DE69827651T2

DE69827651T2 - Verwendung von tempol zur behandlung von essentiellem hochdruck

Info

Publication number: DE69827651T2
Application number: DE69827651T
Authority: DE
Inventors: S. Christopher WILCOX
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University Medical Center
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: US6096759A; WO1999013875A8; EP1014980B1; DE69827651D1; ATE282413T1; AU9400498A; US6617337B1; EP1014980A1; WO1999013875A1

Description

Die Arbeiten, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurden teilweise durch die Regierung der Vereinigten Staaten finanziell unterstützt, NIH-Subvention DK 36079 und DK 49870.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von essentieller Hypertonie durch Verabreichung einer gegen Hypertonie wirksamen Menge an 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol oder TMPN).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Systemische Hypertonie ist in den Vereinigten Staaten die am häufigsten vorkommende kardiovaskuläre Erkrankung, an der mehr als 50 Millionen Personen leiden. Dementsprechend bleiben Anstrengungen zur Prävention, Diagnose und Behandlung von Hypertonie ein wichtiges Thema der nationalen Gesundheitsfürsorge. Obgleich sehr große Fortschritte hinsichtlich des öffentlichen Bewusstseins für die Bedeutung von Hypertonie gemacht wurden, waren bei der Einführung von Therapien gegen Hypertonie und bei der Kontrolle der Hypertonie die nachteiligen Stoffwechselwirkungen einiger Klassen der Arzneimittel gegen Hypertonie und die enttäuschenden Resultate bei der Verhinderung damit einhergehender Erkrankungen der Herzkranzgefäße, die traditionellen Ansätze zur Behandlung des Patienten gegen Hypertonie beeinträchtigten.
Essentielle Hypertonie
Essentielle Hypertonie stellt eine Sammlung genetisch begründeter Krankheiten und/oder Syndrome mit einer Reihe zu Grunde liegender vererbter biochemischer Abnormalitäten, die noch nicht geklärt wurden, dar. Hypertonie führt durch Schädigung des Endothels zu Arterosklerose und anderen Formen der Gefäßpathologie. Eine Endothelschädigung produziert eine Kaskade von Veränderungen. Außerdem kann eine nicht-atherosklerotische, durch Hypertonie induzierte vaskuläre Schädigung zu einem Schlaganfall und zu terminaler Niereninsuffizienz führen. Die Messung des Blutdrucks (BP) ist eines der Hauptverfahren zum Diagnostizieren essentieller Hypertonie. Blutdruck ist gerade ein Faktor, der bei der Wahl der Therapie und der Arzneimittelauswahl zur Behandlung der komplexen Pathologie, die essentielle Hypertonie ist, berücksichtigt wird.
Reaktive Sauerstoffspezies
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), z.B. Superoxidanionen (O₂ ^–), Hydroxylradikale und Wasserstoffperoxid (H₂O₂) sind bei Atherosklerose, Diabetes, Ischämie-Reperfusionsschädigung und Hypertonie beteiligt (Giugliano et al., 1995 Metab. 44: 363-368; Harrison et al., 1995 Am. J. Cardiol. 75: 75B-81B; McCord et al., 1985 312: 159-163; und Kitiyakara et al., Curr. Opin. Nephrol Hypertens., im Druck). Im Vergleich zu Personen mit normalem Blutdruck haben hypertensive Patienten höhere Plasmawerte für Wasserstoffperoxid, Superoxidanion und Lipidperoxide, während sie niedrigere Level für das Antioxidans Ascorbinsäure haben (Lacy et al., 1998 J. Hypertens. 16: 291-303; Kumar et al., 1993 Free Rad. Res. Commun. 19: 59-66; Tse et al., 1994 J. Hum. Hypertens. 89: 843-849; Bulpitt et al., J. Hypertens. 8: 1071-1075). Allerdings bleibt der molekulare Mechanismus für die Sauerstofftoxizität bei Gefäßerkrankungen, z.B. essentielle Hypertonie, noch zu klären.
Enzyme wie Superoxiddismutase (SOD) katalysieren die Dismutation von Superoxidradikalen, um die Radikale aus dem System der Person zu entfernen, wo die Radikale Gewebe zerstören können. Experimente, in denen SOD Ratten verabreicht wurde, verringerten in normalen Ratten oder in spontan hypersensitiven Ratten (SHR) den Blutdruck nicht. Allerdings haben ein SOD-Fusionsprotein und Oxypurinol, ein Inhibitor der Xanthinoxidase, bei getrennter Verabreichung den Blutdruck bei SHR, aber nicht bei normalen Ratten gesenkt (Nakazono et al., 1991 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 10045-10048). Andere Kurzzeitstudien zur ROS-Inhibierung haben angezeigt, dass Blutdruck im SHR-Tiermodell gesenkt werden kann (Yoshioka et al., 1985 Int. J. Vitam. Nutri. Res. 55: 301-307; Nakazono et al., 1991 Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 10045-10048; Suzuki et al., 1998 Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 4754-4759; Susuki et al., 1995 Hypertens. 25: 1083-1089). Ein anderes Antioxidans, Ascorbinsäure, hat ebenfalls den Blutdruck im SHR-Tiermodell gesenkt. Allerdings hat das SHR-Modell auch Abnormalitäten beim Ascorbinsäuremetabolismus angezeigt (Yoshioka et al., 1985 Internat. J. Vit. Nutr. Res. 55: 301-307). Dieser Beweis zeigt, dass Superoxidradikale in und um Gefäßendothelzellen bei der Pathogenese der Hypertonie im SHR-Modell eine Rolle spielen.
Stickstoffoxid (NO), auch als endothelium-derived relaxing factor (EDRF) bezeichnet, wird durch Stickstoffoxidsynthase (NOS) in vielen Zelltypen, einschließlich Gefäßendothelzellen, glatten Gefäßmuskelzellen, aktivierten Makrophagen, neuronalen Zellen und Glialzellen synthetisiert (Miyamato et al., 1996 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 211: 366-373). Gryglewski et al., (1986 Nature 320: 454-456) zeigte, dass O₂ ^– mit NO unter Bildung der potentiell toxischen Molekülspezies Peroxynitrit (ONOO^–) reagiert, die in Gefäßendothelzellen wirksam eine Verarmung an NO herbeiführen kann. Rubanyi et al. (1986) bewies, dass O₂ ^– EDRF in koronaren Arterienringen inaktiviert (Am. J. Physiol. 250: H822-H827). Ein Abfangen von O₂ ^– verstärkt die Endothel-abhängige Vasodilation und erhöht die NO-Freisetzung aus Mesenteri arterioles (Tschudi et al., 1996 Hypertens. 27: 32-35) und Endothelzellen (Grunfeld et al., 1995 Hypertens. 26: 854-857) in SHR. Allerdings wurde der komplette Mechanismus für die vasodilatorischen Wirkungen von O₂ ^–-Abfangmitteln noch nicht geklärt. Obgleich ein in vitro-Beweis existiert, der nahelegt, dass O₂ ^– zu einem verstärkten systemischen vaskulären Ton bei SHR beiträgt, bleibt die spezifische Rolle von O₂ ^– beim verstärkten Nieren gefäßwiderstand (RVR) und beim mittleren arteriellen Grundliniendruck (MAP) bei SHR in vivo unklar (Schnackenberg et al., 1998 Hypertens. 32: 59-64).
Es gibt viele andere Beispiele, in denen ein schwerer oxidativer Stress ohne Hypertonie gefunden wird. Diese umfassen z.B. eine Vergiftung mit Tetrachlorkohlenstoff, Diabetes mellitus und Hypercholesterinämie. In der Tat sind die Anzeichen für oxidativen Stress unter diesen Bedingungen besser als bei Hypertonie. Daher ist die Feststellung, dass eine Korrektur von oxidativem Stress auch Blutdruck reduziert, nicht vorhersagbar (Kitiyakara et al., im Druck).
Nitroxide
Nitroxide wurden bei der Verbesserung der nachteiligen Wirkungen von toxischen, mit Sauerstoff verwandten Spezies, z.B. O₂, verwendet (siehe Mitchell et al., 1995 U.S. Patent-Nr. 5 462 946; Hsia 1997 und 1998 U.S. Patent-Nrn. 5 591 710; 5 725 839; 5 741 893; 5 767 089; 5 804 561; und 5 807 831; und Lee et al., 1996 U.S. Patent-Nr. 5 516 881). Einige Nitroxide, z.B. Tempol (4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy), wurden zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenhypertonie-Krankheiten indiziert (Carney et al., 1997 U.S. Patent-Nr. 5 622 994; WO 92/22290). Allerdings tritt Nierenhypertonie als Resultat eines reduzierten Blutstroms in die Niere auf und ist keine essentielle Hypertonie.
Das Dokument V.V. KHRRMTSOV ET AL.: "In vitro- und in vivo-Studien an Derivaten von 1,2-Diazetin und Nitronylnitroxid als Donoren und Akzeptoren von Stickstoffoxid".
BIOKHIMIYA, Bd. 61, Nr. 10, 1996, Seiten 1731-1742, XP002089419 offenbart die intraperitoneale Injektion von NO-Derivaten im Allgemeinen bei erblich hypertensiven Ratten, um den Blutdruck zu senken.
Das Dokument WO 98/53835, das am 3. Dezember 1998 veröffentlicht wurde, offenbart ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, das die Verabreichung eines Nitroxids, z.B. Tempol, umfasst.
Das Dokument C.G. Schnackenberg et al.: "Normalisation of blood pressure and renal vascular resistance in SHR with a membrane-permeable superoxide dismutase mimetic", Hypertension, Bd. 32, Nr. 1, 1998, Seiten 59-64, wurde von der Anmelderin zwischen dem Prioritätsdatum und dem Anmeldedatum der vorliegenden Erfindung veröffentlicht. Es zeigt, dass Tempol bei SHR, einem Modell der essentiellen Hypertonie, Wirkung gegen Hypertonie hat.
Das Dokument C.G. Schnackenberg et al.: "Long-term tempol administration attenuates the hypertension and production of 8-iso prostaglandin F2a in SHR", Hypertension, Bd. 32, Nr. 3, 1998, Seite 622, das ebenfalls von der Anmelderin zwischen dem Prioritätsdatum und dem Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, zeigt, dass die Verabreichung von Tempol gleichzeitig essentielle Hypertonie und oxidativen Stress abschwächt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Behandlung essentieller Hypertonie hat für den medizinischen Beruf lange Zeit ein ernstes Problem dargestellt. Die vorliegende Erfindung schlägt die Verwendung von 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von essentieller Hypertonie bei einem Subjekt, z.B. einem Menschen, vor.
Die vorliegende Erfindung fasst die Verwendung einer blutdrucksenkenden Menge von Tempol, vorzugsweise im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder einem Exzipiens, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von essentieller Hypertonie ins Auge.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Tempol enthalten, zur Behandlung essentieller Hypertonie werden auf oralen, transdermalen, parenteralen und intravenösen Verabreichungswegen verabreicht.
Kurze Beschreibung der Figuren (NUR ERLÄUTERND)
1. (fällt nicht in den Rahmen der Anmeldung): MAP während der Grundlinienbedingungen (Basal) und während einer Bolusinjektion von Tempol (24 und 72 μmol/kg, i.v.) bei anästhesierten WKY (?, n=6) und SHR (
n=6). *P<0,05 vs. Basal; ✝ P<0,05 vs. WKY.
2. (fällt nicht in den Rahmen der Anmeldung): MAP während Grundlinienbedingungen (Basal) und während intravenöser (i.v.) Infusion von Tempol (1,8, 18, 180 und 1.800 μmol· kg^–1·h^–1) in anästhesierten WKY (?, n=6) und SHR (
n=6). *P<0,05 vs. Basal; ✝ P<0,05 vs. WKY.
3. (fällt nicht in den Rahmen der Anmeldung): Prozentuale Änderung bei MAP nach 7 Tagen Tempol-Verabreichung (1,5 mmol·kg^–1·h^–1, i.p.) in WKY (n=7) und SHR (n=7). ✝ P<0,05 vs. WKY.
4. (fällt nicht in den Rahmen der Anmeldung): Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP) bei WKY und SHR während Kontrollbedingungen (Kontrolle) und nach zwei Wochen oraler Tempol-Behandlung (1 mM Tempol, dem Trinkwasser zugesetzt). *p<0,05 vs. WKY. # p<0,05 vs. Kontrolle.
Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Mit "essentieller Hypertonie" ist essentielle, primäre oder idiopathische Hpyertonie gemeint, die eine systemische Hyper tonie unbekannter Ursache ist. Essentielle Hypertonie ist die Ursache für 95% aller Fälle an diagnostizierter Hypertonie. Sie umfasst Hypertonie jeden Grades, einschließlich solcher an der Grenze, milder, moderater und schwerer. Sie umfasst auch hypertensiven Harndrang und Notfälle oder hypertensive Krisen und tatsächlich alle Fälle der Hypertonie, bei denen es keine bekannte Ursache gibt. Sekundäre Hypertonie ist eine systemische Hypertonie bekannter und reversibler Ursache. Sekundäre Ursachen sind sehr häufig solche, die auf Nierenkrankheiten oder Nierenarterienkrankheiten oder endokrinen Störungen beruhen. Diese machen weniger als 2-10% der diagnostizierten Hypertoniefälle aus.
Mit "blutdrucksenkender Menge" ist die Menge einer Verbindung gemeint, die eine therapeutisch wirksame Konzentration erzeugt, welche den Blutdruck einer Person deutlich senkt. Eine klinisch signifikante BP-Senkung wäre ein Abfallen des BP von mehr als 5% im Vergleich zu dem Grundlinien-BP eines normalen Patienten oder dem BP eines Patienten unter Placebotherapie.
Mit "wirksamer Konzentration an Tempol" ist die Konzentration an Tempol gemeint, die den Blutdruck der hypertensiven Person deutlich senkt. Bei einem Menschen wird ein normaler diastolischer Blutdruck (BP) als normal angesehen, wenn der diastolische Blutdruck bei zwei Visiten des Arztes unter 90 mmHg liegt oder der systolische Blutdruck bei zwei Visiten des Arztes unter 140 mmHg liegt. Unter bestimmten Umständen, z.B. bei Patienten mit schwerer Proteinurie oder diabetischer Nephropathie, wird derzeit ein niedrigerer Zielwert für den BP von 120 bis 125 (systolisch) und 70 bis 75 (diastolisch) mmHg als optimal angesehen.
Diese Definitionen, Therapieziele und Verwendungen herkömmlicher Mittel gegen Hypertonie wurden kürzlich in einem Übersichtsdokument zusammengefasst, das von den National Institutes of Health mit dem Titel "The Sixth Report of the Joint Commission on the Detection, Evaluation and Treatment of Hy pertension" (National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, 1998) veröffentlicht wurde.
Die bevorzugteste Ausführungsform der Erfindung zur Behandlung von essentieller Hypertonie ist das Nitroxid 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol).
Tempol kann entweder auf oralem, parenteralem oder topischem Weg und auf anderen Verabreichungswegen, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Tempol wird am bevorzugtesten in den in Beispiel 2 diskutierten Dosierungen verabreicht, obgleich Variationen notwendigerweise vom Gewicht, Alter und Zustand der Person, die behandelt wird, und dem Vorliegen von co-morbiden Bedingungen, die die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik der Mittel beeinträchtigen können, auftreten werden. Diese werden entsprechend dem besonderen gewählten Verabreichungsweg variieren. Andere Variationen können auch in Abhängigkeit von der Tierspezies, die behandelt wird, und ihrer individuellen Reaktion auf das Medikament, wie auch vom Typ der gewählten pharmazeutischen Formulierung und dem Verabreichungszeitraum und -intervall, bei denen eine solche Verabreichung durchgeführt wird, variieren. In einigen Fällen können Dosierungskonzentrationen unter der Untergrenze des vorstehend genannten Bereichs mehr als adäquat sein, während in anderen Fällen noch höhere Dosen angewendet werden können, ohne dass gefährliche Nebenwirkungen verursacht werden, vorausgesetzt, dass solch höhere Dosen zuerst in mehrere kleine Dosen zur Verabreichung über den Tag aufgeteilt werden oder über Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder durch kontinuierliche Verabreichung durch intravenöse Infusion oder dermale Anwendung verabreicht werden.
Beispielsweise können Tabletten unbeschichtet sein oder sie können durch bekannte Techniken beschichtet sein, um einen Zerfall und eine Absorption im gastrointestinalen Trakt zu verzögern, wodurch eine verzögerte Wirkung über einen längeren Zeitraum bereitgestellt wird. Potentiell verzögernde Ma terialien umfassen Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat. Sie können auch durch die in den US-Patenten Nr. 4 256 108; 4 166 452; und 4 265 874 beschriebenen Techniken beschichtet sein, um osmotische therapeutische Tabletten zur kontrollierten Freisetzung zu bilden.
Tempol kann allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln auf einem der vorher angegebenen Wege verabreicht werden, und eine solche Verabreichung kann in einer einzelnen Dosis oder in mehreren Dosen erfolgen. Tempol kann insbesondere in einer weiten Vielzahl unterschiedlicher Dosierungsformen verabreicht werden, d.h., es kann mit verschiedenen pharmazeutisch annehmbaren, inerten Trägern in Form von Tabletten, Kapseln, Lutschbonbons, Pastillen, harten Süßigkeiten, Pulvern, Sprays, Cremes, Salben, Suppositorien, Gelees, Gelen, Pasten, Lotionen, Salben, wässrigen Suspensionen, injizierbaren Lösungen, Elixieren, Sirupen und dergleichen kombiniert werden. Solche Träger umfassen feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässrige Medien und verschiedene nicht-toxische organische Lösungsmittel, usw. Darüber hinaus können orale pharmazeutische Zusammensetzungen geeigneterweise gesüßt und/oder aromatisiert werden.
Zur oralen Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Exzipientien, wie mikrokristalline Cellulose, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, Dicalciumphosphat und Glycin enthalten, zusammen mit verschiedenen Zerfallsmitteln, wie Stärke (z.B. vorzugsweise Mais-, Kartoffel- oder Tapioca-Stärke), Alginsäure und bestimmten komplexen Silicaten, zusammen mit Granulierungsbindemitteln, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Akaziengummi, verwendet werden. Zusätzlich sind Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talk zu Tablettierzwecken oft sehr nützlich. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in Gelatinekapseln verwendet werden. In diesem Zusammenhang bevorzugte Materialien umfassen auch Lactose oder Milchzucker, wie auch Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht.
Wenn wässrige Suspensionen und/oder Elixiere zur oralen Verabreichung gewünscht werden, kann das aktive Ingrediens mit verschiedenen Süßungsmitteln oder Aromamitteln, Farbmitteln und Farbstoffen und, wenn es gewünscht wird, Emulgatoren und/oder Suspendiermitteln, zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin und verschiedenen ähnlichen Kombinationen davon, kombiniert werden. Wässrige Suspensionen können die aktiven Materialien auch im Gemisch mit Exzipientien, die für wässrige Suspensionen geeignet sind, enthalten. Einsetzbare Suspendiermittel umfassen z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanthgummi und Akaziengummi; Dispergier- oder Netzmittel können natürlich vorkommendes Phosphatid, z.B. Lecithin, oder Kondensationsprodukte von Alkylenoxid mit Fettsäuren, z.B. Lecithin, oder Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit Fettsäuren (z.B. Polyoxyethylenstearat) oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen (z.B. Heptadecaethylenoxycetanol) oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Partialestern, abgeleitet von Fettsäuren und einem Hexit (z.B. Polyoxyethylensorbitmonooleat), oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Partialestern, abgeleitet von Fettsäuren und Hexitanhydriden (z.B. Polyoxyethylensorbitanmonooleat), sein. Die wässrigen Suspensionen können auch ein Konservierungsmittel oder mehrere Konservierungsmittel (z.B. Ethyl- oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat) enthalten.
Zur parenteralen Verabreichung können Lösungen einer erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindung als gebrauchsfertige Lösung in einem isotonischen Vehikel, z.B. eine normale Kochsalzlösung, die geeignete Stabilisatoren enthält, formuliert werden. Das aktive Agens kann auch als trockenes steriles Pulver oder als lyophilisiertes Pulver formuliert werden, das eine Rekonstitution mit einer akzeptablen, isotonischen, sterilen Flüssigkeit erfordert. Diese wässrigen Lösungen sind für intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektionszwecke geeignet. Die Herstellung all dieser Lösungen unter sterilen Bedingungen wird durch pharmazeutische Standardtechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, in einfacher Weise erreicht.
Ein beliebiges der obigen Verfahren zur Verabreichung des aktiven Ingrediens (z.B. Tempol) wird zur Behandlung von Personen, die an essentieller Hypertonie leiden (auch bekannt als primäre oder idiopathische Hypertonie) ins Auge gefasst. Es wird in Betracht gezogen, diese Agentien bei Patienten mit allen Graden der Hypertonie von Grenzlinien-Hypertonie bis schwerer Hypertonie, bei Patienten mit beschleunigter oder maligner Hypertonie und bei Patienten mit hypertensivem Harndrang, hypertensiven Notfällen oder hypertensiven Krisen zu verwenden.
Zur Beurteilung der jüngeren Feststellung, dass eine fehlende TGF-Antwort auf eine NOS-Blockade in Salz-restringierter Sprague-Dawley-Ratte durch eine lokale Mikroperfusion von L-Arginin in JGA wieder hergestellt werden könnte, wurden verschiedene Studien durchgeführt. Als Teil der Studie wurde eine defektive NO-Wirkung in JGA von SHR aus der TGF-Reaktion auf eine Mikroperfusion des Nitroxids 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) mit niedrigem Molekulargewicht analysiert. Tempol ist ein nicht-metallisches, Zellmembran-permeables Superoxiddismutase (SOD)-Mimetikum, das gegen eine Herzreperfusionsschädigung oder eine oxidative Kardiomyozytenschädigung wirkt (Iannone et al., 1989 Biochem. Pharm. 38: 2581-2586; Nilsson et al., 1989 J. Biol. Chem. 19: 11131-11135). Es wurde bewiesen, dass Tempol eine stabile Spin Trap für O₂ ^– ist und eine mit O₂ ^– in Verbindung stehende Verletzung, die aus Ischämie/Reperfusion, Entzündung und Strahlung resultiert, vermindert (Goffman et al., 1992 Radiat. Oncol. Biol. Phys. 22: 803-806; Hahn et al., 1992 Cancer Res. 52: 1750-1753; und Mitchell et al., 1991 Arch. Biochem. Biophys. 289: 62-70).
Die folgenden Arbeitsbeispiele offenbaren Verfahren zur Verabreichung von Tempol-Zusammensetzungen.
BEISPIEL 1
Materialien und Verfahren. Es wurden Untersuchungen an männlichen SHR und WKY, die 235-300 g wogen und mit einem Standard-Rattenfutter (Purina Rat Chow, St. Louis; MO) mit einem Natriumgehalt von 0,3 g·100 g^–1 gehalten wurden, durchgeführt. Bis zum Tag der Untersuchung hatten sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
Serie 1: RT-PCR-Analyse auf mRNA-Abundanz von ecNOS- und bNOS-Transkripten in Glomeruli oder Nierencortex von SHR und WKY. Da die Menge an NOS bei Hypertonie, speziell im SHR-Modell, eine Rolle spielt, waren die Untersuchungen so konzipiert, dass die Hypothese untersucht wurde, dass Transkripte für konstitutive NOS im Cortex der SHR im Vergleich zu WKY-Ratten verringert waren. bNOS-Transkripte und Protein werden reichlich in der Macula densa des Nierencortex exprimiert, und frühere Studien haben eine enge Korrelation zwischen bNOS-mRNA-Transkript-Abundanz in Nierencortex und bNOS-Transkript-Abundanz in der isolierten Macula densa gezeigt. Folglich wurden Studien der bNOS-mRNA-Expression im äußeren Cortexgewebe unter der Annahme durchgeführt, dass Unterschiede wahrscheinlich Veränderungen vornehmlich bei der bNOS-mRNA der Macula densa widerspiegeln. Endothelialzell-NOS(ecNOS)-mRNA wird im Gefäßsystem in größerem Umfang exprimiert, und daher wurde seine Abundanz in einzelnen Glomeruli, die aus äußeren corticalen Nephronen mikroseziert worden waren, bestimmt.
Unter Thiobarbital-Anästhesie (Pentobarbital 100 mg·kg^–1, i.p.) wurde das Abdomen geöffnet, und in die Aorta wurde eine Kanüle eingeführt, um die Nieren mit eiskalter Dissektionslösung zu spülen. Diese Flüssigkeit enthielt 135 mM NaCl, 1 mM Na₂HPO₄ mit pH 7,4. Zur Isolierung von RNA aus der äußeren corticalen Niere wurde eine Niere aus 6 SHR und eine aus 6 WKY längs aufgeschnitten, und ein Segment des äußeren Cortex wurde entfernt und für 30 min bei 37°C mit Kollagenase (1%) verdaut. Glomeruli wurden unter einem Stereomikroskop in Spüllösung bei 4°C seziert. Diese Lösung enthielt (200 μl Volumen): 170 μl Dissektionslösung, 20 μl 5 μM DTT, 10 μl 10 mM Vanadylribonucleosid-Komplex. Sezierte Glomeruli wurden außerdem unter dem Stereomikroskop bei 4°C in Puffer weiter gereinigt. Dieser Puffer enthielt (200 μl Volumen): 170 μl Dissektionslösung, 20 μl 5 μM DTT und 10 mM 2 E/μl RNA sin +. Schließlich wurden Glomeruli in Zentrifugenröhrchen transferriert, die Lyselösung enthielten. Diese Lyselösung enthielt (200 μl Volumen): 166 μl entionisiertes Wasser, 4 μl 2% Triton X-100, 20 μl 5 mM DTT und 10 μl 2 E/μl RNA sin +. Die gesamte RNA wurde unter Verwendung von RNA-ATAT-60^TM (Tel-test B, Inc., Friendswood, TX) extrahiert. Die mRNA wurde mit Oligo(dT)₁₆ als Primer und MuLV als reverse Transkriptase revers transkribiert, wobei ein RNA-PCR-Kit (Perkin Elmer, Inc., Branchburg, NJ) verwendet wurde.
Die für eine PCR des bNOS-Genprodukts verwendeten Primer waren die vorher Beschriebenen. Für bNOS war der Senseprimer: 5'-GTCGAATTCCGAATACCAGCCTGRTCCATGGAA-3' (Seq. #1) und der Antisenseprimer war 5'-CGCGGATCCCATGCGGTGGACTCCCTCCTGGA-3' (Seq. #2). Das vorausgesagte Produkt hatte eine Länge von 599 Basenpaaren. β-Actin wurde als "housekeeper gene" zum Vergleich ausgewählt. Die für β-Actin-mRNA verwendeten Primer waren: Senseprimer: 5'-GATCAAGATCATTGCTCCTC-3' (Seq. #3) und Antisenseprimer: 5'-TGTACAATCAAAGTCCTCAG-3' (Seq. #4). Das PCR-Produkt hatte eine vorhergesagte Länge von 426 bp. Die Mengen an NOS-cDNAs wurden durch die Mengen an β-Actin-cDNA normalisiert. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 pmol jedes Primers, 1,25 mM Deoxynucleotidgemisch, 2,5 μl Taq-DNA-Polymerase, 10 mM Tris-HCl (pH 10), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% (Gew./Vol.) Gelatine in einem Endvolumen von 50 μl. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Nach einer Anfangsschmelztemperatur von 94°C für 4 min erfolgte eine Denaturierung über 30 s bei 94°C; ein Anlagern bei 60°C für 45 s und eine Verlängerung über 45 s bei 72°C für wiederholte Amplifikationszyklen, gefolgt von einer abschließenden Extension für 7 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden an einem 1,5% Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde und unter UV-Licht visualisiert wurde, analysiert. Die Größe der Produkte wurde mit einer Rattennieren-cDNA-Sonde für bNOS verglichen. Um die Authentizität der PCR-Produkte zu bestätigen, wurden die amplifizierten bNOS-cDNAs aus dem Rattennierencortex einer SHR- und WKY-Ratte durch MICROCON^TM (Amicon Co., Beverly, MA) gereinigt und mit einem AmliTaq-cycle sequencing-Kit (Perkin Elmer, Inc., Branchburg, NJ) sequenziert.
Die Transkript-Abundanz für ecNOS wurde in einzelnen Glomeruli des äußeren Cortex nach dem Verfahren von Pelayo et al. (1994) Am. J. Physiol. 267: F497-F503, bestimmt. Es wurden getrennte Gruppen aus SHR (n=6) und WKY (n=6) wie oben beschrieben präpariert. Für diese Studien wurde die mRNA-Abundanz pro einzelnem Glomerulus untersucht. Nach Anästhesie und Vorbereitung des Tiers wurden 1-5 μm-Latexmikrokügelchen (Polysciences, Warrington, PA) in HEPES-Puffer (pH 7,4) in die linke Niere infundiert. Nach Perfusion wurde die Niere herausgeschnitten, in kranzförmige Scheiben geschnitten, auf Eis gelegt, und dann wurde ein Glomerulus aus dem äußeren Cortex unter Stereomikroskopie mikroseziert. Danach wurde die mRNA extrahiert, revers transkribiert und wie oben beschrieben amplifiziert. Die für ecNOS verwendeten Primer waren: Senseprimer: 5'-GTCGAATTCCTGGCGGCGGAAGAGAAGGAGC-3' (Seq. #5) und Antisenseprimer: 5'-CGCGGRTCCGGGGCTGGGTGGGGAGGTGATGTC-3' (Seq. #6). Die vorausgesagte Produktlänge war 691 Basenpaare und wurde mit einer Rattennieren-cDNR-Sonde für ecNOS aus unserem Labor verglichen.
Es wurde für eine Optimierung der Bedingungen für die RT-PCR gesucht. Für jede Studie wurden Parallelanalysen mit reihenverdünnten Mengen an cDNA durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Produkt (bestimmt durch Densitometrie) log-linear mit der cDNA-Menge in den verwendeten Bereichen zunahm. Es wurden negative Kontrollen durch PCR ohne vorherige RT und durch RT-PCR des verwendeten Puffers durchgeführt.
Serie 2: Vergleich der ecNOS-, bNOS- und iNOS-Proteinexpression in Nieren von SHR und WKY. Diese Studien in WKY- und SHR-Ratten wurden durchgeführt, um die Hypothese zu untersuchen, dass Veränderungen in der Nierencortexgen-Transkript-Abundanz von Veränderungen bei NOS-Gen-Translationsprodukten begleitet sind. Sechs SHR- und sechs WKY-Ratten wurden anästhesiert, und ihre Nieren wurden wie oben beschrieben präpariert. Scheiben des äußeren Nierencortex wurden seziert und auf Eis in 1 ml Puffer, der 20 mM Tris pH 7,2, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 1 mM Leupeptin, 1 mM DDT, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, unter Verwendung eines Potter-Elvehjem-Teflon-Glas-Gewebehomogenisators homogenisiert. Die Homogenate wurden dreimal für 40 s beschallt, für 15 min bei 12.000 g zentrifugiert und in Natriumdodecylsulfat (SDS)-Puffer (0,5 M TRIS-HCl pH 6,8, 20% (Vol./Vol.), Glycerol, 4,6% (Gew./Vol.) SDS) verdünnt. Es wurde eine Probe hergestellt, die 350 μg Protein enthielt, und sie wurde auf ein 8% SDS-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und einem Elektroblotting auf einer Nitrocellulosemembran (Pierce, Rockford, IL) unterworfen, wobei diese vorher durch Ponceau-Lösung gefärbt war; auf diese Weise wurde bestätigt, dass der Proteintransfer auf die Membran vollständig war. Die Nitrocellulosemembranen wurden mit 3% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (TBST) für 1 h inkubiert, danach folgte eine Inkubation über Nacht mit einem monoklonalen Maus-Antikörper für bNOS, iNOS oder ecNOS in einer Verdünnung 1:400. Nach Spülen in TBST wurden Membranen für 1 h mit Anti-Maus-IgG-Antikörper-konjugierter Meerrettichperoxidase in einer Ver dünnung von 1:10.000 inkubiert. Die Membranen wurden dann mit TBST gespült, und bNOS-, iNOS- oder ecNOS-Protein wurde durch die Aminobenzidin (DAB) mit 0,3% Wasserstoffperoxid detektiert.
Serie 3: Immunhistochemische Untersuchung der ecNOS- und bNOS-Verteilung in der Niere von SHR und WKY. Diese Studien wurden durchgeführt, um die Verteilung der ecNOS-Immunreaktivität im vaskulären und glomerulären Kapillarendothel und von bNOS im Macula densa-Zellcytoplasma in SHR- und WKY-Ratten zu bestimmen. Spezifisch ausgedrückt, Unterschiede in der konstitutiven und induzierbaren NOS-Expression in verschiedenen Geweben könnten auch die Rolle von NOS bei Hypertonie anzeigen. Nach Anästhesie wurde die abdominale Aorta von 5 SHR und 5 WKY mit einer Kanüle versehen, und die Nieren wurden mit 0,154 M NaCl, anschließend mit Paraformaldehydlysinperiodat (PLP)-Lösung für 5 min perfundiert, in Scheiben geschnitten und über Nacht bei 4°C in PLP eingetaucht, bevor sie in Wachs (Polyethylenglykol 400-Distearat; Polysciences, Inc., Warrington, PA) oder Paraffin eingebettet wurden.
Zwei μm-Wachs-Schnitte wurden für eine lichtmikroskopische Immunhistochemie unter Verwendung der Streptavidin-Biotin-Meerrettichperoxidase-Komplex-Technik (LSAB-Kit, Dako, CA) verarbeitet. Kurz ausgedrückt, Schnitte wurden entwachst, rehydratisiert und mit 3% H₂O₂ für 10 min inkubiert, um endogene Peroxidaseaktivität zu eliminieren. Nach Spülen in Trisgepufferter Salzlösung mit 0,1% Tween-20 (TBST) wurden die Schnitte für 10 min mit Blockierungsserum behandelt und mit primärem monoklonalen Maus-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 für bNOS und ecNOS (beide von Transduction Laboratories Inc., Lexington, KY) 1 h lang inkubiert. Nach Spülen mit TBST wurden die Schnitte mit dem sekundären Antikörper, biotinilierter polyklonaler Kaninchen-Antikörper-gegen-Maus-Immunglobulin (Dako, Dänemark) in einer Verdünnung von 1:600 für 30 min inkubiert, gespült und für 20 min mit Meerrettichperoxidase (HRP)-markiertem Straptavidin inkubiert. Nach Spülen mit TBST wurde HRP durch Diaminobenzidin (DAB) mit Wasserstoffperoxid detektiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht.
Zur elektronenmikroskopischen (EM) Immuncytochemie unter Verwendung des Immunogoldverfahrens nach Einbettung wurden 1 mm³-Blöcke Nierencortex dehydratisiert und in Lowicryl eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden an einem Ultramikrotom geschnitten, an Colloidin-beschichteten Nickelgittern montiert und zur Immungoldmarkierung verarbeitet. Die Schnitte wurden mit 0,1 M NH₄Cl 1 h lang inkubiert, mit Pufferlösung (0,02 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05 Tween 20, eingestellt auf pH 7,2) für 15 min gespült und mit monoklonalem Maus-Antikörper gegen ecNOS (Transduction Laboratories Inc., Lexington, KY) über Nacht bei 4°C in einer Konzentration von 1:100 inkubiert. Nach drei 10-minütigen Pufferwaschgängen wurden 30 nm sekundärer, Gold-markierter Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper (Amersham Life Science, Buckinghamshire, U.K.) für 2 h bei einer Verdünnung von 1:50 angewendet. Danach wurden die Schnitte mit Puffer gewaschen, mit 2% Glutaraldehyd/PBS-Lösung für 30 min inkubiert, mit destilliertem Wasser gespült, mit Uranylacetat und Bleicitrat gegengefärbt und mit einem Elektronenmikroskop (Hitachi 7000-Transmissions-Elektronenmikroskop) untersucht. Um den Grad der ecNOS-Immungoldmarkierung halbquantitativ zu bestimmen, beurteilte ein unabhängiger Betrachter durch Vergleiche EM-Bilder von Schnitten von 3 SHR- und 3 WKY-Ratten. Die Anzahl von Immungoldpartikeln, die über Epithelzellen liegend detektiert wurden, wurden gezählt und als die Anzahl an Partikeln/μm glomerulärer Basismembran ausgedrückt.
Serie 4. Inhibierungseffekte von bNOS auf maximale TGF-Antworten in SHR und WKY. Diese Experimente untersuchten das SHR-Hypertonie-Modell weiter, und auch, ob der erhöhte TGF der SHR-Niere auf einer abgschwächten Bildung von NO durch bNOS in der Macula densa beruht, oder ob die NOS-Inhibierung im SHR-Modell vermindert ist. Gruppen aus SHR- und im Alter passender WKY-Ratten wurden für eine in vivo Mikropunktion, Mikroperfusion und TGF-Studie, wie vorstehend detailliert beschrieben, vorbereitet. Kurz ausgedrückt, die Tiere wurden mit Thiobarbital (Inactin, 100 mg·kg^–1; Research Biochemicals, Inc., Natick, MA) anästhesiert. In die Jugularvene wurde ein Katheter zur Fluidinfusion eingesetzt und in die femorale Arterie wurde ein Katheter zur Aufzeichnung des mittleren arteriellen Blutdrucks (MAP) aus dem elektrisch gedämpften Output eines Druckwandlers (Statham, Inc.) eingesetzt. Es wurde ein Tracheotomierohr eingesetzt, und die Tiere wurden spontan atmen gelassen. Durch einen Lendenschnitt wurde die linke Niere freigesetzt, von Bindegewebe gereinigt und in einem Lucite-Becher stabilisiert. Diese Niere wurde in 0,154 M NaCl, die bei 37°C gehalten wurde, gebadet. Nach Beendigung der Operation erhielten die Ratten eine Infusion mit einer Lösung von 0,154 M NaCl und 1% Albumin, und zwar mit 1,5 ml h^–1, um so einen ausgeglichenen Zustand des Blutvolumens aufrecht zu erhalten. Die Mikropunktionsstudien begannen nach 60 min zur Stabilisierung.
Für eine orthograde Mikroperfusion der Henle-Schleife (LH) wurde eine Mikropipette (8 μm Außendurchmesser), die künstliches tubuläres Fluid (ATF), gefärbt mit FD- und C-Farbstoff, enthielt, in einen späten proximalen Tubulus insertiert. Injektionen des gefärbten ATF identifizierten das Nephron und die Strömungsrichtung. Ein unbeweglicher Knochenwachsblock wurde über eine Mikropipette (10-15 μm) in diese Mikropunktionsstelle eingesetzt und mit einem hydraulischen Antrieb (Trent Wells, Inc., LaJolla, CA) verbunden, um den tubulären Fluidstrom zu halten. Eine Perfusionsmikropipette (6-8 μm), die ATF und Testverbindungen oder Vehikel enthielt, wurde in den proximalen Tubulus stromabwärts vom Wachsblock eingesetzt und mit einer Nanoliter-Perfusionspumpe (WPI, Sarasota, FL) verbunden. Eine Druck-Mikropipette (1-2 μm) wurde in den proximalen Tubulus stromaufwärts vom Wachsblock eingesetzt, um den proximalen Strömungsabbruchdruck (PSF) zu messen. Änderungen beim PSF sind ein Index für Veränderungen beim glome rulären hydraulischen Kapillardruck (P_GC). Messungen des PSF wurden während der Null-Schleifenperfusion in jedem Nephron und während der Perfusion mit ATF bei 40 nl·min^–1 durchgeführt, wobei dieser eine maximale TGF-Reaktion erzeugt, welche als die Differenz zwischen PSF-Werten, die während der Perfusion der Schleife mit ATF mit 0 und 40 nl·min^–1 aufgezeichnet werden.
Die maximalen TGF-Antworten wurden in SHR (n=4) und WKY-Ratten (n=4) für Perfusion der LH mit ATF + Vehikel bestimmt, und den maximalen TGF-Antworten während Perfusion mit ATF + 7-Nitroindazol (7-NI; 10^–4 M) gegenübergestellt.
Serie 5: Maximale TGF-Reaktionen während der Mikroperfusion von L-Arginin in SHR und WKY. Von L-Arginin wurde früher gezeigt, dass es den Blutdruck oder die glomeruläre Filtrationsrate im SHR-Modell nicht senkt. Allerdings kann L-Arginin eine TGF-Antwort auf die NOS-Blockade in untersuchten Ratten, die an eine geringe Salzaufnahme adaptiert waren, wieder herstellen. Daher wurde die Rolle von L-Arginin im SHR-Modell untersucht. Diese Serie untersuchte die Wirkung einer reduzierten Abgabe von L-Arginin an die Macula densa bei NO-Erzeugung, wie es in Serie 4 bestimmt worden war. Gruppen von SHR- (n=4) und WKY-Ratten (n=3) wurden zur Mikroperfusion vorbereitet. PSF wurde während einer orthograden LH-Perfusion bei 0 und 40 nl·min^–1 mit ATF + Vehikel und ATF + L-Arginin (10^–3 M) aufgezeichnet. (Frühere Studien hatten gezeigt, dass dies eine maximal wirksame Dosis ist).
Serie 6: Effekte auf maximale TGF-Reaktionen bei Mikroperfusion von Tempol in die JGA von SHR und WKY. Der Zweck dieses Beispiels besteht darin, zu bestimmen, ob von Sauerstoff abgeleitete freie Radikale in der JGA TGF in SHR potenzieren und ob dieser Effekt durch das Nitroxid Tempol moduliert werden kann. Gruppen von SHR (n=5) und WKY-Ratten (n=5) wurden für Studien der retrograden Mikroperfusion in die Macula densa vorbereitet. Wie aus seiner hohen Membranpermeabilität er wartet wurde, hatte Tempol eher inkonsistente Resultate, wenn es orthograd aus dem späten proximalen Tubulus perfundierte. Daher wurden diese Untersuchungen an TGF mit retrograder Perfusion aus dem frühen distalen (ED)-Tubulus in die Macula densa durchgeführt. Nach Identifizierung des Nephron mit FD & C-Grün wurde die letzte proximale Windung ausgelassen, und stromaufwärts wurde ein Wachsblock plaziert. In den ED-Tubulus wurde stromaufwärts von einem Öltröpfchen eine Mikropipette (8-10 μm Außendurchmesser) insertiert. Die Henle-Schleife wurde retrograd mit Perfusat perfundiert, das direkt in das Macula densa-Segment mit 0-20 nl·min^–1 eintrat. Dies stellt eine maximale Aktivierung für TGF durch retrograde Perfusion dar. Vorhergehende Studien zeigten, dass eine Tempol-Dosis von 10^–3 M maximal wirksam war und die Effekte reversibel waren. Daher wurde diese Dosis nachher bei den Testtieren verwendet (Dosierung/kg wäre bei größeren Tieren üblicherweise niedriger). Es wurden Vergleiche bei den maximalen TGF-Reaktionen durchgeführt, welche während Perfusion von ATF + Vehikel (Ethanol) und ATF + Tempol erhalten worden waren.
Statistische Methoden. Werte sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde auf die Daten innerhalb einer Gruppe für SHR und WKY angewendet; wenn es passend war, wurden danach Dunnett-t-Tests durchgeführt. Werte wurden als statistisch signifikant bei p<0,05 angenommen.
Resultate. Für die Serie 1 war die ecNOS-mRNA-Abundanz in den äußeren corticalen Glomeruli von SHR ständig größer als bei WKY, obgleich für β-Actin-mRNA ähnliche Dichten offensichtlich waren. Dies wurde durch die densitometrische Analyse bestätigt. Die aus einem Glomerulus erhaltene cDNA wurde analysiert, und es wurde festgestellt, dass sie der veröffentlichten Sequenz für Ratten-ecNOS vollständig entspricht.
RT-PCR-Produkte, die cDNAs für bNOS entsprechen, wurden aus dem äußeren Cortex von 6 SHR- und 6 WKY-Rattennieren erhalten. Die Dichte der Banden, die von SHR erhalten wurde, war ständig größer als die für WKY, obgleich ähnliche Dichten für β-Actin gezeigt wurden. Diese Differenz wurde durch densitometrische Analyse bestätigt. Die Analyse des PCR-Produktes aus einer Niere bestätigte, dass es vollständig der veröffentlichten Sequenz für Ratten-bNOS entspricht.
Für Serie 2 zeigte eine Western-Analyse von Proteinen, die aus dem äußeren Cortex von Nieren von SHR- und WKY-Ratten extrahiert worden waren, dass Immunreaktivitätsbanden iNOS und bNOS entsprachen. Eine Bande für ecNOS wurde im Cortex nicht konstant detektiert. Die Expression der immunreaktiven Proteine bNOS und iNOS war im Cortex der SHR im Vergleich zu dem der WKY um 50-65% erhöht.
Für die Serie 3 entsprach die Verteilung der ecNOS- und bNOS-Immunreaktivität im Nierencortex von SHR und WKY den früher veröffentlichten Daten von Sprague-Dawley-Ratten. Die ecNOS-Immunreaktivität war im Endothel der Arterie arcuate im Nierencortex von WKY und SHR leicht nachweisbar. In WKY hatte die Immunreaktivität eine relativ moderate Intensität, wohingegen die Immunreaktivität im Endothel bei SHR dichter zu sein schien. Eine Immunfärbung auf ecNOS trat auch im Endothel der äußeren corticalen Arteriolen auf, wobei sie bei WKY weniger dicht als bei SHR zu sein schien. Eine quantitativere Bestimmung der immunreaktiven ecNOS-Expression im glomerulären Kapillarendothel unter Verwendung der EM-Immuncytochemie war die Anzahl der Immungoldpartikel entlang der Kapillarwände der äußeren corticalen Glomeruli bei SHR deutlich größer als bei WKY (SHR: 0,51 ± 0,05, n=41 vs. WKY: 0,32 ± 0,05, n=40, Goldpartikel·μm^–1; p<0,01). Eine Untersuchung der bNOS-Immunreaktivität zeigte eine starke Färbung des Macula densa-Zellplaques. Bei WKY schien die Färbung weniger deutlich zu sein als bei SHR. Nieren aus 5 SHR- und 5 WKY-Ratten wurden systematisch auf immuncytochemische Färbung untersucht. Die Resultate zeigten eine deutlich stärkere Macula densa-Färbung für bNOS in SHR als in WKY, und zwar bei jedem Paar, das von einem unabhängigen Untersucher, dem sogenannten "blinded observer" untersucht wurde.
Die Grundlinien-Daten für die Mikropunktions-/Mikroperfusions-Studien an Ratten der Serien 4-6 sind in Tabelle 1 gezeigt. Es wird deutlich, dass SHR-Ratten im Vergleich zu WKY-Ratten bei gleichem Körpergewicht und Nierengewicht einen ständig höheren Blutdruck und leicht höhere Herzfrequenz hatten. Die tubuloglomerulären Feedback(TGF)-Parameter zeigten bei SHR ständig höhere Werte für den proximalen Strömungsabbruchdruck während Perfusion der Henle-Schleife mit 0 und 90 nl·min^–1 und eine größere maximale TGF-Reaktion, wie es aus Differenzen zwischen PSF während Perfusion bei 0 und 40 nl· min^–1 bestimmt wurde, wobei Mittelwerte von 135 der WKY-Kontrolle erhalten wurden.
Für Serie 4 wurden maximale TGF-Reaktionen bei SHR- und WKY-Ratten während Zusatz von Vehikel oder 7-NI zu aufrechten LH-Perfusaten gegenübergestellt. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, waren die maximalen TGF-Reaktionen während Perfusion von ATF + Vehikel in SHR größer als in WKY. Der Zusatz von 7-NI erhöhte die maximalen TGF-Antworten bei WKY konstant um durchschnittlich 39%, hatte aber keine signifikanten Wirkungen auf TGF-Reaktionen von SHR.
Für Serie 5 wurden die TGF-Reaktionen bei SHR und WKY während Zusatz von L-Arginin zu orthograden LH-Perfusaten einander gegenübergestellt. Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, waren die maximalen TGF-Reaktionen bei SHR im Vergleich zu WKY während einer Perfusion von ATF + Vehikel größer. Der Zusatz von L-Arginin schwächte die ATF-Reaktionen von WKY signifikant, nämlich durchschnittlich um 18%, hatte aber keine signifikanten Wirkungen auf TGF-Antworten bei SHR.
Für Serie 6 wurden die TGF-Reaktionen bei SHR und WKY während Zusatz des membranpermeablen Nitroxid-SOD-Mimetikums Tempol zu LH-Perfusaten gegenübergestellt. Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, waren die maximalen TGF-Reaktionen in SHR wiederum größer als in WKY, und zwar während der retrograden Perfusion von ATF + Vehikel. Ein Zusatz von Tempol (10³ M) zu den retrograden Perfusionen von ATF verminderte die TGF-Reaktionen bei SHR- und WKY-Ratten deutlich. Allerdings war die Abschwächung von TGF in SHR-Ratten deutlich höher (p<0,01) als in WKY-Ratten. Bei Normalisierung auf die Anfangsreaktion war die prozentuale Verringerung bei TGF mit Tempol für SHR erneut größer (SHR: –26 ± 2 vs. WKY: –17 ± 3%; p<0,05).
In Anbetracht der Befunde aus den Beispielen ist zu erkennen, dass die Expression von konstitutiven wie auch induzierbaren NOS-Isoformen in der SHR-Niere verstärkt ist und dass die Erhöhung bei den konstitutiven NOS-Isoformen im Cortex und der JGA transkriptional reguliert zu sein scheinen, da ihr Auftreten mit einer Erhöhung bei der mRNA-Abundanz begleitet ist. Trotz dieses Beweises für eine verstärkte NOS-Expression in der JGA und/oder dem Nierencortex sind die TGF-Reaktionen von SHR übermäßig und nicht für eine lokale Blockade von nNOS durch Mikroperfusion von 7-NI in die Macula densa oder die lokale Bereitstellung von NOS-Substrat durch Mikroperfusion von L-Arginin in die Macula densa ansprechend. Diese verstärkten Reaktionen halten nach Normalisierung des renalen Perfusionsdrucks mit einer suprarenalen Aortaklemme an und sind daher keine direkte Folge des erhöhten BP.
Diese Resultate mit dem relativ bNOS-selektiven Antagonisten 7-NI zeigen, dass er keine Wirkung auf TGF-Reaktionen von SHR trotz einer Potenzierung der TGF-Reaktionen von WKY hat. Demnach ist die funktionale Reaktion auf eine NOS-Inhibierung bei SHR verringert.
Ergebnis. Eine Mikroperfusion von L-Arginin in die JGA reduzierte die maximalen TGF-Reaktionen bei WKY, modifizierte jedoch Reaktionen bei SHR nicht signifikant. Dies beinhaltet, dass die L-Arginin-Abgabe für die NO-Erzeugung in der JGA der SHR nicht limitierend war. Dies steht mit früheren Feststellungen, dass L-Arginin den BP nicht senkt oder die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) der SHR nicht verbessert, in Übereinstimmung. Die vorliegenden Feststellungen zeigen, dass eine defiziente Abgabe von L-Arginin an die JGA den TGF von äußeren corticalen Nephronen der SHR nicht erklären kann.
Tempol ist eine nicht-toxische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, die schnell zwischen extra- und intrazellulären Compartiments ins Gleichgewicht kommt, wodurch ein viel größerer Schutz gegen eine postischämische, zelluläre Schädigung als durch SOD verliehen wird. Anders als andere SOD-Mimetika ist es nicht von Metallen abhängig und ist daher in der intrazellulären Umgebung, die hohe Mg⁺²-Konzentrationen enthält, stabil.
Da eine Endothel-abhängige Vasodilatation bei SHR verschlechtert wird, wurden in vitro-Studien für SHR durchgeführt, um den Effekt von Tempol auf eine Nierenvasokonstriktion, -Vasodilatation und Hypertonie genauer zu beurteilen.
In der ersten Gruppe wurden die Kurzzeitwirkungen von Tempol in anästhesierten Ratten bestimmt. Der mittlere arterielle Grundliniendruck (MAP) und der renale vaskuläre Widerstand (RVS) waren bei SHR (n=6) im Vergleich zu WKY (n=6) deutlich erhöht. Es wurden die folgenden Daten erhalten:
MAP: SHR = 145 ± 4 vs. WKY = 118 ± 3 mm Hg,
RVR: SHR = 32 ± 4 vs. WKY = 10 ± 8 mm Hg/ml/min,
Tempol wurde intravenös mit 4 mg/kg gegeben, und die Tiere wurden untersucht
MAP: SHR = 108 ± 8 vs. WKY = 98 ± 6 mm Hg,
RVR: SHR = 17 ± 2 vs. WKY = 15 ± 1 mm Hg/ml/min,
Tempol wurde intravenös gegeben:
MAP : SHR = 8 0 ± 5 vs. WKY = 99 ± 7 mm Hg,
Der Langzeiteffekt der Verabreichung von Tempol mit einer Rate von 250 mg/kg/Tag, intraperitoneal über 7 Tage verabreicht, zeigte keine Wirkung auf den MAP bei WKY-Ratten, aber einen gesenkten MAP bei SHR (p<0,01), und zwar von 133 ± 2 auf 120 ± 3 mm Hg.
BEISPIEL 2
Die Feststellung, dass Tempol im Modell der genetisch übertragenen essentiellen Hypertonie eine wirksame Behandlung ist, legt nahe, dass Tempol zur Behandlung essentieller Hypertonie bei Menschen verwendet werden kann.
Die folgenden Zusammensetzungen sind lediglich Vorschläge. Orale Zusammensetzungen können Füllstoffe und zusätzlich Konservierungsstoffe, zusammen mit anderen inerten oder aktiven Agentien, enthalten.
A. Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung

500 mg Tempol
500 mg Stärke
5 mg Magnesiumstearat

Die Zusammensetzung kann in Kapseln gegeben werden, die enterisch beschichtet werden können.
B. Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung [NUR ERLÄUTERND]
Ab etwa 1 Gramm Tempol wird zu etwa 50 bis etwa 100 ml 5%iger Dextroselösung oder normaler Kochsalzlösung oder einer anderen geeigneten isotonischen Lösung zur intravenösen (i.v.) Verabreichung gegeben. Weitere Zusammensetzungen, die zur pa renteralen Verwendung vorgesehen sind, umfassen etwa 0,5 mM bis etwa 100 mM Tempol. Bevorzugter wären etwa 0,5 mM bis etwa 10 mM Tempol, verabreicht in einem isotonischen Vehikel auf intravenösem Weg (i.v.).
Tempol kann auf einem festen Träger verabreicht werden. Ein Beispiel für einen festen Träger sind Pflaster. Pflaster für die Verabreichung von Tempol können als Klebepflaster, die Tempol enthalten, formuliert werden. Beispielsweise kann das Pflaster scheibenartig sein, wobei eine druckempfindliche Siliconklebermatrix, die das aktive Agens enthält, mit einer nicht-permeablen Rückseite bedeckt sein kann. Die Scheibe (Discoid) kann das aktive Agens entweder im Kleber enthalten oder kann darauf einen Träger befestigt haben, der aus einem Material, wie Polyurethanschaum oder Gaze besteht, welcher das aktive Agens halten wird. Vor Verwendung wird das Material, das das aktive Agens enthält, bedeckt, um das Pflaster zu schützen.
C. Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung [NUR ERLÄUTERND]
Bei Ratten umfassen wirksame Dosierungen, die intravenös (i.v.) verabreicht werden: (1) etwa 0,25 bis etwa 800 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung, bevorzugter etwa 0,25 bis etwa 80 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung, und am vorteilhaftesten etwa 2,5 mg/kg bis etwa 8 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung; und (2) etwa 0,5 bis etwa 2.000 mg/kg/h durch i.v. Infusion, bevorzugter etwa 0,5 bis etwa 200 mg/kg/h durch i.v. Infusion, und am bevorzugtesten etwa 5 bis etwa 20 mg/kg/h durch i.v. Infusion. Beim Menschen umfassen die intravenös verabreichten, wirksamen Dosierungen für Tempol wegen des langsameren Metabolismus: (1) etwa 0,025 bis etwa 400 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung, bevorzugter etwa 0,025 bis etwa 40 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung, und am bevorzugtesten etwa 0,25 mg/kg bis etwa 4 mg/kg durch i.v. Bolusdosierung; und (2) etwa 0,05 bis etwa 1.000 mg/kg/h durch i.v. Infusion, bevorzugter etwa 0,05 bis etwa 100 mg/kg/h durch i.v. Infusion, und am bevorzugtesten etwa 0,5 bis etwa 10 mg/kg/h durch i.v. Infusion.
D. Zusammensetzungen zur dermalen Verabreichung
Ein Pflaster oder ein anderer fester Träger, der aus einem Trilaminat aus einer Klebermatrix, die zwischen einer nicht-permeablen Trägerschicht und einer schützenden Deckschicht angeordnet ist, besteht, wird wie folgt hergestellt: Zwei Gramm Tempol werden auf etwa 5 Gramm einer druckempfindlichen Siliconklebstoffzusammensetzung BIOPSA^TM Q7-2920 (Dow Corning Corp., Midland, Michigan, U.S.A.) aufgetragen. Der Klebstoff wird auf einen Polyesterfilm in sukzessiven Schichten aufgetragen, um so etwa 200 mg aktives Agens pro cm² bereitzustellen. Der Film, der den Kleber enthält, wird dann zu einem Pflaster mit 10 cm² verarbeitet. Das Pflaster wird mit einer Schutzschicht bedeckt, die vor Anbringung des Pflasters zu entfernen ist.
Es können Pflaster hergestellt werden, die Permeationsverstärker, wie z.B. Cyclodextrin, butyliertes Hydroxyanisol oder butyliertes Hydroxytoluol enthalten. Allerdings sollte daran gedacht werden, dass das aktive Agens der vorliegenden Erfindung bei Aufbringung auf das epidermale Gewebe wirksam ist. Wenn die Pflaster auf dünne oder abgeschürfte Haut aufgebracht werden sollen, besteht wenig Notwendigkeit, einen Permeationsverstärker zuzusetzen.
BEISPIEL 3 [NUR ERLÄUTERND, FÄLLT NICHT IN DEN RAHMEN DER ANMELDUNG]
Materialien und Verfahren. In den Beispielen 3 bis 6 wurden Gruppen männlicher SHR- und WKY-Ratten (200 bis 300 g) bei Leitungswasser und Standardfutter (Harlan-Teklad Inc.) gehalten. In Beispiel 3 wurden Nierenhämodynamik und MAP während intravenöser Bolusinjektion von Tempol in anästhesierten SHR und WKY verglichen. Zur Durchführung dieses Experiments wurden WKY (n=6) und SHR (n=6) mit Thiobutabarbital (100 mg/kg i.p., Inactin, Research Biochemicals International) anästhesiert und bei 37°C auf einem Servo-kontrollierten, gewärmten Nager-Operationstisch gehalten. Mit einer Polyethylen PE-240-Röhre wurde eine Tracheostomie durchgeführt, und in die linke Jugularvene und die Arteria carotis wurde eine PE-50-Röhrenkanüle eingesetzt. Um einen ausgeglichenen Zustand des Gesamtblutvolumens aufrecht zu erhalten, wurde eine intravenöse Infusion von 1% Albumin, gelöst in 0,154 M NaCl-Lösung, mit 2 ml/h i.v. durchgeführt. Es wurde ein Mittellinienschnitt gemacht, und die linke Nierenarterie wurde isoliert. Um die Nierenarterie wurde eine Blutflusssonde gelegt und mit einem Durchgangszeit-Blutströmungs-Messgerät (1RB, Transonic Systems Inc.) verbunden. Wir haben früher gezeigt, dass dieses Verfahren der Messung von Realzeitänderungen des RBF bei Ratten gültig ist (Welch et al., 1995 Am. J. Physiol. 37: F175-F178).
Der MAP wurde aus der Arteria carotis unter Verwendung eines Statham-Druckwandlers (Modell P23, Gould Instruments) und eines MACLab-Datenerfassungsprogramms kontinuierlich aufgezeichnet. Nach 60 Minuten Äquilibrierung gab es einen Basiszeitraum zur Messung von MAP und RBF über 30 Minuten. Dann wurden die MAP- und RBF-Reaktionen auf Tempol bei 24 und 72 μmol/kg i.v. bestimmt.
Statistik. Alle Werte sind als Mittelwert ± SE angegeben. ANOVA wurde verwendet, um die statistische Signifikanz in Gruppe 1 und 2 zu bestimmen. Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz in den Gruppen 3 und 4, in denen der Vergleich auf zwei Beobachtungen beschränkt war, zu bestimmen. P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die verwendeten statistischen Methoden sind dieselben wie für Beispiele 3 bis 6.
Resultate. 1 zeigt den MAP während Grundlinienbedingungen und nach intravenösen Injektionen von Tempol mit 24 und 72 μm/kg in WKY und SHR. Der Grundlinien-MAP war bei SHR im Vergleich zu WKY deutlich erhöht (145 ± 4 vs. 118 ± 3 mm Hg, P<0,05). Tempol in niedriger Dosis (24 μmol/kg IV) hatte bei WKY (114 ± 5 mm Hg) oder SHR (147 ± 4 mm Hg) keine Wirkung. Allerdings normalisierte Tempol in höherer Dosis den MAP der SHR auf den Level der WKY. Tempol (72 μmol/kg IV) senkte den MAP deutlich (P<0,05), und zwar um 11% bei WKY (96 ± 6 mm Hg) und um 38% bei SHR (104 ± 9 mm Hg).
Während der Grundbedingungen und der Infusion von Tempol mit 24 und 72 μmol/kg wurde die Nierenhämodynamik bei WKY und SHR untersucht. Grundlinien-RBF war zwischen den Gruppen ähnlich (WKY, 7,1 ± 0,7; SHR, 6,8 ± 1,0 ml/min) und wurde während der Tempol-Verabreichung nicht beeinflusst (WKY, 6,6 ± 0,7; SHR, 6,7 ± 0,8 ml/min). Dagegen waren die Grundlinien-RVR-Werte bei SHR im Vergleich zu WKY deutlich erhöht (24 ± 3 vs. 17 ± 1 mm Hg·ml^–1·min^–1, P<0,05). Tempol hatte in niedriger Dosis in keiner Gruppe eine Wirkung auf RVR (WKY, 17 ± 1, SHR, 24 ± 3 mm Hg·ml^–1·min^–1). Allerdings normalisierte Tempol in höherer Dosis den RVR-Wert der SHR auf den Level der WKY. Tempol senkte mit 72 μmol/kg die RVR-Werte bei SHR signifikant (P<0,05), nämlich um 29% in SHR (17 ± 2 mm Hg·ml^–1 min^–1), während WKY nur eine minimale Wirkung zeigte (15 ± 1 mm Hg·ml^–1·min^–1).
Frühere Studien, die die Kurzzeitwirkungen von O₂ ^– auf den Blutdruck bei SHR untersuchten, zeigten, dass eine Bolusinjektion eines Xanthinoxidase-Inhibitors zur Blockierung der Bildung von O₂ ^– aus Xanthin oder von CuZn-SOD den MAP bei SHR stark senkte; allerdings wurden keine Resultate für WKY beschrieben (Miyamoto et al., 1996; Nakazono et al. 1991 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 10045-10048). Diese Behandlung korrigiert eine O₂ ^–-Bildung lediglich aus Xanthinoxidase, wohingegen der vorgeschlagene Wirkmechanismus von Tempol als SOD-Mimetikum voraussagt, dass es eine O₂ ^–-Überproduktion aus al len Quellen korrigieren sollte. Darüber hinaus hat es Zugang sowohl zu intra- als auch extrazellulären Stellen und wird daher oxidativen Stress, der intra- oder extrazellulär entsteht, korrigieren. Die meisten anderen Antioxidantien, z.B. Vitamin C und SOD, wirken nur extrazellulär. Daher verglichen wird die Wirkung des Abfangens von O₂ ^– auf den MAP in SHR mit ihrer genetischen Kontrolle WKY. Wir zeigen, dass eine akute Tempol-Verabreichung die Werte für MAP und RVR in SHR auf den Level von WKY normalisierte.
Frühere Studien haben eine Rolle für O₂ ^– in der Aorta und in mesenterischen Arteriolen von SHR entwickelt (Auch-Schwelk et al., 1989 Hypertens. 13: 859-864; Miyamoto et al., 1996; Grunfeld et al., 1995; und Susuki et al., 1995 Hypertens. 25: 1083-1089). Allerdings spielen die Nieren eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Hypertonie. Tempol erweiterte die Gefäße des Nierengefäßsystems bei SHR stärker als bei WKY. Unter Kontrollbedingungen war der RVR-Wert bei SHR deutlich erhöht, und Tempol normalisierte den RVR-Wert bei SHR auf den Level des Wertes von WKY. Da Tempol den MAP ohne Änderung bei RBF reduzierte, war die Nierenvasodilation beeinträchtigt. Die RVR-Reaktion auf Tempol kann das Resultat einer RBF-Autoregulierung sein. Ob Tempol RVR direkt oder indirekt in SHR verringert, bleibt weiter zu klären. Dies ist der erste Beweis, dass der erhöhte renale vaskuläre Widerstand (RVR) eines Hypertonie-Modells (z.B. SHR) durch eine Therapie korrigiert werden kann, die sich auf das Abfangen von intrazellulärem und extrazellulärem O₂ ^– richtet.
BEISPIEL 4 [NUR ERLÄUTERND, FÄLLT NICHT IN DEN RAHMEN DER ANMELDUNG]
Materialien und Verfahren. In Beispiel 4 wurde der MAP während der konstanten intravenösen Infusion von Tempol in anästhesierten SHR und WKY verglichen. Um die Dosis-Antwort-Beziehung für Tempol zu bestimmen, wurde der MAP während der Grundbedingungen und während der intravenösen Infusion von Tempol mit 1, 8, 18, 180 und 1800 μmol·kg^–1·h¹ für 30 Minuten in anästhesierten WKY (n=6) und SHR (n=6) gemessen.
2 veranschaulicht die Dosis-Antwort-Beziehung zwischen Tempol bei 1, 8, 18, 180, 1800 μmol·kg^–1·h^–1 und MAP in WKY und SHR. Der Grundlinien-MAP war bei SHR (166 ± 7 mm Hg) im Vergleich zu WKY (121 ± 4 mm Hg) deutlich (P<0,05) erhöht. Tempol senkte den MAP dosisabhängig in WKY und SHR, wobei SHR eine größere Empfindlichkeit und Ansprechbarkeit auf eine Tempol-Infusion haben. Die höchste Tempol-Dosis (1.800 μmol kg^–1·h^–1) normalisierte den MAP von SHR (72 ± 10 mm Hg) auf den Level desjenigen von WKY (71 ± 3 mm Hg).
BEISPIEL 5 [NUR ERLÄUTERND, FÄLLT NICHT IN DEN RAHMEN DER ANMELDUNG]
Materialien und Verfahren. In Beispiel 5 wurde die Rolle von NO bei der MAP-Reaktion bzw. -Antwort auf eine konstante Tempol-Infusion bei SHR untersucht. Um zu bestimmen, ob O₂ ^– dem MAP durch Wechselwirkung mit dem NO-Weg erhöht, wurde die MAP-Reaktion auf Tempol in anästhesierten SHR (n=6) und in SHR, die mit dem NO-Synthase-Inhibitor L-NAME (11 μmol·kg^–1 ·min^–1, n=5) vorbehandelt worden waren, bestimmt. Um sicherzustellen, dass eine Änderung bei der MAP-Reaktion auf Tempol bei SHR während einer L-NAME-Verabreichung nicht nur Folge einer Erhöhung beim MAP und dem Gefäßtonus war, wurde das Protokoll bei SHR, denen Norepinephrin (31 μmol·kg^–1·min^–1, n=6) durch Infusion verabreicht worden war, wiederholt. In allen Ratten wurde der MAP während Grundbedingungen; während 20-minütiger Vorbehandlung, entweder mit Kochsalzvehikel, L-NAME oder Norepinephrin, und nach 30-minütiger konstanter Tempol-Infusion (180 μmol·kg^–1·h^–1) gemessen.
Resultate. Die prozentuale Änderung beim MAP wurde bei SHR verglichen, die mit isotonischem Kochsalzvehikel (2 ml/h, i.v.) oder dem NO-Synthese-Inhibitor L-NAME (11 μmol·kg^–1 h^–1, i.v.) vorbehandelt worden waren. Wie in der vorherigen Gruppe senkte eine Tempol-Infusion (180 μmol·kg^–1·min^–1) für 30 Minuten den MAP in SHR deutlich, nämlich um 32% (121 ± 17 mm Hg, P<0,05). Im deutlichen Gegensatz dazu hob der NO-Synthese-Inhibitor L-NAME die MAP-Reaktion auf Tempol auf. Eine 20-minütige L-NAME-Infusion alleine erhöhte den MAP um 18% von 158 ± 11 auf 187 ± 8 mm Hg, und MAP blieb während der Tempol-Infusion unverändert (186 ± 4 mm Hg). Zeit-Kontrollstudien in einer getrennten SHR-Gruppe zeigten, dass der MAP während der L-NAME-Infusion konstant blieb (Veränderung beim MAP bei 50 min, 0,3 ± 3,3%; NS).
Um zu untersuchen, dass die Unfähigkeit von Tempol, den MAP bei Ratten mit L-NAME-Infusion zu senken, eine Folge der schweren Vasokonstriktion und Hypertonie war, wurde das Protokoll bei SHR wiederholt, denen Norepinephrin (31 nmol· kg^–1·min^–1) anstelle von L-NAME durch Infusion verabreicht worden war. Norepinephrin erhöhte den MAP um 15%, nämlich von 164 ± 4 auf 188 ± 7 mm Hg. Dies war ähnlich wie die Erhöhung mit L-NAME. Allerdings senkte Tempol den MAP bei SHR, denen eine Norepinephrin-Infusion verabreicht worden war, deutlich, nämlich um 14% (161 ± 7 mm Hg, P<0,05). Zeit-Kontrollstudien in einer getrennten SHR-Gruppe zeigten, dass MAP während einer Norepinephrin-Infusion konstant blieb (Änderung des MAP bei 50 min, 2,0 ± 0,0%; NS).
Daher zeigt dieses Beispiel, dass die antihypertensive Reaktion von NOS abhängen muss, da sie durch NO-Synthese-Inhibierung blockiert wurde. Die intravenöse Infusion von Tempol senkte den MAP in SHR um 32%, und diese Reaktion wird in SHR-Ratten, die mit dem NO-Synthase-Inhibitor L-NAME vorbehandelt worden waren, blockiert. Es wurde auch gezeigt, dass die negative Antwort auf Tempol während L-NAME nicht nur auf einer Erhöhung des systemischen vaskulären Widerstands und des Blutdrucks beruhte, und zwar wegen der MAP-Reaktion auf Tempol bei SHR, die eine Infusion mit Norepinephrin erhalten hatten. Bei SHR, die mit Norepinephrin vorbehandelt worden waren, welches eine ähnliche Erhöhung beim MAP produ zierte, reduzierte Tempol den MAP um 14%. Forscher hatten früher gezeigt, dass Katecholamine, einschließlich Norepinephrin, Antioxidans-Eigenschaften haben. Da Norepinephrin ein Antioxidans ist, würde der Zusatz eines anderen Antioxidans keinen so markanten Effekt haben wie Tempol, das alleine an Ratten verabreicht wird. Aus diesem Grund war Tempol bei der Senkung des MAP in SHR, die mit Norepinephrin behandelt worden waren, weniger wirksam (14%) als in normalen SHR (32%). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass NO eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der antihypertensiven Wirkungen des Abfangens von O₂ ^– spielt.
Es gibt mehrere mögliche zu beachtende Mechanismen, durch welche NO die antihypertensiven Wirkungen von Tempol vermittelt. Erstens, könnte Tempol direkt NO liefern? Dieser mögliche Mechanismus hat sich als unrichtig erwiesen, da Tempol sich nicht zu NO zersetzt (Landino et al., 1996 Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 15069-15074). Zweitens, ein Abfangen von O₂ ^– erhöht die Halbwertszeit von NO. Gryglewski et al. (1986 Nature 320: 454-456) zeigte, dass O₂ ^– beim Abbau von NO zu Peroxynitrit wichtig ist, und Rubanyi et al. (1986) zeigte, dass O₂ ^– NO in Koronararterienringen inaktiviert. Es gibt mehrere mögliche Quellen für O₂ ^–, einschließlich Xanthinoxidase, NADPH-Oxidase, unvollständiger Elektronentransport und sogar Gehirn-NOS (Samuni et al., 1991 Clin. Invest. 1526-1530). Die Quelle für O₂ ^– in dieser Studie bleibt unklar. Da allerdings frühere Studien eine Rolle von O₂ ^–, das aus dem Gefäßsystem freigesetzt wird, in SHR nahelegen, scheint NOS nicht die Hauptquelle für O₂ ^– zu sein. Als Resultat der kräftigen Wechselwirkung zwischen O₂ ^– und NO kann Tempol die Halbwertszeit von NO verlängern und macht es möglich, dass es eine kräftigere vasodilatorische Wirkung ausüben kann. Schließlich kann Tempol durch Blockierung der Bildung von Peroxynitrit die Produktion von Vasokonstriktor-Endoperoxiden, die durch Peroxynitrit in Makrophagen stimuliert werden, inhibieren (Landino et al., 1996). Dennoch ist dies die erste Studie, die zeigt, dass ein Abfangen von O₂ ^– sowohl extrazellulär als auch intrazellulär mit einem membranpermeablen SOD-Mimetikum, wie Tempol, die RVR- und MAP-Werte von SHR normalisiert (siehe Schnackenberg et al., 1998).
BEISPIEL 7 [NUR ERLÄUTERND, FÄLLT NICHT IN DEN RAHMEN DER ANMELDUNG]
Materialien und Verfahren. Gruppen männlicher SHR- und WKY-Ratten (250 ± 10 g) wurden bei Leitungswasser und Standardfutter (Ralston-Purina Co., Natriumgehalt 0,3 g/100 g) gehalten. Die Ratten wurden in vier Gruppen eingeteilt: WKY, denen Vehikel gegeben wurde, (n=7), SHR, denen Vehikel gegeben wurde, (n=8), WKY, denen Tempol gegeben wurde, (n=6), und SHR, denen Tempol gegeben wurde, (n=8). Tempol ist in Wasser leicht löslich und wurde zwei Wochen lang im Trinkwasser verabreicht (1 mM). Nach Verabreichung von Kontrolle oder Tempol wurden die Ratten für 24 Stunden in Stoffwechselkäfigen gehalten. Urin wurde in Behältern mit 10 μl 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTR) gesammelt, um eine ex vivo-Produktion von 8-Isoprostaglandin F_2α (8-ISO) zu verhindern. Urin wurde 10 min lang bei 4°C mit 1.000 UpM zentrifugiert und bis zur Analyse in Aliquots bei –80°C gelagert.
Danach wurden WKY und SHR mit Thiobutabarbital (100 mg/kg, i.p., Inactin, Research Biochemicals International) anästhesiert und auf einem Servo-kontrollierten, erwärmten Nager-Operationstisch bei 37°C gehalten. Es wurde eine Tracheostomie mit einem Polyethylen PE-240-Röhrchen durchgeführt, und in die linke Jugularvene und in die Arteria carotis wurde eine Kanüle aus PE-50-Röhrchen bzw. -Schlauch eingesetzt. Eine 1% Albuminlösung wurde in 0,154 M NaCl mit 2 ml/h, i.v., infundiert, um den ausgeglichenen Zustand des Gesamtblutvolumens aufrecht zu erhalten. Es wurde ein Mittellinienschnitt durchgeführt, und die linke Nierenarterie wurde isoliert. Eine Blutstromsonde wurde um die Nierenarterie gelegt und an ein Durchgangszeit-Blutfluss-Messgerät (IRB, Transonic Systems, Inc.) angeschlossen. Wir haben vorher gezeigt, dass dieses Verfahren der Messung der Realzeitänderungen im Nierenblutfluss (RBF) bei Ratten gültig ist. Der mittlere arterielle Druck (MAP) und die Herzfrequenz (HR) wurden unter Verwendung eines Statham-Druckwandlers (Modell P23, Gould Instruments) und MACLab-Datenerfassungsprogramms für die Arteria carotis kontinuierlich aufgezeichnet. Die glomeruläre Filtrationsrate (DFR) wurde aus der Clearance von [³H]-Inulin bestimmt. Nach Operation und einem 60-minütigen Äquilibrierungszeitraum wurden MAP, HR, GFR und RBF über 30 Minuten gemessen, und die Daten wurden gemittelt.
Statistik. Alle Werte sind Mittelwerte ± SE. ANOVA wurde verwendet, um die statistische Signifikanz in Gruppe 1 und 2 zu bestimmen. Der Student-t-Test wurde eingesetzt, um die Signifikanz in Gruppe 3 und 4 zu bestimmen, in denen der Vergleich auf zwei Beobachtungen beschränkt war. P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Resultate. Ratten, die bei Tempol, das in Trinkwasser gegeben wurde, 2 Wochen lang gehalten worden waren, hatten einen ähnlichen Nahrungsverzehr wie Kontrollratten, die nur Trinkwasser erhielten. Es gab keine signifikante Differenz zwischen der Nahrungsaufnahme (Kontrolle: 25 ± 1 vs. Tempol: 24 ± 1 g/Tag) oder bei der Körpergewichtszunahme (Kontrolle: 69 ± 4 vs. Tempol: 66 ± 3 g/14 Tage), allerdings war die Wasseraufnahme bei den mit Tempol behandelten Gruppen mäßig erhöht (Kontrolle: 34 ± 2 vs. Tempol: 43 ± 3 ml/Tag, p<0,05). Die Wasseraufnahme war bei Tempol-behandelten WKY und SHR gleichermaßen erhöht.
Der mittlere arterielle Druck in WKY und SHR ist in 4 dargestellt. Unter normalen Bedingungen war der MAP bei SHR im Vergleich zu WKY um 41% erhöht (SHR: 162 ± 8 vs. WKY: 115 ± 5 mm Hg, p<0,001). Nach zweiwöchiger Tempol-Verabreichung war der MAP bei SHR auf einen Wert reduziert, der sich nicht signifikant von dem bei WKY unterschied (SHR 134 ± 6 vs. WKY: 118 ± 7 mm Hg). Der MAP bei SHR, denen Tempol gegeben wurde, war im Vergleich zu normalen SHR deutlich niedriger, nämlich um 18%. Eine Varianzanalyse zeigte, dass Tempol den MAP in SHR spezifisch und deutlich senkte (p<0,05). Die Herzfrequenz war bei SHR (420 ± 6 Schläge/min) im Vergleich zu WKY (374 ± 9 Schläge/min) unter Kontrollbedingungen erhöht (p<0,001) und wurde durch Tempol nicht verändert (SHR: 414 ± 9 vs. WKY: 373 ± 8 Schläge/min). Eine zweiwöchige Verabreichung von Tempol im Trinkwasser (1 mM) an SHR (n=8) senkte den MAP um 18% (162 ± 8 auf 134 ± 6 mm Hg, p<0,05), erhöhte den GFR-Wert um 17 (1,6 ± 0,2 auf 1,9 ± 0,3 ml/min) und senkte UV8-ISO um 39% (9,8 ± 0,7 auf 6,0 ± 0,7 ng/24 h, p<0,05).
TABELLE 5
Tabelle 5 zeigt die Nierenhämodynamik und die Ausscheidungsfunktion unter Normalbedingungen und nach zweiwöchiger Tempol-Verabreichung im Trinkwasser. Unter normalen Bedingungen war der RBF-Wert von SHR um 34% gesenkt (SHR: 5,8 ± 0,6 vs. WKY: 8,8 ± 0,7 ml/min, p<0,01), der GFR-Wert war um 47% gesenkt (SHR: 1,6 ± 0,2 vs. WKY: 3,0 ± 0,4 ml/min, p<0,05) und der RVR-Wert war um 117% erhöht (SHR: 29,4 ± 2,7 vs. WKY: 13,5 ± 1,0 mm Hg/ml/min, p<0,001). Nach zweiwöchiger Tempol-Verabreichung gab es keine signifikanten Veränderungen bei der Nierenhämodynamik von SHR, obgleich es Tendenzen zu einer Senkung des RVR-Werts (16%) und einer Erhöhung des GFR-Werts (17%) gab, so dass nicht länger eine signifikante Differenz beim GFR-Wert zwischen SHR und WKY bestand. Tempol hatte bei WKY keine deutlichen Wirkungen auf die Nierenhämodynamik. Die Nierenausscheidungsfunktion war unter Kontrollbedingungen oder Tempol-Verabreichung zwischen WKY und SHR nicht signifikant verschieden.
Dieses Beispiel beweist, dass eine längere orale Tempol-Therapie den BP in einem Ratten-Modell für essentielle Hypertonie selektiv senkt, aber keine Wirkung auf die WKY-Kontrollratten hat. Von Bedeutung ist, dass der Marker der O₂ ^–-Bildung (z.B. Ausscheidung von 8-ISO) im SHR-Modell erhöht war, Tempol diesen über den zweiwöchigen Zeitraum seiner Verabreichung selektiv auf den Wert reduzierte, der bei den WKY-Kontrollratten beobachtet wurde. Dies ist der erste Beweis, dass eine Steady-State-Verabreichung eines Agenses (z.B. Tempol) Hypertonie selektiv in einem Modell für humane essentielle Hypertonie korrigieren kann. Es wird eine starke rationale Basis für diese Therapieformen bei humaner essentieller Hypertonie bereitgestellt.
In unseren Untersuchungen des Ratten-Modells für milde/moderate essentielle Hypertonie (z.B. die SHR-Ratte) wurde ein erhöhter ROS-Wert detektiert. Es ist wahrscheinlich, dass ROS stärker und ROS umgekehrt wichtiger und dringlicher in schwereren Formen der Hypertonie, z.B. beschleunigter, Arzneimittel-resistenter oder maligner Hypertonie, oder bei hypertensiven Nöten, Notfällen und Krisen ist. Daher können die schwereren Formen der Hypertonie, die oft von einer Dysfunktion des Herzens oder Gehirns begleitet sind, die Hypertonieformen sein, die durch Tempol-enthaltende Zusammensetzungen am besten behandelt werden können.
Die Erfindung wird nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.

Claims

Verwendung einer blutdrucksenkend wirksamen Menge von Tempol in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der essentiellen Hypertonie.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung oral zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung transdermal zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Zusammensetzung als Pflaster zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung parenteral zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung intravenös zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Tempol so formuliert ist, dass etwa 200 mg pro Quadratzentimeter des Pflasters zur Verfügung gestellt werden.
Verwendung einer blutdrucksenkend wirksamen Menge von 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidin-1-oxyl zur Herstellung eines Medikaments zum Absenken des Blutdrucks eines Patienten mit essentieller Hypertonie.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidin-1-oxyl zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zu verabreichen ist.