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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung oder Verringerung
einer Trübung
in einem Getränk
durch die Zugabe einer Endoprotease, und neue Getränke, die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.
Sie betrifft auch neue Endoproteasen.
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Die
Trübung
ist ein bekanntes Phänomen
in der Getränkeindustrie.
Eine Trübung
kann beispielsweise in Bier, Wein und Fruchtsaft vorhanden sein.
Die Bildung einer Trübung
kann in verschiedenen Stufen während des
Brauvorgangs auftreten. In „Enzymes
in food processing",
herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic
Press Inc., San Diego, Kapitel V, S. 448–449, wurde vorgeschlagen,
dass die Trübung
im Bier das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen Bierproteinen
und polyphenolischen Procyanidinen ist. Es wird erklärt, dass
bei Bier die Trübung
häufig
nach dem Kühlen
des Biers auftritt. Bier wird fermentiert und danach gereift, häufig unter
gekühlten
Bedingungen. Um klares Bier zu erhalten, wird dieses oft filtriert,
während
es kalt ist. Trotz der Filterung wird Bier oft trüb nachdem
es verpackt und an Käufer
verteilt und vor dem Servieren wieder gekühlt wird. Schließlich bildet
sich sogar eine Trübung
in Bier, wenn es nicht oder nicht mehr gekühlt ist, und es kann sich ein
Sediment bilden. Das Entstehen einer Trübung ist unerwünscht, da
die durch die Bildung einer Trübung
entstandene Schleierbildung einer durch mikrobielle Zersetzung hervorgerufenen
Schleierbildung ähnlich
ist, die insbesondere für
helle Biere unerwünscht
ist.
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In „Industrial
Enzymology", 2.
Ausgabe, Kapitel 2.6, S. 124-125
wurde beschrieben, dass eine Trübung in
Bier aus der Vernetzung der hochmolekulargewichtigen Hordein-Fraktion
von Malz, die einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren hat,
welche sich mit Polyphenolen verbindet, die im Prinzip aus Proanthocyanidinen
und Catechinen (Flavanoiden) bestehen, entstehen kann. Es ist beschrieben,
dass geringe Mengen von Kohlehydraten und Spuren-Mineralionen auch
an der Trübe-Bildung
beteiligt sind, sowie eine Oxidation, von der festgestellt ist,
dass sie eine wichtige Rolle bei der Polymerisation von Polyphenolen
zur Erzeugung einer irreversiblen Trübung spielt. Es wird vorgeschlagen,
dass Polyphenole sich langsam mit Protein vereinigen, um beim Kühlen eine
Kühlungs-Trübung zu
bilden, die sich aber beim Erwärmen
wieder auflösen.
Schließlich werden
jedoch die Polyphenole, während
sie polymerisieren und an Größe zunehmen,
bei Raumtemperatur unlöslich,
so dass sie eine irreversible oder permanente Trübung bilden.
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In
mehreren anderen Veröffentlichungen
wurde vorgeschlagen, dass die Bildung einer Trübung, beispielsweise in Bier,
Wein und Fruchtsaft, Kaffees und Tees das Ergebnis von Wechselwirkungen
zwischen Proteinen und Polyphenolen ist (K.J. Siebert et al., J.
Agric. Food Chem. 44 (1996) 1997–2005, und K.J. Siebert et
al., J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80–85, K.J. Siebert, J. Agric.
Food Chem. 47 (1999) 353–362).
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Es
wurde auch geoffenbart, dass die Trübungs-aktiven Proteine reich
an Prolin sind (K.J. Siebert et al., J. Am. Soc. Brewing 55, 2 (1997)
73–78).
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Seit
seiner Entdeckung durch L. Wallerstein im Jahr 1911 war bekannt,
dass ein Verfahren zur Verringerung der Kühlungs-Trübungsbildung
bei Bier in der Zugabe von Papain zum Bier besteht. Papain ist ein
Extrakt der Papaya mit proteolytischer Aktivität. In „Enzymes in food processing", herausgegeben von
T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San
Diego, Kapitel V, S. 448–449,
wird Papain als jedem anderen Enzym zur Verhinderung von Kühlungs-Trübung in
Bier weit überlegen
beschrieben. Der genaue Mechanismus, über welchen Papain wirkt, wurde
jedoch nie ermittelt („Enzymes
in food processing",
herausgegeben von T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic
Press Inc., San Diego, Kapitel V, S. 448–449).
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Ein
Nachteil der Verwendung von Papain ist jedoch, dass es eine negative
Wirkung auf Schaum hat. Proteine sind zur Bildung eines stabilen
Schaums auf Bier notwendig. Durch seine proteolytische Aktivität beeinträchtigt Papain
jedoch die Schaumkronen-Stabilität.
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Die
Bildung einer Trübung
bei Wein wurde beispielsweise in „Enzymes in food processing", herausgegeben von
T. Nagodawithana und G. Reed, 3. Ausgabe, Academic Press Inc., San
Diego, Kapitel 16, S. 425, besprochen, wo beschrieben ist, dass
man Traubenproteine als verantwortlich für die Bildung einer Trübung während der
Lagerung von Wein hält.
Wenn sich nach dem Abfüllen
in Flaschen ein Niederschlag im Wein bildet, verliert der Wein für den Konsumenten
an Attraktivität,
was sich negativ auf den Verkauf auswirkt. Um einen Niederschlag
zu verhindern, wird beispielsweise Bentonit verwendet. Obwohl Bentonit
und andere Adsorptionsmittel die Proteine mit Erfolg entfernen,
ist er nicht selektiv und entfernt andere erwünschte Verbindungen aus dem
Wein, was häufig
die organoleptischen Eigenschaften von Wein beeinträchtigt.
Außerdem führt die
Verwendung von Bentonit zu einem beträchtlichen Verlust an Wein,
und das Entsorgen des Bentonit enthaltenden Abfalls bringt Schwierigkeiten
mit sich.
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Obwohl
man den Mechanismus nicht genau versteht, nimmt man an, dass der
Zusatz von Papain das Protein im Bier in einem Maße hydrolysiert,
dass sich keine Protein-Polyphenol-Trübung bildet oder nur in einem
geringeren Ausmaß.
Bentonit wird aus einem ähnlichen
Grund in Wein verwendet: durch Absorption von Proteinen verhindert
er die Bildung von Protein-Polyphenol-Trübung und Niederschlägen. Anstatt
das Protein zu entfernen, kann man jedoch Polyphenole entfernen,
um die Bildung einer Trübung
zu verringern oder zu verhindern. Ein typisches Beispiel für eine zum
Entfernen von Polyphenolen aus Getränken verwendete Verbindung
ist Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP). In jüngster Zeit erkannte man, dass
Polyphenole wichtige Antioxidantien sind. Wegen all der günstigen
Wirkungen, die man Antioxidantien zuschreibt, ist das Entfernen
von Polyphenolen aus Getränken
nicht der attraktivste Weg zur Verhinderung der Bildung einer Trübung.
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Da
alle bekannten Techniken zum Verhindern oder Entfernen einer Trübung Nachteile
haben, besteht noch immer der Bedarf an einem neuen Verfahren zur
Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in Getränken.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verhinderung
oder Verringerung einer Trübung
in einem Getränk
vorzusehen.
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Überraschenderweise
wurde festgestellt, dass dieses Ziel durch das Vorsehen eines Verfahrens
zur Verhinderung oder Verringerung einer Trübung in einem Getränk, bei
welchem dem Getränk
eine Prolyl-spezifische Endoprotease zugesetzt wird, erreicht wird.
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Im
Rahmen dieser Erfindung inkludiert der Ausdruck „Getränk" Getränke in allen Stufen ihrer Herstellung.
So ist ein Getränk
nicht nur ein für
den Verbrauch fertiges Getränk,
sondern auch jede Zusammensetzung, die zur Herstellung des Getränkes verwendet
wird. Beispielsweise ist Bierwürze,
wie sie in der Bierer zeugung verwendet wird, vom Ausdruck „Getränk", wie hierin verwendet,
mit umfasst. Auch die Zugabe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease
während
der Herstellung eines Getränks
zu Zusammensetzungen, die nicht oder nicht vollständig flüssig sind,
soll unter das erfindungsgemäße Verfahren
fallen. Eine Prolylspezifische Endoprotease, die einer Maische am
Beginn des Bierbrauens zugesetzt wird, ist ein Beispiel für eine solche Zusammensetzung.
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Eine
Prolyl-spezifische Endoprotease ist als Endoprotease definiert,
die Proteine oder Peptide in der Nähe von oder an Stellen schneidet,
an welchen das Protein oder Peptid einen Prolyl-Rest in seiner Kette
enthält.
Vorzugsweise ist eine Prolylspezifische Endoprotease eine Endoprotease,
die Proteine oder Peptide an Stellen Schneidet, wo das Protein oder
Peptid einen Prolyl-Rest enthält.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird
vorzugsweise eine Prolyl-spezifische Endoprotease verwendet, die
Prolyl-Reste an ihrem C-Terminus schneidet. Eine Prolylspezifische
Endoprotease, die Prolyl-Reste an ihrem NH2-Terminus schneidet,
ist z.B. in einer Veröffentlichung
in Nature vom 15. Jänner
1998, Bd. 391, S. 301–304,
beschrieben.
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In
diesem Text werden die Ausdrücke
Prolyl-spezifische Endoprotease, Prolin-spezifische Endoprotease,
Prolin-spezifische Endopeptidase und Peptid mit einer Prolyl-spezifischen
Aktivität
oder ähnliche
Ausdrücke
untereinander austauschbar verwendet.
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In
diesem Text sind die Wörter
Peptid und Protein untereinander austauschbar verwendet. In diesem Text
sind auch die Wörter „Trübung", „Schleierbildung" und „Trübe" untereinander austauschbar
verwendet. Um die Menge an Trübung
in einem Getränk
zu quantifizieren, wird oft ein Turbidimeter verwendet. Bei einem Turbidimeter
wird die Menge an Licht, die in einem vorgeschriebenen Winkel in
Bezug auf die Richtung des einfallenden Lichtstrahls gestreut wird,
gemessen. Trübemessungen
sind zur Messung einer als Folge von Protein-Polyphenol-Wechselwirkungen
gebildeten Trübung
sehr geeignet.
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Ein
Polyphenol ist definiert als eine Verbindung mit einer chemischen
Struktur, die mindestens zwei aromatische Ringe, welche durch mindestens
eine Hydroxylgruppe substituiert sind, oder mit einer chemischen
Struktur, die mindestens einen aromatischen Ring, der durch mindestens
zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, enthält.
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Beispiele
für Phenole
sind Tannine und Flavonoide, zu welchen beispielsweise Catechine,
Flavonole und Anthocyanine zählen.
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Endoproteasen
mit einer Prolyl-spezifischen Aktivität sind bekannt (E.C. 3.4.21.26).
Die Verwendung von Prolyl-spezifischen Endoproteasen zur Verhinderung
oder Verringerung einer Trübung
in Getränken
wurde jedoch niemals beschrieben oder nahegelegt.
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Wie
für Enzymaktivitäten typisch
ist, hängt
die Aktivität
von Prolyl-spezifischen Endoproteasen vom pH-Wert ab. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird dem Getränk eine
Endoprotease zugesetzt, die eine maximale Prolyl-spezifische Aktivität bei einem
pH-Wert hat, der dem pH-Wert
des Getränkes,
welchem sie zugesetzt wird, entspricht. Bevorzugte Getränke sind
Protein-hältige
Getränke.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Getränk Proteine
und Polyphenole. Bevorzugte Getränke
sind Getränke
mit einem pH-Wert von unter 7.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird vorteilhaft bei Bier, Wein und Fruchtsaft angewendet. Es kann auch
vorteilhafter Weise für
andere alkoholische Getränke
als Bier und Wein angewendet werden.
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Der
Ausdruck „Bier", wie hierin verwendet,
soll mindestens Bier umfassen, das aus Maischen aus ungemalzenen
Zerealien zubereitet ist, sowie Bier aus Maischen aus gemalzenen
Zerealien und aus allen Maischen aus einer Mischung von gemalzenen
und ungemalzenen Zerealien. Der Ausdruck „Bier" umfasst auch Biere, die mit Zusätzen zubereitet
sind und Biere mit allen möglichen
Alkoholgehalten.
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Fruchtsaft
kann Saft sein, der z.B, aus roten Beeren, Erdbeeren, Äpfeln, Birnen,
Tomaten, Zitrusfrüchten,
Gemüsen
usw. erhalten wurde.
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Die
Menge an Prolin-spezifischer Endoprotease, die einem Getränk bei erfindungsgemäßen Verfahren zugesetzt
wird, kann innerhalb weiter Grenzen variieren. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden pro Gramm Protein im Getränk
mindestens 150 Millieinheiten Prolinspezifischer Endoprotease-Aktivität zugesetzt,
wobei die Aktivität
mit einer Aktivitätsmessung
unter Verwendung von Z-Gly-Pro-pNA
als Substrat gemessen wurde.
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Mehr
bevorzugt werden mindestens 500 Millieinheiten Prolin spezifische
Endoprotease dem Getränk zugesetzt,
und am meisten bevorzugt wird mindestens 1 Einheit Prolin-spezifische
Endoprotease zugesetzt.
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Eine
maximale Menge an zuzusetzender Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität kann nicht
spezifisch angegeben werden. Die maximale Menge hängt beispielsweise
von der gewünschten
Stärke
der Verringerung oder Verhinderung einer Trübung, der Zusammensetzung des
Getränks,
dem pH-Wert des Getränks und
dem pH-Wert, bei welchem die Endoprotease ihre maximale Aktivität aufweist,
ab.
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Eine
Prolyl-spezifische Endoprotease kann in verschiedenen Stufen während der
Herstellung eines Getränks
zugesetzt werden.
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Während des
Herstellungsverfahrens von Bier wird die Prolylspezifische Endoprotease
vorteilhaft einer Maische zugesetzt. Bei einer anderen Ausführungsform
wird die Prolyl-spezifische Endoprotease einem fermentierten Bier
zugesetzt, bevor sich eine Trübung
bildet. Es ist jedoch auch möglich,
dass Prolylspezifische Endoprotease einem fermentierten Bier nach
der Bildung einer Trübung
zugesetzt wird. Die Prolyl-spezifische Endoprotease kann vorteilhaft
dem Maischungs- oder Reifungsschritt bei einem Verfahren zur Herstellung
von Bier zugesetzt werden.
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Während der
Herstellung von Wein wird die Prolyl-spezifische Endoprotease vorteilhaft
einem fermentierten Wein zugesetzt. Die Prolyl-spezifische Endoprotease
kann vorteilhaft nach der alkoholischen Fermentation oder nach der
malolaktischen Fermentation in einem Verfahren zur Herstellung eines
Weins zugesetzt werden.
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Bei
einem Verfahren zur Herstellung eines Fruchtsafts wird die Prolyl-spezifische
Endoprotease vorteilhaft während
des Mazerierens oder Pektinentfernung zugegeben.
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Da
die Bildung einer Trübung
oft in sauren Getränken,
wie z.B. Bier, Wein und Fruchtsaft, vorkommt, werden vorzugsweise
Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer Prolyl-spezifischen Aktivität bei einem pH-Wert
unter 7 verwendet. Am meisten bevorzugt werden beim erfindungsgemäßen Verfahren
Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer maximalen Prolyl-spezifischen
Aktivität
bei einem pH-Wert unter 7 verwendet.
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Die
vorliegende Erfindung sieht weiter ein isoliertes Polypeptid mit
Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität vor, das ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus:
- (a) einem Polypeptid,
das eine Aminosäuresequenz
hat, die mindestens 40% Gesamt-Aminosäuresequenz-Identität mit SEQ
ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, oder einem Fragment davon,
aufweist,
- (b) einem Polypeptid, das durch ein Polynukleotid codiert ist,
das hybridisiert mit (i) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR. 1,
SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 oder einem Fragment
davon, welches zumindest zu 80% oder 90% identisch über 60,
vorzugsweise über
100 Nukleotide, mehr bevorzugt zumindest zu 90% identisch über 200
Nukleotide ist, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die zur Nukleinsäuresequenz
von (i) komplementär
ist.
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Sie
sieht auch ein Nukleinsäuremolekül vor, das
für die
Prolyl-spezifische Endoprotease codiert.
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Die
Erfindung betrifft auch gereinigte oder isolierte Polypeptide mit
Prolyl-spezifischer Endoprotease-Aktivität. Bevorzugt sind gereinigte
Prolyl-spezifische Endoproteasen mit einer maximalen Aktivität bei pH-Werten
von unter 7.
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Die
Erfindung sieht auch ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, eine Aminosequenz erhältlich durch
Exprimieren der Polynukleotid-Sequenzen von SEQ ID NR. 1, SEQ ID
NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 in einem geeigneten Wirt,
vor. Auch ein Peptid oder Polypeptid, das ein funktionelles Äquivalent
der obigen Polypeptide aufweist, ist von der vorliegenden Erfindung
mit umfasst. Die obigen Polypeptide sind kollektiv vom Ausdruck „erfindungsgemäße Polypeptide" umfasst.
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Die
Ausdrücke „Peptid" und „Oligopeptid" werden als synonym
angesehen (wie allgemein anerkannt), und jeder Ausdruck kann austauschbar
verwendet werden, je nachdem, wie es der Zusammenhang verlangt, um
eine Kette von mindestens zwei Aminosäuren, gekoppelt durch Peptidyl-Bindungen,
anzugeben. Das Wort „Polypeptid" wird hierin für Ketten
verwendet, die mehr als sieben Aminosäurereste enthalten. Alle Oligopeptid- und
Polypeptid-Formeln
oder Sequenzen hierin sind von links nach rechts und in Richtung
vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben. Der hierin
verwendete Einbuchstaben-Code der Aminosäuren ist auf dem Gebiet allgemein
bekannt und in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zu finden.
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„Isoliertes" oder „gereinigtes" Polypeptid oder
Protein soll ein Polypeptid oder Protein bedeuten, das aus seiner
nativen Umgebung entfernt ist. Beispielsweise werden rekombinant
erzeugte Polypeptide und Proteine, die in Wirtszellen exprimiert
sind, als isoliert für
die Zwecke der Erfindung angesehen, sowie native oder rekombinante
Polypeptide, die im Wesentlichen mittels jeder geeigneten Technik
gereinigt wurden, wie z.B. mit der Ein-Schritt-Reinigungsmethode, die in Smith
und Johnson, Gene 67:31-40
(1988) offenbart ist.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann aus rekombinanten Zellkulturen mittels wohlbekannter Methoden,
einschließlich
Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung,
Säure-Extraktion,
Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie,
hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie,
Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie, gewonnen und
gereinigt werden. Am meisten bevorzugt wird für die Reinigung die Hochleistungs-Flüssigkeits-chromatographie
(„HPLC") verwendet.
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Zu
den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zählen natürlich gereinigte Produkte,
Produkte chemischer synthetischer Verfahren und Produkte, die mittels
rekombinanter Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirt, einschließlich
beispielsweise Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Zellen,
erzeugt wurden. Je nach dem verwendeten Wirt in einem rekombinanten
Produktionsverfahren können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nichtglykosyliert
sein. Außerdem können die
Polypeptide der Erfindung auch einen initialen modifizierten Methionin-Rest
enthalten, in einigen Fällen
als Folge von durch den Wirt vermittelten Prozessen.
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Eine
vorteilhafte Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein gereinigtes oder isoliertes Polypeptid
mit Endo-Pro-Aktivität.
Ein solches gereinigtes oder isoliertes Polypeptid kann aus einer
Nährlösung erhalten
werden, in welcher ein erfindungsgemäßer Organismus, wie ein A.
niger-Stamm, der ein Polynukleotid gemäß der Erfindung trägt, gezüchtet worden
ist. Ein Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie man ein zumindest teilweise gereinigtes
Enzym aus dem Überstand
einer solchen Kultur erhält.
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Ein
besonders vorteilhaftes Reinigungsverfahren ist das Fol gende: Nach
dem Züchten
der Zellen in einer geeigneten Nährlösung werden
die Zellen aus dem Zellüberstand
durch Zentrifugieren getrennt. Der Überstand sieht trüb aus. Größere Teilchen,
die im Überstand
blieben, wurden dann nachfolgend durch Filtern mit 0,5% Dicalite
oder vorzugsweise 1,0% Dicalite entfernt, um ein Verstopfen des
Filters, der im nächsten Schritt
angewendet wird, zu verhindern. Dann wurde eine Keimreduktionsfilterung
angewendet, um die Menge an Keimen in der Lösung zu verringern. Noch immer
war das Filtrat nicht klar. Ein Millipore-Filter mit einer Molekulargewicht-Ausschlussgrenze
von 10kDalton wurde danach zur weiteren Reduktion des Wasser-, Salz- und
Zuckergehalts der Lösung
verwendet. Ein Druck von 1 bar wurde über den Filter angelegt. Typische
erhaltene Ausbeuten lagen zwischen 50 und 92%, bezogen auf in der
Nährlösung vorhandene
Einheiten, gegenüber
Einheiten, die im gereinigten Ultrafiltrat erhalten wurden. Typische
Enzymkonzentrationen im Ultrafiltrat resultieren in einer Prolyl-spezifischen
Endoprotease-Aktivität
im Bereich von 4 bis 10 Einheiten pro ml.
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Eine
weitere Reinigung wurde durch Anwendung einer der folgenden Methoden
erreicht:
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Eine
Reinigung im Labor-Maßstab
wurde unter Verwendung des Akta Explorers auf einer 24 ml Q-Sepharose
FF-Säule
(Betthöhe
12 cm/Durchmesser 1,6 cm) durchgeführt. 10 ml UF-Konzentrat wurde
10 mal in Puffer A verdünnt
und auf die Säule
aufgetragen. Die Proteine wurden in einem Gradienten eluiert: 0
bis 50% B in 20 CV. Puffer A war 20 mM NaAc pH 5,1. Puffer B war
20 mM NaAc + 1 M NaCl pH 5,1. Fließgeschwindigkeit war 5 ml/min.
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Die
Reinigung wurde unter Verwendung der Akta-Reinigungsvorrichtung gemäß der Arbeitsvorschrift W-0894.A
auf einer 500 1 Q-Sepharose-FF-Säule
(Betthöhe
23,5 cm/Durchmesser 5 cm) vorgenommen. 200 ml UF-Konzentrat wurden
10 mal in Puffer A verdünnt
und auf die Säule
aufgetragen. Die Proteine wurden in einem Gradienten eluiert: 0
bis 40% B in 20 CV. Puffer A war 20 mM NaAc pH 5,1. Puffer B war
20 mM NaAc + 1 M NaCl pH 5,1. Die Fließgeschwindigkeit war 10ml/min.
Die Fraktionen wurden manuell gesammelt.
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Das
erhaltene Produkt wies einen einzigen Peak bei HPSEC auf und schien
als einzige Bande in SDS PAGE und IEF auf. Es kann daher geschlossen
werden, dass Prolyl-spezifische Endoprotease unter Verwendung von
Q-Sepharose FF zur Homogenität
gereinigt werden kann. Die geschätzte
Reinheit war über
90% und die spezifische Aktivität
auf Z-Gly-Pro-pNA war mindestens 0,094E/mg.
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Die
Polypeptide der Erfindung können
in isolierter From vorliegen. Man wird verstehen, dass das Polypeptid
mit Trägern
oder Verdünnungsmitteln,
die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht stören, gemischt
sein kann und noch immer als isoliert angesehen wird. Ein Polypeptid
der Erfindung kann auch in einer mehr im Wesentlichen gereinigten
Form vorliegen, in welchem Fall sie das Polypeptid im Allgemeinen
in einem Präparat
umfassen wird, in welcher mehr als 70%, z.B. mehr als 80%, 90%,
95%, 98% oder 99%, der Proteine in der Zubereitung ein Polypeptid
der Erfindung sind.
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Die
Polypeptide der Erfindung können
in einer solchen Form vorgesehen werden, dass sie sich außerhalb
ihrer natürlichen
Zellumgebung befinden. So können
sie im Wesentlichen isoliert oder gereinigt sein, wie oben besprochen,
oder in einer Zelle, in welcher sie nicht in der Natur vorkommen,
beispielsweise einer Zelle anderer Pilz-Spezies, Tiere, Pflanzen
oder Bakterien.
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Vorteilhafterweise
werden isolierte oder gereinigte Prolylspezifische Endoproteasen
beim erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet.
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Eine
isolierte oder gereinigte Prolin-spezifische Endoprotease gemäß der Erfindung
hat vorzugsweise mindestens 10 Einheiten Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität pro Gramm
proteinhältigem
Material. Diese Einheiten sollten unter Verwendung des synthetischen
Peptids Z-Gly-Pro-pNA bei 37°C
und pH5 gemessen werden, wie im Abschnitt „Verfahren" beschrieben.
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Prolin-spezifische
Endoproteasen findet man weit verbreitet in Tieren und Pflanzen,
doch ihr Vorhandensein in Mikroorganismen scheint begrenzt zu sein.
Bisher wurde Prolin-spezifische Endoprotease in Spezies von Aspergillus
(
EP 0 522 428 ), Flavobacterium
(
EP 0 967 285 ) und Aeromonas
(J. Biochem. 113, 790-796),
Xanthomonas und Bacteroides identifiziert. Obwohl die Prolin-spezifischen
Enzyme der meisten dieser Organismen bei einem pH-Wert von etwa
8 aktiv sind, ist das Aspergillus-Enzym optimalerweise aktiv bei etwa
pH 5. Die Prolin-spezifische Endoprotease der Erfindung kann aus
einer der oben erwähnten
Mikroben-Spezies
isoliert werden, insbesondere aus einer Spezies von Aspergillus.
Vorzugsweise wird die Prolin-spezifische Endoprotease aus einem
Stamm von Aspergillus niger isoliert. Mehr be vorzugt wird die Prolin-spezifische
Endoprotease aus einem Aspergillus niger-Wirt isoliert, der zur Überexpression
eines Gens, das für
eine Prolin-spezifische Endoprotease codiert, hergestellt wurde,
obwohl auch andere Wirte, wie E. coli, geeignete Expressionsvektoren
sind. Beispielsweise machten das Klonieren und die Überproduktion
der von Flavobacterium stammenden Prolinspezifischen Endoprotease
in u.a. E. coli bestimmte Prolinspezifische Endoproteasen in reiner
Form erhältlich.
Ein Beispiel für
ein solches überproduzierendes
Konstrukt ist in World Journal of Microbiology & Biotechnology, Bd. 11, S. 209–212, vorgesehen.
Ein Aspergillus niger-Wirt wird vorzugsweise verwendet, um ein nicht-rekombinantes
Selbst-Konstrukt zu erzeugen, wobei A. niger-Promotoren zum Steuern
der Expression eines Gens, das für
A. niger-Prolin-spezifische Endoprotease codiert, verwendet wird.
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In
einer ersten Ausführungsform
sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz
vor, die einen Gesamtgrad an Aminosäuresequenz-Identität mit den
Aminosäuren
der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5, oder SEQ ID NR. 7 (d.h. dem Polypeptid)
von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, vorzugsweise mindestens
60%, vorzugsweise mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, mehr
bevorzugt mindestens 80%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, sogar
noch mehr bevorzugt mindestens etwa 95%, und am allermeisten bevorzugt
mindestens etwa 97% aufweist, und das eine Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität besitzt.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Identität zwischen
zwei oder mehr Aminosäuresequenzen
mit dem BLAST P-Protein-Datenbank-Suchprogramm (Altschul et al.,
1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) mit Matrix Blosum 62
und einer erwarteten Schwelle (threshold) von 10 bestimmt.
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Ein
Polypeptid der Erfindung kann die in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5
oder SEQ ID NR. [7] angeführte Aminosäuresequenz
oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder ein Fragment einer
dieser Sequenzen mit Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität aufweisen.
Im Allgemeinen ist die natürlicherweise
vorkommende Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 gezeigt ist,
bevorzugt.
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Das
Polypeptid der Erfindung kann auch eine natürlich vorkommende Variante
oder ein Spezies-Homolog des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID
NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 aufweisen.
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Eine
Variante ist ein Polypeptid, das natürlicherweise z.B. in Pilz-,
Bakterien-, Hefe- oder Pflanzenzellen vorkommt, wobei die Variante
eine Prolin-spezifische Endoprotease-Aktivität und eine Sequenz aufweist, die ähnlich dem
Protein von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 ist. Der
Ausdruck „Varianten" bezieht sich auf
Polypeptide, die denselben wesentlichen Charakter oder die grundlegende
biologische Funktionalität
aufweisen wie die Prolin-spezifische Endoprotease von SEQ ID NR.
4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7, und inkludiert allele Varianten.
Vorzugsweise hat eine Polypeptid-Variante mindestens dieselbe Menge an
Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität wie das Polypeptid von SEQ
ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7. Die Varianten inkludieren
allele Varianten entweder vom selben Stamm wie das Polypeptid von
SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 oder von einem anderen
Stamm derselben Gattung oder derselben Spezies.
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In ähnlicher
Weise ist ein Spezies-Homolog des erfindungsgemäßen Proteins ein äquivalentes
Protein mit einer ähnlichen
Sequenz, das eine Prolin-spezifische Endoprotease ist und von Natur
aus in anderen Spezies von Aspergillus vorkommt.
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Varianten
und Spezies-Homologe können
unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorgangsweisen, die zur
Isolierung des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ
ID NR. 7 verwendet wurden, und unter Durchführung solcher Vorgangsweisen
auf einer geeigneten Zellen-Quelle, z.B. einer Bakterien-, Hefe-,
Pilz- oder Pflanzenzelle isoliert werden. Es ist auch möglich, eine
Sonde der Erfindung zu verwenden, um aus Hefe-, Bakterien-, Pilz-
oder Pflanzenzellen hergestellte Bibliotheken zu sondieren, um Klone
zu erhalten, die Varianten oder Spezies-Homologe des Polypeptids
der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 exprimieren. Diese
Klone können
mittels herkömmlicher
Techniken manipuliert werden, um ein Polypeptid der Erfindung zu
erzeugen, welches danach mittels an sich bekannter rekombinanter
oder synthetischer Techniken erzeugt werden kann.
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Die
Sequenz des Polypeptids der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ
ID NR. 7 und von Varianten und Spezies-Homologen kann auch modifiziert
werden, um Polypeptide der Erfindung vorzusehen. Aminosäure-Substitutionen
können
vorgenommen werden, z.B. von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen.
Die selbe An zahl Deletionen und Insertionen kann ebenfalls vorgenommen
werden. Diese Veränderungen
können außerhalb
von Regionen, die für
die Funktion des Polypeptids kritisch sind, vorgenommen werden,
da ein solches modifiziertes Polypeptid seine Prolin-spezifische
Endoprotease-Aktivität
beibehält.
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Die
Polypeptide der Erfindung umfassen Fragmente der oben erwähnten Gesamtlängen-Polypeptide und
von Varianten derselben, einschließlich Fragmente der oben in
SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 angeführten Sequenz.
Solche Fragmente behalten typischerweise die Aktivität als Prolin-spezifische Endoprotease
bei. Die Fragmente können
eine Länge
von mindestens 50, 100 oder 200 Aminosäuren haben, oder es kann ihnen
diese Anzahl von Aminosäuren
von der in SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 gezeigten
Gesamtlängen-Sequenz
fehlen.
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Die
Polypeptide der Erfindung können,
falls nötig,
mit synthetischen Mitteln erzeugt werden, obwohl sie üblicherweise
rekombinant hergestellt werden, wie nachstehend beschrieben. Synthetische
Polypeptide können
modifiziert werden, z.B. durch das Hinzufügen von Histidin-Resten oder
einer T7-Markierung, um ihre Identifizierung oder Reinigung zu unterstüzten, oder
durch die Addition einer Signalsequenz, um ihre Sezernierung aus
einer Zelle zu fördern.
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Somit
können
Sequenz-Varianten jene umfassen, die von Stämmen von Aspergillus stammen,
die nicht jener Stamm sind, von welchem das Polypeptid der SEQ ID
NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 isoliert wurde. Varianten
können
aus anderen Aspergillus-Stämmen
identifiziert werden, indem man nach Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität sucht
und wie hierin beschrieben sequenziert und kloniert. Zu den Varianten
kann die Deletion, Modifikation oder Addition einzelner Aminosäuren oder
Gruppen von Aminosäuren innerhalb
der Proteinsequenz zählen,
solange das Peptid die grundlegende biologische Funktionalität der Prolin-spezifischen
Endoprotease von SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 beibehält.
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Aminosäure-Substitutionen
können
durchgeführt
werden, z.B. 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen. Das
modifizierte Peptid behält
im Allgemeinen die Aktivität
als Prolinspezifische Endoprotease bei. Konservative Substitutionen
können
durchgeführt
werden; solche Substitutionen sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
Vorzugsweise beeinträchtigen
die Substitutionen nicht die Faltung oder Aktivität des Polypeptids.
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Kürzere Polypeptid-Sequenzen
fallen in den Bereich der Erfindung. Beispielsweise wird ein Peptid
mit einer Länge
von mindestens 50 Aminosäuren
oder bis zu 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren als in den Umfang der
Erfindung fallend angesehen, solange es die grundlegende biologische
Funktionalität
der Prolin-spezifischen Endoprotease der SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR.
5 oder SEQ ID NR. 7 zeigt. Insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, umfasst
dieser Aspekt der Erfindung die Situation, in welcher das Protein
ein Fragment der vollständigen
Protein-Sequenz ist.
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In
einer zweiten Ausführungsform
sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid vor, das eine
Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität aufweist und durch Polynukleotide
codiert ist, die unter Bedingungen niedriger Stringenz, mehr bevorzugt,
Bedingungen mittlerer Stringenz, und am meisten bevorzugt, Bedingungen
hoher Stringenz mit (i) der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1,
SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 oder einem Nukleinsäure-Fragment,
das zumindest den C-terminalen
Teil der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SE ID NR. 3 oder SEQ ID NR.
6 aufweist, aber weniger als alle aufweist, oder Basen aufweist, die
sich von den Basen der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3
oder SEQ ID NR. 6 unterscheiden, oder mit (ii) einem Nukleinsäure-Strang,
der zu SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6
komplementär
ist, hybridisieren oder hybridisieren können.
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Der
Ausdruck „hybridisieren
können" bedeutet, dass das
Ziel-Polynukleotid
der Erfindung mit der als Sonde verwendeten Nukleinsäure hybridisieren
kann (z.B. der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR.
2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 angeführt ist, oder einem Fragment
davon, oder dem Komplement von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID
NR. 3 oder SEQ ID NR. 6) in einer Menge wesentlich über dem Hintergrund.
Die Erfindung inkludiert auch jene Polynukleotide, die für die Prolinspezifische
Endoprotease der Erfindung codieren, sowie Nukleotid-sequenzen,
die dazu komplementär
sind. Die Nukleotidsequenz kann RNA oder DNA sein, einschließlich genomischer
DNA; synthetischer DNA oder cDNA. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz
eine DNA und am meisten bevorzugt, eine genomische DNA-Sequenz.
Typischerweise umfasst ein Polynukleotid der Erfindung eine auf einanderfolgende
Sequenz von Nukleotiden, die unter selektiven Bedingungen mit der
Codiersequeez oder dem Komplement der Codiersequenz von SEQ ID NR.
1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren kann.
Solche Nukleotide können
gemäß Methoden,
die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, synthetisiert werden.
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Ein
Polynukleotid der Erfindung kann mit der Codiersequenz oder dem
Komplement der Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ
ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 in einer Menge wesentlich über dem
Hintergrund codieren. Eine Hintergrund-Hybridisierung kann vorkommen,
z.B. weil andere cDNAs in einer cDNA-Bibliothek vorhanden sind.
Die von der Interaktion zwischen einem Polynukleotid der Erfindung
und der Codiersequenz oder einem Komplement der Codiersequenz der
SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 erzeugte
Signalstärke
ist typischerweise mindestens 10 mal, vorzugsweise mindestens 20 mal,
mehr bevorzugt, mindestens 50 mal, und noch mehr bevorzugt, mindestens
100 mal so stark wie die Interaktionen zwischen anderen Polynukleotiden
und der Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR.
3 oder SEQ ID NR. 6. Die Intensität von Interaktionen kann beispielsweise
durch radioaktives Markieren der Sonde, z.B. mit 32P,
gemessen werden. Die selektive Hybridisierung kann typischerweise
unter Verwendung von Bedingungen einer niedrigen Stringenz (0,3M
Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat bei etwa 40°C), einer
mittleren Stringenz (z.B. 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat
bei etwa 50°C)
oder einer hohen Stringenz (z.B. 0,3M Natriumchlorid und 0,03M Natriumcitrat
bei etwa 60°C)
erreicht werden.
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Modifikationen
-
Die
Polynukleotide der Erfindung können
DNA oder RNA umfassen. Sie können
einzel- oder doppelsträngig
sein. Sie können
auch Polynukleotide sein, die in sich synthetische oder modifizierte
Nukleotide, inklusive Peptid-Nukleinsäuren, einschließen. Eine
Anzahl verschiedener Arten von Modifikationen an Polynukleotiden
sind auf dem Gebiet bekannt. Zu diesen zählen ein Methylphosphonat und
Phosphorothioat-Gerüste, und
die Addition von Acridin- oder Polylysin-Ketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Für die Zwecke der
vorliegenden Erfindung sei verstanden, dass die hierin beschriebenen
Polynukleotide mit jedem auf dem Gebiet verfügbaren Verfahren modifiziert
sein können.
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Selbstverständlich können Fachleute
unter Verwendung von Routine-Techniken Nukleotid-Substitutionen
durchführen,
die die von den Polynukleotiden der Erfindung codierte Polypeptidsequenz
nicht beeinflussen, um die Codon-Verwendung irgendeines bestimmten
Wirtsorganismus, in welchem die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert
werden sollen, wiederzugeben.
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Die
Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder
SEQ ID NR. 6 kann durch Nukleotid-Substitutionen, beispielsweise
1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert
werden. Das Polynukleotid der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID
NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 kann alternativ oder zusätzlich durch eine oder mehrere
Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Verlängerung
an einem der beiden oder an beiden Enden modifiziert werden. Das
modifizierte Polynukleotid codiert im Allgemeinen für ein Polypeptid,
das eine Prolinspezifische Endoprotease-Aktivität hat. Es können degenerierte Substitutionen
erzeugt werden und/oder Substitutionen, die zu einer konservativen
Aminosäure-Substitution
führen würden, wenn
die modifizierte Sequenz translatiert wird, wie beispielsweise später in Bezug
auf Polypeptide besprochen ist.
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Homologe
-
Eine
Nukleotidsequenz, die selektiv an das Komplement der DNA-Codiersequenz
der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren
kann, ist in der Erfindung inkludiert und hat im Allgemeinen mindestens
50% oder 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%,
mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenz-Identität mit der
Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder
SEQ ID NR. 6 über
einen Bereich von mindestens 60, vorzugsweise mindestens 100, mehr
bevorzugt, mindestens 200 aneinander angrenzende Nukleotide, oder
am meisten bevorzugt, über die
gesamte Länge
der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6.
Desgleichen ist von der Erfindung auch ein Nukleotid, welches für eine aktive
Prolin-spezifische Endoprotease codiert, die selektiv mit einem
Fragment eines Komplements der DNA-Codiersequenz der SEQ ID NR. 1, SEQ
ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren kann, umfasst.
Ein C-terminales Fragment der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR. 1,
SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6, welches zumindest
zu 80% oder 90% identisch über
60, vorzugsweise über
100 Nukleotide, mehr bevor zugt zumindest zu 90% identisch über 200 Nukleotide
ist, ist von der Erfindung umfasst.
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Jede
Kombination der oben erwähnten
Identitätsgrade
und Minimalgrößen kann
verwendet werden, um Polynukleotide der Erfindung zu definieren,
wobei die stringenteren Kombinationen (d.h., größere Identität über größere Längen) bevorzugt
ist. So bildet beispielsweise ein Polynukleotid, welches zumindest
zu 80% oder 90% identisch über
60, vorzugsweise über
100 Nukleotide ist, einen Aspekt der Erfindung, sowie auch ein Polynukleotid,
welches zumindest zu 90% identisch über 200 Nukleotide ist.
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Das
UWGCG Package sieht das BESTFIT-Programm vor, welches verwendet
werden kann, um die Identität
zu berechnen (beispielsweise an ihren Standardeinstellungen verwendet).
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Die
PILEUP- und BLAST N-Algorithmen können ebenfalls zur Berechnung
der Sequenz-Identität
oder zum Aufreihen von Sequenzen (wie als Identifizierungs-Äquivalent
oder korrespondierende Sequenzen, beispielsweise an ihren Standardeinstellungen
(„default
settings") verwendet
werden.
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Software
zum Durchführen
von BLAST-Analysen ist öffentlich
erhältlich
durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Bei diesem Algorithums werden zuerst Sequenz-Paare mit hoher Bewertung
(high scoring sequence pairs, HSPs) identifiziert, indem kurze Wörter der Länge W in
der Abfragesequenz identifiziert werden, die entweder passen oder
irgendeine positiv bewertete Schwellen-Bewertung T („positive
valued threshold score T")
erfüllen,
wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbank-Sequenz
ausgerichtet werden. T wird als Nachbarschafts-Wortbewertungs-Schwelle („neighborhood
word score threshold")
bezeichnet. Diese anfänglichen
Nachbarschafts-Worttreffer fungieren als Ausgangspunkte zum Ingangsetzen
von Nachforschungen zum Auffinden von HSPs, die diese enthalten. Die
Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz soweit
verlängert,
wie die kumulative Ausrichtungs-Bewertung („cumulative alignment score") gesteigert werden
kann. Verlängerungen
für die
Worttreffer in jeder Richtung werden gestoppt, wenn: die kumulative
Ausrichtungs-Bewertung
um die Menge X von ihrem maximal erreichten Wert abfällt; die
kumulative Bewertung auf Null oder darunter geht infolge der Ansammlung
einer oder mehrerer Rest-Ausrichtungen mit negativer Bewertung;
oder das Ende einer der Sequenzen erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter
W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der
Ausrichtung. Das BLAST-Programm
verwendet als Standardeinstellungen eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungs-Matrix-Ausrichtungen
(B) von 50, Erwartung (E) von 10, M=5, N=4, und einen Vergleich
beider Stränge.
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Der
BLAST-Algorithmus führt
eine statistische Analyse der Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen durch. Ein Maß für die Ähnlichkeit, das vom BLAST-Algorithmus
vorgesehen wird, ist die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit („sum probability", (P(N)), was eine
Anzeige der Wahrscheinlichkeit ist, mit welcher ein Zusammenpassen
zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zufällig vorkommen
würde.
Beispielsweise wird eine Sequenz als einer anderen Sequenz ähnlich angesehen,
wenn die kleinste Summen-Wahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten
Sequenz mit der zweiten Sequenz weniger als etwa 1, vorzugsweise
weniger als etwa 0,1, mehr bevorzugt, weniger als etwa 0,01, und
am meisten bevorzugt, weniger als etwa 0,001 ist.
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Primer und Sonden
-
Die
Polynukleotide der Erfindung inkludieren Primer und können als
Primer verwendet werden, beispielsweise als Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Primer,
als Primer für
alternative Amplifikations-Reaktionen, oder als Sonden, beispielsweise
mit einer sichtbarmachenden Markierung mit herkömmlichen Mitteln unter Verwendung
radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen markiert, oder
die Polynukleotide können
in Vektoren cloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente
sind mindestens 15, beispielsweise mindestens 20, 25, 30 oder 40
Nukleotide lang. Sie sind typischerweise bis zu 40, 50, 60, 70,
100, 150, 200 oder 300 Nukleotide lang, oder selbst bis zu ein paar
Nukleotide (wie 5 oder 10) kürzer
als die Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR.
3 oder SEQ ID NR. 6.
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Im
Allgemeinen werden Primer mit synthetischen Mitteln erzeugt, wobei
die gewünschte
Nukleinsäuresequenz
schrittweise, ein Nukleotid nach dem anderen, hergestellt wird.
Techniken um dies unter Verwendung automatisierte Protokolle zu
erreichen, sind auf dem Gebiet leicht erhältlich. Längere Polynukleotide werden
im Allgemeinen unter Verwendung rekombinanter Mittel, z.B. unter
Verwendung von PCR-Kloniertechniken, erzeugt. Dazu gehören die
Herstellung eines Primer-Paares (von typischerweise etwa 15–30 Nukleotiden),
um die gewünschte
Region der zu klonierenden Prolin-spezifischen Endoprotease zu amplifizieren,
das In-Kontakt-Bringen der Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer
DNA, die aus einer Hefe-, Bakterien-, Pflanzen-, prokaryontischen
oder Pilz-Zelle, vorzugsweise von einem Aspergillus-Stamm erhalten
wurde, das Durchführen
einer Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, die für die Amplifizierung
der gewünschten Region
geeignet sind, das Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B.
durch Reinigen der Reaktionsmischung auf einem Agarose-Gel) und das Gewinnen
der amplifizierten DNA. Die Primer können so entworfen werden, dass
sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen
enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonier-Vektor
kloniert werden kann.
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Solche
Techniken können
verwendet werden, um alle oder einen Teil der Polynukleotide zu
erhalten, die für
die hierin beschriebenen Prolin-spezifischen Endoprotease-Sequenzen
codieren. Introns, Promotor- und Trailer-Regionen fallen in den
Bereich der Erfindung und können
auch auf analoge Weise erhalten werden (z.B. mit rekombinanten Mitteln,
PCR oder Kloniertechniken), beginnend mit genomischer DNA von einer
Pilz-, Hefe-, Bakterien-, Pflanzen- oder prokaryontischen Zelle.
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Die
Polynukleotide oder Primer können
eine sichtbarmachende Markierung tragen. Zu den geeigneten Markierungen
zählen
Radioisotope, wie 32P oder 35S,
Enzymmarkierungen oder andere Protein-Markierungen, wie Biotin. Solche Markierungen
können
Polynukleotiden oder Primern der Erfindung zugsetzt werden und können unter
Verwendung von Techniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt
sind, detektiert werden.
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Polynukleotide
oder Primer (oder Fragmente davon), markiert oder unmarkiert, können in
auf Nukleinsäure
basierenden Tests zur Detektion oder Sequenzierung einer Prolin-spezifischen
Endoprotease oder einer Variante davon in einer Pilz-Probe verwendet
werden. Solche Detektions-Tests umfassen im Allgemeinen das In-Kontakt-Bringen
einer Pilzprobe, von der man vermutet, dass sie die interessierende
DNA enthält,
mit einer Sonde, die ein Polynukleotid oder einen Primer der Erfindung
aufweist, unter hybridisierenden Bedingungen, und das Detektieren
von jeglichem zwischen der Sonde und der Nukleinsäure in der
Probe gebildeten Duplex. Die Detektion kann unter Verwendung von
Techniken, wie PCR, erreicht werden, oder durch Immobilisieren der
Sonde auf einem festen Träger,
Entfernen jeglicher Nukleinsäure
in der Probe, die nicht mit der Sonde hybridisiert ist, und nachfolgendes
Detektieren jeglicher Nukleinsäure,
die mit der Sonde hybridisiert ist. Alternativ kann die Proben-Nukleinsäure auf
einem festen Träger
immobilisiert werden, die Sonde hybridisiert werden, und die Menge
der an einen solchen Träger
gebundenen Sonde nach dem Entfernen jeglicher ungebundenen Sonde
detektiert werden.
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Die
erfindungsgemäßen Sonden
können
praktischer Weise in Form eines Test-Sets in einem geeigneten Behälter verpackt
sein. Bei solchen Sets kann die Sonde an einen festen Träger gebunden
sein, soferne das Test-Format, für
welchen das Set ausgelegt ist, eine solche Bindung erfordert. Das
Set kann auch geeignete Reagenzien zum Behandeln der zu sondierenden
Probe, Hybridisieren der Sonde mit der Nukleinsäure in der Probe, Kontroll-Reagenzien, Instruktionen
u. dgl., enthalten. Die Sonden und Polynukleotide der Erfindung
können
auch im Mikroassay verwendet werden.
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Vorzugsweise
ist das Polynukleotid der Erfindung aus demselben Organismus wie
das Polypeptid erhältlich,
wie aus einem Pilz, insbesondere aus einem Pilz der Gattung Aspergillus.
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Die
Polynukleotide der Erfindung inkludieren auch Varianten der Sequenz
von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6,
die für
ein Polypeptid mit Prolin-spezifischer Endoprotease-Aktivität codieren.
Varianten können
durch Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen gebildet werden.
Solche Varianten der Codiersequenz von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR.
2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 können somit für Polypeptide
codieren, die die Fähigkeit
aufweisen, eine Polypeptid-Kette an der Carboxy-terminalen Seite von
Prolin zu verdauen.
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Herstellung von Polynukleotiden
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Polynukleotide,
die keine 100% Identität
mit SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 aufweisen,
jedoch in den Bereich der Erfindung fallen, können auf vielerlei Weisen erhalten
werden. So können
Varianten der hierin beschriebenen Prolin-spezifischen Endoprotease-Sequenz
beispielsweise durch Sondieren genomischer DNA-Bibliotheken erhalten
werden, die aus einer Reihe von Organismen, wie jenen, die als Quellen
der Polypeptide der Erfindung besprochen wurden, hergestellt wurden.
Außerdem
können
andere Pilz- Pflanzen oder prokaryontische Homolo ge von Prolin-spezifischer
Endoprotease erhalten werden, und solche Homologe und Fragmente
davon können
im Allgemeinen mit SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder
SEQ ID NR. 6 hybridisieren. Solche Sequenzen können durch Sondieren von cDNA-Bibliotheken oder
genomischen DNA-Bibliotheken aus anderen Spezies, und das Sondieren
solcher Bibliotheken mit Sonden, die ganze oder einen Teil der SEQ
ID NR. 1 enthalten, unter Bedingungen einer geringen, mittleren
bis hohen Stringenz (wie früher
beschrieben), erhalten werden. Nukleinsäuresonden, die alles oder einen Teil
von SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 aufweisen,
können
verwendet werden, um cDNA oder genomische Bibliotheken aus anderen
Spezies zu sondieren, wie jenen, die als Quellen für die Polypeptide
der Erfindung beschrieben wurden.
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Spezies-Homologe
können
auch unter Verwendung von degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer
verwendet, die so gestaltet sind, dass sie auf Sequenzen innerhalb
der Varianten und Homologe zielen, die für konservierte Aminosäuresequenzen
codieren. Die Primer können
eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden zu
Stringenz-Bedingungen verwendet, die niedriger als jene sind, die
zum Klonieren von Sequenzen mit einzelnen Sequenz-Primern gegen
bekannte Sequenzen verwendet werden.
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Alternativ
können
solche Polypeptide durch Stellengerichtete Mutagenese der Prolin-spezifischen
Endoprotease-Sequenzen
oder Varianten davon erhalten werden. Dies kann dort nützlich sein,
wo beispielsweise stille Codon-Änderungen
an Sequenzen notwendig sind, um Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle,
in welcher die Polynukleotid-Sequenzen exprimiert werden, zu optimieren.
Andere Sequenzveränderungen können durchgeführt werden,
um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen oder um die Eigenschaft oder
Funktion des von den Polynukleotiden codierten Polypeptids zu verändern.
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Die
Erfindung inkludiert doppelsträngige
Polynukleotide, die ein Polynukleotid der Erfindung und sein Komplement
umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung sieht auch Polynukleotide vor, die für die oben
beschriebenen Polypeptide der Erfindung codieren. Da solche Polynukleotide
als Sequenzen für
eine rekombinante Produktion von erfindungsgemäßen Polypeptiden nützlich sein
werden, ist es nicht notwendig, dass sie an die Sequenz von SEQ ID NR.
1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 6 hybridisieren können, obwohl
dies im Allgemeinen wünschenswert
ist. Andernfalls können
solche Polynukleotide gewünschtenfalls
wie oben beschrieben markiert, verwendet und hergestellt werden.
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Rekombinante Polynukleotide.
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Die
Erfindung sieht auch Vektoren vor, die ein Polynukleotid der Erfindung
aufweisen, einschließlich Klonierungs-
und Expressions-Vektoren, und in einem anderen Aspekt Verfahren
zum Züchten,
Transformieren oder Transfektieren solcher Vektoren in eine geeignete
Wirtszelle, beispielsweise unter Bedingungen, unter welchen die
Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids
oder codiert durch eine erfindungsgemäße Sequenz erfolgt. Ebenso
vorgesehen sind Wirtszellen, die ein Polynukleotid oder einen Vektor
der Erfindung aufweisen, wobei das Polynukleotid heterolog zum Genom
der Wirtszelle ist. Der Ausdruck „heterolog", gewöhnlich bezogen auf die Wirtszelle,
bedeutet, dass das Polynukleotid nicht natürlicherweise im Genom der Wirtszelle
vorkommt, oder dass das Polypeptid nicht natürlicherweise von dieser Zelle
erzeugt wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefezelle, z.B.
eine Hefezelle der Gattung Kluyveromyces oder Saccharomyces, oder
eine filamentöse
Pilzzelle, beispielsweise der Gattung Aspergillus.
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Die
Polynukleotide der Erfindung können
in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor, beispielsweise einen
Klonier- oder Expressions-Vektor, inkorporiert werden. Der Vektor
kann zum Replizieren der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle
verwendet werden. Somit sieht die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden der Erfindung
durch Einführen
eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible
Wirtszelle, und Züchten
der Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Replikation des Vektors
führen,
vor. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete
Wirtszellen sind nachstehend in Verbindung mit Expressionsvektoren
beschrieben.
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Vektoren
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Der
Vektor, in welchen die Expressionskassette der Erfindung insertiert
wird, kann jeder Vektor sein, der in zweckmäßiger Weise rekombinanten DNA-Verfahren
unterzogen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt oft
von der Wirtszelle ab, in welche er eingeführt werden soll. So kann der
Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor,
der als extrachromosomale Entität
existiert, deren Replikation von chromosomaler Replikation unabhängig ist,
wie ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der
bei Einführung
in eine Wirtszelle in das Wirtszellen-Genom integriert wird und
sich zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welche (s) er integriert
worden ist, repliziert.
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Vorzugsweise
ist ein erfindungsgemäßes Polynukleotid,
wenn es sich in einem Vektor befindet, funktionell mit einer regulierenden
Sequenz verknüpft,
die für
die Expression der Codiersequenz durch die Wirtszelle sorgen kann,
d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Ausdruck „funktionell
verknüpft" bezieht sich auf
eine Juxtaposition, wobei die beschriebenen Bestandteile in einem
Verhältnis
stehen, das es ihnen ermöglicht,
in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine regulierende
Sequenz, wie ein Promotor, Verstärker („Enhancer"), oder ein anderes
Expressions-Regulierungssignal, das „funktionsmäßig verknüpft" ist mit einer Codiersequenz,
ist so positioniert, dass die Expression der Codierseqeunz unter
Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel
sind.
-
Die
Vektoren können,
z.B. im Fall eines Plasmids, Cosmids, Virus oder Phagen-Vektors,
mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls mit einem Promotor
für die
Expression des Polynukleotids und gegebenenfalls mit einem Verstärker und/oder
einem Regulator des Promotors, versehen sein. Eine Terminator-Sequenz kann
vorhanden sein, sowie auch eine Polyadenylierungssequenz anwesend
sein kann. Die Vektoren können ein
oder mehrere selektierbare Marker-Gene enthalten, beispielsweise
ein Ampicillin-Resistenz-Gen
im Fall eines bakteriellen Plasmids, oder ein Neomycin-Resistenz-Gen
für einen
Säuger-Vektor.
Die Vektoren können in
vitro verwendet werden, beispielsweise für die Produktion von RNA, oder
sie können
zum Transfektieren oder Transformieren einer Wirtszelle verwendet
werden.
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Die
für das
Polypeptid codierende DNA-Sequenz wird vorzugsweise in einen geeigneten
Wirt als Teil eines Expressions-Konstrukts
eingeführt,
in welchem die DNA-Sequenz funktionell mit Expressionssignalen verknüpft ist,
die die Expression der DNA-Sequenz in den Wirtszellen lenken können. Zur
Transformation des geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt
sind Transfor mations-Verfahren verfügbar, die dem Fachmann wohl
bekannt sind. Das Expressionskonstrukt kann zur Transformation des
Wirts als Teil eines Vektors, der einen selektierbaren Marker trägt, verwendet
werden, oder das Expressionskonstrukt wird als separates Molekül zusammen
mit dem Vektor, der einen selektierbaren Marker trägt, co-transformiert.
Die Vektoren können
ein oder mehrere selektierbare Marker-Gene enthalten.
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Bevorzugte
selektierbare Marker inkludieren – ohne auf diese eingeschränkt zu sein – jene,
die einen Defekt in der Wirtszelle ergänzen oder eine Resistenz gegen
eine Droge vermitteln. Sie inkludieren beispielsweise vielseitige
Marker-Gene, die zur Transformation der meisten filamentösen Pilze
und Hefen verwendet werden können,
wie Acetamidase-Gene oder cDNAs (die amdS-, niaD-, facA-Gene oder
cDNAs aus A.nidulans, A.oryzae oder A.niger) oder Gene, die eine
Resistenz gegen Antibiotika, wie G418-, Hygromycin-, Bleomycin-,
Kanamycin-, Phleomycin- oder Benomyl-Resistenz (benA), verleihen.
Alternativ können
spezifische Selektionsmarker verwendet werden, wie auxotrophe Marker,
die korrespondierende mutierte Wirtsstämme erfordern: z.B. URA3 (aus
S.cerevisiae oder analoge Gene aus anderen Hefen), pyrG oder pyrA
(aus A.nidulans oder A.niger), argB(aus A.nidulans oder A.niger)
oder trpC. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Selektionsmarker
aus der transformierten Wirtszelle nach dem Einführen des Expressionskonstrukts
deletiert, um transformierte Wirtszellen, die das Polypeptid erzeugen
können,
zu erhalten, welche frei von Selektionsmarker-Genen sind.
-
Andere
Marker inkludieren ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphat-decarboxylase (pvrA),
das bakterielle G418-Resistenz-Gen (geeignet in Hefe, aber nicht
in filamentösen
Pilzen), das Ampicillin-Resistenz-Gen (E. coli), das Neomycin-Resistenz-Gen (Bacillus)
und das E. coli uidA-Gen, das für
Glucuronidase (GUS) codiert. Vektoren können in vitro verwendet werden,
beispielsweise für
die Herstellung von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation
einer Wirtszelle.
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Für die meisten
filamentösen
Pilze und Hefe wird das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das
Genom der Wirtszelle integriert, um stabile Transformanten zu erhalten.
Für bestimmte
Hefen sind jedoch auch geeignete episomale Vektor-Systeme erhältlich,
in welche das Expressionskonstrukt für eine stabile und starke Expression
inkorporiert werden kann. Zu den Beispielen dafür zählen Vektoren, die von den
2 μm, CEN-
und pKD1-Plasmiden von Saccharomyces bzw. Kluyveromyces stammen,
oder Vektoren, die eine AMA-Sequenz (z.B. AMA1 aus Aspergillus)
enthalten. Wenn Expressionskonstrukte in Wirtszellen-Genome integriert
werden, sind die Konstrukte entweder an randomisierten Loci im Genom
oder an vorbestimmten Target-Loci integriert, wobei homologe Rekombination
verwendet wird, in welchem Fall die Target-Loci vorzugsweise ein
hoch exprimiertes Gen umfassen. Ein hoch exprimiertes Gen ist ein
Gen, dessen mRNA mindestens 0,01 (Gew./Gew.) der gesamten Zell-mRNA
ausmachen kann, beispielsweise unter induzierten Bedingungen, oder
alternativ ein Gen, dessen Genprodukt mindestens 0,2% (Gew./Gew.)
des gesamten Zell-Proteins
ausmachen kann, oder im Falle eines sezernierten Genprodukts, bis
zu einer Menge von mindestens 0,05 g/l sezerniert werden kann.
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Ein
Expressionskonstrukt für
eine bestimmte Wirtszelle enthält üblicherweise
die folgenden Elemente funktionsmäßig miteinander verknüpft in konsekutiver
Reihenfolge vom 5'-Ende
zum 3'-Ende, bezogen auf
den Codierstrang der Sequenz, die für das Polypeptid des ersten
Aspekts codiert: (1) eine Promotor-Sequenz, die die Transkription
der DNA-Sequenz, welche für
das Polypeptid in der bestimmten Wirtszelle codiert, lenken kann,
(2) vorzugsweise eine 5'-nicht-translatierte
Region (leader), (3) gegebenenfalls eine Signalsequenz, die die
Sezernierung des Polypeptids aus der bestimmten Wirtszelle in das
Kulturmedium lenken kann, (4) die DNA-Sequenz, die für eine reife
und vorzugsweise aktive Form des Polypeptids codiert, und vorzugsweise auch
(5) eine Transkriptions-Terminations-Region (terminator), die die
Transkription stromabwärts
der für
das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz terminieren kann.
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Stromabwärts der
für das
Polypeptid codierenden DNA-Sequenz enthält das Expressionskonstrukt vorzugsweise
eine 3'-nicht-translatierte Region,
die eine oder mehrere Transkritpions-Terminations-Stellen enthält, auch
als Terminator bezeichnet. Der Ursprung des Terminators ist nicht
so kritisch. Der Terminator kann beispielsweise für die für das Polypeptid
codierende DNA-Sequenz nativ sein. Vorzugsweise wird jedoch ein
Hefe-Terminator
in Hefe-Wirtszellen und ein filamentöser Pilz-Terminator in filamentösen Pilz-Wirtszellen verwendet.
Mehr bevorzugt ist der Terminator für die Wirtszelle, in welcher
die für
das Polypeptid codierende DNA-Sequenz exprimiert wird, endogen.
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Eine
verstärkte
Expression des für
das erfindungsgemäße Polypeptid
coiderenden Polynukleotids kann auch durch die Selektion heterologer,
regulierender Regionen erreicht werden, z.B. Promotor-, Signalsequenz-
und Terminator-Regionen, die dazu dienen, die Expressions- und gewünschtenfalls
Sezernierungsmengen des Proteins, an dem ein Interesse besteht,
aus dem gewählten
Expressions-Wirt zu erhöhen und/oder
für die
induzier-bare Kontrolle der Expression des Polypeptids der Erfindung
zu sorgen.
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Abgesehen
vom Promotor, der für
das für
das erfindungsgemäße Polypeptid
codierende Gen nativ ist, können
andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids
zu lenken. Der Promotor kann wegen seiner Effizienz bei der Lenkung
der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids
im gewünschten
Expressionswirt ausgewählt
werden.
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Promotoren/Verstärker (Enhancer)
und andere Expressions-Regulierungs-Signale
können
so ausgewählt
werden, dass sie mit der Wirtszelle, für welche der Expressionsvektor
entworfen wird, kompatibel sind. Beispielsweise können prokaryontische
Promotoren verwendet werden, insbesondere jene, die zur Verwendung
in E.coli-Stämmen
geeignet sind. Wenn die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide
in Säugerzellen
durchgeführt
wird, können
Säuger-Promotoren
verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, z.B. Hepatocyten-zellspezifische
Promotoren, können
ebenso verwendet werden. Es können
auch virale Promotoren verwendet werden, z.B. Moloney-Maus-Leukämievirus-long
terminal repeat (MMLV LTR), der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-LTR-Promotor,
der SV40-Promotor,
der humane Cytomegalovirus (CMV)-IE-Promotor, Herpessimplex-Virus-Promotoren
oder Adenovirus-Promotoren.
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Zu
den geeigneten Hefe-Promotoren zählen
die S. cerevisiae GAL4 und ADH-Promotoren und den S. pombe nmt1-
und adh-Promotor. Zu den Säuger-Promotoren
zählen
der Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle,
wie Cadmium, induziert werden kann. Virale Promotoren, wie der SV40
large T antigen-Promotor
oder Adenovirus-Promotoren können
ebenfalls verwendet werden. Alle diese Promotoren sind auf dem Gebiet
leicht erhältlich.
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Säuger-Promotoren,
wie β-Actin-Promotoren,
können
verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, insbesondere Endothel-
o der Neuronal-Zellen-spezifische Promotoren (z.B. die DDAHI- und
DDAHII-Promotoren) sind besonders bevorzugt. Virale Promotoren können ebenfalls
verwendet werden, beispielsweise der Moleney-Maus-Leukämie-Virus-long terminal repeat
(MMLV LTR)-, der Rous-Sarcoma-Virus (RSV)-LTR-Promotor,
der SV40-Promotor, der humane Cytomegalovirus (CMV)-IE-Promotor,
Adenovirus-, HSV-Promotoren (wie die HSV-IE-Promotoren), oder HPV-Promotoren,
insbesondere die HPV-upstream regulatory region (URR). Virale Promotoren
sind auf dem Gebiet leicht erhältlich.
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Eine
Vielfalt von Promotoren kann verwendet werden, die fähig sind,
die Transkription in den Wirtszellen der Erfindung zu lenken. Vorzugsweise
stammt die Promotor-Sequenz von einem hoch exprimierten Gen, wie
zuvor definiert. Beispiele für
bevorzugte hoch exprimierte Gene, von welchen Promotoren vorzugsweise stammen
und/oder welche in bevorzugten vorbestimmten Ziel-Loci zur Integration
der Expressionskonstrukte mit umfasst sind, inkludieren, ohne auf
diese eingeschränkt
zu sein, Gene, die für
glykolytische Enzyme, wie Triose-Phosphat-Isomerasen (TPI), Glyceraldehyd-phosphat-dehydrogenasen
(GAPDH), Phosphoglyceratkinasen (PGK), Pyruvatkinasen (PYK), Alkoholdehydrogenasen
(ADH), codieren, sowie Gene, die für Amylasen, Glucoamylasen,
Proteasen, Xylanasen, Cellobiohydrolasen, β-Galactosidasen, Alkohol(Methanol)-oxidasen, Elongationsfaktoren
und ribosomale Proteine codieren. Zu den spezifischen Beispielen
für geeignete
hoch exprimierte Gene zählen
z.B. das LAC4-Gen von Kluyveromyces sp., die Methanoloxidase-Gene
(AOX und MOX) von Hansenula bzw. Pichia, die Glucoamylase(glaA)-Gene
von A.niger und A.awamori, das A.oryzae-TAKA-Amylase-Gen, das A.nidulans
gpdA-Gen und die T.reesei-Cellobiohydrolase-Gene.
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Beispiele
für starke
konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die zur Verwendung
in Pilz-Expressions-Wirten bevorzugt sind, sind jene, die erhältlich sind
aus den Pilz-Genen für
Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC),
Triose-phosphat-isomerase (tpi), Alkoholdehydrogenase (AdhA), Amylase
(amy), amyloglucosidase (AG – aus
dem glaA-Gen) Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase(gpd)-Promotoren.
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Zu
den Beispielen für
starke Hefe-Promotoren, die verwendet werden können, zählen jene, die aus den Genen
für Alkoholdehydrogenase,
Lactase, 3-Phosphoglycerat-kinase und Trio sephosphat-isomerase erhältlich sind.
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Zu
den Beispielen für
starke bakterielle Promotoren, die verwendet werden können, zählen die
Amylase- und SPo2-Promotoren sowie Promotoren aus extrazellulären Protease-Genen.
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Für Pflanzenzellen
geeignete Promotoren, die man verwenden kann, umfassen Napalinsynthase (nos),
Octopinsynthase (ocs) Mannopinsynthase (mas), Ribulose-kleine Untereinheit
(Rubisco ssu), Histon, Reisaktiv, Phaseolin, Blumenkohl-Mosaikvirus
(CMV)35S und 19S und Circovirus-Promotoren.
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Der
Vektor kann weiters Sequenzen inkludieren, die das zur RNA führende Polynukleotid
flankieren, welche Sequenzen, die zu solchen aus eukaryontischen
Genom-Sequenzen homolog sind, vorzugsweise Säuger-Genom-Sequenzen, oder
virale Genom-Sequenzen, umfassen. Das ermöglicht die Einführung der
Polynukleotide der Erfindung in das Genom eukaryontischer Zellen
oder Viren durch homologe Rekombination. Insbesondere kann ein Plasmid-Vektor,
welcher die Expressionskassette flankiert von viralen Sequenzen
aufweist, zur Herstellung eines Virus-Vektors verwendet werden,
der zur Abgabe der erfindungsgemäßen Polynukleotide
an eine Säugerzelle
geeignet ist. Andere Beispiele für
geeignete Virus-Vektoren
inkludieren Herpes simplex-Virus-Vektoren und Retroviren, einschließlich Lentiviren,
Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren und HPV-Viren (wie HPV-16 ODER
HPV-18). Gen-Transfer-Techniken
unter Verwendung dieser Viren sind den Fachleuten bekannt. Retrovirus-Vektoren
können
beispielsweise verwendet werden, um das Polynukleotid, das zur antisense-RNA
führt,
stabil in das Wirtsgenom zu integrieren. Replikations-defekte Adenovirus-Vektoren
bleiben dagegen episomal und ermöglichen
daher eine vorübergehende
Expression.
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Der
Vektor kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid
enthalten, das in einer antisense-Richtung orientiert ist, um für die Produktion
von antisense-RNA zu sorgen. Dies kann verwendet werden um gewünschtenfalls
die Expressionsmengen der Polypeptide zu verringern.
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Wirtszellen und Expression
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Gemäß einem
weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids
vor, welches das Züchten
einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben,
unter Bedingungen, die für
die Expression einer für
das Polypeptid codierenden Codier sequenz durch den Vektor geeignet
sind, transformiert oder transfektiert wurde, und das Gewinnen des
exprimierten Polypeptids umfasst. Die Polynukleotide der Erfindung
können
in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor, wie einen Expressions-Vektor, inkorporiert
sein. Der Vektor kann zur Replikation der Nukleinsäure in einer
kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. So sieht die Erfindung
in einer weiteren Ausführungsform
ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
durch Einführen
eines erfindungsgemäßen Polynukleotids
in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible
Wirtszelle und Züchten
der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Vektors
bewirken, vor. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden.
Zu den geeigneten Wirtszellen zählnen
Bakterien, wie E.coli, Hefe, Säugerzelllinien
und andere eukaryontische Zelllinien, beispielsweise Insektenzellen,
wie Sf9-Zellen,
und (z.B. filamentöse)
Pilz-Zellen.
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Vorzugsweise
wird das Polypeptid als sezerniertes Protein erzeugt, in welchem
Fall die für
eine reife Form des Polypeptids codierende DNA-Sequenz im Expressionskonstrukt
funktionell verknüpft
ist mit einer DNA-Sequenz, die für
eine Signal-Sequenz codiert. In jenem Fall, in dem das für das sezernierte
Protein codierende Gen im Wildtyp-Stamm eine Signalsequenz aufweist,
ist die verwendete Signalsequenz vorzugsweise für die für das Polypeptid codierende
DNA-Sequenz nativ (homolog). Alternativ ist die Signalsequenz für die für das Polypeptid
codierende DNA-Sequenz
fremd (heterolog), in welchem Fall die Signalsequenz vorzugsweise
für die
Wirtszelle, in welcher die DNA-Sequenz exprimiert wird, endogen
ist. Beispiele für
geeignete Signalsequenzen für
Hefe-Wirtszellen sind die Signalsequenzen, die von Hefe-MFalpha-Genen
stammen. In ähnlicher
Weise ist eine geeignete Signalsequenz für filamentöse Pilz-Wirtszellen z.B. eine
Signalsequenz, die von einem filamentösen Pilz-Amyloglucosidase(AG)-Gen, z.B. dem A.niger-glaA-Gen,
stammt. Diese Signalsequenz kann in Kombination mit dem Amyloglucosidase-(auch
(Gluco)amylase genannt)-Promotor selbst, sowie in Kombination mit
anderen Promotoren verwendet werden. Hybrid-Signalsequenzen können auch im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Bevorzugte
heterologe Sezernierungs-Leader-Sequenzen sind jene, die vom Pilz-amyloglucosidase(AG)-Gen
(glaA, sowohl die 18- als auch die 24-Aminosäuren-Version, z.B. von Aspergillus),
vom MFalpha-Gen (Hefen, z.B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder
vom alpha-Amylase-Gen (Bacillus) abstammen.
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Die
Vektoren können
wie oben beschrieben transformiert oder in eine geeignete Wirtszelle
transfektiert werden, um für
die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu sorgen.
Dieses Verfahren kann das Züchten
einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben,
unter Bedingungen, die für
die Expression des Polypeptids geeignet sind, transformiert ist,
und das fakultative Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfassen.
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So
sieht ein weiterer Aspekt der Erfindung Wirtszellen vor, die mit
einem Polynukleotid oder Vektor der Erfindung transformiert oder
transfektiert wurden oder dieses bzw. diesen aufweisen. Vorzugsweise
wird das Polynukleotid in einem Vektor getragen, welcher die Replikation
und Expression des Polynukleotids ermöglicht. Die Zellen werden so
gewählt,
dass sie mit dem Vektor kompatibel sind und können beispielsweise prokaryontische
(z.B. bakterielle) oder eukaryontische Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen
sein.
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Die
Erfindung umfasst Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Polypeptids
mittels rekombinanter Expression einer DNA-Sequenz, die für das Polypeptid
codiert. Zu diesem Zweck kann die DNA-Sequenz der Erfindung zur
Gen-Amplifikation und/oder zum Austausch von Expressionssignalen,
wie Promotoren, Sezernierungssignalsequenzen verwendet werden, um
eine wirtschafliche Produktion des Polypeptids in einer geeigneten
homologen oder heterologen Wirtszelle zu ermöglichen. Eine homologe Wirtszelle
ist hierin als eine Wirtszelle definiert, die von derselben Spezies
ist oder eine Variante innerhalb derselben Spezies ist wie jene
Spezies, von welcher die DNA-Sequenz stammt.
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Geeignete
Wirtszellen sind vorzugsweise prokaryontische Mikroorganismen, wie
Bakterien, oder mehr bevorzugt, eurkaryontische Organismen, beispielsweise
Pilze, wie Hefen oder filamentöse
Pilze, oder Pflanzenzellen. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber filamentösen Pilzzellen
bevorzugt, weil sie leichter manipulierbar sind. Einige Proteine
werden jedoch aus Hefen schlecht sezerniert, oder in einigen Fällen werden sie
nicht richtig prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In
die sen Fällen
sollte ein filamentöser Pilz-Wirtsorganismus
gewählt
werden.
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Bakterien
der Gattung Bacillus sind als heterologe Wirte wegen ihrer Fähigkeit,
Proteine in das Kulturmedium zu sezernieren, sehr geeignet. Andere
Bakterien, die als Wirte geeignet sind, sind jene der Genera Streptomyces
und Pseudomonas. Eine bevorzugte Hefe-Wirtszelle für die Expression
der für
das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz ist eine der Gattung Saccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia oder Schizosaccharomyces.
Mehr bevorzugt ist eine Hefe-Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (auch
als Kluyveromyces marxianus var. lactis bekannt), Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Schizosaccharomyces pombe.
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Am
meisten bevorzugt für
die Expression der für
das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz sind jedoch filamentöse Pilz-Wirtszellen. Bevorzugte
filamentöse
Pilz-Wirtszellen sind ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Genera Aspergillus, Trichoderma,
Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus,
Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia und Talaromyces. Mehr bevorzugt
stammt eine filamentöse
Pilz-Wirtszelle
von der Spezies Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae oder Aspergillus
nidulans oder stammt von einer Spezies aus der Aspergillus niger-Gruppe
(wie von Raper und Fennell The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company,
Baltimore, S. 293-344,
1965) definiert. Zu diesen zählen,
ohne darauf eingeschränkt
zu sein, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis,
Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans,
Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae und Aspergillus ficuum,
und auch jene der Spezies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum,
Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa,
Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum
dimorphosporum und Thielavia terrestris.
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Beispiele
für bevorzugte
Expressionswirte im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Pilze,
wie Aspergillus-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A 184
438 und in der EP-A 284 603 beschrieben sind) und Trichoderma-Spezies;
Bakterien, wie Bacillus-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A
134 048 und in der EP-A 253 455 beschrieben sind), besonders Bacillus
subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas-Spezies; und Hefen,
wie Kluyveromyces-Spezies (insbesondere jene, die in der EP-A 096
430 beschrieben sind, wie Kluyveromyces lactis, und in der EP-A
301 670 beschrieben sind), und Saccharomyces-Spezies, wie Saccharomyces
cerevisiae.
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Zu
den erfindungsgemäßen Wirtszellen
zählen
Pflanzenzellen, und die Erfindung erstreckt sich daher auf transgene
Organismen, wie Pflanzen und Teile davon, die eine oder mehrere
erfindungsgemäße Zellen enthalten.
Die Zellen können
das erfindungsgemäße Polypeptid
heterolog exprimieren oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide
heterolog enthalten. Die transgene (oder genetisch modifizierte)
Pflanze kann daher in ihr Genom eine Sequenz (typischerweise stabil)
insertiert haben, die für
die Polypeptide der Erfindung codiert. Die Transformation der Pflanzenzellen
kann unter Verwendung bekannter Techniken, beispielsweise unter
Verwendung eines Ti- oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens,
durchgeführt werden.
Das Plasmid (oder der Vektor) kann daher Sequenzen enthalten, die
zum Infizieren einer Pflanze notwendig sind, und derivate des Ti- und/oder Ri-Plasmids
können
verwendet werden.
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Die
Wirtszelle kann das Polypeptid überexprimieren,
und Techniken zur Herbeiführung
einer Überexpression
sind wohl bekannt und können
bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Wirt kann somit zwei
oder mehr Kopien des Polynukleotids aufweisen.
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Alternativ
kann eine direkte Infektion eines Teils einer Pflanze, wie eines
Blattes, einer Wurzel oder eines Stiels, bewirkt werden. Bei dieser
Technik kann die zu infizierende Pflanze verwundet werden, beispielsweise,
indem man die Pflanze mit einem Rasiermesser schneidet, die Pflanze
mit einer Nadel sticht oder die Pflanze mit einem Scheuermittel
reibt. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium inokuliert. Die
Pflanze oder der Pflanzenteil kann dann auf einem geeigneten Kulturmedium
gezüchtet
werden und sich zu einer reifen Pflanze entwickeln lassen. Eine
Regeneration transformierter Zellen zu genetisch modifizierten Pflanzen
kann unter Verwendung bekannter Teckniken erreicht werden, z.B.
durch Selektion transformierter Triebe unter Verwendung eines Antibiotikums
und durch Sub-Kultivieren der Triebe auf einem Medium, welches die
entsprechenden Nährstoffe,
Pflanzenhormone u.dgl. enthält.
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Züchten von
Wirtszellen und rekombinante Produktion Die Erfindung umfasst auch
Zellen, die modifiziert wurden, damit sie Prolin-spezifische Endoprotease
oder eine Variante davon exprimieren. Zu solchen Zellen gehören vorübergehend,
oder vorzugsweise stabil modifizierte höhere eukaryontischen Zelllinien,
wie Säugerzellen
oder Insektenzellen, niedrigere eukaryontische Zellen, wie Hefe-
und filamentöse
Pilzzellen, oder prokaryontische Zellen, wie Bakterienzellen.
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Es
ist auch möglich,
dass die erfindungsgemäßen Polypeptide
vorübergehend
in einer Zelllinie oder auf einer Membran, wie z.B. in einem Baculovirus-Expressionssystem,
exprimiert werden. Solche Systeme, die zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine
adaptiert sind, sind auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann die Erzeugung des Polypeptids der Erfindung durch
Züchten von
mikrobiellen Expressions-Wirten, die mit einem oder mehreren Polynukleotiden
der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, in einem herkömmlichen
Nähr-Fermentationsmedium
bewirkt werden.
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Die
rekombinanten Wirtszellen gemäß der Erfindung
können
unter Verwendung von Vorgangsweisen, die auf dem Gebiet bekannt
sind, gezüchtet
werden. Für
jede Kombination eines Promotors und einer Wirtszelle stehen Kulturbedingungen
zur Verfügung,
die für
die Expression der für
das Polypeptid codierenden DNA-Sequenz förderlich sind. Nach dem Erreichen
der gewünschten
Zelldichte oder dem Titer des Polypeptids, wird das Züchten beendet,
und das Polypeptid wird unter Verwendung bekannter Vorgangsweisen
gewonnen.
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Das
Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kulturmedium umfassen, welches
eine Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Maltose, Molasse usw.), eine
Stickstoffquelle (z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid
etc.) und anorganische Nährstoffquellen
(z.B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen usw.) enthält. Gegebenenfalls
kann ein Inducer (abhängig
vom verwendeten Expressionskonstrukt) inkludiert oder nachträglich zugesetzt
werden.
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Die
Selektion des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes
und/oder auf den regulierenden Erfordernissen des Expressionskonstrukts
basieren. Geeignete Medien sind den Fachleuten gut bekannt. Das
Medium kann gewünschtenfalls
zusätzliche
Bestandteile enthalten, die die transformierten Expressionswirte
gegenüber
anderen, potentiell kontaminierenden Mikroorganismen favorisieren.
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Die
Fermentation kann über
einen Zeitraum von 0,5–30
Tagen durchgeführt
werden. Die Fermentation kann ein Chargen-, kontinuierliches oder
ein Verfahren mit zugeführten
Chargen („fedbatch") sein, bei einer geeigneten
Temperatur im Bereich von zwischen 0°C und 45°C und beispielsweise bei einem
pH-Wert von 2 bis 10. Zu den bevorzugten Fermentationsbedingungen
gehören
eine Temperatur im Bereich von 20°C
bis 37°C
und/oder ein pH-Wert zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen
werden üblicherweise
auf Grund der Wahl des Experessionswirtes und des zu exprimierenden
Proteins ausgewählt.
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Nach
der Fermentation werden die Zellen, falls nötig, aus der Nährlösung durch
Zentrifugieren oder Filtern entfernt. Nach Beendigung der Fermentation
oder nach dem Entfernen der Zellen kann dann das Polypeptid der
Erfindung gewonnen werden und gewünschtenfalls mit herkömmlichen
Mitteln gereinigt und isoliert werden. Die Prolin-spezifische Endoprotease
der Erfindung kann aus dem Pilzmyzelium oder aus der Nährlösung, in
welche die Prolin-spezifische Endoprotease durch die gezüchteten
Pilzzellen freigesetzt wird, gereinigt werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Polypeptid von einem Pilz, mehr bevorzugt von einem Aspergillus,
am meisten bevorzugt, von Aspergillus niger, erhalten.
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Modifikationen
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Die
Polypeptide der Erfindung können
chemisch modifiziert werden, z.B. post-translational modifiziert. Beispielsweise
können
sie (ein- oder mehrmals) glykosyliert werden oder modifizierte Aminosäurereste
aufweisen. Sie können
auch durch die Zugabe von Histidinresten modifiziert werden, um
ihre Reinigung zu unterstützen,
oder durch die Zugabe einer Signalsequenz, um die Sezernierung aus
der Zelle zu fördern.
Das Polypeptid kann Amino- oder Carboxyl-terminale Verlängerungen
aufweisen, wie einen Amino-terminalen Methionin-Rest, ein kleines
Linker-Peptid von bis zu etwa 20–25 Resten, oder eine kurze
Verlängerung,
die die Reinigung erleichtert, wie einen Polyhistidin-Trakt, ein
antigenes Epitop oder eine Bindungs-Domäne.
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Ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
kann mit einer sichtbarma chenden Markierung markiert sein. Die sichtbarmachende
Markierung kann jede geeignete Markierung sein, die eine Detektion
des. Polypeptids ermöglicht.
Zu den geeigneten Markierungen zählen
Radioisotope, z.B. 125I, 35S,
Enzyme, Antikörper,
Polynukleotide und Linker, wie Biotin.
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Die
Polypeptide können
modifiziert sein, so dass sie nicht natürlicherweise vorkommende Aminosäuren inkludieren
oder um die Stabilität
des Polypeptids zu erhöhen.
Wenn die Proteine oder Peptide mit synthetischen Mitteln erzeugt
werden, können
solche Aminosäuren
während
der Herstellung eingeführt
werden. Die Proteine oder Peptide können auch entweder nach einer
synthetischen oder nach einer rekombinanten Produktion modifiziert
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
können
auch unter Verwendung von D-Aminosäuren erzeugt werden. In solchen
Fällen
sind die Aminosäuren
in reverser Sequenz in Orientierung C nach N verknüpft. Dies ist
auf dem Gebiet zur Erzeugung solcher Proteine oder Peptide herkömmlich.
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Eine
Reihe von Seitenketten-Modifikationen ist auf dem Gebiet bekannt
und kann an den Seitenketten der Proteine oder Peptide der vorliegenden
Erfindung vorgenommen werden. Zu solchen Modifikationen zählen beispielsweise
Modifikationen von Aminosäuren
durch reduktive Alkylierung durch Umsetzung mit einem Aldehyd, gefolgt
von einer Reduktion mit NaBH4, Amidierung
mit Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid.
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Die
von der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Sequenzen können auch
als Ausgangsmaterialien für
die Konstruktion von Enzymen der „zweiten Generation" verwendet werden.
Prolinspezifische Proteasen der „zweiten Generation" sind Prolinspezifische
Proteasen, die durch Mutagenese-Techniken (z.B. Stellen-gerichtete
Mutagenese) verändert
sind, die Eigenschaften haben, die sich von jenen der Wildtyp-Prolin-spezifischen
Protease oder von rekombinanten Prolin-spezifischen Proteasen, wie
jenen, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt werden, unterscheiden.
Beispielsweise können
ihre Temperatur oder das pH-Optimum,
die spezifische Aktivität,
Substrat-Affinität
oder Thermostabilität
verändert
sein, damit sie zur Verwendung in einem bestimmten Verfahren besser
passen.
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Aminosäuren, die
für die
Aktivität
der Prolin-spezifischen Endoprotease der Erfindung wesentlich sind und
daher vorzugsweise einer Substitution unterliegen, können gemäß Vorgangsweisen, die
auf dem Gebiet bekannt sind, wie stellengerichteter Mutagenese oder
Alanin-Scanning Mutagenese, identifiziert werden. Bei der letzteren
Technik werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt, und die resultierenden
mutierten Moleküle
werden auf ihre biologische Aktivität (z.B. Prolin-spezifische
Endoprotease-Aktivität)
getestet, um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls
von kritischer Bedeutung sind. Stellen einer Enzym-Substrat-Interaktion
können
ebenfalls durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt weren, wie
sie durch Techniken, wie kernmagnetische Resonanz, Kristallographie
oder Photoaffinitäts-Markierung,
bestimmt wird.
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Man
erwartet, dass die Verwendung von Hefe und filamentösen Pilz-Wirtszellen
solche post-translationalen Modifikationen (z.B. proteolytische
Verarbetiung, Myristilierung, Glycosylierung, Trunkierung, und Tyrosin-,
Serin- oder Threonin-Phosphorylierung),
die man möglicherweise
braucht, um rekombinanten Expressionsprodukten der Erfindung eine
optimale biologische Aktivität
zu verleihen, vorsieht.
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Herstellungen
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Die
Polypeptide der Erfindung können
in isolierter Form vorliegen. Man wird verstehen, dass das Polypeptid
mit Trägern
oder Verdünnungsmitteln,
die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht stören, gemischt
werden kann und noch immer als isoliert angesehen werden kann. Ein
Polypeptid der Erfindung kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten
Form vorliegen, in welchem Fall dies im Allgemeinen das Polypeptid in
einem Präparat
umfassen wird, in welchem mehr als 70%, z.B. mehr als 80%, 90%,
95%, 98% oder 99% der Proteine im Präparat ein erfindungsgemäßes Polypeptid
ist.
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Die
Polypeptide der Erfindung können
in einer solchen Form vorgesehen werden, dass sie außerhalb ihrer
natürlichen
Zellumgebung vorliegen. So können
sie im Wesentlichen isoliert oder gereinigt, wie oben besprochen,
sein, oder in einer Zelle, in welcher sie in der Natur nicht vorkommen,
beispielsweise einer Zelle anderer Pilz-Spezies, Tiere, Pflanzen
oder Bakterien.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Prolylspezifischen
Endoprotease bei der Herstellung eines Getränks. Eine Prolyl-spezifische
Endoprotease wird vorzugsweise bei der Herstellung von Bier, Wein oder
Fruchtsaft verwendet. Durch die Zugabe einer Prolyl-spezifischen
Endoprotease gemäß dem erfin dungsgemäßen Verfahren
wird eine Verringerung oder Verhinderung einer Trübung erreicht.
Durch Zusetzen dieser Prolylspezifischen Endoproteasen werden neue
Getränke
erhalten. So betrifft die Erfindung auch Getränke, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhältlich
sind. Zu diesen Getränken
zählen
beispielsweise Bier, Wein und Fruchtsaft, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren
erhältlich
sind.
-
Ein
Vorteil der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen
Getränke
ist, dass diese Getränke einen
hohen Gehalt an Antioxidantien aufweisen. Polyphenole sind Antioxidantien.
Bier wird üblicherweise
mit einem Polyphenol-entfernenden Agens behandelt, um die Bildung
einer Trübung
zu verhindern, und infolgedessen hat das erhaltene Bier eine geringe
antioxidative Aktivität.
Dasselbe gilt für
andere mit Polypheol-entfernenden Mitteln behandelte Getränke. Bier,
das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhältlich
ist, hat eine höhere
endogene antioxidative Aktivität.
Da man Antioxidantien als gesundheitsfördernde Ingredienzien ansieht,
kann man die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen
Getränke
als Getränke
ansehen, die gesünder
sind als dieselbe Art Getränk,
die mit Polyphenol-entfernenden Mitteln, wie PVPP, zubereitet wurden. Es
ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Farbe
von mit diesem Verfahren erhältlichen Fruchtsäften nicht
bzw. weniger blass ist als die Farbe von Fruchtsäften, die nach dem Entfernen
von Polyphenolen erhalten werden. Weine und Fruchtsäfte, die
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhältlich
sind, haben ein besseres Aroma und einen besseren Geschmack im Vergleich
zu Getränken,
die mit einem Verfahren erhalten werden, bei welchem Bentonit oder
eine ähnliche
Verbindung verwendet wird, da Bentonit nicht nur Proteine entfernt,
sondern auch Aroma und/oder Geschmackskomponenten.
-
BEISPIELE UND VERGLEICHSVERSUCHE
MATERIALIEN
-
Prolin-spezifische Endoprotease-Enzyme
(Endo-Pro's)
-
Aspergillus
niger G306 wurde beim CBS (CBS109712) am 10. September 2001 hinterlegt.
A.niger G306 enthält
ein Gen, das für
eine Prolyl-spezifische Endoprotease gemäß der Erfindung codiert. Das
Gen oder die cDNA, welche (s) aus diesem Organismus erhältich ist,
kann unter Verwendung bekannter Methoden in jedem Aspergillus niger-Wirt
kloniert und exprimiert werden.
-
Die
folgenden Proben wurden verwendet:
- 1) „Endo-Pro
A", eine Prolin-spezifische
Endoprotease, wurde in Versuchen mit Bier verwendet. Die Probe war
ein Ultrafiltrationskonzentrat, erhalten nach Ultrafiltration einer
Nährlösung, die
nach Fermentation eines Aspergillus niger-Stamms umfassend ein Gen,
das für
eine Prolin-spezifische Endoprotease codiert, erhalten wurde. Die
Prolyl-spezifische Aktivität
der Endo-pro A-Probe
betrug 5,06 E/ml, bestimmt wie unter „Methoden" beschrieben. Die Proteinkonzentration
wurde mit 50g/l ermittelt, bezogen auf die spezifische Aktivität einer
Probe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease mit einer Reinheit
von mehr als 90%.
- 2) „Endo-Pro
B", eine Prolin-spezifische
Endoprotease, wurde in Versuchen mit Wein verwendet. Die Probe wurde
nach Reinigung über
eine Säule
erhalten und hatte eine Aktivität
von 6,0 E/ml.
-
Papain
-
Collupulin,
ein von DSM, Frankreich, erhältliches
flüssiges
Papain-Präparat,
wurde für
Versuche mit Papain verwendet. Die Aktivität beträgt 5280 NF/mg. Eine Einheit
NF ist die Menge an Papain-Aktivität, die die Hydrolyse von Casein
katalysiert, um ein Mikrogramm-Äquilanet
von löslichem
Tyrosin pro Stunde bei pH 6,0 zu erzeugen. Die Protein-Konzentration
in der Papain-Probe wurde gemessen, und sie ist 119 g/l (Lowry).
-
Polyvinylpolypyrrolidon
(PVPP)
-
Das
verwendete PVPP war ein im Handel erhältliches, nicht-wasserlösliches
PVPP mit der Bezeichnung „Polyclar
AT".
-
Bier
-
Ein
Malzbier (Pilsener Typ) von „Les
Trois Brasseurs" in
Lille, Frankreich, wurde bei allen mit Bier durchgeführten Versuchen
verwendet. Der Prozentsatz Alkohol dieses Biers betrug 5,2% (V/V),
und der pH-Wert war 4,4. Dieses bestimmte Bier wurde ausgewählt wegen
der relativ hohen Menge an Trübung,
die bei diesem Bier nach dem Kühlen
gemessen wurde, im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen
Bieren. Das Bier hatte eine Protein-Konzentration von 0,9 g/l, wie
mittels der Lowry-Methode bestimmt.
-
Weißwein
-
Ein
aus weißen
Sauvignon-Trauben hergestellter Weißwein wurde ohne Protein-Entfernungs-Behandlung
verwendet. Die alkoholi sche Fermentierung während der Weinerzeugung erfolgte
mit einer ausgewählten Hefe
VL3 von Lallemand. Die önologische
Analyse des Weins ergab die folgenden Resultate:
-
-
VERFAHREN
-
Spektrophotometrisches
Verfahren zur Bestimmung der Prolylspezifischen Endoprotease-Aktivität
-
Die
Substrat-Lösung
ist eine 2 mM Lösung
von N-Carbobenzoxyglycin-prolin-p-nitro-anilid (Z-Gly-Pro-pNA; MW
426,43; Bachem), hergestellt in einem 0,1 M Zitronensäure/0,2
M Dinatriumphosphat-Puffer, pH 5,0, enthaltend 40% Dioxan.
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Zu
1 ml Puffer, pH 5,0, werden 250 μl
der Substratlösung
zugegeben, gefolgt von 100 μl
der Enzymlösung
(größere oder
geringere Volumsmengen der Enzymlösung sollten durch Pufferlösung kompensiert
werden). Die Reaktionsmischung wird bei 37°C inkubiert, und die Freisetzung
von pNA wird durch Messen der Absorptionssteigerung bei 410 nm verfolgt.
-
Aktivitäts-Definition:
1 Einheit ist die Enzym-Aktivität,
die 1 μmol
pNA aus Z-Gly-Pro-pNA in 1 Minute unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen
freisetzt. Um die Konzentrationen zu berechnen, wird ein molarer
Extinktionskoeffizient (E) von 8.800 M–1 verwendet.
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Kühlungs-Trübungsmessungen (Alkohol/Niedrig-Temperaturtest
gemäß Lucien
Chapon)
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Die
Trübe oder
Trübung
wurde mit einem Turbidimeter mit der Bezeichnung Tannometer, von
Pfeuffer GmbH, Kitzingen, Deutschland, gemäß der Bedienungsanleitung von
Pfeuffer gemessen. Stark unterkühltes Bier
weist eine reversible Trübe,
verursacht durch ausgefällte
Polypehnol-Protein-Komplexe, auf. Die Zugabe von Alkohol verringert
die Löslichkeit
der Komplexe und beschleunigt somit die Bildung von Schleiern. Um
das Tannometer zu eichen, wurde eine Formazin-Standard-Lösung hergestellt,
wie von Jean de Clerk, „Cours
de Brasseries",
2. Ausgabe, (S. 595–596)Unviersite
de Louvain, Belgien, beschrieben. Der Standard für die Trübe war in Einheiten EBC. Vom
Bier wurde durch Filtration über
einen Papierfilter die Kohlensäure
entfernt. Direkt vor dem Durchführen
des Kühlungs-Trübungs-Tests
wurde Ethanol zu den Proben in einer Menge zugegeben, die ausreichte,
um den Alkoholgehalt auf 6% (V/V) zu erhöhen. Der Kühlungs-Trübungs-Test wurde durchgeführt, indem
jede Probe während
30 min auf –8°C gekühlt wurde.
Die gebildete Trübung
(Trübe,
in Einheiten EBC) wurde rasch im Turbidimeter, dessen Messkammer
auch auf –8°C gehalten
wurde, gemessen.
-
Die
für Bier
beschriebenen Kühlungs-Trübungs-Tests
können
auch mit Bierwürzen
oder mit alkoholfreien Bieren durchgeführt werden. In diesen Fällen wird
ebenfalls Ethanol zu den Proben in einer Menge zugegeben, die ausreicht,
um einen Alkoholgehalt von 10% (V/V) in den Proben zu erreichen.
Die verwendete Biertrübungs-
oder Trübe-Einheit
ist das ECB, das sind nephelometrische Trübe-Einheiten, wie von der European
Brewery Convention empfohlen.
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Erhitzungs-Trübungs-Tests
-
Wie
von K.J. Siebert (K.J. Siebert et al., J. Agric. Food Chem. 44 (1996))
beschrieben, kann eine Trübe in
Getränken,
wie Wein oder Fruchtsäften,
durch einen Erhitzungs-Test induziert werden. Das Ausmaß der gebildeten
Trübung
ist hauptsächlich
eine Funktion der Mengen an trübungsaktiven
Proteinen und Polyphenolen im Getränk. Beim Erhitzungs-Test wird
die Turbidität
von Proben (z.B. von Wein oder Fruchtsaft) mit einem Turbidimeter
vor und nach dem 30 Minuten langen Erhitzen bei 80°C gemessen.
Vor dem Messen der Trübung wird
die erhitzte Probe unter kaltem Wasser abgekühlt, bis eine Temperatur von
22–25°C erreicht
ist. Bei den Wein-Versuchen (vgl. Beispiel III) erfolgte die Eichung
des Turbidimeters mit NTE-Formazin-Standard-Lösungen, für die Fruchtsaft-Versuche (vgl.
Beispiel V) wurde die NTE-Trübungs-Standard-Lösung von
Reagecon, Irland, gekauft. NTE=nephelometrische Turbiditäts-Einheiten.
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Kontrollversuche
-
- (i) Ein Leer-Experiment wurde durchgeführt, wobei
kein exogenes Protein während
der Inkubation zugesetzt wurde.
- (ii) Ein Versuch wurde durchgeführt, bei welchem Bier verwendet
wurde, das mit einer großen
Menge an PVPP (1000 g/hl) vor der Inkubation behandelt worden war.
Dieser Versuch ermöglichte
die Bestimmung des durchschnittlichen Ausmaßes der Trübe, die durch den Kühlungs-Trübungs-Test
induziert wird, welche auf Polyphenol-Protein-Präzipitat zurückzuführen ist, weil PVPP Polyphenole
aus dem Bier entfernt und somit die Bildung einer Trübung beeinträchtigt.
- (iii) Versuche wurden durchgeführt, bei welchen exogene Proteine
(Prolin-spezifische Endoprotease bzw. Papain) dem nach einer einstündigen Inkubation
bei 40°C
auf 0°C
gekühlten
Bier zugesetzt wurden. Die Inkubation bei 0°C erfolgte 15 min lang vor den
Trübungsmessungen.
Da das Enzym und Papain bei 0°C nicht
oder kaum aktiv sind, ermöglichten
diese Versuche eine Unterscheidung zwischen dem Effekt der Enzymaktivität und nicht-enzymatischen
Protein-Effekten.
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VERSUCHE UND VERGLEICHSBEISPIELE,
DIE DIE WIRKUNG AUF DIE TRÜBUNG
WÄHREND
VERSCHIEDENER TESTS ZEIGEN
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Beispiel I. Die Wirkungen
der Zugabe einer Prolylspezifischen Endoprotease auf die Trübe-Bildung
in Bier
-
Zu
einem Malzbier, aus dem die Kohlensäure entfernt worden war (Les
Trois Brasseurs), Proteingehalt: 0,9 g/l, wurden verschiedene Mengen
eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms („Endo-Pro A", vgl. „Materialien") zugegeben. Zwei
Reihen von Trübemessungen
wurden durchgeführt.
Bei der ersten Reihe wurden die Bier-Endo-Pro A-Zusammensetzungen
vor dem Kühlungs-Trübungstest
1 h lang bei 40°C
inkubiert. Nach der Inkubation bei 40°C und direkt vor dem Kühlungs-Trübungs-Test
wurde Ethanol zur Bier-Endo-Pro A-Zusammensetzung in einer Menge
zugegeben, die ausreichte, um den Alkohol auf 6% (V/V) zu erhöhen. Bei
der zweiten Reihe wurde das Bier ohne Endo-Pro A 1 h lang bei 40°C inkubiert
und danach auf 0°C gekühlt. Bei
0°C wurde
das Endo-Pro A zugesetzt,
und die resultierenden Zusammensetzungen wurden 15 min lang bei
0°C inkubiert.
Direkt vor dem Kühlungs-Trübungs-Test wurde der Bier-Endo-Pro
A-Zusammensetzung Ethanol in einer Menge zugesetzt, die ausreichte,
um den Alkoholgehalt auf 6% (V/V) zu erhöhen.
-
Die
Mengen an zugesetztem Endo-Pro A und der Prozentsatz der Trübungsverringerung
bezogen auf die gemessene Trübung,
wenn kein Endo-Pro A zugesetzt wurde, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Mengen an zugesetzten Endo-Pro A deckten einen großen Bereich
von weniger als 1% zugesetzter exogener Proteine bis zu mehr als
10% ab, bezogen auf die Menge von im Bier vorhandenem Protein.
-
Tabelle
1. Wirkung der Zugabe eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms
zu einem Bier auf die Menge der Trübung nach einer einstündigen Inkubation
bei 40°C
-
Tabelle
2. Wirkung des Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms in Bier auf
die Menge der Trübung
nach einer 15-minütigen
Inkubation bei 0°C
-
Die
Tabelle 1 zeigt deutlich, dass sich nach dem Kühlen weniger Trübung gebildet
hat, wenn dem Bier eine Prolylspezifische Endoprotease bei einer
Temperatur zugesetzt wird, (und) wenn die Protease vor dem Kühlen aktiv
ist. Die Tabelle 2 zeigt deutich, dass etwas Wirkung vorhanden ist,
wenn eine Prolyl-spezifische Endoprotease dem Bier bei einer Temperatur
zugesetzt wird, die so niedrig ist, dass die Protease nicht oder kaum
aktiv ist, jedoch die Auswirkung sehr gering im Verglich zu jener
Wirkung ist, die beobachtet wird, wenn die Protease bei einer Temperatur
zugesetzt wird, bei welcher sie aktiv ist.
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Vergleichsversuch A. Die
Wirkungen der Zugabe von Papain auf die Trübungsbildung in Bier
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Zu
einem Malzbier (Les trois Brasseur), von welchem die Kohlensäure entfernt
worden war, Proteingehalt: 0,9 g/l, wurden verschiedene Mengen an
Papain (von 0 bis 100 g/hl) zugegeben. Zwei Reihen Kühlungs-Trübungs-Messungen
wurden durchgeführt.
Für die
erste Reihe wurden die Bier-Papain-Zusammensetzungen vor dem Kühlungs-Trübungs-Test
1 h lang bei 40°C
inkubiert. Ethanol wurde den inkubierten Proben zugesetzt, so dass
sie 6% Alkohol (V/V) vor den Trübungsmessungen
erreichten. Bei der zweiten Rei he wurden Bierproben 1 h lang bei
40°C inkubiert,
und danach auf 0°C
abekühlt.
Danach wurde das Papain zugesetzt, und die Proben wurden 15 min
lang bei 0°C
inkubiert. Die Mengen an zugesetztem Papain und der Prozentsatz
der Trübungsverringerung
im Vergleich zur Trübung,
die gemessen wurde, wenn kein Papain zugesetzt wurde, sind in Tabelle
3 gezeigt.
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Tabelle
3. Wirkung von Papain auf die Menge der in Bier gebildeten Trübung nach
einstündiger
Inkubation bei 40°C
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Tabelle
4. Wirkung von Papain auf die Menge der Trübung nach 15-minütiger Inkubation
bei 0°C
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Die
Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen die Wirkung von Papain auf die nach
dem Kühlen
in Bier gebildete Trübungsmenge.
Es ist klar, dass die Wirkung von Papain auf die Trübung sich
einpendelt, wenn Papain in einer Menge von 3g/hl und darüber zugesetzt
wird. Offensichtlich ist es nicht möglich, mit Papain dieselbe Menge
einer Trübungsverminderung
zu erreichen wie mit einer Prolyl-spezifischen Endoprotease.
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Vergleichsversuch B. Die
Wirkungen der Zugabe von PVPP auf die Trübungsbildung in Bier
-
Sowohl
bei den Bier/Prolyl-spezifischen Endoprotease-Versuchen als auch bei den Bier/Papain-Versuchen
wurde ein Kontrollversuch vorgenommen, indem eine große Menge
an PVPP (1000 g/hl) dem Bier vor der Inkubation zugesetzt wurde.
Nach 15-minütigem Mischen
wurde das PVPP durch Filtration entfernt (es wurde kein Prolyl-spezifisches
Endoprotease-Enzym oder Papain zugesetzt). Bei beiden Kontrollen
entstand während
des Kühlungs-Trübungs-Versuchs
fast keine Trübung.
Da bekannt ist, dass PVPP Polyphenole aus Getränken entfernt, weisen diese
Kontrollversuche darauf hin, dass Polyphenole an der Entstehung
einer Trübung
in Bier sehr wohl beteiligt sind. Um die PVPP-Wirkung auf die Bier-Trübungsstabilität zu messen,
wurden verschiedene Mengen an PVPP einem Bier, dem die Kohlensäure entzogen
worden war, zugesetzt und durch Filterung nach 15-minütigem Mischen
entfernt. Vor der Zugabe des PVPP wurde das Bier 1 h lang bei 40°C inkubiert.
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Tabelle
5 zeigt die Wirkung der Zugabe verschiedener Mengen von PVPP auf
die Menge der in Bier nach dem Kühlen
vorhandenen Trübung.
Kein Endo-Pro A oder Papain wurde zugesetzt.
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Tabelle
5. Wirkung von PVPP auf die Menge der in Bier nach dem Kühlen vorhandenen
Trübung
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In
Tabelle 3 ist gezeigt, dass die Zugabe von 3g Papain/hl Bier (welches
die in der Bierindustrie empfohlene maximale Dosis ist) nach einstündiger Inkubation
bei 40°C
eine Trübungsverringerung
von fast 36% induziert. Im Falle einer Zugabe der Prolylspezifischen
Endoprotease, induziert die Zugabe von 1% (bezogen auf die Menge
an Protein im Bier) Prolyl-spezifischer Endoprotease nach einer
einstündigen
Inkubation bei 40°C
eine Verringerung einer Bier-Kühlungs-Trübung von
38% (vgl. Tabelle 1). In Brauereien wird PVPP im Allgemeinen in
einer Menge zugesetzt, die 30 g/hl nicht übersteigt. Da PVPP die Trübung um
etwa 20% verringert, wenn es in dieser Menge zugesetzt wird, kann
man schließen,
dass sowohl Papain als auch Prolyl-spezifische Endoprotease-Enzyme
bessere Trübungs-Hemmer
sind als PVPP.
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Beispiel II. Zugabe von
Endo-Pro auf eine 100 Malzmaische und Trübungsverringerung in einer
100 Malz-Bierwürze
-
Das
Ziel war, zu bestimmen, ob die Zugabe von Prolylspezifischer Endoprotease
zu einer 100 Malzmaische in der end gültigen Malz-Bierwürze zu einer
Trübungsminderung
führen
könnte.
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Jeder
Maischversuch beginnt mit dem Mischen von 25g gemahlenem Malz mit
100 ml Wasser. Danach wird die Maische auf 50°C erhitzt, und nach der Zugabe
einer Menge an „Endo-Pro
A" wird die Maische gemäß einer
stufenweisen Erhitzung auf vier jeweils höhere Temperaturen behandelt.
Die Tabelle 6 zeigt dieses Maischen-Temperaturprofil. Während des
gesamten Maischens wurde die Maische mit 200 U/min gerührt. Am
Ende des Maischens wird die Maische bei Raumtemperatur gehalten,
und Wasser wurde zugegeben, um die Wasserverdampfung zu kompensieren.
Danach wurde die Maische auf Papier filtriert, um die Bierwürze (Flüssigkeit)
von den Feststoffen zu trennen.
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Tabelle
6. Maischen-Temperaturprofil
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0,
200 bzw. 500 μl
Endo-Pro A wurde den Maischen zugesetzt. Ein Kontrollversuch wurde
durchgeführt,
wobei 500 μl
Endo-Pro A verwendet wurden, welches durch 15-minütiges Erhitzen
desselben auf 90°C inaktiviert
wurde. Die Trübung
oder Trübe
der Bierwürze
wurde bei Raumtemperatur und nach dem Kühlungs-Trübungs-Test gemessen. Die Bierwürzen-Kühlungs-Tests
werden, wie im Alkohol/Niedrigtemepratur-Test gemäß Chapon
(Kühlungs-Trübungs-Test
Pfeuffer Bedienungsanleitung) beschrieben, durchgeführt, indem
Ethanol zugesetzt wurde, um 10% (V/V) in der Probe zu erreichen,
wie von Chapon für
alkoholfreie Biere empfohlen.
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Tabelle
7: Wirkung der Zugabe von Prolyl-spezifischer Endoprotease zu 100
Malzmaischen auf die Menge der in den resultierenden 100 Malz-Bierwürzen gebildeten
Trübung
(nach dem Kühlungs-Trübungs-Test)
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Die
Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen deutlich, dass, wenn einer Malzmaische
eine Prolyl-spezifische Endoprotease zugesetzt worden ist, die resultierende
Bierwürze
nach dem Kühlen
viel weniger trüb
ist als eine ohne Zugabe einer Prolyl-spezifischen Endoprotease
hergestellte Bierwürze.
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Um
die Endo-Pro A-Wirkung zu untersuchen, wurde ein Kühlungs-Trübungs-Test
auf einer Malz-Bierwürze
durchgeführt.
Es wurde beobachtet, dass der Zusatz einer Prolyl-spezifischen Endoprotease
die Bierwürze-Kühlungs-Trübung verringerte.
Eine Verringerung der im Kühlungs-Trübungs-Test
gebildeten Trübung wurde
selbst bei geringen Mengen zugesetztem Prolyl-spezifischem Endoprotease-Enzym
beobachtet. Wenn das Enzym vor der Zugabe zur Maische inaktiviert
wird, verschwindet der Stabilisierungseffekt vollständig, d.h. die
Menge der gebildeten Trübung
wird nicht mehr verringert. Die die durch die Zugabe eines Prolylspezifischen
Enzyms induzierte Trübungsverringerung
ist sehr wichtig. Im Beispiel wurde eine Trübungsverringerung von bis zu
82% erreicht.
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Um
die Wirkungen der Zugabe eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms
in Malz-Bierwürzen und
in Gerste-Bierwürzen
zu vergleichen, wurden Versuche durchgeführt, wobei verschiedene Mengen
an Endo-Pro A Gerste-Maischen zugesetzt wurden. Der pH-Wert war 5,6 bei
Malz-Bierwürzen,
bzw. 6,1 bei Gerste-Bierwürzen. Die
bei Gerste-Bierwürzen-Kühlungs-Trübungs-Tests
erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass, wie früher bei Malz- Bierwürzen beobachtet,
die Behandlung von Gerste-Maischen mit einer Prolyl-spezifischen Endoprotease
eine wichtige Verringerung der Gersten-Bierwürzen-Kühlungs-Trübung induziert. Sowohl Malz- als
auch Gerste-Maischen, die mit einer Prolylspezifischen Endoprotease
behandelt wurden, führen
zu sehr stabilisierten Bierwürzen,
doch ist die Wirkung bei Malz-Bierwürzen stärker als bei Gerste-Bierwürzen. Tatsächlich induzierte
die Zugabe von 200 μl
Endo-Pro A zur Maische eine Trübungsverringerung
von etwa 59% bei Gerste-Bierwürzen,
und mehr als 70% bei Malz-Bierwürzen.
Die mit 500 μl
Endo-Pro A durchgeführten
Versuche steigerten die Trübungsverringerung
bis zu 82% bei Malz-Bierwürzen und
verbesserten die Trübungsverringerung
bei Gerste-Bierwürzen nicht,
im Vergleich zum 200 μl
Endo-Pro A-Versuch. Überraschenderweise
führte
die Zugabe von Endo-Pro A zu Gerste-Maischen zu klaren filtrierten Bierwürzen, wogegen
die nicht mit Endo-Pro behandelten Maischen trübe filtrierte Bierwürzen ergaben
(die Gerste-Maische-Filterungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, und
die Trübe
der Bierwürzen
wurde bei Raumtemperatur ohne Ethanol-Zugabe gemessen). Diese Wirkung
wird beobachtet, gleichgültig,
wie hoch die Menge der den Gerste-Maischen zugesetzten Prolyl-spezifischen
Endoprotease ist.
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Beispiel III. Trübungsverringerung
bei Wein
-
Verschiedene
Dosen (0, 30, 60, 150 μl)
einer Prolylspezifischen Endoprotease (Endo-Pro B) mit einer spezifischen
Aktivität
von 6,0 E/ml wurden in Kolben gegeben, die 500 ml Weißwein (Wein,
wie unter „Materialien" beschrieben) enthielten
und bei Raumtemperatur (22–25°C) 19 Tage
lang unter einer Stickstoffatmosphäre inkubiert. Die Wein-Trübungsstabilität wurde
nach 0, 6, 8, 12 und 19 Tagen gemessen, wobei der Erhitzungs-Test wie unter „Methoden" beschrieben, verwendet
wurde.
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Die
Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 8 gezeigt. In Tabelle 8
ist die Wein-Trübung
oder Trübe in
Nephelos-Turbidiäts-Einheiten
(NTE) ausgedrückt, ΔNTE=Trübe in NTE,
gemessen an Weinproben nach dem Erhitzen- Trübe in NTE gemessen an Weinproben
vor dem Erhitzen. Die Menge an Bentonit, die notwendig war, um die
Proteine des Weins zu stabilisieren, wurde gemäß der Formel (1,48 × ΔNTE)+2 errechnet.
Wie bekannt, ist weniger Bentonit notwendig, um im Wein die Entstehung
einer Trübung
zu verhindern, wenn ein Wein weniger empfänglich für eine Trübungsbildung ist.
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Tabelle
8. Wirkung der Zugabe eines Prolyl-spezifischen Endoprotease-Enzyms
zu Weißwein
auf die Menge der nach dem Erhitzen des Weins gebildeten Trübung
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass der Zusatz einer Prolyl-spezifischen
Endoprotease zu einem Weißwein
vor dem Erhitzen die im Wein nach dem Erhitzen gebildete Trübung verringert.
Nach 6-tägiger
Inkubation bei Raumtemperatur wird die Wirkung beobachtet. Tatsächlich erreicht
die Abnahme der Trügung
39% mit 150 μl
zugesetztem Endo-Pro B und etwa 12% mit 30 μl oder 60 μl Endo-Pro B. Nach 12 Tagen,
und unabhängig
von der Men ge der verwendeten Prolyl-spezifischen Endoprotease erreicht
die Trübungsverringerung
46% und übersteigt
70% nach 19 Tagen. Daher ist es klar, dass eine Prolyl-spezifische
Endoprotease verwendet werden kann, um Bentonit, der notwendig ist,
um Wein gegen die Bildung einer Trübung zu stabilisieren, zu vermeiden
oder dessen Menge stark zu verringern.
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Beispiel IV. Trübungsverringerung
in Erdbeersaft
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Ein
Erdbeer-Fruchtsaft wurde, wie folgt, hergestellt: Erdbeeren wurden
aufgetaut und zerstoßen
und danach blanchiert (erhitzt) bei 90°C, um alle endogenen Enzyme,
wie Polyphenoloxidasen, zu zerstören
und die Proteine zu denaturieren. Die zerstoßenen Erdbeeren wurden dann
auf 50°C
abegekühlt,
30 min lang bei 50°C
mit 600g/t Papidase BE super (einem handelsüblichen Enzymprodukt von DSM,
Frankreich) mazeriert, und in einer pneumatischen Presse gepresst.
Um die denaturierten Proteine zu entfernen, wurde die resultierende
Mischung bei einer Geschwindigkeit von 8000 U/min zentrifugiert
und filtriert. Der Erdbeersaft wurde gesammelt. Ein angesäuerter Alkoholtest
war negativ, was bestätigte,
dass der Saft Pektin-frei war. Der pH-Wert des Saftes war 3,3.
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Endo-ProA/Erdbeersaft-Inkubationen:
Unterschiedliche Volumina (0, 5, 10, 20 μl) von Endo-Pro A (5,06 E/ml)
wurden 100 ml Erdbeersaft zugesetzt und bei 50°C 60 min lang inkubiert. Zwei
Kontroll-Versuche wurden durchgeführt, (i) einer durch Zugabe
von 20 μl
inaktiviertem Endo-Pro A (30 min lang bei 80°C inkubiert) und (ii) eine zweite
Kontrolle, durch Zugabe von 200 mg PVPP zu 20 ml Erdbeersaft, welcher
zuvor 1 h lang bei 50°C
inkubiert worden war. Nach 15-minütigem Mischen bei Raumtemperatur
wurde das PVPP durch Zentrifugieren entfernt.
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Saft-Erhitzungs-Test:
die Saft-Trübung
wurde vor und nach dem 30-minütigen
Erhitzen der Fruchtsaft-Proben bei 80°C gemessen. Vor dem Messen der
Trübung
wurden die erhitzten Säfte
unter kaltem Wasser abgekühlt.
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Die
Trübungsmessungen
wurden in einem Turbidimeter durchgeführt, welches zuvor mit NTE-Trübungs-Standards
von Reagecon (Irland) geeicht worden waren.
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Tabelle
9: Wirkung der Zugabe von Prolyl-spezifischer Endoprotease auf die
Trübung
in Erdbeersaft
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Die
Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass die Zugabe von 5 μl Endo-Pro
A zu 100 ml Erdbeersaft die Trübe,
die nach einem Saft-Erhitzungs-Test
gebildet war, um 25,7 verringerte. Die Zugabe von 10 μl Endo-Pro A
zu 100 ml Erdbeersaft verbesserte die Trübungs-Verringerungswirkung
im Vergleich zum Versuch mit 5 μl nicht.
Möglicherweise
ist die Enzymwirkung bei 5 μl
maximal und wird mit vermehrter Enzymzugabe eine vermehrte Protein-Ausfällung erhalten.
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Inaktiviertes
Enzym verringerte noch immer die Menge der gebildeten Trübung, die
Wirkung war jedoch viel weniger ausgeprägt. Nach Zugabe von PVPP wurde
fast keine Trübung
beobachtet, doch ging auch die Farbe der Probe verloren. Die Tatsache,
dass der Zusatz von PVPP eine Trübungsbildung
verhindert, deutet darauf hin, dass auch bei Erdbeersaft die Trübung wahrscheinlich
ein Ergebnis von Polyphenol-Protein-Interaktionen ist.
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