KR20140070176A

KR20140070176A - 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140070176A
Application number: KR1020120138345A
Authority: KR
Inventors: 조시영; 서대방; 박찬웅; 김완기; 이상준
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2014-06-10
Also published as: US9795583B2; KR102016078B1; CN104812385A; US20150283110A1; JP2016502539A; WO2014084658A1; HK1207579A1

Abstract

본 발명은 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 (+)-시링가레시놀을 포함하는 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

심장 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF CARDIOVASCULAR DISEASE}

허혈은 심근 손상을 일으키는 가장 흔한 원인이며 허혈을 일으키는 주된 질환인 관상 동맥 질환은 오늘날 심부전의 가장 중요한 병인이다. 심장에 혈액을 공급하는 관상 동맥에 심한 협착이나 폐색이 발생하면 세포의 생존에 필요한 산소 및 영양소 공급이 차단되고 이 결과, 세포는 사멸하거나 심각한 기능 장애를 나타내게 된다. 특히 심근 세포는 재생, 증식하는 능력이 미약한 세포로서 허혈로 인한 심근 세포의 소실은 심장 기능의 악화에 큰 영향을 미친다.

따라서 심근세포의 사멸을 억제하면 그로 인한 심장질환인 심근경색 등의 질환을 예방, 치료할 수 있을 것으로 여겨진다. 현재 심근경색증에 대한 약물 치료는 심근경색증으로 인한 심실의 변화를 방지하도록 하는 데 중점을 둔다. 그래서 스텐트를 심거나 혈전 억제제인 아스피린 또는 플라빅스 등의 심장 보호 효과를 부가적으로 가지는 혈압약을 사용하고 있다. 그러나 현재까지 심근경색증 치료 중에 죽은 심장 근육을 획기적으로 회생시키는 방법은 없었다.

본 발명자들은 (+)-시링가레시놀을 심근세포에 처리하면 심근세포의 사멸을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 제10-2004-0050396호

본 발명의 목적은 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 화학식 1의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 화학식 1의 화합물, 구체적으로 (+)-시링가레시놀을 유효성분으로 포함하여 SIRT 1 발현을 증강시켜 활성산소에 의해 유도된 심근세포의 사멸을 억제할 수 있어서, 심장 질환을 예방 또는 개선함에 있어 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다. 그러므로 본 발명은 심혈관 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 개선하여 이를 치료할 수 있다.

도 1은 (+)-시링가레시놀[syn(+)], (-)-시링가레시놀[syn(-)] 및 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(GB)]을 각각 처리한 심근세포에서 SIRT 1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다. DMSO(dimethyl sulfoxide) 는 대조군으로 사용하였다.
도 2는 과산화수소수 (H₂O₂)를 처리한 심근세포에 (+)-시링가레시놀[H₂O₂+syn(+)] 또는 (-)-시링가레시놀 [H₂O₂+syn(-)] 를 처리하여 세포의 사멸이 억제한 정도를 나타낸 그래프이다. DMSO(dimethyl sulfoxide) 는 대조군으로 사용하였다.
도 3은 과산화수소수 (H₂O₂)를 처리한 심근세포에 (+)-시링가레시놀[syn(+)] 또는 (-)-시링가레시놀 [syn(-)] 를 처리하고, ELISA 리더 (Thermo Max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 540 nm의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)을 측정한 결과이다.
도 4는 가시오가피로부터 시링가레시놀을 분리하고 정제하는 방법을 도식화한 것이다.
도 5는 가시오가피 메탄올 추출물(가시오가피 M)과 가시오가피 에틸 아세테이트 추출물(가시오가피 M-E)에 대한 HPLC 결과이다.
도 6은 진생베리로부터 시링가레시놀을 분리하고 정제하는 방법을 도식화한 것이다.
도 7은 진생베리 (인삼열매)로부터 추출한 시링가레시놀의 광학이성질체 간의 비를 나타낸 것이다.
도 8은 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(GB)], 합성한 (+)-시링가레시놀[syn(+)], 합성한 (+)-시링가레시놀과 합성한 (-)-시링가레시놀이 1:1[syn(+/-1:1)], 2:1[syn(+/-2:1)], 5:1[syn(syn(+/-5:1))] 또는 10:1[syn(syn(+/-10:1))]의 비를 가지는 경우 및 가시오가피로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(가시오가피)]를 세포에 처리하고, 해당 세포에서 SIRT1 유전자의 발현 정도를 측정한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로,

상기 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 독립적으로 직쇄(unbranched) 또는 분지(branched)된, C₁내지 C₁₈의 알킬기(alkyl group), C₁내지 C₁₈의 알케닐기(alkenyl group), C₁내지 C₁₈의 알키닐기(alkynyl group) 또는 C₃내지 C₆의 사이클릭 알킬기(cyclic alkyl group)이다.

본 명세서에서 "유도체"는 화합물들의 치환 가능한 위치에서 다른 치환기로 변경되는 모든 화합물을 의미한다. 이러한 치환기의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대 각각 독립적으로 히드록실, 페녹시, 티에닐, 푸릴, 피리딜, 시클로헥실, 알킬알콜, 알킬디알콜 또는 임의 치환된 페닐로 치환될 수 있는 C₁ _- ₁₀비사이클릭 탄화수소기; 히드록실, 히드록시메틸, 메틸 또는 아미노로 치환될 수 있는 C₅ _- ₆사이클릭 탄화수소기; 또는 당 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "당 잔기"라는 용어는 다당류 분자로부터 1개의 수소 원자의 제거시의 기를 의미하며, 따라서 예를 들어 단당류 또는 올리고당으로부터 유래된 잔기를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능"이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나 승인 받거나, 또는 약전에 열거되거나 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다. 아울러, 본 명세서에 따른 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 화합물은 (+)-시링가레시놀 (syringaresinol), 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "(+)-시링가레시놀(syringaresinol)"은 화학식 2와 같은 화학 구조를 가지는 리그난계 화합물로, 화학 합성을 통해 얻거나, 아마씨, 황백, 오가피, 참깨 및 인삼 열매 중 하나 이상으로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 일측면은 (+)-시링가레시놀(syringaresinol)을 유효 성분으로 포함하여 심근세포의 사멸을 억제할 수 있다. (+)-시링가레시놀은 심근세포에서 SIRT 1의 발현을 촉진하며, 활성산소에 의해 유도된 세포사멸을 억제할 수 있는 반면, 이의 광학이성질체인 (-)-시링가레시놀은 (+)-시링가레시놀과 달리, SIRT1발현을 증가시키지 못해서 심근세포를 보호하는 효과가 없다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 심장 질환은 심혈관 질환을 포함한다.

본 명세서에서 "심혈관질환"은 혈관이 막히거나 터지면서 조직에 혈액 공급의 장애를 유발하는 질환으로서, 뇌경색, 뇌출혈, 허혈성 심질환, 심근경색, 동맥경화 등을 대표적인 예로 들 수 있다. 이러한 심혈관 질환은 나이가 들어감에 따라 혈관을 구성하는 내피세포가 노화되고 그 과정에서 기능 이상이 축적되어 발생할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 화학식 1의 화합물, 구체적으로 (+)-시링가레시놀을 유효 성분으로 포함하여 심혈관 질환을 예방 또는 개선하는 효과가 우수하므로, 심혈관 질환, 특히 노화성 심혈관 질환을 예방 또는 개선함에 있어 뛰어난 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 심장 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 고혈압, 허혈성 심질환, 심근 경색, 심부전 및 동맥 경화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

허혈성 심장질환은 심근세포에 혈액을 공급하는 관상순환계의 이상으로 심근이 충분한 양의 산소와 영양분을 받지 못해서 사멸하여 발생하는 질환을 말하며, 심근경색, 협심증, 심인성 급사 및 심부전 등을 대표적인 예로 들 수 있다. 이러한 허혈성 심장 질환은 나이가 들어감에 따라 다양한 대사성 질환에 의해 유발되며 우리나라 사망원인 2위이다. 본 발명에 따른 조성물은 (+)-시링가레시놀을 유효 성분으로 포함하여 심근세포의 사멸을 억제하는 효과가 우수하므로, 심장 질환, 특히 노화성 심장 질환을 예방 또는 개선함에 있어 뛰어난 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 조성물 총중량을 기초로 0.001 중량% 내지 80 중량%의 (+)-시링가레시놀을 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 조성물 전체 중량을 기초로 1 중량% 내지 80 중량%, 구체적으로 5 중량% 내지 60 중량%, 더 구체적으로 10 중량% 내지 30 중량%의 (+)-시링가레시놀을 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 사용하는 것이 적절할 수 있다. 구체적으로 (+)-시링가레시놀이 1 중량% 미만인 경우 심근세포 사멸 억제 효과를 얻을 수 없고, 80 중량%를 초과하는 경우 안전성 및 제형 안정성이 낮아질 수 있다.

SIRT 1(Sirtuin 1)은 효모의 잠재 정보 조절자 2(silencing information regulator 2, Sir2)의 포유 동물 호몰로그로서 NAD⁺ 의존적인 히스톤 탈아세틸화 효소이다. 칼로리를 제한하는 경우, 혈관내피세포에서 SIRT 1의 발현이 증가된다고 알려져 있다. SIRT 1(Sirtuin 1)은 NAD⁺-의존적 히스톤 단백질 탈아세틸화효소(NAD+-dependent histone deacetylase)로서 에너지 대사, 호르몬 신호 전달, 스트레스에 대한 반응 등 다양한 과정을 조절한다. 따라서, 혈관 세포의 SIRT 1 발현을 촉진하는 물질을 적용하는 경우, 칼로리를 제한하는 경우와 마찬가지로 혈관내피세포의 노화를 억제하여 동맥경화를 비롯한 심혈관 질환을 예방 및 치료할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 SIRT(Sirtuin) 1의 발현을 촉진할 수 있다. 화학식 1의 화합물, 구체적으로 (+)-시링가레시놀은 SIRT(Sirtuin) 1의 유전자의 활성을 촉진하거나 또는 SIRT(Sirtuin) 1 단백질의 발현을 촉진하여 심장 질환을 예방하거나 개선하여 이를 치료할 수 있다. 구체적으로, (+)-링가레시놀은 혈관내피세포에서 SIRT 1의 발현 및 텔로머라제의 활성을 촉진하며, 노화 표지자인 SA-β-Gal의 활성을 감소시킴으로써, 혈관 세포의 노화를 억제할 수 있다. 한편 노화된 세포에서는 eNOS의 발현이 감소하여 NO의 생성이 감소됨에 의해 혈관의 수축/이완이 원활하게 이루어지지 않으며, PAI-1의 발현이 증가하여 혈전 생성이 촉진된다. (+)-시링가레시놀은 노화된 혈관 세포에서 eNOS의 발현을 증가시킴과 동시에 PAI-1의 발현은 감소시켜 혈관 세포의 노화를 억제하고, 혈관 세포의 기능을 정상화시킬 수 있다. 따라서 시링가레시놀을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 혈관 노화를 억제하여 심혈관 질환을 예방하거나 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 심근세포의 사멸을 억제할 수 있다. 본 명세서에서 "심근세포"는 심장벽을 이루는 가로무늬근으로 심장박동에 관여한다. 화학식 1의 화합물, 구체적으로 (+)-시링가레시놀은 심근세포의 사멸을 억제함에 따라 심장 질환을 예방하거나 개선하여 이를 치료할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol)을 더 포함하고, (+)-시링가레시놀 (syringaresinol)의 중량비가 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol) 중량비의 2배 이상일 수 있다. 상기와 같이, (+)-시링가레시놀 (syringaresinol)을 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol) 2배 이상 포함해야 SIRT 1의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기와 같은 관점에서, 본 발명 조성물에서, (+)-시링가레시놀 (syringaresinol)의 중량비는 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol) 중량비의 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 5.5배 이상 또는 6배 이상일 수 있다. (-)-시링가레시놀 (syringaresinol) 보다 (+)-시링가레시놀 (syringaresinol)의 함량이 커질수록 SIRT 1의 발현을 더 활성화시킬 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 상기 식품 조성물은 뇌경색, 뇌출혈, 허혈성 심질환, 심근 경색 또는 동맥 경화와 같은 심혈관 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 개선할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에 따른 식품 조성물은 기호 식품 또는 건강 식품 조성물을 포함한다.

상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일, 보다 구체적으로는 50 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 일 관점인 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 상기 약학 조성물은 뇌경색, 뇌출혈, 허혈성 심질환, 심근 경색 또는 동맥 경화와 같은 심혈관 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 제형은 유효 성분 이외에 희석제(예: 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 폴리에틸렌 글리콜), 또는 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리딘)를 함유할 수 있다. 경우에 따라 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 또는 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제는 점안제, 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1mg/kg/일 내지 100mg/kg/일, 보다 구체적으로는 5 mg/kg/일 내지 50 mg/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 비교예 ] (-)- 시링가레시놀의 합성

(-)-시링가레시놀을 합성하는 단계를 도시하면 다음과 같다.

[반응식 1]

(1) 4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시벤즈알데히드 (4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxybenzaldehyde)(화합물 2)의 제조

질소 분위기에서 시링가데히드( syringaldehyde )(화합물 1)(3 g, 16.47 mmol)와 탄산 칼륨(potassium carbonate)(6.83 g, 49.4 mmol)을 DMF(16 mL)에 녹인 후, 벤질 브로마이드(benzyl bromide)(2.94 mL, 24.7 mmol)를 넣고 상온에서 밤새 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 물과 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기 층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO₄로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피(5:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 흰색 고체의 화합물 20(4.45 g, 99.2 %)을 수득하였다. 화합물 2의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.90 (s, 6H), 5.13 (s, 2H), 7.11 (s, 2H), 7.29-7.48 (m, 5H), 9.86 (s, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 56.2, 75.0, 106.7, 128.1, 128.2, 128.4, 128.6, 131.9, 137.2, 191.1.

(2) 1-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시페닐 ) 프로프 -2-엔-1-올(1-(4-( benzyloxy )-3,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-ol)(화합물 3)의 제조

질소 분위기에서 위에서 수득한 화합물 2(4.04 g, 14.8 mmol)를 무수 THF(30 mL)에 녹인 후, -78℃로 온도를 낮춘다. 비닐마그네슘 브로마이드(vinylmagnesium bromide)(17.8 mL의 1M THF 용액)를 넣고 -78℃에서 10분간 교반한 후 0℃로 온도를 올리고 다시 2시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 포화 NH₄Cl 수용액으로 퀀칭(quenching)하고, 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO₄로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(4:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노랑색 고체의 화합물 21(3.97 g, 89.1%)을 수득하였다. 화합물 3의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.83 (s, 6H), 4.99 (s, 2H), 5.14 (m, 1H), 5.22 (ddd, J = 10.5, 1.2, 1.2 Hz, 1H), 5.37 (ddd, J = 16.8, 1.8, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (ddd, J = 16.5, 10.5, 6.0 Hz, 1H), 6.60 (s, 2H), 7.28-7.51 (m, 5H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 56.1, 75.0, 75.4, 102.5, 103.4, 115.3, 127.8, 128.1, 128.4, 137.9, 138.3, 140.0, 153.6.

(3) (S)-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시페닐 )((S)- 옥시란 -2-일)메탄올((S)-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl)((S)-oxiran-2-yl)methanol)(화합물 5)의 제조

질소 분위기에서 dried powdered 4Å 몰레큘라시브(molecular sieve)(10.5 g)에 무수 염화 메틸렌(anhydrous methylene chloride)(45 mL)을 넣고 -20℃로 온도를 낮춘다. 이에 (+)-DIPT(diisopropyltryptamine)(1.18 mL, 5.99 mmol)를 넣은 다음 티타늄 이소프로폭사이드(titanium isopropoxide)(1.48 mL, 4.99 mmol)를 천천히 넣고 30분간 교반한다. 30분 후 쿠멘 하이드록사이드(cumene hydroxide)(1.85 mL, 80%, 5.99 mmol)를 넣고 30분 동안 교반한다. 그 다음 무수 염화 메틸렌(10 mL)에 녹인 화합물 3(3 g, 9.99 mmol)을 천천히 한 방울씩 첨가(dropwise addition)한다. -20℃에서 5시간 동안 교반한 후 0℃로 온도를 올리고 밤새 교반한다. TLC로 반응을 확인한 후 10% NaOH 용액(30 mL, in 포화 NaCl 용액)을 넣고 3시간 동안 교반한 다음, 필터로 여과한다. 여과액을 염화 메틸렌으로 추출하여 브라인(brine) 용액으로 씻어준다. 무수 Na₂SO₄로 탈수하고 필터로 여과한 다음 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 화합물 4(1.65g, 55.0%, 붉은색 오일) 및 화합물 5(1.06g, 33.5%, 붉은색 오일)을 수득하였다. 화합물 5의 NMR 데이터는 아래와 같다.

[α]_D +52.9^o (c 1.0, CHCl₃); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.20 (s, 1H), 2.79 (dd, J = 5.1, 3.9 Hz, 1H), 2.95 (dd, J = 5.1, 2.7 Hz, 1H), 3.23 (q, J = 3.9 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 4.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 6.62 (s, 2H), 7.29-7.51 (m, 5H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 43.7, 55.0, 56.2, 71.1, 75.0, 103.4, 127.8, 128.1, 128.4, 135.2, 137.8, 153.7.

(4) 2-(4-((S)-(((E)-3-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시페닐 )알릴) 옥시 )((S)- 옥시란 -2-일) 메틸 )-2,6- 디메톡시페녹시 ) 테트라하이드로 -2H- 피란 (2-(4-((S)-(((E)-3-(4-( benzyloxy )-3,5- dimethoxyphenyl ) allyl ) oxy )((S)- oxiran -2- yl ) methyl )-2,6-dimethoxyphenoxy)tetrahydro-2H-pyran)(화합물 7)의 제조

질소 분위기에서 NaH(0.633 g, 60% 분산, 15.82 mmol)에 dried THF/DMSO (10:1)(20 mL)를 넣고 0℃로 온도를 낮춘다. THF(10 mL)에 녹인 화합물 5(0.5 g, 1.58 mmol)을 부가하고 교반한다. 그리고 THF(10 mL)에 녹인 신나밀 브로마이드(cinnamyl bromide)(화합물 6)(1.15 g, 3.16 mmol)를 넣고 0℃에서 30분 동안 교반한 다음 상온으로 온도를 올리고 밤새 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 물로 퀀칭하고 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출한 유기층을 물로 3회 씻어 주고, 무수 MgSO₄로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피(3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노란색 오일의 화합물 7(760 mg, 80.27%)를 수득하였다. 화합물 7의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.82 (m, 2H), 3.20 (dt, J = 3.3, 3.9 Hz, 1H), 3.83 (s, 6H), 3.85 (s, 6H), 4.08 (m, 2H), 4.33 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 5.02 (s, 2H), 5.03 (s, 2H), 6.19 (dt, J = 15.9, 6.0 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 6.59 (s, 2H), 6.61 (s, 2H), 7.27-7.53 (m, 10H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 45.2, 54.4, 56.1, 56.1, 69.6, 74.9, 75.0, 80.1, 103.7, 104.3, 125.1, 127.7, 127.8, 128.1, 128.3, 128.4, 132.3, 132.7, 134.0, 136.9, 137.7, 137.8, 153.6, 153,7.

(5) 화합물 8의 제조

질소 분위기에서 활성 아연 가루(activated zinc dust)(0.146 g, 4.44 mmol)가 들어있는 플라스크에 THF(20 mL)에 녹인 Cp₂TiCl₂(0.182 g, 1.463 mmol)를 넣고 화합물 7(0.19 g, 0.635 mmol)을 THF(16 mL)에 녹인 후 60℃로 맞춘 다음 앞서 제조한 Cp₂TiCl 용액을 카눌라(cannula)를 이용하여 20분 동안 가한다. 20분 동안 교반한 후 THF(4 mL)에 녹인 I₂(0.105 g, 0.825 mmol)를 부가하고 반응 용액을 1시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액에 포화 NH₄Cl 수용액을 넣어 반응을 종결시키고 디에틸 에테르로 추출한다. 추출한 유기층을 3회 10% Na₂S₂O₃ 용액 및 브라인 용액으로 씻어 주고, 무수 Na₂SO₄로 탈수한 다음 필터로 여과한다. 여과액을 농축하여 컬럼 크로마토그래피 (3:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 붉은색 오일의 화합물 8(62 mg, 32.6%)을 수득하였다. 화합물 8의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.11 (m, 2H), 3.84 (s 12H), 3.94 (dd, J = 9.3, 3.6 Hz, 2H), 4.31 (dd, J = 8.7, 6.6 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 4.99 (s, 4H), 6.57 (s, 4H), 7.29-7.51(m, 10H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 54.3, 56.2, 72.0, 75.0, 86.0, 103.0, 127.8, 128.1, 128.4, 136.8, 137.8, 153.7.

(6) (-)- 시링가레시놀의 제조

화합물 8(90 mg, 0.152 mmol)을 에탄올/THF (1:1)(9 mL)에 녹인 후 온도를 65℃로 맞춘다. 여기에 레이니 니켈(Raney nickel)(0.15 g)을 넣고 65℃에서 1시간 동안 교반한다. TLC로 반응 종결을 확인한 후 반응 용액을 아세톤과 셀라이트(celite)를 이용하여 여과한 다음, 여과액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피(1:1 헥산/EtOAc)로 정제하여 옅은 노란색 고체의 화합물(50mg, 78.7%)을 수득하였다. 수득한 화합물이 (8S, 8'S)-(-)-시링가레시놀임은 아래와 같은 NMR 데이터 및 [α]_D 값이 -38.5^o (c 0.1, CHCl₃)인 것으로부터 확인할 수 있다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.09 (m, 2H), 3.90 (s 12H), 3.91 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.51 (s, 2H), 6.58 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 54.3, 56.4, 71.8, 86.1, 102.7, 132.1, 134.3, 147.1.

[ 실시예 ] (+)- 시링가레시놀의 합성

(+)-시링가레시놀을 합성하는 단계를 도시하면 다음과 같다.

[반응식 2]

(1) (R)-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시페닐 )((R)- 옥시란 -2-일)메탄올((R)-(4-(benzyloxy)-3,5-dimethoxyphenyl)((R)-oxiran-2-yl)methanol)(화합물 10)의 제조

비교예의 화합물 5를 제조하는 방법과 (+)-DIPT 대신에 (-)-DIPT를 사용하는 것을 제외하고 실질적으로 동일한 방법을 적용하여 화합물 3으로부터 화합물 10을 제조하였다. 화합물 10의 NMR 데이터는 아래와 같다.

[α]_D -47.5^o (c 1.0, CHCl₃); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.32 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 2.79 (dd, J = 4.8, 3.9 Hz, 1H), 2.94 (dd, J = 4.8, 2.7 Hz, 1H), 3.22 (q, J = 3.3 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 4.82 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.00 (s, 2H), 6.61 (s, 2H), 7.29-7.51 (m, 5H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 43.73, 54.98, 56.14, 71.11, 74.99, 76.57, 77.00, 77.42, 103.39, 127.78, 128.11, 128.41, 135.20, 136.84, 137.78, 153.69.

(2) 2-(4-((R)-(((E)-3-(4-( 벤질옥시 )-3,5- 디메톡시페닐 )알릴) 옥시 )((R)- 옥 시란-2-일) 메틸 )-2,6- 디메톡시페녹시 ) 테트라하이드로 -2H- 피란 (2-(4-((R)-(((E)-3-(4-( benzyloxy )-3,5- dimethoxyphenyl ) allyl ) oxy )((R)- oxiran -2- yl ) methyl )-2,6-dimethoxyphenoxy)tetrahydro-2H-pyran)(화합물 11)의 제조

비교예의 화합물 7를 제조하는 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 화합물 6과 화합물 10을 반응시켜 화합물 11을 수득하였다. 화합물 11의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.82 (m, 2H), 3.19 (dt, J = 2.7, 3.9 Hz, 1H), 3.83 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 4.12 (m, 2H), 4.32 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 6.18 (dt, J = 15.9, 6.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 17.1 Hz, 1H) 6.59 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 7.28-7.52 (m, 10H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 45.3, 54.4, 56.1, 56.2, 69.7, 75.0, 75.1, 80.1, 103.7, 104.4, 125.1, 127.8, 128.1, 128.4, 128.5, 132.3, 132.8, 134.0, 137.9, 153.6, 156.7.

(3) 화합물 12의 제조

비교예에서 화합물 8을 제조하는 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 화합물 11로부터 화합물 12을 수득하였다. 화합물 12의 NMR 데이터는 아래와 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.11 (m, 2H), 3.84 (s, 12H), 3.93 (dd, J = 9.4, 3.6 Hz, 2H), 4.31 (dd, J = 9.3, 7.2 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 4.99 (s, 4H), 6.57 (s, 4H), 7.28-7.51 (m, 10H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 54.3, 56.2, 72.0, 75.0, 86.0, 103.0, 127.8, 128.1, 128.4, 136.8, 137.8, 153.7.

(4) (+)- 시링가레시놀의 제조

비교예의 (-)-시링가레시놀을 제조하는 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 화합물 12로부터 (+)-시링가레시놀을 제조하였다. 제조한 화합물이 (8R, 8'R)-(+)-시링가레시놀임은 아래와 같은 NMR 데이터 및 [α]_D 값이 +40.9^o (c 0.1, CHCl₃)인 것으로부터 확인할 수 있다.

[α]_D +40.9^o (c 0.1, CHCl₃); ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.10 (m, 2H), 3.90 (s, 12H), 3.90 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 5.48 (s, 2H), 6.59 (s, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 54.4, 56.4, 71.8, 86.1, 102.7, 132.1, 134.3, 147.1.

[ 제조예 ] 화합물 6의 제조

한편, 화합물 6 (신나밀 브로마이드)은 시링가알데히드(1)를 화합물 2를 Horner-Wadsworth-Emmons 올레핀화(olefination)시켜 불포화 에스터 기를 가지는 화합물(13)로 제조한 다음, DIBAL-H로 환원시켜 불포화 알코올기를 가지는 화합물(14)로 제조하고, 다시 PBr₃로 OH를 Br로 치환시켜 제조할 수 있다. 구체적인 화학 반응식은 아래를 참고한다.

[반응식 3]

[ 실험예 1] 심근세포에서 SIRT 1 발현 촉진 효과 평가

두 종의 시링가레시놀의 광학이성질체에 대하여 쥐의 심근세포에서 SIRT 1 유전자 발현 촉진 효과를 평가하기 위해, 아래와 같은 실험을 수행하였다.

생후 1~2일 지난 Sprague-Dawley 래트의 심장을 절제하여 HBSS 용액에 담그고 가위로 잘게 자른 후 트립신(trypsin)/EDTA 액에 넣고 4℃ 쉐이커(shaker)에서 하루밤동안 두었다. 다음날, 트립신 효소액은 버리고 10% FCS/DMEM 액을 더하여 소화를 중단시킨 다음 FCS/DMEM 액을 버리고 콜라게나제(collagenase) 용액을 더하여 37℃ 쉐이킹 바쓰(shaking bath)에 3분 정도 두었다가 상층액만 코니컬 튜브 (conical tube)에 모았다. 이 같은 과정을 세 차례 반복하여 모은 용액을 750rpm에서 5분간 원심 분리한 후 펠렛은 10% FCS/DMEM 용액으로 재부유(resuspend)시킨 다음 이를 배양 플라스크(culture flask)에 옮기고 37℃에서 75분간 배양하였다. 이후 부유액을 다시 새 배양 플라스크에 옮기고 다시 75분간 배양후 부유액을 코니컬 튜브 (conical tube)로 옮긴 후 세포 수를 센 후, 플레이팅(plating)하였다. 분주된 세포들은 10% FCS/DMEM 배지에서 3~4일간 배양하여 융합(confluence)시킨 후 혈청(serum)을 제거한 배지에 실시예에서 얻어진 (+)-시링가레시놀(50mM)과 비교예에서 얻어진 (-)-시링가레시놀(50mM) 각각을 24시간 처리하였다. 대조군으로 DMSO를 처리하였다. 각 시료들을 처리한 세포들을, 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 트리졸 시약(TRIzol agent, Invitrogen)으로 RNA를 추출하였다. 상기에서 추출하여 정량한 1 ㎍/㎕의 RNA와 역전사 시스템(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 및 SIRT 1과 GAPDH의 각 유전자에 대해 미리 디자인된 프라이머(Primer) 및 프루브(probe)(Applied biosystems; SIRT1, Hs01009006_m1; GAPDH, Hs99999905_m1)를 이용하여 각 유전자들의 발현 양상을 측정하였다. PCR 반응과 분석은 로터-진 3000 시스템(Rotor-Gene 3000 system; Corbett Research, Sydney, Australia)을 이용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 (+)-시링가레시놀[syn(+)], (-)-시링가레시놀[syn(-)] 및 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(GB)]을 각각 처리한 심근세포에서 SIRT 1 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다. DMSO(dimethyl sulfoxide) 는 대조군으로 사용하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, (-)-시링가레시놀은 SIRT 1 유전자의 발현을 증가하지 못하는 것으로 확인되었고, (+)-시링가레시놀 및 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀만이 심근세포에서 SIRT 1의 발현을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, (+)-시링가레시놀이 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀보다 더 우수하게 SIRT 1의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 2] 활성산소에 의한 세포사멸로부터 심근세포 보호효과 평가

실험예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 분리, 배양한 심근세포를 혈청을 제거한 배지에 250mM 농도의 과산화수소수 (H2O2)를 2시간 동안 처리하여 활성산소에 의한 세포사멸을 유도하였다. 2시간 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 5, 20, 50mM 농도의 (+)-시링가레시놀과 (-)-시링가레시놀을 24시간 처리하였다. 각 세포에 3-[4,5-다이메틸 사입졸]-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT, Sigma) 용액을 넣고 37 °C 에서 4 시간 동안 배양한 후 다이메틸설폭사이드을 넣고 녹인 후 ELISA reader (Thermo Max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 540 nm의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)을 측정한 결과, 도 3을 얻었다. 도 3은 과산화수소수 (H2O2)를 처리한 심근세포에 (+)-시링가레시놀[syn(+)] 또는 (-)-시링가레시놀 [syn(-)] 를 처리하고, ELISA 리더 (Thermo Max, Molecular Devices Co.)를 이용하여 540 nm의 파장에서 형성된 포르마잔 다이의 광학적 농도(OD)을 측정한 결과이다.

도 2는 과산화수소수 (H2O2)를 처리한 심근세포에 (+)-시링가레시놀[H2O2+syn(+)] 또는 (-)-시링가레시놀 [H2O2+syn(-)] 를 처리하여 세포의 사멸이 억제한 정도를 나타낸 그래프이다. DMSO(dimethyl sulfoxide) 는 대조군으로 사용하였다.

도 2 및 3에서 볼 수 있는 바와 같이, (+)-시링가레시놀은 농도의존적으로 활성산소에 의해 유도된 심근세포의 사멸을 억제하였으나, (-)-시링가레시놀은 오히려 세포사멸을 촉진하는 것으로 관찰되었다. 그러므로 (+)-시링가레시놀 만이 유효하게 심근세포를 보호하여 심장 질환을 예방 또는 개선할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실험예 3] 가시오가피에서 추출한 시링가레시놀의 광학이성질체의 비

1. 가시오가피 전처리

가시오가피를 수확하고, 그 껍질을 벗겨서 제조하였다.

2. 가시오가피 껍질로부터 시링가레시놀의 분리 및 분석

상기에서 제조한 가시오가피 껍질 5g에 메탄올을 3mL를 가하여 가시오가피추출물 1ml(가시오가피 M)을 얻었다. 이를 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 처리하여 분리한 후(가시오가피 M-E), HPLC로 분석하였다. 상기 분리 및 정제 방법을 도식화하여 도 4에 나타내었다고, HPLC 결과를 도 5에 나타내었다.

3. 가시오가피에서 추출한 추출물에서 시링가레시놀의 광학이성질체의 비 분석

시료를 메탄올에 녹여 초임계크로마토그래피(SFC:Supercritical fluid chromatography)법으로 카이럴 컬럼(chiral column, Chiralpak IB column)으로 분리하여 UV210 nm에서 검출하였다.

도 5는 가시오가피에서 추출한 시링가레시놀의 광학이성질체의 비를 나타낸 것이다. 가시오가피에서 추출한 광학이성질체의 비는 (-)-시링가레시놀:(+)-시링가레시놀= 1:1이었다.

[실험예 4] 가시오가피에서 추출한 시링가레시놀 라세미체, 합성한 (+)-시링가레시놀 및 진생베리에서 분리한 시링가레시놀 라세미체의 SIRT1 발현 촉진 효과 평가

1. 진생베리(인삼 열매)의 전처리

생 진생베리를 수확하고, 종자를 분리하여 제거한 후, 진생베리의 과피를 제거하고 과육만을 일광 건조 또는 열풍 건조하여 인삼 열매 과육 건조물을 제조하였다.

2. 진생베리 과육 추출물로부터 시링가레시놀의 분리 및 분석

상기에서 제조한 진생베리 과육 건조물 1kg에 물 또는 주정 3L를 가하여 상온 또는 환류 추출하고 여과한 다음 40~45℃에서 감압 농축하여 진생베리 과육 추출물 300g을 얻었다. 추출물에 에테르(ether)를 처리하여 지용성 성분을 제거한 후, 부탄올(butanol)로 조사포닌을 추출 및 농축하였다. 이를 분리, 정제하여 시링가레시놀을 얻었으며, 구체적인 방법은 다음과 같다.

먼저 시료 194 g을 역상 컬럼 크로마토그래피(reversed-phase (ODS) column chromatography)로 정제하였으며, 이때 용출 용매로 처음에는 100% 물을 사용하였고 메탄올을 10%씩 점차 증가시켜 최종적으로는 100% 메탄올 용매를 사용하였다. 그 결과 GB-1 내지 GB-10 분획물을 얻었으며, 이들 분획물 중 SIRT 1 발현 활성을 나타낸 분획 GB-3을 선별하여 농축한 후 50% 수용성 메탄올(aqueous methanol)을 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography)를 수행하였다. 얻은 분획물 중 SIRT 1 발현 활성을 나타낸 GB-3-6(3F)을 선별하여 농축한 후, 클로로포름:메탄올(10:1)을 전개 용매로 예비 실리카겔(preparative silica gel) TLC를 수행하였고, 그 결과 Rf값 0.67의 활성 분획을 정제하였다. 상기 분리 및 정제 방법을 도식화하여 도 6에 나타내었다.

NMR 분광 분석과 데이터베이스 검색을 수행하여 분리 및 정제한 활성 화합물을 시링가레시놀(syringaresinol)로 동정할 수 있었다. 이를 재확인하기 위하여 질량(mass) 분석을 수행하였으며, ESI-mass를 positive mode에서 측정한 결과 [M+Na]+가 m/z 440.9에서, [2M+Na]+가 m/z 858.9에서 관찰되어 분자량이 418임을 알 수 있었다. 또한 NMR 분광 분석을 수행한 결과, 화학식 3과 같은 결과를 얻었다. 이에 따라, 상기 분리 정제한 활성 화합물은 시링가레시놀(syringaresinol)으로 확인되었다.

이와 같이 진생 베리 열매 과육으로부터 시링가레시놀을 분리하였다.

3. 진생 베리 과육에서 추출한 추출물에서 시링가레시놀의 광학이성질체의 비 분석

시료를 메탄올에 녹여 초임계크로마토그래피(SFC:Supercritical fluid chromatography)법으로 chiral column (Chiralpak IB column)으로 분리하여 UV210 nm에서 검출하였다.

그 결과, 도 7을 얻었다. 도 7은 인삼열매과육에서 추출한 시링가레시놀의 광학이성질체의 비를 나타낸 것이다. 인삼열매과육에서 추출한 광학이성질체의 비는 (-)-시링가레시놀:(+)-시링가레시놀= 1:5이었다.

인간 혈관내피세포는 LONZA(Walersville, MD, USA)로부터 구입하여, 혈관내피세포 전용 배지(EGM-2, EGM-2 SingleQuots, LONZA)에서 70% 컨플루언트(confluent)할 때까지 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 혈관내피세포의 노화는 자연 노화로 자라지 않을 때까지 계대 배양하는 방법으로 유도하였다. 집단 배가 지수(Poplulation-doubling level, PDL)는 아래의 식에 따라 세포 성장이 멈출 때까지 각 세대별로 계산하였다. PDL 값은 노화된 세포일수록 많아진다.

[수학식 1]

PDL = (Log₁₀Y-Log₁₀X)/Log₁₀2

Y는 각 세대 끝에서 센 세포수.

X는 처음 계대한 세포수

진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(GB)], 합성한 (+)-시링가레시놀[syn(+)], 합성한 (+)-시링가레시놀과 합성한 (-)-시링가레시놀이 1:1[syn(+/-1:1)], 2:1[syn(+/-2:1)], 5:1[syn(syn(+/-5:1))] 또는 10:1[syn(syn(+/-10:1))]의 비를 가지는 경우 및 가시오가피로부터 얻어진 시링가레시놀[syn(가시오가피)] 각각을 50 mM 농도로 14 PDL 세포부터 이틀에 한번씩 처리하여 40 PDL 세포까지 노화를 유도하며 처리하였다. 음성 대조군에는 배지 부피 1/1000의 DMSO를 처리하였다. 각 시료들을 처리한 세포들을, 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 트리졸 시약(TRIzol agent, Invitrogen)으로 RNA를 추출하였다. 상기에서 추출하여 정량한 1 ㎍/㎕의 RNA와 역전사 시스템(Promega)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 및 SIRT 1과 GAPDH의 각 유전자에 대해 미리 디자인된 프라이머(Primer) 및 프루브(probe)(Applied biosystems; SIRT1, Hs01009006_m1; GAPDH, Hs99999905_m1)를 이용하여 각 유전자들의 발현 양상을 측정하였다. PCR 반응과 분석은 로터-진 3000 시스템(Rotor-Gene 3000 system; Corbett Research, Sydney, Australia)을 이용하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 볼 수 있듯이, (+)-시링가레시놀을 처리한 세포는 DMSO만을 처리한 세포에 비해 약 4배이상 SIRT1의 발현을 촉진하는 것으로 확인되었다. (+)-시링가레시놀을 처리한 세포는 또한 진생베리로부터 얻어진 시링가레시놀을 처리한 세포보다 SIRT1의 발현이 우수한 것으로 관찰되었다. 아울러, (+)-시링가레시놀을 (-)-시링가레시놀의 중량에 비해 2배 이상 처리할 경우, SIRT1의 발현이 촉진되었고, (+)-시링가레시놀의 상대적인 함량이 더 많아질수록 SIRT1의 발현이 현저하게 촉진되는 것을 확인하였다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 건강 식품

(+)-시링가레시놀................... 1000 ㎎

비타민 혼합물

비타민 A 아세테이트...............70 ㎍

비타민 E ....................... 1.0 ㎎

비타민 B1...................... 0.13 ㎎

비타민 B2 ...................... 0.15 ㎎

비타민 B6........................ 0.5 ㎎

비타민 B12....................... 0.2 ㎍

비타민 C.......................... 10 ㎎

비오틴............................. 10 ㎍

니코틴산아미드.................... 1.7 ㎎

엽산............................... 50 ㎍

판토텐산 칼슘..................... 0.5 ㎎

무기질 혼합물

황산제1철........................ 1.75 ㎎

산화아연.......................... 0.82 ㎎

탄산마그네슘...................... 25.3 ㎎

제1인산칼륨......................... 15 ㎎

제2인산칼슘......................... 55 ㎎

구연산칼륨.......................... 90 ㎎

탄산칼슘........................... 100 ㎎

염화마그네슘...................... 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[제형예 2] 건강 음료

(+)-시링가레시놀.......................... 1000 ㎎

구연산................................ 1000 ㎎

올리고당................................ 100 g

타우린.................................... 1 g

정제수............ ...................... 잔량

통상의 건강 음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균한다.

[제형예 3] 정제

(+)-시링가레시놀 100 mg, 대두 추출물 50 mg, 포도당 100 mg, 홍삼 추출물 50 mg, 전분 96 mg 및 마그네슘 스테아레이트 4 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 40 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하고 타정기를 이용하여 정제로 타정한다.

[제형예 4] 과립제

(+)-시링가레시놀 100 mg, 대두 추출물 50 mg, 포도당 100 mg 및 전분 600 mg을 혼합하고 30% 에탄올을 100 mg 첨가하여 과립을 형성한 후, 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 다음 포에 충진한다.

[제형예 5] 연고

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.

배합 성분	함량(중량%)
(+)-시링가레시놀	3.0
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
밀납	4.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	잔량

Claims

하기 화학식 1의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]

상기 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 독립적으로 직쇄(unbranched) 또는 분지(branched)된, C₁내지 C₁₈의 알킬기(alkyl group), C₁내지 C₁₈의 알케닐기(alkenyl group), C₁내지 C₁₈의 알키닐기(alkynyl group) 또는 C₃내지 C₆의 사이클릭 알킬기(cyclic alkyl group)이다.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 (+)-시링가레시놀 (syringaresinol)인, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 심장 질환은 심혈관 질환인, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 심혈관 질환은 뇌경색, 뇌출혈, 고혈압, 허혈성 심질환, 심근 경색, 심부전 및 동맥 경화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 조성물 총중량을 기초로 0.001 중량% 내지 80 중량%의 (+)-시링가레시놀을 포함하는, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 SIRT(Sirtuin) 1의 발현을 촉진하는, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유효성분은 심근세포의 사멸을 억제하는, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol)을 더 포함하고,
(+)-시링가레시놀 (syringaresinol)의 중량비가 (-)-시링가레시놀 (syringaresinol) 중량비의 2배 이상인, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약학 조성물인, 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물.