KR101251783B1 - Ｂ-환 치환된 플라보노이드 유도체를 함유한 관절염 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 일반식 (I) 로 표기되는 플라보노이드 유도체, 이의 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 플라보노이드 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 연골 구성물질 분해 억제, ECM 분해 억제 활성, 및 MMP-13 발현 억제 활성을 나타내며, 만성 관절염 유발 동물실험에서 관절파괴 억제 활성이 탁월하므로, 관절염의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

Description

Ｂ-환 치환된 플라보노이드 유도체를 함유한 관절염 치료제 {Anti-arthritic agent comprising B-ring substituted flavonoids}

본 발명은 B-환 치환된 플라보노이드 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료제에 관한 것이다.

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관절염에는 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis) 및 퇴행성관절염 (골관절염, osteoarthritis)등이 있으나, 이들 질환은 최종적으로는 관절강의 연골의 파괴가 수반되는 고통스러운 질환이다. 특히 가장 많은 환자들이 겪는 퇴행성관절염은 관절의 연골이 달아 없어지면서 국소적인 퇴행성변화가 나타나는 질환이다. 이 질환은 주로 노인 인구에 발생하여 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는데, 손, 발, 척추와 체중부과를 많이 받는 관절 즉 고관절이나, 무릎관절에 잘 발생한다. 퇴행성관절염의 발병원인은 유전적인 원인, 물리 기계적인 원인 및 aging factor가 중요하게 작용한다. 이런 관절염의 원인은 서로 다르고, 아직 모든 것이 다 밝혀져 있지 않지만, 최종적으로는 관절연골을 파괴시키는 요인으로, 관절부위에서 과발현되는 matrix metalloproteinase (MMP)이 중요하며, 특히 collagenase-3/MMP-13이 관절파괴에 가장 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. (Mitchell PG, Magna HA, Reeves LM, Lopresti-Morrow LL, Yocum SA, Rosner PJ, Geoghegan KF, Hambor JE. Cloning, expression, and type II collagenolytic activity of matrix metalloproteinase-13 from human osteoarthritic cartilage. J Clin Invest 1996;97:761-8; Takaishi H, Kimura T, Dalah S, Okada Y, D’Armiento J. Joint diseases and matrix metalloproteinases: a role for MMP-13. Current Phramaceutical Biotechnology 2008;9:pp.47-54).

MMP-13은 연골 및 관절의 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM) 중 가장 주된 콜라겐(collagen)을 분해하여 관절의 파괴를 진행시킨다. 그러므로 MMP-13을 저해하거나, 발현을 억제하는 물질은 관절연골의 파괴를 억제하고 지연시킬 수 있다 (Johnson AR, Pavlovsky AG, Ortwine DF, Prion F, Man CF, Bornemeier DA, Banotai CA, Mueller WT, McConell P, Yan C, Baragi V, Lesch C, Roark WH, Wilson M, Datta K, Guzman R, Han HK, Dyer RD. Discovery and characterization of a novel inhibitor of matrix metalloproteinase-13 that reduces cartilage damage in vivo without joint fibroplasias side effects. J. Biol. Chem. 2007; 282; pp.27781-91.)

이들 물질을 발굴하고 의약품으로 사용하고자하는 목적으로, 본 연구자는 여러 천연성분들을 대상으로 연구하였고, 이들 중 플라보노이드 유도체들 중 특히 B-환에 치환기를 보유한 일부 유도체들이 강력하게 MMP-13 발현을 억제함을 발견하였고, 이러한 연골파괴 억제 활성은 in vivo 동물실험에서도 확인되어 관절염 질환의 치료 및 예방 약제로서 개발가능성이 높음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

해상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

상기 식에서,

R₁ 는 할로겐 원자, 히드록시기, 및 C₁ 내지 C₃ 저급알콕시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며,

R₂ 내지 R₅ 는 각각 독립적으로 수소원자, 할로겐 원자, 히드록시기, 및 C₁ 내지 C₃ 저급알콕시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.

상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 바람직하기로는 R₁ 는 히드록시기 및 메톡시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기, 보다 바람직하게는 히드록시기이며, R₂ 내지 R₅ 는 각각 독립적으로 수소원자, 히드록시기 및 메톡시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기, 보다 바람직하게는 히드록시기인 화합물 군이다.

상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 가장 바람직한 화합물로서,

5,7,2',3'-테트라히드록시플라본(tetrahydroxyflavone), 5,7,2',4'-테트라히드록시플라본, 5,7,3',4'-테트라히드록시플라본 또는 7-메톡시(methoxy)-5,3',4'-트리히드록시플라본(trihydroxyflavone)을 들 수 있다.

상기 구조식 (Ⅰ)로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 당업계에 공지된 합성방법으로 제조가능하며, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

일정량의 히드록시 아세토페논(II) 및 수산화칼륨을 메탄올 등의 유기용매에 용해시킨 후, 일정량의 4-벤질옥시벤즈알데히드(III)을 첨가하여 실온에서 반응시키는 1 단계; 요오드 등으로 반응시키는 2단계; 소듐 티오설페이트(sodiume tiosulfate) 포화 수용액을 넣고 반응시키고 재결정하는 3단계 등의 반응을 수행하여 본 발명의 목적 화합물 플라본들을 제조가능하다.

본원에서 정의되는 “관절염”은 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염으로부터 선택된 하나 이상의 질환, 바람직하게는 퇴행성 관절염을 포함한다.

관절의 chondrocyte가 ECM의 생산과 MMP들을 생합성하기에 사람 관절 chondrocyte인 SW1353 cell line 세포배양을 통하여 chondrocyte를 배양하고 IL-1를 처리하여 활성화시켰고, 이렇게 활성화된 세포는 ECM 분해에 필요한 MMP-13의 발현양이 급격하게 증가하고 결국 가수분해된 collagen degradation product 및 proteoglycan의 양이 올라간다. 이 시스템(system)에 상기 제조방법으로 얻어진 본 발명의 일반식 (I) 화합물들을 처리하여 이들에 미치는 영향을 연구하였다. 또한 in vivo 동물모델에서 관절파괴 억제활성을 확인하였다.

따라서 본 발명에서는 상기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 플라보노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 단체를 함유하는 염증질환, 면역계 이상 질환 또는 암질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 500 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.

또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물에서, 본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염의 유효용량은 0.1 내지 500 mg/kg 또는 피부적용시 0.1 내지 200 mg/cm²이고, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg 또는 피부적용시 1 내지 10 mg/cm²이며, 하루 1-6회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명은 관절염의 예방 및 개선 효과를 나타내는 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 관절염의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 관절염의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 일반식 (Ⅰ)로 표시되는 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 마우스에 경구 투여, 복강내 투여 및 피하주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 800 mg/kg 이상인 것으로 확인되었고 따라서, 본 발명에 따른 플라보노이드 유도체 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 비교적 안전한 물질로 판명되었다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 일반식 (Ⅰ)로 표기되는 플라보노이드 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염은 연골 구성물질 분해 억제, ECM 분해 억제 활성, 및 MMP-13 발현 억제 활성을 나타내며, 만성 관절염 유발 동물실험에서 관절파괴 억제 활성이 탁월하므로, 관절염의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

도 1은 실시예 화합물들의 MMP-13 발현억제작용을 나타낸 도이며 (A: apigenin, **: P < 0.01, significantly different from the IL-1-treated control group (n = 3) 나타냄), 세로축이 MMP-13의 발현양 ng/ml이다.;
도 2는 apigenin과 합성 flavone 유도체 (5,7,2‘,3’-tetrahydroxyflavone, 7)의 화합물들의 MMP-13 발현억제의 세포내 작용기전을 나타낸 도이며.
도 3는 실시예 화합물들의 관절에서의 조직학적 소견을 나타낸 도이다( (a) Iodoacetate-treated (b) apigenin (c) 화합물 7 (d) 화합물 8 (e) 화합물 9 처리군을 나타냄).

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 실험 준비 및 기기

1-1. 분석기기

본 실험에서 얻은 생성물의 구조 확인을 위해 사용된 기기는 하기와 같다. 핵자기 공명 스펙트럼(¹H NMR, ¹³C NMR)은 200MHz, 300MHz 또는 400MHz 를, 용매는 CDCl₃, DMSO-d₆를 사용하였다. 짝지음(Coupling) 상수( J )는 Hz로 표시하였다. 질량(Mass) 스펙트럼을 사용하였으며 m/z 형태로 표시하였다.

1-2. TLC 및 관 크로마토그래피

TLC (Thin layer chromatography)는 E. Merck 사 제품인 실리카겔(Merck F254)을 사용하였으며 관 크로마토그래피(Column chromatography)를 위해서는 실리카(Merck EM9025, 70-230 mesh)를 사용하였다. 또한, TLC 상에서 분리된 물질을 확인하기 위해서 UV 램프(= 254 nm)를 이용하였다.

1-3. 사용 시약

본 실험에서 사용된 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 란캐스터(Lancaster), 플루카(Fluka) 제품을 구입하여 사용하였으며, 반응에 사용된 용매는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 머크(Merck), 준세이 화학(Junsei Chemical Co.) 제품의 1급 시약을 정제 없이 사용하였다.

실시예 1. 플라보노이드 유도체들의 합성

하기 플라보이드 유도체들을 Dao등의 방법 (Arch. Pharm. Res. 2003;26:345-350, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004;14:1165-1167)에 따라 합성하였다.

1-1. flavone (1)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 수산화칼륨(3 당량)을 메탄올에 용해한 후, 벤즈알데히드(1 당량)을 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 완료 후, 3중량%의 염산수용액을 천천히 적가하면서 교반하였다. 이 때 생성된 노란색 고체를 여과하고 메탄올로 세척한 후 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 디메틸설폭시드(DMSO) 에 용해시킨 후, 상기 수득된 고체를 기준으로 요오드(0.1 당량)을 가한 후 100℃에서 10시간 교반시켰다. 상기 용액을 실온으로 냉각한 후, 소듐 티오설페이트(sodiume tiosulfate) 포화 수용액을 상기 용액이 무색으로 변할 때까지 천천히 적가하였다. 이 때 생성된 고체를 여과하고 메탄올로 재결정하여 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(flavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 46%

- 하얀색 고체, mp 95~96℃.

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 8.22~8.27 (dd, 1H, J = 7.8 Hz, 1.6Hz, H5), 7.93~7.95 (dd, 2H, J = 7.6Hz, H2', H6'), 7.68~7.77 (t, 1H, J = 7.0Hz, 1.6Hz, H7), 7.40~7.60 (m, 7H, J = 8.4Hz, 8.8Hz, 7.8Hz, 2.6Hz, 2.4Hz, H2', H3', H4', H5', H6', H6, H8), 6.85 (s, 1H, H3).

1-2. 4'- hydroxyflavone (2)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 수산화칼륨(3 당량)을 메탄올에 용해한 후, 4-벤질옥시벤즈알데히드(1 당량)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 완료 후, 3중량%의 염산수용액을 천천히 적가하면서 교반하였다. 이 때 생성된 노란색 고체를 여과하고 메탄올로 세척한 후 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 디메틸설폭시드(DMSO) 에 용해시킨 후, 상기 수득된 고체를 기준으로 요오드(0.1 당량)을 가한 후 100℃에서 10시간 교반시켰다. 상기 용액을 실온으로 냉각한 후, 소듐 티오설페이트(sodiume tiosulfate) 포화 수용액을 상기 용액이 무색으로 변할 때까지 천천히 적가하였다. 이 때 생성된 고체를 여과하고 메탄올로 재결정하여 하고 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 아세트산에 용해시킨 후 고체 기준으로 농염산 (2ml/당량)을 첨가하여 30분-1시간 가열환류 반응시켰다. 반응 완료후 실온으로 냉각하고 0℃의 물을 천천히 적가하면서 교반하였다.이 때 생성된 고체를 여과하고 메탄올로 재결정하여 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(4-hydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 28%

- 노란색 고체, mp 264℃.

¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d ₆) : δ 8.17~8.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H5), 7.80~7.85 (d, 2H, J = 9.0 Hz, H2', H6'), 7.67~7.74 (t, 1H, H7), 7.38~7.66 (m, 2H, H6, H8), 6.96~7.01 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H3', H5'), 6.71 (s, 1H, H3).

1-3. 2', 3’- dihydroxyflavone (3)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 수산화칼륨(3 당량)을 메탄올에 용해한 후, 2,3,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 완료 후, 3중량%의 염산수용액을 천천히 적가하면서 교반하였다. 이 때 생성된 노란색 고체를 여과하고 메탄올로 세척한 후 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 디메틸설폭시드(DMSO) 에 용해시킨 후, 상기 수득된 고체를 기준으로 요오드(0.1 당량)을 가한 후 100℃에서 10시간 교반시켰다. 상기 용액을 실온으로 냉각한 후, 소듐 티오설페이트(sodiume tiosulfate) 포화 수용액을 상기 용액이 무색으로 변할 때까지 천천히 적가하였다. 이때 생성된 고체를 여과하고 메탄올로 재결정하여 하고 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 CHCl₃에 용해시킨 후 고체 기준으로 CHCl₃에 용해한 1M BBr₃(5 당량)를 첨가하고 가열 환류 반응시켰다. 반응 완료 후 실온으로 냉각하고 0℃에서 소량의 메탄올을 점적한 후 유기용매를 감압 농축하였다. 얻은 고체를 메탄올로 재결정하여 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(2',3'-dihydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 28%

- 하얀색 고체 , mp 238~239℃.

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 8.02~8.06 (dd, 1H, J = 8.0Hz, 1.2Hz, H5), 7.70~7.85 (m, 2H, H6, H7), 7.44~7.52 (m, 3H, H5', H6', H8), 6.89~6.93 (d, 1H, J = 9.2Hz, H4'), 6.75 (s, 1H, H3).

1-4. 3',4'- dihydroxyflavone (4)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디벤질옥시벤즈알데히드(1 당량)를 출발물질로 사용하여 화합물 (2)와 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(3',4'-dihydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 30%

- 노란색 고체 , mp 250℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆) : δ 9.02 (s, 1H, OH), 8.15~8.19 (d, 1H, J = 8.0Hz, H5), 7.58~7.71 (t, 1H, H7), 7.36~7.54 (m, 4H, H2', H6', H6, H8), 6.95~6.99 (d, 1H, J = 8.0Hz, H5'), 6.67 (s, 1H, H3).

1-5. 2', 4’- dihydroxyflavone (5)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 2,4,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 출발물질로 사용하여 화합물 (3)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(2',4'-dihydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 34%

- 노란색 고체 , mp 285~286℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆) : δ 10.67 (s, 1H, OH), 10.27 (bs, 1H, OH), 7.98~8.03 (d, 1H, J = 9.6 Hz, H5), 7.45~7.84 (m, 3H, H6', H7, H8), 7.45~7.49 (t, 1H, H6), 7.09 (s, 1H, H3), 6.42~6.50 (m, 2H, H3', H5')

1-6. 7,3', 4’- trihydroxyflavone (6)의 제조

2-디히드록시-4-메톡시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 출발물질로 1M BBr₃(10 당량)을 사용하여 화합물 (3)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(7,3',4'-trihydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 31%

- 노란색 고체 , mp >300℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆) : δ 10.75 (s, 1H, OH), 9.84 (s, 1H, OH), 7.83~7.88 (dd, 1H, J = 8.8Hz, H5), 7.38 (t, 2H, J = 8.0Hz, 1.8Hz, H2', H6'), 6.86~6.93 (t, 3H, J = 8.8Hz, 2.6Hz, H5', H6, H8), 6.60 (s, 1H, H3).

1-7. 5,7,2', 3’- tetrahydroxyflavone (7)의 제조

2-히드록시-4,6-디메톡시 아세토페논(1 당량)과 2,3,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 출발물질로 사용하여 화합물 (6)과 동일한 합성방법으로하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(5,7,2',3'-tetrahydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 26%

- 노란색 고체 , mp >300℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆) : δ 12.90 (bs, 1H, 5-OH), 10.86 (bs, 1H, OH), 10.02 (bs, 1H, OH), 9.63 (bs, 1H, OH), 7.29~7.34 (d, 1H, J = 8.6Hz, H6'), 6.98~7.02 (d, 2H, J = 9.6Hz, H2', H5'), 6.81 (s, 1H, H3), 6.45 (d, 1H, J = 1.8Hz, H6), 6.20 (d, 1H, J = 1.6Hz, H8).

1-8. 5,7,3', 4’- tetrahydroxyflavone (8)의 제조

2-히드록시-4,6-디메톡시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 출발물질로 사용하여 화합물 (6)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 24%

- 노란색 고체 , mp >300℃.

¹H-NMR(200MHz, DMSO-d ₆) : δ 7.42 (dd, 1H, J = 8.3Hz, 2.2 Hz, H6'), 7.40 (d, 1H, J = 2.2Hz, H2'), 6.90 (d, 1H, J = 8.3Hz, H5'), 6.68 (s, 1H, H3), 6.45 (d, 1H, J = 2.0Hz, H8), 6.20 (1H, d, J = 2.0Hz, H6).

1-9. 5,7,2', 4’- tetrahydroxyflavone (9)의 제조

2-히드록시-4,6-디메톡시 아세토페논(1 당량)과 2,4,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)을 출발물질로 사용하여 화합물 (6)과 동일한 합성방법으로하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(5,7,2',4'-tetrahydroxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 26%

- 노란색 고체 , mp >300℃.

¹H-NMR(200MHz, DMSO-d ₆) : δ 13.06 (s, 1H, 5-OH), 10.74 (s, 1H, OH), 10.72 (s, 1H, OH), 10.16 (s, 1H, OH), 7.74~7.78 (d, 1H, J = 8.4Hz, H6'), 6.98 (s, 1H, H2'), 6.42~6.49 (m, 3H, H3, H5', H6), 6.16 (d, 1H, J = 2.0Hz, H8).

1-10. 5- hydroxy -7- methoxyflavone (10)의 제조

2-히드록시-4,6-디메톡시 아세토페논(1 당량) 수산화칼륨(3 당량)을 메탄올에 용해한 후, 벤즈알데히드(1 당량)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 완료 후, 3중량%의 염산수용액을 천천히 적가하면서 교반하였다. 이 때 생성된 노란색 고체를 여과하고 메탄올로 세척한 후 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 디메틸설폭시드(DMSO) 에 용해시킨 후, 상기 수득된 고체를 기준으로 요오드(0.1 당량)을 가한 후 100℃에서 10시간 교반시켰다. 상기 용액을 실온으로 냉각한 후, 소듐 티오설페이트(sodiume tiosulfate) 포화 수용액을 상기 용액이 무색으로 변할 때까지 천천히 적가하였다. 이 때 생성된 고체를 여과하고 메탄올로 재결정하여 하고 건조하였다. 상기 반응에서 수득된 고체를 아세토니트릴(CH₃CN)에 용해시키고 얼음을 사용하여 약 0℃로 냉각시킨 후, 무수 알루미늄 트리클로라이드(5 당량)을 첨가하고 가열 환류 조건 하에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상기 용액을 감압 농축하여 아세토니트릴을 제거하고, 수득된 고체를 클로로포름과 3N의 염산 수용액을 2:1의 부피비로 혼합한 용액에 용해한 후, 가열 환류 조건에서 40분간 유지시켰다. 이 후, 유기층을 분리하여 무수 황산 마그네슘으로 여분의 수분을 제거하고 감압 농축하였다. 이 때 수득된 고체를 다시 메탄올로 세척하고 다시 건조하여 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(5-hydroxy-7-methoxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 26%

- 노란색 고체 , mp >300℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆+CDCl₃) : δ 13.02 (s, 1H, 5-OH), 8.05~8.09 (dd, 2H, J = 9.8Hz, H2', H6'), 7.56~7.60 (m, 3H, H3', H4', H5'), 6.67 (s, 2H, H6, H8), 6.47 (s, 1H, H3), 3.99 (s, 3H, OCH₃).

1-11. 3', 4'- dihydroxy -7- methoxyflavone (11)의 제조

2-히드록시-4-메톡시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디벤질옥시벤즈알데히드(1 당량)를 출발물질로 사용하여 화합물 (2)와 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(3’, 4’-dihydroxy-7-methoxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 22%

- 노란색 고체 , mp >240℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆+CDCl₃) : δ 9.12 (bs, 1H, OH), 8.01~8.05 (d, 1H, J = 8.4Hz, H5), 7.33~7.40 (t, 2H, J = 8.6Hz, H2', H6'), 6.92~7.04 (t, 2H, J = 8.2Hz, H6, H8), 6.57 (s, 1H, H3), 3.94 (s, 3H, OCH₃).

1-12. 7- methoxy -5,3',4'- trihydroxyflavone (12)의 제조

2-히드록시-4,6-디메톡시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디벤질옥시벤즈알데히드(1 당량)를 출발물질로 사용하여 화합물 (10)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(7-methoxy-5,3',4'-trihydroxy flavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 17%

- 노란색 고체 , mp 286~287℃.

¹H-NMR (200MHz, DMSO-d ₆) : δ 8.09 (d, 1H, J = 8.9Hz, H2'), 6.94 (d, 1H, J = 8.9Hz, H3'), 6.75 (d, 1H, J = 2.2Hz, H8), 6.36 (d, 1H, J = 2.2Hz, H6), 3.87 (s, 1H, OCH₃).

1-13. 3',4'- dimethoxyflavone (13)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디메톡시벤즈알데히드(1 당량)를 출발물질로 사용하여 화합물 (1)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(3',4'-dimethoxyflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 35%

- 노란색 고체 , mp 155℃.

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 8.22~8.26 (dd, 1H, J = 8.0Hz, 2.4Hz, H5), 7.67~7.75 (t, 1H, J = 8.4Hz, 7.4Hz, 1.6Hz, H7),7.56~7.62 (m, 2H, H6, H8), 7.40~7.60 (m, 2H, H2', H6'), 6.98~7.03 (d, 1H, J = 8.6Hz, H5'), 6.78 (s, 1H, H3), 4.00 (s, 3H, OCH₃), 3.98 (s, 3H, OCH₃).

1-14. 3',4'- dichloroflavone (14)의 제조

2-히드록시 아세토페논(1 당량)과 3,4,-디클로로벤즈알데히드(1 당량)를 출발물질로 사용하여 화합물 (1)과 동일한 합성방법으로 하기 물성치를 갖는 목적 화합물 플라본(3',4'-dichloroflavone)을 제조하였다.

- 수득율 : 77%

- 노란색 고체 , mp 184℃.

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 8.22~8.26 (d, 1H, J = 7.4Hz, H5), 8.04~8.05 (ds, 1H, J = 2.0Hz, H2'), 7.42~7.78 (m, 6H, J = 8.6Hz, 2.0Hz, 1.6Hz, H5', H6', H6, H7, H8), 6.80 (s, 1H, H3).

실험예 1. MMP -13 양에 대한 영향

실시예에서 합성된 유도체들의 MMP-13 양에 대한 영향을 검정하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험하였다.(Mengshol JA, Vincenti MP, Coon CI, Barchowsky A, Brinckerhoff CE. Interleukin-1 induction of collagenase 3 (matrix metalloproteinase 13) gene expression in chondrocytes requires p38, c-Jun N-terminal kinase and nuclear factor κB: differential regulation of collagenase 1 and collagenase 3. Arthritis Rheum 2000;43:801-11.)

Chondrocyte ( SW1353 ) 배양 및 활성화

Human chondrosarcoma cell line인 SW1353(ATCC사로부터 구입)을 10% FBS와 penicillin/strentomycin, glutamine이 첨가된 DMEM(Gibco사)을 사용하여 배양하였다. 배지 내로 분비되는 MMP-13의 발현을 확인하기 위해서 serum-free DMEM 조건하에서 IL-1β를 10 ng/ml 농도로 처리하고 24시간 경과 후 상등액을 얻어 ELISA법 (R&D Systems (Minneapolis, MN)을 시행하여 이들 MMP-13의 양을 확인하였고 그 결과는 도 1과 같다.

본 실험 결과, compound 1과 14를 제외한 모든 군에서 유의적인 MMP-13 발현억제능을 보였으나, 특히 합성유도체 7, 8, 9, 12등에서 강력하게 MMP-13의 양을 감소시킴을 확인하였다.

이 결과는 관절에서의 ECM의 분해가 억제될 것이라는 예상이 가능하게 하였다.

실험예 2. 세포내 작용기전 연구

실시예에서 합성된 유도체들의 세포내 작용기전을 검정하기 위하여 문헌에 기재된 방법 (Lim H, Kim HP. Matrix Metalloproteinase-13 Expression in IL-1β-treated Chondrocytes by Activation of the p38 MAPK/c-Fos/AP-1 and JAK/STAT Pathways. Arch. Pharm. Res. 2011 Jan. in press) 에 따라 하기와 같이 실험하였다. 대조군으로는 apigenin을 사용하였다.

Apigenin과 가장 강력한 저해제인 7의 작용기전을 밝히기 위하여 SW1353 cell에 IL-1β를 10 ng/ml을 처리하고 동시에 flavone류를 10 uM씩 처리 한 후 세포내 작용기전을 검정하였다.

본 실험 결과, 도 2과 같이 이들 유도체들은 c-Fos/AP-1의 활성화와 STAT1/2의 활성화를 저해하는 복합기전으로 MMP-13의 발현을 억제함을 확인하였다.

실험예 3. glycosaminoglycan 및 collagen degradation product 에 미치는 영향 연구

실시예에서 합성된 유도체들의 glycosaminoglycan 및 collagen degradation product에 미치는 영향을 검정하기 위하여 아래와 같이 실험하였다.

3-1. Rabbit articular cartilage slice 배양 및 활성화

Baek등의 방법에 따라 (Biol. Pharm. Bull. 2006;29:1423-1430), Rabbit articular cartilage slice를 잘라내고 5% FBS가 함유된 complete DMEM 배지에서 1일간 배양하고, 그 후 cartilage를 40 mg씩 잘라 각각을 48-well plate well에 넣고, IL-1을 처리하고 3일간 배양한 상등액에서는 glycosaminoglycan 양을 측정하였고 14일 배양한 상등액에서는 collagen degradation product의 양을 측정하였다.

3-2. glycosaminoglycan 및 collagen degradation product 의 측정

연골 글리코사미노글리칸(Cartilage glycosaminoglycan)의 분해도(degradation)를 측정하기 위해서 상등액에서 bilyscan sulfated glycosaminoglycan assay kit(Biocolor)를 사용하여 정량하였다.

또한 Cartilage의 collagen degradation을 측정하기 위해서 상등액에 들어 있는 type II collagen을 collagen type II cleavage ELISA를 이용하였고 (IBEX), 그 결과는 표 1에 기재된 바와 같다.

Flavonoid들의 glycosaminoglycan과 collagen degradation의 저해

Compounds	Concentration (uM)	% degradation of glycosaminoglycan	% idegradation of collagen
Control	-	18.2 ± 4.3	23.8 ± 5.5
IL-1-treated	-	100.0 ± 4.1	100.0 ± 5.1
Prednisolone	25	28.7 ± 5.2*	50.2 ± 5.8*
apigenin	10	40.5 ± 6.1*	38.4 ± 4.9*
	25	11.4 ± 5.2*	18.0 ± 6.6*
5,7,2',3'-tetrahydroxyflavone (7)	10	32.0 ±5.1*	30.8 ± 12.1*
5,7,2',4'-tetrahydroxyflavone (8)	10	54.3 ± 5.3*	33.9 ± 10.0*
5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone (9)	10	35.1 ±4.2*	37.8 ± 4.6*
*: P < 0.01, significant different from IL-1-treated group by unpaired Student t-test (n = 3).

본 실험 결과, 이들 flavonoid들이 10 - 25 uM의 농도에서 강력한 저해능을 보였고 이것은 MMP-13의 유도저해로 인하여 실제로 ECM의 파괴가 저해됨을 의미한다.

실험예 5. 만성 관절파괴 동물모델에서의 저해능 연구

실시예에서 합성된 유도체들의 만성 관절파괴 동물모델에서의 저해능을 검정하기 위하여 문헌에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 실험하였다.

만성 퇴행성 관절염의 model로써, Guingamp등 (Arthritis Rheum. 1997;40:1670-1679)의 방법에 따라, 요오드 초산(Iodoacetic acid) 30 ul을 SD rat (200-220 g, Orient-Bio사)의 우측다리 무릎에 관절강주사로 투여하였다. 후라보노이드 유도체들은 5일/week씩 매일 1회 100 mg/kg/day로 경구 투여하였다.

요오드 초산 투여 5주 후에 래트를 희생시키고 무릎관절을 절개한 후, 조직학적(histology) 방법에 따라 조직을 고정하고, 사프라닌 O (safranin O)로 염색한 다음, 현미경 관찰하여 결과를 표 2에 나타내었다. 또한 관절의 조직학적 관찰결과 (histological observation)의 예는 도 3에 나타냈다.

Flavonoid들의 관절파괴 저해능

Compounds	Dose (mg/kg/day)	Histology 결과 (관절파괴 정도)
iodoacetate-처리 control군	-	+++
apigenin	100	++
5,7,2',3'-tetrahydroxyflavone (7)	100	+
5,7,2',4'-tetrahydroxyflavone (8)	100	++
5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone (9)	100	++

본 실험 결과, 이와 같이 본 발명의 유도체들은 in vivo에서 관절파괴 증상을 강력하게 억제함을 확인하였다.

실험예 6. 독성검정

실시예에서 합성된 유도체들의 독성을 검정하기 위하여, 활성을 보인 합성 flavonoid들 (7, 8, 9)은 KFDA의 protocol에 따라 행한 급성독성검정실험의 결과, 즉 ICR mice에서 800 mg/kg (p.o.)까지 급성독성을 보이지 않았다.

하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

화합물 7(실시예 1) 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

화합물 8(실시예 1) 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

화합물 7(실시예 1) 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

화합물 9(실시예 1) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

화합물 12(실시예 1) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

화합물 8(실시예 1) 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

화합물 7(실시예 1) 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (8)

1. 5,7,2',3'-테트라히드록시플라본, 5,7,2',4'-테트라히드록시플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스 (Lupus) 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 5,7,2',3'-테트라히드록시플라본, 5,7,2',4'-테트라히드록시플라본 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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