KR20210051646A - 9-cis Beta-carotene의 합성방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 화학적 반응을 통해 순도가 높고 대량 생산이 용이한 9-cis Beta-carotene( 9-시스 베타카로틴) 화합물을 합성하는 방법에 관한 것으로, 9-cis Retinol의 Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도하는 가) 단계; β-C15 aldehyde와 3-Methyl-2-butenal을 Knoevenagel condensation의 반응을 유도하여 All-trans Aldehyde를 합성하는 나) 단계; 가) 단계에서 완성된 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 나) 단계에서 완성된 All-trans Aldehyde를 Wittig Olefination반응을 통해 탄소 이중결합으로 연결하는 반응으로 이루어지는 9-cis Beta-carotene의 합성방법에 관한 것이다.

Description

9-cis Beta-carotene의 합성방법{A synthesis method of 9-cis Beta-carotene}
본 발명은 화학적 반응을 통해 9-cis Beta-carotene( 9-시스 베타카로틴) 화합물을 합성하는 방법에 관한 것으로, 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 All-trans Aldehyde가 Wittig Olefination 반응을 통해 순도가 높고 대량 생산이 용이한 9-cis β-carotene을 합성하는 방법에 관한 것이다.
카로티노이드(carotenoid)는 당근, 늙은 호박, 피망, 깻잎, 상추, 부추, 시금치와 같은 녹황색 채소와 과일의 껍질에 주로 존재하는 오랜지색 계열(황색부터 밝은 적색)을 나타내는 색소이다. 그 중 베타카로틴(β-카로틴)은 거의 모든 카로티노이드들의 전구체로서, 체내에서 필수영양소인 비타민 A로 전환된다. 베타카로틴은 동물조직에서 산화로 인한 손상을 방지할 수 있는 항산화 효과, 높은 영양가 및 특유의 색으로 인해 식품 첨가제로 널리 사용되고 있을 뿐만 아니라 항암제, 혈관 질환제, 피부 노화와 관련된 산화 방지제 등으로도 유용하게 사용되고 있다.
특히, 9-시스 베타카로틴(9-cis β-carotene)은 베타카로틴의 이성질체 중에서 의약품으로서 우수한 효과를 가진 것으로 알려져있다. 그러나 녹황색 채소나 과일에 존재하는 베타카로틴의 양은 그리 많지 않아 그생산이 수요를 충족시키지 못하고 있을 뿐 아니라, 천연물로부터 베타카로틴의 정제는 올 트랜스(all trans) 베 타카로틴 및 9-시스 베타카로틴의 혼합 이성질체를 분리하지 못하고 있다.
9-cis Beta-carotene은 Beta-carotene의 이성질체 (isomer)로 분자식은 같지만 서로 다른 물리/화학적 성질을 갖는 분자 즉, 이성질체인 분자들은 원소의 종류와 개수는 같으나 구성 원자단이나 구조가 완전히 다르며, 구조가 같더라도 상대적인 배열이 달라서 다른 성질을 갖게 된다. 이는 분자의 구조나 형태가 분자 간 상호작용 및 광학적 성질을 비롯한 다양한 특성을 변화시킴으로서 분자의 성질이 바뀐다.
9-cis β-carotene와 관련한 용도 및 기전과 관련하여 살펴보면 9-cis β-carotene의 장 관류에 의해 절단되고 흡수되어 제 합성된 9-cis RA의 문맥을 통한 흡수됨으로서 소화된 9-cis β-carotene이 생체 내에서 실질적인 전구체로 분해되고 혈액 및 간에서 9-cis RA로 재합성됨을 확인하였고, 재합성된 9-cis RA가 다양한 세포 신호 전달을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 보고하고 있다. 비특허문헌 1 참조)
LXR/RXR 이합체(dimer)는 옥시 스테롤 (LXR의 경우 리간드) 또는 9-cis β-carotene (RXR의 경우 리간드)에 의해 활성화되며, LXR/RXR 이합체는 ABCA1 수송체에 대한 유전자 발현을 활성화시킴으로써 콜레스테롤 흡수에 중요한 역할을 한다. ABCA1 단백질 발현의 유도는 콜레스테롤 및 인지질의 apo A-1 로의 유출을 증가시키는 것으로 보고하고 있다. 비특허문헌 2 참조)
또한 RXR 리간드 - 9-cis β RA로 HUVEC를 처리하면 NADPH 산화 효소 및 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 고 포도당의 효과가 약화된다. 염증 신호 및 NADPH 옥시 다제 -NF-κB 경로에 대한 RXR 리간드의 억제 효과는 이들 과정에서 RXR의 요구를 입증했다. 비특허문헌 3참조)
이와 같이 9-cis β-carotene는 약학적 조성물 또는 작용기전에 관하여 많은 연구가 이루어지고 있는바, 순도가 높고 대량 생산이 용이한 9-cis β-carotene의 합성방법의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명은 9-시스 베타카로틴을 화학적으로 분리 및 정제하는 방법을 제공하고자 한다. 9-시스 베타카로틴의 화학적 합성을 통해 정제할 경우, 9-시스 베타카로틴의 생산이 용이하고, 또한 친환경적으로 대량생산이 가능하며, 또한 우수한 순도를 나타냄으로서 약학적 조성물 등으로 사용 가능함을 확인하였다.
특허 출원번호 제10-2014-0070176호 등록 특허공보 제10-1907994호 등록 특허공보 제10-0477899호
1) Xavier Hebuterne, Xiang-Dong Wang, Elizabeth J. Johnson. 1995. Intestinal absorption and metabolism of 9-cis β-carotene in vivo: biosynthesis of 9-cis retinoic acid. J. Lipid Res. 36, 1264-1273. 2) Shubha Murthy,Ella Born, Satya N. Mathur, and F. Jeffrey Field. 2002. LXR/RXR activation enhances basolateral efflux of cholesterol in CaCo-2 cells. J. Lipid Res. 43, 1054-1064. 3) R. B. Ning, J. Zhu, D. J. Chai. 2013. RXR agonists inhibit high glucose-induced upregulationof inflammation by suppressing activation of the NADPH oxidase-nuclear factor-κB pathway in human endothelial cells. Genet. Mol. Res. 12(4), 6692-6707.
본 발명은 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 All-trans Aldehyde가 Wittig Olefination 반응을 통해 9-시스 베타카로틴을 화학적으로 합성 정제하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 All-trans Aldehyde가 Wittig Olefination 반응을 통해 9-cis β-carotene을 합성하는 단계별 반응 절차는 다음과 같다.
[단계 1] 2.2.6 trimethyl cyclohexanone과 (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol의 합성에서 R-Mg-X화합물로 X는 할로겐이고 R은 유기기인 alkyl 또는 aryl형태의 methylmagnesium chloride 또는 phenylmagnesium bromide 등의 그리냐르 시약 (Grignard reagents)을 특징으로 하는 반응을 촉진하는 것으로 부터 시작한다.
[단계 2] 완성된 acetylene을 E-ethylene으로 환원시키기 위한 환원제로 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합한다.
[단계 3] 상기 합성된 케미컬의 말단의 Alcohol기를 선택 산화 반응하여 알데하이드의 생성하는 방법으로 Dess-Martin periodinane (DMP) 산화제를 적용(
Figure pat00001
)하는 방법, DMSO 산화제를 적용(
Figure pat00002
)하는 방법, 실시의 예와 같이 MnO2 산화제를 적용하는 방법 그리고 TPAP 촉매 산화법으로 5mol%의 TPAP에 NMO를 1.5배을 넣고 CH2Cl2 하에서 반응(
Figure pat00003
)하는 방법을 포함한다.
[단계 4] 합성된 상기의 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성한다.
[단계 5] C18 말단의 Alcohol기를 HCOOH 산으로 탈수하여 Ethylene을 형성하는 반응으로, Cyclohexanol기의 OH를 산화시킨다.
[단계 6] Ethylene형성 후, Rochelle salt를 혼합하여 esters, carboxylic acids 및 amides의 OH의 Alcohol기로 환원한다.
[단계 7] C17 알코올은 상기의 [단계 3]과 같은 알코올의 선택 산화반응하여 Aldehyde의 생성하는 방법과 동일하게 반응시킨다.
[단계 8] Alkylation 반응을 유도하는 것으로 Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화하는 반응을 유도한다.
[단계 9] Hydor Oxidation반응을 유도한다.
[단계 10] Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응을 유도한다.
[단계 11] Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 형성한다.
[단계 12] Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도한다.
[단계 13] All-trans Aldehyde를 합성하기 위하여 β-C15 aldehyde와 3-Methyl-2-butenal을 Knoevenagel condensation의 반응을 유도한다.
[단계 14] Wittig Olefination 반응을 통해 [단계 12]에서 완성된 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 [단계 13]에서 완성된 All-trans Aldehyde를 탄소 이중결합으로 연결하는 반응으로 완료한다.
본 발명의 화학적 합성을 통해 9-시스 베타카로틴을 정제할 경우, 식물에서 추출하는 경우보다 친환경적으로 대량생산이 가능하며, 또한 우수한 순도를 나타냄으로서 약학적 조성물 등으로 사용 가능하다.
도 1은 2.2.6 trimethyl cyclohexanone과 (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol의 합성반응을 나타낸다.
도 2는 완성된 acetylene을 E-ethylene으로 환원시키기 위한 환원제로 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합하는 과정을 나타낸다.
도 3은 도 2에서 합성된 케미컬의 말단의 Alcohol기를 선택 산화 반응하여 알데하이드의 생성하는 방법을 나타낸다.
도 4는 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성하는 과정을 나타낸다.
도 5는 C18 말단의 Alcohol기를 HCOOH 산으로 탈수하여 Ethylene을 형성하는 반응을 나타낸다.
도 6은 Ethylene형성 후, Rochelle salt를 혼합하여 esters, carboxylic acids 및 amides의 OH의 Alcohol기로 환원하는 과정을 나타낸다.
도 7은 C17 알코올의 산화 반응으로 Aldehyde의 생성하는 방법을 나타낸다.
도 8은 Alkylation 반응을 유도하는 것으로 Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화 하는 반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
도 9는 Hydor Oxidation반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
도 10은 Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
도 11은 Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 형성하는 과정을 나타낸다.
도 12는 Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
도 13은 All-trans Aldehyde를 합성하기 위하여 β-C15 aldehyde와 3-Methyl-2-butenal을 Knoevenagel condensation의 반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
도 14는 Wittig Olefination반응을 통해 도 12에서 완성된 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 도 13에서 완성된 All-trans Aldehyde를 탄소 이중결합으로 연결하는 반응 과정을 나타낸다.
도 15는 Polo-like kinase 신호 전달 기전작용 모식도를 나타낸다.
도 16은 본 발명방법의 9-cis β-carotene 합성과정 중 9-cis RA와 all trans RA형태로 합성하여 1:1의 비율로 각 0.2μg/ml를 마우스 근육세포 (Mus musculus: C3H10T1/2)에서 지방세포 제거 정도 실험 결과를 나타낸다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 All-trans Aldehyde가 Wittig Olefination 반응을 통해 9-cis β-carotene을 합성하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된, 9-시스 베타카로틴을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 9-시스 베타카로틴을 포함하는, 의약품, 식품조성물, 화장품조성물을 제공한다. 이하, 본 발명의 9-cis Beta(β)-carotene의 합성을 상세히 설명한다.
본 발명의 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 All-trans Aldehyde가 Wittig Olefination 반응을 통해 9-cis β-carotene을 합성하는 방법은 다음과 같다.
[단계 1] 2.2.6 trimethyl cyclohexanone과 (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol의 합성에서 R-Mg-X화합물로 X는 할로겐이고 R은 유기기인 alkyl 또는 aryl형태의 methylmagnesium chloride 또는 phenylmagnesium bromide 등의 그리냐르 시약 (Grignard reagents)을 특징으로 반응을 촉진하는 것으로 부터 시작한다.
[단계 2] 완성된 acetylene을 E-ethylene으로 환원시키기 위한 환원제로 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합한다.
[단계 3] 상기 합성된 케미컬의 말단의 Alcohol기를 선택 산화 반응하여 알데하이드의 생성하는 방법으로 Dess-Martin periodinane(DMP) 산화제를 적용 (
Figure pat00004
)하는 방법, DMSO 산화제를 적용(
Figure pat00005
)하는 방법, 실시의 예와 같이 MnO2 산화제를 적용하는 방법 그리고 TPAP 촉매 산화법으로 5mol%의 TPAP에 NMO를 1.5배을 넣고 CH2Cl2 하에서 반응(
Figure pat00006
)하는 방법을 포함한다.
[단계 4] 합성된 상기의 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성 한다.
[단계 5] C18 말단의 Alcohol기를 HCOOH 산으로 탈수하여 Ethylene을 형성하는 반응으로, Cyclohexanol기의 OH를 산화 시킨다.
[단계 6] Ethylene형성 후, Rochelle salt를 혼합하여 esters, carboxylic acids 및 amides의 OH의 Alcohol기로 환원한다.
[단계 7] C17 알코올은 상기의 [단계 3]과 같은 알코올의 선택 산화반응 하여 Aldehyde의 생성하는 방법과 동일하게 반응 시킨다.
[단계 8] Alkylation 반응을 유도하는 것으로 Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화 하는 반응을 유도한다.
[단계 9] Hydor Oxidation반응을 유도한다.
[단계 10] Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응을 유도한다.
[단계 11] Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 형성한다.
[단계 12] Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도한다.
[단계 13] All-trans Aldehyde를 합성하기 위하여 β-C15 aldehyde와 3-Methyl-2-butenal을 Knoevenagel condensation의 반응을 유도한다.
[단계 14] Wittig Olefination반응을 통해 [단계 12]에서 완성된 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 [단계 13]에서 완성된 All-trans Aldehyde를 탄소 이중결합으로 연결하는 반응으로 완료한다. 이하 각 단계별 반응공정을 살펴본다.
<실시단계 1>
도 1은 2.2.6 trimethyl cyclohexanone과 (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol의 합성반응을 나타낸다.
1) 먼저 5ml THF 중 10g의 2.2.6 trimethyl cyclohexanone 용액에 교반 혼합하였다. 2) 0~5℃에서 바람직하게는 0℃에서 100ml THF 중 11.2 ml (1.5 배수) (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol을 교반하고 이후, 용액에. Ethylmagnesiumbromide (3 배수)를 에테르 (etherial) 용액 7ml를 혼합한 용액을 첨가하고 실온이 될 때까지 30 ~ 40분 동안 교반하였다. 3) 상기 1)과 2) 혼합물을 12시간 그리고 Ammonium chloride (NH4Cl)을 교환하여 포화시켰다. (Ammonium chloride 포화 수용액을 첨가하여 반응을 멈추었다.) 4) 이를 hexane과 ethylacetate 용매으로 실리카겔 컬럼상으로 정제하여 13.5 g (수율 80%)의 생성물을 얻었다
본 단계의 R-Mg-X화합물로 X는 할로겐이고 R은 유기기인 alkyl 또는 aryl형태의 methylmagnesium chloride 또는 phenylmagnesium bromide 등의 그리냐르 시약 (Grignard reagents)으로 반응을 촉진하는 방법을 특징으로 한다.
<실시단계 2>
도 2는 acetylene을 E-ethylene으로 환원시키기 위한 환원제로 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합하는 과정을 나타낸다.
1) 2g의 리튬 알루미늄 하이드 라이드(Lithium aluminium hydride: LiAlH4)를, THF (100ml)을 안전을 위해 천천히 넣으며 혼합액 에머전이 없어질 때까지 혼합한다. 이후, 상기에서 형성된 13.5g의 2-Methyl-5-phenylpentan-2-ol을 혼합하고 12시간 교반하였다. 2) 0℃에서로 냉각하고 황산나트륨 (Sodium sulfate: Na2SO4)을 혼합하고 30분간 교반하였다. 3) 미세한 입자를 제거하기 위하여 Celiteㄾ filter로 여과하였다. 4) 이를 hexane과 ethylacetate 용매으로 실리카겔 컬럼상으로 정제하여 10.5g (수율 70%)의 생성물을 얻었다.
본 단계에서는 acetylene을 E-ethylene으로 환원시키기 위한 환원제로 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합하는 것을 특징으로 한다.
<실시단계 3>
도 3은 알코올의 선택 산화반응하여 알데하이드의 생성하는 방법을 나타낸다.
1) 상기 실시단계 2의 수득합성물 10.5g을 5ml의 DCM에 이산화망간 (MnO2) 5.75g 혼합물을 첨가하였다. 2) 반응의 완료 후, 생성물을 Celiteㄾ filter 로 여과하고 DCM으로 세척하여 7.40g (수율 79%)을 얻었다.
본 단계는 알코올의 선택 산화반응하여 알데하이드의 생성하는 방법으로 Dess-Martin periodinane(DMP) 산화제를 적용(
Figure pat00007
)하는 방법, DMSO 산화제를 적용(
Figure pat00008
)하는 방법, 실시의 예와 같이 MnO2 산화제를 적용하는 방법 그리고 TPAP 촉매 산화법으로 5mol%의 TPAP에 NMO를 1.5배을 넣고 CH2Cl2 하에서 반응(
Figure pat00009
)하는 방법을 포함한다.
<실시단계 4>
도 4는 합성된 상기의 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성하는 방법을 나타낸다.
1) 상기 실시단계 3의 수득물 7.0g을 10ml의 benzene에 용해시키고 Phosphonium ylides 24g을 첨가하고 1시간동안 반응시켰다. 2) 교반된 용매는 진공으로 제거하여 HPLC 검사 상으로 6.50 g의 hydroxy ester (75%)를 수득하였다.
본 단계는 합성된 상기의 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성하는 방법을 특징으로 한다.
<실시단계 5>
도 5는 alcohol을 HCOOH 산으로 탈수하여 ethylene을 형성하는 반응을 나타낸다.
헥산에 녹아 있는 상기의 hydroxy ester 용액 6.50 g에 80% formic acid 0.4 ml를 첨가하고. 상온에서 12시간 교반하여 3.9g을 (수율 69%) 얻었다.
본 단계는 alcohol을 HCOOH 산으로 탈수하여 ethylene을 형성하는 반응으로, cyclohexanol기의 OH를 산화시키기 위한 반응으로 aldaehyde group을 사용함을 특징으로 한다.
<실시단계 6>
도 6은 Rochelle salt를 혼합하고, 환원을 위한 환원제로서 THF를 이용하여 C17 알코올을 합성하는 방법을 나타낸다.
1) 0.48g의 리튬 알루미늄 하이드 라이드(Lithium aluminium hydride: LiAlH4)를 THF (25ml)에 안전을 위해 천천히 넣으며 혼합액 에머전이 없어질 때까지 혼합한다. 완료 후, 상기에서 형성된 3.5g의 ester에 혼합하고 12시간 교반하였다. 2) 0℃에서로 냉각하고 황산 나트륨 (Sodium sulfate: Na2SO4)을 혼합하고 30분간 교반하였다. 3) 미세한 입자를 제거하기 위하여 Celiteㄾ filter 로 여과하였다. 4) 이를 hexane과 ethylacetate 용매으로 실리카겔 컬럼상으로 정제하여 2.19g (수율 70%)의 생성물을 얻었다.
본 단계는 LiAlH4과 같은 Rochelle salt를 혼합하여 esters, carboxylic acids 및 amides의 환원을 위한 환원제로서 THF 또는 Diethyl ether, Monoglyme, Diglyme, Triglyme, Tetraglyme, Dioxane, Dibutyl ether로 대신할 수 있는 것을 특징으로 한다.
<실시단계 7>
도 7은 C17 알코올의 선택 산화반응하여 Aldehyde의 생성하는 방법을 나타낸다.
1) 상기 수득물 1.50g에 30ml의 DCM에 0.58g의 MnO2를 첨가 하여 실온에서 30분 동안 교반 하였다. 2) 반응 완료 후, 생성물을 Celiteㄾ filter를 통해 여과하고 Celiteㄾ filter를 DCM으로 세척 하였다. 용매를 감압 제거하고 화합물 1.10 g (수율 74 %)을 HPLC로 확인하였다.
본 단계는 C17 알코올은 상기의 그림 3과 같은 알코올의 선택 산화반응하여 Aldehyde의 생성하는 방법과 동일하게 반응을 특징으로 한다.
<실시단계 8>
도 8은 Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화하는 반응을 나타낸다.
1) 0℃에서 20ml THF 중 1.10g의 상기 알데히드의 교반 된 용액에 0.5ml의 Methylmagnesium bromide (MeMgBr)을 첨가 하였다. 용액을 0℃에서 30분 동안 교반 하였다. 2) 반응의 완료 후, NHCl의 포화 용액으로 반응종료하고 에테르로 추출하였다. 추출한 에테르층을 물 및 염수 용액으로 세척하고 무수 황산 나트륨(NaSO4)상에서 건조시켰다. 진공으로 용매를 제거하고, 크로마토그래피 정제 화합물을 55% 수율로 수득하였다.
본 단계는 도 1과 같이 alkylation 반응을 유도하는 것으로 Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화하는 반응을 특징으로 한다.
<실시단계 9>
도 9는 Hydor Oxidation반응을 유도하는 과정을 나타낸다.
1) 20ml의 DCM 중 0.50g의 상기 추출물을 넣고 0.18g의 MnO2를 첨가하고 혼합물을 실온에서 교반 하였다. 반응 완료 후, 생성물을 Celiteㄾ filter를 통해 여과 하였다. 2) DCM으로 세척 하였다. 용매를 진공하에 제거하고 크로마토그래피 정제 후 순수한 화합물 0.39g (79%)을 수득하였다.
본 단계는 상기 도 3과 같이 Hydor Oxidation반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.
<실시단계 10>
도 10은 Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응하는 과정을 나타낸다.
1) 20ml의 THF에 4mg 수소화나트륨 (NaH)의 50% 분산액의 현탁액에 0.14ml의 Methyl diethylphosphonoacetate 를 첨가하고, 반응물이 냉각되고 깨끗해질 때까지 교반 하였다. 2) THF 중 1g의 케톤을 적가하고, 반응이 실온에서 완료 될 때까지 반응을 교반 하였다. 과량의 NaH를 물로 켄 칭하고 반응 혼합물을 에테르로 추출 하였다. 에테르 층을 물, 염수 용액으로 세척하였다. 3) 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 증류 제거하고 크로마토 그래피 정제로 메틸 레티노 에이트(0.88g 수율 70%)수득하였다.
본 단계는 Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응을 특징으로 한다.
<실시단계 11>
도 11은 Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 얻는 방법을 나타낸다.
1) 0.106g의 리튬 알루미늄 하이드 라이드(Lithium aluminium hydride: LiAlH4)를 THF (45ml)에 혼합하고 상기에서 형성된 0.88g의 ester를 혼합하고 12시간 교반하였다. 2) 0℃에서로 냉각하고 황산 나트륨 (Sodium sulfate: Na2SO4)을 혼합하고 30분간 교반하였다. 3) 미세한 입자를 제거하기 위하여 Celiteㄾ filter 로 여과하였다. 4) 이를 hexane과 ethylacetate 용매으로 실리카겔 컬럼상으로 정제하여 0.56g 9-cis-retinol (수율 70%)의 생성물을 얻었다.
본 단계는 도 6과 같이 Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 얻는 방법을 특징으로 한다.
<실시단계 12>
도 12 Alcohol기를 Phosphonium salt로 치환하는 반응을 나타낸다.
1) 상위 0.56g 9-cis-retinol을 2.5mL Methanol에 용해시킨 용액에 0.812g PPh3HBr을 Methanol에 녹인 용액을 떨어뜨린다. 2) 혼합용액을 실온, Argon 충진 하에 1시간 교반한다. 3) 회전 진공기로 용매를 제거한다. 4) 25mL hexane으로 부산물을 5-6번 세척한다. phosphonium salt 0.86g (수율 70%)를 얻었다.
본 단계는 Alcohol기를 Phosphonium salt로 치환하는 반응을 특징으로 한다.
<실시단계 13>
도 13은 Knoevenagel condensation와 all trans retinal 형성하는 과정을 나타낸다.
1) 3-Methyl-2-butenal 0.31g을 물 8mL에 녹인 용액에 β-C15 aldehyde 0.12g를 빠르게 첨가하고 실온에서 교반한다. 2) 5분 후 생성된 고체를 거르고 건조한다. all trans retinal 0.39g (수율 95%)를 얻었다.
본 단계는 Knoevenagel condensation와 all trans retinal 형성을 특징으로 한다.
<실시단계 14>
도 14는 Wittig 반응을 통해 Phosphonium salt와 Aldehyde를 탄소 이중결합으로 연결하는 반응을 나타낸다.
1) Phosphonium salt 0.86g을 THF 8mL에 녹인 후 온도를 -78'C로 낮춘다. 2) n-BuLi (1.6M) 0.88mL (phosphonium salt와 같은 mol수)을 천천히 적가하고 30분 동안 교반한다. 3) all trans retinal 0.39g을 THF 50mL에 용해시킨 용액을 첨가하고 -78도에서 1시간 동안 교반 후 25'C에서 30분 더 교반한다. 4) 물을 넣고, E2O로 3회 추출 한 후 염수로 2회 세척한다. Na2SO4로 잔여 수분을 제거한다. 5) 용매를 감압 제거하고, Silica Column (C18-silica gel, CH3CN)으로 정제한다. 0.51g (수율 63%)를 얻었다.
본 단계는 Wittig 반응을 통해 Phosphonium salt와 Aldehyde를 탄소 이중결합으로 연결하는 반응을 특징으로 한다.
<본 발명에서 합성된 9-cis Beta-carotene의 안전성>
본 발명을 통해 합성된 9-cis β-carotene의 랫드를 이용한 정맥 및 경구투여 신속 약물동태시험 결과는 다음과 같다.
1. 0.2 및 1 mg/kg 용량 단회 경구투여 및 0.2 mg/kg 용량 단회 정맥투여
본 시험은 9-cis β-carotene의 랫드를 이용한 단회 정맥 및 경구투여 신속 약물동태시험으로, 시험물질 9-cis β-carotene를 0.2 및 1 mg/kg 용량으로 단회 경구투여 및 0.2 mg/kg 용량으로 단회 정맥투여를 실시하였다. 채혈은 모든 투여군에서 시험물질 투여 전(0), 투여 후 0.5, 2 및 8시간에 약 0.5 mL씩 실시하였다. 생체시료분석은 LC-MS/MS를 이용하여 생체시료분석법 [KIT Analytical Procedure: AP_9-cis β-carotene_ CBA01 (V1.00)]에 따라 실시하였다. 약물동태해석 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 시험기간 동안 모든 투여군에서 사망동물은 관찰되지 않았다.
(2) 일반증상 관찰 결과, 모든 투여군에서 시험물질 투여와 관련된 이상소견은 관찰되지 않았다.
(3) 시험물질 9-cis β-carotene를 0.2 및 1 mg/kg 용량으로 경구투여 및 0.2 mg/kg 용량으로 정맥투여한 시험군의 모든 혈장 시료에서 9-cis β-carotene의 농도는 정량한계(LLOQ: 40 ng/mL) 이하로 나타났다.
결론적으로, 9-cis β-carotene 를 수컷 랫드에 0.2 및 1 mg/kg 용량으로 단회 경구 투여 및 0.2 mg/kg 용량으로 정맥 투여한 결과, 모든 투여군에서 시험물질 투여와 관련된 이상소견은 관찰되지 않았고, 모든 혈장 시료에서 9-cis β-carotene의 농도는 정량한계(LLOQ: 40 ng/mL) 이하로 나타났다. 이를 바탕으로 볼 때, 0.2 mg/kg 용량으로 정맥투여 및 0.2 및 1 mg/kg으로 경구투여시, 정량한계 이상으로 검출될 정도의 전신노출을 나타내지 않았다.
2. 25, 50 및 100 mg/kg 용량의 단회 경구투여, 25 및 50 mg/kg 용량의 단회 정맥투여
본 시험은 9-cis beta carotene-rich extract 의 랫드를 이용한 단회 정맥 및 경투투여 신속 약물동태시험으로, 시험물질 9-cis beta carotene-rich extract 을 25, 50 및 100 mg/kg 용량으로 단회 경구투여를, 25 및 50 mg/kg 용량으로 단회 정맥투여를 실시하였다. 채혈은 경구캡슐 투여군에서 시험물질 투여전(0), 투여 후 0.5, 2, 4, 8 및 10시간에, 정맥투여군에서 투여 후 10, 20, 40, 60, 80 및 120분에 약 0.4 mL씩 실시하였다. 생체시료분석은 LC-MS/MS를 이용하여 생체시료분석법 [KIT Analytical Procedure: AP_9-cis β-carotene_CBA01 (V1.00)]에 따라 실시하였다. 약물동태해석 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 시험기간 동안 모든 투여군에서 사망동물은 관찰되지 않았다.
(2) 일반증상 관찰 결과, 시험물질 투여 직후 정맥투여군인 T4군 및 T5군의 모든 동물에서 각각 orange 및 red로 변색된 약간의 뇨배설이 관찰되었다. 경구투여군에서는 시험물질과 관련된 일반증상은 발생하지 않았다.
(3) 시험물질 9-cis beta carotene-rich extract 을 25, 50 및 100 mg/kg의 용량으로 수컷 랫드에 경구투여한 시험군(T1, T2 및 T3)의 모든 혈장 시료에서 정량한계 이하로 나타났다.
(4) 시험물질 9-cis beta carotene-rich extract 를 25 및 50 mg/kg의 용량으로 수컷 랫드에 정맥투여한 시험군(T4 및 T5)에서 전신노출을 나타내었다. 모든 동물에서 첫 채혈포인트인 10분에서 최고혈중농도를 나타내었고, 이후 감소하였다. 시험물질의 소실반감기(t1/2)는 24.4분으로 나타났다.
(5) 시험물질에 대한 전신노출(AUClast)은 25 및 50 mg/kg 정맥투여군에서 투여용량이 증가함에 따라 투여량의 증가율보다 높은 증가율을 보였다. Cmax의 경우, 투여량의 증가율과 비슷한 증가율을 보였다.
결론적으로, 9-cis beta carotene-rich extract 을 25-100 mg/kg 용량으로 단회 경구 투여 및 25-50 mg/kg 용량으로 정맥 투여한 결과, 시험물질은 경구투여군의 모든 혈장 시료에서 정량한계 이하로 나타났고, 정맥투여군에서만 전신노출을 나타내었다. 정맥투여군에서 시험물질의 반감기는 24.4분이었고, 시험물질에 대한 전신노출(AUClast)은 투여용량의 증가율보다 높은 증가율을 보였다. Cmax는 투여용량의 증가에 따라 투여량의 증가율과 비슷한 증가율을 보였다.
3. 300 mg/kg용량의 단회 경구투여
본 시험은 9-cis beta carotene-rich extract 의 랫드를 이용한 단회 경구투여 신속 약물동태시험으로, 시험물질 9-cis beta carotene-rich extract 을 300 mg/kg용량으로 단회 경구투여를 실시하였다. 채혈은 시험물질 투여 전(0), 투여 후 0.5, 2, 4, 8 및 10시간에 약 0.4 mL씩 실시하였다. 생체시료분석은 LC-MS/MS를 이용하여 생체시료분석법 [KIT Analytical Procedure: AP_9-cis β-carotene_ CBA01 (V1.00)]에 따라 실시하였다. 약물동태해석 결과를 요약하면 다음과 같다.
(1) 시험기간 동안 사망동물은 관찰되지 않았다.
(2) 일반증상 관찰 결과, 시험물질 투여와 관련된 이상소견은 관찰되지 않았다.
(3) 시험물질 9-cis beta carotene-rich extract를 300 mg/kg용량으로 경구투여한 모든 혈장 시료에서 9-cis β-carotene의 농도는 정량한계(LLOQ: 40 ng/mL) 이하로 나타났다.
결론적으로, 9-cis beta carotene-rich extract를 300 mg/kg 용량으로 단회 경구투여한 결과, 시험물질 투여와 관련된 이상소견은 관찰되지 않았고, 모든 혈장 시료에서 9-cis β-carotene의 농도는 정량한계(LLOQ: 40 ng/mL) 이하로 나타났다. 이를 근거로 볼 때, 300 mg/kg으로 경구투여시 체내 흡수가 매우 낮은 것으로 사료된다.
<본 발명에서 합성된 9-cis Beta-carotene의 약물학적 적용>
본 발명에서 합성 9-cis Beta-carotene 연구 및 개발 범위는 98%이상 순도의 약물로 마우스의 근육세포(Mus musculus)에 정제한 9-cis β-carotene을 투여하고 적용된 세포의 전체 RNA-seq. 분석을 수행하여, 발현양의 변화가 2배 이상인 유전자 731개 발굴하고, 대표적인 gene의 차이점 분석했다. 실험결과mRNA 증가 유도 7 case, 억제 유도 11 case가도출하여 적용범위를 확인하였다. 적용병증의 범위는 암, 심, 뇌혈관, 파킨슨병, 백혈병, 각막질환에 관여하는 mRNA에 작용됨을 확인하였다.
또한 키나제 신호전달 메커니즘 (kinase signaling mechanism) 분석하였다. 마우스 대식세포주 raw264.7 세포에 9-cis 베타카로틴 투여 실험을 통해 관련 단백질의 인산화 유도를 확인하고자 하고자 한국생명공학연구원 바이오의약연구부 바이오신약중개연구센터에 의뢰하여 9-cis β-carotene의 신호전달 기전작용 실험을 위탁진행 하였다.
9-cis Beta-carotene의 암, 심, 뇌혈관, 파킨슨병, 백혈병, 각막질환에 관여하는 mRNA에 작용 결과
Transcript Gene_id Gene_
symbol		 Desc 9-cis-Beta/control.fc 9-cis-Beta/control
.volume		 N_control N_9-cis-Beta FPKM_control FPKM_
9-cis-Beta
NM_009140 20310 Cxcl2 chemokine (C-X-C motif) ligand 2 -6.113034 10.32423171 11.71244473 9.1005561 3515.874628 560.598553
NM_013642 19252 Dusp1 dual specificity phosphatase 1 -4.349714 6.465756688 7.61260383 5.49168333 190.396298 45.77917
NR_106169 102465886 Mir8094 . -7.991137 5.921524901 7.60756015 4.60915937 189.814005 24.090911
NM_009971 12985 Csf3 colony stimulating factor 3 (granulocyte) -12.242036 5.691682965 7.77849288 4.1647213 210.784275 17.441649
NM_019641 16765 Stmn1 stathmin 1 4.366855 5.011442781 4.05970568 6.18630037 15.29653 74.065683
NM_026785 68612 Ube2c ubiquitin-conjugating enzyme E2C 5.000023 3.970218504 2.97551428 5.29744894 6.718521 39.703433
NM_008566 17218 Mcm5 minichromosome maintenance deficient 5, cell division cycle 46 (S. cerevisiae) 5.189962 3.205637329 2.23078197 4.60650607 3.621921 24.013711
NM_008182 14858 Gsta2 glutathione S-transferase, alpha 2 (Yc2) 4.904446 1.668218146 0.87747069 3.17156096 0.811133 8.242925
NM_023595 110074 Dut deoxyuridine triphosphatase 4.235051 1.45364406 0.74686989 2.82924922 0.654704 6.24292
NM_133232 170768 Pfkfb3 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 -4.031818 0.763145402 2.26819444 0.2567641 3.741562 0.20563
NR_108102 12091 Glb1 galactosidase, beta 1 9.733571 0.123055558 0.00460603 3.28757527 0.002499 9.023243
NM_001080798 17355 Aff1 AF4/FMR2 family, member 1 -8.894195 0.090779943 3.15547569 0.00261165 7.674939 0.002262
NM_008995 19305 Pex5 peroxisomalbiogenesis factor 5 -4.325454 0.068850324 2.11509278 0.00224121 3.276099 0.001889
실험결과는 PLK(Polo-like kinase)에 의한 염색체 유사분열(mitosis), 에스트로겐 수용체에 의한 염색체 유사분열(mitosis), 사이클린 단백질에 의한 세포 사이클 조절 과정을 활성화, G2/M(복제기)기에 일어나는 염색체 분열 중지 및 검사 과정과 관련된 단백질(관련단백질 : G0/G1 조절 단백질인 사이클린 D1, Cdk4, 사이클린 E 및 Cdk2 단백질)의 발현을 감소, TNFR1 신호 전달과정에 관여하는 단백질의 발현을 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 9-cis β-carotene이 인산화 유도를 통해 억제함에 따라 암, 파킨슨병 유발 유전자의 변이를 억제함을 확인하였다. 도 15는 Polo-like kinase 신호 전달 기전작용모식도를 나타낸다.
도 16은 마우스 근육세포에서 지방세포 제거 정도 실험 결과를 나타낸다. 세포의 지질 제거 작용을 확인하기 위하여 Novartis사의 당뇨병 치료제 후보 물질 FGF21 단백질과 주사제형의 본 발명방법으로 개발된 9-cis β-carotene 합성과정중 9-cis RA와 all trans RA형태로 합성하여 1:1의 비율로 각 0.2μg/ml를 마우스 근육세포 (Mus musculus: C3H10T1/2)에서 지방세포 제거 정도 실험을 한국생명공학연구원 바이오의약연구부 바이오신약중개연구센터의 지원을 받아 진행하였다. 결과를 비교해 보았을 때 지방 에너지 영역에서 안정적인 효과가 관찰되었다. 도 16에서 적색 영역은 세포 내 지질 인자이다. 우리의 9-cis β-carotene 은 FGF21보다 효과적으로 붉은색으로 염색된 지방세포가 제거됨을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 9-cis Retinol의 Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도하는 가) 단계;
    β-C15 aldehyde와 3-Methyl-2-butenal을 Knoevenagel condensation의 반응을 유도하여 All-trans Aldehyde를 합성하는 나) 단계;
    가) 단계에서 완성된 9-cis Retinoic Phosphonium salt와 나) 단계에서 완성된 All-trans Aldehyde를 Wittig Olefination반응을 통해 탄소 이중결합으로 연결하는 반응으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 9-cis Beta-carotene의 합성방법
  2. 청구항 1에 있어서 가) 단계의 9-cis Retinol은
    [단계 1] 2.2.6 trimethyl cyclohexanone과 (Z)-3-Methylpent-2-en-4-yn-1-ol을 R-Mg-X화합물로 반응을 촉진하고;
    [단계 2] 상기 [단계 1]에서 완성된 acetylene을 E-ethylene으로 환원시킨 후,
    [단계 3] 상기 [단계 2]에서 합성된 케미컬의 말단의 Alcohol기를 선택 산화 반응하여 알데하이드의 생성하며,
    [단계 4] 상기 [단계 3]에서 합성된 C15 Aldaehyde에 Phosphonium ylides로 C18 hydroxy ester를 합성하며;
    [단계 5] 상기 [단계 4]에서 합성된 C18 말단의 Alcohol기를 HCOOH 산으로 탈수하여 Ethylene을 형성하는 반응으로, Cyclohexanol기의 OH를 산화시킨 후;
    [단계 6] 상기 [단계 5]에서 Ethylene형성 후, Rochelle salt를 혼합하여 esters, carboxylic acids 및 amides의 OH의 Alcohol기로 환원하여;
    [단계 7] 상기 [단계 6]에서 생성된 C17 알코올은 선택 산화반응하여 Aldehyde의 생성하며;
    [단계 8] Grignard 반응을 통해 Ketone을 Methyl기로 알킬화 하는 반응을 유도하는 단계 및 [단계 9] Hydor Oxidation반응을 유도하는 단계;
    [단계 10] Aldehyde 또는 ketone을 RO group으로 C=C 커플링 반응을 유도하는 단계;
    [단계 11] Ester기를 LiAlH4 환원제로 환원하여 Alcohol기를 형성한 후;
    [단계 12] Alcohol기를 9-cis Phosphonium salt로 치환하는 반응을 유도하는 과정으로 생성되는 것을 특징으로 하는 9-cis Beta-carotene의 합성방법
  3. 청구항 2에 있어서, [단계 1]의 R-Mg-X화합물에서 X는 할로겐이고 R은 유기기인 alkyl 또는 aryl형태의 methylmagnesium chloride 또는 phenylmagnesium bromide의 그리냐르 시약 (Grignard reagents) 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 9-cis Beta-carotene의 합성방법
  4. 청구항 2에 있어서, [단계 3]의 Alcohol기를 선택 산화 반응하여 알데하이드를 생성하는 방법은 Dess-Martin periodinane (DMP) 산화제를 적용 (
    Figure pat00010
    )하는 방법, DMSO 산화제를 적용(
    Figure pat00011
    )하는 방법, 실시의 예와 같이 MnO2 산화제를 적용하는 방법 그리고 TPAP 촉매 산화법으로 5mol%의 TPAP에 NMO를 1.5배을 넣고 CH2Cl2 하에서 반응(
    Figure pat00012
    )하는 방법 중에서 선택되는 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 9-cis Beta-carotene의 합성방법
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