als die SS1- oder SS2-Bindungsbestandteile
und als das örtliche
Betäubungsmittel
gewählt
werden, kann die Zusammensetzung durch Mischen der Bestandteile
unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt werden, oder sie kann
gemischt und dann für
eine spätere
Verabreichung aufbewahrt werden. Diese Wahl hängt zum Teil davon ab, welcher
pH-Wert jedem Bestandteil eine gute Stabilität verleiht. Bestandteile, welche sehr
unterschiedliche pH-Werte für
eine langfristige Stabilität
benötigen,
sollten unmittelbar vor der Verabreichung gemischt werden.
-
BEISPIELE
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen zwar die Verfahren und Zusammensetzungen
der Erfindung, ohne aber die Erfindung auf irgendeine Weise beschränken zu
wollen.
-
Tiere
-
Weiße Neuseeland-Kaninchen,
die vom Tierzentrum der Universität Peking, Peking, VR China,
gekauft wurden.
-
Materialien
-
Tetrodotoxin,
Reinstoff, Lösemittel;
Acetatpuffer, bereitgestellt durch Nanning Maple Pharmaceutical Co.,
Ltd. (Nanning, Guangxi, VR China).
-
Vorrichtung
-
CSI60-Hochgeschwindigkeitszahnbohrer,
Shanghai Dental Appliance Factory (Shanghai, VR China); SEN-7103-Elektrostimulator,
Nihon Kohden, Japan.
-
Die
Textrodotoxinlösung
wurde in einem Acetatpuffer (pH 4,0) aufgelöst und vor jedem Versuch hergestellt.
-
Verfahren
-
Die
Versuche wurden gemäß dem Verfahren
durchgeführt,
das durch Voges et al. entwickelt wurde. Die Spannung, die das Kaninchen
veranlasste, das erste Mal zu lecken, wurde als die schmerzauslösende Schwellenspannung
definiert. Die Elektrostimulationsspannung wurde bei 0 V gestartet
und stufenweise um jeweils 0,25 Volt erhöht, bis die schmerzauslösende Schwellenspannung
festgestellt wurde. Die schmerzstillenden und narkotisierenden Wirkungen
wurden durch die prozentuale Änderung
der Schwellenspannung vor und nach der Verabreichung der Medikamente
ausgewertet:
-
Versuchsbeispiel 1 – Wirkung
der topischen Verabreichung von Tetrodotoxin bei Schmerz, der durch
Zahnmarkreizung ausgelöst
wird
-
60
weiße
Neuseeland-Kaninchen wurden willkürlich in sechs Gruppen aufgeteilt,
die mit Acetatpuffer (als Lösemittelkontrolle)
oder TTX bei 1 mM, 1,25 m, 2,5 m, 5 mM beziehungsweise 10 mM zu
behandeln waren. Die Versuchsmedikamente wurden durch eine Injektion
von 20 μL
in die Zahnmarkhöhle
gespritzt. Die Zahnmarkhöhle
wurde durch Durchbohren des Zahns erreicht. Die schmerzauslösende Schwellenspannung wurde
vor der Verabreichung von Medikamenten und dann 10 Minuten, 30 Minuten,
1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 8 Stunden nach der
Verabreichung wieder gemessen. Die Ergebnisse wurden als mittlere,
prozentuale Änderung
der schmerzauslösenden
Schwellenspannung ± Standardabweichung
dargestellt und in Tabelle 1 tabellarisch zusammengestellt.
-
Die
Ergebnisse zeigten an, dass sich die Schwellenspannungen bei den
Kaninchen, welchen die Acetatpufferlösung verabreicht worden war,
nicht merklich änderten.
TTX bei allen fünf
Konzentrationen erhöhte die
Schmerzschwellenspannung erheblich, was deutlich eine konzentrationsabhängige Beziehung
zeigt. TTX bei 1 mM erzeugte eine verhältnismäßig schwache Wirkung (p < 0,001, F = 32,55),
während
TTX bei 10 mM die stärkste
Wirkung erzeugte (p < 0,0001,
F = 91,51) . Bei den drei anderen Gruppen erhöhten sich die Schwellenspannungen
jeweils bedeutend (p < 0,0001,
F-Werte waren 107,13, 75,31 beziehungsweise 102,44). Die Wirkung
von TTX, welche die Schwellenspannung erhöhte, setzte 5 Minuten nach
Verabreichen der Dosis ein, und eine Spitze wurde 1 Stunde nach
Verabreichen der Dosis erreicht.
-
Unter
der Annahme, dass eine 50%-ige oder stärkere Zunahme der Schwellenspannung
wirksam ist, zeigten die Ergebnisse, dass die schmerzstillende Wirkung
von TTX bei 10 mM über
6 Stunden; TTX bei 5 mM 4 Stunden; TTX bei 2,5 mM 2 Stunden und
TTX bei 1,25 mM nur 1 Stunde andauerte.
-
Die
Leistungsfähigkeit
von TTX nahm bei zunehmender Konzentration von TTX bei 30, 60, 90
und 120 Minuten nach Verabreichen der Dosis merklich zu, und TTX
bei 10 mM erzeugte die stärkste
Wirkung (p < 0,0001).
TTX bei 1 mM zeigte eine beträchtliche
Wirkung zu drei Zeitpunkten mit Ausnahme von 120 Minuten nach Verabreichen
der Dosis (p < 0,001,
0,01 beziehungsweise 0,05). Die Ergebnisse in Tabelle 1 und 1 legten
auch nahe, dass die Dauer der Wirksamkeit von TTX ebenfalls konzentrationsabhängig war.
-
Versuchsbeispiel 2 – Bestimmung
der mittleren, effektiven Konzentration (EC50)
von TTX
-
Eine
50%-ige Zunahme der Schwellenspannung wurde als ein Kriterium für eine effektive, örtliche Schmerzstillung
angesehen. Es wurde ein vereinfachtes Probiteinheitsverfahren zur
Untersuchung und Bestimmung der EC50 von
TTX für
die örtliche
Zahnschmerzstillung verwendet.
-
Dreißig Kaninchen
wurden in drei Gruppen, bestehend aus jeweils 10 Kaninchen, aufgeteilt
und erhielten TTX bei 1 mM, 1,125 mM beziehungsweise 1,25 mM durch
eine Injektion von 20 μL
in die Zahnmarkhöhle verabreicht.
Die Schmerzschwellenspannungen bei den Kaninchen wurden vor Verabreichen
der Dosis und zu Zeitpunkten von bis zu 2 Stunden nach Verabreichen
der Dosis gemessen, und es wurden die prozentualen Änderungen
berechnet. Effektive Schmerzmittel sollten als erreicht gelten,
wenn das TTX die Schwellenspannung zu jedem Zeitpunkt um 50% oder
mehr erhöhte.
Die positiven Ansprechraten, die berechnet wurden, betrugen 30%
für TTX
bei 1 mM, 80% für
TTX bei 1,125 mM und 100% für
TTX bei 1,25 mM. Der EC50-Wert von TTX und
95% Konfidenzintervall, basierend auf dem vereinfachten Probiteinheitsverfahren,
betrug 1,04 ± 0,03 mM.
-
Versuchsbeispiel 3 – Vergleich
der örtlichen,
schmerzstillenden Wirkung von TTX und drei herkömmlichen, klinischen Betäubungsmitteln
-
Drei
herkömmliche,
klinische Betäubungsmittel,
nämlich
Lidocain, Procain und Tetracain, wurden zum Vergleich mit TTX ausgewählt. Es
wurden dieselben Tierversuche in diesem Experiment verwendet. Die
Kaninchen wurden in sechs Gruppen zu je 10 aufgeteilt und erhielten
Acetatpuffer (Lösemittelkontrolle),
TTX bei 1 mM, TTX bei 1,25 mM, 2% Lidocainchlorid (entspricht 74
mM) beziehungsweise 1% Tetracain (entspricht 33 mM) durch eine Injektion
von 20 μL
in die Zahnmarkhöhle
verabreicht. Die Schwellenspannung wurde vor Verabreichen der Dosis
und an sechs Zeitpunkten innerhalb 1 Stunde nach Verabreichen der
Dosis gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 2 zeigten an, dass 2% Procain, das ähnlich wirkte,
wie die Lösemittelkontrolle,
keine klare Wirkung auf die Schwellenspannung bei den Kaninchen
hatte (p > 0,05, F
= 0,15). 2% Lidocain und 1% Tetracain wirkten ähnlich, indem sie die Schwellenspannung
im Vergleich zur Lösemittelkontrolle merklich
erhöhten,
p > 0,01, F = 10,09
beziehungsweise p < 0,001,
F = 23,43. Die Wirkungen von Lidocain und Tetracain näherten sich
jenen von TTX bei 1 mM (p > 0,05,
F = 0,0007 beziehungsweise 0,077) an, waren aber schwächer als
jene von TTX bei 1,25 mM (p < 0,01,
F = 13,6 beziehungsweise p < 0,001,
F = 18,5). TABELLE
2 – Vergleich
der Wirkungen von TTX und drei örtlichen
Betäubungsmitteln
-
Der
Vergleich zwischen den Differenzgruppen basierte auf der Varianzanalyse
für mehrere
Messungen.
-
Versuchsbeispiel 4 – Toxizität von TTX
durch topische Verabreichung
-
Klinische Anzeichen von
TTX-Toxizität
durch topische Verabreichung
-
Es
wurden keine Todesfälle
oder negativen, klinischen Anzeichen bei den Kaninchen, welche bei
allen Versuchen TTX in Konzentrationen im Bereich von 1 mM bis 20
mM verabreicht erhielten, festgestellt. Nur 4 von 10 Kaninchen,
die TTX bei 10 mM erhielten, zeigten eine verstärke Exkretion im Atmungstrakt.
-
Wirkung von TTX durch
topische Verabreichung auf die Herzfrequenz, die Atemfrequenz und
das EKG der Kaninchen
-
Fünf Kaninchen
wurden mit 3% Natriumpentobarbital (30 mg/kg, iv) betäubt, dann
bewegungsunfähig gemacht
und an einen Elektrokardiographen angeschlossen. Die Herzfrequenz,
die Atemfrequenz und das EKG wurden aufgezeichnet. Dann wurden den
Kaninchen 20 μL
TTX bei 20 mM in einer Injektion in das Mark eines Zahns gespritzt.
Dieselben Parameter wurden bei 15, 30, 60, 120, 240 und 360 Minuten
nach Verabreichen der Dosis gemessen. Die Ergebnisse, die in Tabelle
3 dargestellt sind, zeigten an, dass eine Injektion von 20 μL TTX bei
20 mM die Herzfrequenz oder die Atemfrequenz der Kaninchen innerhalb
von 6 Stunden nicht wesentlich änderten
(p > 0,05). Das EKG
legte auch keine bedeutende Wirkung von TTX nahe (p > 0,05).
-
Blutbiochemische
Wirkungen von Tetrodotoxin durch topische Verabreichung
-
Acht
Kaninchen wurden in zwei Gruppen unterteilt; eine Gruppe mit akuter
Dosierung und eine Gruppe mit chronischer Dosierung. Jedes Kaninchen
in der Gruppe mit akuter Dosierung wurde mit 3% Natriumpentobarbital
(30 mg/kg, iv) betäubt
und auf einem Operationstisch bewegungsunfähig gemacht. Eine 3-mL-Blutprobe
wurde dem Herz entnommen, wobei 1 mL zur Analyse des Blutzelleninhalts
und 2 mL zur Messung von blutbiochemischen Parametern verwendet
wurden. Anschließend
wurden 20 μL
von TTX bei 20 mM durch eine Injektion in die Zahnmarkhöhle gespritzt,
und 1 Stunde nach Verabreichen der Dosis wurde dem Herz erneut eine
Blutprobe (3 mL) entnommen. Für
die Gruppe mit chronischer Dosierung wurde den Kaninchen 4 Tage lang
TTX bei 20 mM durch eine Injektion von 20 μL pro Tag in die Zahnmarkhöhle eingespritzt.
Nach der letzten Verabreichung wurden die Kaninchen wieder betäubt, um
dem Herz Blutproben zu entnehmen. Alle Blutproben wurden unter Verwendung
von klinischen Standard-Blutanalyseverfahren am selben Tag untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabellen 4, 5 und 6 dargestellt.
-
Die
Ergebnisse zeigten an, dass TTX bei 20 mM, das einmal oder über 4 aufeinander
folgende Tage verabreicht wurde, keine bedeutende Wirkung auf die
blutzellulären
und -biochemischen Parameter der Kaninchen hatten.
-
Versuchsbeispiel 5 – Synergistische
Aktivität
von TTX und einem anderen, örtlichen
Betäubungsmittel
-
Die
Kaninchen wurden in 7 Gruppen aufgeteilt und erhielten TTX bei 1
mM, 2% Lidocain, 1% Tetracain, TTX + Lidocain (zuerst wurde TTX
bei 1 mM verabreicht und 10 Minuten später Lidocain), Lidocain + TTX
(zuerst wurden 2% Lidocain verabreicht und 10 Minuten später TTX
bei 1 mM), TTX + Tetracain (zuerst wurde TTX bei 1 mM verabreicht
und 10 Minuten später
1% Tetracain) und Tetracain + TTX (zuerst wurde 1% Tetracain verabreicht
und 10 Minuten später
TTX) durch eine Injektion von 20 μL
in die Zahnmarkhöhle
eingespritzt. Die Schwellenspannung wurde vor Verabreichen der Dosis
und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verabreichen der Dosis gemessen.
Die prozentuale Änderung
der Schwellenspannung wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle
7 und 2 dargestellt.
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 7 zeigten, dass Tetracain + TTX eine wesentlich
stärkere
Wirkung als TTX bei 1 mM allein (p < 0,001, F = 23,85) oder 1% Tetracain
allein (p < 0,001,
F = 23,5) erzeugten. Das Ergebnis war sogar stärker als die Summe der beiden
Letzteren. Lidocain zeigte keine ähnliche, synergistische Aktivität mit TTX.
Die Wirkung von Tetracain + TTX währte 90 Minuten, die längste Dauer
aller Gruppen.
-
Um
festzustellen, ob die positive, synergistische Wirkung von TTX und
Tetracain, wenn zusammen verabreicht, zu beobachten ist, wird der
folgende Versuch durchgeführt:
-
Das
Versuchsmaterial und die Tierversuche sind dieselben wie zuvor.
-
Feststellen
der Schwellenspannungen von Tetracain bei Konzentrationen von 1%,
0,1% und 0,01% durch Reizung des Zahnmarks der Versuchskaninchen:
Die Wirkung von Tetracain gilt als positiv, wenn sich die Schwellenspannung
um 30% erhöht.
Die Mindestkonzentration von Tetracain, welche eine derartige Erhöhung der
Schwellenspannung bewirkt, wird als die effektive Konzentration
Ce definiert. Getrenntes Feststellen der Wirkung des Verabreichens
von 10 μL
TTX bei 1 mM auf die Schwellenspannung und der Dauer der Wirkung.
-
Mischen
von 10 μL
TTX bei 1 mM mit 10 μL
Tetracain bei einer Konzentration von 2 × Ce und Verabreichen der Mischung
in einer Injektion in das Zahnmark der Kaninchen und Beobachten
der Wirkung der Formulierung auf die Schwellenspannung und die Dauer
der Zunahme der Schwellenspannung: Die Beobachtung einer Zunahme
der Schwellenspannung oder der Dauer der Betäubung oder von beidem gegenüber den
Additionseffekten von Tetracain bei Ce und TTX bei 10 mM allein
weist auf eine synergistische Wirkung hin.
-
Alle
Veröffentlichungen
und Patentanmeldungen, welche in dieser Beschreibung erwähnt wurden, werden
hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und durch Erwähnung hierin
für alle
Zwecke aufgenommen.
-
Obwohl
die Erfindung in Bezug auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben wurde,
ist für
den Fachmann zu erkennen, dass viele Änderungen und Modifikationen
daran vorgenommen werden können, ohne
sich vom Geist und Rahmen der Erfindung zu entfernen.
-
Bezugsquellen
-
- 1. Du, P. und Yan, Y.J., Effect and Pharmacological
Action of Tetrodoxin on Sodium Channel, China Marine Drugs, 1–2: S. 49–50 (1988).
- 2. Schwartz, D.M. et al., Tetrodoxin: Anesthetic Activity in
the De-epithelialized Cornea, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol.,
236(10): S. 790–4
(1998).
- 3. Schwartz, D.M. et al., Experimental Use of Tetrodotoxin for
Corneal Pain After Excimer Laser Keratectomy, Cornea 17(2): S. 196–199 (1998).
- 4. Vogel, H.G. und Vogel, W.H., Drug discovery and evaluation-pharmacological
Essays, Springer, Berlin, S. 374–75 (1997).
- 5. Xu, J.G., Molecular Biology of Foreign Medical Science, 26:
S. 1655 (1987).
- 6. Liu, Z.C. und Yu, S.Y (Editors-in-Chief), Nutrition and Food
Hygiene, 2nd Edition, People's Hygiene Publishing
Services, Beijing (1984).
- 7. Chen, Y.C. und Yuan, S.L., Research and Utilization of Toxins,
Compilation of Theses of China Biochemistry Society Seminars, Vol.4,
Sciences Publishing Services, Beijing (1988).
-
Zusammenfassung
-
Diese
hier aufgeführte
Erfindung bezieht sich auf einen neuen Prozess zur Extraktion von
Tetrodotoxin aus dem Gewebe eines Organismus. Die Erfindung bietet
einen erhöhten
Ertrag an Tetrodotoxin aus tierischem Gewebe.