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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die für die Behandlung
der Parkinson Krankheit verwendbar sind. Insbesondere betrifft sie
die Verwendung von Mitteln zum Blockieren des Abtransports von L-DOPA
aus den Nierenzellen als Bestandteile der Zusammensetzungen.
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Die
Parkinson Krankheit (PK) ist eine chronische neurodegenerative Erkrankung
unbekannter Ätiologie,
die in einem hohen Maße
dopaminerge Gehirnneuronen betrifft, die aus der Substantia Nigra
stammen und auf das Striatum projektieren. Klinisch zeigen PK-Patienten
eine allmähliche
motorische Beeinträchtigung, die
sich für
gewöhnlich
durch Zittern (Tremor), Steifheit (Rigor), und einen abnormalen
Gang äußert. Personen, die
an PK leiden, zeigen eine erhebliche motorische Verbesserung, wenn
ihnen L-DOPA, der Vorläufer
des Neurotransmitters Dopamin im Gehirn, zusammen mit Carbidopa
oder Benserazid veräbreicht
wird. Die letzteren Verbindungen sind wirkungsvolle Hemmer der peripheren
aromatischen L-Aminosäuredecarboxylase (AADC),
und ihre Verabreichung soll die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin
in peripheren Geweben beseitigen, und damit das Auftreten von adversen
Wirkungen im Bezug auf die Wirkung von Dopamin in peripheren Organen
(kardiovaskulären
und Magen-Darm-Organen)
verhindern. Die Hemmung der peripheren AADC wird zudem von einer
verbesserten Bioverfügbarkeit
von L-DOPA begleitet, die in einer wirkungsvolleren Auffüllung der
Dopaminlager in den nicht betroffenen dopaminergen Gehirnneuronen
resultiert.
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Die
relative geringe Halbwertszeit von L-DOPA stellt jedoch eine Einschränkung bei
der Erhaltungstherapie von PK-Patienten dar, da die Verabreichung
von mehreren Dosen von L-Dopa notwendig ist. Aus diesem Grund wurden
in letzter Zeit Formulierungen zur langsamen Freisetzung von L-DOPA
verfügbar
gemacht, um eine länger
anhaltende motorische Verbesserung zu erzeugen und um die Anzahl
der täglichen
Verabreichungen zu reduzieren. Diese Vorgehensweise ist immer noch
nur beschränkt
erfolgreich, das das zirkulierende L-DOPA schnell in den Urin ausgeschieden
wird, wobei diesem Weg der Eliminierung große Bedeutung zukommt. Obwohl
das meiste L-DOPA, das im Urin auftaucht, seinen Ursprung in gefiltertem
L-DOPA hat, weiß man
von einer beachtlichen Menge an gefiltertem L-DOPA, die durch Natrium-abhängige und
Natriumunabhängige
Aminosäuretransporter
entlang des Nephrons reabsorbiert wird. Auf dem Niveau der proximalen
Tubuli kann das absorbierte L-DOPA leicht in Dopamin umgewandelt
werden. Bei PK-Patienten, denen L-DOPA mit einem AADC-Hemmer verabreicht
wurde, wird die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin in den proximalen
Nierentubuli blockiert und es wird angenommen, dass das meiste des
intrazellulären
L-DOPA die Zelle durch die apikale Zellgrenze verlässt: dies
ist ein durch einen Träger
vermitteltes Transportsystem, dessen Hemmung zu einer erheblichen
Akkumulation von L-DOPA im intrazellulären Kompartment führen kann.
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Es
wurde herausgefunden, dass dieses System zum tubulären Abtransport
von L-DOPA aus der Niere gegenüber Cyclosporin
A (Pestana, et al., 1995, Br. J. Pharmacol. 115, 1349–1358) empfindlich
ist. Weitere Nachweise deuteten darauf hin, dass P-Glycoprotein
an dem Abtransport von L-DOPA beteiligt ist (Soares-da-Silva, et
al., 1998, Br. J. Pharmacol. 123, 13–22 ; Soares-da-Silva & Serrão, 2000,
J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 697–704). Da ein größeres Problem
bei der Behandlung von PK mit L-DOPA
mit dessen kurzer Halbwertszeit und der verringerten biologischen
Verfügbarkeit
zusammenhängt
(Cederbaum, 1989, Clin. Neuropharma-col. 12, 147–166 Koller & Tolosa, 1998,
Neurology, 50 (suppl. 6), S1–S48),
dachte man, dass die Hemmer des apikalen tubulären Abtransportes von L-DOPA
aus der Niere (die deren Nierensekretion fördern) deren Ausscheidung in
den Urin verringern und die biologische Verfügbarkeit verbessern könnten. Dies
würde die
Bewegung von L-DOPA aus dem tubulären Epithel in das Niereninterstitium
und dann zurück
in den Kreislauf begünstigen.
Leider sind die meisten P-Glycoprotein-Hemmer,
die sich zur Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit von L-DOPA bei PK-Patienten
als vorteilhaft herausstellen könnten,
bekannte cytotoxische Mittel, oder, wenn sie nicht toxisch sind,
sind die zur Herstellung einer Hemmung von P-Glycoprotein benötigten Konzentrationen
unter in vivo-Bedingungen nicht realisierbar.
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Aus
diesem Grund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen
für die
Behandlung von PK zur Verfügung
zu stellen, die Verbindungen umfassen, die in der Lage sind, die
Nierenexkretion von L-DOPA zu verringern. Eine weitere Aufgabe der
vorliegenden Erfindung ist die zur-Verfügung-Stellung von wenigstens einer
der oben genannten Verbindungen bei der Herstellung eines Medikamentes
zur Behandlung von PK durch sequenzielle oder simultane Verabreichung
mit L-DOPA.
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Demzufolge
stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen für die Behandlung
der Parkinson Krankheit, wie in den angehängten Ansprüchen beschrieben, zur Verfügung.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von wenigstens
einem Blocker des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen bei
der Präparation
eines Medikamentes für
die Behandlung der Parkinson Krankheit oder für die Behandlung von Bewegungsstörungen durch
sequentielle oder simultane Verabreichung mit L-DOPA zur Verfügung, wie
in den anhängenden
Ansprüchen
beschrieben. Die Erfindung stellt zudem die Verwendung einer Zusammensetzung
zur Verfügung,
die wenigstens eine solche blockierende Verbindung in Kombination
mit L-DOPA bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung
der Parkinson Krankheit, wie in den anhängenden Ansprüchen beschrieben,
umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung wenigstens
einen Blocker des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen,
in Kombination mit L-DOPA, zur Verwendung bei der Therapie wie in
den anhängenden
Ansprüchen
beschrieben, zur Verfügung.
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Gemäß eines
weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren
zur Behandlung der Parkinson Krankheit zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren
die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung
zur Hemmung des Abtransports von L-DOPA aus den Nierenzellen in
sequentieller oder simultaner Kombination mit L-DOPA an eine Säugetierart,
die eine derartige Behandlung benötigt, umfasst.
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Zudem
wird gemäß eines
weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle der
Bewegung eines an Parkinson leidenden Patienten zur Verfügung gestellt,
bei dem eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung zur Blockierung
des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen verabreicht wird,
um die Verfügbarkeit
von sequentiell oder simultan verabreichtem L-DOPA für das Gehirn
und die Bewegungskontrolle zu verbessern.
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Die
erfindungsgemäße blockierende
Verbindung wird aus den in den anhängenden Ansprüchen 1 bis 6
beschriebenen Verbindungen ausgewählt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung zudem ein Verfahren sowohl
zur Erhöhung
des zirkulierenden Spiegels des verabreichten L-DOPA bei einer Säugetierart,
als auch zur Verbesserung der Verfügbarkeit von L-DOPA für das Gehirn
zur Verfügung,
wobei das Verfahren umfasst, dass dieser Säugetierart eine wirksame Menge
wenigstens einer der blockierenden Verbindungen wie obenstehend
beschrieben in sequentieller oder simultaner Kombination mit L-DOPA
verabreicht wird.
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Zusätzlich zur
Hemmung des apikalen tubulären
Abtransports von L-DOPA aus der Niere hemmen die hierin beschriebenen
Hemmverbindungen gleichzeitig peripheres AADC. Diese Verbindungen
erhöhen
die zirkulierenden Spiegel des verabreichten L-DOPA im Plasma, hemmen
AADC im äußeren Körperbereich
(„Peripherie") und verbessern
die Verfügbarkeit
des verabreichten L-DOPA für
das Gehirn.
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Vorzugsweise
umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
ferner die Verabreichung von bekannten AADC-Hemmern (wie zum Beispiel
Benserazid oder Carbidopa) oder Catechol-o-methyltransferase
(wie zum Beispiel Entacapon oder Tolcapon), entweder sequentiell
oder simultan mit den anderen aktiven Verbindungen. Zusätzlich werden
den aktiven Verbindungen inerte pharmazeutisch akzeptable Träger beigemischt.
Die pharmazeutisch akzeptablen Träger können entweder fest oder flüssig sein.
Präparationen
in fester Form umfassen Pulver, Tabletten, dispergierbare Granulate
und Kapseln. Ein Feststoffträger
kann ein oder mehrere Stoff(e) sein, der/die auch als Verdünnungsmittel
fungieren kann/können,
als Aromastoffe, als Lösungsmittel, als
Gleitmittel, als Suspensionsmittel, als Bindemittel oder als Tablettendisintegrationsmittel;
er kann auch ein einkapselndes Material sein.
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Bevorzugt
liegt die pharmazeutische Präparation
in Einheitsdosierungsform vor, zum Beispiel eine gekapselte Präparation,
bei der das Paket separate Mengen der Präparation umfasst, wie zum Beispiel
verpackte Tabletten, Kapseln und Pulvern in Fläschchen oder Ampullen.
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Die
Dosierungen können
je nach den Bedürfnissen
des Patienten, des Schweregrades der Krankheit und der jeweiligen
verwendeten Verbindung abgewandelt werden. Die gesamte tägliche Dosis
kann aus Bequemlichkeitsgründen
aufgeteilt werden und über
den Tag hinweg in Portionen verabreicht werden. Die geeignete Dosierung
für die
jeweilige Situation kann durch den Fachmann durchgeführt werden,
liegt aber im Falle der oben genannten blockierenden Verbindungen
bevorzugt im Bereich von etwa 40 μg
bis etwa 30.000 μg/kg pro
Behandlung.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden im Nachfolgenden anhand der Beispiele
detailliert beschrieben, und dabei wird auf die beigefügten Figuren
Bezug genommen, bei denen:
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1 ein
Graph ist, der die Wirkung der Testverbindungen auf die Akkumulation
von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen
zeigt, die 6 Minuten lang bei 37°C
mit 2,5 μM
des Substrats (L-DOPA) inkubiert wurden.
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2 ein
Graphenpaar ist, das die Wirkung der Testverbindungen auf den apikalen
Strom (2a) und die Zellakkumulation
(2b) von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen zeigt, die bei 37°C 6 Minuten
lang mit 25 μM
des Substrats (L-DOPA) inkubiert wurden, die aus der basolateralen
Zellgrenze angewendet wurde.
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3 ein
Graph ist, der die Wirkung der Testverbindungen auf die Decarboxylierung
von L-DOPA in LLC-PK1-Zellen darstellt, die bei 37°C für 6 Minuten
mit 250 μM
des Substrates (L-DOPA) inkubiert wurden.
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4 ein
Graph ist, der die Wirkung von steigenden Konzentrationen von Benserazid
auf die Aktivität der
aromatischen L-Aminosäurendecarboxylase
(AADC) von Gehirn, Leber und Niere, gemessen unter Vmax Bedingungen
(5 mM L-DOPA ; 15 Minuten Inkubation), darstellt.
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5 ein
Graph ist, der die Wirkung von Resveratrol auf die Spiegel von L-DOPA
im Plasma von Ratten, denen L-DOPA (12mg/kg) plus Benserazid (3
mg/kg) und Resveratrol verabreicht worden war, darstellt.
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MATERIALIEN UND VERFAHREN
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IN VITRO-UNTERSUCHUNGEN
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Zellen
der Zellkultur LLC-PK1, eine vom Schwein
stammende proximate tubuläre
Nierenepithelzellinie, die in Kultur einige Eigenschaften von proximalen
tubulären
Epithelzellinien beibehalten (Hull, R. N., et al., 1976, In Vitro
12, 670–677),
wurden von der amerikanischen Kulturensammlung „American Type Culture Collection" (Rockville, MD)
erhalten. LLC-PK1-Zellen (ATCC CRL 1392;
Absätze
198–206)
und wurden in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2-95%
Luft bei 37°C
erhalten und im Medium 199 (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo,
USA) gezüchtet
und mit 100 U/ml Penicillin G, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 100, μg/ml Streptomycin
(Sigma), 3% fötalem
Rinderserum (Sigma) und 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES;
Sigma) angereichert. Zur Abimpfung wurden die Zellen mit 0,05 Trypsin-EDTA
dissoziiert, 1:4 aufgeteilt, und in Costar-Kolben mit 75- oder 162-cm2 Wachstumsgebieten (Costar, Badhoevedorp, Niederlande)
abgeimpft. Für
die Aufnahmestudien wurden die Zellen in mit Kollagen behandelten
24-Well-Kulturclustern (innerer Durchmesser 16 mm, Costar) in einer
Dichte von 40 000 Zellen pro Well oder auf Kollagen behandelten
0,2 μm Polycarbonatfilterträgern (innerer
Durchmesser 12 mm Transwell, Costar) bei einer Dichte von 13.000
Zellen pro Well (2,0×104 Zellen cm2) angesät. Das Zellmedium
wurde alle 2 Tage gewechselt und die Zellen erreichten nach 3 bis
5 Tagen Inkubation eine Konfluenz. 24 Stunden vor jedem Experiment
war das Zellmedium frei von fötalem
Rinderserum. Im Allgemeinen wurden die Experimente 2–3 Tage
nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten durchgeführt, und
6–8 Tage
nach dem ersten Ansähen
umfasste jeder cm2 etwa 80 μg Zellprotein.
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TRANSPORTUNTERSUCHUNGEN
BEI LLC-PK1-ZELLEN
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Am
Tag des Experiments wurde das Wachstumsmedium aspiriert und die
Zellen wurden mit einem Hanks-Medium gewaschen; danach wurden die
Monoschichten der Zellen 15 bei 37°C Minuten lang in einem Hanks-Medium
vorinkubiert. Das Hanks-Medium wies die folgende Zusammensetzung
(mM) auf : NaCl 137, KCl 5, MgSO4 0,8, Na2HPO4 0,33, KH2PO4 0,44, CaCl2 0,25, MgCl2 1,0,
Tris HCl 0,15 und Natriumbutyrat 1,0, pH-Wert=7,4. Das Inkubationsmedium
umfasste auch Benserazid (1 μM)
und Tolcapon (1 μM)
um die Enzyme AADC bzw. Catechol-O-methyltransferase zu hemmen.
Zeitverlaufsstudien wurden bei den Experimenten durchgeführt, bei
denen die Zellen mit 0,5 μM
Substrat für
1, 3, 6 und 12 Minuten inkubiert wurden. Sättigungsexperimente wurden
in Zellen durchgeführt,
die 6 Minuten mit zunehmenden Konzentrationen von L-DOPA (2,5 bis
250 μM)
inkubiert wurden. Testsubstanzen wurden nur von der apikalen Seite
aus angewendet und waren während
der Vorinkubations- und Inkubationsphasen vorhanden. Während der
Vorinkubation und Inkubation wurden die Zellen ständig geschüttelt und
auf 37°C
belassen. Eine apikale Aufnahme wurde durch das Hinzufügen von
2 ml Hanks-Medium mit einer vorgegebenen Konzentration des Substrats
eingeleitet. Die Aufnahme wurde durch das schnelle Entfernen der
Aufnahmelösung
durch eine Vakuumpume, die mit einer Pasteurpipette verbunden war,
beendet, gefolgt von einer schnellen Waschung mit kaltem Hanks-Medium
und dem Hinzufügen
von 250 μl
an 0,2 mM Perchlorsäure.
Vor der Injektion in einen Hochdruckflüssigkeitschromatographen für die Prüfung von
L-DOPA wurden die angesäuerten
Proben bei 4°C
gelagert.
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Vorausgehende
Studien haben gezeigt, dass ein Teil des in den LLC-PK1-Zellen
akkumulierten L-DOPA die Zelle durch (einen) apikale(n) Transporteur
e) nach Außen
verlassen kann (Soares-da-Silva, et al., 1998, Am. J Physiol. 274,
F243–F251).
Die Hemmung dieses Vorgangs führt
zu einem Anstieg der zellulären Akkumulation
von L-DOPA (Soares-da-Silva,
et al., 1998, Br. J. Pharmacol. 123, 13–22). Daher wurden bei Experimenten,
die die Wirkung der Arzneimittel untersuchen sollten, die die intrazelluläre Akkumulation
von L-DOPA erhöhten,
die Zellen mit 25 μM
L-DOPA, angewendet
von der basalen Zellgrenze, inkubiert und die Aufnahme (Akkumulation
in der Monoschicht der Zelle) und der Fluss (Transfer in die gegenüberliegende Kammer)
wurden über
einen Zeitraum von 6 Minuten gemessen. Testarzneimittel wurden nur
von der apikalen Seite aus angewendet und waren während der
Vorinkubations- und der Inkubationsphasen vorhanden. Am Ende der Inkubation
wurden die Zellen auf Eis angeordnet und das Medium, in dem die
apikale Zellgrenze gebadet wurde, wurde gesammelt, mit Perchlorsäure angesäuert, und
bei 4°C
gelagert, bis es auf L-DOPA analysiert wurde. Die Zellen wurden
mit eiskaltem Hanks-Medium gewaschen und es wurde 0,2 mM Perchlorsäure (100 μl und 500 μl in den
oberen bzw. unteren Kammern) hinzugefügt; die angesäuerten Proben
wurden bei 4°C
gelagert, bevor sie für
die Analyse auf L-DOPA in den Hochdruckflüssigkeitschromatographen injiziert
wurden.
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DECARBOXLIERUNGSSTUDIEN
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Am
Tag des Experiments wurde das Wachstumsmedium aspiriert und die
Zellen (LLC-PK1) wurden mit Hanks-Medium gewaschen;
danach wurden die Zellmonoschichten bei 37°C 15 Minuten lang in einem Hanks-Medium
vorinkubiert. Das Hanks-Medium wies die folgende Zusammensetzung
(mM) auf : NaCl 137, KCl 5, MgSO4 0,8, Na2HPO4 0,33, KH2PO4 0,44, CaCl2 0,25, MgCl2 1,0,
Tris HCl 0,15 und Natriumbutyrat 1,0, pH-Wert=7,4. Das Inkubationsmedium
enthielt zudem Pyridoxalphosphat (120 μM), Tolcapon (1 μM) und Pargylin
(100 μM).
Sättigungsexperimente
wurden in Zellen durchgeführt,
die 6 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen von L-DOPA (2,5
bis 250 μM)
inkubiert wurden. Bei Experimenten zum Studium der Wirkungen der
Testverbindungen auf die Decarboxylierung von L-DOPA, wurden Zellen
in Gegenwart der zu testenden Verbindungen 30 Minuten lang
vorinkubiert. Nach der Vorinkubation wurden die Zellen 6 Minuten
in einem Hanks-Medium mit 250 μM
L-DOPA inkubiert. Die Umsetzung wurde durch das Hinzufügen von
250 μl 0,2
mM Perchlorsäure
beendet. Die angesäuerten
Proben wurden vor der Injizierung in einen Hochdruckflüssigkeitschromatographen
für die
Analyse auf Dopamin bei 4°C
gelagert.
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VITALITÄTSTEST DER
ZELLEN
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Auf
Plastikträgern
kultivierte Zellen wurden 15 Minuten lang bei 37°C vorinkubiert und dann in Abwesenheit
oder in Gegenwart von L-DOPA und Testverbindungen weitere 6 Minuten
lang inkubiert.
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Danach
wurden die Zellen bei 37°C
2 Minuten lang mit Trypanblau (0,2% w/v) in einem Phosphatpuffer inkubiert.
Die Inkubation wurde beendet, indem die Zellen zweimal mit Hanks-Medium
gespült
wurden, und die Zellen wurden unter Verwendung eines Leica-Mikroskops
untersucht. Unter diesen Umständen
schlossen mehr als 95% der Zellen den Farbstoff aus.
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IN VIVO-STUDIEN
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Diese
Experimente wurden entwickelt, um die Wirkung der Testverbindungen
auf die biologische Verfügbarkeit
von L-DOPA und auf
den Zugang von L-DOPA zum Gehirn zu bewerten. In allen Experimenten
wurden männliche
Wistar-Ratten mit
einem Gewicht von 170–280
g, von denen jeweils zwei in einem Käfig unter kontrollierten Umweltbedingungen
gehalten wurden (Hell-Dunkel-Zyklus 12 Stunden und Raumtemperatur 24°C) verwendet.
Die Ratten wurden in vorher bestimmten Intervallen durch Enthauptung
getötet
und ihre Gehirne, Leber und Nieren wurden entfernt und zur Bestimmung
von L-DOPA, Dopamin und DOPAC verwendet.
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ANALYSE VON
AADC IM RATTENGEWEBE
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In
einigen Experimenten wurde die AADC Aktivität in Gehirn, Leber und Niere
unter Vmax-Bedingungen (5 mM L-DOPA;
Inkubation 15 Minuten) wie obenstehend beschrieben (Soares-da-Silva,
et al., 1994, Br. J. Pharmacol. 112, 611–615) bestimmt. Die Umsetzung
wurde durch das Hinzufügen
von 500 μl
2M Perchlorsäure
beendet, und die Präparationen
wurden 60 Minuten lang auf 4°C
behalten. Die Proben wurden danach zentrifugiert (200 g, 2 Minuten,
4°C) und
500 μl Aliquots
des auf den Spin-X-Filter-Röhrchen (Costar)
gefilterten Überstandes
wurden für
die Analyse von Dopamin verwendet.
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ANALYSE VON L-DOPA, DOPAMIN
UND AMINMETABOLITEN
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L-DOPA,
Dopamin und Aminmetabolite (DOPAC und HVA) wurden unter Verwendung
eines Hochdruckflüssigkeitschromatographen
mit elekrochemischer Detektion quantifiziert, wie obenstehend berichtet
(Soares-da-Silva und Garrett, 1990, Neuropharmacol. 29, 869–874; Soares-da-Silva,
et al., 1998, Am. J. Physiol. 274, F243–F251). Das Hochdruckflüssigkeitschromatographensystem
bestand aus einer Pumpe (Gilson Modell 302 ; Gilson Medical Electronics,
Villiers le Bel, Frankreich), die mit einem manometrischen Modul (Gilson Modell
802C) und einer Edelstahl-5 μm-ODS-Säule (Biophase;
Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) mit einer Länge von
25 cm verbunden war; die Proben wurden mittels eines automatischen
Probeninjektors (Gilson Modell 231), der mit einem Gilson-Verdünner verbunden
ist (Model 401), eingespritzt. Die mobile Phase war eine entgaste
Lösung
aus Zitronensäure
(0,1 mM), Natriumoctylsulphat (0,5 mM), Natriumacetat (0,1 M), EDTR
(0,17 mM), Dibutylamin (1 mM) und Methanol (8% v/v), die mit Perchlorsäure (2 M)
auf den pH-Wert 3,5 angepasst, und auf eine Geschwindigkeit von
1,0 ml/min–1 gepumpt
wurde. Die Detektion wurde elektrochemisch mit einer gläsernen Kohlenstoffelektrode,
einer Ag/AgCl Referenzelektrode und einem amperometrischen Detektor
(Gilson Modell 141) durchgeführt;
die Detektorzelle wurde bei 0,75 V betrieben. Der erzeugte Strom
wurde unter Verwendung der Gilson 712 HPLC Software überwacht.
Die niedrigeren Grenzen für
die Detektion von L-DOPA, Dopamin, DOPAC, 3-MT und HVA lagen im
Bereich von 350 bis 500 fmol.
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DATENANALYSE
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Km- und Vmax-Werte
für die
Aufnahme von L-DOPA, wie in Sättigungsexperimenten
bestimmt, wurden aus nichtlinearer Regressionsanalyse unter Verwendung
des Software-Pakets „GraphPad
Prism statistics software package" (Motulsky, P. Spannard, R. Neubig.
GraphPad Prism (Version 1.0) San Diego, USA: GraphPad Prism Software
Inc., 1994) berechnet.
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Der
apikale fraktionelle Ausfluss wurde unter Verwendung der Formel
L-DOPAApikalflüssigkeit/
(L-DOPAApikalflüssigkeit+L-DOPAZelle) berechnet, wobei L-DOPAApikalflüssigkeit die
Menge von L-DOPA (in nmol/mg Protein) angibt, die die apikale Kammer
erreichte und L-DOPAZelle (in nmol/mg Protein)
die Menge an L-DOPA angibt, die in der Zellmonoschicht akkumuliert
war. Mit S.E.M. stehen arithmetische Mittel zur Verfügung. Die
statistische Analyse wurde durch One-Way-Analyse der Abweichung (ANOVA) durchgeführt, gefolgt
von einem Newman-Keuls-Test für
multiple Vergleiche.
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Es
wurde angenommen, dass ein pH-Wert von weniger als 0,05 einen signifikanten
Unterschied bedeutet.
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ERGEBNISSE
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Die
Akkumulation einer nicht sättigenden
Konzentration (0,5 μM)
an L-DOPA bei Zeitverlauf-Experimenten, stieg linear mit der Zeit
für einige
Minuten an. Nach einer Inkubation von 6 Minuten, wenn die Aufnahme
hinsichtlich der Zeit linear war, und intrazelluläres Wasser
als 7,0±0,7 μl/mg Protein
angesehen wurde (Soares-da-Silva, et al., 1998, Am. J. Physiol.
274, F243-F251), betrug die intrazelluläre L-DOPA Konzentration bei
einer Mediumkonzentration von 0,5 μM 4,0±0,4 μM. Dies stellte eine Zellkonzentration
von L-DOPA dar, die 8,0±0,8
mal höher
war als die entsprechende Mediumkonzentration: Bei den Experimenten
zur Bestimmung der kinetischen Parameter des apikalen Transporters
von L-DOPA wurden die Zellen 6 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen
(1 bis 250 μM)
des Substrats inkubiert. Die nicht-lineare Analyse der Sättigungskurve
für L-DOPA
ergab einen Km-Wert (in μM) von 47±8 und einen Vmax-Wert
(in pmol mg Protein/6 Minuten) von 3069±224.
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Zur
Bewertung der metabolischen Anforderungen für die Aufnahme von L-DOPA wurden
die Zellen bei 4°C
inkubiert. Die Wirkung einer Verringerung der Temperatur von 37
auf 4°C
während
der Vorinkubation und der Inkubation stellte eine merkliche Abnahme
(Verringerung 77±2%)
bei der L-DOPA Akkumulation
(2,5 μM) dar.
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Eine
Verringerung des extrazellulären
Natriums (von 140 mM auf 70,35 und 0 mM) hatte keine Auswirkung
auf die Akkumulation von L-DOPA. Überdies waren in Abwesenheit
des extrazellulären
Natriums (ersetzt durch eine equimolare Konzentration von Cholin),
die Km- und Vmax-Werte für L-DOPA
denen, die in der Gegenwart von Natrium beobachtet wurden, ähnlich.
N-(Methylamino)isobuttersäure
(MeAIB) konnte die Aufnahme von L-DOPA nicht beinflussen, wohingegen
2-Aminobicyclo(2,2,1)heptan-2-carboxylsäure (BHC) eine konzentrationsabhängige Hemmung
der L-DOPA-Aufnahme (IC50=407 μM) erzeugte.
Die inhibitorische Wirkung von 1 mM BHC auf die Akkumulation von
L-DOPA war von konkurrenzbetonter Art, wie durch den Anstieg der
Km- (130±19 μM) aber nicht Vmax-
(3783±244
pmol/mg Protein/6 Minuten) Werte für die L-DOPA-Aufnahme belegt
wurde. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass der apikale
Transfer von L-DOPA nach innen durch den BHC-sensitiven und Natrium-unabhängigen Aminosäurentransporter
vom L-Typ gefördert werden
kann (Audus and Borchardt, 1986, J. Neurochem. 47, 484–488).
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Es
wurde herausgefunden, dass die Hemmer des Abtransportes von L-DOPA
aus den Nierenzellen die Akkumulation von L-DOPA (2,5 μM) in einer
von der Konzentration abhängigen
Art und Weise mit EC50-ern von 6 bis 339 μM (1)
erhöhen.
Es wurde herausgefunden, dass die Vorbehandlung der Zellen mit den
Testverbindungen die Maximalakkumulation (Vmax)
der steigenden Konzentrationen von L-DOPA deutlich erhöhen (P<0,05), ohne dass
dabei die Km-Werte deutlich verändert werden.
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Um
darzustellen, dass eine erhöhte
Akkumulation von L-DOPA,
die durch die Testverbindungen hervorgerufen worden war, auf einen
verringerten Abtransport von intrazellulärem (kürzlich akkumulierten) L-DOPA
zurückzuführen war,
wurden in Polcarbonatfiltern kultivierte Zellen mit L-DOPA (25 μM) von der
Basalzellgrenze angewendet, und der Basal-Apikal-Flux von L-DOPA
wurde gemessen. Wie in 2 dargestellt, verringerten
die Testverbindungen den Basal-Apikal-Flux von L-DOPA und erhöhten die
Akkumulierung von L-DOPA in der Zelle, wobei sie Ihre Wirkung als
Blocker des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen deutlich
zeigten.
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Die
nächste
Experimentenreihe hatte das Ziel, die inhibitorische Stärke der
Testverbindungen auf AADC zu bewerten. Zu diesem Zweck wurden LLC-PK1-Zellen 30 Minuten lang mit steigenden Konzentrationen
der Testverbindungen oder Benserzarid vorinkubiert; danach wurden
die Zellen mit einer Konzentration von L-DOPA inkubiert, die der
Sättigung
nahe kam (250 μM).
Wie in 3 gezeigt, wurde herausgefunden, dass die Testverbindung
die AADC-Aktivität
in einer von der Konzentration abhängigen Art und Weise hemmen,
wie durch die Umwandlung von L-DOPA zu Dopamin gemessen wurde. Die
IC50's
reichten von 0,07 μM (für Benserazid)
bis 393 μM
(für die
weniger starken).
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In
in vivo-Experimenten wurde Ratten die Restverbindung 30 Minuten
vor der Verabreichung von L-DOPA oder L-DOPA und Benserazid oral
verabreicht. Da hohe Dosen von Benserazid in der Hemmung von AADC
im Gehirn (Da Prada, et al., 1987, Eur. Neurol. 27, 9–20) resultieren
können,
wurden vorbereitende Experimente durchgeführt, um die Dosis an Benserazid
zu bestimmen, die die AADC-Aktivität im Gehirn nicht beeinflusste.
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Wie
in 4 gezeigt, betrug die Dosis an Benserazid, die
die maximale Hemmung des AADC von Leber und Niere erzeugte, ohne
Wirkung auf das AADC im Gehirn, 3 mg/kg Benserazid, dies ist völlig konform mit
den Daten von anderen (Da Prada, et al., 1987, Eur. Neurol. 27,
9–20).
Zur Anpassung an das für
gewöhnlich
bei Menschen verwendete Verhältnis
von L-DOPA/Benserazid (Verhältnis
4:1) wurde die verwendete L-DOPA-Dosis auf 12 mg/kg festgelegt.
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Als
nicht anästhesierten
Ratten Resveratrol 30 Minuten vor der Verabreichung von L-DOPA (12mg/kg) plus
Benserazid (3 mg/kg) oral verabreicht wurde, war das Ergebnis ein
deutlicher Anstieg der L-DOPA-Werte im Gewebe, ebenso wie der Dopamin-
und Aminmetaboliten im Gehirn (Tabelle 1). Der Anstieg der Plasmaniveaus
von L-DOPA (5)
und der Anstieg der Gewebewerte von L-DOPA und Dopamin in der Niere
(Tabelle 1) begleitete diese Effekte. Es ist möglich, dass die AADC hemmende
Wirkung von Resveratrol nicht groß dazu beitrug, die Verfügbarkeit
von L-DOPA zu verbessern. Erstens waren bei Rattert, denen das Testresveratrol verabreicht
wurde, der Dopaminspiegel in der Niere größer als bei den entsprechenden
Kontrolltieren (Ratten, denen L-DOPA mit Benserazid verabreicht
worden war). Zweitens war die hemmende Wirkung von 30 mg/kg Resveratrol
auf die AADC-Aktivität von Leber
und Niere (Leber 48% Reduktion; Niere 38% Reduktion) signifikant
geringer als diejenige, die für
Benserazid beobachtet wurde (4).
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Alles
in Allem zeigen die obenstehend genannten Daten, dass die Blocker
des Abtransportes von L-DOPA aus den Nierenzellen höhere L-DOPA-Niveaus
im Plasma zur Folge haben und dessen Verfügbarkeit für das Gehirn verbessern.
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Tabelle
1. Niveau (in ng/g) von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin
(L-DOPA), Dopamin (DA), 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC)
und Homovanillinsäure
(HVR) in Gehirn und Niere nach der Verabreichung des Vehikels (0,5%
Carboxymethylcellulose, 4 ml/kg), L-DOPA (L, 12 mg/kg), L-DOPA (L,
12mg/kg) mit Benserazid (B, 3 mg/kg) und Resveratrol (R) mit L-DOPA
(L ; 12 mg/kg) mit Benserazid (B, 3 mg/kg). Resveratrol wurde 30
Minuten vor dem L-DOPA+Benserazid verabreicht, und die Ratten wurden 60
Minuten nach der Verabreichung von L-DOPA+Benserazid getötet.
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Signifikant
unterschiedlich von den entsprechenden Werten bei Ratten, die mit
L-DOPA (L, 12 mg/kg) mit Benzerazid (B, 3 mg/kg) (*P<0,05) behandelt
wurden.