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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochmonodispersen,
polymeren, hydrophilen Nanopartikeln mit oder ohne Targetmolekülen, die
darin eingekapselt sind und die Größen von bis zu 100 nm und eine
hohe Monodispersität
aufweisen.
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Stand der Technik
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Nach
einer Verabreichung eines Arzneimittels an ein lebendes System wird
die aktive Substanz in Abhängigkeit
von ihren physiochemischen Eigenschaften und ihrer molekularen Struktur über den
ganzen Körper verteilt.
Die Endmenge an Arzneimittel, die ihren Zielort erreicht, kann nur
ein geringer Anteil der verabreichten Dosis sein. Das Ansammeln
des Arzneimittels an dem nicht gewünschten Ort kann zu schädlichen
Auswirkungen und unerwünschten
Nebenwirkungen führen.
Deswegen ist es nötig,
das Arzneimittel an spezifische Körperstellen zu dirigieren.
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Ein
Weg zur Änderung
der Biodistribution von Arzneimitteln im Körper besteht darin, sie in
ultrafeinen Arzneimittelträgern
einzuschließen.
Von diesen Trägern
wurden Liposome, Nanopartikel und Pharmakosome umfassend untersucht.
Es stellte sich heraus, dass der Einsatz von Liposomen als Wirkstoffe
zum Arzneimittel-targeting begrenzt ist, was hauptsächlich auf
die Probleme des geringen Einschlussergebnisses, der Arzneimittelinstabilität, des schnellen
Auslaufens des Arzneimittels und die schlechte Lagerungsbeständigkeit
zurückzuführen ist.
Mit dem Ziel, diese Probleme zu lösen, wurde in den letzten beiden
Jahrzehnten die Produktion von polymeren Nanopartikeln erforscht.
Nanopartikel werden als kolloidale Festpartikel definiert, deren Größe von etwa
10 nm bis 1000 nm reicht.
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Eine
erhebliche Anzahl von Studien hat von neuerlichen Fortschritten
in Bezug auf die Möglichkeiten des
Arzneimittel-Targetings und der anhaltenden Freisetzung mittels
Nanopartikeln, welche die Arzneimittel eingekapselt haben, berichtet.
Es wurde auch von einigen in-vivo-Studien berichtet, wobei die besondere
Aufmerksamkeit auf das retikuloendotheliale System (RES) gerichtet
war. In der Literatur wurde auch über einige in-vivo-Studien
berichtet, die die Verabreichung von Nanopartikeln auf dem oralen
oder dem okularen Weg hinsichtlich der eventuellen Verbesserungen
der Bioverfügbarkeit
betrafen. Diese polymeren Nanopartikel sollten nicht antigen, biokompatibel
und biologisch abbaubar sein.
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Man
fand heraus, dass die wichtigen Eigenschaften der Partikel, die
zum targeting von spezifischen Körperzellen
eingesetzt werden, hauptsächlich
durch zwei Faktoren beeinflusst werden: (i) durch die Größe der Nanopartikel
und (ii) durch die Oberflächenbeschaffenheit
der Nanopartikel.
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Partikel,
die kleiner als 7 μm
sind, und insbesondere Nanopartikel, werden nicht in der Lunge gefiltert und
ihre Bioverteilung hängt
von ihrer Wechselwirkung mit dem retikuloendothelialen System (RES)
ab. Biologisch abbaubare Nanopartikel werden hauptsächlich durch
die Kupffer-Zellen in der Leber aufgenommen, während geringe Mengen diese
Partikel zu den Makrophagen in der Milz und in das Knochenmark wandern. Die
Aufnahme durch das Knochenmark und das targeting von anderen Stellen
kann durch die Verringerung der Partikelgröße drastisch verändert werden.
Nanopartikel mit einem Durchmesser von 200 nm oder mehr haben eine
Bioverteilung, die von deren Interaktion mit RES abhängt. Die
Bioverteilung kann jedoch invertiert werden, wenn die Partikelgröße viel
kleiner gestaltet ist (d.h. unterhalb von 100 nm) und Partikeloberflächen werden so
gestaltet, dass sie hydrophil sind. Man fand beispielsweise heraus,
dass wenn diese Partikel in drei Größenbereiche von – 60 nm,
150 nm und 250 nm aufgeteilt werden und ihre Oberflächen durch
die Adsorption von tensidartigen Poloxameren hydrophil gestaltet
werden, werden die eine kleine Größe aufweisenden Partikel mit
einer maximalen Oberflächen-Hydrophilie
größtenteils
von Zellen aufgenommen, die keine Kupffer-Zellen sind, wie in 1 der
beiliegenden Zeichnungen gezeigt wird. 1 zeigt
insbesondere die größenabhängige Aufnahme
von mit poloxameren Tensiden unbeschichteten und beschichteten Nanopartikeln,
die durch das Knochenmark aufgenommen werden. Diese kleinen Partikel
im Blutserum absorbieren kein Serumprotein durch Opsonierung und
daraus resultierend nimmt ihre Zirkulationszeit im Blut stark zu.
Aufgrund von Opsonisierung werden die hydrophoben Partikel sehr
schnell aus dem Kreislauf entfernt. Nanometer-große Partikel
mit hydrophiler Oberfläche
bleiben für
einen längeren
Zeitraum im Blut, so dass das Targeting von spezifischen Stellen
erleichtert werden kann.
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Derzeit
werden Nanopartikel für
die Arzneimitteleinkapselung durch Verfahren hergestellt, die entweder
die Polymerisation von dispersen Monomeren oder die Dispersion von
vorgeformten Polymeren in Emulsion in Gegenwart des gewünschten
Arzneimittels mit einschließt.
Die im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von
Nanopartikeln sind (i) das Dispersionspolymerisationsverfahren,
(ii) das Emulsionspolymerisationsverfahren, (iii) die Dispersion
von synthetischen Polymernanosphären
in einer Emulsion, und (iv) die Technik der Grenzflächenpolymerisation.
In all diesen Verfahren werden Öl-in-Wasser-Emulsionen
eingesetzt, und das Polymer wird in der Öl-Phase gebildet oder löst sich
darin auf.
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Demzufolge
sind die Polymer-Materialien immer hydrophob, da sie in Öl lösbar sein
müssen,
und die gebildeten Partikel sind Nanopartikel, die größer sind
(d.h. oberhalb von 100 nm), da die durchschnittliche Größe der Emulsionströpfchen größtenteils
100 nm und mehr im Durchmesser beträgt. Da die Emulsionströpfchen weiterhin
stark polydispers sind, haben die gebildeten Nanopartikel ein breites
Spektrum bezüglich
der Größenklasse,
und sie sind auch hochpolydispers. So kann man in solch bekannten
Prozessen (i) keine, eine subkolloidale Größe aufweisende, Nanopartikel
herstellen, und (ii) die Vorgabe an das Emulsionsmedium ist die, dass
die polymeren Materialien hydrophob sein sollten.
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Das
französische
Patent Nr.
2 208 716 offenbart
einen Prozess zur Produktion von partikulären Zusammensetzungen, wobei
die Emulsionspolymerisation eingesetzt wird. Die partikulären Zusammensetzungen
können
ein aktives Material, wie ein Medikament, einen Katalysator oder
eine Farbe, enthalten.
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Aufgaben der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen neuen Prozess zur
Herstellung von hochmonodispersen, polymeren Nanopartikeln mit oder
ohne Targetmaterialien, die eine Größe von bis zu 100 nm mit einer
hohen Monodispersität
haben, vorzuschlagen.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zur Herstellung
der polymeren Nanopartikel, die auf erforderliche Größen moduliert
werden können,
bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zur Herstellung
der hochmonodispersen, polymeren, eine subkolloidale Größe aufweisenden
Nanopartikel mit oder ohne Target-Materialien, vorzuschlagen.
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Noch
eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zur
Herstellung dieser hydrophilen polymeren Nanopartikel vorzuschlagen.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zur Herstellung
der hochmonodispersen, mit Arzneimittel beladenen, polymeren Nanopartikel,
die in wässrigen
Puffer dispergiert und frei von allen toxischen Materialien sind,
vorzuschlagen.
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Noch
eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zur
Herstellung hoch monodisperser, mit Arzneimittel beladenen, polymeren
Nanopartikeln hydrophiler Natur vorzuschlagen, der die Nachteile verhindert,
die mit denen des Standes der Technik verbunden sind.
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Noch
eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, einen Prozess zum
Einführen
von und zum Beladen mit einem Target-Arzneimittel/einer Target-Substanz
in Nanopartikeln, um sie vor äußeren Eingriffen
in vivo oder in einer Zellkultur in vitro zu schützen, bis sie innerhalb der
Zelle an der Target-Stelle exponiert ist.
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Beschreibung der Erfindung
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Gemäß dieser
Erfindung wird ein Prozess zur Herstellung hoch monodisperser polymerer
hydrophiler Nanopartikel mit oder ohne Target-Materialien, die eine
Größe von bis
zu 100 nm aufweisen, mit einer hohen Monodispersität bereitgestellt,
umfassend die Schritte:
- (i) Auflösen eines
Tensids in Öl
unter Erhalt von reversen Micellen;
- (ii) Zufügen
einer wässrigen
Lösung
von einem Monomer oder vorgebildeten Polymer, zu den reversen Micellen,
eines Vernetzungsmittels, eines Initiators und gegebenenfalls eines
Arzneimittels oder einer Target-Substanz;
- (iii) Aussetzen eines solchen Gemischs dem Polymerisationsschritt;
- (iv) Trocknen des polymerisierten Reaktionsprodukts zur Entfernung
des Lösungsmittels
unter Erhalt von trockenen Nanopartikeln und Tensiden;
- (v) Dispergieren der Trockenmasse in wässrigem Puffer; und
- (vi) Trennen des Tensids und anderer toxischer Materialien davon.
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Gemäß dieser
Erfindung wird der wässrige
Kern eines reversen, micellaren Tröpfchens als ein Nanoreaktor
zur Herstellung von Nanopartikeln verwendet. Die Größen des
wässrigen
Kerns solcher Tröpfchen
liegen im Bereich von 1 nm-10
nm. Die Größe der Partikel,
die primär
innerhalb dieser Tröpfchen
gebildet werden, sind größer als
die Größe des wässrigen
Kerns der Tröpfchen.
Da weiterhin die Polymerisation in einem wässrigen Medium stattfindet,
werden durch diese Erfindung Polymere mit oberflächenhydrophilen Eigenschaften
erhalten. Deswegen ist es beim Einsatz des reversen, micellaren
Verfahrens der vorliegenden Erfindung möglich, Nanopartikel herzustellen,
die eine sehr kleine Größe mit hydrophiler
Oberfläche
haben, so dass sowohl deren Opsonieren als auch deren Aufnahme durch
RES im Wesentlichen minimiert ist. Eine hohe Monodispersität der Partikel
ist möglich,
da reverse, micellare Tröpfchen,
in denen die polymeren Reaktionen stattfinden, hochmonodispers sind.
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Die
wässrige
Phase wird auf solche Weise geregelt, dass die gesamte Mischung
in einer optisch transparenten Mikroemulsionsphase gehalten wird.
Der Bereich der wässrigen
Phase kann nicht definiert werden, da dies von Faktoren wie dem
Monomer, dem Tensid oder der Polarität von Öl abhängt, und der einzige Faktor ist
der, dass das System eine optisch transparente Mikroemulsionsphase
ist.
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Nanopartikel
haben gemäß dieser
Erfindung einen Größenbereich
von bis zu 100 nm, vorzugsweise eine Größe von bis zu 10 nm bis 100
nm.
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Gemäß dieser
Erfindung wird der wässrige
Kern eines reversen, micellaren Tröpfchens effektiv als Nanoreaktor
eingesetzt, um ultrafeine Nanopartikel herzustellen und um die Arzneimittel
einzukapseln (normalerweise wasserlösliche Chemikalien mit einer
maximalen Größe von bis
zu 100-200 k Dalton Protein). Durch den Prozess der vorliegenden
Erfindung wurden extrem kleine Partikel größerer Gleichmäßigkeit
und bis runter auf etwa 10 nm erzielt.
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Das
Tensid, Natrium-bis-ethylhexylsulphosuccinat oder das Aerosol OT
(d.h. AOT) wird in n-Hexan aufgelöst, um reverse Micellen herzustellen.
Zur AOT-Lösung in
Hexan (0,01 M bis 0,1 M AOT in Hexan) werden wässrige Lösungen von Monomeren oder vorgebildeten
Polymeren, Vernetzungsmitteln, Initiatoren sowie Arzneimitteln hinzugefügt, und
die Polymerisation findet in Gegenwart von Stickstoffgas statt.
Eine zusätzliche Menge
Wasser kann hinzugefügt
werden, um größere Nanopartikel
zu erhalten. Die maximale Menge an Arzneimittel, die in reversen
Micellen aufgelöst
werden kann variiert von Arzneimittel zu Arzneimittel und muss dadurch
bestimmt werden, dass die Menge an Arzneimittel schrittweise erhöht wird,
bis sich die klare Mikroemulsion in eine durchscheinende Lösung verwandelt.
Alle Stammlösungen
werden in Phosphat-Puffer
hergestellt, und der Gehalt intensiv gerührt, um die Transparenz der
Lösung
sicherzustellen. Die Reaktionsmischung wird mit Stickstoffgas gespült. Die
Polymerisation findet unter Stickstoffatmosphäre statt. Das Lösungsmittel
n-Hexan wird dann
bei einer Temperatur von beispielsweise 35°C unter Einsatz eines Rotationsverdampfers
bei niedrigem Druck verdampft, worauf die transparente trockene
Masse erhalten wird. Das Material wird in Wasser dispergiert, und
es wird tröpfchenweise
CaCl2-Lösung
hinzugefügt,
bis das gesamte Calcium-Salz von Diethylhexylsulphosuccinat (Ca(DEHSS)2)
von AOT gefällt
ist. Die Mischung wird dann einer Zentrifugation unterworfen, beispielsweise
10 Minuten lang bei 15.000 rpm („rpm” = Umdrehungen pro Minute).
Der Überstand,
der Nanopartikel enthält,
die eingekapselte Arzneimittel enthalten, wird dekantiert. Einige
Nanopartikel bleiben in dem Niederschlagskuchen absorbiert. Zur
kompletten Wiedergewinnung der Nanopartikel aus dem gefällten Calcium
(DEHSS)2, wird letzterer in n-Hexan aufgelöst, und die Nanopartikel mit
Wasser extrahiert. Die wässrige
Dispersion wird sofort etwa eine Stunde lang durch eine 12.000 cut
off Dialysemembran dialysiert und die Flüssigkeit zu Trockenpulver lyophilisiert
und bis zur weiteren Verwendung bei niedrigen Temperaturen gelagert.
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Es
wird nun auf 2 der beigefügten Zeichnungen Bezug genommen,
die das Flussdiagramm für
die Herstellung einer Mikroemulsion unter Verwendung von Nanopartikeln
veranschaulicht. Schritt A zeigt ein reverses, micellares Tröpfchen A1,
das durch das Auflösen
des Tensids in Öl
hergestellt wurde. Wenn somit ein Tensid in Öl aufgelöst wird, bleiben die hydrophoben,
konstituierenden Schwänze
in Kontakt mit dem Öl,
und ein innerer Kern A3 umfasst hydrophile Bestandteile. Wenn Wasser
einer Lösung
zugeführt
wird, die reverse Micellen A1 enthält, wird Wasser zur hydrophilen
Domaine oder zum Kern A3 hingezogen, da der hydrophile Bestandteil
wasserlöslich
ist. Ein Monomere vernetzendes Mittel, das erforderliche Arzneimittel
und der Initiator werden den reversen Micellen A1 zugegeben. Da
die vorgenannten Bestandteile von Natur aus hydrophil sind, wandern
solche Bestandteile zum Kern A3. Zur Bildung eines Polymers B1 und
eines eingekapselten Arzneimittels wird die Polymerisation in einer
Stickstoffatmosphäre,
wie in Schritt B veranschaulicht, durchgeführt. In Schritt B wird eine
Verdampfung unter niedrigem Druck zum Entfernen des Lösungsmittels
durchgeführt. Schritt
C veranschaulicht die getrocknete Masse, die aus Nanopartikeln C1
und dem Tensid C2 besteht. Die getrocknete Masse wird in Phosphatpuffer
aufgelöst,
und anschließend
werden in Schritt D 30%iges CaCl2 tröpfchenweise
zugefügt,
um das Tensid als Calcium-diethylhexylsulfosuccinat (DEHSS) zu fällen. Schritt
D veranschaulicht Nanopartikel C1 und Calcium DEHSS. Die Lösung aus
Schritt D wird in Schritt E zentrifugiert, um klare Nanopartikel
zu erhalten, die im Puffer dispergiert sind und den Niederschlag
von Ca (DEHSS) 2.
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Der
Kuchen aus Ca (DEHSS)2 kann einige absorbierte Nanopartikel enthalten,
die wiedergewonnen werden können,
indem der Kuchen in Hexan aufgelöst
wird und die Nanopartikel durch den Puffer 2- bis 3-mal ausgewaschen
werden können.
Die Auswasch-Lösungen
werden zusammen mit der Lösung
E aufgefangen. Solch eine Nanopartikel enthaltende Pufferlösung kann
immer noch einige nicht reagiert habende oder toxische Stoffe enthalten,
die durch die zweistündige
Dialyse und durch anschließendes
Gefriertrocknen der Lösung
entfernt werden.
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Es
werden 0,01 bis 0,1 M AOT in n-Hexan verwendet. Vinylpyrrolidon
(VP) oder ein Gemisch aus Vinylpyrrolidon und Polyethylenglycolfumarat
(PEGF) werden als Monomere verwendet, da sie bei der Polymerisation
wasserlösliche
Hydrogele bilden und hochbiocompatibel sind. Ein weiteres geeignetes,
aber antigenes Polymer, das eingesetzt wurde, ist das Rinderserumalbumin.
Weitere geeignete, wasserlösliche
Hydrogele und biocompatible Materialien können zur Bildung der Nanopartikel
eingesetzt werden. Im Falle der Hydrogele findet die Vernetzung
mit N,N-Methylen-bis-acrylamid (MBA) statt, wobei Albumin durch
Glutaraldehyd vernetzt wird. Im Falle von Polyvinylpyrrolidon (PVP),
das mit MBA vernetzt wird, beträgt
die eingesetzte Monomermenge zum Beispiel etwa 50 Gew.% AOT, und
die Menge an eingesetztem Vernetzungsmittel (MBA) ist 1,2% w/w des
Polymers. Solch eine Zusammensetzung hat eine maximale Lagerbeständigkeit
und die Retention des Arzneimittels durch Nanopartikel dieser Zusammensetzung
ist auch maximal. Die Arzneimittelbeladung sollte zwischen 1% bis
10% w/w dieses Polymers gemäß der Löslichkeit
dieses Arzneimittels in dem micellaren System betragen, sie kann
aber auch erhöht
werden, wenn die Löslichkeit
des Arzneimittels in den reversen Micellen hoch ist.
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Die
folgenden Beispiele werden zum Zweck der Veranschaulichung der vorliegenden
Erfindung dargestellt und sollten nicht so interpretiert werden,
als würden
sie den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
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Beispiel I: Herstellung eines mit einem
Antigen beladenen Polyvinylpyrrolidon-Nanopartikels.
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Ein
Antigen aus Aspergillus fumigatus wurde als Arzneimittel zur Einkapselung
eingesetzt. In 40 ml einer 0,03 M AOT-Lösung Hexan wurden 140 μl frisch
destilliertes reines Vinylpyrrolidon, 35 μl N,N-Methylen-bis-acrylamid,
(0,49 mg/ml), 20 μl
1%ige Eisenammonium-Sulfat-Lösung,
40 μl 11,2%iger
wässriger
Lösung
von Tetramethylendiamin (TMED), 10 μl 5%iges Kaliumpersulphat als
Initiator und 180 μl
Antigen (Antigen = 16 mg/ml) hinzugefügt. Die Menge an überschüssigem Puffer,
die in die reversen Micellen zugefügt werden musste, wurde durch
die gewünschte
Größe der herzustellenden
Nanopartikel bestimmt. Das überschüssige Puffervolumen
kann von 0 bis auf eine maximale Menge erhöht werden, bis zu der die Mikroemulsionsbildung
möglich
ist und keine Phasentrennung stattfindet. Die Lösung war homogen und optisch
transparent. Die Polymerisation fand 8 Stunden lang bei 30° in Gegenwart
von N2-Gas in einem thermostatischen Bad
unter kontinuierlichem Rühren
statt. Die eingekapseltes Arzneimittel enthaltenden Nanopartikel
aus Pyrrolidon werden gebildet. Das Lösungsmittel wurde in einem
Vakuum-Rotationsverdampfer verdampft, und die trockene Masse wurde
erneut in 5 ml Wasser suspendiert. Die errechnete Menge an 30%iger
CaCl2-Lösung
wurde dem Niederschlag tröpfchenweise
hinzugefügt,
um AOT als Calciumsalz Bis-ethylhexylsulphosuccinat
zu fällen.
Die zentrifugierte wässrige
Lösung
enthält
Nanopartikel und war homogen und nahezu transparent. Nach dem Zentrifugieren
enthält
der Calcium DEHSS-Kuchen eine gewisse Menge an Nanopartikeln, die
in demselben absorbiert sind. Er wurde in 10 ml n-Hexan gelöst, und
die Hexan-Lösung wurde
jedes Mal 2- bis 3-mal mit 1 ml Wasser gewaschen. Die phasengetrennte,
klare, wässrige
Schicht wurde entwässert
und zusammen mit dem ursprünglichen
Filtrat aufgefangen. Die gesamte wässrige Dispersion von Nanopartikeln
wurde dann für etwa
2 Stunden gegen Wasser dialysiert (12.000 Ausschlussmembran), und
die dialysierte Lösung
wurde sofort zu trockenem Pulver für die nachfolgende Verwendung
lyophilisiert. Die Probe sollte frei von AOT, Monomeren, Vernetzungsmittel
und Perdisulfat sein. Jede Spurenmenge von nichtumgesetzten Materialien
und Tensiden konnte durch HPLC detektiert werden. Perdisulfat wurde
chemisch unter Einsatz einer Stärke-Iodit-Lösung detektiert,
und es wurde die Gegenwart von AOT wie folgt getestet:
Zu einer
1 mg/ml-Lösung
aus trockenem Pulver wurde ein Tropfen Methylenblau-Farbe zugefügt. Die
Lösung wurde
dann intensiv mit 1 ml n-Hexan gemischt und zur Phasentrennung stehen
gelassen. Die Hexan-Schicht wurde dann spektrophotometrisch bei
580 nm getestet, um die Gegenwart des Farbstoffs festzustellen.
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Beispiel II: Die Nanopartikel aus Polyethylenglycolfumarat
wurden wie folgt hergestellt:
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5
g Polyethylenglycol 600, 0,9 g Fumarsäure und 1,22 mg Hydrochinon
wurden miteinander vermischt und 7-8 Stunden lang bei 190°C in einem
100 ml Dreihals-Kolben, der mit einem Thermometer, einem Rücklaufkondensator
und einem Stickstoffeinlass ausgestattet war, erhitzt. Bei Raumtemperatur
war das Produkt eine grünlich-gelbe
visköse
Flüssigkeit.
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In
40 ml einer 0,06 M AOT-Lösung
Hexan wurden die folgenden Komponenten zugegeben. 100 μl Polyethylenglycolfumarat
(0,186 g/ml), 10 μl
frisch destilliertes Vinylpyrrolidon, 10 μl N,N-Methylen-bis-acrylamid (0,049
g/ml), 10 μl
0,5%iges Eisenammonium-Sulfat, 20 μl 11,2%iges TMED und je nach
Fall 10 μl
oder 20 μl, fluoreszierendes
Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran) mit einem Molekulargewicht
von 16 KD (160 mg/ml). 0-200 μl
Puffer werden in Abhängigkeit
von der Tröpfchengröße zugegeben.
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Bei
der obigen Lösung
ließ man
N2-Gas 30 min lang durchströmen und
anschließend
wurden 10 μl 5%iges
Kaliumperdisulfat als Initiator unter kräftigem Rühren zugefügt. Anschließend ließ man das
Stickstoff-Gas noch einmal sechs Stunden lang bei 30°C durch die
Lösung
hindurchströmen.
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Die
Nanonpartikel wurden aus der wässrigen
Lösung
auf die gleiche Weise gewonnen wie vorstehend im Falle der Polyvinylpyrrolidon-Partikel
beschrieben.
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Beispiel III: Herstellung von Nanopartikeln
von Rinderserumalbumin-Glytaraldehyd:
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In
40 ml 0,06 m AOT in n-Hexan wurden 200 μl Rinderserumalbumin (100 mg/ml)
und 0-600 μl
Wasser in Abhängigkeit
von der gewünschten
Größe der micellaren
Tröpfchen
zugegeben. Die Mischung wurde intensiv bei Raumtemperatur gerührt, bis
eine transparente Mikroemulsion gebildet war. Zu der gut gerührten Lösung wurden
20 μl 5%iges
Glutaraldehyd zugegeben und das Rühren für eine weitere halbe Stunde
bis zur Bildung der Nanopartikel weitergeführt. Die wässrige Nanopartikel-Lösung wurde
aus der AOT-Lösung
nach der Methode hergestellt wie sie vorstehend im Fall von Polyvinylpyrrolidon
betrieben wurde.
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Die Nanopartikel wurden wie folgt charakterisiert:
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Die
Einschluss-Effektivität
der FITC-Dextran-Farbe in Polyvinylpyrrolidon-Nanopartikel wurde wie folgt bestimmt:
Der wässrige
Extrakt, beinhaltend die wiederholten Wäschen, wurde aufgefangen und
auf ein Volumen von 10 ml aufgefüllt.
Es wurden 500 μl
der Lösung
durch 100 KD-Membranfilter gefiltert und 2 μl Phosphatpuffer zugefügt. Das
Absorptionsvermögen
der Lösung
wurde bei 493 nm gemessen. In Phosphat-Puffer wurde das Absorptionsvermögen derselben
Konzentration von freiem FITC gemessen. Die Einschluss-Effektivität wurde
aus der Absorptionsdifferenz berechnet, und es stellte sich heraus,
dass die Werte, wie in der Tabelle gezeigt wird, im Bereich von
39-44% liegen, unabhängig
von der Größe der Nanopartikel.
| Größe der PVP-Partikel
(nm) | Einschluss-Effektivität (%) |
| 21 | 40 |
| 26 | 44 |
| 31 | 42 |
| 34 | 40 |
| 52 | 39 |
| 96 | 40 |
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Die
Größe der Nanopartikel
wurde durch Laser-Lichtstreuungsmessungen ermittelt.
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Dynamische
Laser-Lichtstreuungsmessungen zur Ermittlung der Größe der Nanopartikel
wurden unter Einsatz des Brookhaven 9000-Instruments mit dem BI200SM
Goniometer durchgeführt.
Ein mit Argonionengas gekühlter
Laser wurde als eine Lichtquelle bei 488 nm betrieben. Die Zeitabhängigkeit
der Intensitäts-Autokorrelationsfunktion
der gestreuten Intensität
wurde unter Einsatz eines 128 Kanäle aufweisenden digitalen Korrelators
abgeleitet. Die Intensitäts-Korrelationsdaten
wurden verarbeitet, indem das Verfahren der Kummulanten eingesetzt
wurde. Der translatorische Diffusionskoeffizient (σT) der im
wässrigen
Puffer dispergierten Partikel wurde durch einen nichtlinearen least
square fit der Korrelationskurve unter Verwendung der Zerfallsfunktion
erhalten. Von dem Wert des translatorischen Diffusionskoeffizienten
wurde der Mittelwert des hydrodynamischen Durchmessers Dh der streuenden
Partikel durch die Stokes-Einstein-Beziehung Dh = kT/3ΔησT berechnet,
wobei k die Boltzmann-Konstante und η die Viskosität des Lösungsmittels
bei einer absoluten Temperatur T ist.
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Die
Größe der mit
Arzneimittel beladenen Nanopartikel von Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycolfumarat
und Rinderserumalbumin wurden bestimmt und die repräsentativen
Spektren für
jeden Typ in 3(a) gezeigt. 3(a) (i bis iii) zeigen
- (i) Nanopartikel,
die aus Polyethylenglycolfumarat, enthaltend FITC-Dextran, hergestellt
sind
- (ii) Nanopartikel, die aus Polyvinylpyrrolidon, enthaltend FITC-Dextran,
hergestellt sind,
- (iii) Nanopartikel, die aus mit Glutaraldehyd vernetztem Rinderserumalbumin
hergestellt sind.
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3(b) zeigt die Variation in der Partkielgröße zusammen
mit der Größenänderung
der Mikroemulsionströpfchen.
Interessanterweise nimmt die Größe der Polyvinylpyrrolidon-Nanopartikel
exponentiell mit der Zunahme der Tröpfchengröße zu, wohingegen dieselben
im Fall von Rinderserumalbumin-Glutaraldehyd
mehr oder weniger konstant bleiben.
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Kinetische Studien zur in-vitro-Freisetzung:
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Eine
bekannte Menge von lyophilisierten, FITC-Dextran einkapselnden Nanopartikeln
wurde in 10 ml Phosphatpuffer-Salzlösung in 50 ml-Polypropylenröhrchen suspendiert.
Die Röhrchen
wurden in ein bei 37°C aufrechterhaltenes
Wasserbad platziert. In vorgegebenen Intervallen wurde ein Volumen
von 500 μl,
das von jedem Rohr abgenommen worden war, durch einen 100 KD-Filter
(Millipore UFP2THK24) hindurch passiert, der die Nanopartikel zurückhielt,
und die freie Farbe kam mit dem Filtrat heraus. Die Farbkonzentration
im Filtrat wurde spektrophotometrisch bestimmt.
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Die
Ergebnisse werden in 4 gezeigt, die die Freisetzung
von FITC-Dextran aus Polyethylenglycolfumarat-Partikeln bei unterschiedlicher
Beladung veranschaulicht, und wo die Kurve x1 eine Ladung von 6,4% und
Kurve x2 eine Ladung von 3,2% aus Farbe darstellt.
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Die
in-vivo-Antikörper-Antwort
durch das Injizieren von in Nanopartikeln eingekapseltem Antigen.
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Mäuse wurden
dreimal in einem Intervall von 7 Tagen von PVP-Nanopartikel, subkutan
infiziert, welche 300 μg
Aspergillus fumigatus-Antigen enthielten, das in den PVP-Nanopartikeln
eingeschlossen war, die in 100 μg
physiologischer Salzlösung
suspendiert wurden. Jede Gruppe enthielt fünf Tiere, von denen drei drei das
in den Nanopartikeln eingeschlossene Antigen, eins freies Antigen
(300 μg)
und die Kontrolle leere, in physiologischer Salzlösung suspendierte
Nanopartikel erhielten. Den Mäusen
wurde zu vorgegebenen Intervallen Blut abgenommen, und die Menge
des Aspergillus fumigatus-spezifischen-Antikörpers in den Mäusen wurde unter
Einsatz des indirekten ELISA-Tests bestimmt. Die Ergebnisse werden
in 5 gezeigt, die die spezifische Antigen-Antikörper-Antwort veranschaulicht.
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Die
spezifische Antikörper-Antwort
des Antigens von Aspergillus fumigatus, das mit verschiedenen Mengen
an Vernetzungsmittel in Polyvinylpyrrolidon-Nanopartikel eingeschlossen ist, mit
den Kurven x3, x4, x5 und x6, die jeweils 0%, 0,3%, 0,6% 1,2% des
Vernetzungsmittels haben.