KR101327936B1 - 옥시레스베라트롤 이민 유도체를 유효성분으로 함유하는 뇌신경보호 효과를 가지는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 옥시레스베라트롤 이민 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 보호효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 옥시레스베라트롤 이민 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 산화적손상에 대한 뇌신경 보호효과를 나타냄으로써, 뇌신경세포의 산화적 손상 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

옥시레스베라트롤 이민 유도체를 유효성분으로 함유하는 뇌신경보호 효과를 가지는 조성물{Composition comprising oxyresveratrol imine derivative having the neuroprotective effects}

본 발명은 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol) 이민 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌신경보호 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.

산화적 스트레스의 증가는 심혈관질환, 노화 및 많은 뇌질환의 발생과 연관이 있다. 와인에 함유되어 있는 항산화물질인 레스베라트롤(resveratrol) (trans-3,4’,5-trihydroxystilbene)은 심혈관질환의 발생을 억제하며 이는 French paradox라는 임상현상으로 잘 알려져 있다. 이러한 레스베라트롤의 심혈관질환 억제효과는 항산화작용이 큰 원인인 것으로 밝혀진바 있으며 최근에는 레스베라트롤이 산화적손상에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제한다는 연구 보고가 있었다.

한편, 옥시레스베라트롤은 하이드록시스틸벤(hydroxystilbene)에 속하는 천연물질로써 레스베라트롤의 구조에 한 개의 하이드록실기를 더 갖고 있다. 최근에는 옥시레스베라트롤이 레스베라트롤에 비해 탁월한 티로시네이즈(tyrosinase) 억제효과 및 항산화효과를 나타낸다고 보고된 바 있다. 따라서 본 연구에서는 옥시레스베라트롤의 화학구조를 기본으로 한 유도체 중 더욱 뛰어난 항산화, 뇌신경보호효과를 나타내는 물질을 도출하고자 하였다.

이에 본 발명자들은 뇌신경 보호효과를 갖는 신규 옥시레스베라트롤 유도체를 합성하기 위하여 지속적인 연구를 수행해 오던 중 옥시레스베라트롤 유래의 물질 중에서 4개의 하이드록실기 자리에 메톡시기를 가지고 두 벤젠링 사이에 이민 형태를 가지고 있는 신규 옥시레스베라트롤 이민 유도체가 뛰어난 뇌신경보호효과를 나타냄을 확인하게 되었다.

따라서, 본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 옥시레스베라트롤 이민 유도체를 함유하는 뇌신경세포의 산화적손상 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 (I)로 표기되는 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

(I)

본 발명의 일 구체예는 파라아니스알데히드(p-anisaldehyde)와 아닐린(aniline)을 반응시켜서 제조되는 약학조성물을 제공하고, 상기 반응은 -30℃ ~ -10℃에서 재결정을 추가로 포함하며, 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 유기 용매를 사용하여 제조된다.

본 발명의 일 구체예는 뇌신경 세포의 산화적 손상을 예방 및 치료하는 약학조성물을 제공하고, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 헌팅턴병 또는 파킨슨병으로부터 선택된 질병을 예방 및 치료한다.

본 발명의 일 구체예는 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 약학조성물을 제공하고, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 형태인 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예는 상기 화학식 (I)로 표기되는 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물을 유효성분으로 포함하는 뇌신경 질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예는 상기 화학식 (I)로 표기되는 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예는 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 조성물을 제공하고, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 형태인 조성물을 제공한다.

상기한 과제 해결 수단에 의한 본 발명에 따르면, 본 발명은 옥시레스베라트롤 이민 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하며, 본 발명의 조성물은 산화적 손상에 대한 뇌신경 보호효과를 나타냄으로써, 뇌신경세포의 산화적 손상 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 PC12 세포내 과산화수소(H₂O₂) 주입에 대한 뇌신경세포 보호효과를 나타낸 것이다.
도 2는 과산화수소의 제거효과를 나타낸 것이다. (Res: 레스베라트롤, Oxy: 옥시레스베라트롤)
도 3은 PC12 세포내 ROS 생성을 A: 컨트롤(Control), B: 하이드록시퍼록사이드(Hydroxyperoxide), C: 하이드록시퍼록사이드 및 200μM (3,5- 디메톡시벤질리덴)-(2,4- 디메톡시페닐아민)로 나타낸 것이다.
도 4는 PC12 세포내 ROS 생성을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 옥시레스베라트롤 이민 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 옥시레스베라트롤 이민 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 산화적손상에 대한 뇌신경 보호효과를 나타냄으로써, 뇌신경세포의 산화적 손상 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

구체적으로는, 본 발명은 하기 화학식 (I)로 표기되는 옥시레스베라트롤 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

　　　(I)

상기 구조식 (I)로 표기되는 본 발명의 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염으로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의　　 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 물질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 <22> 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 물질을 포함하는 조성물은 뇌신경 질환을 개선하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에 따른 물질을 포함하는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 또한, 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 필수 성분으로서 본 발명에 따른 물질을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 10 g, 바람직하게는 약 5 내지 6 g이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.　 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1. (3,5- 디메톡시벤질리덴 )-(2,4- 디메톡시페닐아민 )의 합성

파라아니스알데히드(p-anisaldehyde) (1.2 ml, 10.0 mmol) 와 아닐린 (910 ml, 10.0 mmol)을 메탄올(50 ml)에 녹인 후 12 시간 동안 환류하였다. 얻어진 반응물을 -20℃에서 재결정하여 27 mg의 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)을 얻었다.

(3,5- 디메톡시벤질리덴)-(2,4- 디메톡시페닐아민):

Brownish solid; 1H-NMR(CDCl3, 300MHz)δ: 8.42 (s, 1H), 7.05 (2H, d, J = 2.4 Hz), 7.01 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.55 (m, 2H), 6.49 (1H, dd, J = 2.7 Hz; 2.7 Hz), 3.87 (3H, s), 3.84 (6H, s), 3.82 (3H, s); 13C-NMR(CDCl3, 75MHz)δ: 159.47, 138.63, 134.76, 120.70, 115.13, 107.10, 107.04, 106.24, 104.31, 104.15, 103.84, 99.48, 99.31, 55.82, 55.69, 55.50, 55.44. MS (EI+) m/z 301 (M+,100), 286(19), 271(8), 242(8), 228(11), 164(40), 150(21), 135(18).

이름	구조
(3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)

실시예 2. 뇌신경세포 보호효과

(1) 세포배양

　PC12 rat pheochromocytoma 세포를 the American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하여 10% FBS, 5% 말혈청(horse serum), 2 mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)이 함유된 Dulbecco’s modification of Eagle medium (DMEM) 배지를 사용하여 poly-D-lysine (50 μg/ml)이 코팅된 배양 용기에서 배양하였다.

(2) 세포생존율

PC12 세포에 90분간 실험물질을 2~200 μM 처리한 후 300 mM H2O2에 노출시켰다. 24시간 배양한 후 배양액의 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) (LDH) 농도를 다음과 같이 측정하였다.　 기질 [1.4 mM β-nicotinamide adenine dinucleotide in 0.75 mM pyruvate] 30 μl 와 medium 30 μl 를 96-well plate에 섞은 후 37℃에서 30분간 배양하였다. 여기에 2,4-디니트로페닐하이드라진 (1 mM in 1 N HCl) 30 μl를 첨가한 후 상온에서 20분간 배양하고 0.4 N NaOH를 100 μl 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(3) 뇌신경세포보호효과

본 발명에서는 뇌신경세포에 대한 보호효과를 측정하기 위하여　PC12 rat adrenal pheochromocytoma 세포를 사용하였다. PC12 세포는 도파민 작용성의 뇌신경 세포로 중금속 이온 및 자유라디칼 데미지에 민감한 세포로 널리 사용되고 있다. PC12 세포에 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)과 옥시레스베라트롤을 각각 90분간 처리한 후 과산화수소를 24시간 동안 처리한 결과 옥시레스베라트롤은 20 μM에서 33.1%의 세포사멸을 억제하였으나 200 μM에서는 뇌신경세포보호효과를 나타내지 못하였다. 반면 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)는 200 μM에서 81.2%의 뇌신경보호세포효과를 나타내어 옥시레스베라트롤에 비하여 매우 우수한 보호효과를 보였다.　 상기 실험결과를 표 2 및 도 1에 나타내었다.

	2 μM	20 μM	200 μM
레스베라트롤	4.9 ± 5.1	29.8 ± 4.5	-16.7 ± 4.4
옥시레스베라트롤	4.8 ± 6.2	33.1 ± 5.8	-9.6 ± 6.3
(3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)	9.3 ± 5.6	29.9 ± 5.6	81.2 ± 6.1

실시예 3. 과산화수소 제거효과 측정

(1) 과산화수소 제거효과

과산화수소 제거효과는 카탈라제 측정 키트(Sigma CAT100, USA)를 이용하여 측정하였다. 200 mM 과산화수소 용액 25 μl와 50 mM 포타슘 인 버퍼(potassium phosphate buffer) (pH 7.0)에 녹인 실험물질 75 μl을 잘 섞은 후 5분간 상온에서 incubation 하고 증류수에 녹인 15 mM 아지드화물(sodium azide) 900 μl를 첨가하였다. 반응물 10 μl에 0.25 mM 4-아미노안티피린 및 2 mM 3,5-디클로로-2-하이드록시벤젠설포닉산이 함유된 150 mM 포타슘 인 버퍼 (pH 7.0) 1 ml을 첨가하고 15분간 상온에서 배양한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.　

(2) 과산화수소 제거효과 측정

카탈라제 측정 키트를 이용하여 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)의 과산화수소 제거효과를 측정하였다. 측정결과 옥시레스베라트롤은 농도의존적인 과산화수소 제거효과를 나타내었으나 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)는 모든 측정농도에서 과산화수소 제거효과를 나타내지 못하였다. 상기 실험결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 4. 세포내 ROS 생성억제효과 측정

(1) 세포내 ROS 측정

세포내 ROS 생성량은 ROS-sensitive fluorescent dye 2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate (DCF-DA, Sigma, USA)로 염색하여　 fluorescent microscopy를 사용하여 측정하였다. PC12 세포에 하이드로겐 퍼록사이드와 실험물질을 1시간 처리한 후 PBS로 씻고 3 mM DCF-DA 첨가하여 30분간 배양하였다. 플루오레슨스는 fluorescent microscopy (Carl Zeiss LSM 510 Meta, Oberkochen,Germany)를 이용하여　 485-535nm에서 측정하였다.

(2) 세포내 ROS 생성억제효과

ROS의 과생성은 산화적 스트레스, 세포생리억제, 세포자연사를 유발한다. (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)이 PC12 세포내 ROS 생성을 억제하는지 알아보기 위하여 fluorescent dye DCF-DA를 이용하여 ROS 수준을 측정하였다. 과산화수소를 처리한 PC12 세포는 세포내 ROS 생성이 증가되었으나 200 μM (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)를 처리한 결과 세포내 DCF 플루오레슨스의 량이 유의적으로 감소하였다. 상기 실험결과를 도 3에 나타내었다.

상기 실험결과, (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)은 옥시레스베라트롤에 비하여 매우 높은 뇌신경보호효과를 나타내었고 세포내 ROS 생성을 억제하였다. 반면에 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)은 세포 free상-과산화수소 제거효과는 없었는데 이러한 결과를 종합하여 볼 때 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민)의 신경세포 보호효과는 직접적인 자유 라디칼 제거효과가 아니라 세포내의 ROS 생성억제효과에 의한 것으로 판단된다.

상기 실험예들의 데이터는 3회 반복실험값의 means ± SD로 나타내었고 유의성 검정은 ANOVA를 이용하여 분석하였다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 (I)로 나타내는 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물을 유효성분으로 포함하는, 뇌신경 세포의 산화적 손상, 또는 중풍, 치매, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 파킨슨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
   

   

   (I).
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물은 파라아니스알데히드(p-anisaldehyde)와 아닐린(aniline)을 반응시켜서 제조되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 반응은 -30℃ ~ -10℃에서의 재결정을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 반응은 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유기 용매 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 제형화된 약학 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 형태로 제형화된 약학 조성물.
9. 삭제
10. 하기 화학식 (I)로 나타내는 (3,5-디메톡시벤질리덴)-(2,4-디메톡시페닐아민) 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 약학 조성물:
    

    

    (I).
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 조성물은 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 제형화된 약학 조성물.
12. 제 10 항에 있어서,
    상기 조성물은 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 형태로 제형화된 약학 조성물.

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