DE602005002654T2

DE602005002654T2 - Prozess zur Herstellung von Nano- und Mikrokapseln aus Spinnenseidenprotein

Info

Publication number: DE602005002654T2
Application number: DE602005002654T
Authority: DE
Inventors: Thomas Scheibel; Andreas Bausch; Daniel Huemmerich; Kevin Cincinnati Hermanson
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen
Priority date: 2005-08-01
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-08-02
Also published as: JP2009502492A; EP1757276B1; CN101309676A; PL1757276T3; ES2294606T3; US20100056438A1; WO2007014755A1; EP1757276A1; CA2617530A1; US8729238B2; CA2617530C; DK1757276T3; ATE374018T1; US8372436B2; CN101309676B; DE602005002654D1; JP5129746B2; US20130136779A1; PT1757276E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nano- und Mikrokapseln aus Spinnenseidenproteinen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nano- oder Mikrokapseln, die durch dieses Verfahren gewinnbar sind, ebenso wie pharmazeutische, kosmetische und Nahrungsmittelzusammensetzungen, die dieselben enthalten.
Strukturen im kleinen Maßstab sind von großem Interesse als Transportvesikel und als potentielle Bausteine für Vorrichtungen der Zukunft. Eine Aufgabe besteht darin, Reaktanten oder Teilchen in kleinem Maßstab zu verkapseln oder die ausgelöste Freisetzung des eingekapselten Materials zu ermöglichen, nachdem dieses an einem speziellen Ort angeordnet wurde. Eine Lösung für ein derartiges Problem ist die Verwendung chemischer Vesikeln, sog. Nanokapseln. Die Nanokapseln werden so entwickelt, dass die Reaktanten nach Einwirkung eines externen Auslösers oder Stimulus bzw. Reizes freigesetzt werden. Es ergeben sich mehrere Probleme aus einem derartigen Bestreben: das Bedeutendste besteht darin, wie solche Nanokapseln auf definiertem Wege um beispielsweise chemisch oder biologisch aktive Reaktanten herum aufgebaut werden sollen.
Kürzlich wurden „Hybrid" Stimuli-Responsive Nanokapseln entwickelt, um diesem Bedarf entgegen zukommen. Die Strukturen (Vesikeln, jedoch auch Mizellen) werden aus der Selbst-Assemblierung beispielsweise amphiphiler Polybutadien (PB)-b-Poly(Glutaminsäure) (PGA) Diblock-Copolymere gewonnen, die eine pH-empfindliche Konformation aufweisen. Die pH-Empfindlichkeit kann dazu verwendet werden, die Vesikeln zu entladen. Diese PB-b-PGA-Copolymere, die einen vernetzbaren hydrophoben Block und einen hydrophilen peptidischen Block tragen, wurden durch Kombinieren einer anionischen und einer Ringöffnungspolymerisation synthetisiert (Chécot et al., 2002). Die Polydispersität der Copolymere ist klein genug, um wohl definierte selbst-assemblierte Aggregate zu gewinnen. Beispielsweise formt ein PB40-b-PGA100 Copolymer, wenn es sich in Wasser befindet, geschlossene Bilayer-Vesikeln, die als Polymersome bezeichnet werden. (Won et al., 1999). Eine Eigenschaft der Vesikeln besteht darin, dass sie auf eine äußere pH-Verschiebung durch Veränderung ihrer Größe reagieren (1). Dieser Übergang nach pH-Veränderung ist reversibel und nur mode rat gegenüber der Salinität empfindlich, weil er nicht auf einem einfachen Polyelektrolyt-Quelleffekt beruht, sondern auf der peptidischen Natur des PGA-Blocks (1). Diese Vesikeln sind nicht nur dazu in der Lage, Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht einzukapseln (wie Lösungsmittelmoleküle, wie beispielsweise Fluorophore (Chécot et al., 2003)), sondern können auch größere Nanopartikel stabilisieren. Der Nachteil derartiger Systeme besteht in der teilweisen Inkompatibilität mit biologischen Systemen, die üblicherweise gegenüber dramatischen pH-Veränderungen hoch empfindlich sind, weil pH-Veränderungen einen Verlust der biologischen Aktivität der verkapselten Probe zur Folge haben können.
1 zeigt zur Veranschaulichung (a) eine Dynamische Lichtstreuung (= Dynamic Light Scattering) des hydrodynamischen Peptosom-Radius R_H als eine Funktion der NaCl-Konzentration und des pH. (b) Schematische Darstellung des Peptosoms und seiner Größenveränderung als Funktion des pHs aufgrund eines Knäuel-zu-α-Helixsekundärstrukturübergangs im Peptidanteil.
Ein weiteres etabliertes Verkapselungsverfahren ist die Selbst-Assemblierung kolloidaler Teilchen an der Öl/Wasser-Grenzfläche. Die Antriebskraft für den Selbst-Assemblierungsprozess ist die Minimierung der Gesamtoberflächenenergie – somit kann eine breite Vielzahl von Teilchen und Lösungsmitteln verwendet werden. Derart stabilisierte Emulsionen sind als Pickering-Emulsionen wohl bekannt. Die Stabilisierung einer Vernetzung der Teilchen führt zu mechanisch stabilen Käfigen, die dann in die kontinuierliche Phase übertragen werden können. Die Vorteile der sog. Kolloidosomen sind die Kontrolle des zu verkapselnden Stoffes und die Erleichterung der Abstimmung der mechanischen und chemischen Stabilität der Außenhülle. Die Selbst-Assemblierung der Teilchen hat eine beinahe kristalline Struktur zur Folge und somit treten Löcher zwischen den Teilchen auf. Diese Löcher sind ein größenselektiver Filter, der die Kontrolle der Diffusion über die Membrane hinweg ermöglicht (Dinsmore et al., 2000). Der gesamte Prozess kann auf eine biokompatible Weise durchgeführt werden. Jedoch sind die kolloidalen Teilchen selbst nicht notwendigerweise biokompatibel.
US 6 303 150 beschreibt Nanokapseln mit vernetzten Protein-basierten Wänden. Das Protein muss Film-bildende Effekte aufweisen und kann aus einer Gruppe von Pflanzen- oder Tierproteinen wie beispielsweise Seide ausgewählt sein. Ein Vernetzungsmittel ist erforderlich.
WO 02/47665 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung selbst-assemblierter, selektiv permeabler elastischer mikroskopischer Strukturen, die als Kolloidosome bezeichnet werden, die eine kontrollierte Porengröße, Porosität und vorteilhafte mechanische Eigenschaften aufweisen. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen von Partikeln, die aus einem biokompatiblen Material gebildet sind, in einem ersten Lösungsmittel; (b) Ausbilden einer Emulsion durch Zusetzen einer ersten Flüssigkeit zu dem ersten Lösungsmittel, wobei die Emulsion durch Tröpfchen der ersten Flüssigkeit definiert ist, umgeben vom ersten Lösungsmittel; (c) Beschichten der Oberfläche der Tröpfchen mit den Teilchen; und (d) Stabilisieren der Teilchen auf der Oberfläche des Tröpfchens zur Bildung von Kolloidosomen mit einer Endfestigkeit von zumindest ungefähr 20 Pascal. WO 02/47665 verwendet biokompatible synthetische Polymere zur Erzeugung dieser Kolloidosome. Beispiele sind Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polyalkylene, Siliziumdioxid und Kombinationen hiervon. Die Teilchen, aus denen die Kolloidosome gewonnen werden, werden beispielsweise durch Sintern, chemisches Vernetzen und dergleichen stabilisiert. Jedoch ist das Verfahren zur Herstellung dieser Kolloidosome vergleichsweise schwierig und die kolloidalen Partikel, die verwendet werden, können schädliche Eigenschaften für in vivo-Anwendungen aufgrund ihrer künstlichen und nicht natürlichen Natur aufweisen. Die Verwendung kolloidaler Teilchen begrenzt ebenfalls den Größenbereich der Hüllen, weil die Verwendung von Kolloiden die minimale Taschengröße mit definierten Löchern begrenzt.
Es ist deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nano- und Mikrokapseln bereitzustellen, die in hohem Maße biokompatibel und somit für in vivo-Anwendungen geeignet sind. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Nano- und Mikrokapseln zu gewinnen, die dazu in der Lage sind, unterschiedliche Typen und variierende Mengen wirksamer Mittel oder Nährstoffe etc. aufzunehmen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nano- und Mikrokapseln bereitzustellen, die biologisch abbaubar sind, d. h., die zu einer kontrollierten Freisetzung der wirksamen Stoffe etc. in vivo in der Lage sind, beispielsweise bei topischen oder systemischen Verabreichungen.
Diese Aufgaben werden durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Es hat sich in der vorliegenden Erfindung erstaunlicher Weise herausgestellt, dass Spinnenseidenproteine als Basis zur Ausbildung von Mikro- und Nanokapseln dienen können, die für verschiedene in vivo-Anwendungen verwendet werden. Es hat sich insbesondere herausgestellt, dass dies durch ein verbessertes Verfahren zur Herstellung dieser Kapseln getan werden kann, das den Bedarf nach der Verwendung von Schritten zur Bindung oder Stabilisierung der Teilchen, aus denen die Kapseln gebildet werden, durch Zusatz von Chemikalien wie Vernetzern umgeht oder dass das Sintern oder dergleichen erfordert, was nachteilige Effekte auf die in die Mikro- und Nanokapseln zu verpackenden Mittel aufweisen könnte.
Weil die meisten gegenwärtig verwendeten Verkapselungstechniken (siehe beispielsweise WO 02/47665 ) auf nicht-biologischen Teilchen oder Makromolekülen beruhen, haben die Erfinder ein neues stabiles Verkapselungsverfahren auf Grundlage selbst-assemblierender Spinnenseidenproteine entwickelt. Anders als andere Verkapselungstechnologien wird im vorliegenden Verfahren die hydrophobe/hydrophile Natur der Emulsionsoberfläche nicht nur zum Assemblieren kolloidaler Teilchen verwendet, sondern wird auch als Antriebskraft für die Kolloid-Immobilisation durch Koaleszenz und Polymernetzwerkbildung (Stabilisierung) verwendet. Dieses Verfahren repräsentiert nicht nur ein Verfahren zur Herstellung polymerer Nano- und Mikrokapseln, die aus einer neuen Klasse biokompatibler Kolloide gebildet werden, es repräsentiert ebenfalls einen neuen Ansatz zur Bildung eines Polymernetzwerks unter Verwendung von Proteinen. Der große Vorteil von Nano- und Mikrokapseln, die aus diesem Verfahren gebildet werden, ist die Biokompatibilität und die Funktionalität, die den Mikrokapseln durch die Proteine verliehen werden. Dies ermöglicht die Kontrolle der Freisetzungsmechanismen durch mehrere Mittel: pH-Veränderungen, Temperaturveränderungen oder die Aktivität von Proteasen.
Beispielsweise könnten Nano- oder Mikrokapseln zerstört werden und ihre Inhalts-stoffe könnten in vivo chemisch, physikalisch (beispielsweise durch Scherkräfte) oder biologisch (durch proteolytischen Verdau) freigesetzt werden.
Die Selbst-Assemblierung der Spinnenseidenproteine an der Grenzfläche wurde durch Einbringen des Proteins in die Wasserphase einer Wasser/Öl-Emulsion (siehe 2) erreicht. Die Minimierung der Oberflächenenergie trieb die Proteine zur Grenzfläche und induzierte eine Aggregation der Monomere zu einem dichten Polymernetzwerk (3).
Die Spinnentaschen/Ballons, die aus diesem Verfahren gebildet werden, werden beispielsweise mit dem Inhalt der Wasserphase gefüllt und können in organischen Lösungsmitteln, Alko holen ebenso wie in Wasser existieren (3). Deswegen zeigen sie eine unerwartete Stabilität in stark unterschiedlichen Umgebungen. Prinzipiell ist die Selbst-Assemblierung von Proteinen an einer inversen Emulsionsoberfläche ebenfalls möglich – somit wird der Inhalt der Ölphase (siehe ebenfalls unten) eingekapselt.
Auffälligerweise können die Taschen/Ballons mit Proteinen, chemischen Reaktanten, Nano- und Mikrometer großen Teilchen etc. befüllt werden, was beispielhaft durch Befüllung der Teilchen mit Fluoreszenz- (FITC) markierten Dextranteilchen (4) dargestellt ist.
Die Impermeabilität der Membrane und die mechanische Stabilität der Beutel bzw. der Taschen gegen osmotische Belastungen sind unter Berücksichtigung der Dicke der Membran beide relativ groß. Elektronenmikroskopie-Bilder zeigen, dass die Dicke zwischen 10 und 70 nm liegt (5).
Der gegenwärtige Ansatz wurde durch Verwendung synthetischer Spinnenseidenproteine demonstriert, insbesondere durch Verwendung der synthetischen Sequenz C₁₆ (Huemmerich et al., 2004) zur Erzeugung einer biologischen Verkapselung aktiver Mittel.
Spinnenseiden sind allgemein Proteinpolymere, die außerordentliche physikalische Eigenschaften zeigen, es existieren jedoch nur begrenzte Informationen bezüglich der Zusammensetzung der verschiedenen Seiden, die durch unterschiedliche Spinnen produziert wurden (siehe Scheibel, 2004). Unter den verschiedenen Typen von Spinnenseiden wurden die Abseilfäden bzw. Draglines der golden Seidenspinne Nephila Clavipes und der Gartenkreuzspinne Araneus Diadematus am intensivsten untersucht. Abseilfaden-Seiden sind im Allgemeinen aus zwei Hauptproteinen zusammengesetzt und es bleibt unklar, ob zusätzliche Proteine eine signifikante Rolle in der Assemblierung der Seide und der endgültigen Seiden-Struktur spielen. Die beiden Hauptproteinkomponenten von Abseilfäden von Araneus Diadematus sind ADF-3 und ADF-4 (Araneus Diadematus Fibroin).
Gene, die für spinnenseidenartige Proteine kodieren wurden unter Verwendung einer Klonierungsstrategie erzeugt, die auf einer Kombination synthetischer DNA-Modul und PCR-amplifizierter authentischer Gen-Sequenzen basierte (Huemmerich et al., 2004). Die Abseilfaden-Spinnenproteine ADF-3 und ADF-4 von der Gartenspinne Araneus Diadematus wurden als Matrizen für die synthetischen Konstrukte gewählt. Eine nahtlose Klonierungsstrategie ermöglichte die kontrollierte Kombination unterschiedlicher synthetischer DNA-Modul ebenso wie authentischer Genfragmente. Ein Klonierungsvektor wurde entwickelt, der eine Klonierungskassette mit einem Spacer umfasste, der als Platzhalter für synthetische Gene diente (Huemmerich et al., 2004).
Um die repetitive Sequenz von ADF-4 nachzuahmen, wurde eine einzige konservierte Repeat- bzw. Wiederholungseinheit entwickelt, um ein Konsensus-Modul mit der Bezeichnung C zu gewinnen, das multimerisiert wurde, um das repetitive Protein C₁₆ zu gewinnen, das im gegebenen Ansatz als Beispiel verwendet wurde.
Es existieren viele mögliche Anwendungen für die präsentierten Spinnenseidentaschen/Ballons, die sich von Functional Food bis pharmazeutische oder kosmetische Anwendungen bewegen. Beispielsweise könnte die Verkapselung in der Nahrungsmitteltechnologie bestimmte Inhaltsstoffe wie beispielsweise Vitamine vor einer oxidierenden Umgebung schützen. In anderen Nahrungsmitteltechnologieanwendungen könnten Inhaltsstoffe wie beispielsweise Fischöl in ihrem Geschmack kaschiert werden. In pharmazeutischen Anwendungen ermöglicht die Diffusionsbarriere der Proteinhülle langsame (kontrollierte) Freisetzungsprozesse für das eingekapselte Material. Das weitere Design der Proteinhüllen könnte einen definierten Freisetzungs-Behälter zur Folge haben, der den Inhalt nur nach Aktivierung unter Verwendung bestimmter Proteasen oder anderer Auslöser bzw. Trigger freisetzt. In der Kosmetik könnte der Transport wasseraktiver Inhaltsstoffe in die Haut durch die präsentierten Beutel/Ballons erleichtert werden, nach langsamem Abbau der Proteinhülle, beispielsweise durch Proteasen der Haut. Weiterhin könnte eine mechanische Scherung dazu verwendet werden, den Inhalt nach Exposition gegenüber der Haut freizusetzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die folgenden Aspekte und Ausführungsformen:
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Nano- und Mikrokapseln, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung von Spinnenseidenproteinen;
b) Ausbilden einer Lösung oder Suspension dieser Proteine in einem geeigneten Lösungsmittel;
c) Erzeugen einer Emulsion mit zumindest zwei Phasen, wobei die Emulsion die Lösung oder Suspension, gebildet in b) als erste Phase und zumindest eine weitere Phase enthält, die im Wesentlichen mit der ersten Phase nicht mischbar ist;
d) Ausbilden eines Polymernetzwerks der Spinnenseidenproteine einer Grenzfläche der zumindest zwei Phasen;
e) Abtrennen des Proteinpolymernetzwerks, erzeugt in (d) aus der Emulsion.

Wie oben erklärt, hat es sich unerwarteter Weise herausgestellt, dass die Bildung des Polymernetzwerks in Schritt d) nicht den Zusatz irgendwelcher weiterer Inhalts-stoffe (beispielsweise Vernetzer) erfordert und kein Bedarf nach zusätzlichen Schritten wie Sintern, Vernetzen etc. besteht.
Es sei erwähnt, dass der Begriff „Spinnenseidenprotein" wie hierin verwendet, nicht nur alle natürlichen Sequenzen, sondern auch alle künstlichen oder synthetischen Sequenzen umfasst, die hieraus abgeleitet sind.
Demgemäß können die Spinnenseidensequenzen aus Sequenzen gewonnen werden, die hierin als „authentisch" bezeichnet werden. Dieser Begriff bedeutet, dass die zugrunde liegenden Nukleinsäuresequenzen aus ihrer natürlichen Umgebung ohne Durchführung substantieller Änderungen in der Sequenz selbst isoliert werden. Die einzige Modifikation, die eintreten darf besteht darin, wenn die authentische Nukleinsäuresequenz modifiziert wird, um die Sequenz an die Expressionen einem Wirt ohne Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz anzupassen. Bevorzugte Sequenzen sind NR3 (SEQ ID No. 10, gewonnen aus ADF-3) und NR4 (SEQ ID No. 11, gewonnen aus ADF-4). In beiden Sequenzen wurde zur effizienteren Translation das Codon AGA (Arg), das selten in E. coli translatiert wird, zu CGT (Arg) unter Verwendung von PCR-Mutagene mutiert.
Die authentischen nicht-repetitiven Sequenzen sind bevorzugt aus den aminoterminalen nicht-repetitiven Regionen (flagelliforme Proteine) abgeleitet und/oder der carboxyterminalen nicht-repetitiven Region (Flagelliform- und Dragline-Proteine) von natürlich vorkommenden Spinnenseidenproteinen. Bevorzugte Beispiele dieser Proteine sind unten angegeben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die authentischen nicht-repetitiven Sequenzen von der aminoterminalen nicht-repetitiven Region (flagelliforme Proteine) und/oder der carboxyterminalen nicht-repetitiven Region (flagelliforme und Dragline-Proteine) eines natürlich vorkommenden Spinnenseidenproteins abgeleitet.
Bevorzugte authentische Sequenzen flagelliformer Proteine sind die Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz von FlagN-NR (SEQ ID No. 31 und 32) und FlagC-NR (SEQ ID No. 33 und 34).
Die rekombinanten Spinnenseidenproteine der Erfindung können im Allgemeinen von Spinnen-Dragline-Proteinen aus der großen Ampullen drüse bzw. „major ampullate"-Drüse und/oder von Proteinen, abgeleitet aus der Flagelliform-Drüse abgeleitet sein.
Gemäß einer Ausführungsform sind die rekombinanten (synthetischen/künstlichen) Spinnenseidenproteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, im Allgemeinen von Spinnenseiden Dragline-Proteinen aus der „major ampullate"-Drüse der Spinne und/oder aus Proteinen, die aus der Flagelliform-Drüse gewonnen werden, abgeleitet.
Es wird im Allgemeinen bevorzugt, die Dragline- und/oder Flagelliform-Sequenzen aus Dragline- und Flagelliform-Proteinen von Radnetzspinnen (Araneidae und Araneoiden) auszuwählen.
Besonders bevorzugt werden die Dragline-Proteine und/oder Flagelliform-Proteine aus einer oder mehreren der nachfolgenden Spinnen ausgewählt: Arachnura Higginsi, Araneus Circulissparsus, Araneus Diadematus, Argiope Picta, Wespenspinne (Argiope Trifasciata), Nephila Antipodiana, Cyrtophora Beccarii, Celaenia Excavata, Gasteracantha Kuhlii, Argiope Aurantia, Ordgarius Furcatus, Ordgarius Magnificus, Neoscona Nautica, Neoscona Rufofemorata, Zygiella Calyptra, Parawixia Dehaani, Neoscona Oxancensis, Gasteracantha Cancriformis (elipsoides), Gasteracantha Arcuata, Cyrtophora Moluccensis, Cyrtophora Parnasia, Dolophones Conifera, Dolophones Turrigera, Gasteracantha Doriae, Gasteracantha Mammosa, Cyrtophora Exanthematica, Aculeperia Ceropegia, Eriophora Pustulosa, Anespsion Depressi um, Gasteracantha Quadrispinosa, Eriophora Transmarina, Araneus Bicentenarius, Nephila Maculata, Gasteracantha Hasseltii, Tegenaria Atrica, Heurodes Turrita, Cyclosa Insulana, Astracantha Minax, Araneus Mitificus, Eriovixia Laglaisei, Cyclosa Bifida, Nephilengys Malabarensis, Argiope Versicolor, Herennia Ornatissima, Argiope Aemula, Cyrtophora Unicolor, Cyrtophora Hirta, Argiope Keyserlingi, Acusilas coccineus, Argiope Argentata, Gasteracantha Cancriformis, Neoscona Domiciliorum, Argiope Aetheria, Argiope Keyserlingi, Polytys Illepidus, Arkys Clavatus, Arkys Lancearius, Poecilopachys Australasia, Nephila Species, z. B. Nephila Clavipes, Nephila Senegalensis, Nephila Madagascariensis und viele mehr (bezüglich weiterer Spinnenspezies, siehe ebenfalls unten). Am meisten bevorzugt sind die Dragline-Proteine von Araneus Diadematus abgeleitet und die Flagelliform- Proteine sind von Nephila Clavipes abgeleitet.
Im Kontext dieser Erfindung sollte klar sein, dass ein rekombinantes Spinnenseidenprotein nicht nur Proteinsequenzen aus einer Spezies umfassen kann, sondern auch Sequenzen enthalten kann, die aus unterschiedlichen Spinnenspezies abgeleitet sind. Als Beispiel könnte die ein oder mehrere synthetische repetitiven Spinnenseidenproteinsequenzen aus einer Spezies abgeleitet sein, die ein oder mehreren authentischen nicht-repetitiven Spinnenseidenproteinsequenzen von einer anderen. Als weiteres Beispiel ist es ebenfalls möglich, ein rekombinantes Spinnenseidenprotein zu entwickeln, das mehr als eine Art einer repetitiven Sequenz enthält, wobei die unterschiedlichen Typen aus unterschiedlichen Spezies abgeleitet sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Dragline-Protein Wildtyp ADF-3, ADF-4, MaSp I, MaSp II und ist das flagelliforme Protein FLAG. Der Begriff ADF-3/-4 wird im Kontext von MaSp-Proteinen verwendet, die durch Araneus Diadematus erzeugt werden. (Araneus Diadematus Fibroin 3/4). Beide Proteine, ADF-3 und -4 gehören zur Klasse von MaSp II-Proteinen (Major Ampullate Spidroin II).
In einer weiteren Ausführungsform ist die bereitgestellte Nukleinsäuresequenz ADF-3 (SEQ ID No. 1) und/oder ADF-4 (SEQ ID No. 2) oder eine Variante hiervon.
Es wird angemerkt, dass zwei unterschiedliche Arten von ADF-3 und ADF-4 codierenden Sequenzen und Proteinen in dieser Erfindung betrachtet werden: zunächst die bereits veröffentlichte Sequenz von ADF-3 und ADF-4 (hierin „Wildtyp"-Sequenz) und zweitens, eine Variante hiervon, codiert von SEQ ID No. 1 (ADF-3) und 2 (ADF-4). Die Wildtyp- Sequenzen wurden bereits veröffentlicht und sind unter den Zugangsnummern U47855 und U47856 (SEQ ID No. 8 und 9) verfügbar.
Weitere Spinnenseidenproteine, die in dieser Erfindung verwendet werden können (d. h. alleine oder in Kombination mit weiteren Proteinen) und ihre Datenbankzugangsnummern sind:
Spidroin 2 [Araneus Bicentenarius]gi|27228957
Major Ampullate Gland Dragline Silk Protein-1 [Araneus Ventricosus]gi|27228959
Major Ampullate Gland Dragline Silk-Protein-2 [Araneus Ventricosus]gi|27228959
Ampullate
Spidroin 1 [Nephila Madagascariensis]gi|13562006
Major Ampullate Spidroin 1 [Nephila Senegalensis]gi|13562010
Major Ampullate Spidroin 1 [Latrodectus Geometricus]gi|13561998
Major Ampullate Spidroin 1 [Argiope Trifasciata]gi|13561984
Major Ampullate Spidroin 1 [Argiope Aurantia]gi|13561976
Dragline Silk Protein Spidroin 2 [Nephila Clavata]gi|16974791
Major Ampullate Spidroin 2 [Nephila Senegalensis]gi|13562012
Major Ampullate Spidroin 2 [Nephila Madagascariensis]gi|13562008
Major Ampullate Spidroin 2 [Latrodectus Geometricus]gi|13562002
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das flagelliforme Protein SEQ ID No. 6 (Flag-N) und/oder SEQ ID No. 7 (Flag-C) oder eine Variante hiervon.
Jedoch können ebenfalls bereits bekannte und veröffentlichte flagelliforme Sequenzen hierin verwendet werden, insbesondere die folgenden:
Flagelliform Silk Protein Partial cds [Nephila Clavipes]gi|2833646
Flagelliform Silk Protein Partial cds [Nephila Clavipes]gi|2833648
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Spinnenseidenprotein eine oder mehrere synthetische repetitive Sequenzen, die ein oder mehrere Polyalanin enthaltende Konsensus-Sequenzen enthalten. Solche Polyalanin-Sequenzen können von 6 bis 9 Alaninreste enthalten. Siehe beispielsweise SEQ ID No. 1, die mehrere Polyalaninmotive von 6 Alaninresten enthält.
Vorzugsweise wird die Polyalanin enthaltende Konsensus-Sequenz von ADF-3 abgeleitet und weist die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3 (Modul A) oder eine Variante hiervon auf. Modul A enthält ein Polyalanin mit 6 Alaninresten. Eine weitere bevorzugte Polyalanin enthaltende Konsensus-Sequenz, abgeleitet von ADF-4, ist Modul C (SEQ ID No. 5), das 8 Alaninreste enthält.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im rekombinanten Spinnenseidenprotein der Erfindung die synthetische repetitive Sequenz von ADF-3 abgeleitet und umfasst ein oder mehrere Repeats bzw. Wiederholungen der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4 (Modul Q) oder einer Variante hiervon.
In allgemeinen Worten kann eine synthetische repetitive Sequenz ebenfalls die allgemeinen Motive: GGX oder GPGXX enthalten, d. h. glycinreiche Regionen. Wie oben erwähnt werden diese Regionen dem Protein eine Flexibilität verleihen und somit dem aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein, das die Motive enthält, gebildeten Faden.
Es sei erwähnt, dass die speziellen Modul für die synthetische repetitive Sequenz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ebenfalls miteinander verwendet werden können, d. h. Modul (Wiederholungseinheiten), die A und Q, Q und C etc. kombinieren sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Obwohl die Anzahl der in das Spinnenseidenprotein einzuführenden Modul nicht beschränkt ist wird es bevorzugt, mehrere Modul der synthetischen repetitiven Sequenz für jedes rekombinante Protein zu verwenden, deren Anzahl sich vorzugsweise von 5 bis 50 Moduln, besonders bevorzugt 10 bis 40 Moduln und am meisten bevorzugt zwischen 15 und 35 Moduln bewegt.
Die synthetische repetitive Sequenz umfasst vorzugsweise eines oder mehreres von (AQ) und/oder (QAQ) als Repeat-Einheiten. Noch mehr bevorzugt ist die synthetische repetitive Sequenz (AQ)₁₂, (AQ)₂₄, (QAQ)₈ oder (QAQ)₁₆.
Wenn immer die synthetische repetitive Sequenz von ADF-4 abgeleitet ist, kann sie vorzugsweise ein oder mehrere Repeats der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 5 (Modul C) enthalten oder eine Variante hiervon, wie oben erwähnt, wobei die synthetische repetitive Gesamtsequenz C₁₆ oder C₃₂ ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der vollständigen rekombinanten Spinnenseidenproteine der Erfindung sind (QAQ)₈NR3, (QAQ)₁₆NR3, (AQ)₁₂NR3, (AQ)₂₄NR3, C₁₆NR4 und C₃₂NR4, d. h. Proteine, die diese Sequenzen umfassen oder aus diesen bestehen.
Es sei erwähnt, dass die obige Konfiguration der synthetischen repetitiven Sequenz (unter Verwendung des A-, Q- und C-Systems) ebenfalls auf alle anderen Wiederholungseinheiten, die oben offenbart wurden, angewendet werden können, beispielsweise können alle Polyalanine enthaltenden Sequenzen für A und/oder C genommen werden und alle glycinreichen Sequenzen können als Q verwendet werden.
Neue Modul für synthetische repetitive Sequenzen, die aus flagelliformen Sequenzen abgeleitet sind, sind die Modul K (SEQ ID No. 35 und 36), SP (SEQ ID No. 37 und 38), X (SEQ ID No. 39 und 40) und Y (SEQ ID No. 41 und 42):
Die synthetische repetitive Sequenz umfasst vorzugsweise ebenfalls Y₈, Y₁₆, X₈, X₁₆, K₈, K₁₆ oder besteht aus diesen.
Es ist weiterhin möglich, solche Sequenzen zu kombinieren, die aus ADF-3, ADF-4 und Flag abgeleitet wurden, in einer rekombinanten Sequenz zu kombinieren.
In der vorliegenden Erfindung wird es jedoch sehr bevorzugt, Spinnenseidenproteine in Schritt a) zu verwenden, die aus Sequenzen der Gruppe von ADF-4 Sequenzen und Derivaten hiervon, die C₁₆, C₁₆NR4, C₃₂ und/oder C₃₂NR4 einschließen, ausgewählt sind oder diese enthalten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Lösungsmittel in b) und/oder die Lösungsmittel der zumindest einen weiteren Phase aus der Gruppe ausgewählt, die aus hydrophilen Lösungsmitteln, vorzugsweise Wasser, Alkoholen wie Ethanol, Glycerol oder lipophilen Lösungsmitteln, vorzugsweise natürlichen Ölen, beispielsweise Ölen von Pflanzen oder Tier Ursprung, synthetischen Ölen, wie beispielsweise Miglyol, Silikonöl, organische Lösungsmittel wie beispielsweise aromatischen Kohlenwasserstoffen, beispielsweise Toluol, Benzol etc. besteht.
Es sei erwähnt, dass eine einzige Phase ebenfalls mehr als ein Lösungsmittel enthalten kann (d. h. ein Gemisch) solange die Lösungsmittel im Wesentlichen identisch sind. „Im Wesentlichen identisch" bedeutet, dass die Lösungsmittel ähnliche Solubilitätseigenschaften aufweisen und somit nur eine gemeinsame Phase bilden. Somit schließen „im Wesentlichen identische" Lösungsmittel Lösungsmittel ein, in denen man keine getrennten Phase beobachten kann, wenn die Lösungsmittel gemischt werden. Als Beispiel können zwei oder mehr lipophile Lösungsmittel in einer Phase kombiniert werden, beispielsweise ein Pflanzenöl (beispielsweise Olivenöl und Rizinusöl) und Miglyol und/oder Hexadekan. Oder, als Alternative, kann eine hydrophile Phase zwei oder mehrere hydrophile Bestandteile umfassen, beispielsweise Wasser, Glycerol und dergleichen.
Wie oben erwähnt, ist das einzige Erfordernis, dass das Emulsionssystem zur Herstellung der Nano- und Mikrokapseln der Erfindung zumindest zwei Phasen ausweist, wobei die Phasen im Wesentlichen nicht miteinander mischbar sind.
Alle bekannten Emulsionstypen können in Schritt c) des vorliegenden Verfahrens verwendet werden, beispielsweise W/O, O/W, O/W/O oder W/O/W Typ Emulsionen. Diese Emulsionstypen sind in der Technik wohl bekannt und es wird bezüglich weiterer Informationen auf „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe oder weitere verfügbare Informationen Bezug genommen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Ausbildung der Emulsionen der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Miniemulsion zu erzeugen. Miniemulsionen sind Dispersionen von kritisch stabilisierten Öltröpfchen mit einer Größe zwischen 50 und 500 nm, hergestellt durch Scheren eines Systems, das Öl, Wasser, ein Tensid und ein Hydrophob enthält. Polymerisationen in derartigen Miniemulsionen haben, wenn sie sorgfältig vorbereitet werden, Teilchen zur Folge, die ungefähr dieselbe Größe wie die ursprünglichen Tropfen haben. Dies bedeutet, dass die geeignete Formulierung einer Miniemulsion eine Koaleszenz von Tröpfchen oder ein Ostwald-Ripening unterdrückt. Die Herstellung der Miniemulsion wird durch Hochscherungs-Vorrichtungen wie beispielsweise Ultraschall und Hochdruckhomogenisatoren durchgeführt. Es wird auf die verschiedenen Veröffentlichungen von K. Landfester und Mitarbeiter verwiesen.
Im Falle einer Emulsion des W/O-Typs wird die W-(hydrophile)-Phase die Emulsionströpfchen bilden und in diesem Falle sind die Spinnenseidenproteine in der W-Phase enthalten. Die O-Phase ist die lipophile Phase und bildet die kontinuierliche Phase.
Im Falle einer Emulsion des O/W-Typs wird die O-(lipophile)-Phase die Emulsionströpfchen bilden und in diesem Falle sind die Spinnenseidenproteine in der O-Phase enthalten. Die W-Phase ist die hydrophile Phase und bildet die kontinuierliche Phase.
Die Tenside, die in den obigen Emulsionen verwendet werden, können aus solchen Verbindungen ausgewählt werden, die der Fachmann auf dem Gebiet auf Grundlage des verfügbaren Wissens auf dem Gebiet der pharmazeutischen und verwandter Wissenschaften auswählen wird. Eine beispielhafte Auswahl von Tensiden bzw. oberflächenaktiven Stoffen zur Verwendung in der Gewinnung der vorliegenden Emulsionen sind Fettsäureester von Glycerolen, Sorbitol und andere multifunktionelle Alkohole, vorzugsweise Glycerolmonostearat, Sorbitanmonolaurat, oder Sorbitanmonoleat; Poloxamine, Polyoxyethylenether und Polyoxyethylenester; ethoxylierte Triglyceride; ethoxylierte Phenole und ethoxylierte Diphenole; Metallsalze von Fettsäuren, Metallsalze von Fettalkoholsulfaten, Natriumlaurylsulfat; und Metallsalze von Sulfursuccinaten; Polysorbaten, bevorzugt Polysorbate 20, 40, 60 und 80; Poloxamere, Polyoxyethylenglycole; und Gemische dieser Substanzen.
Es sei jedoch ausdrücklich erwähnt, dass es kein essentielles Merkmal dieser Erfindung ist, ein Tensid zu verwenden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Emulsionssysteme, die keine Tenside erfordern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das in 1b) verwendete Lösungsmittel weiterhin ein oder mehrere pharmazeutische Wirkstoffe, kosmetische Mittel, Nährstoffe oder Nahrungsadditive. Mit anderen Worten werden zusätzliche Inhaltsstoffe üblicherweise in der Phase vorhanden sein, die ebenfalls die Spinnenseidenproteine enthält. In diesem Falle werden die ein oder mehreren Inhaltsstoffe/Mittel in das Polymernetzwerk eingekapselt werden, das an der Phasengrenzfläche gebildet wird.
Es ist als Alternative ebenfalls möglich, die oben erwähnten Mittel zur kontinuierlichen Phase hinzuzufügen, die die Spinnenseidenproteine nicht enthält. In diesem Falle werden die Nano- und Mikrokapseln der Erfindung durch diese Mittel beschichtet werden.
Als weitere Alternative können die Mittel in die Nano- und Mikrokapseln der Erfindung eingebaut werden, nachdem sie durch das vorliegende Verfahren gewonnen wurden. Dies kann durch Quellen der Membran mit bestimmten Lösungsmitteln und durch Diffundieren des eingekapselten Stoffes (Wirkstoff) innerhalb dieser erreicht werden. Ein Quellen kann ebenfalls durch Temperatur, Druck oder nicht nur Lösungsmittel, sondern auch andere chemische Mittel (wie beispielsweise chemische Mittel, pH und andere) durchgeführt werden.
Es ist ebenfalls möglich, das zu verkapselnde Mittel in die Membran einzubauen. Dieser Ansatz kann veränderte oder verbesserte Freisetzungseigenschaften als die Verkapselung des zu verkapselnden Stoffes in diese ergeben.
Der Typ an Wirkstoff, der zusätzlich in die Nano- und Mikrokapseln der Erfindung eingebaut wird, ist in keiner Weise beschränkt.
Beispielsweise kann das pharmazeutische Mittel bzw. der pharmazeutische Wirkstoff aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Analgetika; Hypnotika und Sedativa; Arzneistoffen zur Behandlung von psychiatrischen Störungen wie beispielsweise Depression und Schizophrenie; Anti-Epileptika und Anti-Konvulsiva; Arzneistoffen für die Behandlung von Parkinson und Huntington-Krankheit, Alters- und Alzheimer Krankheit; Arzneistoffen, die die Behandlung von ZNS-Traumata oder Schlaganfällen zum Ziel haben; Arzneistoffen zur Behandlung von Sucht und Drogenmissbrauch; chemotherapeutischen Mitteln für parasitäre Infektionen und Erkrankungen, die durch Mikroben verursacht sind; immunsuppressiven Mitteln und Anti-Krebsarzneistoffen; Hormonen und Hormonantagonisten; Antagonisten für nicht-metallische toxische Mittel; zytostatische Mittel zur Behandlung von Krebs; diagnostische Substanzen zur Verwendung in der Medizin; immunaktive und immunreaktive Mittel; Antibiotika; Antispasmodika; Antihistaminika; Mitteln gegen Übelkeit; Relaxanzien; Stimulanzien; Zerebraldilatatoren; Psychotropika; vaskulären Dilatatoren und Konstriktoren; Antihypertensiva; Arzneistoffen für die Migränebehandlung; Hypnotika, hyperglykämische und hypoglykämische Mitteln; Anti-Asthmatika; antiviralen Mitteln; und Gemischen hiervon ausgewählt sein.
Nahrungsmittel und Nahrungsmittelzusatzstoffe können aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Vitaminen (Ascorbinsäure, Tocopherolacetat und dergleichen), Mineralien (Kalzium, Magnesium, Kalium, Natrium, beispielsweise), Spurenelementen (Selen), Extrakten natürlichen Ursprungs, natürlichen Ölen (Fischöl) etc. umfassen.
Kosmetische Mittel können beispielsweise aus Tocopherolacetat, Ölen natürlichen und synthetischen Ursprungs, Panthenol, Pflanzenextrakten, UV absorbierenden Mitteln, Desinfektionsmitteln, Anti-Irritationsmitteln, Repellanzien ausgewählt sein.
Es sei erwähnt, dass die Mittel im Lösungsmittel in gelöster, suspendierter oder fester Form vorliegen könnten. Im letzteren Fall wird ein fester Kern bereitgestellt, der durch die Spinnenseidenproteine der vorliegenden Erfindung beschichtet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Auftrennung bzw. Abtrennung des Polymernetzwerks in Schritt e) mittels Zentrifugation oder durch Zerstören der in Schritt c) gebildeten Emulsion und durch Bilden einer einphasigen Lösung durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, um die Nano- und Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung vom Emulsionssystem abzutrennen.
Die in den Schritten b) bis e) verwendete Temperatur ist 5–40°C, vorzugsweise 10–30 und besonders bevorzugt Raumtemperatur. Der in den Schritten b) bis e) verwendete pH ist 3–9, vorzugsweise 5–8, besonders bevorzugt 7.
Die Größe der Emulsionströpfchen und der Nano- und Mikroteilchen, die hiervon abgeleitet sind, liegt vorzugsweise von 10 nm bis 20 μm, vorzugsweise zwischen 500 nm und 10 μm, am meisten bevorzugt ungefähr bei 5 μm. Die Wanddicke der erzielten Nano- und Mikrokapseln ist vorzugsweise 5 und 100 nm, besonders bevorzugt zwischen 10 und 70 nm (siehe beispielsweise 5).
In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Nano- und Mikrokapseln, die durch das oben offenbarte Verfahren gewinnbar sind.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wie oben definierte Nano- und Mikrokapseln enthält und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger. Somit werden die aktiven Bestandteile der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung in Dosen bzw. Do sierungen verwendet, und werden mit einem verträglichen Träger oder Trägermaterial vermischt, so dass die Erkrankung behandelt oder zumindest gelindert werden kann. Eine derartige Zusammensetzung kann (zusätzlich zum aktiven Bestandteil und dem Träger) Füllmaterial, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel und andere Materialien einschließen, die Stand der Technik sind.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich" ist als nicht toxisches Material definiert, das die mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Bestandteils nicht interferiert. Die Auswahl des Trägers hängt von der Anwendung ab.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusätzliche Bestandteile enthalten, die die Aktivität des aktiven Bestandteils erhöhen oder die die Behandlung ergänzen. Derartige zusätzliche Bestandteile und/oder Faktoren können Teil der pharmazeutischen Zusammensetzung sein, um synergistische Wirkungen zu erzielen oder um abträgliche oder unerwünschte Wirkungen zu minimieren.
Techniken zur Formulierung oder Zubereitung und Anwendung/Medikation von Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe (siehe ebenfalls oben) veröffentlicht. Eine geeignete Anwendung kann beispielsweise eine orale, dermale oder transmucosale Anwendung und eine parenterale Anwendung einschließen, einschließlich einer intramuskulären, subkutanen, intramedulären Injektion ebenso wie intrathekalen, direkt intraventrikulären, intravenösen, intraperitonealen oder intranasalen Injektionen.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein kosmetisches oder Nahrungsmittelprodukt bereit, das wie oben offenbarte Nano- und Mikrokapseln enthält.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die beigefügten Figuren veranschaulicht, bei denen Folgendes gezeigt wird:
1(a) eine Dynamische Lichtstreuung des hydrodynamischen Peptosomen-Radius R_H als Funktion der NaCl-Konzentration und des pHs zeigt. (b) Schematische Darstellung des Peptosoms und seiner Größenveränderung als Funktion des pHs aufgrund eines Knäuel zu α-Helix Sekundärstrukturübergangs im Peptidanteil.
2 ist eine schematische Darstellung des Spinnenbeutel/Ballonbildungsprozesses. (A) Eine wässrige Proteinsuspension wird in Toluol emulgiert. (B) Ein Protein absorbiert an der Wasser-Toluol-Grenzfläche und denaturiert, wodurch ein Polymernetzwerk gebildet wird (Einfügung). (C) Wenn es einmal absorbiert ist, kann das Proteinnetzwerk in Wasser durch Zentrifugation übertragen werden. Endgültige Beutel/Ballonstrukturen weisen Wasser auf der Innenseite und Wasser auf der Außenseite auf. (D) Alternativ kann das Proteinnetzwerk, wenn es einmal absorbiert ist, in eine einphasige Lösung durch Zusatz von Ethanol übertragen werden.
3 zeigt ein Bild von Spinnenbeutel/Ballons in (A) Toluol/Ethanol (50:50) und (B) nach Transfer in Wasser.
4 ist ein Bild von Spinnenbeutel/Ballons befüllt mit FITC-markiertem Dextran (MW 500kDa) nach Transfer in die kontinuierliche Wasserphase: (A) helles Feld-Bild. (b) Fluoreszierendes Bild.
5 zeigt Spinnenbeutel/Ballons, die durch SEM wiedergegeben werden. Die Membrandicke wurde als kleiner als 70 nm bestimmt.
Beispiele:
Proteinherstellung
Die Proteinlösung, aus der die Spinnenballons gebildet wurden, wurde durch zunächst Auflösen von rekombinanten Spinnendragline-Seidenprotein (C₁₆, siehe Huemmerich et al., 2004) in einer Konzentration von 10 mg/ml in 6M Guanidinthiocyanat hergestellt. Die Proteinlösung wurde auf 4°C abgekühlt und die Konzentration von Guanidinthiocyanat wurde 1 mM durch Dialysieren der Proteinlösung gegen einen 10 mM Trispuffer, pH 8,0 über Nacht unter Verwendung eines Dialyseröhrchens von Carl Roth Gmbh mit einer Molekulargewichtsgrenze von 14 kDa reduziert. Jegliches undispergiertes Protein wurde durch Zentrifugieren der dialysierten Lösung für 30 Minuten bei einer Kraft von 100.000 × g entfernt, während die Lösungstemperatur bei 4°C aufrecht erhalten wurde. Die endgültige Proteinkonzentration wurde unter Verwendung einer UV Absorption bestimmt, unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten der Proteine von 0,859 bei einer Wellenlänge von 276 nm.
Beutel/Ballonbildung
Beutel/Ballons aus Spinnenseide wurden durch Emulgieren von 5 μl dialysierter Proteinsuspension in 300 μl Toluol für 90 Sekunden (2A) gebildet. Während der Emulgierung absorbiert Seidenprotein und verändert seine strukturelle Konformation an der Oberfläche der Emulsionströpfchen, was ein Polymernetzwerk zur Folge hat, das das Emulsionströpfchen einkapselt (2B). Spinnenseidenbeutel/Ballons wurden unter Verwendung von Proteinsuspensionen mit Konzentrationen im Bereich von 1–6 mg/ml und mit Emulsifikationszeiten von nur 20 Sekunden gebildet. Die Größe der Beutel/Ballons, die sich bildeten, hängt von der Größe der Emulsionströpfchen ab.
Wenn sie einmal gebildet wurden, wurden die Proteinhüllen, die die Emulsionströpfchen umgeben, aus der Zwei-Phasen-Emulsion in eine Ein-Phasen-Lösung übertragen. Zwei unterschiedliche Verfahren sind bei Übertragen der Proteinhüllen effektiv. Beim ersten Verfahren wurden 300 μl Wasser dem Toluol zugesetzt, um eine wässrige Sub-Schicht zu bilden. Die Proteinhüllen, die die Wassertröpfchen umgeben, wurden aus der Toluolschicht in die wässrige untere Schicht bei einer Kraft von 100 × g für 4 Minuten zentrifugiert (2C). Bei zweiten Verfahren wurde eine einphasige Lösung durch Zusatz von 300 μl Ethanol zur zweiphasigen Lösung gebildet, um das Toluol und Wasser zu solubilisieren (2D). Nach Verwendung jedes Verfahrens zur Übertragung der Beutel/Ballons auf eine Einphasen-Lösung wurden die sich ergebenden Strukturen mit einem optischen Mikroskop bzw. Lichtmikroskop untersucht (3).
Die Integrität der zentrifugierten Ballon-artigen Proteinhüllen wurden durch Zusatz von 0,5 Gew.-% FITC markiertem 500 kDa Dextran (Sigma-Aldrich) zur Proteinlösung vor der Emulsifikation verifiziert. Nach Emulsifikation und Zentrifugation wiesen die gebildeten Ballon-artigen Strukturen nach wie vor eine Fluoreszenz auf, was darauf hinweist, dass die Proteinhülle dieser Strukturen während der Zentrifugation nicht zerrissen wurde (4).
Literatur

Chécot F, Lecommandoux S, Gnanou Y, Klok HA (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41, 1339
Chécot F, Lecommandoux S, Klok HA, Gnanou Y (2003) Euro. Phys. J. E 10, 25
Dinsmore AD, Hsu MF, Nikolaides MG, Marquez M, Bausch AR, Weitz DA. (2002) Colloidosomes: Selectively permeable capsules composed of colloidal particles. Science 298(5595):1006–1009.
Y. -Y. Won, H. Davis, F. Bates, Science 283, 960 (1999)
Huemmerich D, Helsen CW, Quedzuweit S, Oschmann J, Rudolph R, Scheibel T (2004) Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry 43: 13604–12
Scheibel T (2004) Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins, Microbial Cell Factories 3, 14

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Nano- und Mikrokapseln, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen von Spinnenseidenproteinen; b) Bilden einer Lösung oder Suspension dieser Proteine in einem geeigneten Lösungsmittel; c) Erzeugen einer Emulsion aus zumindest 2 Phasen, wobei die Emulsion die Lösung oder Suspension, gebildet in b), als eine erste Phase enthält und zumindest eine weitere Phase enthält, die im Wesentlichen mit der ersten Phase unmischbar ist; d) Ausbilden eines Polymernetzwerkes der Spinnenseidenproteine an der Grenzfläche der zumindest 2 Phasen; e) Auftrennen des Proteinpolymernetzwerks, erzeugt in (d) aus der Emulsion.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Spinnseidenproteine, die in a) bereitgestellt werden, aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus ADF-4 und Derivaten hiervon besteht, einschließlich C16, C16NR4, C32, C32NR4.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lösungsmittel in b) und/oder die Lösungsmittel der zumindest einen weiteren Phase aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus hydrophilen Lösungsmitteln, vorzugsweise Wasser und Alkohol oder lipophilen Lösungsmitteln besteht, vorzugsweise natürlichen Ölen oder synthetischen Ölen.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Emulsion, die in c) gebildet wird, W/O, O/W, O/W/O oder W/O/W-Typ aufweist.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das in 1 b) verwendete Lösungsmittel weiterhin ein oder mehrere pharmazeutische Mittel, kosmetische Mittel, Nahrungsmittel oder Nahrungszusatzstoffe enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das pharmazeutische Mittel im Lösungsmittel gelöst, suspendiert oder in fester Form vorliegt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abtrennung des Polymernetzwerks in Schritt e) mittels Zentrifugation oder durch Zerstören der in Schritt c) gebildeten Emulsion und durch Bilden einer einphasigen Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in den Schritten b) bis e) verwendete Temperatur 5 bis 40 °C, vorzugsweise 10 bis 30 °C und besonders bevorzugt Raumtemperatur ist, und wobei der in den Schritten b) bis e) verwendete pH 3 bis 9, vorzugsweise 5 bis 8, besonders bevorzugt 7 ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Größe der Emulsionströpfchen und die hiervon gewonnenen Nano- und Mikropartikel von 100 nm bis 20 μm, vorzugsweise zwischen 500 nm und 10 μm, am Meisten bevorzugt ungefähr 5 μm beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wanddicke der erzielten Nano- und Mikrokapseln zwischen 5 und 100 nm, vorzugsweise zwischen 10 und 70 nm liegt.
Nano- und Mikrokapsel, gewinnbar durch das Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die Nano- und Mikrokapseln nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Kosmetik- oder Nahrungsmittelprodukt, das Nano- und Mikrokapseln nach Anspruch 11 enthält.