KR20210153642A - 바이러스 및 박테리아 감염 치료를 위한 신규 mek-억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이러스 감염 또는 바이러스 및 박테리아 동시감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264에 관한 것이다. 또한, 바이러스 감염의 치료 및 박테리아 동시-감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 이러한 억제제를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

바이러스 및 박테리아 감염 치료를 위한 신규 MEK-억제제

인플루엔자 A 바이러스는 심각한 이환율 및 사망률을 결과하는 중증 호흡기 질환의 원인이 되는 작용제이다. 인플루엔자 바이러스 감염 과정에서 치명적인 사례의 대부분은 실제로 상이한 박테리아, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (에스. 아우레우스((에스. 아우레우스)), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza)에 의해 유발된 이차성 폐렴의 결과이다 (Morens et al., 2008, Chertow et al., 2013). 박테리아 동시-감염(bacterial co-infection)의 가장 두드러진 문제는 갑자기 증가된 병원성 (Iwao et al., 2012, Paddock et al., 2012, Parker et al., 2012) 및 상이한 병원체에 대한 강력한 항감염제의 제한된 저장량(arsenal)이다. 인플루엔자 바이러스의 높은 가변성 및 신규 균주의 지속적인 출현 (Neumann et al., 2009, Taubenberger et al., 2010, Parry, 2013), 박테리아 균주의 특정 특성 (Grundmann et al. 2006, Moran et al., 2006, Gillet et al., 2007, Shilo et al., 2011), 뿐만 아니라 사용 가능한 약물/항생제에 대한 인플루엔자 바이러스 (Hayden et al, 1992, Bright et al., 2006, Pinto et al., 2006, De Clercq et al., 2007, Pinto et al., 2007) 및 박테리아 (Grundmann et al., 2006, Moran et al., 2006, Shilo et al. 2011) 둘 다의 신속한 내성 발달(resistance development)이 열악한 치료 옵션의 주요 원인이다.

WO 2001/076570은 MEK 억제제를 통해 (-)RNA 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료 또는 예방하는 개념을 제공한다. WO 2014/056894는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 특정 MEK 억제제, 예를 들어 AZD-6244, AZD-8330, RDEA-119, GSK-1120212 (트라메티닙), GDC-0973 (코비메티닙), CI-1040, PD-0325901, RO-5126766, MSC1936369 (AS-703026)를 제공한다. WO 2015/173788 A1에서는 MEK 억제제가 인플루엔자 바이러스 및 박테리아 동시-감염을 치료하는 방법에서의 용도에 대해 개시되어 있다.

2009년의 H1N1 팬데믹은 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)가 세계 보건 시스템에 강한 영향을 미친다는 것을 분명히 입증한다 (Mackey and Liang, 2012; Monto et al., 2011; Robertson and Inglis, 2011). 이는 2019/2020 코로나바이러스(coronavirus) (Covid19) 팬데믹에 의해 확인된다. 예방 백신 외에, 단지 몇 가지 항바이러스 약물이 인플루엔자에 대해 승인되었으며 현재까지 Covid19에 대해 공지된 것은 없다. 이는 감염을 더 잘 제어하기 위해 추가적인 효과적인 항바이러스제의 긴급한 필요성을 강조한다. 특히, 어떤 백신도 이용 가능하지 않은 펜데믹의 초기 단계에서는, 항바이러스제가 독자적(stand-alone) 치료법이다. 게다가, 현재 승인된 항바이러스제에 내성이 있는 IAV의 출현은 새롭고 충분히 이용 가능한 항바이러스 약물의 긴급한 필요성을 강조한다 (Moss et al., 2010).

그러나, 비록 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위해 몇 가지 유망한 MEK 억제제가 이미 공지되어 있고 제공되긴 하지만, 이러한 적용을 위해 추가의, 이상적으로 개선된 MEK 억제제를 여전히 제공할 필요가 있다.

게다가, 바이러스 감염의 항바이러스 요법은 감염 후 가능한 빨리 시작하는 것이 매우 중요하다. 예를 들어, 오셀타미비르를 사용하여 인플루엔자 요법을 시작하는 시간 창은 단지 최대 24시간이다. 매우 종종, 환자는 이 기간 후에 의사를 방문하여 표준 항바이러스 치료(standard anti-viral treatment)를 사용한 치료를 소용없게 만든다. 추가로, 항바이러스 치료는 가능한 약물 상호작용 때문에, 특히 하나 이상의 의약을 지속적으로 종종 복용하여야 하는 노인의 경우에는 사용이 금해질 수 있다. 매우 종종, 이러한 의약의 복용을 중단하는 것은 쉽지 않다. 결과적으로, 이들 환자가 항바이러스 요법에 적합하기 전에 항바이러스 요법을 시작하기 위한 시간 프레임은 이미 지나간다.

선행 기술을 고려하여, 특히 늦은 치료 시작의 경우, 특히 RNA 바이러스 예컨대 인플루엔자 바이러스 (IV) 또는 코로나바이러스 (CoV)에 의해 유발된 호흡기도 질환(respiratory tract disease)에서 바이러스성 질환의 치료에서 효과적인 신규 화합물 및 조성물이 필요하다는 것은 분명하다. 게다가, 바이러스가 항바이러스 요법에 내성인 바이러스 감염의 치료, 및 박테리아 동시-감염의 예방 및/또는 치료가 필요하다.

기술적 문제의 해결책은 바이러스성 질환(viral disease), 예컨대 인플루엔자 또는 코로나바이러스 감염, 박테리아 감염 또는 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 CI 1040의 대사산물인 PD 0184264를 제공하는 것이다. 이 해결책은 또한 이하에 기재된 실시양태 및 청구범위에서 반영되며, 실시예 및 도면에 예시되어 있다. 본 출원의 발명자들은 놀랍게도 MEK 억제제 CI 1040의 대사산물 PD-0184264가 CI 1040 자체보다 더 높은 항바이러스 및 항박테리아 활성을 갖는다는 것을 밝혀냈다. 게다가, PD-0184264는 감염 후 24시간 초과에 치료를 시작하더라도 효과적인 것으로 나타났으므로, 바람직하게는 대상체(subject)는 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간 또는 적어도 72시간 동안 바이러스 감염에 대한 증상을 나타냈다.

바람직하게는, 치료는 질환 발병 후 적어도 24시간 및 48시간 이내에 시작된다.

바람직하게는, 바이러스 감염은 양성 또는 음성 RNA 가닥 바이러스에 의해 유발된다. 바람직하게는, 음성 가닥 RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 보다 바람직하게는 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 또는 인플루엔자 B 바이러스 (IBV)이고, 훨씬 보다 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1에 따라 이루어진 군으로부터 선택되거나 인플루엔자 B 바이러스는 IBV 유형 야마가타(Yamagata) 및 빅토리아(Victoria)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 양성 가닥 RNA 바이러스는 중증 급성 호흡기 바이러스(severe acute respiratory virus)(SARS-CoV 및 SARS-CoV2) 또는 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(MERS)이다.

일부 실시양태에서, 바이러스는 항바이러스 치료에 내성이고, 여기서 보다 바람직하게는 항바이러스 치료는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 아만타딘, 리만타딘, 파비피라비르, 발록사비르 마르복실 또는 피모디비르의 투여이다.

한 실시양태에서, 항바이러스 치료에 대하여 내성인 바이러스는 H1N1 H275Y 돌연변이체(mutant)이다.

따라서, PD 0184264의 사용은 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염, 뿐만 아니라 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스, 박테리아 동시-감염에 대한 더 효과적인 치료 옵션을, 첫 번째 증상이 확인된 후 24시간 초과 내지 적어도 72시간까지 치료 시작을 허용하는 확대된 치료 범위(treatment window)으로 제공함으로써 본 출원의 기초가 되는 기술적 문제를 해결한다.

비록, MEK 억제제 CI-1040은 인플루엔자 바이러스 감염 및 인플루엔자 바이러스 또는 박테리아 동시-감염의 치료 또는 예방에서 이미 효과적이긴 하지만, 본 발명자들은 CI-1040의 대사산물 (PD-0184264, 화학식 1)이 CI-1040 자체보다 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스와 박테리아 감염을 포함하는 동시감염을 표적으로 하는 데 더 효과적임을 밝혀냈다. PD-0184264는 CI-1040의 여러 대사산물 중 하나이나 (Wabnitz et al., 2004, LoRusso et al., 2005), 대사산물이 CI-1040보다 더 강력하다는 사실은 공지되어 있지도 않고 가정할 수도 없을 것이다. 본 발명자들은 매우 놀랍게도, 하나의 대사산물 (PD-0184264, 하기 구조식 1)이 실시예에 나타낸 바와 같이 CI-1040보다 더 효과적이며 더 높은 치료 잠재력을 갖는다는 것을 실제로 밝혀냈다. PD-0184264는 실제로 CI-1040보다 시험관내 MEK 키나제에 대한 더 약한 억제 효과를 나타내기 때문에, PD-0184264의 이러한 특성은 예상할 수 없을 것이다 (실시예 9 참조). 게다가, 시험관내 검정은 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 더 약한 항바이러스 효과를 나타냈으며 (실시예 10 참조), 한편 생체내 검정은 놀랍게도 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 훨씬 더 강한 항바이러스 효과를 나타났다 (실시예 11 참조).

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따라서, 본 발명은 박테리아 감염 및/또는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이러스성 질환을 유발하는 바이러스는 RNA 바이러스이다. RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 이는 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 바람직하게는 코로나바이러스 예컨대 SARS, SARS-CoV2 또는 MERS이다.

본 발명은 또한 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 박테리아 감염은 바람직하게는 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae), 레지오넬라세아에(Legionellaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 클라미디아세아에(Chlamydiaceae), 미코플라스마타세아에(Mycoplasmataceae), 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도모나달레스(Pseudomonadales) 및/또는 파스퇴렐라세아에(Pasteurellaceae)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.

본 발명은 추가로 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다.

바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 박테리아 감염은 바람직하게는 스타필로코카세아에, 스트렙토코카세아에, 레지오넬라세아에, 슈도모나다세아에, 바실라세아에, 클라미디아세아에, 미코플라스마타세아에, 엔테로박테리아세아에, 슈도모나달레스 및/또는 파스퇴렐라세아에로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.

바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자　A 바이러스 또는 인플루엔자　B 바이러스이다.

바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염과 조합되어 투여된다.

바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염과 조합되어 투여된다.

대안적인 실시양태에서 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법 또는 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된다.

또한, 본 발명에 의해 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염 및 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

바람직하게는, PD-0184264는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법 및/또는 박테리아성 질환의 예방 및/또는 치료 방법 및/또는 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 하나 이상의 MEK 억제제와 조합된다.

바람직하게는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염은 대상체, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 조류 또는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에서 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 동시-감염의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 것이다.

본 개시내용은 추가로 치료 유효량의 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

게다가, 본 발명은 치료 유효량의 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이러스성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, PD-0184264는 대상체에게 100 mg 내지 900 mg, 바람직하게는 600 mg의 경구 투여 형태로 1일 1회 투여한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스이고, 보다 바람직하게는 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고 가장 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다.

바람직하게는, 박테리아 감염은 바람직하게는 스타필로코카세아에, 스트렙토코카세아에, 레지오넬라세아에, 슈도모나다세아에, 바실라세아에, 클라미디아세아에, 미코플라스마타세아에, 엔테로박테리아세아에, 슈도모나달레스 및 파스퇴렐라세아에로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.

도면은 다음을 나타낸다:
도 1: PD-0184264 또는 CI-1040으로 인플루엔자 A에 감염된 마우스의 치료.
실시예 1의 실험으로부터의 결과는 바이러스 역가 (log10) pfu/ml (왼쪽) 또는 % 바이러스 역가 (오른쪽)로 제시된다.
도 2: PD-0184264 및 CI-1040이 MRSA 박테리아 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프.
그래프의 수평 축에 표시된 바와 같이, 상이한 시점에서, 무세포 박테리아 배양물의 광학 밀도는 그래프의 수직 축에 % (OD600)로 나타낸, 박테리아 성장에 대한 지표로서 측정되었다. 데이터는 실시예 2에 기재된 세 가지 생물학적 복제물의 평균값을 나타낸다.
도 3: 상이한 농도의 PD-0184264를 사용한 박테리아 MRSA 성장의 억제.
PD-0184264를 에스. 아우레우스 USA300 (MRSA)의 밤새 배양물(over-night culture)에 상이한 농도 (표시된 바와 같이)로 투여하였다. 6시간 후 광학 밀도를 시험하였다. 도면에 나타낸 데이터는 실시예 2에 기재된 세 가지 생물학적 복제물로부터의 하나의 실험을 나타낸다.
도 4: CI-1040 및 PD-0184264가 박테리아 성장에 미치는 영향.
(A) CI-1040이 상이한 농도에서 박테리아 성장에 미치는 영향 (B, C) PD-184264가 상이한 농도의 PD-0184264에서 에스. 아우레우스 균주 6850 (B) 또는 균주 USA300 (C)에 미치는 영향.
도 5: 단일 또는 동시-감염된 세포에 PD-0184264의 투여는 세포를 보호한다.
인간 폐 상피 세포 (A549)를 PD-0184264 (표시된 농도에서) 또는 용매 (DMSO)로 전처리하고 인간 인플루엔자 바이러스 균주 A/푸에르토리코(Puerto Rico)/8/34 (H1N1)로 감염시켰다. PD-0184264의 항바이러스 및 강한 항박테리아 효과를 고려해 볼 때 (도 2 내지 4), 본 발명자들은 화합물의 이러한 특징이 IAV (인플루엔자 A 바이러스) 및/또는 에스. 아우레우스 감염에 의해 도출된 세포 붕괴(disrupting) 세포병변 효과(cytopathic effect) (CPE)와 관련하여 육안으로 또한 관찰될 수 있는 지 여부를 분석하였다. IAV (H1N1) (중간 패널) 또는 에스. 아우레우스 균주 6850 (상단 패널)에 의한 단일 감염 후에 세포 단층의 약간의 붕괴가 관찰되었다. 이 CPE는 병원체 둘 다 (하단 패널)에 의한 동시-감염시 강하게 증가하였으나, PD-0184264의 증가하는 농도의 존재 하에 억제되었다.
도 6: PD-0184264와 일반 항생제의 항박테리아 작용의 비교.
MEK-억제제 PD0184164의 항박테리아 특성을 일반 항생제의 작용에 맞추어 조정하기 위해, 본 발명자들은 밤새 박테리아를 용매, MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 상이한 농도의 항생제 젠타마이신으로 처리하였다. 용매 처리된 박테리아와 비교하여, 1세대 MEK-억제제 U0126과의 인큐베이션은 박테리아 역가의 경미한 감소만을 결과하였으며, 한편 PD-0184264로의 처리는 박테리아 로드의 매우 강한 감소를 야기하였다. 이는 박테리아 균주 둘 다에 해당되었다.
도 7: (a) PD-0184264의 항박테리아 작용을 다른 MEK 억제 화합물 또는 항생제 젠타마이신과 비교한 첨가-시간(time-of-addition) 검정 결과.
(b) 젠타마이신, 에리트로마이신 처리 또는 미처리와 비교된 에스. 아우레우스에서 MEK 억제제 PD0184264에 대한 내성에 대한 시험 결과.
도 8: 박테리아 키나제 PknB의 도메인 구조 (상단) (Rakette et al. 2012) 및 포유동물 MAP 키나제 p38, JNK, 및 직접적인 MEK 표적 ERK의 활성화 부위와 PknB의 자가-인산화(auto-phosphorylation) 부위의 서열 상동성 (Miller et al. 2010).
도 9: 상이한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)에 억제제 처리가 미치는 영향의 결정.
도 10: PD-0184264로 처리했을 때 에스. 아우레우스 균주 6850 및 MRSA 균주 USA300의 스트레스 내성.
도 11: PD-0184264로의 처리는 스트렙토코커스 뉴모니아에의 상이한 혈청형의 성장을 손상시킨다.
(A) OD600에 의해 측정된 바와 같은 스트렙토코커스 뉴모니아에 균주 TIGR4 (혈청형 4) 및 D39 wt (혈청형 2)의 배양에 대한 PD-0184264의 효과; (B) CFU/ml로 나타낸, 스트렙토코커스 뉴모니아에 균주 TIGR4 (혈청형 4) 및 D39 wt (혈청형 2)의 배양에 대한 PD-0184264의 효과; (C): CFU/ml로 나타낸, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양에 대한 PD-0184264의 효과.
도 12: 표 1: 항생제.
도 13:
PD-0184264로의 세포 처리가 단일 박테리아 (에스. 아우레우스) 또는 바이러스 (인플루엔자 IV) 감염 및 동시-감염시 병원체-유도 CPE (세포병변 효과)를 강하게 감소시킨다는 것을 나타내는 사진.
도 14: CI-1040 (a) 또는 PD-0184264 (b)로 처리시 세포내 박테리아 로드의 변화를 나타내는 그래프.
CI-1040 또는 PD-0184264를 진행 중인 감염 동안 나중에 투여했을 때 비슷한 결과가 수득되었다 (c).
도 15: 세포 생존력 (A, B) 및 막 파열 (C, D)을 나타내는 그래프.
(A, B)는 PD-0184264의 증가하는 농도의 존재 하에 A549 세포 생존력을 나타낸다. (C) 및 (D)에서, 억제제 처리로 인한 막 파열을 결정하기 위해 LDH-검정을 수행하였다.
도 16: MEK 경로에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 억제 효과를 나타내는 무세포 키나제 검정.
키나제의 활성은 ELISA 검정에 의해 인산화된 표적 단백질 ERK의 양을 결정함으로써 측정된다. 유사한 결과를 나타내는 세 가지 독립적인 실험 시리즈를 수행하였다. 하나의 대표적인 실험이 여기에 제시된다.
도 17: 시험관내 검정에서 인플루엔자 바이러스 H1N1pdm09에 대한 PD-0184264의 항바이러스 활성.
(A) A549 세포를 바이러스 (MOI=0.001)로 감염시켜 바이러스 역가 감소를 결정하였다. (B)　A549 세포를 바이러스 RBI (MOI=0.001)로 감염시키고 상이한 농도의 PD-0184264 (100 μM, 50 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM, 0.5 μM 및 0.1 μM)로 처리하여 EC₅₀ 값을 결정하였다. (C) A549 세포를 24시간 동안 상이한 농도의 PD-0184264 (100 μM, 50 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM, 0.5 μM 및 0.1 μM)로 처리한 후 4시간 WST-염색하여 CC₅₀ 값을 결정하였다.
도 18: PD-0184264에 의한 마우스의 폐에서 바이러스 역가의 생체내 감소.
H1N1pdm09 바이러스 감염 후 암컷 C57BL/6 마우스를 2.8, 8.4 또는 25 mg/kg PD-0184264 (왼쪽 패널) 또는 25, 75 또는 150 mg/Kg CI-1400 (오른쪽 패널) 경구 경로로 처리하였다. 감염 24시간 후 동물을 죽이고 표준 방법을 사용하여 바이러스 역가를 결정하였다.
도 19: PD-0184264는 CI-1040보다 양호한 생체이용률을 갖는다.
(A) 수컷 NMRI 마우스를 75 mg/kg CI-1040 (진회색 영역) 또는 75 mg/Kg PD-0184264 정맥내 경로로 처리하였다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 (시험 2일차)에 혈액을 수집하고 약물의 존재에 대해 혈장을 분석하였다. (B) 수컷 NMRI 마우스를 경구 위관영양법을 사용하여 150 mg/kg CI-1040 (진회색 영역) 또는 150 mg/kg PD-0184264로 경구로 처리하였다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 (시험 2일차)에 혈액을 수집하고 약물의 존재에 대해 혈장을 분석하였다.
도 20: PD-0184264로 처리한 후 마우스의 생존.
8마리의 암컷 C57BL/6 마우스를 H1N1pdm09 감염에 감염시키고 경구 경로를 통해 25 mg/kg PD-0184264 (ATR-002, 중간 회색 선) 또는 용매 단독 (밝은 회색 선)으로 처리하였다. 처리는 그래프 (회색 막대)에 표시된 바와 같이 5일 동안 감염 후 24, 48 또는 72시간에 시작되었다. 20%의 체중 감소가 밝혀졌을 때 마우스를 희생시켜야 하였다 (회색 점선). 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 8 소프트웨어를 사용하여 도면 둘 다를 도시하였다. P-값은 로그순위(Logrank) (만텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험을 사용하여 결정하였다.

하기 설명은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 여기에 제공된 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 바이러스성 질환 또는 박테리아 감염 및 바이러스 감염을 포함하는 동시-감염의 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264에 관한 것이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, PD-0184264는 박테리아 키나제 PknB에 작용하는 것으로 보이며, 이로 인해 적어도 부분적으로는 이의 정균 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같이, PD-0184264는 바이러스 및 박테리아 감염 시나리오 뿐만 아니라 박테리아 및 바이러스 동시-감염 시나리오에서도 효과를 나타낸다. 이 효과는 박테리아 및 바이러스 감염의 치료를 위해 선행 기술에서 이미 공지된 MEK 억제제인 CI-1040보다 놀랍게도 더 강하다. 실시예 9에 나타낸 바와 같이 MEK 키나제에 대한 CI-1040 및 PD-0184264의 억제 효과를 비교할 때, MEK 억제제가 상기 효과를 달성하기 위해 선행 기술에서 사용되었기 때문에 실제로 그 반대를 예상할 수 있을 것이다.

시험관내 검정에서 PD-0184264와 CI-1040의 항바이러스 효과를 비교할 때도 마찬가지이다. 여기서, CI-1040은 실시예 10으로부터 알 수 있는 바와 같이 D-0184264보다 더 효과적이다. 구체적으로, 동일한 억제 효과를 달성하기 위해 시험관내 검정에서 PD-0184264의 10배 더 높은 농도가 필요하다. 놀랍게도, 약한 시험관내 억제에도 불구하고, PD-0184264는 실시예 11로부터 알 수 있는 바와 같이 생체내에서 CI-1040보다 월등한 것으로 밝혀졌다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 이미 2.8 mg/kg PD-0184264는 바이러스 역가의 감소를 나타내며, 한편 25 mg/kg PD-0184264는 폐에서 바이러스 역가의 적어도 90% 감소를 나타낸다. 대조적으로, CI-1040은 150 μM에서만 유사한 감소를 나타낸다. 더욱이, 실시예 1은 PD-0184264에 의해 폐에서 바이러스 역가의 감소를 나타낸다. 실시예 1에서, 마우스를 인플루엔자 바이러스에 감염시키고 각각 150 mg/kg, 75 mg/kg, 또는 25 mg/kg CI-1040 또는 PD-0184264로 처리하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이미 25mg/kg PD-0184264는 150 mg/kg CI-1040과 동일한 효과를 갖는다. 본 발명자들이 매우 놀랍게도, 이전의 시험관내 데이터는 PD-0184264로 작업을 계속할 어떤 인센티브도 제공하지 않았지만, PD-0184264는 생체내에서 강한 항바이러스 효과를 나타낸다. 이 놀라운 효과는 실시예 12에 나타낸, CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 더 높은 생체이용률을 기반으로 할 수 있다.

실시예 2, 4, 및 6-8은 게다가, 또한 CI-1040 및 기타 MEK 억제제와 비교하여 PD-0184264의 강한 항박테리아 효과를 나타낸다. 실시예 2에서, 박테리아 성장에 대한 PD-0184264의 효과가 분석된다. 도 2는 PD-0184264가 박테리아의 성장을 억제하며, 한편 CI-1040은 박테리아 성장에 영향도 미치지 않음을 나타낸다. 도 3에서는 박테리아 성장이, 50 μM PD-0184264에서 시작하여 거의 완전한 성장 억제를 나타내는 농도-의존적 방식으로 PD-0184264에 의해 억제됨을 나타낸다. 유사하게, 또한 도 4는 박테리아 성장이 농도-의존적방식으로 PD-0184264에 의해 억제됨을 나타내며 - 이미 10 μM PD-0184264는 성장의 상당한 감소를 나타내며 - 한편 CI-1040은 박테리아 성장에 어떤 영향도 미치지 않는다. 실시예 4에서, PD-0184264의 항박테리아 효과는 MEK 억제제 U0126 또는 항생제 젠타마이신과 비교된다. 도 6은 PD-184264가 젠타마이신과 유사한 항생제 효과를 가지며, 한편 선행 기술로부터 공지된 MEK 억제제 U0126은 박테리아 성장에 어떤 효과도 없음을 나타낸다. 박테리아 성장 과정이 모니터링되는 도 7A의 경우에도 마찬가지이다. 도 7B에서는 PD-0184264가 PD-0184264에 대한 내성을 유도하지 않으며, 한편 박테리아는 젠타마이신 및 에리트로마이신에 대한 내성을 쉽게 발생시킴을 추가로 나타낸다. 따라서, PD-0184264는 박테리아에서 내성을 유도하지 않는다. 실시예 6에서는 항생제에 대한 박테리아의 민감도에 대한 PD-0184264의 영향을 분석하였다. 도 9 및 표 2에 나타낸 바와 같이, PD-0184264로의 처리는 실제로 상이한 항생제에 대한 박테리아의 감수성의 증가를 야기하였으며, 이는 페니실린과 젠타마이신의 경우에 가장 두드러졌다. 게다가, 도 10은 PD-0184264가 박테리아의 스트레스 내성을 감소시킴을 나타낸다. 실시예 7은 PD-0184264의 효과가 에스. 아우레우스에 국한되지 않을 뿐만 아니라 스트렙토코커스 뉴모니아에 (도 11A 및 B 참조) 및 바실러스 서브틸리스 (도 11C 참조)와 같은 기타 박테리아에도 효과가 있다는 증거를 제공한다.

실시예 3 및 8은 박테리아 및 바이러스 동시-감염의 맥락 내에서 PD-0184264의 효능을 강조한다. 실시예 3은 PD-0184264의 효능이 바이러스 및/또는 박테리아 감염에 의해 도출된 세포 붕괴 세포병변 효과 (CPE)와 관련하여 육안으로또한 관찰될 수 있는지 여부를 분석하였다. 도 5는 PD-0184264가 15 μM PD-0184264에서 이미 효과를 나타내는 농도-의존적 방식으로 특히 박테리아 및 바이러스 동시-감염에 의해 유발된 세포병변 효과를 감소시킴을 나타낸다. 동일한 내용이 실시예 8에서도 분석되었으며, 이는 박테리아 및 바이러스 동시-감염 시나리오에서 PD-0184264의 긍정적인 효과를 도 13에 다시 나타낸다. 실시예 8은 동시 감염 시나리오에서 세포내 박테리아 역가에 대한 PD-0184264의 효과를 추가로 분석하였다. 도 14는 PD-0184264가 세포내 박테리아 역가를 감소시키며, 한편 CI-1040은 효과가 없음을 나타낸다. 게다가, 실시예 8 및 도 15는 PD-0184264가 어떤 세포독성 효과도 발휘하지 않는다는 것을 나타낸다.

추가로, 실시예 13에서, H1N1 인플루엔자 균주에 감염된 마우스에 PD-0184264 처리는, 비록 감염 후 72시간만큼 늦게 약물을 투여하였음에도 불구하고, 유의한 생존 차이를 야기하는 것으로 나타났다 (도 20 참조).

결과는 하스바흐(Haasbach) 논문 (Haasbach et al. 2017) 및 본 출원인에 의해 수행된 추가 실험에 제시된 CI-1040으로 수득한 데이터와 비슷하다. 이들 실험에서, CI-1040은 공지된 항바이러스제, 구체적으로 타미플루 (오셀타미비르)에 비해 확대된 치료 범위을 가져, 타미플루가 효과가 없는 기간에 투여할 수 있음이 밝혀졌다. 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들은 Cl-1040이 생체내에서 인플루엔자 바이러스 폐 역가를 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 놀랍게도, Cl-1040의 치료 범위은 타미플루^® 치료가 효과가 없을 때 감염 후 적어도 48시간까지 확장되는 것으로 밝혀졌다.

FDA 라벨에 따르면. 오셀타미비르(타미플루^®)는 현재 2일 이내 동안에 증상을 나타낸 환자에서 인플루엔자 치료에 지시된다. 이는 이전 연구에서 마우스 모델에서 관찰된 것과 상응하며, 여기서 오셀타미비르는 이를 인플루엔자 바이러스 감염 후 48시간 초과에 투여되는 경우 더 이상 효과적이지 않다. 대조적으로, PD-0184264는 감염 후 72시간에도 효과적이었다. 따라서, PD-0184264는, CI-1040과 마찬가지로, 오셀타미비르보다 치료 범위이 더 긴 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 마우스 모델에서 관찰된 효과는 인간 환자에게 외삽될 수 있을 확률이 크며, 이는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염 또는 유도체가 바이러스 감염 증상 발병 후 2일 초과 환자에게 투여될 수 있음을 의미한다. 이는 또한 CI-1040 및 PD-0184264의 작용 방법을 오셀타미비르의 작용 방법과 비교할 때 의미가 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 오셀타미비르는 감염된 세포에서 비리온의 용출을 차단하는 것으로 생각된다. 이러한 이유로, 비리온이 아직 세포를 떠나지 않은 경우에만 효과적이다. 대조적으로, CI-1040과 PD-0184264는 바이러스 복제에 필요한 MEK 경로를 차단하여, 바이러스 RNP 복합체가 세포핵에 유지되는 것으로 밝혀졌다. MEK 억제의 분자적 작용 방식과 관련하여, 본 발명자들은 프로토타입 억제제 U0126을 사용한 키나제의 억제가 바이러스 RNP 복합체의 핵 세포질 수송의 차단을 야기한다는 것을 이전에 나타냈다 (Pleschka et al., 2001). 이는 CI-1040 및 PD-0184264에서 확인할 수 있다. 실시예 13의 데이터 및 추가 예비 연구를 기반으로, PD-0184264는 그것이 CI-1040의 대사산물이고 CI-1040과 동일한 경로를 표적으로 하기 때문에 CI-1040과 동일한 효과를 가질 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명의 방법 및 용도는 또한 적어도 24시간, 적어도 36시간, 또는 적어도 48시간 동안 증상을 나타낸 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 것에 관한 것이다. 물론 이들 시간은 증상을 나타낸 대상체에 대해 예컨대 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47시간 사이의 모든 시간 프레임을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 치료 전 적어도 48시간 동안 증상을 나타냈다. 예를 들어, 치료는 질환 발병 후 24시간 내지 48시간 사이에 시작할 수 있다. 이러한 맥락에서 "증상을 나타낸"과 "질환 발병"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 치료는 감염 후 적어도 60시간, 적어도 72시간 또는 적어도 96시간에 또한 시작할 수 있다. PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염 또는 유도체가 상이한 항바이러스제가 이미 효과가 없는 것으로 밝혀졌을 때 투여되는 경우, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염 또는 유도체는 이전 항바이러스제 치료가 완료된 경우, 24시간 후에 투여될 수 있다.

게다가 CI-1040과 마찬가지로, PD-0184264는 항바이러스제 치료에 내성이 있는 인플루엔자 바이러스에 대해 또한 효과적일 확률이 매우 크다. 이는 많은 표준 항바이러스제(standard antiviral) 치료의 문제점을 해결하고 표준 항바이러스제로의 치료가 실패한 후 CI-1040 및 PD-0184264를 투여할 수 있게 하는 CI-1040 및 PD-0184264의 특징이다. 본원에 사용된 바와 같은 표준 항바이러스 치료는 항바이러스제로서 사용이 승인되고 이의 수명 주기의 임의의 단계에서 바이러스 병원체의 발생을 억제하는 데 효과적인 약물로의 치료로 정의된다. 예는 진입 억제제, 탈피(uncoating) 억제제, 역전사 억제제, 폴리머라제 억제제, 엔도뉴클레아제 억제제, 단백질 성숙 억제제, 인테그라제 억제제, 전사 억제제, 번역 억제제, 프로테아제 억제제, 비리온 어셈블리 억제제 또는 비리온 방출 억제제를 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 맥락에서, 공지된 항바이러스 치료의 두 가지 상이한 표준 접근법: 뉴라미니다제 억제제 및 M2 단백질 억제제가 있다.

따라서, 한 실시양태에서 바이러스는 항바이러스 치료에 내성이다. 본원에 요약된 바와 같이, 항바이러스 치료는 뉴라미니다제 억제제, 예컨대 오셀타미비르, 자나미비르, 라니나미비르 및 페라미비르의 투여, 및/또는 M2 억제제 예컨대 아만타딘 및 리만타딘의 투여에 관한 것일 수 있다. 따라서, 항바이러스 치료는 오셀타미비르, 자나미비르, 아만타딘 및/또는 리만타딘의 투여일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항바이러스 치료는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 아만타딘, 리만타딘, 파비피라비르, 발록사비르 마르복실 및/또는 피모디비르의 투여에 관한 것이다.

PD-0184264는 본원에 기재된 의학적 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다. 이와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 그러한 감염을 동반하는 증상을 좋아지게 하거나 개선할 목적으로 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염을 앓고 있는 대상체에게, 바람직하게는 의약의 형태의 PD 0184264의 투여를 포함한다. 유사하게, 바람직하게는 의약 형태의 PD 0184264의, 박테리아 감염을 앓고 있는 대상체에게 투여 또는 이러한 감염을 동반하는 증상을 좋아지게 하거나 개선할 목적으로 투여를 포함한다. 게다가 바람직하게는 의약 형태의 PD-0184264의, 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체에게 투여 또는 이러한 감염을 동반하는 증상을 좋아지게 하거나 개선할 목적으로 투여를 포함한다. 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염, 바이러스성 질환 및 박테리아 감염은 PD 0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염에 의해 치료되거나 예방되는 의학적 병태이다.

더욱이, 본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같은 용어 "예방법" 또는 "예방"은 본원에 기재된 의학적 병태를 예방하는 것이 목적인 임의의 의료 또는 공중 보건 절차를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방하다", "예방" 및 "예방하는"은 본원에 기재된 바와 같은 주어진 병태, 즉 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 포함하는 동시감염, 박테리아 감염 단독 또는 바이러스 감염 단독의 획득 또는 발생 위험 감소를 지칭한다. 또한, "예방법"이란, 대상체에서 인플루엔자 바이러스 감염 및 박테리아 감염을 포함하는 동시감염, 박테리아 감염 단독 또는 바이러스 감염 단독의 재발의 감소 또는 억제를 의미한다.

본 발명의 PD-0184264는 실시예 3 및 8에 나타낸 바와 같이 동시감염을 치료하는 데 효과적이다. 본원에 사용된 바와 같은 "동시감염"은 바이러스성 질환, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 감염, 및 박테리아 감염을 포함한다. 이러한 동시감염은 박테리아 및 인플루엔자 바이러스에 숙주 예를 들어 대상체 및/또는 단일 세포의 동시적 감염에 의해 발생할 수 있다. 또한, 숙주 예컨대 대상체 및/또는 세포는 하나 이상의 바이러스 입자 및 하나 이상의 박테리아로 동시에 감염될 수 있다. 그러나, 이러한 동시감염은 또한 순차적으로 발생할 수 있다. 이러한 경우에, 대상체 및/또는 세포는 먼저 하나 이상의 바이러스 입자로 감염되고 늦게 동일한 대상체 및/또는 세포가 하나 이상의 박테리아에 감염되거나 그 반대도 마찬가지이다. 두 감염 사이의 기간은 많아야 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간, 6시간, 3시간, 1.5시간 또는 최소 30분의 기간일 수 있다. 이와 관련하여, PD-0184264의 확대된 치료 범위으로 인해, 장기간 투여하면 2차 박테리아 감염의 보다 더 효과적인 예방이 예상된다.

이러한 상황은 또한 중복 감염일 수 있으며, 여기서 두 번째 감염이 특히 첫 번째 감염에 대해 사용된 치료에 내성이 있는 외인성 또는 내인성 기원의 상이한 미생물제에 의해 이전 감염에 중첩된다.

동시감염의 인플루엔자 바이러스 감염 내에 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 매개될 수 있으며, 바람직하게는 인플루엔자　A 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1이다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1이다. 다른 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H3N2, H5N1 및 H7N9이다. 추가 실시양태에서, 인플루엔자 A 바이러스는 H3N2, H5N1, H1N1, H5N6, H7N2 및 H7N9이다.

본 발명은 또한 숙주, 예를 들어 대상체 및/또는 세포에 존재하는 상기 기재된 동시감염의 설정에서 발생할 수 있는 "박테리아 감염"에 관한 것이다. 박테리아 감염은 임의의 박테리아에 의해 매개될 수 있으며; 바람직하게는 이는 스타필로코카세아에, 스트렙토코카세아에, 레지오넬라세아에, 슈도모나다세아에, 바실라세아에, 클라미디아세아에, 미코플라스마타세아에, 엔테로박테리아세아에, 슈도모나달레스 및/또는 파스퇴렐라세아에로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개된다.

박테리아 감염은 스타필로코커스, 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스, 메티실린-민감성 및 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스, 팬톤-발렌타인 류코시딘(Panton-Valentine leucocidin) (PVL)-발현 스타필로코커스 아우레우스 및/또는 스트렙토코카세아에, 바람직하게는 스타필로코커스 미티스(Streptococcus mitis), 스타필로코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 또는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 레지오넬라(Legionella), 바람직하게는 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈도모나스(Pseudomonas), 바람직하게는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스(Bacillus), 바람직하게는 바실러스 서브틸리스, 클라미도필라(Chlamydophila), 바람직하게는 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumonia), 미코플라즈마(Mycoplasma), 바람직하게는 미코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 클렙시엘라(Klebsiella), 바람직하게는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 모락셀라(Moraxella), 바람직하게는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 및/또는 헤모필루스(Haemophilus), 바람직하게는 헤모필루스 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개될 수 있다. 바람직하게는 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스, 스트렙토코커스 뉴모니아 또는 헤모필루스 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는 박테리아는 스타필로코커스 아우레우스이다.

본 발명이 또한 관련되는 "바이러스성 질환" 또는 "바이러스 감염"은 상기에 기재된 동시감염의 설정에서 발생할 수 있거나 숙주, 예를 들어, 대상체 및/또는 세포에 존재하는 유일한 감염으로서 발생할 수 있다. 바이러스성 질환 또는 바이러스 감염은 임의의 바이러스에 의해 매개될 수 있으며; 바람직하게는 이는 호흡기도 감염(respiratory tract infection)을 유발하는 바이러스 예컨대 RNA 바이러스에 의해 매개된다. 바람직한 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 코로나 바이러스(corona virus)이다. 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 매개되며, 여기서 인플루엔자 A 바이러스가 바람직하다. 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 및/또는 H5N1이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 코로나 바이러스 감염은 SARS-CoV, SARS-CoV2 또는 MERS-CoV에 의해 감염된다.

대안적인 실시양태에서 PD-0184264는 하나 이상의 MEK 억제제와 조합하여 투여된다. MEK 억제제는 예를 들어 U0126, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, CI-1040, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059, ARRY-438162, ARRY-162, ARRY-300, PF-3644022 및 PD184352를 포함한다. 추가 MEK 억제제는 PD-0184264와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.

바람직하게는, PD-0184264는 본 발명의 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법을 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 인플루엔자 바이러스 또는 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제와 조합된다. PD-0184264는 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제와 동시에, 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다.

일반적으로, 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 억제제는 인플루엔자 요법에서 효과적인 억제제 또는 의약이다. 상이한 물질이 인플루엔자 바이러스 감염을 감소시키는 데 효과적인 것으로 공지되어 있다. 그 중에는 예를 들어 바이러스 뉴라미니다제에 대한 억제제, 바이러스 이온 채널 단백질 (M2)을 표적으로 하는 화합물 및 바이러스 폴리머라제 복합체의 구성요소인 PB1, PB2, PA 또는 NP를 간섭함으로써 바이러스 폴리머라제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 표적으로 하는 화합물이 있다. 본 발명에 의해 또한 억제제의 제약상 허용되는 염이 구상된다. 그러나, 바람직한 억제제는 본원에 기재된 바와 같은 MEK 억제제, 특히 바람직한 PD 0184264이다.

"MEK 억제제"는 MEK (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제)를 억제함으로써 세포 또는 대상체에서 유사분열 신호전달 캐스케이드 Raf/MEK/ERK를 억제한다. 이 신호 전달 캐스케이드는 많은 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 강탈(hijack)되어 바이러스 복제를 촉진한다. 따라서, 병목 MEK에서 Raf/MEK/ERK 경로의 특정 차단은 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스의 성장을 손상시킨다. 게다가, MEK 억제제는 인체에서 낮은 독성을 나타내며 유해 부작용을 나타내지 않는다. 또한 바이러스 내성을 유도하는 경향이 없다 (Ludwig, 2009). 특히 바람직한 억제제는 PD 0184264이다.

"뉴라미니다제 억제제"는 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 항바이러스 약물이며, 이는 바이러스의 뉴라미니다제 단백질의 기능을 차단함으로써 작동하여, 새로 생성된 바이러스가 복제되는 세포에서 싹을 틔울 수 없기 때문에, 감염된 숙주 세포로부터 바이러스가 방출되는 것을 방지한다. 또한, 뉴라미니다제 억제제의 제약상 허용되는 염이 포함된다. 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 라니나미비르 또는 이들 물질 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 예컨대 오셀타미비르 포스페이트, 오셀타미비르 카르복실레이트 등이다. 가장 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 오셀타미비르 또는 페라미비르이다.

바이러스 이온 채널 단백질 (M2)을 표적으로 하는 화합물은 예를 들어 아만타딘 및/또는 리만타딘이며, 한편 바이러스 폴리머라제 복합체, PB1, PB2, PA 또는 NP의 구성요소를 간섭함으로써 폴리머라제 또는 엔도뉴클레아제 활성을 표적으로 하는 화합물은 예를 들어 NP 차단제 뉴클레오진 또는 폴리머라제 억제제 T 705 (파비피라비르)이다.

게다가, PD-0184264는 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제와 조합될 수 있다. 실시예 6은 PD-0184264가 항생제에 대한 박테리아의 민감도를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 박테리아를 표적으로 하는 억제제는 박테리아 감염을 감소시키는데 효과적인 임의의 억제제일 수 있다. 본 발명에서, PD 0184264는 박테리아를 표적으로 하는 억제제로서 강하게 선호되나, 통상의 기술자에게 공지된 박테리아를 표적으로 하는 또 다른 억제제는 항생제이다. 바람직한 항생제는 표 1 (도 12)로부터 수득할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항생제는 표 1 (도 12)에 열거된 바와 같은 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 항생제는 표 1 (도 12)에 열거된 바와 같은 항생제의 부류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 항생제는 표 1 (도 12)에 열거된 바와 같은 항생제의 일반명으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 젠타마이신, 리팜피신, 리소스타핀, 에리트로마이신, 레보플록사신, 반코마이신, 테이코플라닌, 페니실린 및 옥사실린으로부터 선택된 항생제가 보다 바람직하다.

본 발명의 억제제, 특히 MEK 억제제, 또는 억제제의 조합에 의해 치료될 수 있는 "대상체"는 바람직하게는 척추동물이다. 본 발명의 맥락에서 용어 "대상체"는 본원에 기재된 바와 같은 동시-감염 또는 박테리아 또는 바이러스 감염 단독의 치료를 필요로 하는 개체를 포함한다. 바람직하게는, 대상체는 동시-감염 또는 박테리아 또는 바이러스 감염 단독을 앓고 있거나 이의 위험에 처한 환자이다. 바람직하게는, 환자는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유동물이다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 포유동물은 인간, 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 마우스, 래트 등이고, 특히 바람직하게는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임의로 1세 초과 14세 미만, 50세 내지 65세, 18세 내지 50세, 또는 65세 초과인 인간 대상체이다. 다른 실시양태에서 대상체는 적어도 50세인 대상체, 만성 치료 시설에 거주하는 대상체, 폐 또는 심혈관계의 만성 장애를 갖는 대상체, 만성 대사 질환, 신장 기능장애, 혈색소병증, 또는 면역억제 때문에 전년도 동안 정기적인 의학적 추적 또는 입원을 필요로 하는 대상체, 14세 미만의 대상체, 6개월 내지 18세 의 대상체로서 장기간 아스피린 요법을 받고 있는 대상체, 및 치료, 그리고 인플루엔자 시즌 동안 임신 제2 또는 제3 3개월이 될 여성으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 대상체이다.

본 발명의 방법에서, PD-0184264는 경구적으로, 정맥내, 흉막내, 근육내, 국소적으로 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, PD-0184264는 흡입을 통해 국소적으로 또는 경구적으로 투여된다. 바람직한 실시양태에서, PD-0184264는 7 내지 21일 동안, 100 mg 내지 900 mg, 바람직하게는 600 mg의 경구 투여량으로 1일 1회 투여된다.

구체적으로, 실시예 14에 기재된 바와 같이, PD-0184264는 단일 상승 용량/다중 상승 용량 (SAD / MAD) 요법에 따라, 100 mg의 개시 용량 및 7개의 아암에서 최대 3개의 증량(escalation) 단계로 투여되었다. 투여 계획은 PD-0184264 1회 용량으로, 100 mg에서 900 mg으로 증량 (SAD)한 후에, PD-0184264를 7일에 걸쳐 100 mg에서 600 mg으로 증량하는 7회 용량 (MAD)이었다. 각각의 용량 코호트는 안전성 검토 위원회 (SRC)에 의해 안전한 것으로 간주되었으며, 다음 더 높은 용량 (각각 최대 SAD 900 mg 및 MAD 600 mg)에 대해 방출이 허용되었다. 관찰된 약물동태학적 프로파일은 추가 임상 개발을 위해 의도된 1일 1회 요법을 뒷받침한다.

시험 기간 동안 총 유해 사례가 거의 없었고 어떤 심각한 유해 사례도 관찰되지 않았다. 따라서 PD-0184264는 안전하고 내약성이 양호한 것으로 간주된다. 약물동태학 노출 및 MEK 억제의 결정이 검증되었고 임상적으로 관련된 혈액 수준의 유지를 확인하였다.

본 발명은 또한 상이한 조성물, 바람직하게는 제약 조성물을 구상한다. 본 발명은 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 유사하게 박테리아 감염 및/또는 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD 0184264를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 의해 박테리아 감염 및 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한, PD-0184264 및 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스, 및/또는 박테리아를 표적화하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 게다가, 본 발명은 박테리아 감염 또는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 및 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기에 언급된 바와 같이, PD-0184264 및 궁극적으로 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제 및/또는 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 조성물은 제약 조성물일 수 있다. 제약 조성물의 바람직한 실시양태는 PD 0184264 및 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 억제제, 특히 뉴라미니다제 억제제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 PD 0184264 및 추가 MEK 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 담체, 바람직하게는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 조성물은 경구 투여가능한 현탁액 또는 정제, 비강 스프레이, 흡입 장치용 제제, 멸균 주사가능한 제제 (정맥내, 흉막내, 근육내)의 형태, 예를 들어, 멸균 주사가능한 수성 또는 유지성 현탁액 또는 좌제 형태로서일 수 있다.

PD-0184264 및 임의로 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제 및/또는 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제를 포함하는 본 발명의 사용을 위한 제약 조성물은 포유동물 또는 조류인 환자에게 투여된다. 적합한 포유동물의 예는 마우스, 래트, 소, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 기니피그, 개, 햄스터, 밍크, 물개, 고래, 낙타, 침팬지, 붉은털원숭이 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 인간이 바람직하다. 적합한 조류의 예는 몇 가지 예만 들면, 칠면조, 닭, 거위, 오리, 쇠오리, 청둥오리, 찌르레기, 고방오리, 갈매기, 백조, 뿔닭 또는 물새를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 환자는 본 발명의 특정한 실시양태이다

억제제 또는 억제제들은 바람직하게는 치료 유효량으로 투여된다. PD-0184264 또는 각각의 활성 화합물/억제제에 대한 "치료 유효량"은 사용된 화합물의 활성, 환자의 신체내 활성 화합물의 안정성, 완화될 병태의 중증도, 치료될 환자의 총 체중, 투여 경로, 체내에서 화합물의 흡수, 분포 및 배설의 용이성, 치료될 환자의 연령 및 민감도, 통상의 기술자에게 명백할, 유해 사례 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여량은 시간이 지남에 따라 다양한 요인이 변화함에 따라 조정될 수 있다.

본원에 기재된 억제제, 방법 및 용도는 인간 요법 및 수의학적 적용 둘 다에 적용가능하다. 본원에 기재된 화합물, 특히 PD-0184264 및 임의로 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제 및/또는 원하는 치료 활성을 갖는 박테리아를 표적으로 하는 하나 이상의 억제제는 본원에 기재된 바와 같이, 생리학상 허용되는 담체 중에서 대상체에게 투여될 수 있다. 도입 방식에 따라, 화합물은 하기에 논의된 바와 같이 여러 가지의 방식으로 제제화될 수 있다. 제제 중 치료 활성 화합물의 농도는 약 0.1-100 wt. %로 달라질 수 있다. 작용제는 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여 투여될 수 있다. 실시예 1은 25 및 75 mg/kg의 PD-0184264가 경구 투여에 의해 생체내에서 효과적임을 나타낸다. 따라서, PD-0184264는 10 내지 100 mg/kg PD-0184264의 범위, 바람직하게는 25 내지 75 mg/kg PD-0184264 범위의 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 및 800 mg과 같은 임의의 투여량을 포함한, 100 내지 900 mg의 1일 1회 투여량이다. 바람직한 실시양태에서, 투여는 1일 1회이고 투여량은 경구 투여되는 600 mg이다. PD-0184264는 연속 1일 내지 21일 이상의 기간 동안, 바람직하게는 7일 내지 14일 동안 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에서 제약 화합물은 임의의 적합한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 적합한 경구 제제는 정제, 캡슐, 현탁액, 시럽, 츄잉 검, 웨이퍼, 엘릭시르 등의 형태일 수 있다. 결합제, 부형제, 윤활제, 및 감미제 또는 향미제와 같은 제약상 허용되는 담체가 경구 제약 조성물에 포함될 수 있다. 원하는 경우, 특수 형태의 맛, 색상, 및 형상을 변형시키기 위한 기존 작용제가 또한 포함될 수 있다.

주사 가능한 제제의 경우, 제약 조성물은 적합한 바이알 또는 튜브에서 적합한 부형제와 혼합된 동결건조된 분말일 수 있다. 클리닉에서 사용하기 전에, 약물은 정맥내 또는 근육내 주사에 적합한 조성물을 형성하기 위해 동결건조된 분말을 적합한 용매 시스템에 용해시켜 재구성될 수 있다.

PD-0184264와 항바이러스제 예컨대 뉴라미니다제 억제제, 예컨대 오셀타미비르의 조합은 상승작용적 효과를 야기한다. 이 상승작용적 효과는 증가된 항바이러스 효과일 수 있으며, 이는 예를 들어 감소된 바이러스 역가 또는 연장된 치료 범위을 결과한다. 따라서, 본 발명은 또한 치료 유효량의 PD-0184264 뿐만 아니라 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 라니나미비르, 자나미비르 및 페라미비르의 군으로부터 선택된 치료 유효량의 뉴라미니다제 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 조성물은 치료 유효량 (예를 들어, 0.1 mg 내지 2000 mg, 0.1 mg 내지 1000 mg, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 200 mg, 30 mg 내지 300 mg, 0.1 mg 내지 75 mg, 0.1 mg 내지 30 mg)의 상기에 기재된 바와 같은 뉴라미니다제 억제제와 함께 경구 투여가능한 형태 (예를 들어, 정제 또는 캡슐 또는 시럽 등)일 수 있다.

추가 실시양태에서, PD-0184264는 본 발명의 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 시험관내 시험 시스템과 접촉할 때, 바이러스 및 박테리아 감염 둘 다를 감소시키며, 여기서 시험 시스템은 접촉 전의 시험관내 시험 시스템과 비교할 때

a) 인플루엔자 바이러스

b) 박테리아

에 감염된 배양된 세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, PD-0184264는 본 발명의 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 PD-0184264는 시험관내 시험 시스템과 접촉할 때 박테리아 감염을 감소시키고, 여기서 시험 시스템은 접촉 전의 시험관내 시험 시스템과 비교할 때, 박테리아에 감염된 배양된 세포를 포함한다.

이와 같이 본 발명은 또한 시험관내 시험 시스템에 관한 것이며, 여기서 시험 시스템은

a) 인플루엔자 바이러스 및

b) 박테리아

에 감염된 배양된 세포를 포함한다.

이에 따라, 본 발명은 또한 시험관내 시험 시스템을 제공하며, 여기서 시험관내 시험 시스템은 박테리아에 감염된 배양된 세포를 포함한다.

시험관내 시험 시스템이 바이러스 및 박테리아 감염을 포함하는 경우에, 또한, 이들 감염은 순차적으로 또는 동시에 발생할 수 있다.

"배양된 세포" 또는 "배양된 세포들"은 이의 자연 환경에 예를 들어 식물 또는 동물 내에서 존재하지 않는 세포이다. 오히려, 배양된 세포는 이의 자연 환경, 또는 세포주로부터 단리된 세포를 포함하는 1차 세포 배양물일 수 있다. 바람직하게는 배양된 세포는 인간 폐 상피 세포이다. 바람직하게는 배양된 세포는 0.5　ml, 1　ml, 1.5　ml, 2　ml, 2.5　ml, 3　ml, 3.5　ml, 4　ml 배지 예컨대 DMEM 중 약 1x10⁵, 2x10⁵, 3　x10⁵, 4x10⁵, 5x10⁵, 6x10⁵, 7x10⁵, 8x10⁵, 9x10⁵, 10x10⁵, 11x10⁵, 가장 바람직하게는 8x10⁵개 세포의 밀도로 시딩된다. 가장 바람직한 것은 2 ml DMEM 중 8x10⁵의 밀도이다.

이러한 배양된 세포는 바이러스 및 박테리아에, 또는 다른 실시양태에서는 박테리아 단독으로 감염된다. 상기에 이미 기재된 바와 같이, 동시-감염은 순차적 또는 동시적 방식으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포는 먼저 인플루엔자 바이러스에 감염되고 30분 후에 박테리아/박테리아에 감염될 수 있다. 3시간 후 배양물에 추가로 항생제를 첨가하여, 세포외 박테리아를 제거하는 것이 또한 가능하다. 이러한 시나리오에서, 이어서 항생제는 다시 씻겨 나갈 것이다. 다른 실시양태에서, 세포는 박테리아로만 감염된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "접촉"은 인플루엔자 바이러스 및 박테리아를 포함하는 세포를 PD-0184264에 공간적으로 매우 근접하게 가져오는 것을 지칭한다. 이는 예를 들어 억제제가 주사기를 통해 배양된 세포가 위치한 배지에 적용된다는 것을 의미할 수 있다.

한 실시양태에서, 바이러스 감염의 감소는 플라크 형성 단위 (PFU)/ml의 감소이고 박테리아 감염의 감소는 집락 형성 단위 (CFU)/ml의 감소이다. "플라크 형성 단위"는 바이러스 입자와 같이 단위 부피당 플라크를 형성할 수 있는 입자의 수를 측정한 것이다. 이는 입자의 절대량을 측정하는 것이라기 보다는 기능적 측정이다: 결함이 있거나 이의 표적 세포를 감염시키지 못하는 바이러스 입자는 플라크를 생성하지 않을 것이므로 계수되지 않을 것이다. 예를 들어, 1,000　PFU/μl의 농도를 가진 인플루엔자 바이러스 용액은 1 μl의 용액은 세포 단층에서 1000개의 감염성 플라크를 생성하기에 충분한 바이러스 입자를 보유함을 나타낸다. 본 발명의 경우에, 억제제로 처리된 세포 배양물은 PD-0184264로의 처리 전의 배양물과 비교할 때, 처리 후 배양물에서 감소된 수의 플라크 형성 단위를 나타낸다.

가능한 "플라크 형성 단위 (PFU)/ml의 감소"는 하기 방식으로 분석된다. 먼저 인플루엔자 바이러스와 박테리아에 동시-감염된 배양된 세포는, 예를 들어 페트리 접시로부터 일부 세포를 흡인하고 이들을 플레이팅하여 형성될 박테리아 플라크를 계수함으로써, 플라크 형성 단위 (PFU)/ml를 생성하는 이의 능력에 대해 분석된다. 이어서 이 결과는 억제제가 적용된 후 동일한 배양물의 세포에 의해 생성된 플라크 형성 단위 (PFU)/ml의 수와 비교된다. 플라크 형성 단위 (PFU)/ml의 수가 억제제의 적용 전에 생성된 수와 비교하여 억제제로 처리 후 감소되는 경우, 플라크 형성 단위의 감소가 있다.

"집락 형성 단위 (CFU)/ml"는 샘플 중 생존 가능한 박테리아의 수를 추정한다. 상이한 방법이 존재한다. 예를 들어, 집락 형성 단위를 생성하기 위해 샘플 (예를 들어 적은 부피의 배양된 세포)을 영양 한천 플레이트의 표면에 걸쳐 펼치고 계수를 위해 배양하기 전에 건조되도록 한다. 생존 가능한 박테리아는 제어된 조건에서 이분열을 통해 증식할 수 있는 능력으로서 정의된다. 세포 배양 중 집락의 시각적 외관은 상당한 성장을 필요로 한다 -집락을 계수할 때 집락이 하나의 세포 또는 1,000개 세포로부터 생성되었는지 확실하지 않다. 따라서, 결과는 액체의 경우 CFU/ml (밀리리터당 집락-형성 단위)로 보고되고 고체의 경우 CFU/g (그램당 집락-형성 단위)으로 보고되어 이러한 불확실성 (세포/ml 또는 세포/g이라기 보다는)을 반영한다.

"집락 형성 단위 (CFU)/ml"는 하기 방식으로 분석될 수 있다. 먼저 인플루엔자 바이러스와 박테리아에 또는 박테리아 단독으로 동시-감염된 배양된 세포는, 예를 들어 페트리 접시로부터 일부 세포를 흡인하고 이들을 플레이팅하여 이들을 계수함으로써, 집락 형성 단위 (CFU)/ml를 생성하는 이의 능력에 대해 분석된다. 이어서 이 결과는 억제제가 적용된 후 동일한 배양물의 세포에 의해 생성된 집락 형성 단위 (CFU)/ml의 수와 비교된다. 집락 형성 단위 (CFU)/ml의 수가 억제제의 적용 전에 생성된 수로 감소되는 경우, 감소가 있다.

일반적으로, 관련 기술의 통상의 기술자는 박테리아 및 바이러스 감염을 분석하는 이들 널리 공지된 기술을 알고 있다. 플라크 형성 단위 (PFU)/ml 및 집락 형성 단위 (CFU)/ml를 측정하는 방법은 문헌 (Tuchscherr et al. 2011, Hrincius et al. 2010)에 추가로 기재되어 있다.

본 발명의 목적을 위해, 상기에 정의된 바와 같은 활성 화합물은 또한 이의 제약상 허용되는 염(들)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 어구 "제약상 또는 화장품용으로 허용되는 염(들)"는 원하는 투여 형태에 대해 안전하고 효과적인 본 발명의 화합물의 그러한 염을 의미한다. 제약상 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온으로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.

본 발명은 또한 하기 항목을 특징으로 한다:

1. 바이러스성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

2. 항목 1에 있어서, 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염

5. 박테리아 감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

6. 항목 5에 있어서, 박테리아 감염이 바람직하게는 스타필로코카세아에, 스트렙토코카세아에, 레지오넬라세아에, 슈도모나다세아에, 바실라세아에, 클라미디아세아에, 미코플라스마타세아에, 엔테로박테리아세아에, 슈도모나달레스 및/또는 파스퇴렐라세아에로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개되는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

7. 박테리아 감염과 바이러스성 질환을 포함하는 동시-감염의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

8. 항목 7에 있어서, 박테리아 감염이 바람직하게는 스타필로코카세아에, 스트렙토코카세아에, 레지오넬라세아에, 슈도모나다세아에, 바실라세아에, 클라미디아세아에, 미코플라스마타세아에, 엔테로박테리아세아에, 슈도모나달레스 및/또는 파스퇴렐라세아에로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의해 매개되는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

9. 항목 7 또는 8에 있어서, 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

10. 항목 7 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 바이러스 감염이 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

11. 항목 7 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 바이러스 감염이 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 유발되는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

12. 항목 1 내지 4 및 7 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염과 조합되어 투여되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

13. 항목 12에 있어서, 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 제약상 허용되는 염으로부터 선택되는, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

14. PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.

15. PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염 및 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물.

16. 추가 MEK 억제제를 포함하는 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목의 임의의 용도.

17. 대상체, 바람직하게는 척추동물에서 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 따른 용도를 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.

***

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 분명히 달리 나타내지 않는 한 복수 참조대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 그러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고 "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법을 변형시키거나 대체할 수 있는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.

본 개시내용에 인용된 모든 간행물 및 특허는 그 전문이 참조로 포함된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서가 임의의 그러한 자료를 대신할 것이다.

달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 일상적인 실험을 통해서만 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하나, 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하는 것은 아니라는 점이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는"으로 대체될 수 있거나, 때때로 본원에서 사용되는 경우 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다

본원에서 사용되는 경우 "로 이루어진"은 청구항 요소에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 경우, "본질적으로 로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.

본원의 각각의 경우에 용어 "포함하는", "본질적으로 로 이루어진" 및 "~로 이루어진" 중 임의의 것은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.

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실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 예시의 목적으로 포함되며 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.

실시예 1: PD-0184264를 사용한 마우스의 처리는 폐에서 바이러스 역가의 감소를 야기한다

8주령 C57BL/6 마우스 (군당 다섯마리)를 인플루엔자 바이러스 균주 A/레겐스부르크/D6/2009, (RB1, H1N1pdm09)에 1,5 x 10⁵ PFU (5x MLD₅₀)로 감염시켰다. 감염 1시간 전부터 시작하여 마우스를 150　mg/kg CI-1040; 75　mg/kg CI-1040, 25　mg/kg CI-1040, 75　mg/kg PD0184264, 25　mg/kg PD0184264 또는 용매 (대조군)): 50　μl DMSO/150 μl 크레모포르/800 μl PBS로 8시간 간격으로 처리하였다. 모든 동물은 경구로 200 μl의 부피를 받았다. 마우스를 감염 후 24시간에 희생시키고 폐의 무게를 재고 라이싱 매트릭스(Lysing Matrix) D 튜브 (MP 바이오(MP Bio))로 옮기고 폐의 10배 부피의 양으로 BSS (완충 염 용액)를 샘플에 적용하였다. 패스트프렙(FastPrep) FP 120 (사반트(Savant))을 사용하여 장기를 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위해 균질액을 2000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 균질액 중 바이러스 역가의 결정은 아비셀(AVICEL)^® 플라크 검정을 사용하여 수행하였다. 결과는 도 1에 바이러스 역가 (log10) pfu/ml (왼쪽) 또는 % 바이러스 역가 (오른쪽)로서 제시하였다. 바이러스 역가는 두 명의 조사자가 독립적으로 결정하였다. 모든 적정으로부터의 평균값을 제시하였다.

실시예 2: CI 1040 또는 PD-0184264의 투여는 시험관내에서 MRSA를 포함한 박테리아 성장에 대한 억제 효과를 나타낸다.

일반적으로 박테리아 성장에 대한 CI-1040 또는 PD-0184264의 영향을 조사하기 위해, MRSA 균주 에스. 아우레우스 (USA300)의 무세포 밤새 배양물에 50 μM의 CI-1040 또는 PD 0184264 또는 용매로서 역할을 하는 동일한 부피 (40 μl)의 DMSO를 보충하였다 (도 2). 박테리아 성장을 360분 동안 모니터링하였다. PD-0184264는 박테리아 성장에 강한 영향을 미쳤으며, 상기 성장은 전체 관찰 기간 동안 거의 완전히 부재하였다. CI-1040은 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이 용매 대조군과 비교하여, 실험 개시 120분 후 시작하여 MRSA의 성장을 약간 억제하였다. 이는 PD-0184264 뿐만 아니라 CI-1040도 세포에서 MEK를 차단하는 것에 더하여 박테리아 성장을 담당하는 박테리아 구성요소를 차단한다는 것을 나타낸다.

박테리아 성장을 억제하는 데 필요한 PD-0184264의 농도를 조사하기 위해, PD-0184264를 에스. 아우레우스 USA300 (MRSA)의 밤새 배양에 상이한 농도로 투여하였다 (도 3에 표시된 바와 같이). MRSA 박테리아를 0　-　100 μM 범위의 상이한 농도의 MEK 억제제와 함께 배양하고 배양 후 6시간 동안 박테리아 성장을 모니터링하였다. 박테리아 성장의 50%를 억제하는 데 필요한 농도는 15 - 25 μM의 범위였다.

이들 데이터는 처리 후 나중 시점에서 OD 대신에 실제 박테리아 역가를 결정하는, 약간 상이한 실험 환경에서 검증할 수 있을 것이다. 에스. 아우레우스 6850의 하루종일 배양(over-day culture)은 20 CFU/ml로 설정하였고 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 표시된 바와 같이 상이한 농도의 CI-1040으로 처리하였다. 이어서, 광학 밀도 (OD₆₀₀)를 측정하였다. 나머지 배양물은 PBS로 세척하고 연속 희석액을 BHI 한천 플레이트에 처리(objecting)하였다. 박테리아 역가는 ml당 집락 형성 단위 (CFU/ml)로 나타낸다. 결과는 두 가지 기술적 복제물을 가진 세 가지 독립적인 생물학적 실험의 평균 + SD를 나타내며 도 4A에 나타냈다. 게다가, 에스. 아우레우스 6850 (도 4B) 또는 MRSA 균주 USA300 (도 4C)의 하루종일 배양을 20 CFU/ml로 설정하고 37℃ 및 5 % CO₂에서 밤새 표시된 바와 같이 상이한 농도의 PD-0184264로 처리하였다. 아침에 광학 밀도 (OD600)를 측정하였다. 나머지 배양물을 PBS로 1회 세척한 다음에 연속 희석액을 BHI 한천 플레이트에 처리하였다. 박테리아 역가는 집락 계수기 "프로토콜3"을 사용하여 결정하였으며 대수 규모(logarithmic scale)에서 ml당 집락 형성 단위 (CFU/ml)로 나타냈다. 결과는 두 가지 기술적 복제물을 가진 세 가지 독립적인 생물학적 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어서 듀넷(Dunnett)의 다중 비교 검정에 의해 분석하였다. CI-1040 (도 4A)과 PD-0184264 (도 4B, C)는 둘 다, 에스. 아우레우스 균주 6850 (도 4A, B) 및 MRSA 균주 USA 300 (도 4C)에 대한 이들 검정에서 또한 효과적이었다 20 μM의 PD-0184264를 사용하여 최대 1.5 내지 2 자릿수의 역가의 매우 강한 감소가 검출될 수 있을 것이다 (도 4B, C).

실시예 3: 단일 또는 동시-감염된 세포에 PD-0184264의 투여는 IAV 및/또는 에스. 아우레우스의 세포병변 효과로부터 세포를 보호한다

PD-0184264의 항바이러스 및 강한 항박테리아 효과를 고려해 볼 때 (상기 실시예 2의 도 2 내지 4), 본 발명자들은 화합물의 이러한 특징이 IAV 및/또는 에스. 아우레우스 감염에 의해 도출된 세포 붕괴 세포병변 효과 (CPE)와 관련하여 육안으로 또한 관찰될 수 있는 지 여부를 분석하였다. 인간 폐 상피 세포 (A549)를 PD-0184264 (표시된 농도에서) 또는 용매 (DMSO)로 전처리하고 37℃에서 감염다중도 (MOI=0.001)에서 인간 인플루엔자 바이러스 균주 A/푸에르토리코/8/34 (H1N1)로 감염시켰다. 30분 후, 바이러스 희석액을 제거하고, 세포를 PBS로 헹구고 표시된 억제제 또는 용매 대조군의 농도의 존재 하에 에스. 아우레우스 6850 (MOI=0.1)이 있거나 없는 침윤 배지 DMEM/INV (1% 인간 혈청 알부민, 25 nM HEPES 함유)로 보충하였다. 박테리아 감염 3시간 후 세포를 10% FBS, 2　μg/ml 리소스타핀을 함유하는 DMEM/FBS로 20분 동안 처리하여 세포외 박테리아를 제거하였다. PBS로 추가 세척한 후, 세포를 억제제 또는 용매를 함유하는 감염 배지 DMEM/BA (0.2　% BA, 1　mM MgCl2, 0.9　mM CaCl2, 100　U/ml 페니실린, 0.1　mg/ml 스트렙토마이신)로 보충하였다. 37℃에서 24시간의 인큐베이션 후, 광학 현미경으로 세포 형태를 조사하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, IAV (H1N1) 또는 에스. 아우레우스 균주 6850에 의한 단일 감염 후에 세포 단층의 약간의 붕괴가 관찰되었다. 이 CPE는 병원체 둘 다 (하단 패널)에 의한 동시-감염시 강하게 증가하였다. 그러나, MEK-억제제의 양이 증가함에 따라 세포 단층이 무손상인 채로 유지되고 세포가 덜 둥근 형상임에 따라 이 표현형은 농도 의존적 방식으로 역전될 수 있었다. PD-0184264의 이러한 세포 보호 효과는 항바이러스 및 항박테리아 특성을 완벽하게 반영한다 (도 5).

실시예 4: PD-0184264와 일반 항생제의 항박테리아 작용 비교

MEK-억제제 PD0184164의 항박테리아 특성을 일반 항생제의 작용에 맞추어 조정하기 위해, 본 발명자들은 박테리아를 밤새 용매, MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 상이한 농도의 항생제 젠타마이신으로 처리하였다. 에스. 아우레우스 6850 또는 MRSA 균주 USA300의 하루종일 배양을 20 CFU/ml로 설정하고 37℃ 및 5% CO₂에서 MEK 억제제 U0126 및 PD-0184264 또는 항생제 젠타마이신으로 밤새 표시된 바와 같이 처리하였다. 아침에 광학 밀도 (OD600)를 측정하였다. 나머지 배양물을 PBS로 1회 세척한 다음에 연속 희석액을 BHI 한천 플레이트에 처리하였다. 박테리아 역가는 집락 계수기 "프로토콜3"을 사용하여 결정하였으며 ml당 집락 형성 단위 (CFU/ml)로 나타냈다. 도 6에 나타낸 결과는 두 가지 기술적 복제물을 가진 세 가지 독립적인 생물학적 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석에 이어서 듀넷의 다중 비교 검정에 의해 분석하였다. 용매 처리된 박테리아와 비교하여, 1세대 MEK-억제제 U0126과의 인큐베이션은 박테리아 역가의 경미한 감소만을 결과하였으며, 한편 PD-0184264로의 처리는 도 4에 앞서 나타낸 바와 같이 박테리아 로드의 매우 강한 감소를 야기하였다. 이는 박테리아 균주 둘 다에 해당되었다. 예상된 바와 같이, 항생제의 항박테리아 작용은 에스. 아우레우스 6850의 경우에 더 높았긴 하지만, 박테리아 균주 둘 다의 성장은 1　μg/ml 초과의 농도로 젠타마이신 처리에 의해 강하게 억제되었다. 0.5 μg/ml 젠타마이신에서 박테리아 역가의 어떤 감소도 균주 둘 다에 대해 검출될 수 없을 것이다. 요약하면, MEK 억제제 PD-0184264가 박테리아 성장에 미치는 영향은 항생제 젠타마이신의 낮은 농도만큼 거의 효율적이었다.

PD-0184264의 항박테리아 작용을 다른 MEK 억제 화합물 또는 항생제 젠타마이신과 추가로 비교하기 위해, 첨가-시간 검정을 수행하였다 (도 7a). 에스. 아우레우스 6850의 밤새 배양을 용매 DMSO 단독 또는 MEK-억제제 U0126 및 PD-0184264 중 하나 또는 두 가지 다른 농도의 항생제 젠타마이신 (0,5 또는 2 μg/ml)과 함께 15 ml의 BHI 배지를 포함하는 6개의 계대배양으로 나누었다. 상이한 화합물을 첨가한 직후 OD600을 측정하고 연속 희석액을 BHI 한천 플레이트에 처리하여 박테리아 역가를 계산하였다. 나머지 배양물은 물질 또는 용매 단독의 존재 하에 5% CO₂와 함께 37℃에서 추가로 인큐베이션되었다. 이 절차를 접종 후 3시간과 6시간에 2회 반복하였다. 박테리아 역가는 집락 계수기 "프로토콜3"을 사용하여 결정하였으며 ml당 집락 형성 단위 (CFU/ml)로 나타냈다. MEK-억제제 PD-0184264로의 처리는 다른 모든 화합물과 비교하여 박테리아 성장의 가장 강한 억제를 나타냈다. 그 후에, 배지 교환을 수행하고 어떠한 물질도 첨가하지 않고 배양물을 추가로 인큐베이션하였다. 모든 배양물은 이전에 용매 처리된 배양물의 탁도에 도달했으며, 이는 MEK 억제제 PD-0184264가 살박테리아 작용이라기 보다는 정균 작용을 나타냄을 나타낸다.

일반적으로 사용되는 여러 가지의 항생제에 대한 내성 발생(resistance development)은 정기적으로 발생하며 클리닉에서 주요 문제를 나타낸다. MEK 억제제 PD0184264가 에스. 아우레우스에서 내성 발생을 유발하는지 여부를 시험하기 위해, 배양물을 억제제, 젠타마이신, 에리트로마이신의 존재 하에 거의 3주 동안 지속적으로 처리하거나 미처리 상태로 두었다. 구체적으로, 배양물은 물질의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 성장시키고, OD₆₀₀을 측정한 다음에, 배양물을 20 CFU/ml로 설정하고 24시간 동안 다시 성장시켰다. 이 절차를 17일 동안 반복하였다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 분산분석 후 듀넷의 다중 비교 검정에 의해 분석하였다 (* p　<　0.05; ** p　<　0.01; *** p　<　0.001; **** p　<　0.0001). 젠타마이신로부터 알 수 있는 바와 같이, 마크롤리드 항생제 에리트로마이신과 대조적으로 치료 첫 주에 내성이 발생하였다. 특히 MEK 억제제 치료는 내성을 유도하지 않았다 (도 7b에 나타낸 결과 참조).

실시예 5: 박테리아 키나제 PknB는 박테리아에서 PD-0184264의 표적일 수 있다

억제제 PD-0184264는 포유동물에 존재하는 키나제 MEK에 특이적인 것으로 가정된다. 이의 직접적인 항박테리아 효과는 원핵생물의 작용 방식에 대한 의문을 제기하며, 즉, PD-0184264에 의해 구체적으로 표적화될 수도 있는 MEK-유사 박테리아 구성요소가 있는지 여부이다. 이 시점에서, 박테리아성 세린/트레오닌 키나제 PknB가 조사의 초점이 되었다. 이 키나제는 세포성 세린/트레오닌 키나제, 보다 정확하게는 MEK 키나제 예컨대 p38, JNK 및 ERK에 대해 높은 구조적 및 기능적 유사성을 나타내며 (Miller et al., 2010, Rakette et al. 2012) (도 8), 이들은 포유동물 세포의 표적이다. 흥미롭게도, 키나제는 자가인산화에 의해 활성화되는 것으로 나타났으며, 따라서, 이는 MEK-유사 활성을 나타낸다는 것을 강하게 시사한다.

실시예 6: PD-0184264는 항생제에 대한 스타필로코커스 아우레우스의 민감도를 증가시키고 박테리아 스트레스 내성을 감소시킨다

3개의 페니실린 결합 도메인 (PASTA)의 발현으로 인해 (도 8, 상단 패널 참조) PknB는 항생제 감수성의 조절에 관여한다. 키나제의 결여는 상이한 항생제, 특히 여러 가지의 β-락탐에 대한 증가된 감수성을 결과하는 것으로 나타날 수 있을 것이다 (Tamber et al. 2010). MEK-억제제 PD-0184264를 사용한 박테리아의 처리가 박테리아 키나제에 영향을 미칠 수 있고 키나제의 녹아웃과 유사한 표현형을 결과할 수 있는지 조사하기 위해, 박테리아 배양물을 밤새 용매 (DMSO) 또는 20 μM의 PD-0184264로 처리한 다음에 사용하여 상이한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC)를 결정하였다. 에스. 아우레우스 6850의 하루종일 배양을 20 CFU/ml로 설정하고 용매 (DMSO 또는 MEK 억제제 PD-0184264)로 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 처리하였다. 아침에, 광학 밀도 (D600)를 측정하였다. 간단히 말하면, 용매 및 억제제 처리된 배양물을 PBS로 1회 세척하고 1:1 희석액을 BHI 한천 플레이트에 처리하였다. 접종 직후 상이한 항생제 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific))에 대한 MIC 시험 스트립을 플레이트의 중간에 배치한 다음에 37℃에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 18시간 인큐베이션한 후 MIC 농도를 플레이트의 시각적 분석을 통해 결정하였다. 어떤 성장 억제도 더 이상 보이지 않는 농도를 각각의 개별 항생제에 대한 MIC로 명명하였다. PD-0184264 처리는 실제로 상이한 항생제에 대한 박테리아의 감수성의 증가를 야기하였으며, 이는 페니실린과 젠타마이신의 경우에 가장 두드러졌다 (도 9, 표 2). 이 결과는 키나제가 결여된 돌연변이 균주로 생성된 공개된 데이터와 완벽하게 일치한다 (Tamber et al. 2010).

[표 2]

PD0184264로 밤새 처리한 후 MIC의 결정

키나제가 결여된 박테리아의 표현형과 일치하는 PD-0184264로의 처리시 관찰된 항생제 감수성 증가 (Tamber et al. 2010)는, PknB가 억제제에 의해 직접 표적화될 수 있음을 강하게 시사한다. 키나제는 박테리아 스트레스 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있으므로, 억제제 PD-0184264로 박테리아를 처리한 후 열 스트레스 하에서 박테리아 성장을 모니터링하였다. 에스. 아우레우스 균주 6850 및 MRSA 균주 USA300을 용매 또는 20 μM의 PD-0184264로 밤새 처리하였다. 다음날 동일한 양의 박테리아로 계대배양을 준비하고 (OD600 및 BHI 한천에 플레이팅하여 확인) 42℃에서 6시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 이어서 BHI 한천 플레이트에 연속 희석액을 플레이팅하여 박테리아 역가를 계산하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, PD-0184264-처리된 박테리아는 용매 처리된 병원체와 비교하여 이들 조건 하에 강하게 손상되었다. 이는 메티실린-민감성 균주 6850 (흑색 막대)뿐만 아니라 MRSA 균주 USA300 (회색 막대) 둘 다에서 관찰된다. 억제제의 존재 하에서 손상된 스트레스 내성은 PD-0184264가 스트레스 내성의 중요한 매개체인 키나제 PknB를 직접 표적으로 한다는 또 다른 징후이다. 요약하면, 데이터는 PD-0184264가 박테리아 키나제 PknB를 억제하여 이의 항박테리아 작용을 도출한다는 강한 정황 증거를 제공한다.

실시예 7: PD-0184264의 투여는 스트렙토코커스 뉴모니아 및 바실러스 서브틸리스의 성장에 대한 억제 효과를 나타낸다

에스. 아우레우스 외에도, 환자에서 인플루엔자 바이러스 (IV) 감염에 따른 2차 박테리아성 폐렴을 유발하는 것으로 공지된 다른 박테리아이 있다. 이 맥락에서 가장 풍부한 병원체는 스트렙토코커스 뉴모니아에이다. 이들 박테리아는 지역사회-획득 폐렴의 가장 일반적인 원인이다. 에스. 아우레우스와 대조적으로, 스트렙토코커스 뉴모니아에의 2차 감염은 IV 후 오히려 후기 단계에서 발생하므로 인플루엔자 후 폐렴(post-influenza pneumonia)의 말단에 상응한다.

에스. 아우레우스와 유사하게, 스트렙토코커스 뉴모니아에 균주의 대부분은 PknB와 같은 진핵생물-유사 세린/트레오닌 키나제를 발현하며, 이는 상이한 속 간에 고도로 보존된다. 게다가, 이들 키나제는 세포 MAP 키나제 (예를 들어 ERK, JNK, p38)와 높은 상동성을 공유한다. 상이한 에스. 아우레우스 균주로 수득한 실시예 2 내지 6에 나타낸 결과는 박테리아 성장에 대한 PD-0184264 처리의 억제 효과를 이미 입증하였으며, 이는 관찰된 표현형에서 PknB와 같은 박테리아 키나제의 관여를 시사한다. 놀랍게도, 에스. 아우레우스 PknB의 상동체가 스트렙토코커스 뉴모니아에도 존재하며, 이는 이들 박테리아가 PD 0184264에도 민감할 수 있음을 시사한다. 따라서, PD-0184264가 스트렙토코커스 뉴모니아의 상이한 균주에 미치는 영향을 분석하였다. 스트렙토코커스 뉴모니아에 균주는 독성 및 전반적인 병원성이 상이한 여러 혈청형으로 나눌 수 있다. 혈청형- 또는 균주-독립적인 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 캡슐화된 균주 D39와 TIGR4를 사용하였으며, 이들은 둘 다 독성이 있으나, 서로 상이한 혈청형에 속한다. PD-0184264를 사용한 처리는 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아에의 성장을 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 스트렙토코커스 뉴모니아에 균주 TIGR4 (혈청형 4) 및 D39 wt (혈청형 2)의 하루종일 배양물을 광학 밀도 (OD600) 1로 설정하고 BHI 배지에서 1:2000 희석하고 용매 (DMSO) 또는 표시된 바와 같이 상이한 농도의 특정 MEK 억제제 PD0184264 (PD; 활성 대사산물 또는 CI-1040)로 밤새 처리하였다. 이어서, OD600을 다시 측정하고(결과는 도 11A에 나타냄) 연속 희석물을 BHI 한천 플레이트에 처리하여 박테리아 역가를 결정하였다 (결과는 도 11B에 나타냄). 그 결과, 혈청형 둘 다가 PD-0184264에 민감함을 입증할 수 있을 것이다 (도 11a, b).

10 μM PD-0184264의 존재 하에 생존 가능한 박테리아 수의 강한 감소가 관찰되었고 더 높은 농도에서 완전한 파괴가 관찰된 바실러스 서브틸리스의 경우에도 마찬가지이다 (도 11c의 결과 참조). 구체적으로, 비. 서브틸리스(B. subtilis)에 대한 잠재적인 항박테리아 효과를 시험하기 위해 비. 서브틸리스의 밤새 배양물을 용매 또는 상이한 농도의 MEK 억제제 PD-0184264 (표시된 대로)와 함께 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, OD600 측정 및 BHI 한천 플레이트에 연속 희석액의 플레이팅을 통해 박테리아 로드를 결정하였다. 도 11에 도시된 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균 + SD를 나타낸다.

요약하면, 이들 데이터는 항박테리아 치료에서 PD-0184264의 광범위한 적용 가능성을 나타낸다.

실시예 8: CI-1040이 아니라 PD-0184264가 세포내 박테리아 역가를 감소시킨다

인플루엔자 바이러스 (IV) 감염은 항바이러스 시토카인, 가장 중요하게는 중대한 하류 항바이러스 반응을 활성화하고 후속 박테리아 감염을 또한 강화할 수 있는 I형 IFN의 발현을 향상시킨다. CI-1040 또는 PD-0184264 처리가 2차 에스. 아우레우스 감염에 대해 세포를 감작하는지 여부를 확인하기 위해, 불멸화된 인간 폐포 기저 상피 세포 (A549)의 세포 배양물을 억제제의 존재 또는 부재 하에 인플루엔자 IV 및 에스. 아우레우스에 감염시켰다. 구체적으로, A549 세포는 용매 대조군으로서 10 μM의 특이적 MEK-억제제 PD-0184264 또는 DMSO로 1시간 동안 전처리하였다. 그 후, 세포를 PBS로 헹구고 37℃, 5% CO₂에서 30분 동안 인플루엔자 바이러스 (IV) (표시된 바와 같이 MOI)로 감염시켰다. 이후에, 세포를 PBS로 세척하고 억제제의 존재 또는 부재하에 3시간 동안 에스. 아우레우스 6850 (표시된 바와 같이 MOI)으로 감염시켰다. 박테리아의 과-성장을 방지하기 위해. 리소스타핀 (2 μg/mL)을 사용한 항생제 세척 단계를 37℃에서 20분 동안 수행하여 내부화되지 않은 박테리아를 제거하였다. 이어서, 세포를 1회 세척하고 억제제 또는 용매의 존재 하에 24시간 p.i.까지 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간의 종료에, 세포 단층을 광학 현미경을 통해 분석하였다. 현미경 검사는 두 병원체 모두에 대한 초-감염이 단일 감염과 비교하여 세포병변 효과 (CPE)가 크게 증가한 것으로 나타났다 (도 13, 상단 패널). CPE는 PD-0184264 (도 13, 하단 패널)의 존재 하에 완전히 파괴되어 바이러스 복제가 감소되었음을 나타낸다.

PD-0184264로의 처리 및 CI-1040으로의 처리가 비슷한지 확인하기 위해, A549 세포를 10 μM CI-1040, PD-0184264 또는 용매 (DMSO)로 60분 동안 전처리한 다음에 37℃에서 0.001의 MOI로 인플루엔자 IV (H7N7)에 감염시켰다. 결과는 각각 도 14A 및 14B에 나타냈다. 대안적으로, 세포를 미처리 상태로 두고 (DMSO) 37℃에서 0.01의 MOI로 IV (H1N1)에 감염시켰다. 30분 후 바이러스 희석액을 제거하고, 세포를 PBS로 헹구고 10 μM CI-1040, PD-0184264 또는 용매 대조군의 존재 하에 에스. 아우레우스 6850 (6850) (MOI 0.1)이 있거나 없는 침윤 배지로 보충하였다. 박테리아 감염 3시간 후 세포를 리소스타핀 (2 μg/mL)으로 20분 동안 처리하여 세포외 박테리아를 제거하였다. 이어서 세포를 세척하고 억제제 또는 용매를 함유하는 감염 배지로 보충하였다. 24시간의 총 인큐베이션 기간 후(바이러스 감염 후) 세포내 박테리아 역가를 분석하였다. 결과는 세 가지 개별 실험의 평균 + SD를 나타낸다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석에 이어서 터키(Tukey)의 다중 비교 검정에 의해 평가하였다 (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). 도 14A로부터 알 수 있는 바와 같이, CI-1040 처리는 세포내 박테리아 로드의 변화가 검출될 수 없었기 때문에 에스. 아우레우스에 의한 2차 감염에 대해 세포를 감작시키지 않았다. 놀랍게도, PD-0184264의 투여는 도 14B로부터 알 수 있는 바와 같이 감소된 세포내 박테리아 역가를 심지어 결과하였다. CI-1040 또는 PD-0184264가 도 14C에 도시된 바와 같이 진행 중인 감염 동안 나중에 투여되었을 때 비슷한 결과를 수득하였다.

바이러스 및 세포내 박테리아 복제의 감소가 A549 세포에 대한 PD-0184264의 세포독성 효과의 결과임을 배제하기 위해, 증가하는 농도의 존재 하에 세포 생존을 24시간 및 48시간 동안 모니터링하였다. 게다가, 억제제 처리로 인한 막 파열을 결정하기 위해 LDH-검정을 수행하였다. PD-0184264를 사용한 A549 세포의 처리는 세포 독성을 유도하지 않는 것으로 나타났다. A549 세포를 PD-0184264 (1, 5, 10, 20, 50 또는 100 μM)의 농도를 증가시키면서 24시간 (도 15A 및 C에 표시된 바와 같음) 또는 48시간 (도 15B 및 D에 표시된 바와 같음) 동안 처리하였다. 인큐베이션 시간 후, 제조업체의 지침에 따라 시토실렉트(CytoSelect) LDH 세포독성 검정 키트를 사용하여 LDH 방출 측정을 위해 상청액을 취하였다 (도 15C, D에 나타냄). 게다가, 트립판 블루로 염색하여 생존 세포를 계수하였다. 세포 생존력은 DMSO 처리된 세포에 대해 정규화되었으며 % 생존력으로 나타냈다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균 + SD를 의미한다. 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 이어서 듀넷의 다중 비교 검정에 의해 계산되었다 (* p < 0.05; ** p < 0.01; 27 *** p < 0.001).

실시예 9: CI-1040 및 PD-0184264에 대한 IC ₅₀ 값의 결정

억제제 분취량을 100% DMSO (마스터 용액 10 mM)에 용해시켰다. IC50 값을 분석하기 위해 미세역가 플레이트에서 50 μM, 25 μM, 5 μM, 2.5 μM, 0.5 μM, 0.25 μM, 0.05 μM, 0.025 μM, 0.025 μM, 0.005 μM의 연속 희석액을 준비하였다. 각각의 희석액 1 μl를 키나제 반응 혼합물 49 μl에 첨가하여 하기 시험 농도를 산출하였다: 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0.5 nM, 0.1 nM.

3 μl 활성 c-Raf1, 2 μl MEK1wt 및 3 μl ERK2wt의 정제된 단백질 용액을 키나제 완충제 및 1 μl DMSO 또는 DMSO/억제제 (최종 부피 45 μl)와 혼합하였다. 혼합물을 암실에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이 사전 인큐베이션 후에, MEK 단백질에 대한 억제제 결합을 확인하고, 5 μl의 10 mM ATP를 첨가하고 피펫과 혼합하여 키나제 반응을 시작하였다. 샘플을 500 rpm에서 26℃ 써모 믹서(Thermo mixer) (에펜도르프(Eppendorf))에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 키나제 반응을 중지하기 위해, 5.5 μl의 20% SDS 용액을 첨가하고 이 혼합물을 후속적으로 50℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 각각의 샘플을 190 μl 차단 완충제 (TBST 중 1% BSA)으로 희석하였다. 100 μl의 각각의 샘플을 96-웰-마이크로타이터 플레이트의 항-ERK 항체 코팅된 웰에 첨가하였다.

키나제 반응 샘플 (100 μl/웰)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 항-ERK 항체 코팅 및 BSA 차단 웰에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이후에 플레이트를 100 μl TBST 세척 완충제로 3x5분 세척하였다. 인산화된 ERK를 검출하기 위해, 항 포스포-ERK (p44/p42) 항체 (1:3000, 차단 완충제 중 100 μl/웰)를 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

3회의 세척 단계 (3x100 μl/웰) 후, HRP-접합된 항-마우스 IgG 특이적 항체 (TBST 중 1:1000)를 첨가하고 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl/웰의 퍼옥시다제 기질 ABTS를 3회의 추가 세척 단계 (3x100 μl/웰 TBST) 후에 첨가하고 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 기질 반응은 2.5 μl의 20% SDS를 첨가하여 정지시켰다. 혼합물의 광학 밀도(OD)는 ELISA 판독기에서 405 nm의 파장에서 측정된다.

무세포 키나제 검정은 실제로 MEK 키나제의 더 약한 억제제인 PD-0184264와 비교하여 MEK 활성의 50%를 억제하는 데 12.5배 더 적은 CI-1040 (도 16)이 필요함을 밝혀냈다. 따라서, PD-0184264의 강한 항바이러스 및 항박테리아 효과를 예상한 사람은 아무도 없었을 것이다. 그러나, 앞서 실시예에 나타낸 바와 같이, PD-0184264는 생체내에서 CI-1040와 비교하여 더 강한 항바이러스 및 항박테리아 활성을 나타낸다.

실시예 10: 시험관내 검정에서 PD-0184264의 항바이러스 활성

약물

CI-1040 [2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(시클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로 벤즈아미드; Lot: CC-5395.0-16] 및 PD-0184264 (PD0184264) [2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; Lot: CC-5595.4-10]은 켐콘 게엠베하(ChemCon GmbH) (독일 프라이부르크)에서 합성되었다. 세포 배양 실험을 위해, CI-1040 (M=478,66 g/mol) 및 PD-0184264 (M=409,55 g/mol)의 10 mM 스톡 용액을 DMSO (머크-밀리포어(Merck-Millipore), 독일)에서 준비하였다.

바이러스 및 세포

0.001의 MOI로 인플루엔자 A 바이러스 균주 RB1[A/레겐스부르크/D6/09 (H1N1pdm09)]으로 수행된 바이러스 억제 실험.

자손 바이러스 억제 검정

A549 세포를 5% CO₂ 분위기에서 37℃에서 30분 동안 RB1로 감염시켰다. 인큐베이션 후, 바이러스 희석액을 흡인하고, 세포를 PBS로 헹구고 500 μl IMDM (이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)/BA (소 알부민) - 배지 (0.2% BA, 1 mM MgCl₂, 0.9　mM CaCl₂, 100 U/ml 페니실린, 0.1 mg/ml 스트렙토마이신) 및 0.6 μl TPCK-처리된 트립신으로, 10 μM CI-1040 또는 상이한 농도의 PD-0184264 (100 μM, 50 μM, 1　0 μM, 5 μM, 1　μM, 0.5 μM 및 0.1 μM, 최종 DMSO 농도 = 1　%)의 존재 하에 5　% CO₂에서 37℃에서 24시간 동안 보충하였다. 용매 대조군은 1% DMSO를 가진 IMDM/BA-배지였다. 세포 배양 상청액을 수집하여 이전에 기재한 바와 같이 아비셀^® 플라크 검정을 사용하여 MDCK II 세포에 대한 자손 바이러스 역가를 결정하였다 (Haasbach et al. 2011, Matrosovich et al. 2006).

WST-검정

A549 세포를 96-웰 평평한-바닥 조직 플레이트 (그라이너(Greiner), 독일)에 시딩하고 밤새 성장시켰다. 그 후, 세포를 5% 태아 송아지 혈청 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 독일) 최종 DMSO 농도 = 1%로 보충된 100 μl IMDM (써모피셔, 독일)에 용해된 상이한 농도의 PD-0184264 (100 μM, 50 μM, 10 μM, 5 μM, 1 μM, 0.5 μM 및 0.1 μM)로 처리하고 배양을 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 수행하였다. 그 후에, 10 μl WST-1 시약 (로슈(Roche), 독일)을 배양 배지에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 동안, 안정한 테트라졸륨염 WST-1은 배양물에서 대사적으로 활성인 세포에 의해 가용성 포르마잔으로 절단하였다. 이 인큐베이션 기간 후, 형성된 포르마잔 염료를 405 nm에서 ELISA 판독기로 정량화하였다. 측정된 흡광도는 생존 가능한 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있다.

결과

RB1에 대한 PD-0184264의 항바이러스 활성을 표준 바이러스 억제 검정에서 조사하였다 (도 17A). 세포가 1100 μM PD-0184264 (P >0.0001)로 처리되었을 때 바이러스 역가의 98.87 ± 0.03% 감소가 발견되었다. 유사한 감소가 50 μM PD-0184264에서 발견되었다 91.50 ± 2.08　%; P >0.0001). 대조적으로, 10 μM PD-0184264가 사용되었을 때 바이러스 역가의 약한 감소만이 발견되었다 (58.97 ± 4.45 %). 1 μM PD-0184264는 자손 바이러스의 감소를 거의 나타내지 않았다. 따라서, 10 μM CI-1040 (96.78 ± 0.65　%; P　>　0.0001)을 사용한 바이러스 감소와 비교하여 자손 인플루엔자 바이러스의 유사한 감소를 달성하려면 PD-0184264의 거의 10배 더 높은 농도가 필요하다. 이는 CI-1040과 비교하여 PD-0184264의 EC50 값과도 일치한다. PD-0184264의 경우 EC₅₀ 값은 0.804 μM이다 (도 17B). 또 다른 연구에서, RB1에 대한 CI-1040의 EC₅₀ 값은 0.026 μM로 결정될 수 있을 것이다 (Haasbach et al. 2017). PD-0184264 CC₅₀ 값 > 1576 (도 17C)은 CI-1040 (> 312.3 μM; Haasbach et al. 2017)와 비교하여 더 높다. 따라서 PD-0184264는 S.I. = 1960 (선택성 지수)을 갖는다.

요약/논의

결과는 CI-1040과 비교하여, 세포 배양, 즉 시험관내에서 PD-0184264의 감소된 항바이러스 활성을 입증한다. 시험관내 검정에서 CI-1040과 동일한 바이러스 감소를 달성하려면 거의 10배 더 높은 농도의 PD-0184264가 필요하다. 이들 두 화합물 간의 EC₅₀ 값 차이는 훨씬 더 두드러진다. 여기서, PD-0184264의 EC₅₀ 값은 CI-1040의 EC₅₀ 값과 비교하여 31배 더 높다 (Haasbach et al. 2017). A549 세포의 RB1에 대한 PD-0184264의 S.I.는 또한 CI-1040 발달과 비교하여 감소된다.

실시예 11: PD-0184264에 의한 마우스의 폐에서 바이러스 역가의 생체내 감소

(A) H1N1pdm09 감염 후 암컷 C57BL/6 마우스를 2.8, 8.4 또는 25 mg/kg PD-0184264 (왼쪽) 또는 25, 75 또는 150 mg/Kg CI-1400 (왼쪽) 경구 경로로 처리하였다. 감염 24시간 후 동물을 죽이고 폐를 취하여 10% 현탁액을 제조하였다. 바이러스 역가는 표준 방법을 사용하여 결정하였다. 두 가지 MEK-억제제로 처리된 마우스의 바이러스 역가를 용매 (대조군) 단독으로 처리된 마우스의 바이러스 역가와 비교하였다. 대조군 마우스의 폐에 있는 바이러스 역가는 100% (흑색 막대)로 설정되었다. 그래프패드 프리즘 7 소프트웨어를 사용하여 도면 둘 다를 도시하였다.

약물

CI-1040 [2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(시클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로 벤즈아미드; Lot: CC-5395.0-16] 및 PD-0184264 (PD0184264) [2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; Lot: CC-5595.4-10]은 켐콘 게엠베하(독일 프라이부르크)에서 합성되었다.

25 mg/kg의 경구 적용을 위해, 2.5 mg의 PD-0184264를 50 μl DMSO (시그마-알드리치, 독일)에 용해시키고 0.15 ml 크레모포르 EL (머크-밀리포어, 독일) 및0.8 ml PBS (깁코(Gibco), 독일)로 추가로 희석시켰다. 8.4 mg/kg 및 2.8 mg/kg의 적용응 위해, 0.84 mg 또는 0.28 mg PD-0184264를 50 μl DMSO (시그마-알드리치, 독일)로 용해시키고 0.15 ml 크레모포르 EL/0.8 ml PBS로 추가로 희석시켰다. 202.5 mg CI-1040을 0.5 ml DMSO/ 0.15 ml 크레모포르 EL/0.8 ml PBS에 용해시키고크레모포르 EL 및 PBS로 추가로 희석시켰다.

동물

투여시 21.0 - 24.0 g의 체중을 가진 8주령 C57Bl/6 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories), 독일)을 항바이러스 연구에 사용하였다. 동물에게 정상 급식을 하였다. 음용수는 무제한으로 이용 가능하였다.

약물 적용

약물은 시험 1일차에 경구 위관영양법으로 단일 용량을 사용하여 투여하였다. 투여 속도는 200 μl의 투여 부피로 1회 투여당 15초였다.

폐 바이러스 적정 검정

마우스를 감염 후 24시간에 희생시키고 폐의 무게를 재고 라이싱 매트릭스 D 튜브 (MP 바이오)로 옮기고 폐의 10배 부피의 양으로 BSS 를 샘플에 적용하였다. 패스트프렙 FP 120 (사반트)을 사용하여 장기를 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위해 균질액을 2000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 균질액 중 바이러스 역가의 결정은 이전에 기재됩 바와 같은 아비셀^® 플라크 검정을 사용하여 수행하였다. (Haasbach et al. 2011, Mastrosovich et al. 2006).

요약/논의

도 18은 실험 결과를 나타낸다. 대조 실험과 비교하여, CI-1040의 75 mg/kg 이상의 농도에서만 바이러스 역가 감소 효과가 나타났다. 대조적으로, PD-0184264는 이미 2.8 mg/kg의 농도에서 폐에서 바이러스 역가가 대략 70% 나타났다. 8.4 mg/kg의 농도에서, 바이러스 역가는 대략 20%의 양으로 감소되며, 한편 25 mg/kg에서는 바이러스 역가는 대략 10%로 감소한다. 따라서, PD-0184264의 6배 더 낮은 농도는 항바이러스 효과에 대한 PD-0184264의 높은 잠재력을 강조하는 150 mg/kg CI-1040과 유사한 효과를 달성하는 데 필요하다.

실시예 12: PD-0184264는 CI-1040과 비교하여 더 높은 생체이용률을 갖는다

(A) 수컷 NMRI 마우스를 75 mg/kg CI-1040 (진회색 영역) 또는 75 mg/Kg PD-0184264 정맥내 경로로 처리하였다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 (시험 2일차)에 혈액을 수집하고 약물의 존재에 대해 혈장을 분석하였다. (B) 수컷 NMRI 마우스를 경구 위관영양법을 사용하여 150 mg/kg CI-1040 (진회색 영역) 또는 150 mg/kg PD-0184264로 경구로 처리하였다. 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 (시험 2일차)에 혈액을 수집하고 약물의 존재에 대해 혈장을 분석하였다. 각각 데이터 포인트는 3개의 혈장 샘플의 평균값을 나타낸다. 그래프패드 프리즘 7 소프트웨어를 사용하여 도면 둘 다를 도시하였다.

약물

CI-1040 [2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-(시클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로 벤즈아미드; Lot: CC-5395.0-15] 및 PD-0184264 (PD0184264)[2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-3,4-디플루오로 벤조산; Lot: CC-5595.4-10]은 켐콘 게엠베하 (독일 프라이부르크)에서 합성되었다. 정맥내 적용의 경우, 30.65 mg CI-1040을 0.075 ml DMSO (시그마-알드리치, 스위스)에 용해시키고 0.225 ml 크레모포르 EL (머크-밀리포어, 독일) 및 2.7 ml PBS (깁코, 독일)로 추가로 희석시켰다. 34.88 mg PD-0184264를 0.075 ml DMSO에 용해시키고 0.225 ml 크레모포르 EL/2.7 ml PBS로 추가로 희석시켰다. 경구 적용을 위해, 202.5 mg CI-1040을 0.5 ml DMSO/ 1.5　ml 크레모포르 EL/8.0 ml PBS에 용해시켰다. 81.0 mg PD-0184264를 0.2 ml DMSO/0.6 ml 크레모포르 EL/3.2 ml PBS에 용해시켰다.

동물

투여시 23.9 - 36.5 g의 체중을 가진 8주령 수컷 NMRI 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 독일)을 약물동태학적 연구에 사용하였다. 동물에게 정상 급식을 하였다. 음용수는 무제한으로 이용 가능하였다.

혈액 샘플링 및 혈장 준비

실험은 LPT 게엠베하(GmbH) (함부르크, 독일)에서 수행되었다. 이소플루란 마취 하에 채취한 - 충분한 전혈을 수집하여 하기 시간: 0 (투여 전), 투여 후 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 (시험 2일차)의 시점에 및 군당 3마리 동물의 Li-헤파린 혈장을 적어도 2 x 100 μL 수득하였다. 전혈 샘플은 회수 후 0.5시간 이내에 원심분리될 때까지 이소-썸-랙(Iso-Therm-Rack) 시스템(에펜도르프 AG, 독일)을 사용하여 즉시 냉각되었다. 원심분리 직후, 샘플은 추가 분석이 있을 때까지 -20℃에서 보관되었다. 플라즈마 분석은 프롤리틱 게엠베사(Prolytic GmbH) (프랑크푸르트, 독일)에서 표준 절차를 사용하여 수행되었다.

약물 적용

약물은 시험 1일차 경구 위관영양법 또는 꼬리 정맥에 정맥내 볼루스 주사에 의해 단일 용량을 사용하여 투여되었다. 주입 속도는 200 μl의 투여 부피로 15초/용량이었다.

결과

약물동태학 실험은 CI-1040과 비교하여 마우스의 혈장에서 정맥내 (도 19A) 및 경구로 (도 19B) 적용 후에 PD-0184264의 더 높은 노출이 발견되었음을 밝혀냈으며, 여기서 AUC 값 1953.68 μg*h/ml PD-0184264는, CI-1040에 대한 값보다 훨씬 더 높다. 정맥내 적용 후 8시간 및 CI-1040의 경구에 의해 적용 후 혈장에서 거의 약물이 검출되지 않았음을 주목한다. 대조적으로, 8시간 데이터 포인트에서 PD-0184264 2의 경구 적용에 따라 여전히 높은 농도가 발견되었다.

요약/논의

단일 정맥내 적용 후 PD-0184264 및 CI-1040에 대한 혈장노출의 급격한 차이는 이미 CI-1040이 빠르게 저하될 수 있다는 가정을 생성한다. 본 발명자들은 약물이 단일 지수 방식으로 감소한다고 가정하였다. 일반적으로, 이 가정은 유효하다. 낮은 농도에서, 약물은 대개 단일 지수 방식으로 감소한다. 그리고 최종 제거율 상수는 시간이 지남에 따라 또는 순환하는 약물의 농도에 따라 변하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이 시점에서 본 발명자들은 장간 순환과 같은 다른 과정이 약물동태학적 프로파일의 말기 단계에서 중요한 역할을 하는지 여부를 알 수 없다.

종합하면, PD-0184264는 생체내에서 CI-1040보다 높은 항바이러스 활성을 나타내며, 이는 약물의 더 높은 생체이용률을 기반으로 할 수 있다.

실시예 13: PD-0184264는 확대된 치료 범위을 갖는다

약물 및 약물 적용

25 mg/Kg의 경구 적용의 경우 10 mg의 PD-0184264를 50 μl DMSO (시그마-알드리치, 독일)에 용해시키고 0.15 ml 크레모포르 EL (머크-밀리포어, 독일) 및 0.8 ml PBS (깁코, 독일)에 추가로 희석시켰다. 용매의 경우 50 μl DMSO (시그마-알드리치, 독일)를 0.15 ml 크레모포르 EL (머크-밀리포어, 독일) 및 0.8 ml PBS (깁코, 독일)로 희석시켰다. 약물은 8시간의 시간 간격으로 경구 위관영양법에 의한 1일 2회 (BID) 투여를 사용하여 투여되었다. 치료는 감염 후 24, 48 또는 72시간에 시작되었다. 적용 속도는 50 μl의 투여량으로 15초/용량이었다.

동물

투여시 17.0 - 21.0 g의 체중을 가진 8주령 암컷 C57Bl/6 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈, 독일)를을 생존 연구에 사용하였다. 동물에게 정상 급식을 하였다. 음용수는 무제한으로 이용 가능하였다.

바이러스 감염

감염을 위해, 200 μl 케타민/롬푼을 복강내 주사하여 동물을 마취시켰다. 동일한 양의 2% 롬푼 (바이엘(Bayer)) 및 10% 케타민 (사노피(Sanofi)) 스톡 용액을 PBS와 1:10의 비로 혼합하였다. 마우스를 균주 A/레겐스부르크/D6/2009 인플루엔자 H1N1pdm09 (5xMLD50)의 3x10⁵ pfu로 비강내 감염시켰다. 적당한 바이러스 용량을 50 μl BSS에 희석하고 25 μl를 각 콧구멍에 접종하였다. 모든 동물 연구는 튀빙겐의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Tuebingen)의 승인을 받았다.

임상 관찰

규제 당국의 규칙에 따라, 동물을 매일 관찰하고 무게를 쟀다. 임상 증상의 발병 전에, 마우스를 1일 2회 및 질환 발병 후 1일 3회 관찰하였다. 체중의 20% 감소가 발견되었을 때 마우스를 희생시켜야 하였다. 동물 중 한 마리도 케이지에서 죽지 않았으며, 모두 CO₂ 처리 후 목 탈구로 희생되었다.

결과

암컷 C57BL/6 마우스를 H1N1pdm09에 감염시켰다. 25mg/kg PD-0184264를 사용한 치료는 감염 후 24, 48 또는 72시간에 시작되었다. 대조군으로 기능한 마우스는 용매만 받았다. 이들 동물들은 ≥20%의 체중 감소를 나타냈기 때문에, 감염 후 4일 내지 8일차에 희생되어야 하였다. 감염 24시간 후 치료가 시작되었을 때 8마리의 동물 중 2마리는 10일차 희생되어야 했고, 한편 8마리의 마우스 중 6마리는 보호되었다. 체중 감소에는 차이가 없었지만, 감염 후 10일차에 마우스는 관찰 기간의 종료 때까지 다시 체중이 증가하였다. 생존과 관련하여 용매와 PD-0184264 처리된 마우스 간의 차이는 통계적으로 유의하였다 (로그 순위 만텔-콕스 시험 P = 0.0001). 감염 48시간 후에 치료가 시작되었을 때 8마리의 동물 중 3마리는 8일 내지 10일차에 희생시켜야 했고 8마리 중 5마리는 보호하였다. 다시 말하지만, 체중 감소에는 차이가 없었다. 감염 후 9일차에 마우스는 관찰 기간의 종료 때까지 다시 체중이 증가하였다. 생존의 차이는 다시 유의하였다 (로그 순위 만텔-콕스 검정 P = 0.0004). 감염 후 72시간 후에 치료를 시작한 경우에도 생존율의 차이도 유의하였다 (로그순위 만텔-콕스 검정 P = 0.0002). 여기서, 7일 내지 10일차에 8마리 동물 중 중 6마리의 동물을 희생시켜야 했고, 한편 8마리 마우스 중 2마리는 보호하였다. 감염 후 9일차부터 시작하여, 마우스의 체중이 증가하였다.

요약/논의

H1N1pdm09에 감염된 마우스의 25 mg/kg PD-0184264 처리는 감염 후 늦어도 72시간 이내에 약물을 투여하였음에도 불구하고, 생존에 유의한 차이를 야기한다.

실시예 14: 건강한 인간 대상체에서 PD-0184264에 대한 일상 임상 시험(phase Ⅰ clinical trial)

무작위화, 이중 맹검 위약-대조 용량 증량 연구가 수행되었으며 70명의 건강한 지원자에서 PD-0184264의 안전성과 내약성을 입증하였다. 이는 단일 상승 용량 / 다중 상승 용량 (SAD/MAD) 요법에 따라 100 mg의 시작 용량 및 7개 아암에서 최대 3개의 증량 단계로 적응 설계를 따랐다. 투여 계획은 PD-0184264 1회 용량으로, 100 mg에서 900 mg으로 증량 (SAD)한 후에, PD-0184264를 7일 동안 100 mg에서 600 mg으로 증량하는 7회 용량 (MAD)이었다. 각각의 용량 코호트는 안전성 검토 위원회 (SRC)에 의해 안전한 것으로 간주되었으며, 다음 더 높은 용량 (각각 최대 SAD 900 mg 및 MAD 600 mg)에 대해 방출이 허용되었다. 관찰된 약물동태학적 프로파일은 추가 임상 개발을 위해 의도된 1일 1회 요법을 뒷받침한다.

시험 기간 동안 총 유해 사례가 거의 없었고 어떤 심각한 유해 사례도 관찰되지 않았다. 따라서 PD-0184264는 안전하고 내약성이 양호한 것으로 간주된다. 약물동태학 노출 및 MEK 억제의 결정이 검증되었고 임상적으로 관련된 혈액 수준의 유지를 확인하였다.

참고문헌

Claims (21)

1. 대상체(subject)가 치료가 시작될 때 적어도 24시간 동안 바이러스 감염에 대한 증상을 나타냈던 것인, 바이러스성 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
2. 제1항에 있어서, 대상체가 치료가 시작될 때 적어도 36시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 72시간 동안 바이러스 감염에 대한 증상을 나타냈던 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가로 박테리아 동시-감염(bacterial co-infection)의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 감염이 음성 또는 양성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발된 호흡기도 감염(respiratory tract infection)인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
5. 제4항에 있어서, 음성 가닥 RNA 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
6. 제5항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
7. 제6항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스가 H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1에 따라 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
8. 제6항에 있어서, 인플루엔자 B 바이러스가 IBV-형 야마가타(Yamagata) 또는 빅토리아(Victoria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 감염이 양성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
10. 제9항에 있어서, 바이러스가 코로나바이러스(coronavirus)인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
11. 제10항에 있어서, 바이러스가 SARS-CoV, SARS-CoV2 또는 MERS인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 표준 항바이러스 치료(standard antiviral treatment)에 대하여 내성인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
13. 제12항에 있어서, 표준 항바이러스 치료가 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 아만타딘, 리만타딘, 파비피라비르, 발록사비르 마르복실 및/또는 피모디비르의 투여인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염
14. 제12항에 있어서, 바이러스가 H1N1 바이러스 A H275Y 돌연변이체(mutant)인 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 PD-0184264의 투여 전에 표준 항바이러스제(standard antiviral)로 치료된 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염이 뉴라미니다제 억제제 또는 이의 제약상 허용되는 염과 조합하여 투여되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
17. 제16항에 있어서, 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 라니나미비르 또는 페라미비르 또는 이의 제약상 허용되는 염으로부터 선택되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체, 바람직하게는 척추동물, 가장 바람직하게는 인간에서 사용하기 위한 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, PD-0184264가 인간 대상체에게100 내지 900 mg, 바람직하게는 600 mg의 용량으로 1일 1회 투여되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PD-0184264가 인간 대상체에게 연속 1일 내지 21일, 바람직하게는 연속 7일 내지 14일로 투여되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, PD-0184264가 인간 대상체에게 경구 투여 형태로 투여되는 PD-0184264 또는 이의 제약상 허용되는 염.
    
    

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