ES2260078T3 - Sistema de administracion microbiana. - Google Patents

Sistema de administracion microbiana.

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ES2260078T3
ES2260078T3 ES00982485T ES00982485T ES2260078T3 ES 2260078 T3 ES2260078 T3 ES 2260078T3 ES 00982485 T ES00982485 T ES 00982485T ES 00982485 T ES00982485 T ES 00982485T ES 2260078 T3 ES2260078 T3 ES 2260078T3
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico y que comprende además un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en la que la composición farmacéutica reduce las respuestas inmunes alérgicas en sujetos que son alérgicos al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.

Description

Sistema de administración microbiana.
Información de prioridad
La presente solicitud reivindica prioridad bajo 35 U.S.C. 119(e) a la Solicitud de Patente Provisional de EEUU con el Número de Serie 60/195.035 titulada "Bacterial Polypeptide Delivery" presentada el 6 de marzo, 2000.
Solicitudes relacionadas
La presente invención está, de manera general, en el área de la administración controlada de antígenos para utilizarse en vacunación o en la inducción de tolerancia a alergenos y, en especial, se refiere a la administración celular de proteínas y polipéptidos. Esta solicitud está relacionada con U.S.S.N. 60/169.330 titulada "Controlled Delivery of Antigens" presentada el 6 de diciembre, 1999; U.S.S.N. 09/141.220 titulada "Methods and Reagents for Decreasing Clinical Reaction to Allergy" presentada el 27 de agosto, 1998; U.S.S.N. 09/455.294 titulada "Peptide Antigens" presentada el 6 de diciembre, 1999; U.S.S.N. 09/494.096 presentada el 28 de enero, 2000 titulada "Methods and Reagents for Decreasing Clinical Reaction to Allergy" de Bannon et al.; y U.S.S.N. 09/527.083 titulada "Immunostimulatory Nucleic Acids and Antigens" de Caplan presentada el 16 de marzo, 2000.
Antecedentes de la invención
Las reacciones alérgicas presentan problemas serios de salud pública en todo el mundo. Solamente la alergia al polen (rinitis alérgica o fiebre del heno) afecta a aproximadamente un 10-15% de la población y genera unos inmensos costes económicos. Por ejemplo, los informes estiman que la alergia al polen generó unos gastos directos e indirectos de \textdollar 1,8 billones en los Estados Unidos en 1990 (Fact Sheet, National Institute of Allergy and Infectious Diseases; McMenamin, Annals of Allergy 73:35, 1994). El asma, que puede desencadenarse por exposición a antígenos, también es un problema serio de salud pública y, al igual que las reacciones alérgicas anafilácticas, puede producir la muerte en casos extremos. Actualmente, el asma es el responsable de millones de visitas anuales a hospitales y su frecuencia está incrementándose. El único tratamiento disponible actualmente sirve para mitigar los síntomas, por ejemplo, para reducir la constricción de las vías aéreas. Más importante que los costes económicos asociados con el polen y otros alergenos inhalados (por ejemplo, mohos, ácaros del polvo, caspa de animales) es el riesgo de una reacción alérgica anafiláctica observada con alergenos tales como, alergenos alimenticios, venenos de insectos, medicamentos y látex.
Las reacciones alérgicas se producen cuando el sistema inmune de un individuo sobrerreacciona, o reacciona inapropiadamente, frente a un antígeno. Típicamente, no existe reacción alérgica la primera vez que un individuo se expone a un antígeno particular. Sin embargo, la respuesta inicial al antígeno es la que prepara al sistema para reacciones alérgicas posteriores. En especial, el antígeno es internalizado por las células presentadoras de antígenos (APC; por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) que degradan el antígeno y exponen fragmentos del antígeno a las células T. Las células T, en especial las células T "colaboradoras" CD4^{+}, responden secretando un grupo de citoquinas que tienen efectos en otras células del sistema inmune. El perfil de las citoquinas secretadas por las células T CD4^{+} determina si las exposiciones posteriores al antígeno inducirán reacciones alérgicas. Dos clases de células T CD4^{+} (Th1 y Th2) influyen en el tipo de respuesta inmune que se produce frente a un antígeno.
Las células Th2 pueden secretar varias citoquinas e interleuquinas incluyendo IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Un efecto de IL-4 es estimular la maduración de las células B que producen anticuerpos IgE específicos para el antígeno. Las respuestas alérgicas a alergenos se caracterizan por la producción de anticuerpos IgE específicos de antígeno que dependen de la ayuda de las células T CD4^{+} secretoras de IL-4. Estos anticuerpos IgE específicos de antígeno se unen a receptores de la superficie de los mastocitos, basófilos y eosinófilos, en donde actúan como desencadenantes del inicio de una reacción alérgica rápida en la siguiente exposición al antígeno. Cuando el individuo entra en contacto con el antígeno una segunda vez, el antígeno se une rápidamente a estas moléculas de IgE asociadas a la superficie. Típicamente, cada antígeno tiene más de un sitio de unión a IgE, de manera que las moléculas de IgE unidas a la superficie se entrecruzan rápidamente entre sí mediante sus asociaciones simultáneas (directas o indirectas) con el antígeno. Dicho entrecruzamiento induce la desgranulación de los mastocitos, lo que resulta en la liberación de histaminas y otras sustancias que desencadenan las reacciones alérgicas. Se sabe que los individuos con niveles altos de anticuerpos IgE son especialmente propensos a las alergias.
Los tratamientos actuales de las alergias implican intentos para "vacunar" a un individuo sensible a un alergeno particular mediante la inyección o tratamiento periódico del individuo con una suspensión cruda del alergeno crudo. El objetivo, mediante la administración controlada de cantidades conocidas de antígeno, es modular la respuesta de IgE que se produce en el individuo. Si la terapia tiene éxito, la respuesta de IgE del individuo disminuye, o incluso puede desaparecer. Sin embargo, la terapia requiere varios ciclos de vacunación durante un periodo de tiempo largo (3-5 años), y muy frecuentemente no produce los resultados deseados. Más aún, determinados individuos sufren reacciones anafilácticas a las vacunas, a pesar de su administración intencionada, controlada.
Vrtala et al. (Int Arch Allergy Immunol 1995; 107; 290-294) describe la expresión de alergenos recombinantes de polen de árboles (Bet v I y Bet V II) en cepas no patógenas de Salmonella y la inmunización de ratones con los alergenos resultantes.
Medaglini et al. (Proc Natl Acad Sci USA, vol. 92, páginas 6868-6872, julio 1995) describe cepas de Streptococcus gordonii que expresan una proteína de fusión que comprende el alergeno Ag 5.2 de veneno de avispón.
La Patente Internacional WO 99/25387 describe la utilización como vacunas de bacterias Salmonella atenuadas que expresan alergenos.
La Patente de EEUU 5.389.368 describe vacunas que comprenden bacterias vivas no virulentas. Las bacterias pueden expresar un gen heterólogo que codifica un antígeno de un microorganismo patógeno y la vacuna resultante puede inducir una respuesta inmune frente al patógeno.
La Patente Internacional WO 99/38978 describe un método para modificar alergenos con el fin de hacerlos menos alergénicos modificando los sitios de unión a IgE en los alergenos.
La Patente Internacional WO 98/44096 describe la utilización de células de Mycobacterium como vacunas recombinantes. Las células de Mycobacterium pueden comprender un vector que contiene un gen que codifica un alergeno.
La Patente Europea EP 0080806 describe vacunas que comprenden un microorganismo no patógeno que produce un alergeno.
Mekalanos (Adv. Exp. Med. Biol., 1992, vol. 327, páginas 43-50) describe varios tipos de vacunas bacterianas.
Hansen et al. (J. Immunol., 2000, vol. 164, páginas 223-230) describe la utilización de Listeria como un adyuvante en inmunoterapia.
La Patente Internacional WO 96/14876 describe la utilización de levaduras como vehículos para la administración de compuestos heterólogos que pueden utilizarse para modular la respuesta inmune de un organismo.
Eko et al. (Vaccine 1999, vol. 17, páginas 1643-1649) describe la utilización de fantasmas bacterianos como vehículos de antígenos.
Claramente, existe una necesidad de tratamientos y métodos preventivos para pacientes con alergias a alergenos que incitan respuestas alérgicas graves incluyendo anafilaxia.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona métodos y composiciones para modular la respuesta inmune en un sujeto. La presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir reacciones alérgicas no deseadas y reacciones alérgicas anafilácticas a alergenos en un sujeto. Las composiciones de la presente invención son útiles para administrar a sujetos microorganismos que expresan o producen alergenos de interés. Sin estar limitado al mecanismo de acción propuesto, después de la administración los microorganismos son internalizados por las células presentadoras de antígenos del sujeto en las que se liberan los antígenos expresados. Después de procesarse en el interior de las células presentadoras de antígenos y ser mostrados en la superficie celular, los antígenos procesados activan las respuestas inmunes mediadas por las células T. Por lo tanto, la utilización de microorganismos modificados genéticamente para expresar y administrar alergenos a un sujeto reduce la exposición de los alergenos a los anticuerpos IgE del sujeto, que da lugar a reacciones alérgicas y, posiblemente, a anafilaxia. Por lo tanto, la presente invención reduce el riego de anafilaxia durante la inmunoterapia. Además, los microorganismos pueden actuar como un adyuvante natural para incrementar respuestas inmunes deseadas de tipo Th1.
Según un primer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico y que comprende además un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en el que la composición farmacéutica reduce las respuestas inmunes alérgicas en sujetos que son alérgicos al alergeno proteico, en el que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en el que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
Según un aspecto más, la invención incluye la utilización de una composición que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico en la fabricación de un medicamento para tratar una alergia en un sujeto susceptible al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico y además comprende un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en la que el alergeno proteico está modificado para tener una capacidad reducida para unir o entrecruzar anticuerpos IgE, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
La invención también incluye la utilización de una composición que comprende microorganismos E. coli muertos que producen o han producido un alergeno proteico en la fabricación de un medicamento para tratar una alergia en un sujeto susceptible al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está modificado para tener una capacidad reducida para unir o entrecruzar anticuerpos IgE, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
En una realización preferida, los microorganismos se modifican genéticamente para expresar polipéptidos o proteínas seleccionados, y se utilizan como vehículos de administración según la presente invención. Dichos microorganismos son bacterias, concretamente E. coli.
En una realización especialmente preferida, las bacterias se utilizan como microorganismos para expresar y administrar proteínas alergénicas a individuos para tratar o prevenir respuestas alérgicas, incluyendo respuestas alérgicas anafilácticas, a los alergenos. Las bacterias gram-negativas, tal y como se describe en la presente memoria, pueden utilizarse en la presente invención como vehículos de administración. Los antígenos expresados por las bacterias pueden secretarse o no secretarse. La secreción de proteínas puede implicar la secreción al medio celular. En el caso de bacterias gram-negativas, la secreción puede implicar la secreción al periplasma. La secreción de polipéptidos puede facilitarse mediante péptidos señal de secreción. En determinadas realizaciones preferidas los microorganismos que expresan compuestos alergénicos pueden administrarse a sujetos en composiciones como microorganismos atenuados, microorganismos no patógenos, microorganismos no infecciosos, o como microorganismos muertos. Preferiblemente, los microorganismos muertos se matan sin degradar las propiedades antigénicas de los polipéptidos.
En otra realización preferida, los alergenos utilizados son alergenos que se encuentran en alimentos, venenos, medicamentos y productos basados en caucho. Los alergenos proteicos especialmente preferidos se encuentran en alimentos y venenos que incitan respuestas alérgicas anafilácticas en sujetos que son alérgicos a los alergenos. En la presente invención están incluidos los péptidos y polipéptidos cuyas secuencias de aminoácidos se encuentran en los alergenos proteicos naturales. También se incluyen en la presente invención los alergenos que tienen modificaciones que reducen la capacidad de los péptidos, polipéptidos y proteínas de unir y entrecruzar anticuerpos IgE. También están incluidos en la presente invención los alergenos no peptídicos que son producidos por microorganismos e incluyen, por ejemplo, antibióticos tal como la penicilina.
En otro aspecto de la invención, las composiciones para utilizarse en el tratamiento o prevención de respuestas alérgicas y alérgicas anafilácticas en un sujeto comprenden microorganismos que se han modificado artificialmente y, preferiblemente, mediante la introducción de uno o más ácidos nucleicos, para producir alergenos según la presente invención. En determinadas realizaciones preferidas, los alergenos producidos son péptidos, polipéptidos o proteínas codificados por el o los ácidos nucleicos introducidos.
Descripción breve de las figuras
Figura 1. Los experimentos diseñados para determinar la temperatura óptima para matar bacterias (E. coli) con calor se muestran en forma de gráfico. El número de colonias supervivientes en las alicuotas de las muestras se muestran como función de la temperatura (Celsius).
Figura 2. Determinación de las proteínas producidas por célula. La densidad óptica (D.O.) del alergeno Ara h 2 con etiqueta de HIS se determinó a partir de una transferencia inmunoelectroforética en la que se sometieron a electroforesis diferentes concentraciones de extracto de E. coli en geles SDS-PAGE. La D.O. del alergeno se utilizó para estimar la cantidad de proteína producida por ese extracto.
Figura 3. Resultados de análisis por ELISA de anticuerpos IgG específicos para Ara h 2 producidos en ratones después de inyectar E. coli que produce Ara h 2. IgG1 está a la izquierda e IgG2a está a la derecha.
Figura 4. Resultados de análisis por ELISA de anticuerpos IgG específicos para Ara h 3 producidos en ratones después de inyectar E. coli que produce Ara h 3. IgG1 está a la izquierda e IgG2a está a la derecha.
Definiciones
"Alergeno": Un "alergeno" es un antígeno que (i) incita una respuesta IgE en un individuo: y/o (ii) incita una reacción asmática (por ejemplo, inflamación crónica de las vías aéreas caracterizada por eosinofilia, hiperrespuesta de las vías aéreas, y producción excesiva de mucosidad), tanto si dicha reacción incluye una respuesta de IgE detectable como si no. Los alergenos preferidos para el propósito de la presente invención son alergenos peptídicos polipeptídicos y proteicos. Se presenta una lista ejemplar de alergenos proteicos en forma de Apéndice. Esta lista se adaptó de ftp://biobase.dk/pub/who-iuis/allergen.list (actualizada el 1 de marzo, 2000), que proporciona listas de alergenos conocidos. Otros alergenos preferidos son compuestos químicos tales como moléculas pequeñas que se producen por proteínas.
"Reacción alérgica": Una reacción alérgica es una respuesta clínica de un individuo a un antígeno. Los síntomas de las reacciones alérgicas pueden afectar los sistemas cutáneo (por ejemplo, urticaria, angioedema, prurito), respiratorio (por ejemplo, estornudo, tos, edema laríngeo, rinorrea, ojos acuosos/con prurito), gastrointestinal (por ejemplo, vómito, dolor abdominal, diarrea), y/o cardiovascular (si se produce una reacción sistémica). Para los propósitos de la presente invención, se considera que una reacción asmática es una forma de reacción alérgica.
"Antígeno anafiláctico": Un "antígeno anafiláctico" según la presente invención es un antígeno (o alergeno) que se sabe que presenta un riesgo de reacción anafiláctica en individuos alérgicos cuando se encuentra en su estado natural, bajo condiciones naturales. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, los pólenes y caspa o excreciones animales (por ejemplo, saliva, orina) no se consideran antígenos anafilácticos. Por otra parte, los antígenos alimenticios, antígenos de insectos, medicamentos y caucho (por ejemplo, látex) se consideran generalmente antígenos anafilácticos. Los antígenos alimenticios son antígenos anafilácticos especialmente preferidos para utilizarse en la práctica de la presente invención. Los antígenos anafilácticos especialmente interesantes son aquellos (por ejemplo, nueces, semillas, y pescado) frente a los que frecuentemente las reacciones son tan graves que producen riesgo de muerte.
"Anafilaxia" o "reacción anafiláctica", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una respuesta inmune caracterizada por la desgranulación de los mastocitos secundaria al entrecruzamiento inducido por el antígeno del receptor de IgE de alta afinidad en mastocitos y basófilos con la liberación posterior de mediadores y la producción de respuestas patológicas en órganos diana, por ejemplo, vías aéreas, piel, tracto digestivo y sistema cardiovascular. Como se sabe en la técnica, la gravedad de una reacción anafiláctica puede evaluarse, por ejemplo, ensayando reacciones cutáneas, hinchazón alrededor de los ojos y boca, y/o diarrea, seguido de reacciones respiratorias tales como estornudo y respiración dificultosa. Las reacciones anafilácticas más graves pueden resultar en la pérdida de consciencia y/o muerte.
"Antígeno": Un "antígeno" es (i) cualquier compuesto o composición que incita una respuesta inmune; y/o (ii) cualquier compuesto que se une a un receptor de células T (por ejemplo, cuando está presentado por una molécula MHC) o a un anticuerpo producido por una célula B. Los expertos en la técnica apreciarán que un antígeno puede ser un conjunto de diferentes compuestos químicos (por ejemplo, un extracto o preparación cruda) o un único compuesto (por ejemplo, una proteína). Los antígenos preferidos son antígenos peptídicos, polipeptídicos o proteicos.
"Células presentadoras de antígenos": Las "células presentadoras de antígenos" o "APC" incluyen APC conocidas tales como células de Langerhans, células veladas de conductos linfáticos aferentes, células dendríticas y células interdigitantes de órganos linfoides. El término también incluye células mononucleadas tales como linfocitos y macrófagos que internalizan polipéptidos y proteínas según la invención.
"Atenuación": La "atenuación" de microorganismos tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a la manipulación de los microorganismos de manera que los microorganismos no inducen reacciones tóxicas significativas en individuos o animales de ensayo de laboratorio. Las manipulaciones incluyen métodos genéticos y son muy conocidas en la técnica.
"Sitio de unión a IgE": Un "sitio de unión a IgE" es una región de un antígeno que es reconocida por una molécula IgE anti-antígeno. Dicha región es necesaria y/o suficiente para resultar en (i) unión del antígeno a IgE; (ii) entrecruzamiento de IgE anti-antígeno; (iii) desgranulación de mastocitos que contienen unida en su superficie IgE anti-antígeno; y/o (iv) desarrollo de síntomas alérgicos (por ejemplo, liberación de histamina). En general, los sitios de unión a IgE se definen para un antígeno o fragmento de antígeno particular exponiendo ese antígeno o fragmento a suero de individuos alérgicos (preferiblemente de la especie a la que van a administrarse las composiciones de la invención). Debe apreciarse que los individuos diferentes pueden generar IgE que reconozcan diferentes epítopos en el mismo antígeno. Por lo tanto, típicamente es deseable exponer el antígeno o fragmento a una mezcla representativa de muestras de suero. Por ejemplo, cuando se desea identificar en un determinado antígeno o fragmento los sitios reconocidos por IgE humana, se mezcla suero preferiblemente de al menos 5-10, preferiblemente al menos 15, individuos con alergia demostrada al antígeno. Los expertos en la técnica conocerán la estrategia útil de mezclado en otros contextos.
"Agentes inductores inmunológicos": El término "agentes inductores inmunológicos" se utiliza en la presente memoria como agentes que estimulan la expresión de citoquinas que estimulan Th1 por las células T e incluyen factores tales como CD40, ligando de CD40, oligonucleótidos que contienen restos CpG, TNF, y extractos microbianos tales como preparaciones de Staphylococcus aureus, Listeria matadas con calor y toxina del cólera modificada.
"Promotor inducible": El término "promotor inducible", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa un sitio promotor que se activa directamente en presencia o ausencia de un agente químico o indirectamente por un estímulo medioambiental tal como cambios en la temperatura. Un promotor es la región de ADN a la que se une la enzima ARN polimerasa e inicia el proceso de la transcripción génica.
"Mastocito": Como resultará evidente en el contexto, el término "mastocito" se utiliza frecuentemente en la presente memoria para referirse a uno o más entre mastocitos, basófilos, y otras células que tienen receptores de IgE, que cuando se activan por entrecruzamiento de moléculas de IgE unidas, liberan histaminas, vasodilatadores y/o otros mediadores de las respuestas alérgicas.
"Microorganismos": Los "microorganismos" tal y como se utiliza en la presente memoria son células, bacterias, hongos, virus, algas y protozoos. Los microorganismos preferidos pueden estar manipulados genéticamente para producir uno o varios polipéptidos deseados.
"Péptido": Según la presente invención, un "péptido" comprende una cadena de al menos tres aminoáci-
dos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Los péptidos de la invención sólo contienen preferiblemente aminoácidos naturales, aunque alternativamente pueden utilizarse aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se
encuentran en la naturaleza pero que pueden incorporarse en una cadena polipeptídica; véase, por ejemplo,
http://www.cco.caltech.edu/\simdadgrp/Unnatstruct.gif, que muestra estructuras de aminoácidos no naturales que se han incorporado con éxito a canales iónicos funcionales) y/o análogos de aminoácidos que se conocen en la técnica. También puede modificarse uno o más aminoácidos en un péptido de la invención, por ejemplo, mediante la adición de un resto químico tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo de ácido graso, un ligante para conjugación, funcionalización u otra modificación, etc.
Un péptido o polipéptido se obtiene a partir de una proteína si la secuencia de aminoácidos del péptido o polipéptido se encuentra en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Las secuencias son preferiblemente idénticas aunque pueden tener una homología de secuencia entre aproximadamente el 80 y el 100%. Los restos de aminoácidos pueden estar reemplazados por otros restos de aminoácidos con propiedades físicas similares tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, estructuras aromáticas y polaridad.
"Unión reducida a IgE": Se considera que una composición o antígeno de la invención tiene una "unión reducida a IgE" si demuestra un nivel de interacción con IgE menor cuando se compara con el antígeno sin modificar en cualquier ensayo disponible. Por ejemplo, se considera que un antígeno modificado tiene una unión a IgE reducida si (i) su afinidad por IgE anti-antígeno (ensayada, por ejemplo, utilizando estudios de unión directos o estudios de competición indirectos) está reducida al menos aproximadamente 2-5 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 10, 20, 50 ó 100 veces si se compara con la del antígeno intacto; (ii) la capacidad del antígeno modificado para producir el entrecruzamiento de IgE anti-antígeno está reducida al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 5, 10, 20, 50 ó 100 veces si se compara con la del antígeno intacto; (iii) los mastocitos que contienen IgE anti-antígeno unida a su superficie se desgranulan menos (al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 3, 5, 10, 20, 50 ó 100 veces menos) cuando entran en contacto con el antígeno modificado si se compara con el antígeno no modificado; y/o (iv) los individuos que entran en contacto con el antígeno modificado desarrollan menos (al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 3, 5, 10, 20, 50 ó 100 veces menos) síntomas alérgicos, o los síntomas desarrollados se reducen en intensidad cuando se exponen a antígenos modificados si se compara con los antígenos no modificados.
"Señales de secreción": Una señal de secreción es cualquier secuencia de aminoácidos que cuando se conjuga con un péptido, polipéptido o proteína facilita el transporte de las proteínas de fusión conjugadas a través de las membranas celulares. En las utilizaciones de señales de secreción en microorganismos, el transporte de las proteínas de fusión implica atravesar una membrana interna hacia el periplasma. Se prefiere que las señales de secreción también faciliten el transporte de las proteínas de fusión a través de una membrana externa hacia un medio extracelular. La secreción de proteínas al medio extracelular se considera "excreción".
"Mastocito sensibilizado": Un mastocito "sensibilizado" es un mastocito que tiene moléculas de IgE específicas para un antígeno unidas en la superficie. El término es necesariamente específico de antígeno. Es decir, en cualquier momento, un mastocito particular estará "sensibilizado" frente a determinados antígenos (aquellos que son reconocidos por la IgE de su superficie) pero no estará sensibilizado frente a otros antígenos.
"Moléculas pequeñas": Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto sintetizado en el laboratorio o que se encuentra en la naturaleza. Típicamente, una molécula pequeña es orgánica y se caracteriza porque contiene varios enlaces carbono-carbono, y tiene un peso molecular de menos de 1.500 daltons, aunque no se pretende que esta caracterización sea limitativa para los propósitos de la presente invención. Los ejemplos de "moléculas pequeñas" que son alergenos incluyen, sin limitación, penicilina, alcoholes y aspirina. Las moléculas pequeñas no orgánicas alergénicas incluyen sulfitos presentes, por ejemplo, en el vino.
"Individuo susceptible": según la presente invención una persona es susceptible a una reacción alérgica si (i) esta persona ha mostrado alguna vez síntomas de alergia después de la exposición a un determinado antígeno; (ii) miembros de la familia genética de esa persona han mostrado síntomas de alergia frente al alergeno, especialmente si se sabe que la alergia tiene un componente genético; y/o (iii) se han encontrado en el individuo IgE específicas de antígeno, bien en suero o en mastocitos.
"Respuesta Th1" y "respuesta Th2": Determinados péptidos, polipéptidos, proteínas y composiciones preferidas de la presente invención se caracterizan por su capacidad para suprimir una respuesta Th2 y/o estimular una respuesta Th1 preferentemente si se compara con su capacidad de estimular una respuesta Th2. Las respuestas Th1 y Th2 son respuestas del sistema inmune alternativas conocidas que se caracterizan por la producción de diferentes grupos de citoquinas y/o cofactores. Por ejemplo, las respuestas Th1 están asociadas generalmente con la producción de citoquinas tales como IL-1\beta, IL-2, IL-12, IL-18, IFN\alpha, IFN\gamma, TNF\beta, etc; las respuestas Th2 están asociadas generalmente con la producción de citoquinas tales como IL-4, IL-5, IL-10, etc. La magnitud de la supresión o estimulación del subconjunto de células T puede determinarse mediante cualquier medio disponible incluyendo, por ejemplo, determinación intra-citoplásmica de citoquinas. En las realizaciones preferidas de la invención, la supresión de Th2 se ensaya, por ejemplo, mediante la cuantificación de IL-4, IL-5, y/o IL-13 en sobrenadantes de cultivos de células T estimuladas o evaluando en las células T (por ejemplo, mediante tinción de proteínas o análisis de ARNm) IL-4, IL-5, y/o IL-13 intra-citoplásmicas; la estimulación Th1 se ensaya, por ejemplo, mediante la cuantificación de IFN\alpha, IFN\gamma, IL-2, IL-12 y/o IL-18 en sobrenadantes de cultivos de células T activadas o evaluando los niveles intra-citoplásmicos de estas citoquinas.
Descripción de determinadas realizaciones preferidas
La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la respuesta inmune en un sujeto. Es un aspecto de la presente invención que las respuestas inmunes alérgicas no deseadas a antígenos en un sujeto se traten o prevengan mediante la administración de células, viriones, o esporas ("microorganismos") modificadas que expresan alergenos de interés. Mediante la utilización de microorganismos modificados genéticamente para expresar y administrar alergenos se reduce o elimina la exposición de los alergenos a la respuesta inmune alérgica del sujeto mediada por IgE. Sin limitarse a los mecanismos propuestos, se espera que los microorganismos modificados de la presente invención sean internalizados por las células presentadoras de antígenos (APC) tales como macrófagos y células dendríticas sin exponer los alergenos a los anticuerpos IgE. Una vez en el interior de las APC, los alergenos expresados se liberan mediante la lisis de los microorganismos o la secreción del antígeno por los microorganismos. Los alergenos son procesados, por ejemplo, mediante digestión parcial por las APC, y expuestos en la superficie celular.
Una vez que los antígenos procesados se exponen en la superficie celular, la activación de la respuesta de las células T citotóxicas y la respuesta de las células T colaboradoras estimula la respuesta celular inmune y la respuesta de las células B mediada por Th1 frente a los alergenos proteicos. Además, los antígenos procesados tienen una capacidad reducida (o carecen de ella) para unir y entrecruzar anticuerpos IgE localizados en la superficie de los mastocitos y basófilos que da lugar a la liberación de histaminas y otros vasodilatadores responsables de las respuestas alérgicas y anafilácticas en algunos casos mortales.
Microorganismos anfitriones
Según la presente invención puede utilizarse como vehículo de administración cualquier microorganismo capaz de expresar alergenos (por ejemplo, mediante la expresión de alergenos polipeptídicos o proteicos, o mediante la expresión de enzimas polipeptídicas o proteicas implicadas en la síntesis de moléculas pequeñas alergénicas). Dichos microorganismos incluyen, pero no están limitados a, bacterias, virus, hongos (incluyendo levaduras), algas, y protozoos. Generalmente, los microorganismos son organismos de célula única, espora única o virión único. Además, se incluyen en el alcance de la presente invención las células de organismos multi-celulares que han sido modificadas para producir un polipéptido de interés. Se prefieren los microorganismos que pueden manipularse genéticamente para producir un polipéptido deseado. (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, Inc. 1999). La manipulación genética incluye mutación del genoma del anfitrión, inserción de material genético en el genoma del anfitrión, deleción de material genético del genoma del anfitrión, transformación del anfitrión con material genético extracromosómico, transformación con plásmidos lineales, transformación con plásmidos circulares, inserción de material genético en el anfitrión (por ejemplo, inyección de ARNm), inserción de transposones, y modificación química de material genético. Los métodos para construir ácidos nucleicos (incluyendo un gen que se quiere expresar) y para introducir dichos ácidos nucleicos en un sistema de expresión para expresar la proteína codificada son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
La utilización de microorganismos tales como bacterias y levaduras para administrar alergenos según la presente invención, ofrece muchas ventajas sobre la administración de alergenos que no están encapsulados en el interior de microorganismos para inmunoterapia. Generalmente, se sabe que los microorganismos tales como bacterias, actúan como adyuvantes (para una revisión, véase, por ejemplo, Freytag et al. Curr Top Microbiol Immunol 236:215-36, 1999). Por lo tanto, la utilización de microorganismos para administrar alergenos a sujetos, y APC a sujetos, proporciona una protección al alergeno frente a respuestas alérgicas mediadas por IgE y también proporciona un efecto adyuvante que incita una respuesta inmune tipo Th1 en un individuo susceptible a respuestas alérgicas. Además, la utilización de microorganismos no patógenos, no infecciosos, atenuados y/o muertos reduce o elimina la toxicidad que puede estar asociada a los vehículos de administración de alergenos.
En una realización preferida, se utilizan bacterias como microorganismos de administración de proteínas. Generalmente, las bacterias se clasifican como gram-negativas o gram-positivas dependiendo de la estructura de las paredes celulares. Los expertos en la técnica son capaces de identificar bacterias gram-negativas y gram-positivas que pueden utilizarse para expresar proteínas según la presente invención. Los ejemplos no limitativos de géneros y especies de bacterias gram-negativas incluyen Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Listeria, Legionella, Shigella, Yersinia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Plesiomonas y Aeromonas. Los ejemplos no limitativos de géneros y especies de bacterias gram-positivas que pueden utilizarse en la presente invención incluyen Bacillus subtilis, Sporolactobacillus, Clostridium, Arthrobacter, Micrococcus, Mycobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus y Lactococcus.
Se conocen los sistemas bacterianos gram-negativos para utilizarse como vehículos de administración y pueden utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, E. coli es una bacteria muy estudiada, y son muy conocidos los métodos de expresión de proteínas en E. coli. La mayoría de las cepas de E. coli tienen la ventaja de no ser patógenas debido a que E. coli se encuentra de forma natural en el intestino. Por lo tanto, en la presente invención se prefiere E. coli como vehículo de administración. Además, Calderwood et al. (Patente de EEUU 5.747.028) utilizan Vibrio cholerae como vehículo de administración para la producción de antígenos para utilizarse como una vacuna viva frente a organismos infecciosos. Miller y Mekalanos (Patente de EEUU 5.731.196) utilizan Salmonella como vehículo de administración para la producción de antígenos para utilizarse como una vacuna viva frente a organismos infecciosos. Hess et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1458-1463, 1996) utilizan Salmonella recombinante atenuada que secreta determinantes antigénicos de Listeria como una vacuna viva para proteger frente a la listeriosis. Donner et al. (WO 98/50067) utilizan Salmonella typhimurium atenuada como un anfitrión gram-negativo para la secreción de polipéptidos para controlar la fertilidad y también muestran que otras cepas gram-negativas atenuadas incluyendo Yersinia pueden utilizarse para expresar y secretar dichos polipéptidos.
También se han estudiado las bacterias gram-positivas como vehículos de administración de proteínas para modular una respuesta inmune en un sujeto. La Patente Internacional WO 97/14806 describe la utilización de Lactococcus para administrar polipéptidos a un cuerpo con el fin de incrementar la respuesta inmune a los polipéptidos. Sin embargo, la Patente Internacional WO 97/14806 no muestra la utilización de Lactococcus para tratar pacientes con alergias alimenticias y alergias a venenos que pueden resultar en anafilaxia.
En otra realización preferida, se utilizan levaduras como microorganismos para administrar proteínas. Se sabe que las levaduras son susceptibles de ser manipuladas genéticamente para expresar una proteína o unas proteínas elegidas (Ausubel et al. supra). Además, en general, la mayoría de las levaduras no son patógenas. Sin limitación a estas especies, dos especies bien caracterizadas de levaduras son la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, y la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe. Más aún, se ha estudiado la administración de levaduras que expresan antígenos proteicos para alterar una respuesta inmune. Duke et al. (Patente de EEUU No. 5.830.463; "Duke") describen la utilización de levaduras para expresar proteínas después de la administración de las levaduras a un mamífero. Sin embargo, Duke no muestra la utilización de levaduras para tratar pacientes con alergias alimenticias y alergias a venenos que pueden resultar en anafilaxia.
Los microorganismos de la presente invención pueden administrase a un sujeto como microorganismos vivos o muertos. Preferiblemente, si los microorganismos se administran como microorganismos vivos, son microorganismos no patógenos o patógenos atenuados. Para las aplicaciones de la invención en las que se administran microorganismos vivos a individuos, preferiblemente los microorganismos están atenuados y/o se administran en materiales de encapsulación adecuados y/o como composiciones farmacéuticas tales como vacunas para disminuir la respuesta inmune de un individuo al microorganismo y/o compuestos alergénicos. Generalmente, la atenuación implica modificar genéticamente el microorganismo infeccioso patógeno para reducir o eliminar la capacidad infecciosa del microorganismo. Preferiblemente, el microorganismo está atenuado de manera que un individuo inoculado con el microorganismo no sufre ningún efecto citotóxico como consecuencia de la presencia del microorganismo. Los microorganismos atenuados especialmente preferidos son patógenos infecciosos intracelulares que son fagocitados por las células presentadoras de antígenos en individuos que se exponen al microorganismo. Los ejemplos de microorganismos que son patógenos intracelulares incluyen Salmonella, Mycobacterium, Leishmania, Legionella, Listeria y Shigella.
Los microorganismos de la presente invención pueden administrarse a sujetos después de matar a los microorganismos. Puede utilizarse cualquier método para matar a los microorganismos que no altere mucho la antigenicidad de los polipéptidos expresados. Los métodos para matar microorganismos incluyen, pero no están limitados a, calor, antibióticos, compuestos químicos tales como yodo, lejía, ozono, y alcoholes, radiactividad (es decir, irradiación), luz UV, electricidad, y presión. Los métodos preferidos para matar microorganismos son reproducibles y matan al menos al 99% de los microorganismos. Es especialmente preferida la utilización de calor por encima de 50 grados Celsius durante un periodo de tiempo que mata a más de un 99% de las células y preferiblemente al 100% de las células.
Sistemas inducibles
En otra realización preferida, la expresión de alergenos por microorganismos de la invención está regulada de manera que la síntesis se produce en un momento controlado después de que el microorganismo vivo haya sido administrado a un individuo. Preferiblemente, la inducción de la síntesis de proteínas está regulada de manera que la activación se produce después de que el microorganismo o microorganismos hayan sido internalizados por las células presentadoras de antígenos (APC) y hayan sido fagocitados en el endosoma. Un resultado deseable de esta regulación es que la producción del alergeno de interés se produzca en el interior de las APC y que, por lo tanto, se reduzca o elimine la exposición del alergeno a las moléculas de IgE unidas a la superficie de mastocitos o basófilos que liberan histamina. Esto reduce o elimina el riesgo de anafilaxia durante la administración de microorganismos que producen antígenos anafilácticos.
Según la presente invención puede utilizarse cualquier método para controlar la síntesis de proteínas en el microorganismo. Preferiblemente, el método para controlar la síntesis de proteínas utiliza un promotor inducible unido de manera operativa al gen de interés (por ejemplo, un gen que codifica un péptido señal y un antígeno proteico). Se conocen muchos sistemas para controlar la transcripción de un gen utilizando un promotor inducible (Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons. Nueva York, 1999). Generalmente, los sistemas inducibles utilizan la activación del gen o la desrrepresión del gen. Se prefiere que la presente invención utilice la activación de un gen para inducir la transcripción. Sin embargo, también pueden utilizarse en la presente invención los sistemas inducibles que utilizan la desrrepresión de un gen. Se prefieren los sistemas que utilizan la activación porque estos sistemas son capaces de controlar firmemente la inactivación (y, por lo tanto, el nivel basal de síntesis) ya que la desrrepresión puede resultar en niveles bajos de transcripción si la desrrepresión no es firme.
Los métodos para inducir la transcripción incluyen, pero no están limitados a, inducción mediante la presencia o ausencia de un agente químico, inducción utilizando un promotor inducible por deficiencia de nutrientes, inducción utilizando un promotor inducible por deficiencia de fosfato e inducción utilizando un promotor inducible sensible a la temperatura. Un sistema especialmente preferido para regular la expresión génica utiliza un sistema de expresión controlable por tetraciclina. Los sistemas que utilizan un sistema de expresión controlable por tetraciclina están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA).
Otro sistema especialmente preferido para regular la expresión génica utiliza un sistema de expresión inducible por ecdisona que también está disponible comercialmente (Invitrogen, Carlsbad CA). El sistema de expresión inducible por ecdisona está basado en la capacidad de la ecdisona, que es una hormona de insectos, para activar la expresión génica mediante su unión al receptor de la ecdisona. El sistema de expresión utiliza una proteína heteróloga modificada que contiene el receptor de la ecdisona, un dominio de transactivación viral (de VP16) y el receptor retinoide X obtenido a partir de células de mamífero para unir un elemento de la respuesta de ecdisona modificado en presencia de un ligando tal como ecdisona o un análogo (por ejemplo, muristerona A, ponasterona A).
Se prefiere que los sistemas inducibles para utilizarse en la presente invención utilicen agentes inductores que no sean tóxicos para las células de mamíferos incluyendo los seres humanos. Además, se prefiere que los agentes inductores de la transcripción atraviesen las membranas celulares. Más específicamente, para la activación de la síntesis de proteínas en microorganismos después de la fagocitosis por APC, los agentes inductores de la transcripción deben ser capaces de pasar a través de las membranas celulares de las APC y de las membranas celulares del microorganismo para activar la expresión de genes que codifican alergenos proteicos según la presente invención. Debido a que tanto la tetraciclina como la ecdisona son capaces de pasar a través de las membranas celulares y no son tóxicas, los sistemas inducibles por tetraciclina y los sistemas inducibles por ecdisona son muy adecuados para utilizarse en la presente invención. Sin embargo, la utilización de sistemas inducibles en la presente invención no está limitada a estos sistemas.
También se prefiere que las bacterias que no han sido fagocitadas estén muertas antes de la inducción de los genes que expresan los alergenos polipeptídicos de interés. Un método preferido para matar bacterias es la utilización de antibióticos que no atraviesan las membranas celulares de mamíferos de manera que sólo se mate a las bacterias que no han sido fagocitadas. La utilización de antibióticos, según la presente realización, reduce o elimina la producción de polipéptidos por las bacterias fuera de las células presentadoras de antígenos. Es importante reducir o eliminar la exposición de las bacterias que producen alergenos al sistema inmune, especialmente de las bacterias que secretan polipéptidos, que podrían incitar una reacción anafiláctica potencialmente mortal en un individuo. Los expertos en la técnica conocen los antibióticos que pueden utilizarse. Dichos antibióticos incluyen, pero no están limitados a, penicilina, ampicilina, cefalosporina, griseofulvina, bacitracina, polimixina b, anfotericina b, eritromicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, vancomicina, gentamicina y rifamicina.
Señales de secreción
En otra realización de la presente invención, los alergenos expresados (y/o moléculas inmunomoduladoras, tales como citoquinas; véase más adelante) son secretados por los microorganismos. Preferiblemente, la secreción de los alergenos se produce en el interior de una célula de mamífero para reducir o eliminar la exposición de los alergenos a la respuesta inmune alérgica de un sujeto. La secreción de los polipéptidos incluye la secreción al medio extracelular y la secreción de polipéptidos al periplasma de microorganismos tales como bacterias gram-negativas y levaduras. Las ventajas de secretar alergenos al periplasma incluyen una salida reducida de los alergenos antes de la fagocitosis del microorganismo. Esta ventaja se aplica principalmente a los sistemas no inducibles. Las ventajas de secretar alergenos al medio extracelular en sistemas inducibles incluyen maximizar la cantidad de alergenos disponible para el procesamiento por las células presentadoras de antígenos después de la fagocitosis de los microorganismos de la presente invención.
Para expresar los polipéptidos secretados en bacterias, pueden utilizarse diferentes señales de secreción bacterianas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el proceso dependiente de Sec en E. coli es uno muy conocido (para una revisión, véase Driessen et al. Curr. Opin. Microbiology 1:216-22). Además, el péptido señal OmpA de E. coli ha sido descrito por Wong y Sutherland (Patente de EEUU 5.223.407). Las proteínas de fusión que contienen cualquiera de estos péptidos señal de secreción no son secretadas completamente por las bacterias, sino que son transportadas a través de la membrana interna de las bacterias gram-negativas al periplasma. Estas señales de secreción pueden utilizarse en la presente invención para transportar polipéptidos alergénicos o inmunomoduladores al periplasma de las bacterias. Después de la administración a un individuo de las bacterias sometidas a ingeniería genética y de la fagocitosis posterior por las APC, los polipéptidos alergénicos o inmunomoduladores en el periplasma son liberados después de la degradación de la membrana externa por enzimas en el endosoma de las APC. Preferiblemente, las bacterias sintetizan y secretan los polipéptidos al periplasma y se matan, preferiblemente con calor, antes de la administración. Sin embargo, se admite que pueden utilizarse bacterias atenuadas para secretar los alergenos de la invención al periplasma y administrarse a individuos.
En otra realización preferida de proteínas o polipéptidos secretados, las proteínas de fusión que contienen secuencias de señales de secreción y secuencias alergénicas o inmunomoduladoras se secretan completamente al medio extracelular por un microorganismo antes de la síntesis de la proteína. Dichas señales de secreción incluyen las encontradas en hemolisina y listeriolisina. En una realización especialmente preferida, se utiliza el complejo de hemolisina de E. coli para transportar polipéptidos alergénicos o inmunomoduladores a través de la membrana interna y externa de un microorganismo (por ejemplo, E. coli, Salmonella, Shigella, Vibrio, Yersinia, Citrobacter, Serratia, Pseudomonas) al medio extracelular (Spreng et al. Mol. Microbiol. 31:1589-1601, 1999, y referencias en ésta). Se ha mostrado que la fusión de HlyAs a proteínas y polipéptidos resulta en la secreción de estas proteínas de fusión utilizando el sistema de secreción de la hemolisina (Blight y Holland, Trends Biotechnol. Nov. 1994; 12(11):450-5.; Gentschev et al., Behring Inst Mitt. Dic 1994; (95):57-66).
La proteína hemolisina (HlyA) contiene una señal de transporte en el extremo C-terminal (HlyAs) que tiene una longitud aproximada de 50-60 aminoácidos (Hess et al., Mol. Gen. Genet. Nov 1990; 224(2):201-8; Jarchau et al., Mol. Gen. Genet. 17 Oct 1994; 245(1):53-60). La proteína HlyA se secreta a través de las membranas celulares interna y externa mediante el sistema de secreción de la hemolisina. Este complejo contiene tres proteínas de membrana. Dos de estas proteínas, HlyB y HlyD, están localizadas en la membrana interna, y la tercera TolC está localizada en la membrana externa. Los genes que codifican estas proteínas forman parte del operón de la hemolisina que consiste en cuatro genes hlyC, hlyA, hlyB y hlyD (Wagner et al., J. Bacteriol. Abr 1983; 154(1):200-10; Gentschev. Gene. 7 Nov 1996; 179(1):133-40).
En una realización preferida para utilizar el sistema de secreción Hly, se utilizan plásmidos de ADN (vectores) para expresar las proteínas de fusión que contienen el péptido señal HlyAs y polipéptidos alergénicos o inmunomoduladores. Los genes que codifican el complejo de transporte (hlyB y hlyD) están codificados por el mismo vector. Se admite que pueden utilizarse múltiples vectores para codificar y expresar estos genes, o que las secuencias que codifican estos genes pueden insertarse en el genoma del anfitrión para su expresión. Preferiblemente, un vector único contiene el operón completo de la hemolisina incluyendo el promotor específico hly y un regulador de tipo amplificador hlyR; el gen HlyA en el que sólo está presente la secuencia de polipéptido mínima necesaria para transportar una proteína de fusión; y el antígeno de interés. La proteína TolC se produce generalmente por el sistema de anfitrión de E. coli. Sin embargo, en los sistemas en los que el ADN de tolc no está codificado por un organismo anfitrión, tolC puede estar codificado por un vector.
En una realización especialmente preferida, se utiliza el plásmido de secreción pMOhly1 descrito en WO 98/50067 ("Donner") para expresar las proteínas de fusión que contienen las secuencias de la señal de secreción y los polipéptidos relacionados con la inducción de anafilaxia en individuos. El vector de secreción pMOhly1 contiene el operón completo de la hemolisina incluyendo el promotor específico hly y un regulador de tipo amplificador hlyR. Una gran parte del gen hlyA ha sido delecionado de manera que HlyA codifica sólo los 34 aminoácidos del extremo amino terminal y 61 aminoácidos del extremo carboxilo terminal (HlyA_{s}). Un único sitio de restricción enzimático Nsi entre los restos del extremo amino terminal y carboxilo terminal de HlyA facilita la inserción de genes o fragmentos de genes heterólogos en el marco de lectura de HlyA_{s}. En este vector de secreción pMOhly1 puede insertarse la información genética de antígenos de un tamaño de 10-1.000 aminoácidos, lo que facilita la secreción de estos antígenos en Salmonella atenuada o en otras cepas de inoculación gram-negativas atenuadas (por ejemplo, E. coli, Vibrio cholera, Yersinia enterocolitica). A diferencia de otros sistemas de secreción, la secreción de proteínas de fusión utilizando un único plásmido está descrita por Donner. Una ventaja del sistema de secreción de hemolisina en comparación con sistemas de transporte convencionales es el mayor tamaño de las proteínas de fusión sintetizadas y secretadas según los métodos mostrados en Donner. Los sistemas de secreción convencionales para la presentación de antígenos sólo son capaces de secretar péptidos relativamente cortos a la parte exterior de la célula bacteriana (Cardenas y Clements, Clin Microbiol Rev. Jul 1992; 5(3):328-42).
Antígenos y alergenos
En general, puede producirse cualquier alergeno por microorganismos según la presente invención. Los alergenos preferidos se encuentran en determinados alimentos, venenos, medicamentos o caucho y son capaces de incitar respuestas alérgicas y, en particular, respuestas alérgicas anafilácticas en un individuo. Los alergenos especialmente preferidos son alergenos proteicos o polipeptídicos.
En una realización preferida, los microorganismos de la presente invención producen proteínas alergénicas que incitan alergias, posiblemente anafilaxia, y se encuentran en alimentos, venenos, medicamentos y productos basados en caucho. Son especialmente preferidas las proteínas alergénicas que inducen anafilaxia, tales como diferentes alergenos proteicos que se encuentran en alimentos (cacahuetes, leche, huevos, trigo), venenos de insectos (es decir, abejas, reptiles), medicamentos y látex. Los ejemplos no limitativos de alergenos proteicos que se encuentran en alimentos incluyen las proteínas encontradas en nueces (por ejemplo, cacahuetes, almendras, pacana, anacardo, avellana, pistachos, piñón, nuez de Brasil), marisco (por ejemplo, gambas, cangrejos, langosta, almejas), fruta (por ejemplo, ciruelas, melocotones, nectarinas; Ann Allergy Asthma Immunol 7(6):504-8 (1996); cerezas, Allergy 51(10):756-7 (1996)), semillas (sésamo, amapola, mostaza), y productos de soja y de granja (por ejemplo, huevos, leche).
Algunos alergenos proteicos que se encuentran en las nueces están relacionados con alergias a legumbres y pueden utilizarse en lugar de las proteínas de las legumbres (por ejemplo, cacahuetes, habas, lentejas; Ann Allergy Asthma Immunol 77(6):480-2 (1996). También pueden utilizarse los antígenos proteicos que se encuentran en alergias a alimentos relacionadas con el polen (por ejemplo, polen de abedul relacionado con alergias a manzanas). Otros alergenos proteicos que se encuentran en alimentos incluyen los que se encuentran en el ajo joven (Allergy 54(6):626-9 (1999), y para los niños alérgicos a ácaros del polvo, los alergenos que se encuentran en los caracoles (Arch Pediatr 4(8):767-9 (1997)). Se sabe que los alergenos proteicos del trigo producen alergias inducidas por el ejercicio (J Allergy Clin Immunol Mayo 1999; 103(5 Pt 1):912-7).
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Se sabe que los aguijones de los organismos que inyectan venenos, tales como aguijones de insectos, producen anafilaxia en individuos con alergias al veneno. En general, los venenos de insectos incluyen veneno de Hymenoptera tales como abejas, avispón, avispas, avispa amarilla, avispas afelpadas y hormigas de fuego. En particular, por ejemplo, el veneno de las abejas melíferas del género Apis puede producir anafilaxia en víctimas de picaduras que son alérgicas (Weber et al. Allergy 42:464-470). El veneno de las abejas melíferas contiene numerosos compuestos que han sido ampliamente estudiados y caracterizados (véase para referencia, Banks y Shipolini. Chemistry and Pharmacology of Honey-bee Venom. Capítulo 7 de Venoms of the Hymenoptera. Ed. T. Piek. Academic Press. Londres. 1986). Los dos componentes principales del veneno de las abejas son fosfolipasa A2 y melitina y son alergenos proteicos preferidos para utilizarse en la presente invención para tratar y prevenir alergias al veneno de las abejas.
En determinadas utilizaciones de la presente invención, será deseable trabajar en sistemas en los que un único compuesto (por ejemplo, una única proteína) es la responsable de la mayor parte de la alergia observada. En otros casos, la invención puede aplicarse a alergenos más complejos. Por lo tanto, pueden utilizarse grupos de más de un antígeno de manera que puedan modularse simultáneamente las respuestas inmunes a múltiples antígenos.
El Apéndice A presenta una lista representativa de determinados antígenos proteicos conocidos. Como se indica, se conoce la secuencia de aminoácidos de muchas o todas de estas proteínas, bien mediante el conocimiento de la secuencia de sus genes cognados o mediante el conocimiento directo de la secuencia de la proteína, o ambos. De especial interés son los antígenos anafilácticos.
En otra realización de antígenos alergénicos, los microorganismos se someten a ingeniería genética para sintetizar y secretar polipéptidos alergénicos modificados que incitan anafilaxia cuando se exponen a individuos que son susceptibles a un choque anafiláctico. Preferiblemente, los alergenos se modifican de manera que se reduce o elimina la capacidad de incitar anafilaxia. Como se ha discutido previamente, los alergenos incitan respuestas alérgicas que algunas veces son lo suficientemente graves como para inducir choque anafiláctico mediante el entrecruzamiento de anticuerpos IgE unidos a la superficie de mastocitos y basófilos. El entrecruzamiento de IgE libera compuestos tales como histaminas que producen síntomas relacionados con alergias y choque anafiláctico. Según la presente invención, se utilizan microorganismos para sintetizar y secretar antígenos que están modificados para reducir o eliminar los sitios de unión a IgE mientras se mantiene la antigenicidad o la actividad inmunomoduladora (WO 99/38978). Esto reduce el riesgo de respuestas alérgicas o anafilácticas en individuos tratados con vacunas que contienen estos microorganismos modificados.
La cantidad de antígeno que se empleará en cualquier composición o aplicación particular dependerá de la naturaleza del antígeno particular y de la aplicación para la que se utiliza, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Los experimentos descritos en los Ejemplos 1-4 sugieren que son útiles grandes cantidades de polipéptidos para inducir respuestas Th1. La cantidad de antígeno puede controlarse mediante varios factores incluyendo, pero sin limitarse a, sistemas de expresión, sistemas de expresión inducibles, niveles de secreción y excreción, métodos para matar a las bacterias antes de la administración. Los expertos en la técnica son capaces de determinar los niveles deseados de antígenos que deben producir las bacterias y ser administrados a individuos.
Se admite que pueden administrarse simultáneamente múltiples moléculas antigénicas mediante bacterias según los métodos de la presente invención. Sin limitación, pueden administrarse diferentes determinantes antigénicos de una proteína antigénica. También pueden administrarse diferentes determinantes antigénicos de diferentes proteínas antigénicas. Además, pueden administrarse múltiples polipéptidos y proteínas antigénicas según la presente invención. También se admite que pueden administrarse polipéptidos antigénicos únicos o múltiples y citoquinas únicas o múltiples a individuos mediante bacterias según la presente invención. Por ejemplo, pero sin limitación, los antígenos alergénicos de la presente invención y las moléculas inmunomoduladoras tales como interleuquinas pueden administrarse mediante bacterias utilizando métodos de secreción o no secreción según la presente invención.
Adyuvantes y agentes inmunoestimuladores
Las composiciones y métodos de la presente invención incluyen la utilización de adyuvantes y polipéptidos inmunomoduladores o factores inmunoestimuladores para modular la respuesta inmune de un individuo. Los adyuvantes inmunológicos son agentes que incrementan las respuestas inmunes específicas a las vacunas. La formulación de las vacunas con adyuvantes potentes es deseable con el fin de mejorar el rendimiento de las vacunas compuestas de antígenos. Los adyuvantes pueden tener diversos mecanismos de acción y deben seleccionarse para utilizarse tomando como base la vía de administración y el tipo de respuesta inmune (anticuerpo, mediada por células, o inmunidad mucosal) que se desea para una vacuna en particular.
En general, los polipéptidos inmunomoduladores incluyen citoquinas que son proteínas o factores biológicos pequeños (en el intervalo de 5-20 kD) que son liberadas por las células y que tienen efectos específicos en las interacciones célula-célula, y en la comunicación y comportamiento de otras células. Como se ha descrito previamente, las citoquinas según la presente invención son proteínas que son secretadas por las células T para inducir una respuesta Th1 o Th2. Preferiblemente, la o las citoquinas que se van a administrar se seleccionan con el fin de reducir la producción de una respuesta Th2 a antígenos asociada con anafilaxia. Un método preferido para reducir una respuesta Th2 es mediante la inducción de la respuesta alternativa. Las citoquinas que inducen una respuesta Th1 en las células T (es decir, "citoquinas estimuladoras de Th1") cuando se expresan durante la administración del antígeno a las células, incluyen IL-12, IL-2, IL-18, IL-1 o fragmentos de éstas, IFN, y/o IFN\gamma.
Otros compuestos que son inmunomoduladores incluyen agentes inductores inmunológicos. Estos agentes inductores estimulan la expresión de citoquinas que estimulan Th1 por las células T e incluyen factores tales como, CD40, ligando de CD40, oligonucleótidos que contienen restos CpG, TNF, y extractos microbianos tales como preparaciones de Staphylococcus aureus, Listeria matada con calor, y toxina del cólera modificada, etc.
Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente los tipos preferidos de adyuvantes para utilizarse con composiciones particulares de antígenos. En general, el adyuvante inmunológico incluye adyuvantes de tipo gel (por ejemplo, hidróxido de aluminio/fosfato de aluminio, fosfato de calcio), adyuvantes microbianos (por ejemplo, ADN tal como restos CpG; endotoxinas tales como monofosforil lípido A; exotoxinas tales como toxina del cólera, toxina sensible al calor de E. coli, y toxina pertussis; y muramil dipéptido), adyuvantes basados en una emulsión de aceite y emulsionantes (por ejemplo, Adyuvante Incompleto de Freund, MF59 y SAF), adyuvantes particulados (por ejemplo, liposomas, microesferas biodegradables y saponinas) y adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloque no iónicos, análogos del muramil péptido, polifosfaceno y polinucleótidos sintéticos).
Preferiblemente se evitan los adyuvantes que se sabe que estimulan respuestas Th2. Los adyuvantes especialmente preferidos incluyen, por ejemplo, preparaciones (incluyendo muestras matadas con calor, extractos, aislados purificados parcialmente o cualquier otra preparación de un microorganismo o componente de microorganismo suficiente para mostrar una actividad de adyuvante) de microorganismos tales como Listeria monocytogenes u otros (por ejemplo, Bacilo de Calmette-Guerin [BCG], especies de Corynebacterium, especies de Mycobacterium, especies de Rhodococcus, especies de Eubacteria, especies de Bortadella y especies de Nocardia) y preparaciones de ácidos nucleicos que incluyen restos CpG sin metilar (véanse, por ejemplo, Patente de EEUU No. 5.830.877; y las solicitudes PCT publicadas WO 96/02555, WO 98/18810, WO 98/16247 y WO 98/40100). Otros adyuvantes preferidos que se ha mostrado que inducen respuestas del tipo Th1 y no respuestas del tipo Th2 incluyen, por ejemplo, Aviridina (N,N-dioctadecil-N’N’-bis(2-hidroxietil)propanodiamina) y CRL 1005. Son especialmente preferidos los que inducen la producción de IL-12, incluyendo extractos microbianos tales como Staphylococcus aureus fijado, preparaciones de Streptococcus, Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacárido (LPS), monofosforil lípido A (MPLA) de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas (Richards et al. Infect Immun 1998 Jun; 66(6):2859-65), listeria monocytogenes, toxoplasma gondii, leishmania major. Algunos polímeros también son adyuvantes. Por ejemplo, los polifosfacenos están descritos en la Patente de EEUU No. 5.500.161 de Andriavnov et al. Éstos pueden utilizarse no sólo para encapsular los microorganismos sino también para incrementar la respuesta inmune al antígeno.
Si los adyuvantes no son sintetizados por los microorganismos según la presente invención, los adyuvantes que son citoquinas pueden proporcionarse como preparaciones impuras (por ejemplo, aislados de células que expresan un gen de citoquina, bien endógeno o exógeno a la célula), aunque preferiblemente se proporcionan en forma purificada. Preferiblemente, las preparaciones purificadas son al menos aproximadamente 90% puras, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puras, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puras. Alternativamente, pueden proporcionarse genes que codifican las citoquinas o los agentes inductores inmunológicos, de manera que la expresión del gen resulte en la producción de citoquinas o del agente inductor inmunológico bien en el individuo que se está tratando o en otro sistema de expresión (por ejemplo, un sistema de transcripción/traducción in vitro o una célula anfitriona) a partir del cual puede obtenerse la citoquina o agente inductor inmunológico expresado para administrarlo al individuo. Se admite que los microorganismos utilizados para sintetizar y administrar proteínas alergénicas y/o inmunomoduladoras según la presente invención pueden actuar como un adyuvante, y que los microorganismos preferidos son adyuvantes inmunoestimuladores.
Los expertos en la técnica apreciarán que la administración de la invención de microorganismos que expresan citoquinas y/o alergenos puede combinarse opcionalmente con la administración de cualquier otro factor modulador deseado del sistema inmune tal como, por ejemplo, un adyuvante u otro compuesto inmunomodulador.
Métodos de administración
Las formulaciones pueden administrarse a un paciente mediante cualquier vía disponible incluyendo, por ejemplo, administración enteral, parenteral, tópica (incluyendo nasal, pulmonar u otra vía mucosal), oral o local. Las composiciones se administran preferiblemente en una cantidad eficaz para incitar la inmunidad celular y la producción de IgG relacionada con Th1 a la vez que se minimizan las respuestas mediadas por IgE. También son preferidas las composiciones administradas en una cantidad eficaz para activar la respuesta de las células T, preferiblemente las respuestas del tipo Th1. Para las composiciones de la presente invención que contienen bacterias, la administración se suministra preferiblemente por vía parenteral.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas para utilizarse según la presente invención pueden incluir un excipiente o vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico" significa un material de relleno no tóxico, sólido, semi-sólido o líquido inerte, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación de cualquier tipo. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos aceptables desde un punto de vista farmacéutico son azúcares tales como lactosa, glucosa, y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetil celulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón; aceite de girasol; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógenos; disolución salina isotónica; disolución de Ringer; alcohol etílico, y disoluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes no tóxicos compatibles tales como laurilsulfato sódico y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a seres humanos y/o a otros animales, por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas o gotas), bucal o como un pulverizador oral o nasal.
Las formas líquidas de dosificación para la administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires aceptables desde un punto de vista farmacéutico. Además de los compuestos activos, las formas líquidas de dosificación pueden contener diluyentes inertes utilizados habitualmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilen glicol, dimetilformamida, aceites (en especial, aceites de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de sorbitán de ácidos grasos, y mezclas de éstos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir agentes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saporíferos y perfumantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles pueden formularse según las técnicas conocidas utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable parenteralmente, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden utilizarse están agua, disolución de Ringer, disolución de cloruro sódico U.S.P. e isotónica. Además, se utilizan habitualmente aceites estériles fijados como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede utilizarse cualquier aceite suave fijado incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se utilizan ácidos grasos tales como el ácido oleico.
Con el fin de prolongar el efecto de un agente, es deseable habitualmente ralentizar la absorción del medicamento inyectado por vía subcutánea o intramuscular. Esto puede conseguirse mediante la utilización de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción del agente depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un medicamento administrado por vía parenteral se consigue disolviendo o suspendiendo el medicamento en un vehículo oleoso. Las formas inyectables de liberación lenta se realizan formando matrices microencapsuladas del medicamento en polímeros biodegradables tales como poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de la proporción del agente respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado, puede controlarse la velocidad de liberación del agente. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de liberación lenta también se preparan incluyendo el medicamento en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos
corporales.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de caco, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y que, por lo tanto, se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas sólidas de dosificación para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En dichas formas sólidas de dosificación, el compuesto activo está mezclado con al menos un excipiente o vehículo inerte aceptable desde un punto de vista farmacéutico tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) materiales de relleno o espaciadores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) ligantes tales como, por ejemplo, carboximetil celulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la disolución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como arcilla de caolín y bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico, y mezclas de éstos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.
También pueden utilizarse las composiciones sólidas de un tipo similar como material de relleno en cápsulas de gelatina blandas y duras utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y semejantes.
Las formas sólidas de dosificación de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos u otros recubrimientos muy conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libera el o los ingredientes activos sólo, o preferentemente, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
También pueden utilizarse las composiciones sólidas de un tipo similar como material de relleno en cápsulas de gelatina blandas y duras utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y semejantes.
Los compuestos también pueden estar en forma micro-encapsulada con uno o más excipientes como se ha indicado anteriormente. Las formas sólidas de dosificación de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación u otros recubrimientos muy conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En dichas formas sólidas de dosificación, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de comprimidos u otros integrantes de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de las cápsulas, comprimidos y pastillas, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libera el o los ingredientes activos sólo, o preferentemente, en una parte determinada del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden utilizarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizadores, inhaladores o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico y cualquier conservante o tampón según se requiera. También se contempla que la formulación oftálmica, gotas para el oído, gotas para los ojos estén dentro del alcance de esta invención.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de éstos.
Los polvos y pulverizadores pueden contener, además de los compuestos de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener además propelentes habituales tales como clorofluorohidrocarburos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación pueden realizarse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. También pueden utilizarse potenciadores de la absorción para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana que controle la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz de polímero o gel.
Encapsulación
En una realización preferida, las composiciones de la invención que comprender microorganismos vivos se proporcionan en asociación con un dispositivo de encapsulación (véase, por ejemplo, U.S.S.N. 60/169.330 titulada "Controlled Delivery of Antigens" presentada el 6 de dic, 1999. Los dispositivos de encapsulación preferidos son biocompatibles, son estables en el interior del cuerpo de manera que los microorganismos no se liberan hasta después de que el dispositivo de encapsulación alcanza su destino pretendido (por ejemplo, recubrimiento mucosal del intestino, endocitosis por las células presentadoras de antígenos (APC)). Por ejemplo, los sistemas de encapsulación preferidos son estables al pH fisiológico y se degradan a niveles de pH ácidos comparables con los encontrados en el tracto digestivo o los endosomas de las APC. Las composiciones de encapsulación especialmente preferidas incluyen, pero no están limitadas a, las que contienen liposomas, poli(láctido-coglicólido) (PLGA), quitosán, polímeros sintéticos biodegradables, hidrogeles utilizados para fines medioambientales y nanopartículas de gelatina PLGA. Las composiciones de la invención pueden estar encapsuladas en combinación con uno o más adyuvantes, entidades dirigidas, u otros agentes incluyendo, por ejemplo, vehículos, diluyentes, excipientes, aceites farmacéuticos, etc. Alternativamente o adicionalmente, el dispositivo de encapsulación puede estar asociado con una entidad dirigida y/o un adyuvante.
Los métodos para encapsular células vivas son conocidos y también pueden utilizarse según la presente invención para administrar microorganismos que secretan antígenos a individuos. Las referencias siguientes se proporcionan como ejemplos de encapsulación de células vivas. Sin embargo, en la presente invención puede utilizarse cualquier método para encapsular células vivas. La Patente de EEUU 5.084.350; Patente de EEUU 4.680.174; y Patente de EEUU 4.352.883 describen la encapsulación de una célula procariota o eucariota o de un cultivo celular en microcápsulas. Brevemente, las Patentes de EEUU 5.084.350; 4.680.174; y 4.352.883 describen que una muestra de tejido, célula o cultivo celular que va a encapsularse se prepara en primer lugar en una forma finamente dividida según técnicas muy conocidas y se suspende en un medio acuoso adecuado para mantener y apoyar los procesos metabólicos en marcha de las células particulares implicadas. Generalmente, los medios adecuados para este propósito están disponibles comercialmente. Posteriormente, se añade al medio una sustancia soluble en agua que es compatible fisiológicamente con las células y que puede convertirse en insoluble en agua para formar una masa esferoide o de otra forma coherente que conserva la forma. La disolución se convierte en gotitas que contienen las células junto a su medio de mantenimiento o crecimiento y se convierte inmediatamente en insoluble en agua y gelifica para formar masas coherentes típicamente esferoides que conservan la forma.
El material utilizado para inducir la gelificación del medio de cultivo puede ser cualquier material no tóxico soluble en agua que, mediante un cambio en la temperatura, pH, medio iónico, o concentración del medio puede convertirse en masas que conservan la forma. Preferiblemente, el material también comprende varios grupos que se ionizan fácilmente, por ejemplo, grupos carboxilo o amino, que pueden reaccionar mediante la formación de sales con polímeros que contienen varios grupos que se ionizan para formar especies de carga contraria. La utilización de este tipo de material permite la deposición de una membrana con un intervalo de porosidad seleccionado sin dañar a las células lábiles. Los materiales preferidos actualmente para formar las masas gelificadas son polisacáridos solubles en agua naturales o sintéticos. Muchos de dichos materiales disponibles comercialmente se extraen típicamente de materia vegetal y se utilizan frecuentemente como aditivos en diferentes alimentos. El alginato sódico es el polisacárido soluble en agua preferido actualmente. Otros materiales que pueden utilizarse incluyen fracciones ácidas de goma de guar, goma arábiga, carragenina, pectina, goma de tragacanto o gomas de xantano. Estos materiales pueden gelificarse cuando se intercambian iones multivalentes por el hidrógeno ácido o ion de metal alcalino normalmente asociado con los grupos carboxilo.
Utilizaciones
Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para tratar o prevenir reacciones alérgicas en un sujeto. Los sujetos son pacientes animales y humanos que necesitan tratamiento para alergias. Preferiblemente, el animal es un mamífero domesticado (por ejemplo, un perro, gato, caballo, oveja, cerdo, cabra, vaca, etc). Los animales también incluyen animales de laboratorio tales como ratones, ratas, hamsters, monos y conejos. Puede tratarse cualquier individuo que padezca alergia, o que sea susceptible a alergia. Debe apreciarse que un individuo puede considerarse susceptible a alergia sin haber sufrido una reacción alérgica al antígeno particular en cuestión. Por ejemplo, si el individuo ha sufrido una reacción alérgica a un antígeno relacionado (por ejemplo, uno presente en la misma fuente o uno para el que son comunes las alergias compartidas), este individuo se considerará susceptible a la alergia al antígeno relevante. De manera similar, si hay miembros de la familia de un individuo que son alérgicos a un antígeno particular, el individuo puede considerarse susceptible a la alergia a este antígeno. Más preferiblemente, cualquier individuo que es susceptible a un choque anafiláctico después de la exposición a alergenos alimenticios, alergenos de venenos o alergenos de caucho puede tratarse según la presente invención.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse para administrarse por cualquier vía. Preferiblemente, las composiciones se formulan para inyección, ingestión o inhalación.
Se pretende que las modificaciones y variaciones de los métodos y composiciones descritos en la presente memoria estén en el alcance de las reivindicaciones siguientes.
Ejemplos Materiales y Métodos
Para los métodos generales utilizados para expresar proteínas en microorganismos véanse Ausubel et al. (supra) y Sambrook et al. (supra). Además, los vectores de expresión para utilizarse en la presente invención están disponibles a partir de fuentes comerciales (véanse, por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega Corporation, Madison, WI; New England Biolabs, Beverly, MA).
Los experimentos siguientes describen la encapsulación de alergenos en bacterias para utilizarse como vehículo de administración y/o adyuvante en inmunoterapia según lo mostrado en la presente invención. Se produjeron proteínas alergénicas recombinantes de cacahuete (Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3; Burks et al. J Allergy Clin Immunol. 88(2):172-9, 1991; Burks et al. J Allergy Clin Immunol. 90(6 Pt 1):962-9, 1992; Rabjohn et al. J Clin Invest. 103(4):535-42, 1999) en células BL21 de E. coli mediante la transformación de las células bacterianas con clones de ADNc que codifican las proteínas (véase el Apéndice B; secuencias clonadas en pET24, Novagen, Madison, WI). Las células transformadas se inyectaron en ratones C3H/HEJ para determinar si la E. coli que expresa alergenos incita una respuesta inmune.
Ejemplo 1 Métodos para matar E. coli que produce alergenos
Se ensayaron diferentes métodos para matar E. coli que produce alergenos. Preferiblemente, el método para matar bacterias no desnaturaliza o proteoliza el o los alergenos recombinantes producidos por las bacterias. Como ejemplos no limitativos, E. coli se mataron con calor (a intervalos de temperatura de 37ºC a 95ºC), utilizando etanol (0,1% a 10%), y utilizando disoluciones que contienen yodo (0,1% a 10%). La supervivencia se determinó plaqueando 100 \mul de células en placas de agar apropiadas y contando posteriormente las colonias resultantes. El método más reproducible para matar fue el que utilizó calor. Por lo tanto, el método preferido para matar E. coli que produce alergenos es incubar las células a 60ºC durante 20 minutos lo que resulta en una muerte del 100% (es decir, no se forman colonias, véase la Figura #).
Ejemplo 2 Crecimiento de las Bacterias
Se desarrolló el protocolo siguiente para la preparación de células de E. coli que producen alergenos para inocular ratones.
Día 1
Se prepararon cinco mililitros (ml) de cultivos líquidos de LB (medio de Luria-Bertani) que contienen kanamicina (30 microgramos/ml para cada línea celular utilizada) en tubos o matraces estériles de 50 ml. Los cultivos se inocularon con aproximadamente 10 microlitros de una preparación madre congelada de la línea celular bacteriana deseada que contiene los vectores de expresión deseados. Los cultivos inoculados se incubaron con agitación toda la noche a 37ºC.
Día 2
La mañana siguiente, se inocularon 100 ml de LB líquido (matraz Erlenmeyer de 500 ml) que contiene kanamicina (30 microgramos/ml) utilizando una alicuota de 1 ml del cultivo de 5 ml crecido el día previo. (Los 4 ml de cultivo restantes se congelaron. Opcionalmente, los 4 ml de cultivo restantes pueden guardarse a 4ºC durante varias semanas para inocular cultivos posteriores). Los cultivos inoculados se incubaron con agitación a 37ºC hasta que la densidad óptica de la disolución medida a 600 nm (DO_{600}) alcanzó aproximadamente 0,6 a 0,9.
Día 3
Para inducir la producción de las proteínas recombinantes, los cultivos del día previo se indujeron añadiendo isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de una preparación madre 1 M hasta una concentración final de 1 mM (100 microlitros de 1 M IPTG por 100 ml de cultivo) cuando la DO_{600} del cultivo alcanzó aproximadamente 0,6-0,9. Los cultivos inducidos se incubaron toda la noche.
Día 4
Se alicuotaron 1,4 ml de cultivo del día previo en cada uno de cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada cultivo y se mataron con calor a 60ºC en un baño de agua durante 20 minutos. Los tubos se centrifugaron a 16.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se desechó el sobrenadante. Los sedimentos se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X y se centrifugaron a 16.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó de nuevo y los sedimentos se resuspendieron en 250 microlitros de PBS 1X. Se juntaron los sedimentos resuspendidos de las mismas muestras originales. Se determinó la DO_{600} para cada muestra y se diluyeron hasta la DO_{600} deseada utilizando PBS 1X.
Ejemplo 3 Producción y liberación del alergeno Liberación del alergeno por bacterias matadas con calor
Con el fin de determinar si las células permanecían intactas después de matarlas con calor se determinó la cantidad de alergeno liberada en el medio. Se desarrolló un ensayo de hibridación sobre mancha que utilizó como controles alergenos recombinantes purificados aplicados a un filtro a concentraciones conocidas e IgE sérica de pacientes sensibles a cacahuetes. El ensayo detectó y cuantificó la cantidad de alergeno presente en 100 microlitros de sobrenadante después de precipitar las bacterias matadas con calor. El nivel de alergeno liberado varió y fue dependiente del vector de expresión y de la proteína ensayados. En general, se liberó más Ara h 2 que Ara h 1 y Ara h 3 (Ara h 2>>Ara h 1>Ara h 3).
Producción del alergeno
Con el fin de determinar las cantidades de alergeno en E. coli, se desarrolló un ensayo de transferencia inmunoelectroforética que utiliza una etiqueta de seis histidinas (etiqueta HIS) que está presente en todos nuestros alergenos recombinantes purificados y un anticuerpo frente a la etiqueta de HIS para construir una curva estándar que pueda utilizarse para estimar las cantidades de alergeno producidas. La cantidad de alergeno producida por célula varió depen-
diendo del clon ensayado. En general, se produjo más Ara h 3 que Ara h 2 y Ara h 1 (Ara h 3>Ara h 2>Ara h 1).
Nuestra mejor estimación para las cantidades de alergeno administradas en 100 \mul de un inóculo de E. coli con una D.O. de 2,0 varía de aproximadamente 1 \mug de Ara h 1 a aproximadamente 20 \mug de Ara h 3.
La Figura 2 es un ejemplo de una curva estándar generada para Ara h 2. La densidad óptica (D.O.) del alergeno Ara h 2 etiquetado con HIS se determina a partir de una transferencia inmunoelectroforética en la que se han sometido a electroforesis en geles SDS-PAGE diferentes concentraciones de extracto de E. coli. La D.O. del alergeno se utiliza para estimar la cantidad de proteína producida por ese extracto.
Ejemplo 4 Respuesta inmune de los ratones
El protocolo siguiente se utilizó para determinar la respuesta inmune de ratones inyectados con bacterias productoras de alergenos. Se recogió la sangre de la vena de la cola de cada ratón utilizado antes de la primera inyección. Se recogió suficiente sangre para ELISA de anticuerpos para cada alergeno y proteínas de E. coli. En el Día Cero se inyectaron a cada ratón subcutáneamente en el flanco posterior izquierdo 100 microlitros de las muestras de E. coli muertas. Los ratones se inyectaron una segunda vez en el Día 14 utilizando el mismo procedimiento que en el Día Cero. En el Día 21, se recogió una segunda muestra de sangre de cada ratón. Las muestras de sangre del Día Cero y Día 21 se ensayaron para detectar anticuerpos IgG1 e IgG2a frente a Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3 mediante un ensayo ELISA.
Los ratones inyectados con E. coli que produce Ara h 1 no presentaron niveles detectables de ninguna inmunoglobulina frente al alergeno Ara h 1 y, por lo tanto, no se muestran los datos. Sin limitación a la teoría, especulamos que esto puede ser debido a las cantidades relativamente pequeñas de Ara h 1 producidas por estas células (véase la discusión previa). Los ratones inyectados con E. coli que produce Ara h 2 contenían niveles relativamente altos de IgG1 e IgG2a. De nuevo, sin limitación a la causa, especulamos que esto puede ser debido a la cantidad de Ara h 2 liberada por estas células (véase la discusión anterior). Los ratones inyectados con E. coli que produce Ara h 3 contenían niveles relativamente altos de IgG2 (indicativa de una respuesta de tipo Th1) e incitaron niveles relativamente bajos de IgG1 (indicativa de una respuesta de tipo Th2).
Interpretación de los resultados
Los datos presentes deben interpretarse con cautela. Los datos de las Figuras sólo representan niveles de D.O. y no representan cantidades absolutas de inmunoglobulinas. Por lo tanto, las comparaciones entre grupos deben tener en consideración los datos presentados como D.O. Sin embargo, la tendencia general sugiere, por ejemplo, que hubo más ratones que presentaron una respuesta IgG2a a Ara h 3 que ratones que presentaron una respuesta IgG1 a Ara h 3.
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Claims (23)

1. Una composición farmacéutica que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico y que comprende además un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en la que la composición farmacéutica reduce las respuestas inmunes alérgicas en sujetos que son alérgicos al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el alergeno proteico es un alergeno anafiláctico.
3. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico se encuentra en alimentos, venenos de insectos, o caucho.
4. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico se encuentra en un alimento seleccionado del grupo que consiste en cacahuetes, leche, huevos, marisco, nueces, productos lácteos y fruta.
5. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico se encuentra en el veneno de las abejas.
6. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico es Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3.
7. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico está modificado para tener una capacidad reducida para unir o entrecruzar anticuerpos IgE.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el alergeno proteico modificado tiene un número reducido de sitios de unión a IgE comparado con el alergeno proteico sin modificar.
9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el alergeno proteico está modificado para reducir o eliminar los sitios de unión a IgE.
10. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico no se secreta.
11. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el alergeno proteico se secreta al periplasma.
12. Utilización de una composición que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico en la fabricación de un medicamento para tratar una alergia en un sujeto susceptible al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
13. Una composición farmacéutica que comprende microorganismos E. coli muertos que han producido un alergeno proteico y que comprende además un vehículo aceptable desde un punto de vista farmacéutico, en la que el alergeno proteico está modificado para tener una capacidad reducida para unir o entrecruzar anticuerpos IgE, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que el alergeno proteico es un alergeno anafiláctico.
15. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en la que el alergeno proteico se encuentra en alimentos, venenos de insectos o caucho.
16. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el alergeno proteico se encuentra en un alimento seleccionado del grupo que consiste en cacahuetes, leche, huevos, marisco, nueces, productos lácteos y fruta.
17. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que el alergeno proteico se encuentra en el veneno de las abejas.
18. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que el alergeno proteico es Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3.
\newpage
19. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en la que el alergeno proteico modificado tiene un número reducido de sitios de unión a IgE comparado con el alergeno proteico sin modificar.
20. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en la que el alergeno proteico está modificado para reducir o eliminar los sitios de unión a IgE.
21. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en la que el alergeno proteico no se secreta.
22. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en la que el alergeno proteico se secreta al periplasma.
23. Utilización de una composición que comprende microorganismos E. coli muertos que producen o han producido un alergeno proteico en la fabricación de un medicamento para tratar una alergia en un sujeto susceptible al alergeno proteico, en la que el alergeno proteico está modificado para tener una capacidad reducida para unir o entrecruzar anticuerpos IgE, en la que el alergeno proteico está encapsulado en el interior de los microorganismos, y en la que los microorganismos se han matado utilizando calor o compuestos químicos.
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