JPH07285875A - ノミアレルゲンの製造方法および該方法により製造されるノミアレルゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】生理食塩水中において、ノミ虫体をまずティッ
シュホモジナイザーで磨砕し、次いで超音波細胞破壊装
置で細胞レベルまで破砕する。その後、高速遠心装置に
て不溶成分と可溶成分とに分離して不溶成分を除去す
る。 【効果】ノミアレルギーの診断および治療のいずれにも
用いることができる。また、減感作療法を、アナフィラ
キシーなどの生体を重篤な状態に追いやる副作用を生じ
ることなく行なうことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ノミアレルギーの診
断および治療に用いることができるノミアレルゲンの製
造方法およびこの方法により製造されるノミアレルゲン
に関する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギー性疾患は、ヒトやイヌ、ネ
コ、ヒツジ、ウマ、ウシなどの多くの動物種に発生する
疾患である。一般に、アレルギーは、特定の異種タンパ
クが導入されて感作された状態にある生体に、再び同一
の異種タンパクが生体内に侵入した際に呈する異常反応
であると理解されている。この場合の異種タンパクはア
レルゲンと呼ばれ、種々の物質がアレルゲンになり得る
ことが知られている。

【０００３】家畜類においても種々のアレルゲンが認め
られているが、とりわけノミに由来するアレルゲン、す
なわちノミアレルゲンによるアレルギーは広く一般に見
受けられ、家畜類の健康上の大きな問題となっている。
このようなアレルギー性疾患は、例えば、イヌにおいて
はアレルギー性皮膚炎として認められることが多い。

【０００４】従来、このようなアレルギー性疾患の治療
法としては、抗アレルギー剤や抗ヒスタミン剤を用いる
対症療法、免疫グロブリンや金製剤を用いる変調療法、
原因アレルゲンを投与する減感作療法などが知られてい
る。このうち、減感作療法は、アレルギーの原因となっ
ているアレルゲンを生体にごく少量注射し、漸次その量
を増加させて、そのアレルゲンに対する生体の過敏性を
除去・減弱させる方法であり、アレルギーの治療法とし
て好ましい方法であるとされている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記ノミアレルギーに
対しても減感作療法は好ましい療法であると考えられる
が、この療法に用いられるノミアレルゲンは現在製造さ
れていない。また、減感作療法は、注射後短時間から 2
〜3 日にわたる臨床症状の激化、注射部位の局所反応
（疼痛性または無痛性の浮腫や掻痒症）、アナフィラキ
シーショックなど、時には被検体を重篤な状態に追いや
る危険性のある副作用を呈することがある。

【０００６】したがって、この発明は、ノミアレルゲン
の簡便な製造方法であって、得られたノミアレルゲンが
アナフィラキシーショック等の生体にとって危険な副作
用を呈することがない製造方法を提供することを目的と
する。また、この発明は、上記製造方法により製造され
るノミアレルゲンを提供することをも目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明によるノミアレ
ルゲンの製造方法は、緩衝液中において、ノミ虫体をま
ず機械的に、次いで超音波を用いて破砕してホモジネー
トを得、その後、該ホモジネートを遠心して不溶成分を
分離することを特徴とする。

【０００８】また、この発明によるノミアレルゲンは、
緩衝液中において、ノミ虫体をまず機械的に、次いで超
音波を用いて破砕してホモジネートを得、その後、該ホ
モジネートを遠心して不溶成分を分離することにより得
られることを特徴とする。

【０００９】この発明による製造方法においては、ま
ず、緩衝液中において、ノミ虫体を機械的に磨砕し、次
いで超音波を用いて細胞レベルまで破砕してノミ組織の
ホモジネートを得る。ここで用いられる緩衝液として
は、通常この分野において用いられるいかなる緩衝液を
も用いることができるが、得られたアレルゲンを生体内
に注射することを考慮すると生理食塩水もしくは緩衝生
理食塩水を用いることが好ましい。また、使用するノミ
の種は特に限定されるものではなく、治療対象とする動
物に通常寄生するものを任意に用いることができる。

【００１０】ノミ虫体を機械的に磨砕する手段は特に限
定されるものではなく、当該分野において通常用いられ
るいかなる手段をも用いることができ、例としてティッ
シュホモジナイザーを挙げることができる。また、超音
波を用いてノミ組織を破砕する手段も特に限定されるも
のではなく、市販の超音波細胞破壊装置を好適に用いる
ことができる。

【００１１】ノミ組織のホモジネートが得られた後、こ
のホモジネートを遠心にかけて可溶成分と不溶成分とに
分離し、不溶成分を除去して可溶成分、すなわち上清の
みを採取する。遠心の条件は、可溶成分と不溶成分とが
完全に分離し得るものであれば特に限定されるものでは
ないが、高速回転で、具体的には 12,000 ｒｐｍ程度で
行なうことが好ましい。

【００１２】このようにして得られた上清は、そのまま
ノミアレルゲンとしてヒトやイヌ、ネコ、ヒツジ、ウ
マ、ウシ等の家畜類のノミアレルギーの診断や治療に用
いることができるが、さらに、適当な手段により殺菌す
ることが好ましい。この上清の殺菌は、例えば、滅菌用
フィルターで濾過滅菌した後、65℃程度の低温で 1時間
程度インキュベーターに静置して低温加熱殺菌すること
により行なうことができる。

【００１３】このノミアレルゲンを用いたノミアレルギ
ーの診断は、以下の通りに行なうことができる。まず、
上記方法により得られた上清を、生理食塩水等で適切な
濃度、通常 1：1,000 重量／容量（Ｗ／Ｖ）に調整す
る。次に、この希釈溶液を、陽性対照および陰性対照と
共に被検動物の皮内に注射する。所定時間の後、各々の
注射部位に生じた膨疹を計測し、それぞれの計測値を比
較して所定の基準により陽性並びに陰性の判定を行な
う。

【００１４】また、このノミアレルゲンは、アレルギー
の治療、すなわち減感作療法に用いることができる。そ
の際、ノミアレルゲンは、上記アレルギー皮内検査用い
る場合よりもさらに希釈し、通常 1：5,000 Ｗ／Ｖ程度
で用いられる。減感作療法は、希釈ノミアレルゲン液を
所定の期間被検動物の皮下に注射することにより行なう
ことができる。ノミアレルゲン液の投与量、投与期間等
は、治療対象となる動物により適宜設定され、具体的に
は、対象動物がイヌの場合には、 1頭につき濃度 1：5,
000 Ｗ／Ｖのノミアレルゲン液 1ｍｌを毎週 1回ずつ、
計12回投与することを標準治療法とする。

【００１５】なお、従来市販されているアレルゲン診断
薬並びに治療薬は、数十回分をまとめてバイヤル瓶に収
容して製品化されており、必要に応じて注射器で採取
し、残りは冷蔵庫等の冷所に保管する方式を採ってい
る。しかしながら、この方式では長期間使用中に雑菌が
混入する恐れが高く、そのため、アレルゲン液中に雑菌
の増殖防止のための防腐剤、通常 0.5％程度のフェノー
ルが添加されているが、これは皮膚局所における炎症反
応を抑制して皮膚反応の測定の正確性を低下させる恐れ
がある。また、使用の度に低温から室温までの温度変化
を受けるため、アレルゲンの活性が低下する恐れもあ
る。したがって、この発明によるノミアレルゲンは、防
腐剤を添加することなく 1回使用量をアンプルに収容す
ることが好ましい。

【００１６】

【実施例】以下、この発明を実施例によってより詳細に
説明する。 Ａ．ノミアレルゲンの調製 アレルゲンの調製には犬から採取したノミ成虫を用い
た。採取したノミには、形態学的にイヌノミとネコノミ
が確認され、これらが任意に混合していた。

【００１７】これらのノミ成虫に、ノミの重量に対して
1：1,000 Ｗ／Ｖ（重量／容量）の濃度となるように
0.5％フェノール添加生理食塩水を加え、ティシュ・グ
ラインダ（tissue grinder）を用いて 4℃で15分間ホモ
ジナイズした後、超音波細胞破砕装置を用いて氷冷下で
15分間超音波暴射（50Ｗ）を行ない、さらに 12,000 ｒ
ｐｍで60分間高速遠心分離を行なった。

【００１８】その後、上清を滅菌用フィルター（ポアサ
イズ：0.22μｍ）で濾過滅菌し、得られた濾液を滅菌バ
イアルに分注して65℃で 1時間放置した後 4℃で保存し
た。 Ｂ．被検犬のアレルギー皮内検査 皮膚病発症犬に、上記Ａで調製したノミアレルゲン液
（ 1：1,000 Ｗ／Ｖ）、陽性対照液（10,000倍リン酸ヒ
スタミン・ 0.5％フェノール添加生理食塩水）および陰
性対照液（ 0.5％フェノール添加生理食塩水）をそれぞ
れ注射し、15分後に発赤を伴う膨疹の計測（長径×短
径）を行なった。その結果、ノミアレルゲン液による膨
疹の測定値が、陰性対照液による測定値と陽性対照液に
よる測定値との中間値以上の値を示した反応を陽性と判
定した。 Ｃ．減感作療法 減感作療法には、上記Ａで調製したノミアレルゲン液
（ 1：1,000 Ｗ／Ｖ）を陰性対照液で 5倍に希釈（ 1：
5,000 Ｗ／Ｖ）して用いた。このノミアレルゲン液 1ｍ
ｌを、上記Ｂの検査により陽性と判定された犬 9頭（雄
4頭、雌 5頭）の背部皮下に 3〜 4カ所に分けて注射し
た。投与は 1週間隔で行ない、12回を原則とした。ただ
し、 9頭のうち、 3頭については投与を 4回で中止し、
また 1頭については12回の投与では症状の改善が見られ
なかったため18回投与を行なった。

【００１９】アレルゲン液注射時には、全身アナフィラ
キシーショックの発生に備えてノルエピネフリンやコル
チコステロイドを用意した。また、アレルゲン液注射後
は、原則として約30分間動物を観察し、激しい運動は避
けるようにした。 Ｄ．評価 ノミアレルゲンの評価は、減感作療法を施した被検犬の
皮膚症状の推移、ノミアレルゲンに対する間接赤血球凝
集（ＩＨＡ）抗体価の変化、およびプラウスニッツ・キ
ュストナー（Prausnits-Kustner ）（Ｐ−Ｋ）反応によ
り行なった。 ｉ）皮膚症状の推移 皮膚症状は、下記表１に示す Halliwell REW: J Am Ani
m Hosp Assoc, 17, 249-253 (1981)に記載の方法に従っ
て数値化し、その推移を見た。減感作療法後に症状の改
善を認めたものを減感作療法に対する応答例とし、応答
率を算出した。

【００２０】また、下記式を用いて皮膚症状の改善率を
算出した。 改善率＝（実施後の皮膚症状の等級／実施前の皮膚症状
の等級）× 100 結果を下記表２に示す。

【００２１】 表１ 皮膚症状の重篤度分類 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 等 級 症 状 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ０ 正常犬 １ ０と２の中間 ２ 丘疹を伴う軽度の掻痒症 ３ ２と４の中間 ４ 痂皮を伴う広範囲の丘疹、発赤と掻痒症による自虐性損傷 ５ ４と６の中間 ６ 苔癬化を伴う広範囲の脱毛、発赤と掻痒症による顕著な自虐性損傷 ７ ６と８の中間 ８ 全身にわたる病変、激しい掻痒症、広範囲の丘疹、持続性の自虐性 損傷 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 表２ 減感作療法による皮膚症状の変化 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 注射 皮膚症状重篤度 皮膚症状の 番号 犬種 年齢 性別 −−−−−−− 回数 実施前 実施後 改善率 (%) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 1 甲斐犬 11 雄 18 4 4 0 2 柴 犬 14 雌 4 3 3 0 3 柴 犬 5 雌 4 2 0 100 4 雑 種 2 雌 12 4 0 100 5 雑 種 11 雌 12 5 1 80 6 ビーグル 7 雌 12 6 4 33 7 柴 犬 7 雄 12 4 1 75 8 雑 種 8 雄 12 2 1 50 9 柴 犬 2 雄 4 3 3 0 平均 3.7 1.9 48.6 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 表２から明らかなように、治療前の重篤度は平均 3.7
（ 2〜 6）であったのに対して治療後は平均 1.9（ 0〜
4）であり、症状が軽減している。また、症状の改善を
示したものは 9頭中 6頭であって応答率は67％であり、
これら 6頭に限ってみると平均改善率は73％（33〜 100
％）、うち 5頭（83.3％）は50％以上の改善率を示し
た。残りの 3頭については、症状の改善は見られなかっ
たが、症状が悪化した例はなかった。

【００２２】また、投与回数別にみると、 4回投与した
3頭のうち症状が改善されたのは 1頭であり（応答率3
3.3％）、その 1頭の改善率は 100％であった。これに
対し、12回および18回投与した 6頭のうち改善がみられ
たのは 5頭であり（応答率83.3％）、この 5頭の平均改
善率は67.6％であった。 ii）ＩＨＡ抗体価の変化 ＩＨＡ反応は、Hayasaki M: Jpn J Vet Sci, 43, 21-26
(1981) に記載の方法に従って行なった。

【００２３】減感作療法前後のＩＨＡ抗体価は、 1号犬
および 9号犬で 1：2 倍から 1：4倍へ、 3号犬で 1：2
倍から 1：8 倍へとわずかな上昇が認められた。ま
た、 4号犬では 1：2 倍から 1：4 倍、 6号犬では 1：
4 倍から 1：8 倍とそれぞれわずかに上昇したものの、
治療後には治療前と同一の抗体価に戻った。さらに、 2
号犬（ 1：2 倍）、 5号犬（ 1：4 倍）、 7号犬（ 1：
16倍）、 8号犬（ 1：4倍）では抗体価の変動は認めら
れなかった。

【００２４】このように、アレルゲン投与によって抗体
価の上昇が認められたのは 3頭であったが、抗体価の上
昇時期と症状の改善時期との間には明確な相関は見られ
なかった。 iii ）プラウスニッツ・キュストナー（Ｐ−Ｋ）反応 Ｐ−Ｋ反応は、減感作療法実施前および実施後 6週の被
検血清について測定した。レシピエント犬には、試験に
用いる前約 1年半の間閉鎖環境下の犬舎内で飼育し、外
部寄生虫および腸内寄生虫陰性、犬糸状虫未感染で、被
毛色が白色または淡黄色の健康な成犬 2頭を用いた。

【００２５】測定は、まずレシピエント犬をペントバル
ビタールで全身麻酔した後背部から腹部にかけて剪毛
し、次に剪毛部に 3〜 4ｃｍ間隔で被検血清を 0.1ｍｌ
ずつ皮内注射し、さらに72時間後に、無麻酔下において
ノミアレルゲン液（ 1：1,000Ｗ／Ｖ）を 0.1ｍｌずつ
血清注射部位に皮内注射することにより行なった。

【００２６】判定は、アレルゲン注射の15分後の計測値
が、陽性および陰性対照液の中間値以上の値を示す反応
を陽性とし、抗体価は陽性反応における最大血清希釈倍
数をもって表わした。

【００２７】その結果、 4号犬では療法前に 1：8 倍を
示したが、 5週後に反応陰性となり、この時期に皮膚症
状の改善も認められた。また、 6号犬では、療法前は反
応陰性で 5週後に 1：128 倍と上昇したが、皮膚症状の
改善は 8週後から見られ、以後11週まで漸次改善され、
11週後の抗体価は 1：8 倍であった。残りの 3、 5、7
および 8号犬では減感作療法期間を通して反応陰性であ
った。このように、皮膚症状の改善に伴うＰ−Ｋ抗体価
の減少が 2例に認められた。

【００２８】

【発明の効果】以上のように、この発明の製造方法によ
ると、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用を生
じることなく減感作療法に用いることが可能なノミアレ
ルゲンを容易に製造することが可能となる。また、この
ようにして製造したこの発明のノミアレルゲンは、濃度
を調整することにより、ノミアレルギーの診断および治
療のいずれにも好適に用いることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大石 勇 東京都府中市幸町３の５の８ 東京農工大 学内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】緩衝液中において、ノミ虫体をまず機械的
   に、次いで超音波を用いて破砕してホモジネートを得、
   その後、該ホモジネートを遠心して不溶成分を分離する
   ことを具備するノミアレルゲンの製造方法。
2. 【請求項２】請求項１記載の方法により製造されるノミ
   アレルゲン。