KR101677904B1

KR101677904B1 - 티로시나제 억제제로서 쿠마린 신규 유도체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101677904B1
Application number: KR1020150002513A
Authority: KR
Inventors: 서승염; 아쉬라프 자만; 라피크 무하마드
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-11-22
Also published as: KR20160085943A

Abstract

본 발명은 티로시나제 억제제로서 쿠마린 신규 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 쿠마린 신규 유도체는 항산화 활성을 가지며, 티로시나제 억제 활성이 우수하여 멜라닌의 생성을 저해함으로써, 멜라닌 생성억제용 약학조성물, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

티로시나제 억제제로서 쿠마린 신규 유도체 및 이의 제조방법{Cumarin novel derivative as tyrosinase inhibitor and method for preparing the same}

본 발명은 티로시나제 억제제로서 쿠마린 신규 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 멜라닌 생성 억제 효과가 있는, 티로시나제 억제로서 쿠마린 신규 유도체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 멜라닌 생성억제용 약학조성물, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 사회가 발달하고 생명공학의 발전과 생활수준의 향상, 평균수명 연장으로 인한 고령화 사회에 진입함에 따라 피부노화지연 및 피부세포부활 등의 생리활성 기능과 효과가 함께 갖춰진 복합 기능성 화장품 개발이 대두되고 있는 실정이다. 현재 기능성 화장품의 개발에는 생리활성을 가지는 원료물질의 개발이 선결과제이며, 검토해야 할 기능성으로는 미백, 항염증, 주름개선, 항노화, 항산화효과 등이 있다. 이러한 효과를 보유한 물질을 한약재 등 다양한 천연물에서 찾으려는 연구가 시도되고 있으며, 최근에 피부 흑화의 생물학적 기전이 상세히 규명됨에 따라 피부에 멜라닌(melanin) 색소가 침착되는 것을 예방하고 완화시켜 기미나 주근깨 등의 생성을 억제함으로써 피부의 미백에 도움을 주는 미백제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다.

현재까지 미백제의 개발은 주로 티로시나제(tyrosinase)를 억제하거나 멜라닌 생성량의 감소 등을 통하여 이루어져 왔다. 티로시나제(tyrosinase)는 생물학적 시스템에 존재하는 이핵 구리를 포함하는 효소이다. 상기 효소는 산소가 참여하는 두 가지 형태의 반응, (1) 모노페놀로부터 σ-디페놀로의 오르토히드록실레이션(모노페놀라제 활성) 및 (2) σ-디페놀로부터 이의 상응하는 σ-퀴논으로의 산화(디페놀라제 활성)를 촉매화한다. 대략적으로 티로시나제는 세 개의 영역으로 구성되며, 이 중 중심 영역은 CuA 및 CuB로 불리는, 두 개의 구리(Cu)-결합 사이트를 포함한다. 상기 효소는 동물, 식물, 균 및 박테리아 등에 널리 분포하나, 이의 생물학적 기능에 대해서는 여전히 잘 알려져 있지 않다.

멜라닌(melanine)는 큰 분자량을 갖는 갈색 색소(brown-pigment)로서 높은 반응성으로 인해 퀴닌(quinine)의 중합에 의해 합성되며, 아미노산 및 단백질과 반응하여 갈색 색소를 더욱 증가시킨다. 멜라닌 생합성의 첫 번째 두 단계는 티로시나제에 의해 촉매화되고, 멜라닌의 과잉 축적은 노인성 흑점, 기미, 주근깨, 반점 및 곰보 등의 원인이 되므로, 특히 여성의 관심을 이끌어 왔다. 일반적으로 치료방법은 탈색소침착제 또는 피부미백제를 포함하는 약물 또는 의료용 화장품의 사용을 포함한다. 티로시나제 억제제는 멜라닌 과잉축적과 관련된 피부 질환을 치료하기 위해 사용되며, 탈색소용 화장품에 필수적으로 이용된다. 예로, 검버섯 및 주근깨는 표피 멜라닉 색소의 지나친 축적이 원인이다. 대표적인 미백제로는 코지산(kojic acid)과 알부틴(arbutin)이 존재하며, 이들은 많이 상용되었으나 세포독성, 돌연변이 유발 등의 부작용 등이 최근 보고되었다. 그러므로 이와 같은 부작용을 유발하지 않으며 안정성을 갖춘 피부미백제의 개발이 필요한 실정이다

쿠마린(coumarin)은 움벨리페래 및 루타세애 과에 특히 풍부하다. 천연의 일부 쿠마린은 인간에 대한 치료제로서 이용되어 왔고, 이들의 항세균, 항균, 및 항암 작용은 추가적인 유도체에 대한 관심을 이끌어 왔다. 7-히드록시쿠마린으로 알려진 움벨리페론(umbelliferone)은 산형과(apiaceae), 국화과(asteraceae) 및 쥐꼬리망초과(acanthaceae) 식물 등에 널리 분포된 천연물이다. 또한, 쿠마린 유도체는 다양한 구조적 형태 및 항염증, 항산화, 혈관완화, 세포상해, 항-HIV 및 항균과 같은 다재다능의 생물학적 특성으로 인해 많은 관심을 이끌어왔고, 따라서, 쿠마린 유도체의 생물학적 반응에 대해 널리 연구되어 왔다. 그러나, 티로시나제 억제 활성에 대해서는 아직까지 거의 알려진 바가 없다.

KR 공개번호: 10-2012-0040596

본 발명자들은 티로시나제 억제제에 대해 탐색하던 중, 히드록실(또는 할로겐) 페닐기를 포함하는 쿠마린 유도체가 항산화 활성을 가지며, 티로시나제 억제 활성이 우수하여 멜라닌의 생성을 저해하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 티로시나제 억제제로서 쿠마린 신규 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 약학조성물, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은,

하기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

n은 0 또는 1이고,

R1 내지 R5는 각각 독립적으로 같거나 다르며, 수소(H), 히드록시(OH), C₁~C₂₀의 알콕시, 카복시(CO₂H), F, Br, Cl 또는 I이다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 따른 하기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

상기 화학식 K 또는 I에서,

n은 0 또는 1이고,

또한. 본 발명은 상기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 화장품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은,

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

n은 0 또는 1이고,

바람직하게, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 4a, 화학식 4b, 화학식 4c, 화학식 4d, 화학식 4e, 화학식 4f, 화학식 4g, 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물일 수 있다.

[화학식 4a]

[화학식 4b]

[화학식 4c]

[화학식 4d]

[화학식 4e]

[화학식 4f]

[화학식 4g]

[화학식 6a]

[화학식 6b]

즉, 상기 화학식 I로 표시되는 쿠마린 신규 유도체 화합물은 7-히드록시 쿠마린(움벨리페론)에 히드록시(또는 할로겐 등) 치환된 페닐기를 친핵성 치환 반응시켜 결합시킨 구조를 갖는다.

본 발명의 발명자들은 상기 화학식 I의 화합물의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하기 위해, 미백제로 사용되는 코지산과 티로시나제 억제 활성을 비교해보았다. 티로시나제 억제 활성을 측정한 결과, 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 8.96 ~ 362 μM 범위의 IC₅₀ 값을 나타내어 강력한 티로시나제 억제 활성을 나타내었고, 특히 상기 화학식 4e의 화합물은 8.96의 IC₅₀ 값을 나타내어 코지산의 16.69의 IC₅₀ 값보다 더 강력한 티로시나제 억제 활성을 나타내었다. 이 결과로부터 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체가 미백활성을 갖는 다는 것을 확인하였다.

[반응식 1]

상기 화학식 K 또는 I에서,

n은 0 또는 1이고,

상기 (1)단계는, 중간체인 화학식 2의 화합물(움벨리페론 클로로아세틸 유도체)을 제조하는 단계로, 상기 (1) 단계의 반응 화합물에 트리에틸아민을 추가로 가한 후, -10 ~ 10℃에서 교반되어 수행될 수 있다. 보다 구체적으로는 화학식 1의 움벨리페론 화합물을 트리에틸아민 및 클로로아세틸 클로라이드와 혼합한 후, 디클로로메탄 용매에서 5 ~ 7시간 동안 -5 ~ 0℃에서 교반하여 화학식 2의 생성물을 얻을 수 있다.

상기 (2)단계는, 표제 화합물인 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물을 제조하는 단계로, 상기 화학식 2의 화합물을 트라에틸아민 및 화학식 K의 화합물과 혼합한 후, 디메틸포름아미드 용매에서 20 ~ 30시간 동안 교반하여 화학식 I의 화합물을 얻을 수 있다.

상기 (1)단계 또는 (2)단계에서, 사용된 용매는 증류수, 디클로로메탄, 테트라클로로에탄, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 메탄올, 헥산, 아세토니트릴, 톨루엔, 벤젠, 사염화탄소, 펜탄, 아세톤, 디메틸 설폭시드, 테트라하이드로퓨란, 디메틸포름알데히드 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 질병은 기미, 주근깨, 노인성 흑점, 반점, 곰보, 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation), 피부염, 피부암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 식품조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 액상, 분말, 또는 과립형태일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 의약용, 식품용, 화장용 등으로 사용가능하며 용도에 맞도록 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 비경구 또는 경구 투여가 가능하며, 투여 방법에 따라 적절한 제형으로 제조된다. 본 발명에 따른 조성물은 제형에 따라 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 멜라닌 생성 저해활성이 있으며, 항산화 활성을 가지고 있으므로, 화장료 조성물에 포함되어 사용이 가능하다. 특히 미백용 화장료 조성물로서 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 총 중량에 대하여 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물을 0.001 내지 90중량%, 바람직하게는 0.01 내지 70중량%를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 화장료는 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물 외에 비타민, 펩티드, 다당, 지질 등을 더 포함할 수 있으며, 그 외 통상 화장료에 배합되는 유지성분, 보습제, 계면활성제, 안료, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 향료, 정제수 등을 포함할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 오일, 왁스, 파우더, 스프레이, 비누, 클렌징, 팩, 파운데이션, 메이컵베이스 및 모발화장료로 구성된 군으로부터 선택된 제형일 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 티로시나제 과다 활성, 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 치료용 의약 조성물, 멜라닌 생성 저해용 의약 조성물 또는 항산화용 의약 조성물에 포함될 수 있다.

멜라닌 과다 생성으로 인한 질병으로는 기미, 주근깨, 노인성 흑점, 반점, 곰보, 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation), 피부염, 피부암, 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포사멸 등을 들 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 이를 위하여 전신투여(예를 들어 경구 투여) 및 국소투여(예를 들어 피부도포) 방법을 각각 또는 동시에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 조성물 전량 중, 0.0005 내지 30중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10중량% 포함될 수 있으나, 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량은 연령, 개인차, 증상 등 에 따라 적절히 결정되지만, 사람에게 투여하는 경우의 투여량은 통상 0.01 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg이며, 이 양을 1일 1회 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제 등의 형태로 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구로 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제가 함께 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 환제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리, 주사제 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 콜로이드 성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료제가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 티로시나제 활성 저해, 멜라닌 생성 저해, 항산화를 위한 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 멜라닌 과다 생성으로 인한 질병의 예방 및 개선용 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물을 포함하는 식품 조성물 또는 식품첨가물 조성물은 단독으로 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 상기 화학식 I의 쿠마린 유도체 화합물은 식품 또는 음료제조 시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 30중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 첨가되는 양은 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디 류, 스낵 류, 과자 류, 피자, 라면, 기타 면 류, 껌 류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명에 따른 쿠마린 신규 유도체는 항산화 활성을 가지며, 티로시나제 억제 활성이 우수하여 멜라닌의 생성을 저해함으로써, 멜라닌 생성억제용 약학조성물, 멜라닌의 과다 생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 멜라닌 생성억제용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 기존의 임상적으로 사용된 티로시나제 억제제인 코지산, 알부틴, 옥시레스베라트, p-쿠마린 산 및 캠페롤의 이미지를 나타내는 도이다.
도 2는 25℃ 및 L-DOPA의 촉매작용에서 (a) 화학식 4e의 화합물 및 (b) 코지산의 버섯 티로시나제에 대한 디페놀라제 활성을 나타내는 도이다.
도 3은 (a) 화학식 4c 및 (b) 화학식 4e의 화합물의 티로시나제 억제와 관련된 작용기들의 3차원 이미지를 나타내는 도이다.
도 4는 화학식 4e의 화합물의 버섯 티로시나제 억제에 대한 (a) Lineweaver-Burk 플럿 및 (b) 억제 상수 (Ki)에 대한 플럿을 나타내는 도이다.
도 5는 티로시나제의 활성 부위와 화학식 4a의 화합물의 리간드-단백질 상호 작용을 나타내는 도이다. 여기서 (a) 및 (b)는 결합 포켓(binding pocket)에서의 화합물의 3차원적 도킹 이미지를나타내고, (c)는 2차원적 상호작용 패턴을 나타낸다.
도 6은 티로시나제의 활성 부위와 화학식 4c의 화합물의 리간드-단백질 상호 작용을 나타내는 도이다. 여기서 (a) 및 (b)는 결합 포켓(binding pocket)에서의 화합물의 3차원적 도킹 이미지를나타내고, (c)는 2차원적 상호작용 패턴을 나타낸다.
도 7은 티로시나제의 활성 부위와 화학식 4e의 화합물의 리간드-단백질 상호 작용을 나타내는 도이다. 여기서 (a) 및 (b)는 결합 포켓(binding pocket)에서의 화합물의 3차원적 도킹 이미지를나타내고, (c)는 2차원적 상호작용 패턴을 나타낸다.
도 8은 티로시나제의 활성 부위와 화학식 6a의 화합물의 리간드-단백질 상호 작용을 나타내는 도이다. 여기서 (a) 및 (b)는 결합 포켓(binding pocket)에서의 화합물의 3차원적 도킹 이미지를나타내고, (c)는 2차원적 상호작용 패턴을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예들에서 사용되는 시약 및 용매는 시그마 케미칼 사에서 구입하여 사용하였다. 융점은 디지멜트 MPA 160을 이용하여 결정하였다. 또한, 적외선(IR) 스펙트럼은 Shimadzu FT IR-8400S 분광광도계를 이용하여 측정하였고, ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 400MHz에서 작동되는 Bruker 분광기를 이용하여 측정하였다. 화학적 이동 값(δ)은 테트라메틸실란(TMS)으로부터 ppm 다운필드(downfield)를 측정하여 기록하였다. 화합물의 순도는 n-헥산 및 에틸아세테이트를 이동상으로하여 실리카 겔 박층크로마토그래피(TLC)로 결정하였다.

또한, 기존의 임상적으로 사용된 티로시나제 억제제인 코지산, 알부틴, 옥시레스베라트, p-쿠마린 산 및 캠페롤의 이미지를 도 1에 나타내었다.

이하 실시예들의 제조는 하기 반응식 1a 및 1b에 따른다.

[반응식 1a]

여기서,

R은 a(3-OH), b(4-OH), c(3,4-di-OH), d(3,5-di-OH), e(2,4-di-OH), f(2,6-di-OH), 또는 g(3,4,5-tri-OH)이다.

실시예 1. 움벨리페론 클로로아세틸 유도체 (화학식 2)의 제조

무수 디클로로메탄(25mL)에 용해된 7-히드록시 쿠마린(화학식 1의 화합물, 0.01mol) 및 트리에틸아민(0.01mol)의 혼합물을 얼음 소금(ice salt) 혼합물에서 0 내지 -5℃로 냉각하였다. 상기 반응혼합물에 건조 디클로로메탄에 있는 클로로아세틸 클로라이드(0.01mol)를 방울방울 가하면서 상기 온도를 유지하며, 1시간 동안 일정하게 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 추가적으로 교반한 후, 5% HCl, 5% 수산화나트륨으로 세척하고, 마지막으로 브라인(brine) 용액으로 세척하였다. 이어서, 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후 여과하고, 용매를 감압하에 제거함으로써 화학식 2의 움벨리페론 클로로아세틸 유도체를 얻었다.(백색 고체, 반응시간:6시간, 수율:85%, 융점:162~164℃, R_f 0.64(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 2 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1: 3079 (sp2 C-H), 2973(sp3 C-H), 1766(C=O ester), 1728(C=O, lactone), 1615 (C=C aromatic);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.73 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-4), 7.54 (d, J=4.4 Hz, 1H, H-5), 7.19 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-8), 7.13 (dd, J=2.4, 6.0 Hz, 1H, H-6), 6.26(d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 4.36 (s, 2H, -CH₂);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 165.2 (C=O ester), 160.0 (C-2), 154.7 (C-7), 152.5 (C-10), 142.6 (C-4), 128.7 (C-5), 117.8 (C-9),117.1 (C-6), 116.5 (C-8), 110.1 (C-3), 40.6 (CH₂).

실시예 2. 표제 화합물 (화학식 4)의 제조

2-1. 화학식 4a 화합물의 제조 (R= a)

디메틸포름아미드(25mL)에 용해된 움벨리페론 클로로아세틸 유도체(화학식 2의 화합물, 0.01mol), 히드록시 치환된 벤조산(화학식 3a의 화합물, 0.01mol), 트리에틸아민(0.01mol) 및 요오드화칼륨(0.01mol)의 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응혼합물을 교반하면서 미쇄하게 분쇄된 얼음속에 부은 후, 에틸아세테이트(4 x 25mL)로 추출하였다. 이어서, 결합된 유기층을 5% HCl, 5% 수산화나트륨으로 세척하고, 마지막으로 브라인 용액으로 세척하였다. 상기 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후 여과하고, 용매를 감압하에 제거함으로써 화학식 4a의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:73%, 융점:184~186℃, Rf 0.42(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4a 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3126 (O-H), 3014 (sp2 C-H), 2873 (sp3 C-H), 1705 (C=O ester), 1680 (C=O lactone), 1589 (C=C aromatic), 1148 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.81 (dd, J=2.0, 2.1 Hz, 1H, H-2'), 7.80 (m, 2H, H-4', H-6'), 7.66 (t, J=4.0 Hz, 1H, H-5'), 7.58 (d, J=1.2 Hz, 1H, H-8), 7.55(d, J=2.8 Hz, 1H, H-4), 7.53 (d, J=4.8 Hz, 1H, H-5), 6.81 (dd, J=2.4, 2.0 Hz, 1H, H-6), 6.21 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-3), 5.28 (s, 2H, -CH₂), 2.50 (s, 1H, 3'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 177.7 (C-1''), 161.7 (C=O ester), 160.8 (C-2), 155.9 (C-3'), 153.1 (C-7), 144.9 (C-10), 143.8 (C-4), 139.3 (C-1'), 132.2 (C-5'), 130.1 (C-5), 119.3 (C-6'), 116.5 (C-4'), 113.6 (C-6), 111.8 (C-2'), 111.7 (C-8), 107.5 (C-6'), 102.6 (C-3), 40.2 (CH₂).

2-2. 화학식 4b 화합물의 제조 (R= b)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3b의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4b의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:78%, 융점:177~179℃, Rf 0.44(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4b 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3093(O-H), 2962 (sp2 C-H), 2852 (sp3 C-H), 1772 (C=O ester), 1710 (C=O lactone), 1602 (C=C aromatic), 1159 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.92 (dd, J=9.2, 1.6 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.52 (d,J=8.4, 1H, H-4), 6.92 (dd, J=5.6, 1.2 Hz, 2H, H-3', H-5'), 6.81 (dd, J=6.4, 2.0 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J=2.0 Hz, 1H, H-8), 6.51 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-5), 6.21 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 5.18 (s, 2H, -CH₂), 2.51 (s, 1H, 4'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 173.4 (C-1''), 162.4 (C=O ester), 160.8 (C-2), 155.9 (C-4'), 149.1 (C-7), 144.9 (C-10), 143.4 (C-4), 135.3 (C-1'), 132.3 (C-3', C-5'), 130.1 (C-5), 114.4 (C-6), 113.4 (C-8), 111.8 (C-2', C-6'), 110.5 (C-9), 102.5 (C-3), 40.5 (CH₂).

2-3. 화학식 4c 화합물의 제조 (R= c)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3c의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4c의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:71%, 융점:226~228℃, Rf 0.39(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4c 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3126(O-H), 2868 (sp2 C-H), 2827(sp3 C-H), 1712(C=O ester), 1681(C=O lactone), 1567 (C=C aromatic), 1128(C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.86 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-6'), 7.80 (d, J=8.6 Hz, 1H,H-2'), 7.48 (d, J=8.6 Hz, 1H, H-4), 7.39 (d, J=7.2 Hz, 1H, H-5), 6.88 (d, J=6.2 Hz, 1H, H-5'), 6.82 (dd, J=6.4, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-8), 6.21 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 4.90 (s, 2H, -CH₂), 3.01 (s, 2H, 2' 4'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 173.6 (C-1''), 162.4 (C=O ester), 161.5 (C-2), 156.2 (C-4'), 150.2 (C-3'), 148.1 (C-7), 144.6 (C-10), 136.8 (C-4), 136.3 (C-1'), 133.2 (C-5'), 129.2 (C-5), 124.3 (C-6'), 113.1 (C-4'), 111.6 (C-6), 110.9 (C-2'), 108.7 (C-8), 105.5 (C-6'), 102.0 (C-3), 49.2 (CH₂).

2-4. 화학식 4d 화합물의 제조 ((R= d)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3d의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4d의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:78%, 융점:221~223℃, Rf 0.40(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4d 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3170(O-H), 3010 (sp2 C-H), 2962 (sp3 C-H), 1775 (C=O ester), 1679 (C=O lactone), 1567 (C=C aromatic), 1130 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.84 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-4), 7.68(d, J=8.4 Hz, 1H, H-5), 7.38 (dd, J=1.6, 2.0 Hz, 2H, H-2', 6'), 7.03 (dd, J=1.2, 1.6 Hz, 1H, H-4'), 6.84 (dd, J=8.0, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J=2.0 Hz, 1H, H-8), 6.21 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 4.88 (s, 2H, -CH₂), 3.32 (s, 2H, 3', 5'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 166.3 (C-1''), 162.2 (C=O ester), 161.7 (C-2), 158.5 (C-3', C-5'), 155.8 (C-7), 144.6 (C-10), 143.5 (C-4), 129.2 (C-1'), 115.3 (C-2', C-6'), 113.1 (C-5), 111.7 (C-4), 110.9 (C-6), 109.7 (C-8), 102.0 (C-3), 59.2 (CH₂).

2-5. 화학식 4e 화합물의 제조 (R= e)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3e의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4e의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:64%, 융점:204~206℃, Rf 0.45(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4e 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3125 (O-H), 2924 (sp2 C-H), 2852 (sp3 C-H), 1709 (C=O ester), 1677 (C=O lactone), 1603 (C=C aromatic), 1128 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 8.09 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-6'), 7.94(d, J=9.6 Hz, 1H, H-4), 7.53 (d, J=8.4 Hz, 1H, H-5), 7.22 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-3', 6.80 (dd, J=6.4, 2.4 Hz, 1H, H-5', 6.73 (d, J=2.0 Hz, 1H, H-8), 6.50 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.33 (d, J=2.0 Hz, 1H, H-8), 6.21 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3),4.60 (s, 2H, -CH₂), 3.34 (s, 2H, 2', 4'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 176.5 (C-1''), 161.7 (C=O ester), 160.8 (C-2), 155.9 (C-2', C-4'), 144.9 (C-7), 143.8 (C-10), 142.3 (C-4), 132.6 (C-1'), 130.9 (C-5), 113.6 (C-6'), 111.8 (C-3', C-5'), 111.7 (C-6), 107.7 (C-8), 102.6 (C-3), 58.2 (CH₂).

2-6. 화학식 4f 화합물의 제조 (R= f)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3f의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4f의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:74%, 융점:190~192℃, Rf 0.46(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4f 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3103 (O-H), 2912 (sp2 C-H), 2853(sp3 C-H), 1678 (C=O ester), 1601 (C=O lactone), 1566 (C=C aromatic), 1122 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.92 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-4), 7.54(d, J=8.4 Hz, 1H, H-5), 7.18 (m, 3H, H-3', 4', 5'), 6.85 (dd, J=9.6, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-8), 6.20 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-3), 5.20 (s, 2H, -CH₂), 4.09 (s, 2H, 2', 6'-OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 180.8 (C-1''), 166.4 (C=O ester), 161.3 (C-2), 155.6 (C-2', C-6'), 150.1 (C-7), 144.9 (C-10), 142.8 (C-4), 136.1 (C-4'), 132.4 (C-1'), 130.1 (C-3', C-5'), 119.5 (C-5), 111.9 (C-6), 111.8 (C-8), 102.5 (C-3), 48.5 (CH₂).

2-7. 화학식 4g 화합물의 제조 (R= g)

상기 실시예 2-1에서 화학식 3a의 화합물 대신 화학식 3g의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 4g의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:52%, 융점:230~232℃, Rf 0.42(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 4g 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3124 (O-H), 2914 (sp2 C-H), 2829 (sp3 C-H), 1705(C=O ester), 1678 (C=O lactone), 1566 (C=C aromatic), 1129 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.87 (d, J=0.4 Hz, 1H, H-2', H-6'), 7.85(d, J=0.4 Hz, 1H, H-8), 7.48 (d, J=8.8 Hz, 1H, H-4), 6.82 (dd, J=6.0, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-5), 6.21 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 4.90 (s, 2H, -CH₂), 3.90 (s, 1H, -OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 178.7 (C-1''), 162.3 (C=O ester), 161.7 (C-2), 155.6 (C-3', 4', 5'), 144.6 (C-7), 141.7 (C-10), 138.3 (C-4), 131.6 (C-1'), 129.2 (C-2', C-6'), 113.1 (C-5), 111.7 (C-6), 110.9 (C-8), 102.0 (C-3), 48.2 (CH₂).

[반응식 1b]

여기서,

R은 a(OH) 또는 b(Cl)이다.

실시예 3. 표제 화합물 (화학식 6)의 제조

3-1. 화학식 6a 화합물의 제조 (R= a)

디메틸포름아미드(25mL)에 용해된 움벨리페론 클로로아세틸 유도체(화학식 2의 화합물, 0.01mol), 히드록시 치환된 벤조산(화학식 5a의 화합물, 0.01mol), 트리에틸아민(0.01mol) 및 요오드화칼륨(0.01mol)의 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응혼합물을 교반하면서 미쇄하게 분쇄된 얼음속에 부은 후, 에틸아세테이트(4 x 25mL)로 추출하였다. 이어서, 결합된 유기층을 5% HCl, 5% 수산화나트륨으로 세척하고, 마지막으로 브라인 용액으로 세척하였다. 상기 유기층을 무수 MgSO₄로 건조시킨 후 여과하고, 용매를 감압하에 제거함으로써 화학식 6a의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:76%, 융점:201~203℃, Rf 0.45(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 6a 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3166(O-H), 2931 (sp2 C-H), 2843 (sp3 C-H), 1678 (C=O ester), 1624 (C=O lactone), 1601 (C=C aliphatic)1567 (C=C aromatic), 1128 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 8.08 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-4), 7.93 (d, J=9.2 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.68 (d, J=3.2 Hz, 1H, H-5), 7.53 (d, J=8.4 Hz, 2H, H-3', H-5'), 6.83 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-8), 6.78 (dd, J=6.0, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.49 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1'), 6.31 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2'), 6.20 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-3), 5.07 (s, 2H, -CH₂), 2.52 (s, 1H, -OH);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 162.3 (C-ester), 161.7 (C-3'', C=O), 160.8 (C-2), 155.9 (C-4'), 146.3 (C-7), 144.9 (C-10), 132.1 (C-1'), 131.3 (C-4), 130.1 (C-2', C-6'), 116.3 (C-5), 115.8 (C-2''), 113.6 (C-3', C-5'), 111.8 (C-6), 111.7 (C-8), 102.6 (C-3), 36.2 (CH₂).

3-2. 화학식 6b 화합물의 제조 (R= b)

상기 실시예 3-1에서 화학식 5a의 화합물 대신 화학식 5b의 화합물을 사용한 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 수행하여 화학식 6b의 생성물을 얻었다.(고체, 반응시간:24시간, 수율:84%, 융점:154~156℃, Rf 0.47(n-헥산:에틸아세테이트 2:1)).

상기 화학식 6b 화합물의 FT-IR, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 측정 결과를 하기에 나타내었다.

FT-IR υ_max cm^-1:3083 (sp2 C-H), 2867(sp3 C-H), 1716 (C=O ester), 1692 (C=O lactone), 1615 (C=C aliphatic), 1568 (C=C aromatic), 1123 (C-O, ester);

¹H NMR (CDCl₃, δ ppm): 7.77 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-1'), 7.70 (d, J=9.2 Hz, 1H, H-4), 7.54 (d, J=6.0 Hz, 1H, H-5), 7.51 (dd, J=4.0, 2.4 Hz, 2H, H-2', H-6'), 7.39 (dd, J=4.8, 1.6Hz, 2H, H-3', H-5'), 7.21 (d, J=2.0 Hz, 1H, H-8), 7.14 (dd, J=6.0, 2.4 Hz, 1H, H-6), 6.53 (d, J=16.0 Hz, 1H, H-2'), 6.43 (d, J=9.6 Hz, 1H, H-3), 5.03 (s, 2H, -CH₂);

¹³C NMR (CDCl₃, δ ppm): 165.8 (C=O ester), 160.1 (C-3'', C=O), 154.7 (C-2), 152.4 (C-4'), 145.3 (C-7), 142.6 (C-10), 136.8 (C-1'), 132.5 (C-3'), C-5'), 129.4(C-2', C-6'), 129.3 (C-4), 128.6 (C-5), 118.0 (C-2''), 117.0 (C-6), 116.4 (C-8), 110.2 (C-3), 60.7 (CH₂).

실험예 1. 자유 라디칼 소거 활성 분석

라디칼 소거 활성(radical scavenging activity)을 수정된 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 분석법을 이용하여 결정하였다 (참조: Bioorga. Med. Chem. 2011, 19, 384; Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 2784). 분석 용액을 100μL의 DPPH(150 μM) 및 20μL의 농도 증가 시험 화합물로 구성하였고, 총 부피를 DMSO를 갖는 각각의 웰에서 200μL로 조정하였다. 그 후, 반응혼합물을 실온에서 30분 동안 배양하였다. 아스코빅산(ascorbic acid, 비타민 C)을 기준 억제제로 사용하였고, 측정은 517nm에서 마이크로플레이트리더(OPTI max, tunable)를 이용하여 수행하였다. 반응속도을 비교하였고, 시험 억제제의 존재에 따른 퍼센트(%) 억제율를 계산하였다. 각각의 농도를 3개의 별도의 실험으로 분석하였고, IC₅₀ 값을 연속 희석(serial dilution)후에 데이타 분석으로 결정하였고, 오리진 소프트웨어를 이용하여 그래프하였다.

실시예 1 내지 3에 따른 움벨리페론 유도체(화학식 4a~4g의 화합물, 및 화학식 6a~6b의 화합물) 및 아스코빅산의 농도에 따른 자유라디칼 소거 활성을 표 1에 나타내었다.

Entry	화합물	DPPH free radical Scavenging activity (IC ₅₀ ± SEM in μM)
1	2	>1000
2	4a	>1000
3	4b	>1000
4	4c	538.93 ± 17.9
5	4d	>1000
6	4e	>1000
7	4f	87.39 ± 6.4
8	4g	>1000
9	6a	>1000
10	6b	>1000
11	Ascorbic acid	14.82 ± 1.6

표 1에 나타난 바와 같이, 각각 화학식 4a~4g의 화합물, 및 화학식 6a~6b의 화합물은 자유라디칼 DPPH와 상호작용하여 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 상기 화합물들은 20μM의 낮은 농도에서는 라디칼 소거 퍼텐셜을 나타내지 않았으나, 농도가 100μM까지 증가함에 따라 화학식 4f의 화합물이 항산화 활성을 나타내었다. 그러나, 상기 모든 화합물들은 아스코빅산과 비교할 때, 더 작은 상호작용을 나타내었다.

실험예 2. 버섯 티로시나제 억제 활성 분석( mushroom tyrosinase inhibition assay )

문헌에 기재된 방법을 수정하여 버섯 티로시나제를 이용하여 생체외 바이오분석을 수행하였다 (참조: J. Med. Chem. 2010, 45, 2010; Res. Pharm. Sci. 2013, 8, 233].

먼저, 140μL의 인산염 퍼버(20mM, pH 6.8), 20μL의 버섯 티로시나제 및 20μL의 억제제 용액을 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 위치시켰다. 그 후, 실온에서 10분 동안 예비-배양을 한 후, 20μL의 L-DOPA(3,4-디히드록실페닐알라닌, 0.85mM)를 가하고, 추가적으로 20분 동안 25℃에서 배양하였다. 이어서, 마이크로플레이트리더를 이용하여 도파크롬(dopachrome)의 흡광도를 492nm에서 측정하였다. 기준 억제제로서 코지산(kojic acid)을 이용하였고, 인삼염 버퍼를 네가티브 조절용으로 사용하였다. 각각의 농도는 3개의 별도의 실험으로 분석하였고, IC₅₀ 값을 데이타 분석으로 결정하고, 오리진 소프트웨어를 이용하여 그래프하였다. 티로시나에제 억제 퍼센트(%)를 하기의 식 (1)로 계산하였다.

식 (1): 억제( inhibition )(%) = [(B-S)/B] X 100, 여기서, B 및 S는 블랭크 및 시료에 대한 흡광도이다.

코지산은 경쟁적인 티로시나제 억제제로서, 버섯 티로시나제의 디페놀라제 활성에 대한 혼합된 억제 효과를 나타낸다고 알려져 있다. 따라서, 코지산은 비교 목적을 위한 티로시나제의 기준 억제제로서 적합한 물질이다.

실시예 1 내지 3에 따른 움벨리페론 유도체(화학식 4a~4g의 화합물, 및 화학식 6a~6b의 화합물) 및 코지산의 농도에 따른 티로시나제 억제 활성(IC₅₀)을 표 2에 나타내었다.

Entry	화합물	Log P ^a	IC ₅₀ μM
1	2	0.96 ± 0.30	362.18 ± 12.1
2	4a	2.54 ± 0.37	173.23 ± 8.5
3	4b	2.51 ± 0.37	179.11 ± 9.2
4	4c	2.34 ± 0.38	118.48 ± 8.5
5	4d	2.25 ± 0.38	233.33 ± 17.3
6	4e	2.57 ± 0.40	8.96 ± 4.3
7	4f	2.94 ± 0.41	198.87 ± 5.7
8	4g	2.91 ± 0.41	258.06 ± 5.1
9	6a	2.29 ± 0.39	123.77 ± 11
10	6b	3.35 ± 0.39	80.20 ± 10.1
11	Kojic acid	-	16.69 ± 2.8
12	Umbelliferone ^b	-	420

a: Log P 값은 chemSketch ACD labs 2012로부터 계산되었다.

b: 참조: QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 317.

표 2에 나타난 바와 같이, 코지산은 화학식 4e의 화합물을 제외하고는 다른 움벨리페론 유도체 화합물에 비해 더 높은 활성을 나타내었다. 또한, 화학식 4e, 4c 및 6b의 화합물은 각각 8.96 ~ 118.48 μM 범위의 IC₅₀ 값을 나타내어 다른 화합물에 비해 더 강력한 버섯 티로시나제 억제 활성을 나타내었다. 상기 화학식 4e 및 4c 화합물은 2,4-디히드록실 및 3,4-디히드록실 페닐기를 포함한다. 그러나, 그 외의 움벨리페론 유도체 화합물들은 기준 억제제인 코지산에 비해 더 낮은 억제 활성을 나타내었다. 그러나, 기존에 보고된 움벨리페론 화합물들의 티로시나제 억제 활성과 비교해 볼 때, 실시예 1 내지 3에 따른 움벨리페론 유도체(화학식 4a~4g의 화합물, 및 화학식 6a~6b의 화합물)는 더 높은 억제 활성 값을 나타내었다 (참조: QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 317.). 또한, 화학식 4e의 화합물은 기준 억제제인 코지산보다도 더 우수한 버섯 티로시나제 억제 활성을 나타내었다.

25℃ 및 L-DOPA의 촉매작용에서 (a) 화학식 4e의 화합물 및 (b) 코지산의 버섯 티로시나제에 대한 디페놀라제 활성을 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 화학식 4e의 화합물은 코지산보다 더 적은 양을 사용했음에도 코지산과 동일한 티로시나제 억제 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.또한, 본 발명의 움벨리페론 유도체의 구조적인 특징을 살펴보면, 화학식 4a~4g의 화합물은 히드록실 치화된 벤조산을 포함하나, 화학식 6a~6b의 화합물은 히드록실 또는 클로로 치환된 신남산의 스캐폴드를 포함한다. 따라서, 모노히드록시, 디히드록시 및 클로로 기의 서로 다른 치환기를 갖는 스캐폴드들의 활성을 비교해 보면, 디히드록시페닐 고리를 포함하는 쿠마린 유도체가 모도히드록시페닐 고리를 갖는 쿠마린 유도체에 비해 더 강력한 억제 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

또한, 2,4- 및 3,4-디히드록시 치환된 페닐기를 갖는 쿠마린 유도체는 3,5-디히드록시 페닐 고리를 갖는 쿠마린 유도체에 비해 더 강한 활성을 갖는 것을 알 수 있고, 이 결과로부터 페닐 고리에 2 또는 3 히드록시와 함께 4-히드록시의 존재는 버섯 티로시나제와 더욱 강한 상호작용을 형성하는 것을 알 수 있다.

또한 버섯 티로시나제의 억제 활성에 대한 할로겐 치환기의 역할을 조사하였다. 4-클로로 치환된 신남산 스캐폴드를 포함하는 화학식 6b의 화합물은 디히드록시 치환된 페닐 고리를 갖는 화합물들보다는 더 낮는 억제 활성을 나타냈으나, 4-히드록시 치환된 신남산 스캐폴드를 포함하는 화학식 6a의 화합물보다는 더 높은 억제 활성을 나타내었다. 상기 결과로부터, 티로시나제 및 할로겐의 상호작용에 대한 추가적인 조사가 필요할 것으로 생각된다.

또한, (a) 화학식 4c 및 (b) 화학식 4e의 화합물의 티로시나제 억제와 관련된 작용기들의 3차원 이미지를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 결과들로부터 화학식 4c 및 화학식 4e의 화합물이 신규한 티로시나제 억제제의 설계 및 개발에 대해 구조적 템플릿이 될 수 있을 것으로 생각된다.

실험예 3. 티로시나제 억제의 운동역학적 분석

화학식 4e의 화합물의 버섯 티로시나제 억제의 운동역학적 분석을 위해, 하기의 일련의 실험을 수행하였다. 먼저, 화학식 4e의 화합물의 각각 다른 5개의 농도(0.0mM, 0.007mM, 0.014mM, 0.028mM 및 0.056mM)에 대해, L-DOPA 농도(0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 mM)를 변화시켰다. 예비-배양 및 측정 시간은 상기 버섯 티로시나제 억제 분석에서 수행된 것과 동일하게 실시하였다. 초기 속도는 15초 간격으로 버섯 티로시나제를 가한 후, 5분에서 흡광도의 초기 선형 부분으로부터 결정하였다. 효소에 대한 억제 유형은 기질 농도의 역수(1/[S] mM^-1) 대한 속도의 역수(1/V)의 Lineweaver-Burk 플럿에 의해 분석하였고, 억제 상수 Ki는 K _m/V _max 또는 1/V _max 대한 화학식 4e 화합물의 농도에 대한 플럿으로부터 결정하였다.

화학식 4e의 화합물의 버섯 티로시나제 억제에 대한 (a) Lineweaver-Burk 플럿 및 (b) 억제 상수 (Ki)에 대하 플럿을 도 4에 나타내었고, 화학식 4e 화합물의 농도에 따른 1/V _max, K _m 및 Ki을 표 3에 나타내었다.

농도 [mM]	1/ V _max	K _m	K _i
0.000	59293.01	0.027	0.0215
0.007	118586	0.027	0.0215
0.014	177879	0.027	0.0215
0.028	237172	0.027	0.0215
0.056	296465	0.027	0.0215

여기서, 1/V _max은 반응속도의 역수, K _m은 Michaelis Menten 상수 및 Ki는 억제 상수이다.

도 4(a) 및 표 3에 나타난 바와 같이, 화학식 4e의 화합물은 버섯 티로시나제에 대해 비-경쟁적 억제제인 것을 알 수 있다. 또한, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 1/V _max 값이 새로운 값으로 증가하는 동안, K _m 값은 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 화학식 4e의 화합물이 단순히 효소의 비-경쟁적 결합 형태에 의해 작용기적 효소의 농도를 낮추는 것을 나타낸다. 대부분의 경쟁적 억제제가 중앙의 구리를 갖는 버섯 티로시나제의 활성 결합 부위에 결합하는데 반해, 화학식 4e 화합물의 비-경쟁적 행동은 2,4-디히드록시 치환된 페닐 구리의 존재 때문으로 확인된다.

실험예 4. 분자 모델링

인간 티로시나제의 실험 X-선 구조는 아직까지 결정되지 않았다. 따라서, 이러한 문제를 극복하기 위해, 구조적 생물정보학(RCSB) 단백질 데이타 뱅크에 대한 연구 협력자로부터 구한, 버섯 티로시나제(PDB 접근 코드 2ZWE)의 결정구조로부터 상동성 모델(homology model)을 만들었다. 첨부된 리간드 및 물 분자는 AutoDock Tools 1.5.6을 이용한 모델로부터 제거하였다. 전하를 안정화시키고, 극성 수소 분자를 단백질 구조에 가하였다. 리간드 분자 또한 동일한 프로그램을 이용하여 도킹(docking)에 의해 제조하였고, 도킹 연구를 위해 화학식 4a, 4c, 4e 및 6a의 쿠마린 유도체 화합물을 선택하였다. 티로시나제의 결합 포켓(binding pocket)을 이구리 이온을 둘러싼 잔기로 나타내었다. 리간드 당 포즈(pose)의 최대 수 및 분자 당 추가적인 시작 형태의 값은 결합 모드의 정확도를 증가시키기 위해 40으로 확장하였다. 다른 매개변수는 소프트웨어의 기본설정을 기반으로 하였다. 그 후, AutoDockVina 1.1.2에 적절한 검색 공간 정보를 제공함으로써 분자 도킹을 수행하였다. 도킹 결과는 Kcal/mol의 결합 친화도의 형태로 얻어졌고, 도킹 과정은 별도의 10개의 컴퓨터 시스템에서 10번 되풀이하여 수행하였다. 결합 모드는 Discovery Studio 4.0을 이용하여 시각화하였고, 분자의 상호작용을 확인하기 위해 2 또는 3차원 이미지를 이용하였다.

화학식 4a, 4c, 4e 및 6a의 화합물의 도킹 후에 계산된 평균 결합 에너지 값을 표 4에 나타내었다.

Entry	Compounds	Average Binding Affinity (Kcal/mol)
1	4a	-7.5
2	4c	-7.7
3	4e	-7.6
4	6a	-6.0

표 4에 나타난 바와 같이, 화학식 4c 및 4e 화합물이 효소와 높은 결합력을 나타내었다. 또한, 티로시나제의 활성 부위와 화학식 4a, 4c, 4e 및 6a의 화합물의 리간드-단백질 상호 작용을 각각 도 5 내지 도8에 나타내었다. 여기서 (a), (b)는 3차원적 도킹 이미지를, (c)는 2차원적 도킹 패턴을 나타낸다.

도 6에 나타난 바와 같이, 화학식 4c의 화합물은 억제제의 락톤닉 페닐 고리 및 티로시나제의 ASP113사이에서 π-π 스택을 형성한 것을 알 수 있다. 또한 화학식 4c 화합물의 페닐 고리의 3,4-위치와 티로시나제의 활성부위의 ARG140 및 GLN116 잔기 사이에 수소 결합이 있는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 페닐 고리에 있는 히드록시 기가 티로시나제 억제 활성에 중요한 역할을 하는 것을 확인시켜 준다.

도 7에 나타난 바와 같이, 화학식 4e의 화합물에서 SER96과의 수소 결합에 포함된 락톤닉 카보닐(carbonyl)과 카복실 카보닐은 효소의 GLN116 아미노산 잔기와 수소 결합을 형성하며, 페닐 고리의 2 및 4 위치에 있는 히드록시 기는 표적 단백질의 HOH609, HOH646 및 HOH695에 단단하게 결합되어 있는 것을 알 수 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

하기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 I]

상기 화학식 I에서,
n은 0 또는 1이고,
R1 내지 R5는 각각 독립적으로 같거나 다르며, 수소(H), 히드록시(OH), C₁~C₂₀의 알콕시, 카복시(CO₂H), F, Br, Cl 또는 I이다.
제 1항에 있어서,
상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 4a, 화학식 4b, 화학식 4c, 화학식 4d, 화학식 4e, 화학식 4f, 화학식 4g, 화학식 6a 또는 화학식 6b의 화합물인 것을 특징으로 하는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 4a]

[화학식 4b]

[화학식 4c]

[화학식 4d]

[화학식 4e]

[화학식 4f]

[화학식 4g]

[화학식 6a]

[화학식 6b]
하기 반응식 1에 따른 하기 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법:
[반응식 1]

상기 화학식 K 또는 화학식 I에서,
n은 0 또는 1이고,
R1 내지 R5는 각각 독립적으로 같거나 다르며, 수소(H), 히드록시(OH), C₁~C₂₀의 알콕시, 카복시(CO₂H), F, Br, Cl 또는 I이다.
제 3항에 있어서,
상기 (1)단계의 반응은 트리에틸아민((C₂H₅)₃N)을 가한 후, -10 ~ 10℃에서 교반되어 수행되는 것을 특징으로 하는, 쿠마린 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법.
제 3항에 있어서,
상기 (1)단계 또는 (2)단계에서, 사용된 용매는 증류수, 디클로로메탄, 테트라클로로에탄, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 메탄올, 헥산, 아세토니트릴, 톨루엔, 벤젠, 사염화탄소, 펜탄, 아세톤, 디메틸 설폭시드, 테트라하이드로퓨란 및 디메틸포름알데히드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 쿠마린 유도체 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법.
제 1항의 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 기미, 주근깨, 노인성 흑점, 반점, 곰보 및 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 멜라닌 과다생성으로 인한 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
삭제
제 1항의 화학식 I로 표시되는, 쿠마린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 기미, 주근깨, 노인성 흑점, 반점, 곰보 및 임신기 과색소 침착(hyperpigmentation)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 멜라닌 과다생성으로 인한 질병의 예방 또는 개선용 화장료조성물.