CZ20023348A3

CZ20023348A3 - Kompozice obsahující blokátory přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách pro léčbu Parkinsonovy nemoci

Info

Publication number: CZ20023348A3
Application number: CZ20023348A
Authority: CZ
Inventors: Patricio Soares-Da-Silva
Original assignee: Portela & Companhia S. A.
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2003-02-12
Also published as: ES2228858T3; SI1267853T1; HUP0300130A3; RU2266111C2; WO2001068065A3; GB0006063D0; JP2003526658A; DE60105401D1; KR100738746B1; EP1267853B1; GB2348371B; DK1267853T3; KR20030095184A; AU5828301A; PL359327A1; TR200402661T4; HUP0300130A2; CA2402712A1; CA2402712C; CN1429109A

Description

Kompozice obsahující blokátory přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách pro léčbu Parkinsonovy nemoci ~řl/

Oblast techniky

Vynález se týká kompozicí pro použití při léčbě Parkinsonovy nemoci. Týká se zejména použití blokátorů vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách jako složek uvedených sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Parkinsonova nemoc (PD) je chronické neurodegenerativní onemocnění neznámé etiologie postihující z velké části mozkové dopaminergní neurony vznikající v Substantia Nigra a vstupující do Striatum. PD pacienti vykazují klinicky postupné zhoršování motoriky, které se většinou projevuje třesem, ztuhlostí a abnormální chůzí. Jednici postižení PD vykazují výrazné zlepšení motoriky po aplikaci L-DOPA, prekurzoru mozkového neurotransmiteru dopaminu a karbidopa nebo benserazidu. Poslední uvedené sloučeniny jsou silnými inhibitory periferální dekarboxylázy aromatických L-aminokyselin (AADC) a jejich aplikace ruší přeměnu L-DOPA na dopamin v periferálních tkáních, proto prevence před nepříznivými defekty se týká působení dopaminu v periferálních orgánech (kardiovaskulárních a gastrointestinálních). Inhibice periferální AADC je též spojena s biologickou dostupností L-DOPA, což se odrazí v účinnějším doplňování zásoby dopaminu v nepostižených mozkových dopaminergních neuronech.

Relativně krátký poločas L-DOPA je však omezující při léčbě PD pacientů vyžadující aplikaci několikanásobných dávek L-DOPA. Z těchto důvodů se objevily nedávno dostupné formulace L-DOPA s postupným uvolňováním za účelem zlepšení průběhu vylučování a snížení počtu denních dávek. Úspěch této strategie je stále omezený, protože cirkulující L-DOPA se rychle vylučuje do moče, tento způsob vylučování je převládající. Ačkoli má L-DOPA vyskytující se v moči svůj původ v přefiltrovaném L-DOPA, je známo, že významné množství filtrovaného L-DOPA je reabsorbováno v neuronech pomocí aminokyselinových přenašečů závislých i nezávislých na sodíku; na úrovni proximálních tubulů může být absorbovaný L-DOPA snadno přeměněn na dopamin. U DP pacientů, kterým je podáván AADC inhibitor, je přeměna L-DOPA na dopamin v ledvinových proximálních tubulech blokována a ·· » · předpokládá se, že většina intracelulárního L-DOPA opouští buňku přes apikální část buněčné stěny. Jedná se o transportní systém zprostředkovaný nosičem, jehož inhibice může vést k významné akumulaci L-DOPA v intracelulárním prostoru.

U tohoto vnějšího tubulárního přenosového systému L-DOPA byla zjištěna citlivost na cyklosporin A (Pestana a kol., 1995, Br. J. Pharmacol. 115, 1349-1358) a podle dalších zjištění se předpokládá, že P-glykoprotein je zahrnut ve vnějším přenosu L-DOPA (Soares-da-Silva, a kol., 1998, Br. J. Pharmacol. 123, 13-22; Soares-da-Silva & Serrao, 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther. 293, 697-704). Poněvadž hlavní problém při léčbě PD pomocí L-DOPA se týká krátkého poločasu a snížené biologické dostupnosti (Cederbaum, 1989, Clin. Neuropharmacol. 12, 147-166; Koller & Tolosa, 1998, Neurology, 50 (dodatek č. 6), S1-S48), předpokládalo se, že inhibitory ledvinového tubulárního apikálního vnějšího přenosového systému LDOPA (který podporoval vylučování ledvinami) mohou snižovat vlastní vylučování močí a zvyšovat biologickou dostupnost. To by podporovalo přenos L-DOPA z tubulárního epitelia do ledvinových skulin a pak zpět do oběhu. Většina Pglykoproteinových inhibitorů, které mohou prověřit výhodu biologické dostupnosti LDOPA u PD pacientů, jsou bohužel obecně známy jako cytotoxické látky nebo pokud nejsou toxické, podmínky dosažení požadované koncentrace k dosažení inhibice Pglykoproteinu jsou prakticky neproveditelné v podmínkách in vivo.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je proto poskytnout sloučeniny k léčbě Parkinsonovy nemoci, které obsahují sloučeniny účinné při snížení vylučování L-DOPA ledvinami. Dalším úkolem vynálezu je též použití alespoň jedné z uvedených sloučenin pro přípravu léku pro léčbu PD s následnou nebo současnou aplikací L-DOPA.

Vynález tak uvádí sloučeniny pro léčbu Parkinsonovy nemoci, které jsou vybrány ze skupiny fenylbenzopyranových derivátů, trans-stilbenových derivátů nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pro blokaci vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách, který zvyšuje biologickou dostupnost L-DOPA v mozku. S výhodou fenylbenzopyranové deriváty obsahují flavonoidovou sloučeninu, která má výhodněji má obecný vzorec:

• · · 4

kde skupiny X jsou shodné nebo odlišné a představují H nebo OH, skupiny Y jsou shodné nebo odlišné a představují H nebo OR, kde R představuje H, CH3 a CH2fenyl, včetně odpovídajících derivátů 3-C6Hs(Y4).

Dále kompozice podle vynálezu s výhodou obsahují trans-stilbenové deriváty, které mají obecný vzorec:

kde skupiny X jsou shodné nebo odlišné a jsou H nebo OH.

Kompozice podle vynálezu nejvýhodněji obsahuje blokující sloučeniny vybrané ze skupiny obsahující:

5.7- dihydroxy-2-(4-methoxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (akacetin),

5.7- dihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (apigenin),

5.6.7- trihydroxy-2-fenyl-4H-1 -benzopyran-4-on (baikalein),

5.7- dihydroxy-2-fenyl-4H-1 -benzopyran-4-on (chrysin), ([2R, 3R])-2-[3,4-dihydroxyfenyl]-3,4-dihydro-1[2H]benzopyran-3,5,7-triol, ((-)-epikatechin]), 2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (fisetin),

5.7- dihydroxy-3-(4-hydroxyfenyl)-4H-1 -benzopyran-4-on (genistein),

3.5.7- trihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (kaempferol),

2- (2,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-benzopyran-4-on (morin),

3.5.7- trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (myricetin),

3- (4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanon (floretin),

2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (quercetin), 2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,6,7-tetrahydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (quercetagetin), 4‘-benzyloxy-3‘,5‘-dimethoxy-3,5,7-trihydroxyflavon,

3,7-dihydroxy-3',4,5‘-trimethoxyflavon, 3‘,4‘,7,8-tetrahydroxyflavon,

3_;5,7-trihydroxy-3'4‘5‘-trimethoxyflavon, 3,3', 4, 5‘-tetrahydroxy-trans-stilben (piceatannol), trans-4-styrylfenol a 3,4‘,5-trihydroxy-trans-stilben (resveratrol).

Kompozice podle vynálezu s výhodou obsahuje resveratrol.

Kompozice podle vynálezu může dále obsahovat inhibitor enzymu dekarboxylázy aminokyselin a/nebo inhibitor enzymu katechol-o-methyltransferázy, s tím že uvedený inhibitor dekarboxylázy aminokyselin s výhodou obsahuje benserazid nebo karbidopa a uvedený inhibitor enzymu katechol-o— methyltransferázy obsahuje entakapon nebo tolkapon.

Kompozice podle vynálezu může také obsahovat inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče.

Jiným předmětem vynálezu je použití alespoň jednoho blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA ledvinovými buňkami pro přípravu léku pro léčbu nebo prevenci Parkinsonovy nemoci nebo onemocnění motoriky za následné nebo současné aplikaci L-DOPA. Vynález tak uvádí použití alespoň jednoho blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA v kombinaci s L-DOPA pro přípravu látky pro léčbu Parkinsonovy nemoci.

Dalším předmětem vynálezu je alespoň jeden blokátor vnějšího přenosu L— DOPA v ledvinových buňkách vybraný ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1-(2,4,6trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pro použití při léčbě v kombinaci s následnou nebo současnou aplikací L-DOPA.

Dalším předmětem vynálezu je použití alespoň jednoho blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA ledvinové buňky vybrané ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1-(2,4,6trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pro přípravu léčiva pro léčbu nebo prevenci stavů zhoršení kterékoli formy Parkinsonovy nemoci s následnou nebo současnou aplikací L-DOPA. Dále se tyto blokátory používají pro výrobu léčiva pro léčbu pohybových onemocnění modifikací vlastní aktivity nigrostriatální cesty nebo pro léčbu Parkinsonovy nemoci blokací periferální dekarboxylace s následnou nebo ··*· současnou aplikací L-DOPA. Množství sloučeniny blokátoru podle vynálezu v jedné dávce je s výhodou přibližně 40 až 30 000 pg/kg.

Dále je možná současná nebo následná aplikace inhibitoru dekarboxylázy aminokyselin nebo inhibitoru katechol-o-methyltransferázy, přičemž inhibitor dekarboxylázy s výhodou obsahuje benserazid nebo karbidopa a inhibitor methyltransferázy s výhodou obsahuje entakapon nebo tolkapon.

V souladu s dalším hlediskem vynálezu je předmětem způsob léčby Parkinsonovy nemoci zahrnující aplikaci terapeuticky účinného množství sloučeniny pro blokaci vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách savci vyžadujícímu tuto léčbu s následnou nebo současnou kombinací L-DOPA.

V souladu s dalším předmětem vynálezu se navíc uvádí způsob kontroly motoriky pacientů s Parkinsonovou nemocí, kdy se podává terapeuticky účinné množství sloučeniny L-DOPA blokující vnější přenos v ledvinových buňkách pro zvýšení biologické dostupnosti nebo se následně nebo současně aplikuje L-DOPA do mozku a kontroluje se motorika.

Uvedená blokující sloučenina je vybrána ze sloučenin popsaných výše.

Vynález též také uvádí způsob zvýšení hladiny aplikovaného L-DOPA v oběhu u savců a zvýšení biologické dostupnosti L-DOPA v mozku, způsob zahrnuje aplikaci účinného množství alespoň jedné ze sloučenin uvedené výše jako blokátoru savci s následnou nebo současnou kombinaci s L-DOPA.

Navíc kromě inhibice vnějšího apikálního přenosu L-DOPA tubulárními ledvinovými buňkami popsané blokující sloučeniny též současně inhibují periferální AADC. Sloučeniny zvyšují hladinu aplikovaného L-DOPA v plazmě, inhibují AADC v periferálním oběhu a zvyšují biologickou dostupnost aplikovaného L-DOPA v mozku.

Způsob podle vynálezu dále výhodně zahrnuje aplikaci známých inhibitorů AADC (jako například benserazidu nebo karbidopa) nebo katechol-omethyltransferázy (jako například entacaponu nebo tolkaponu), následně nebo současně s jinou aktivní sloučeninou. S aktivní sloučeninou se navíc smíchají inertní farmaceuticky přijatelné nosiče. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou být pevné nebo kapalné. Pevné přípravky zahrnují prášky, tablety, dispersibilní zrna nebo kapsle. Pevný nosič může být ve formě jedné nebo více látek, které mohou působit též jako ředidla, aromatické látky, rozpouštědla, lubrikanty, suspendující látky, nosiče nebo tablety desintegrující látky; mohou to být též opouzdřující látky.

Farmaceutický přípravek je s výhodou v jednotkové dávkové formě, například jako balený přípravek, balení obsahuje samostatné množství přípravku, jako například balené tablety, tobolky a prášky v tobolkách nebo ampulích.

Dávkování se může lišit v závislosti na požadavcích pacienta, míře onemocnění a aplikované sloučenině. Celková denní dávka může být s výhodou rozdělena a aplikovaná po částech během dne. Stanovení správné dávky pro určitý případ je známo odborníkům v oboru zdravotnictví, ale s výhodou se pohybuje v rozmezí 40 μρ až 30 000 μρ/kg pro léčbu v případě uvedených blokujících sloučenin.

Popis obrázků

Následně jsou detailně popsána výhodná provedení pouze na základě příkladů a s odkazem na přiložené obrázky, kde:

Obr. 1 je graf znázorňující účinek testovaných sloučenin na hromadění LDOPA v LLC-PK1 buňkách inkubovaných 6 minut při 37 °C s 2,5 μΜ substrátem (LDOPA).

Obr. 2 je sloupcový graf zobrazující účinek testované sloučeniny na apikální tok (obr. 2a) a buněčnou akumulaci L-DOPA v LLC-PK buňkách (obr. 2b) inkubovaných 6 minut při 37 °C s 25 μΜ substrátem (L-DOPA) aplikovaným z bazolaterální buněčné stěny.

Obr. 3 je graf zobrazující účinek testovaných sloučenin na dekarboxylaci LDOPA u LL-PK1 buněk) inkubovaných 6 minut při 37 °C s 250 μΜ substrátem (LDOPA).

Obr.4 je graf zobrazující účinek zvyšujících se koncentrací benserazidu v mozku, aktivitu dekarboxylázy aromatické L-aminokyseliny (AADC) v játrech a ledvinách měřenou za podmínek V_max (5 mM L-DOPA; 15 min. inkubace).

Obr. 5 je graf zobrazující účinek resveratrolu na hladinu L-DOPA v plazmě krys při aplikaci L-DOPA (12 mg/kg), benserazidu (3 mg/kg) a resveratrolu.

♦ • · · · ·» .Ϊ • · <·

•. · • · • · ·· ·«··♦

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Studie in vitro

Použila se buněčná kultura buněčné linie LLC-PKi buněk odvozená od prasečích epiteliálních buněk proximálních ledvinových tubulů zachovávající si •

některé vlastnosti kultury proximálních tubulárních epiteliálních buněk (Hulí, R.N., a a ’··’· kol., 1976, In Vitro 12, 670-677), získaná z American Type Cell Cultrure Collection :···· (Rockville, MD). Buňky LLC-PKi (ATCC CRL 1392; strany 198-206) se uchovávaly . .

ve zvlhčené atmosféře 5%CO2-95% vzduch při 37 °C rostoucí v mediu 199 (Sigma •

Chemical Company, St. Louis, Mo, USA) s přídavkem penicilinu G 100 U/ml, 0,25 ·’’* pg/ml amfotericinu B, 100 gg/ml streptomycinu (Sigma), 3% fetálního hovězího séra • · · · (Sigma) a 25 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfonové kyseliny (HEPES; ·«. * Sigma). Pro vytvoření subkultury se buňky smíchaly s 0,05% trypsin-EDTA, zředily 1:4 a vytvořila se subkultura v Costarově nádobě s 75 - nebo 162- cm² rostoucích ploch (Costar, Badhoevedorp, Nizozemí). Pro studium buněčného růstu se buňky nanesly do kolagenem potažených 24 jamkových plastikových destiček (vnitřní průměr 16 mm, Costar) o hustotě 40 000 buněk na jamku nebo do kolagenem potažených 0,2 μιη polykarbonátových filtrů (vnitřní průměr 12 mm, Tranwell,

Costar) o hustotě 13 000 buněk na jamku (2,0 x 10⁴ buněk na cm²). Buněčné medium se měnilo každé 2 dny, buňky dosáhly shloučení po 3-5 dnech inkubace. Po dobu 24 hodin před každým pokusem buněčné medium neobsahovalo fetální hovězí sérum. Pokusy se obecně prováděly za 2-3 dny po dosažení shluknutí a 6-8 dnů po prvotním nasazení a každý cm² obsahoval přibližně 80 μg buněčných proteinů.

Transportní studie u LLC-PKi buněk

V den pokusu se růstové médium odsálo, buňky se promyly Hanksovým médiem a monovrstva buněk se preinkubovala 15 min. v Hanksově médiu při 37 °C. Hanksovo médium mělo následující složení (mM): NaCl 137, Kel 5, MgSO₄ 0,8, Na₂HPO₄ 0,33, KH₂PO₄ 0,44, CaCI₂0,25, MgCI₂ 1,0, Tris HCI 0,15 a butyrát sodný 1,0, pH=7,4. Inkubační médium též obsahovalo benserazid (1μΜ) a tolkapon (1μΜ) pro inhibici enzymu AADC a respektive katechol-o-methyltransferázy. Časové studie ·<*· » · · ··» * · 9 9 • *· ♦ » ί· · ··· · ·2 • ··· ··· · J··· |·* : ·%···♦ se prováděly u pokusů, kdy se buňky inkubovaly s 0,5 μΜ substrátem po dobu 1, 3, 6 a 12 minut. Saturační pokusy se prováděly u buněk inkubovaných 6 minut se zvyšujícími se koncentracemi L-DOPA (2,5 až 250 μΜ). Látky se aplikovaly pouze ze strany výběžku a působily po dobu preinkubace a inkubace. Po dobu preinkubace a inkubace se buňky průběžně třepaly a udržovaly při 37 °C. Přísun ze strany výběžku byl zahájen přídavkem 2 ml Hanksova média s danou koncentrací substrátu. Přísun byl zastaven rychlým odstraněním roztoku pomocí vakuové pumpy připojené na •

Pasteurovu pipetu a následně rychlým promytím chladným Hanksovým médiem a přídavkem 250 μΙ 0,2 mM kyseliny chloristé. Okyselený vzorek se uchovával při 4 °C před aplikací na vysokotlakou kapalinovou chromatografii pro stanovení L-DOPA. :

•

Předchozí studie ukázaly, že část L-DOPA nahromaděného vLLC-PKi · buňkách může opustit buňku přes vnější apikální buněčného(é) přenašeč(e) (Soaresda-Silva a kol., 1998, Am. J. Physiol. 274, F243-F251), jejichž inhibice vede ke •

zvýšení buněčné akumulace L-DOPA (Soares-da-Siiva a kol., 1998, Br. J. · Pharmacol. 123, 13-22). Pokusy byly proto navrženy pro studium účinků léčiv, které zvyšují intracelulární akumulaci L-DOPA, buňky se inkubovaly s 25 μΜ L-DOPA aplikovaným přes bazální buněčnou membránu a zvýšení množství (akumulace v buněčné monovrstvě) a tok (přenos do protějšího prostoru) se měřil v intervalu 6 min. Látky se aplikovaly pouze z apikální strany a působily po dobu preinkubace a inkubace. Na konci inkubace se buňky umístily na led a médium omývající apikální okraj buňky se odstranilo, prostředí se okyselilo kyselinou chloristou a buňky se uchovaly při 4 °C před měřením L-DOPA. Buňky se promyly ledem zchlazeným Hanksovým médiem a přidala se 0,2 mM kyselina chloristá (respektive 100 μΙ a 500 μΙ v horní a spodní komůrce); okyselené vzorky se uchovaly při 4 °C před aplikací na vysokotlakou kapalinovou chromatografii pro stanovení L-DOPA.

Dekarboxylační studie

V den pokusu se růstové médium odsálo, buňky (LLC-PK^ se promyly Hanksovým médiem a monovrstva buněk se preinkubovala 15 min. v Hanksově médiu při 37 °C. Hansovo médium mělo následující složení (mM): NaCI 137, Kel 5, MgSO₄ 0,8, Na₂HPO₄ 0,33, KH₂PO₄ 0,44, CaCI₂ 0,25, MgCI₂ 1,0, Tris Hel 0,15 a butyrát sodný 1,0, pH=7,4. Inkubační médium též obsahovalo pyridoxalfosfát (120 μΜ), tolkapon (1μΜ) a pargylin (100 μΜ). Saturační pokusy se prováděly u buněk .{ ··*· • ♦ •V· • · • · t*.

·* ·· • 9 9 ·· Ϊ ·* ·* ·♦· · * ·♦ *9 99· inkubovaných 6 minut se zvyšujícími se koncentracemi L-DOPA (2,5 až 250 μΜ).

V pokusu navrženém jako studium účinků testovaných sloučenin na dekarboxylaci LDOPA se buňky preinkubovaly 30 min v přítomnosti testovaných sloučenin. Po preinkubaci se buňky inkubovaly 6 min v Hanksově médiu s 250 μΜ L-DOPA.

Reakce se zastavila přídavkem 250 μΙ 0,2 mM kyseliny chloristé a okyselené vzorky se uchovaly při 4 °C před aplikací na vysokotlakou chromatografii pro stanovení dopaminu. .· ;

• · · • · · · • · ······

Buněčná životaschopnost * ,

Buněčné kultury v plastických nádobkách se preinkubovaly 15 minut při 37 °C •

a pak se inkubovaly za nepřítomnosti nebo přítomnosti L-DOPA a testovaných #”**;

• · · · sloučenin po dobu dalších 6 min. Následně se buňky inkubovaly 2 minuty při 37 °C • · · ♦ stryfanovou modří (0,2 hmotnostních procent) ve fosfátovém pufru. Inkubace se • · zastavila dvojnásobným promytím buněk v Hanksově médiu a buňky se sledovaly ·*·. * pod mikroskopem Leica. Za těchto podmínek více než 95% buněk nepropustilo barvivo.

Studie in vivo

Tyto pokusy byly navrženy pro zjištění účinků testovaných sloučenin na biologickou dostupnost a přístup L-DOPA v mozku. Ve všech pokusech se použili samci krys Wistar o hmotnosti 170-280 g chovány po dvou v kleci za kontrolovaných podmínek prostředí (cyklus 12 h světlo/tma a teplotě 24 °C). Ve stanovených intervalech se krysy usmrtily dekapitací, jejich mozky, játra a ledviny se odstranily a použily se ke stanovení L-DOPA, dopaminu a DOPAC.

Stanovení AADC v tkáních krys

U některých pokusů se aktivita AADC stanovila v mozku, játrech a ledvinách za podmínek V_max (5 mM L-DOPA; 15 min. inkubace), jak bylo popsáno výše (Soares-de-Silva a kol., 1994, Br. J. Pharmacol. 112, 611-615). Reakce se zastavila přídavkem 500 μΙ 2M kyseliny chloristé a vzorky se uchovaly 60 min. při 4 °C. Vzorky se pak zcentrifugovaly (200 g, 2 min., 4 °C) a 500 μΙ alikvotu supernatantu přefiltrovaného ve filtračních zkumavkách Spin-X (Costar) se použilo pro stanovení dopaminu.

» • ♦» v» w •i ·· «« * »· ·».*.·* *

Stanovení L-DOPA, dopaminu a aminových metabolitů

Množství L-DOPA, dopaminu a aminometabolitů (DOPAC a HVA) se stanovila pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí, jak bylo •

uvedeno dříve (Soares-da Silvaa Garrett, 1990, Neuropharmacol. 29, 869-874; Soares-da-Silva a kol. 1998, Am. J. Physiol. 274, F243-F251). Systém vysokotlaké : kapalinové chromatografie obsahoval pumpu (model Gilson 302; Gilson Medical

Electronics, Villiers le Bel, France) připojenou na manometrický modul (model Gilson ‘ •

802 C) a 5 pm ODS kolonu z nerez oceli (Biophase; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) délky 25 cm; vzorky se injekčně aplikovaly pomocí automatického :

injekčního aplikátoru vzorků (model Gilson 234) napojeného na ředící zařízení Gilson · (model 401). Mobilní fází byla odplyněný roztok kyseliny citrónové (0,1 mM), oktylsulfát sodný (0,5 mM), octan sodný (0,1 M), EDTA (0,17 mM), dibutylamin (1 mM) a methanol (8 objemových procent), upravený na pH 3,5 kyselinou chloristou (2 M) a pumpována rychlostí 1,0 ml min'¹ . detekce se prováděla elektrochemicky skleněnou uhlíkovou elektrodou Ag/AgCI referenční elektrodou a amperometrickým detektorem (Gilson model 141); detekční buňka pracovala při 0,75 V. Aktuální výsledky byly monitorovány pomocí HPLC softwaru Gilson 712. Nižší hranice detekce L-DOPA, dopaminu, DOPAC, 3-MT a HVA se pohybovaly v rozmezí 350 až 500 fmol.

Analýza dat

Hodnoty Km a V_max pro zvýšení L-DOPA, jak byly uvedeny v příkladech na saturaci, se vypočetly pomocí nelineární regresní analýzy za použití GraphPad Prism softwarového souboru pro statistiku (Motulsky, P.Spannard, R. Neubig. GraphPad Prism (verze 1,0). San Diego, USA: GraphPad Prism Software lne., 1994).

Frakční výběžkový tok se vypočetl za použití exprese

L-DOPA^{apikalní 1ok} / (DOPA^apikálnitok + L-DOPA^{V buňce})

• · (

• * ···· kde DOPA^{apiká,ní tok} značí množství L-DOPA (v nmol/mg proteinu) které dosahuje apikální prostor a L-DOPA^{7 bunce} (v nmol/mg proteinu) značí množství L-DOPA akumulovaného v monovrstvě buněk.

Aritmetické průměry jsou uvedeny za použití rastrovací elektronové mikroskopie. Statistická analýza se prováděla jednosměrnou analýzou odchylky (ANOVA) a následně Newman-Keuls testem pro mnohočetné srovnání. Hodnoty P _t .

• · nižší než 0,05 se považovala za statisticky nevýznamné. •./.i

Výsledky

Akumulace nesaturující koncentrace L-DOPA (0,5 μΜ) v době pokusu se lineárně zvyšovala po dobu několika minut. Po 6. Minutě inkubace, kdy byl nárůst lineární v čase vezmeme-li v úvahu intracelulární vodu 7,0 ± 0,7 μΙ/mg proteinu (Soares-da-Silva a kol.m, 1998, Am. J. Physiol. 274, F243-F251) byla intracelulární koncentrace L-DOPA 4,0 ± 0,4 μΜ při koncentraci média 0,5 μΜ. To představovalo buněčnou koncentraci L-DOPA 8,0 ± 0,8 krát vyšší než odpovídající koncentrace média. V pokusech navržených pro stanovení kinetických parametrů apikálního přenašeče L-DOPA se buňky inkubovaly 6 minut se zvyšující se koncentrací (1 až 250 μΜ) substrátu. Nelineární analýzou saturační křivky L-DOPA se získala hodnota Km (v μΜ) 47 ± 8 a hodnota V_max (v pmol mg proteinu/6 minut) 3069 ± 224.

Ke zhodnocení metabolických požadavků pro L-DOPA se buňky inkubovaly při 4 °C. Účinek snižování teploty z 37 °C na 4 °C během preinkubace a inkubace vedl k významnému snížení (77 ± 2%) akumulace L-DOPA (2,5 μΜ).

Snížení extracelulárního sodíku (ze 140 mM na 70,35 a 0 mM) nemá vliv na akumulaci L-DOPA. Navíc v nepřítomnosti extracelulárního sodíku (nahrazeného ekvimolární koncentrací cholinu), byly hodnoty Km a Kmax u L-DOPA podobné zjištěným za přítomnosti sodíku. N-(methylamino)-izobutyrová kyselina (MeAlB) neprokázala účinek na zvýšení L-DOPA, zatímco 2-aminobicyklo(2,2,1)-hepten-2karboxylová kyselina (BHC) způsobila na koncentraci závislou inhibici zvyšování LDOPA (IC50 = 407 μΜ). Inhibiční účinek 1 mM BHC na akumulaci L-DOPA byl kompetitivního typu, jak je zřejmé ze zvýšení Km (130 ± 19 μΜ), ale ne hodnot V_max (3783 ± 244 pmol/mg proteinu/6 min). V souhrnu, výsledky předpokládají, že apikální vnitřní transport L-DOPA může být usnadněn pomocí BHC sensitivního a na sodíku ·♦« · • ·· F ·· ·· · i2 ···: λ : .ι ··* *·«*·♦ • «Μ «·· , >··. «♦ • · · · « · ·· ··· ··· ·· nezávislého L-typu aminokyselinového přenašeče (Audusa Brochardt, 1986, J. Neurochem. 47, 484-488).

Blokátory vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách zvyšují akumulaci L-DOPA (2,5μΜ) v závislosti na koncentraci s EC50 z 6 na 339 μΜ (Obrázek 1). Předchozí kontakt buněk s testovanými sloučeninami významně zvýšil (P<0,05) maximální akumulaci (V_max) zvyšující se koncentrace L-DOPA aniž by se významně změnily hodnoty Km.

Pro důkaz skutečnosti, že zvýšení akumulace L-DOPA vyvolané testovanými sloučeninami bylo způsobeno snížením vnějšího přenosu intracelulárního L-DOPA (čerstvě akumulovaného), byly vytvořeny buněčné kultury na polykarbonátových filtrech, které se inkubovaly s L-DOPA (25 μΜ) aplikovaném bazální membránou a měřil se tok z bazální membrány k apikálnímu výběžku. Jak je zřejmé z obrázku 2, testované sloučeniny významně snižovaly tok L-DOPA z bazální membrány k apikálnímu výběžku a zvyšovaly akumulaci L-DOPA v buňce, což zřejmě prokazuje jejich vliv jako blokátorú vnějšího přenosu v ledvinových buňkách.

Další série pokusů byla prováděna pro zjištění inhibiční míry testovaných sloučenin pomocí AADC. Za tímto účelem se buňky LLC-PKi preinkubovaly 30 minut se zvyšující se koncentrací testovaných sloučenin nebo benserazidem; pak se buňky inkubovaly s koncentrací L-DOPA dosahující nasycení (250 μΜ). Jak je zobrazeno na obrázku 3, testované sloučeniny průkazně inhibovaly aktivitu AADC v závislosti na koncentraci podle měření přeměny L-DOPA na dopamin. IC50 se lišila od 0,07 μΜ (pro benserazid) do 393 μΜ (pro nejslabší).

U pokusů prováděných in vivo se krysám orálně aplikovaly testované sloučeniny 30 minut před aplikací L-DOPA nebo L-DOPA a benserazídu. Poněvadž vysoké dávky benserazídu mohou vyvolat inhibici AADC v mozku (Da Prada a kol., 1987, Eur. Neurol. 27, 9-20), předběžné pokusy se prováděly v pořadí kvůli zjištění dávky benserazídu, která neovlivňuje aktivitu AADC v mozku.

Jak je zobrazeno na obr. 4, dávka benserazídu, která vyvolala maximální inhibici jaterního a ledvinového AADC bez účinku na mozkový AADC byla 3 mg/kg benserazídu, což je v úplném souladu s údaji z jiných zdrojů (Da Prada a kol., 1987, Eur. Neurol., 27, 9-20). Za účelem souladu se poměrem L-DOPA / benserazid většinou používaného u člověka (4:1), se použila dávka 12 mg/kg L-DOPA.

> · * i·· ·

···· ···· ·· 9 ·* * · * • · «Η

·.{:: I .· • · #«·ϊ ι·; Σ ·«.·····

Orální aplikace resveratrolu neuspaným myším 30 minut před L-DOPA (12 mg/kg) a benserazidu (3 mg/kg) vedla k významnému zvýšení L-DOPA ve tkáních a dopaminu a amino metabolitů v mozku (tabulka 1). Dalším doprovodným jevem bylo zvýšení hladiny L-DOPA v plasmě (obrázek 5) a zvýšení L-DOPA ve tkáních a dopaminu v ledvinách (tabulka 1). Je možné, že inhibiční účinek resveratrolu na AADC nepřispěl ve velké míře ke zvýšení biologické dostupnosti L-DOPA. Zaprvé, hladiny dopaminu v ledvinách u krys, kterým byl aplikován testovaný resveratrol, byly vyšší ve srovnání s kontrolami (krysy, kterým se aplikoval L-DOPA a benserazid). Zadruhé, inhibiční účinek resveratrolu 30 mg/kg na aktivitu AADC v játrech a ledvinách (48% snížení u jater; 38% snížení u ledvin) byl významně nižší než u testovaného benserazidu (obrázek 4).

V souhrnu, výsledky uvedené výše ukazují, že blokátory vnějšího přenosu LDOPA v ledvinových buňkách vedly ke zvýšení hladiny L-DOPA v plasmě a zvýšení jeho biologické dostupnosti v mozku.

Tabulka 1

Hladiny (v ng/g) L-3,4-dihydroxyfenylalaninu (L-DOPA), dopaminu (DA), 3,4dihydroxyfenyloctové kyseliny (DOPAC) a homovanilové kyseliny (HVA) v mozku a ledvinách po aplikaci nosiče (0,5% karboxymethylcelulózy, 4 mg/kg), L-DOPA (L, 12 mg/kg) a benserazidu (B, 3 mg/kg) a resveratrolu R a L-DOPA (L; 12 mg/kg) a benserazidu (B, 3 mg/kg). Resveratrol se aplikoval 30 minut před L-DOPA + benserazid, a krysy se zabily 60 minut po aplikaci L-DOPA + benserazid.

Mozek	L-DOPA	DA	DOPAC	HVA
Nosič	5,6 ±1,6	292,0 120,0	+	33,3 ±12,5	308,5 ±61,4
L	9,6 + 1,0	201,0 19,6	±	24,3 ±2,4	320,6 ± 37,4
L+B	116,3 ± 23,5	222,0 16,80	±	132,0 ± 13,7	2435,2 ± 308,50

··*· ·· * · • · « *<í

R (0,3 mg/kg) + L	146,8 14,9	±	280,6 36,6	+	192,7 13,8	+	3975,7 ±462,1*
+ B
R (1,0 mg/kg) + L + B	143,5 29,1	±	221,9 41,5	±	149,9 15,8	±	3068,6 + 234,4
R (3,0 mg/kg) + L + B	180,9 26,3*	±	412,5 79,7*	±	221,2 33,8*	±	3026,5 ± 337,2
R (10,0 mg/kg) + L + B	208,4 21,8*	±	531,9 41,6*	±	316,6 20,9*	±	2449,5 ± 93,5
R (30,0 mg/kg) + L + B	294,0 52,1*	±	403,2 99,2*	+	257,8 51,1*	±	3324,8 ±529,4

···· «· · · t» · ·_ΛΛ · _Λ· • · * · · «* ·· } !··♦>· • ·♦· «·· · /··* |·φ J ······ • · · · · · · a a ·· ··· ··· ·· »« ····

Ledviny	L-DOPA	DA	DOPAC	HVA
Nosič	14,2 +1,1	6,2 +0,7	0,3 +0,3	264,7 + 41,0
L	17,4 + 2,1	120,8 + 27,5	84,3 + 23,3	10235,5+3772, 9
L+B	437,7 + 50,4	470,9 + 44,0	332,9 + 53,8	17591,0 ± 2286,6
R (0,3 mg/kg) + L + B	857,4 + 103,3*	685.4 + 148.4	564,2 + 183,0	27169,4+ 2617,0*
R (1,0 mg/kg) + L + B	739,3 ± 144,7*	622,5 + 61,5*	598,3 + 144,5	26254,3 ± 3677,0
R (3,0 mg/kg) + L + B	1016,2 ± 121,5*	615,0 + 60,8*	420,4 + 44,4*	29094,8 ± 3342,3*
R (10,0 mg/kg) + L + B	949,3 ± 126,4*	710,3 + 67,2*	476,3 + 52,8*	25779,8 ± 3941,7
R (30,0 mg/kg) + L + B	1198,6 ± 225,1*	864,4 + 316,1*	731,9 + 427,3	27923,6 ± 10686,2

Významně odlišné ve srovnání s odpovídajícími hodnotami u krys léčených L-DOPA (L, 12 mg/kg) a benserazid (B, 3 mg/kg) (*P <0,05).

*··« * · ···· ·» • · * • · * • *·· · • · » • · · · · • «· ·« ·9 ·· · · · · · .i »<*.♦ ;··.%♦* ·’ • ί >·<*«·; ;*··*··!·« • · · · · · •·· · · ·· ···*

7ψ £<Μ.- 33W

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice pro léčbu Parkinsonovy nemoci, vyznačující se tím, že obsahuje v kombinaci s L-DOPA alespoň jednu sloučeninu vybranou ze skupiny . .

fenylbenzopyranových derivátů, trans-stilbenových derivátů nebo 3-(4- *··*·· hydroxyfenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pro blokaci ;··♦·» vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách, který zvyšuje biologickou .

dostupnost L-DOPA v mozku. *····, • ♦ • · · · •
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že fenylbenzopyranové ·*.*.· deriváty obsahují flavonoidovou sloučeninu. ;·,
3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že flavonoidová sloučenina má obecný vzorec:

kde skupiny X jsou shodné nebo odlišné a představují H nebo OH, skupiny Y jsou shodné nebo odlišné a představují H nebo OR, kde R představuje H, CH3 a CH2fenyl, včetně odpovídajících derivátů 3-C6Hs(Y4).
4.

16 ···: λ i a / wr : .♦,····· ··· ··· ·· ♦·· ·* ·· Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že trans-stilbenové deriváty mají obecný vzorec: X xv ,X 'X l I x^^y • · • · • · · X ·· ·· • ·

kde skupiny X jsou shodné nebo odlišné a jsou H nebo OH. * • ·
5. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že je blokující sloučenina vybrána ze skupiny obsahující:

5.7- dihydroxy-2-(4-methoxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (akacetin),

5.7- dihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (apigenin),

5.6.7- trihydroxy-2-fenyl-4H-1 -benzopyran-4-on (baikalein),

5.7- dihydroxy-2-fenyl-4H-1 -benzopyran-4-on (chrysin), ([2R, 3R])-2-[3,4-dihydroxyfenyl]-3,4-dihydro-1[2H]benzopyran-3,5,7-triol, ((-)-epikatechin]), 2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,7-dihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (fisetin),

5.7- dihydroxy-3-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (genistein),

3.5.7- trihydroxy-2-(4-hydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (kaempferol),

2- (2,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-benzopyran-4-on (morin),

3.5.7- trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyfenyl)-4H-1-benzopyran-4-on (myricetin),

3- (4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanon (floretin),

2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (quercetin), 2-(3,4-dihydroxyfenyl)-3,5,6,7-tetrahydroxy-4H-1-benzopyran-4-on (quercetagetin), 4‘-benzyloxy-3‘,5‘-dimethoxy-3,5,7-trihydroxyflavon,

3.7- dihydroxy-3‘,4,5‘-trimethoxyflavon, 3‘,4‘,7,8-tetrahydroxyflavon,

3,5,74rihydroxy-3‘4‘5‘-trimethoxyflavon, 3,3‘, 4, 5‘-tetrahydroxy-trans-stilben (piceatannol), trans-4-styrylfenol a 3,4',5-trihydroxy-trans-stilben (resveratrol).

• · »· '# 1 · • «·«····
6. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 1, 4 nebo 5, vyznačující se tím, že sloučeninou blokátoru je resveratrol.
7. Kompozice podle kteréhokoli z výše uvedených nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje inhibitor enzymu dekarboxylázy aminokyselin a/nebo inhibitor enzymu katechol-o-methyltransferázy.
8. Kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený inhibitor dekarboxylázy aminokyselin obsahuje benserazid nebo karbidopa a uvedený inhibitor enzymu katechol-o-methyltransferázy obsahuje entakapon nebo ,···· • * « · tolkapon. ·
9. Kompozice podle kteréhokoli z výše uvedených nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče.
10. Použití kompozice kteréhokoli z výše uvedených nároků pro přípravu léčiva pro léčbu nebo prevenci stavů zhoršení kterékoli formy Parkinsonovy nemoci.
11. Alespoň jeden blokátor vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách vybraný ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty transstilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanonu (floretin) pro použití při léčbě v kombinaci s následnou nebo současnou aplikací L-DOPA.
12. Alespoň jedna sloučenina blokátoru podle nároku 11 vybraná ze skupiny popsané v kterémkoli z nároků 2 až 6.
13. Použití alespoň jednoho blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA ledvinové buňky vybrané ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty transstilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanonu (floretin) pro přípravu léčiva pro léčbu nebo prevenci stavů zhoršení kterékoli formy Parkinsonovy nemoci pro použití při léčbě nebo prevenci zhoršení kterékoli formy Parkinsonovy nemoci s následnou nebo současnou aplikací LDOPA.
14. Použití alespoň jednoho blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách vybraného ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanonu (floretin) pro přípravu léčiva pro léčbu pohybových onemocnění modifikací vlastní aktivity nigrostriatální cesty a následnou nebo současnou aplikací LDOPA.
15. Použití podle nároku 13 nebo 14, kde alespoň jedna sloučenina blokátoru je vybrána ze sloučenin popsaných v kterémkoli z nároků 2 až 6.
16. Použití podle kteréhokoli z nároků 13 až 15, kde je sloučenina blokátoru přítomna v množství, které představuje přibližně 40 až 30 000 pg/kg na jednu dávku.
17. Použití podle kteréhokoli z nároků 13 až 16, kde léčba též zahrnuje současnou nebo následnou aplikaci inhibitoru dekarboxylázy aminokyselin nebo inhibitor katechol-o-methyltransferázy.
18. Použití podle nároku 17, kde inhibitor dekarboxylázy obsahuje benserazid nebo karbidopa a inhibitor methyltransferázy obsahuje entakapon nebo tolkapon.

Použití alespoň jedné sloučeniny blokátoru vybrané ze skupiny sloučenin popsaných v kterémkoli z nároků 1 až 6 pro přípravu léčiva pro léčbu Parkinsonovy nemoci blokací periferální dekarboxylace následnou nebo současnou aplikací L-DOPA.
20. Způsob léčby Parkinsonovy nemoci, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky účinného množství alespoň jedné sloučeniny blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA ledvinových buňkách vybraného ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pacientovi vyžadujícímu tuto léčbu s následnou nebo současnou kombinací s L-DOPA.
21. Způsob kontroly pohybových onemocnění modifikací vlastní dopaminergní aktivity nigrostriatální cesty, vyznačující se tím, že se aplikuje terapeuticky účinné množství alespoň jedné sloučeniny blokátoru vnějšího přenosu LDOPA v ledvinových buňkách vybrané ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1-(2,4,6trihydroxyfenyl)-1-propanonu (floretin) pacientovi vyžadujícímu tuto léčbu v následné nebo současné kombinaci L-DOPA.
22. Způsob zvýšení cirkulující hladiny aplikovaného L-DOPA pacientovi, vyznačující se tím, že se aplikuje terapeuticky účinné množství alespoň jedné sloučeniny blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách vybrané ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty transstilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanonu (floretin).
23. Způsob zvýšení biologické dostupnosti aplikovaného L-DOPA v mozku pacienta, vyznačující se tím, že se aplikuje terapeuticky účinné množství alespoň jedné sloučeniny blokátoru vnějšího přenosu L-DOPA v ledvinových buňkách vybrané ze skupiny zahrnující deriváty fenylbenzopyranu, deriváty trans-stilbenu nebo 3-(4-hydroxyfenyl)-1 -(2,4,6-trihydroxyfenyl)-1 -propanonu (floretin).
24. Způsob podle kteréhokoli z nároků 20 až 23, vyznačující se tím, že dále zahrnuje aplikaci inhibitoru dekarboxylázy aromatické L-mainokyseliny nebo inhibitoru katechol-o-methyltransferázy.