DE60035487T2

DE60035487T2 - Reifung von dendritischen zellen mit immunantwort modifizierenden verbindungen

Info

Publication number: DE60035487T2
Application number: DE60035487T
Authority: DE
Inventors: Mark A. Saint Paul TOMAI; John P. Saint Paul VASILAKOS; Cory L. Saint Paul AHONEN
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2020-01-13
Also published as: EP1153122A2; DE60035487D1; AU2504300A; WO2000047719A2; US6558951B1; US20030186440A1; WO2000047719A3; ES2286996T3; ATE366800T1; JP2002536013A; NO20013875L; NO20013875D0; EP1153122B1; CA2362377A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung synthetischer Modifikatoren der Immunantwort, um die Reifung dendritischer Zellen in vitro zu induzieren. Die Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren der Reifung dendritischer Zellen, In-vitro-Verfahren zum Verstärken der Antigenpräsentationsfähigkeit dendritischer Zellen und zum Verstärken der T-Zell-Stimulation mithilfe von synthetischen Modifikatoren der Immunantwort. Die vorliegende Beschreibung beschreibt des Weiteren zelluläre Hilfsstoffe, die mit den dendritischen Zellen hergestellt worden sind, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereift worden sind.
Es ist bekannt, dass dendritische Zellen eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen, sowohl aufgrund ihrer starken Antigenpräsentationsfähigkeit und ihrer Fähigkeit, von T-Zellen vermittelte Immunantworten auszulösen. Dendritische Zellen („DC") aktivieren T-Zellen tatsächlich effizienter als alle anderen bekannten antigenpräsentierenden Zellen und könnten für die anfängliche Aktivierung naiver T-Zellen in vitro und in vivo erforderlich sein. Diese Zellen sind im Körper im Allgemeinen an Stellen vorhanden, die Fremdantigenen routinemäßig ausgesetzt sind, beispielsweise die Haut, Lunge, der Darm, das Blut und die Lymphgewebe. DC werden im Allgemeinen grob als unreif oder reif klassifiziert. Unreife DC nehmen Antigen durch Endozytose auf und verarbeiten es effizient, exprimieren aber niedrige Mengen an kostimulatorischen Molekülen. Reife DC zeigen dagegen erhöhte Mengen der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und CD86 sowie von HLA-DR. Darüber hinaus exprimieren reife DC CD83 und sezernieren erhöhte Mengen verschiedener Zytokine und Chemokine, die die Aktivierung von T-Zellen unterstützen.
DC aktivieren nicht nur naive T-Zellen, sondern können das Gleichgewicht der Th1/Th2-Immunantwort beeinflussen. Mehrere Berichte haben darauf hingewiesen, dass DC vorzugsweise Th1-Antworten aktivieren, wobei die IL-12-Sekretion der aktivierten DC den wichtigsten determinierenden Faktor darstellt. Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071 (1995). Hilkens et al., Blood 90:1920 (1997). Andere Berichte haben gezeigt, dass DC die Erzeugung von Th1- oder Th2-Klonen auslösen können. Roth, et al., Scand. J. Immunol. 43:646 (1996). Die Belege deuten an, dass die Fähigkeit von DC zur Auslösung einer Th1- oder Th2-Antwort von mehreren Faktoren beeinflusst wird, einschließlich vom Verhältnis von DC zu T-Zellen, dem Herkunftsgewebe der DC, der Menge an Antigen, die zum Priming der DC verwendet wird, der Expression kostimulatorischer Moleküle und dem Antigeninjektionsweg.
Die zentrale Rolle, die DC bei der Antigenpräsentation und der T-Zell-Aktivierung spielen, hat dazu geführt, dass der Verwendung von DC in der Immuntherapie erhebliches Interesse entgegengebracht wurde. Dies zeigt sich insbesondere in den Gebieten der Vakzinologie und der Krebsimmuntherapie. Obwohl viel Arbeit auf die Entwicklung erfolgreicher Impfstoffe mithilfe rekombinanter DNA aufgewandt worden ist, wurde die erfolgreiche klinische Anwendung von DNA-Impfstoffen nicht erreicht. Kürzlich erhaltene Hinweise deuten darauf hin, dass eine wirksame Immunisierung mit DNA-Impfstoffen die Expression rekombinanten Proteins von Seiten der DC erfordert. In Tiermodellen wurde darüber hinaus eine verstärkte Immunität erreicht, indem DNA-Impfstoffe verwendet wurden, die Zytokine kodieren oder die CpG-Oligonukleotidsequenzen enthalten, welche die DC-Reifung hochregulieren. Kürzlich sind aus Krebspatienten erhaltene autologe DC für eine Krebsimmuntherapie verwendet worden. Siehe z. B. WO98/23728 . Entsprechend sind effiziente Ex-vivo-Verfahren zum Erzeugen von DC eine Bedingung für eine erfolgreiche Immuntherapie.
Der Vorgang der Erzeugung von DC ex vivo besteht im Allgemeinen aus dem Erhalten von DC-Vorläuferzellen und der anschließenden Differenzierung der Zellen zu DC in vitro, bevor sie zurück in den Patienten verbracht werden. Die DC müssen allerdings terminal differenziert sein, da sie ansonsten zu Monozyten/Makrophagen differenzieren und ihre immunpotenzierende Fähigkeit größtenteils verlieren. Die Reifung von DC ex vivo wurde mit Monozyten-konditioniertem Medium, rekombinanten Zytokinen wie TNF-α, IL-1 und IL-6, bakteriellen Produkten wie LPS, bakterieller DNA und Vernetzung von CD40 und Transfektion mit Genen, die Zytokine oder kostimulatorische Moleküle kodieren, erfolgreich erreicht. Obgleich diese Verfahren reife DC hervorbringen können, gibt es Nachteile bei der Verwendung rekombinanter Moleküle und zellulärer Überstände zur Reifung von DC in vitro. Diese umfassen uneinheitliche Qualität und Ausbeute von Charge zu Charge dieser Reagenzien und die Einführung exogener Proteine in Patienten, die toxisch sein oder zu Autoimmunität führen könnten. Solche Reagenzien können auch teuer in der Herstellung sein, was eine Immuntherapie so teuer macht, dass sie nicht infrage kommt. Es besteht ein Bedarf für ein Verfahren der Reifung von DC, das zuverlässig und effizient ist und nicht die Nachteile der derzeit bekannten Verfahren aufweist. L. Zitvogel et al. beschreiben in Cellular Immunology 1996, 197(1), 284-293, gentechnisch hergestellte dendritische Zellen und deren Rolle als Tumorimpfstoffadjuvans in vivo.
Wir haben festgestellt, dass bestimmte, die Immunantwort modifizierende (IRM) Verbindungen die Reifung von DC in vitro induzieren können. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um kleine Moleküle, die einfach und mit gleichmäßigem Reinheits- und Wirksamkeitsgrad produziert werden können. Durch Verwendung dieser Verbindungen können DC effizient und einheitlich gereift werden, die dann als immuntherapeutische Mittel verwendet werden können. Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten IRM-Verbindungen sind im Allgemeinen vom Imidazochinolintyp; das heißt, sie haben eine Struktur, die das Imidazochinolin-Ringsystem oder ein ähnliches Ringsystem, wie Imidazopyridin oder Imidazonaphthyridin, enthält.
Entsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren der In-vitro-Reifung dendritischer Zellen bereit, umfassend das Behandeln der dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem enthält.
Die Erfindung stellt des Weiteren ein In-vitro-Verfahren zum Verstärken der Antigenpräsentationsfähigkeit von dendritischen Zellen bereit, umfassend das Behandeln der dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wie oben definiert.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines zellulären Adjuvans für die Behandlung einer Krankheit bereit, umfassend die Schritte des Reifens dendritischer Zellen in vitro durch Behandeln der dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wie oben definiert, und Aussetzen der reifen dendritischen Zellen zu einem Antigen, das mit der Krankheit verknüpft ist.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung dendritischer Zellen bereit, welche durch Stimulation mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp gereift worden sind, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem enthält, für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Krankheit, wobei eine therapeutisch wirksame Dosis der dendritischen Zellen einem Säuger verabreicht wird, der eine solche Behandlung benötigt, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus einem Tumor, Infektionen, Asthma, allergischer Rhinitis, systemischem Lupus erythematodes, Ekzem, atopischer Dermatitis, Omenn-Syndrom (Hypereosinophilie-Syndrom), parasitären Infektionen, ausgewählt aus kutanen und systemischen Leishmaniasen, einer Toxoplasma-Infektion und Trypanosomen-Infektion, Pilzinfektionen, ausgewählt aus Candidiasis und Histoplasmose und intrazellulären bakteriellen Infektionen, ausgewählt aus Lepra und Tuberkulose.
1 ist eine grafische Darstellung der Fähigkeit der IRM-Verbindung 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazo-[4,5-c]-chinolin-1-ethanol (R-848) zur Verstärkung der Zelloberflächenexpression von CD83 und CD86.
2 zeigt die Fähigkeit von R-848 zur Verstärkung der Zelloberflächenexpression von kostimulatorischen Molekülen auf MO-DC.
3 zeigt die Reifung von DC wie gemessen durch Zelloberflächenexpression verschiedener Marker nach 6-stündiger Stimulation mit 2 μg/ml R-848.
4 zeigt die Ergebnisse des Behandelns von MO-DC mit R-484 auf die T-Zell-Proliferation und die Zytokinproduktion von T-Zellen, wie in einer primären MLR beobachtet.
5 zeigt die Antwort von mit R-848 behandelten MO-DC auf Tetanus-Toxoid.
Die IRM-Verbindungen
Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen IRM-Verbindungen vom Imidazochinolintyp. Der Begriff „IRM-Verbindungen vom Imidazochinolintyp" bezieht sich auf Verbindungen, die ein Imidazochinolin-Ringsystem oder ein ähnliches Ringsystem enthalten und die Fähigkeit aufweisen, die Immunantwort zu modifizieren. Die IRM-Verbindungen vom Imidazochinolintyp enthalten eines oder mehrere der folgenden Ringsysteme: Imidazochinolin, Imidazopyridin, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin, Imidazonaphthyridin und Imidazotetrahydronaphthyridin. Besonders bevorzugte IRM-Verbindungen enthalten ein Imidazochinolin-4-Amin-Ringsystem. Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, haben typischerweise auch die Fähigkeit, die Produktion von einem oder mehreren der Zytokine TNF-α, IL-1, IL-6 und IL-12 zu induzieren, wenn sie einem Wirt oder dendritischen Zellen oder Monozyten/Makrophagen in vitro verabreicht werden.
Die Immunantwort modifizierenden Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen Verbindungen, die von den Formeln I-IX(b) unten definiert sind. Bevorzugte 1H-Imidazo-[4,5-c]chinolin-4-amine sind definiert durch Formel I-V:
wobei
R₁₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen, Hydroxalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl, wobei es sich bei der Acyloxy-Einheit um Alkanoyloxy mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen oder Benzoyloxy handelt und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl besteht, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
R₂₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl besteht, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten; und
jedes R₁ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₁-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
wobei
R₁₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen und substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen besteht, und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen; und
R₂₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei solche Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten; und
jedes R₂ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₂-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten,
wobei
R₂₃ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, Benzyl, (Phenyl)ethyl, und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten; und
jedes R₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₃-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
wobei
R₁₄ -ChR_xR_y ist, wobei R₁₄ Wasserstoff oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ist, unter der Maßgabe, dass, wenn R_y Wasserstoff ist, R_x Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, 1-Alkynyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, Alkoxyalkyl wobei die Alkoxyeinheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält und die Alkyleinheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, 2-, 3- oder 4-Pyridyl ist, und unter der weiteren Maßgabe, dass, wenn R_y eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ist, R_y und R_x zusammen eine Tetrahydrofuranylgruppe bilden, die gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy und Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht;
R₂₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Phenyl und substituiertem Phenyl besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht; und
R₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₄-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
wobei
R₁₅ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen und substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen besteht und aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, und substituiertes geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxyeinheit eines bis vier Kohlenstoffatome enthält und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Acyloxyalkyl, wobei es sich bei der Acyloxy-Einheit um Alkanoyloxy mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen oder Benzoyloxy handelt, und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Benzyl, (Phenyl)ethyl, und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
ist, wobei
R_S und R_T unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Phenyl und substituiertem Phenyl besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen ausgewählt ist;
X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyl-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Haloalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkylamido, wobei die Alkylgruppe ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Amino, substituiertem Amino, wobei der Substituent Alkyl oder Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist, Azido, Chloro, Hydroxy, 1-Morpholino, 1-Pyrrolidino, Alkylthio mit einem bis vier Kohlenstoffatomen; und
R₅ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₅-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten.
Bevorzugte 6,7-fusionierte Cycloalkylimidazopyridin-4-amin-IRM-Verbindungen sind durch Formel VI unten definiert:
wobei m 1, 2 oder 3 ist;
R₁₆ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, Cycloalkyl mit drei, vier oder fünf Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen and substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Cycloylkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Fluor- oder Chloralkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen und einem oder mehreren Fluor- oder Chloratomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen und substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen; Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen; Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxyeinheit eines bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Acyloxyalkyl, wobei es sich bei der Acyloxy-Einheit um Alkanoyloxy mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen oder Benzoyloxy handelt, und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, mit der Maßgabe, dass jede solche Alkyl-, substituierte Alkyl-, Alkenyl-, substituierte Alkenyl-, Hydroxyalkyl-, Alkoxyalkyl- oder Acyloxyalkylgruppe kein vollständig substituiertes Kohlenstoffatom aufweist, das direkt mit dem Stickstoffatom verbunden ist, Benzyl, (Phenyl)ethyl, und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, mit der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
und -ChR_xR_y,
wobei
R_y Wasserstoff oder eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ist, mit der Maßgabe, dass wenn R_y Wasserstoff ist, R_x ein Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Hydroxyalkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, 1-Alkynyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyleinheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, 2-, 3- oder 4-Pyridyl, und mit der weiteren Maßgabe, dass, wenn R_y eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ist, R_y und R_x zusammen eine Tetrahydrofuranylgruppe bilden, die gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Hydroxy und Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht;
R₂₆ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Morpholinoalkyl, wobei die Alkyl-Einheit 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine Einheit substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Methyl, Methoxy und Halogen besteht; und
-C(R_S)(R_T)(X), wobei R_S und R_T unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Phenyl und substituiertem Phenyl besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen ausgewählt ist;
X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyl-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Haloalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkylamido, wobei die Alkylgruppe ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Amino, substituiertem Amino, wobei der Substituent Alkyl oder Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist, Azido, Alkylthio mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen, Hydroxy, Morpholino und Morpholinoalkyl, wobei die Alkyl-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält; und
R₆ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Fluor- oder Chloralkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und mindestens einem Fluor- oder Chloratom besteht.
Bevorzugte Imidazopyridin-4-amin-IRM-Verbindunen sind durch Formel VII unten definiert:
wobei
R₁₇ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, -CH₂R_w, wobei R_w aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus einem geradkettigen, verzweigtkettigen oder zyklischen Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, bei dem die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyl-Einheit ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält, und Phenylethyl und -CH=CR_zR_z, wobei es sich bei jedem R_z unabhängig um ein geradkettiges, verzweigtkettiges oder zyklisches Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen handelt;
R₂₇ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff, einem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, geradkettigem oder verzweigtkettigem Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, bei dem die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyl-Einheit ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine Einheit substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Methyl, Methoxy und Halogen besteht, und Morpholinoalkyl, wobei die Alkyl-Einheit eines bis vier Kohlenstoffatome enthält; und
R₆₇ und R₇₇ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Wasserstoff und einem Alkyl mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen, mit der Maßgabe, dass R₆₇ und R₇₇ zusammen genommen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten, und mit der weiteren Maßgabe, dass, wenn R₇₇ ein Wasserstoff ist, R₆₇ kein Wasserstoff ist und R₂₇ kein Wasserstoff oder Morpholinoalkyl ist, und mit der weiteren Maßgabe, dass, wenn R₆₇ ein Wasserstoff ist, R₇₇ und R₂₇ kein Wasserstoff sind.
Bevorzugte 1,2-überbrückte Imidazochinolin-4-amin-IRM-Verbindungen sind durch Formel VIII unten definiert:
wobei
Z aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht:
-(CH₂)_p, wobei p 1 bis 4 ist;
-(CH₂)_a-C(R_DR_E) (CH₂)_b-, wobei a und b ganze Zahlen sind und a + b 0 bis 3 ist, R_D ein Wasserstoff oder Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist und R_E aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Hydroxy, -OR_F, wobei R_F ein Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist und -NR_GR'_G, wobei R_G und R'_G unabhängig Wasserstoff oder Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen sind; und
-(CH₂)_a-(Y)-(CH₂)_b-, wobei a und b ganze Zahlen sind und a + b 0 bis 3 ist, und Y O, S oder -NR_J ist, wobei R_J Wasserstoff oder Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist;
und wobei q 0 oder 1 ist und R₈ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht.
Bevorzugte Imidazonaphthyridin-4-amin- und Imidazotetrahydronaphthyridin-4-amin-IRM-Verbindungen sind definiert durch Formel IX(a) und IX(b) unten:
wobei
A =N-CR=CR-CR=; =CR-N=CR-CR=; =CR-CR=N-CR=; oder =CR-CR=CR-N= ist;
R₁₉ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
– Wasserstoff
– C_1-20-Alkyl oder C_2-20-Alkenyl, das unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus:
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– O-C_1-20Alkyl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– C_1-20Alkoxycarbonyl;
– S(O)_0-2-C_1-20Alkyl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– N (R₃₉)₂;
– N₃;
Oxo;
– Halogen;
– NO₂;
– OH; und
– SH; und
-C_1-20Alkyl-NR₃₉-Q-X-R₄₉ oder -C_2-20Alkenyl-NR₃₉-Q-X-R₄₉,
wobei Q -CO- oder -SO₂- ist; X eine Bindung, -O- oder -NR₃₉- und R₄₉ Aryl, Heteroaryl, Heterocyclyl oder -C_1-20-Alkyl oder -C_2-20Alkenyl ist, das unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– O-C_1-20Alkyl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– C_1-20Alkoxycarbonyl;
– S(O)_0-2-C_1-20Alkyl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– N(R₃₉)₂;
– NR₃₉-CO-O-C_1-20Alkyl;
– N₃;
Oxo;
– Halogen;
– NO₂;
– OH; und
– SH; oder R₄₉ ist
wobei Y -N- oder -CR- ist;
R₂₉ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
– Wasserstoff;
– C_1-10Alkyl;
– C_2-10Alkenyl;
– Aryl;
– C_1-10Alkyl-O-C_1-10Alkyl;
– C_1-10Alkyl-O-C_2-10Alkenyl; und
– C_1-10Alkyl oder C_2-10Alkenyl, substituiert durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
– OH;
– Halogen;
– N(R₃₉)₂;
– CO-N(R₃₉)₂;
– CO-C_1-10Alkyl;
– N₃;
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– CO-Aryl; und
– CO-Heteroaryl;
jedes R₃₉ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff und C_1-10Alkyl besteht; und
jedes R unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, C_1-10Alkyl, C_1-10Alkoxy, Halogen und Trifluormethyl besteht,
wobei
B -NR-C(R)₂-C(R)₂-C(R)₂-; -C(R)₂-NR-C(R)₂-C(R)₂-; -C(R)₂-C(R)₂-NR-C(R)₂- oder -C(R)₂-C(R)₂-C(R)₂-NR- ist;
R₁₉ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
– Wasserstoff;
– C_1-20Alkyl oder C_2-20Alkenyl, das unsubstituiert ist oder substituiert durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– O-C_1-20Alkyl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– C_1-20Alkoxycarbonyl;
– S(O)_0-2-C_1-20Alkyl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1–Aryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– N(R₃₉)₂;
– N₃;
Oxo;
– Halogen;
– NO₂;
– OH; und
– SH; und
-C_1-20Alkyl-NR₃₉-Q-X-R₄₉ oder -C_2-20Alkenyl-NR₃₉-Q-X-R₄₉, wobei Q -CO- oder -SO₂- ist; X eine Bindung, -O- oder -NR₃₉- und R₄₉ Aryl, Heteroaryl, Heterocyclyl oder -C_1-20-Alkyl oder -C_1-20Alkenyl ist, das unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– O-C_1-20Alkyl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– O-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– C_1-20Alkoxycarbonyl;
– S(O)_0-2-C_1-20Alkyl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Aryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heteroaryl;
– S(O)_0-2-(C_1-20Alkyl)_0-1-Heterocyclyl;
– N(R₃₉)₂;
– NR₃₉-CO-O-C_1-20Alkyl;
– N₃;
Oxo;
– Halogen;
– NO₂;
– OH; und
– SH; oder R₄₉ ist
wobei Y -N- oder -CR- ist;
R₂₉ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
– Wasserstoff;
– C_1-10Alkyl;
– C_2-10Alkenyl;
– Aryl;
– C_1-10Alkyl-O-C_1-10Alkyl;
– C_1-10Alkyl-O-C_2-10Alkenyl; und
– C_1-10Alkyl oder C_2-10Alkenyl, substituiert durch einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
– OH;
– Halogen;
– N(R₃₉)₂;
– CO-N(R₃₉)₂;
– CO-C_1-10Alkyl;
– N₃;
– Aryl;
– Heteroaryl;
– Heterocyclyl;
– CO-Aryl; und
– CO-Heteroaryl;
jedes R₃₉ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff und C_1-10Alkyl besteht; und
jedes R unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, C_1-10Alkyl, C_1-10Alkoxy, Halogen und Trifluormethyl besteht.
Die Substituenten R₁₁-R₁₉ oben werden allgemein als „1-Substituenten" bezeichnet, da sie sich an Position 1 der verschiedenen Ringsysteme befinden. Bevorzugte 1-Substituenten umfassen Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen und Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist der 1-Substituent 2-Methylpropyl oder 2-Hydroxy-2-methylpropyl.
Die Substituenten R₂₁-R₂₉ oben werden allgemein als „2-Substituenten" bezeichnet, da sie sich an Position 2 der verschiedenen Ringsysteme befinden. Bevorzugte 2-Substituenten umfassen Wasserstoff, Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen; Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält und die Alkyleinheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, und Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen. Mehr bevorzugt ist der 2-Substituent Wasserstoff, Methyl, Butyl, Hydroxymethyl, Ethoxymethyl oder Methoxyethyl.
In Fällen, in denen n null, eins oder zwei sein kann, ist n vorzugsweise null oder eins.
Wie hierin verwendet, schließen die Begriffe „Alkyl", „Alkenyl" und die Vorsilbe „Alk" sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige Gruppen und zyklische Gruppen ein, d. h. Cycloalkyl und Cycloalkenyl. Diese zyklischen Gruppen können monozyklisch oder polyzyklisch sein und weisen vorzugsweise 3 bis 10 Ring-Kohlenstoffatome auf. Beispielhafte zyklische Gruppen umfassen Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Adamantyl. Alkyl- und Alkenylgruppen enthalten 1 bis 10 (oder 2 bis 10) Kohlenstoffatome, sofern nicht anders angegeben.
Der Begriff „Aryl", wie hierin verwendet, umfasst carbozyklische aromatische Ringe oder Ringsysteme.
Beispiele von Arylgruppen umfassen Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Fluorenyl und Indenyl. Der Begriff „Heteroaryl" umfasst aromatische Ringe oder Ringsysteme, die mindestens ein Ring-Heteroatom (z. B. O, S, N) enthalten. Geeignete Heteroarylgruppen umfassen Furyl, Thienyl, Pyridyl, Chinolinyl, Tetrazolyl, Imidazolyl und so weiter.
„Heterocyclyl" umfasst nicht-aromatische Ringe oder Ringsysteme, die mindestens ein Ring-Heteroatom (z. B. O, S, N) enthalten. Beispielhafte heterozyklische Gruppen umfassen Pyrrolidinyl, Tetrahydrofuranyl, Morpholinyl, Thiazolidinyl, Imidazolidinyl und dergleichen.
Die Aryl-, Heteroaryl- und Heterocyclylgruppen können unsubstituiert sein oder durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C_1-20Alkyl, Hydroxy, Halogen, N(R₁₀)₂ besteht, wobei jedes R₁₀ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, C_1-10-Alkyl, NO₂, C_1-20Alkoxy, C_1-20Alkylthio, Trihalomethyl, C_1-20Acyl, Arylcarbonyl, Heteroarylcarbonyl, (C_1-10Alkyl)_0-1-Aryl, (C_1-10Alkyl)_0-1-Heteroaryl, Nitril, C_1-20Alkoxycarbonyl, Oxo, Arylalkyl besteht, wobei die Alkylgruppe ein bis 10 Kohlenstoffatome enthält, und Heteroarylalkyl, wobei die Alkylgruppe ein bis 10 Kohlenstoffatome enthält.
Die Erfindung schließt die hierin beschriebenen Verbindungen in jeder ihrer pharmazeutisch zulässigen Formen ein, einschließlich Salze, Isomere wie beispielsweise Diastereomere und Enantiomere, Solvate, Polymorphe und dergleichen.
Von den vorigen IRM-Verbindungen sind solche mit der Imidazochinolinstruktur bevorzugt. Insbesondere sind Imidazochinolin-4-amin-Verbindungen mit Formel I und V bevorzugt. Die Verbindungen 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol und 1-(2-Methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin sind besonders bevorzugt.
Die für die erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten IRM-Verbindungen können anhand von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise beschrieben in US-Patent Nr. 4,689,338 , 5,389,640 , 5,268,376 , 4,929,624 , 5,266,575 , 5,352,784 , 5,494,916 , 5,482,936 , 5,346,905 , 5,395,937 , 5,756,747 , 4,988,815 , 5,175,296 , 5,741,908 5,367,076 , 5,693,811 und 5,525,612 und in US-Patent Nr. 6,194,425 , die alle hierin durch Bezugnahme enthalten sind.
Reifung dendritischer Zellen
Man fand heraus, dass die oben beschriebenen IRM-Verbindungen die Reifung von DC ex vivo induzieren. Im Allgemeinen zeigen reife DC Eigenschaften wie Zytokinsekretion, die Expression bestimmter Zelloberflächenmarker und eine verstärkte Fähigkeit zur Stimulierung von T-Zellen.
Dendritische Zellen, die mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gereift werden können, lassen sich aus beliebigen Quellen erhalten, wobei die Quellen von einem Fachmann leicht bestimmt werden können. Beispielsweise können die unreifen DC erhalten werden, indem die DC aus Geweben wie beispielsweise Blut, Milz, Knochenmark, Haut (z. B. Langerhans-Zellen) und dergleichen isoliert werden oder indem die Differenzierung von Monozyten oder von nicht-embryonalen Stammzellen mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren induziert wird. Ein bevorzugtes Verfahren zum Erhalt von DC umfasst die zytokininduzierte Differenzierung humaner peripherer mononukleärer Blutzellen. Dieses Verfahren ist beispielsweise von Romani et al., J. Immunol. Methods 196: 137 (1996) und Bender et al., J. Immunol. Methods 196: 121 (1996) beschrieben worden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren umfasst die Kultivierung von CD14-positiven peripheren Blutmonozyten mit GM-CSF und IL-4 mithilfe des von Romani, oben, beschriebenen Verfahrens.
Die so erhaltenen DC befinden sich in einem unrei fen Stadium, wobei sie im Allgemeinen eine hohe Kapazität zur Erfassung und Prozessierung von Antigen, aber eine relativ niedrige Kapazität zur Stimulierung von T-Zellen besitzen. Zur Erlangung einer optimalen Kapazität zur Stimulierung von T-Zellen müssen sich die DC in einem stabilen reifen Stadium befinden. Reife DC lassen sich durch eine Reihe von Eigenschaften identifizieren, einschließlich durch ihre Expression des Zelloberflächenmarkers CD83 und durch das Verhalten, das sie in der gemischten Lymphozytenreaktion (Mixed Lymphocyte Reaction, MLR) zeigen. Bei dieser Reaktion bewirken DC eine verstärkte Proliferation naiver allogener T-Zellen und/oder eine erhöhte Produktion von Zytokinen dendritischer Zellen. Die reifen DC induzieren vorzugsweise eine Steigerung der Proliferation naiver allogener T-Zellen um mindestens das Zweifache und/oder zeigen eine Steigerung der Produktion von Zytokinen dendritischer Zellen, insbesondere von IL-12 und TNF-α, um mindestens das Dreifache im Vergleich zu DC, die derselben Herkunft sind, aber nicht mit exogenen Stimuli in Berührung gebracht wurden („unreife DC"). Obgleich auch unreife DC einige der oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, sind diese bei ihnen in viel geringerem Maß vorhanden als bei DC, die durch Aussetzen gegenüber exogenen Stimuli, beispielsweise einer IRM-Verbindung vom Imidazochinolintyp, gereift worden sind. Die reifen DC sollten stabil sein und nicht in ihren unreifen Zustand zurückkehren, da die unreifen DC viel schwächere Stimulatoren der T-Zell-Aktivität sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Reifung von DC durch Stimulierung der DC mit einem IRM vom Imidazochinolintyp in einer Menge und über einen Zeitraum, die bzw. der ausreichend ist, damit die DC reifen. Es versteht sich, dass die DC in einem Gewebekulturmedium unter Bedingungen inkubiert werden, die von einem Fachmann leicht bestimmt werden. Die spezifische Menge des verwendeten IRM und die Dauer des Aussetzens richten sich nach einer Reihe von Faktoren, die einem Fachmann bekannt sind, einschließlich der Herkunft der zu reifenden DC, der Wirksamkeit und anderer Eigenschaften der verwendeten IRM-Verbindung und so weiter. Derzeit ist jedoch bevorzugt, dass das verwendete IRM in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 10 μg/ml, vorzugsweise von etwa 0,5 bis etwa 2,0 μg/ml verwendet wird. Die IRM-Verbindung wird gelöst, bevor sie zu dem DC-haltigen Medium gegeben wird, vorzugsweise in Wasser oder einem physiologischen Puffer. Falls es erforderlich ist, kann die Verbindung aber auch in einer kleinen Menge eines organischen Lösungsmittels wie beispielsweise DMSO gelöst und anschließend verdünnt oder direkt zu dem DC-haltigen Medium gegeben werden.
Die DC werden von der IRM-Verbindung ausreichend lange stimuliert, damit die DC voll ausreifen können. Dies lässt sich feststellen, indem regelmäßig Proben des DC-haltigen Mediums entnommen und auf eine der oben beschriebenen Eigenschaften getestet wird, beispielsweise auf Sekretion von Zytokinen dendritischer Zellen. Im Allgemeinen gelten die DC als voll ausgereift, wenn die gemessene Eigenschaft ihre maximale Größenordnung erreicht hat und sich im Lauf der Zeit nicht länger erhöht. Obgleich die Dauer des Aussetzens je nach Faktoren, die einem Fachmann bekannt sind (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der Herkunft der DC, der Konzentration und Wirksamkeit der IRM und so weiter), variiert, sind im Allgemeinen etwa 16 bis 24 Stunden an Stimulation erforderlich, damit die DC vollständig ausreifen.
Dendritische Zellen, die durch Aussetzen gegenüber einem oder mehreren IRM vom Imidazochinolintyp gereift worden sind, exprimieren CD83 und zeigen eine verstärkte Expression von CD80, CD86 und CD40. Darüber hinaus schütten mit IRM gereifte DC eine Reihe von Zytokinen aus, insbesondere proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IFN-α, IL-6, IL-1, IL-12 p40.
Verwendung von mit IRM gereiften dendritischen Zellen
Dendritische Zellen, die durch Aussetzen gegenüber IRM vom Imidazochinolintyp gereift worden sind, weisen im Vergleich zu unreifen DC eine verstärkte Antigenpräsentationsfähigkeit auf und können auf verschiedene Weise verwendet werden, um die Immunantwort eines Individuums zu verstärken. Beispielsweise können die reifen DC direkt in einen Patienten injiziert werden. In diesem Fall handelt es sich bei den DC vorzugsweise um DC monozytären Ursprungs, wobei die Monozyten vom selben Patienten erhalten wurden.
Die DC können auch bei einer Reihe von Immuntherapien verwendet werden. Beispiele solcher Therapien umfassen Ex-vivo-Zelltransplantationstherapien zum Behandeln von Erkrankungen des Immunsystems, wie beispielsweise AIDS, die Ex-vivo-Expansion von T-Zellen, insbesondere antigenspezifischen T-Zellen, die dann verwendet werden können, um Erkrankungen zu behandeln, die von einer Verschlechterung des Immunsystems gekennzeichnet sind; die Erzeugung monoklonaler Antikörper, die DC-spezifische Marker erkennen; die Herstellung antigenaktivierter DC nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Entwicklung von Impfstoffen und Impfstoffadjuvanzien.
Bevorzugte Verwendung von DC, die durch Aussetzen gegenüber einem oder mehreren IRM vom Imidazochinolintyp gereift worden sind, umfassen solche, die antigenaktivierte DC und/oder DC-modifizierte Antigene verwenden. Die antigenaktivierten DC oder zellulären Adjuvanzien der Erfindung werden im Allgemeinen hergestellt, indem die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereiften DC einem Antigen ausgesetzt werden. Bei dem Antigen kann es sich der Art her um ein Protein, Kohlenhydrat oder eine Nukleinsäure handeln, das beliebiger Herkunft ist, einschließlich neoplastische Zellen (z. B. Tumorzellen) und infektiöse Erreger (z. B. Bakterium, Virus, Hefe, Parasit). Alternativ kann das Antigen durch Rekombinationsmittel gewonnen werden.
Das zelluläre Adjuvans, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, kann bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise können zelluläre Adjuvanzien, die hergestellt werden, indem die reifen DC von Tumoren stammenden Antigenen ausgesetzt werden, einem Patienten verabreicht werden, wodurch eine gegen den Tumor gerichtete Immunantwort in dem Patienten hervorgerufen wird. Auch Infektionskrankheiten können behandelt werden, indem dem Patienten zelluläre Adjuvanzien verabreicht werden, die hergestellt werden, indem die DC von dem Infektionserreger stammenden Antigenen ausgesetzt werden,
Dendritische Zellen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereift wurden, produzieren Zytokine wie beispielsweise IL-12 und IFN-α, welche die Erzeugung von Th1-Immunantworten begünstigen. Die Fähigkeit zur Verschiebung der Immunantwort in Richtung einer Th1-Antwort, im Gegensatz zu einer Th2-Antwort, könnte ein Mittel zum Behandeln von Th2-vermittelten Erkrankungen bereitstellen. Beispiele solcher Erkrankungen umfassen: Asthma, allergische Rhinitis, systemischer Lupus erythematodes, Ekzem, atopische Dermatitis, Omenn-Syndrom (Hypereosinophilie-Syndrom), bestimmte parasitäre Infektionen wie beispielsweise kutane und systemische Leishmaniasen, Toxoplasma-Infektion und Trypanosomen-Infektion, bestimmte Pilzinfektionen wie beispielsweise Candidiasis und Histoplasmose und bestimmte intrazelluläre bakterielle Infektionen wie beispielsweise Lepra und Tuberkulose.
Experimentell
Materialien und Verfahren
Kulturmedium. In dieser gesamten Studie wurde komplettes RPMI (cRPMI)-Medium verwendet. cRPMI besteht aus RPMI 1640 mit 25 mM HEPES (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FKS (Hyclone, Logan, UT, USA), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht-essenziellen Aminosäuren, 1 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin-Sulfat (Life Technologies).
Reagenzien. CD14-positive Zellen aus dem peripheren Blut wurden mithilfe von 800 E/ml rekombinantem humanem GM-CSF und 25 ng/ml rekombinanten humanen IL-4 (R&D Corporation, Minneapolis, MN, USA) zu DC differenziert, wie von Romani und Bender, oben, beschrieben ist. Tetanus-Toxoid (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) wurde in cRPMI gelöst und bei 10 μg/ml verwendet. Die Verbindung R-848 (S-28463), 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol, M.W. = 314,4, wurde hergestellt von 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, USA. Für Zellkulturstudien wurde das HCl-Salz in pyrogenfreiem sterilem Wasser gelöst und als Stammlösung bei 4°C bis zu 4 Monate lang gelagert. Der Endotoxingehalt war unter der Nachweisgrenze [1 pg/ml] im Limulus-Amöbozyten-Assay. Eine Stammlösung von bakteriellen LPS von Escherichia coli 055:B5 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) wurde bei 1 mg/ml in pyrogenfreiem Wasser gelöst und bei 4°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Erzeugung von von Monozyten abstammenden dendritischen Zellen (MO-DC). PBMC wurden nach Erhalt des informierten Einverständnisses mithilfe eines Histopaque HybriMax -1077-Dichtegradienten (Sigma) aus gesunden Freiwilligen isoliert. CD14-positive Zellen wurden durch positive Selektion mithilfe von CD14-positiven Mikrokügelchen in Verbindung mit dem MiniMACS-System (Miltenyi Biotech, Auborn, CA, USA) unter Befolgung der Anleitungen des Herstellers gereinigt. Die durchflusszytometrisch festgestellte Reinheit lag über 90%. Die CD14- positiven Zellen wurden bei 2 - 5 × 10⁶ Zellen je 3 ml cRPMI in Platten mit 6 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA, USA) mit 800 E/ml GM-CSF und 25 ng/ml IL-4 kultiviert, wie von Romani und Bender, oben, beschrieben. Alle drei Tage wurde frisches GM-CSF- und IL-4-haltiges Medium zugegeben. MO-DC wurden routinemäßig zwischen Kulturtag 7 und 8 verwendet. Als Kontrolle wurden depletierte auf die gleiche Weise kultiviert.
In-Vitro-Stimulation von MO-DC. MO-DC wurden mit 0,1 bis 8 μg/ml R-848 (1 μg/ml = 3,2 μM) oder 1 μg/ml LPS für 1-96 Stunden stimuliert. Die Zellen wurden anschließend durchflusszytometrisch auf Expression verschiedener Zelloberflächenmarker analysiert, und die Zellkulturüberstände wurden durch ELISA auf verschiedene Zytokine und Chemokine analysiert.
Zelloberflächendurchflusszytometrie und intrazelluläre Durchflusszytometrie. Die Bestimmung der Expression von Zelloberflächenmarkern erfolgte mittels durchflusszytometrischer Analyse, wobei folgende monoklonale Antikörper verwendet wurden: FITC-konjugierter CD1a, Klon NA1/34 HLK (Accurate Chemical, Westbury, NY, USA); PE-konjugierter CD14, Klon MΦP9, PE-konjugierter CD80, Klon L307.4, PE- und FITC-konjugierter HLA-DR, Klon L243, PE- und FITC-konjugierte γ1/γ2a-Isotypkontrolle, Klon X40 und X39 (alle von Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA); PE-konjugierter CD40, Klon EA-5 (Biosource International, Camarillo, CA, USA); PE-konjugierter CD83, Klon HB15a, PE- und FITCkonjugierte γ1/γ1-Isotypkontrolle, Klon 679.1Mc7 (Immunotech, Marseille, Frankreich), PE-konjugierter CD86, Klon 2331 (Pharmingen, San Diego, CA, USA). Zellen (5 × 10⁵) wurden 15 Minuten bei 4°C mit gereinigten IgD (Becton Dickinson) inkubiert, um unspezifische Bindung zu blockieren, und anschließend wurden die Zellen 30 Minuten bei 4°C in PBS enthaltend 10% FKS und 0,1% Natriumazid mit den Antikörpern gefärbt. Nach Waschen in PBS wurden die Zellen mit einem FACScan-Durchflusszytometer und der Cell Quest-Software (Becton Dickinson) analysiert.
Allogene Lymphozytenaktivierung. T-Zellen wurden mit T-Zell-Reinigungssäulen nach Angaben des Herstellers (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) isoliert. Allogene MO-DC-Stimulatorzellen wurden unterschiedliche lange für 1, 6 oder 24 Stunden mit nur Medium, R-848 oder LPS gepulst und anschließend gewaschen und für 20 Minuten bei 37°C mit 50 μg/ml Mitomycin C (Sigma) behandelt. Dendritische Zellen wurden daraufhin gewaschen, in cRPMI resuspendiert und in verschiedenen Konzentrationen (1 - 32 × 10³ je Vertiefung) zu gereinigten Responder-T-Zellen (1 × 10⁵ je Vertiefung) in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (BD Labware) in einem Gesamtvolumen von 200 μl gegeben. Dreifachkulturen wurden 96 Stunden bei 37°C gehalten, woraufhin die Zellproliferation durch Einbau von [³H]-Thymidin ([³H]-TdR) (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) bestimmt wurde. Jede Vertiefung erhielt 1 μCi [³H]-TdR und wurde 18 Stunden später geerntet. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere CPM (Counts per Minute) ± SEM von Dreifachvertiefungen. Vor dem Pulsen mit [³H]-TdR wurden aus denselben Kulturen Überstände abgenommen und hinsichtlich IFN-γ, IL-5 und IL-2 analysiert.
Autologe T-Zell-Aktivierung. Autologe T-Zellen und R-848-behandelte MO-DC wurden hergestellt, wie für allogene T-Zell-Stimulation beschrieben wurde. MO-DC wurden mit R-848 [2 μg/ml] und Tetanus-Toxoid [10 μg/ml] 24 Stunden lang kultiviert. Die MO-DC wurden gewaschen und 7 Tage lang in abgestuften Dosen mit aus PBMC stammenden CD3-positiven T-Zellen kultiviert. Vor dem Pulsen mit [³H]-TdR wurden aus denselben Kulturen auch Überstände abgenommen und hinsichtlich IFN-γ und IL-5 analysiert.
Zytokinanalyse. Die Zytokinmengen wurden mittels ELISA gemessen. Kits für humanes TNF-α, IL-12 (p40/p70), IFNγ, IL-4 und IL-2 wurden erworben von Genzyme (Cambridge, MA, USA). Kits für humanes IL-6 wurden erhalten von Biosource International (Camarillo, CA, USA). Humanes IL-5, IL-8, MIP-1α, MCP-1 und RANTES wurden erworben von R&D Systems. Jeder ELISA wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die IFN-Mengen wurden in einem Bioassay (40) gemessen: IFN-α und IFN-β-spezifische Antikörper wurden verwendet um zu bestimmen, welches Typ-1-IFN in den MO-DC-Überständen vorhanden war. Die Ergebnisse aller ELISAs sind in pg/ml dargestellt, wobei die IFN-Ergebnisse in E/ml angegeben sind.
Statistische Analyse. Daten wurden mit einem gepaarten Student's t-Test analysiert, und die Ergebnisse galten als statistisch signifikant, wenn p ≤ 0,05 war.
Zur Bestimmung der Reifungswirkung von R-848 auf DC wurden MO-DC 24 Stunden lang mit R-848 [0,1-8 μg/ml] oder LPS [1 μg/ml] behandelt, und auf der Zelloberfläche der DC-Population (gegated) wurde durchflusszytometrisch die Expression von CD83 und CD86 bestimmt, wie durch die Merkmale der Vorwärts-/Seitwärtsstreuung definiert war (1A). Die Ergebnisse in 1B zeigen, dass R-848 die Expression von CD83 und CD86 auf MO-DC im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen (Vehikel) verstärkt. Es gab keine Erhöhung der Zelloberflächenexpression von CD83 oder CD86 mit 0,1 μg/ml R-848. Bei 0,4, 2 und 8 μg/ml R-848 ist eine erhöhte CD86-Expression zu sehen. Bei 2 und 8 μg/ml R-848 ist eine erhöhte Zelloberflächenexpression von CD83 zu sehen. Mit LPS, von dem gezeigt wurde, dass es die Expression dieser Moleküle auf DC erhöht, erhöht sich die Zelloberflächenexpression sowohl von CD83 als auch von CD86. 1C zeigt die quantitative Zelloberflächenexpression von CD83 und CD86 in Form der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von mit R-848 behandelten MO-DC. R-848 induziert eine dosisabhängige Erhöhung der Expression von CD83 und von CD86, wobei sich die CD86-Expression zwischen 0,1-0,4 μg/ml R-848 erhöht. Die CD83-Expression ist zwischen 0,4-2 μg/ml R-848 signifikant erhöht. Mit 2 μg/ml wird eine maximale Erhöhung der Expression von CD83 und CD86 erzeugt, was einem durchschnittlichen Anstieg um das etwa 3- bis 4-Fache sowohl für CD83 als auch für CD86 entspricht. Im Vergleich war die mit R-848 induzierte maximale Zelloberflächenexpression von CD83 und CD86 äquivalent zu der von LPS induzierten. Sowohl die relative Zellzahl als auch die MFI-Daten korrelieren, was auf eine erhöhte Anzahl von Zellen hinweist, die diese Antigene als Antwort auf R-848 exprimieren.
Zusätzlich zu CD83 und CD86 wurden weitere Zelloberflächenmoleküle durchflusszytometrisch analysiert, die eine DC-Reifung anzeigen. MO-DC wurden für 24 Stunden mit 2 μg/ml R-848 kultiviert, was, wie in 1 gezeigt, eine maximale Expression von CD83 und CD86 ergab. Die Zellen wurden auf Zelloberflächenexpression von CD1a, CD80, CD83, CD86, CD40 und HLA-DR gefärbt. 2A zeigt, dass R-848 zusätzlich zu CD83 und CD86 und im Vergleich zu Vehikelkontrollen auch die Expression von CD80 und CD40 erhöht. 2B und 2C zeigen die quantitativen Unterschiede der Molekülexpression auf der Zelloberfläche. In Übereinstimmung mit der Erhöhung der Expression von CD83 und CD86 induziert die Behandlung mit R-848 im Vergleich zu mit Vehikel behandelten MO-DC auch eine Erhöhung der Expression von CD80 und CD40 um das Zweifache. Obwohl R-848 eine Erhöhung der Zelloberflächenexpression von HLA-DR induziert (2A und 2C), ist der Anstieg statistisch nicht signifikant. In ähnlicher Weise ist auch die durch R-848 induzierte Verminderung der Expression von CD1a statistisch nicht signifikant. Diese Trends der Expression von HLA-DR und CD1a nach Stimulation mit R-848 wurde in allen Experimenten beobachtet, und in einigen Experimenten waren die Unterschiede zwischen Zellen, die mit R-848 oder Vehikel behandelt worden waren, statistisch signifikant. In einer Konzentration von 1 μg/ml eingesetztes LPS erhöhte die Zelloberflächenexpression von CD40, CD80, CD86 und CD83 auf ein ähnliches Maß, wie es von R-848 induziert wurde (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse in 1 und 2 zeigen, dass R-848 eine Reifung von MO-DC induziert, wie durch erhöhte Expression von CD83, CD80, CD86 und CD40 definiert ist. Diese DC-Reifungsmarker wurden auch nach 48-, 72- und 96-ständiger Stimulation mit R-848 untersucht, und nach 24 Stunden in Kultur mit 2 μg/ml R-848 wurde eine maximale Expression von DC-Reifungsmarker erhalten.
R-848 induziert die Sekretion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine aus von Monozyten abstammenden dendritischen Zellen
DC-Reifung führt zur Produktion verschiedener Zytokine und Chemokine. Darüber hinaus können zahlreiche von reifen DC produzierten Zytokine wie beispielsweise TNF-α und IL-12 die Reifung von DC induzieren oder verstärken. Wir haben daher geprüft, ob R-848 die für die DC-Reifung charakteristische Sekretion von Zytokinen und Chemokinen von MO-DC induziert. MO-DC wurden 24 Stunden lang bei verschiedenen Konzentrationen von R-848 wie in 1 und 2 kultiviert. Die Überstände wurden durch ELISA oder Bioassay auf sezernierte Zytokine und Chemokine analysiert. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass MO-DC, die mit R-848 behandelt werden, im Vergleich zu der Vehikelkontrolle signifikant mehr TNF-α, IL-6, IL-12, IL-8, MIP-Iα und IFN-α produzieren. Obgleich mit 2 μg/ml R-848 statistisch signifikante Mengen aller getesteten Zytokine erhalten werden, scheinen IL-6, IL-8 und IL-12 mit zwischen 0,1-0,4 μg/ml R-848 induziert zu werden, aber die Mengen unterscheiden sich statistisch nicht von denen, die von Vehikel-behandelten MO-DC produziert werden. MCP-1-Mengen waren mit 0,1-8 μg/ml R-848 erhöht, aber nicht signifikant verschieden von den von den Kontrollzellen produzierten Mengen. Neutralisierung von IFN-α hemmte mehr als 95% der Bioaktivität, was anzeigt, dass es sich bei dem durch R-848 induzierten IFN um IFN-α handelte. Ähnlich wie R-848 verstärkte LPS TNF-α, IL-6, IL-12, MIP-1α und IFN-α im Vergleich zu der Vehikelkontrollgruppe signifikant. Die durch LPS induzierten Höchstmengen der Zytokine und Chemokine sind mit den durch R-848 induzierten Höchstmengen vergleichbar.
Die Länge des Zeitraums, den MO-DC in Berührung mit R-848 sein müssen, damit eine Reifung stattfindet, wurde bestimmt, indem die Zellen unterschiedlich lange mit R-848 gepulst wurden. Kulturüberstände wurde nach unterschiedlich langer Behandlung mit R-848 oder LPS auf Zytokinsekretion analysiert. Als Marker der DC-Reifung wurde auf der Basis der Ergebnisse in Tabelle 1 und aus vorherigen Studien die TNF-α- und IL-12-Sekretion verwendet. Zunächst wurden MO-DC mit 2 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS für 1, 6 oder 24 Stunden kultiviert, und anschließend wurden die Überstände unmittelbar nach der Kultur auf Zytokinsekretion analysiert (Tabelle II, Gruppe I, II und V). Die Ergebnisse in Tabelle II zeigen, dass MO-DC nach einstündiger Stimulation mit R-848 minimale Mengen von TNF-α und IL-12 produzieren. Nach sechsstündiger Stimulation mit R-848 wurde in den Überständen eine signifikante Erhöhung von TNF-α- und IL-12-Protein festgestellt. Vierundzwanzigstündige Behandlung mit R-848 induzierte ebenfalls eine signifikante Steigerung der Sekretion von TNF-α und IL-12. Die LPS-Gruppen produzierten TNF-α und IL-12 mit derselben Kinetik wie die mit R-848 behandelten Gruppen, außer dass LPS etwa zweimal mehr TNF-α induzierte als R-848. LPS-behandelte MO-DC produzierten etwa fünfmal mehr IL-12 als mit R-848 behandelte MO-DC.
Die Ergebnisse in Tabelle II zeigen, dass MO-DC eine mehr als einstündige Stimulation mit R-848 oder LPS benötigen, um signifikante Mengen von TNF-α und IL-12 auszuschütten. Maximale Sekretion von TNF-α wird nach zwischen ein- und sechsstündiger Stimulation erreicht, und die maximale Sekretion von IL-12 erfordert eine zwischen sechs- und vierundzwanzigstündige Stimulation mit R-848 oder LPS.
Außer der Produktion von TNF-α und IL-12 wurden nach unterschiedlich langer Behandlung mit R-848 auch Zelloberflächenmarker der DC-Reifung durchflusszytometrisch untersucht, um den Zeitraum zu bestimmen, den MO-DC mit R-848 kultiviert werden müssen, um eine optimale Reifungsmarkerexpression zu erreichen. MO-DC, die eine Stunde lang mit 2 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS gepulst und anschließend im Hinblick auf DC-Reifungsmarker gefärbt wurden, zeigten keine erhöhte Expression von CD83, CD80, CD86, CD40 oder HLA-DR. MO-DC, die sechs Stunden lang mit R-848 gepulst und sofort im Hinblick auf Reifungsmarker gefärbt wurden, zeigten eine signifikante Erhöhung der Expression von CD83, aber nicht von CD80, CD86, CD40 oder HLA-DR (3A und 3B). Obgleich die Expression von CD40, CD86 und HLA-DR in der mit R-848 behandelten Gruppe nach sechsstündiger Kultur erhöht war, sind die Unterschiede im Vergleich zur Mediumkontrolle statistisch nicht signifikant. Ähnlich wie mit R-848 behandelte MO-DC zeigten mit LPS behandelte MO-DC erhöhte Expression von CD83, aber keine Veränderung der Expression von CD40, CD80, CD86 und HLA-DR.
MO-DC wurde 1 bis 6 Stunden lang mit 2 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS gepulst, vom Stimulus frei gewaschen und anschließend vor der Bestimmung von DC-Reifungsmarkern auf der Zelloberfläche für weitere 23 Stunden (1-stündiger Puls) oder 18 Stunden (6-ständiger Puls) kultiviert. Die 1 Stunde lang mit 2 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS gepulsten MO-DC zeigten nach 24-ständiger Kultur keine erhöhte Expression von CD83, CD80, CD86, CD40 oder HLA-DR. Für 6 Stunden mit R-848 gepulste MO-DC zeigten nach 24-ständiger Kultur eine signifikante Erhöhung der Expression von CD83 und CD40, aber nicht von CD80, CD86 oder HLA-DR (3C und 3D). Die Expression der Marker CD86 und HLA-DR ist im Vergleich zur Mediumkontrollgruppe erhöht, wobei der Unterschied jedoch statistisch nicht signifikant ist. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit ähnlich kultivierten LPS-stimulierten MO-DC erhalten.
Proliferation allogener T-Zellen und Sekretion von T-Zell-Zytokinen werden durch mit R-848 behandelte, von Monozyten abstammende dendritische Zellen erhöht
R-848-stimulierte MO-DC wurden in einer primären MLR getestet um zu bestimmen, ob die funktionellen Eigenschaften von DC durch Imidazochinolinbehandlung verändert werden. MO-DC wurden mit 0,1-8 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS behandelt. Nach 24 Stunden wurden die MO-DC vom Stimulationsmittel frei gewaschen und 96 Stunden lang mit allogenen CD3-angereicherten T-Zellen aus dem peripheren Blut kultiviert, wobei die Zellproliferation durch Einbau von [³H]Thymidin bestimmt wurde. Die Ergebnisse in 4A zeigen, dass die mit R-848 behandelten MO-DC wirksamere Stimulatoren der Proliferation allogener T-Zellen waren als mit Vehikel behandelte Zellen, und mit R-848 behandelte Zellen waren so wirksam wie LPS-stimulierte Zellen. Im Vergleich zu mit Vehikel behandelten MO-DC wird ein signifikanter Unterschied der T-Zell-Proliferation beobachtet, wenn MO-DC mit 2 oder 8 μg/ml R-848 behandelt werden.
MLR-Überstände wurden nach 96-ständiger Kultur auf T-Zell-Zytokine analysiert. Im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe erhöhten die mit R-848 behandelten MO-DC die Sekretion von IL-2, IL-5 und IFN-γ aus allogenen T-Zellen (4B-4D). Übereinstimmend mit den MRL-Proliferationsergebnissen in 4A wurde durch Kulturen, die MO-DC enthielten, welche mit 2 und 8 μg/ml R-848 behandelt worden sind, im Vergleich zu unbehandelten MO-DC-Kulturen eine signifikante Erhöhung der Produktion von IL-2, IL-5 und IFN-γ um das 2- bis 3-Fache induziert. Die durch mit R-848 stimulierte MO-DC induzierten T-Zell-Zytokine waren äquivalent zu der Menge an Zytokinen, die durch mit LPS stimulierte MO-DC induziert wird. Die Produktion von IL-2, IL-5 und IFN-γ erfordert MO-DC, die mit T-Zellen kultiviert worden sind, da Kulturen, die nur MO-DC oder nur T-Zellen enthalten, keine feststellbaren Mengen an IL-2, IL-5 und IFN-γ produzierten. Darüber hinaus produzieren T-Zellen, die in Gegenwart von R-848 ohne hinzugefügte MO-DC kultiviert werden, kein IL-2, IL-5 oder IFN-γ. Diese Daten zeigen, dass R-848 die DC-Funktion äquivalent zu der durch LPS induzierten verstärkt. Obgleich durch MO-DC, die 24 Stunden lang mit R-848 gepulst worden sind, maximale Proliferation induziert wurde, verstärkten auch MO-DC, die 6 Stunden lang mit R-848 behandelt worden sind, die Proliferation allogener T-Zellen im Vergleich zu unbehandelten MO-DC signifikant. Wenn MO-DC für weniger als 6 Stunden mit R-848 behandelt wurden, war die Proliferation allogener T-Zellen im Vergleich zu den unbehandelten MO-DC-Kontrollen nicht signifikant erhöht.
Proliferation autologer T-Zellen und Sekretion von T-Zell-Zytokinen werden durch mit R-848 behandelte, von Monozyten abstammende dendritische Zellen erhöht
Der Effekt von R-848 auf die MO-DC-Funktion wurde auch in einer autologen (syngenen) anamnestischen Reaktion auf Tetanus-Toxoid getestet. MO-DC wurden 24 Stunden lang mit 2 μg/ml R-848 und 10 μg/ml Tetanus-Toxoid behandelt. Die MO-DC wurden von der Verbindung und dem Antigen frei gewaschen und anschließend 7 Tage lang mit syngenen CD3-angereicherten T-Zellen aus dem peripheren Blut kultiviert, woraufhin die Proliferation durch Einbau von [³H]Thymidin bestimmt wurde. Die Ergebnisse in 5A und 5B zeigen, dass mit Tetanus-Toxoid behandelte MO-DC und unbehandelte MO-DC dasselbe Maß an Proliferation syngener T-Zellen induzierten. Im Vergleich zu den MO-DC, die nicht mit R-848 behandelt wurden, erhöhten die mit R-848 behandelten MO-DC die T-Zell-Proliferation um das 2- bis 3-Fache. Auch die Zytokinsekretion aus dem autologen MO-DC-/T-Zell-System wurde analysiert. IFN-γ-Sekretion wurde nur in den Überständen festgestellt, die MO-DC enthielten, welche mit R-848 und mit Tetanus-Toxoid behandelt worden waren (5C und 5D). MO-DC, die mit R-848 und mit Tetanus-Toxoid behandelt worden waren, produzierten um das 4- bis 11-Fache mehr IFN-γ als MO-DC, die nur mit dem Tetanus-Toxoid-Antigen kultiviert worden waren. IL-5 wurde in keinem dieser IFN-γ enthaltenden Überstände festgestellt. Die Daten in 5 zeigen, dass die IFN-γ-Sekretion, aber nicht die Proliferation, von T- Gedächtniszellen durch mit R-848 behandelte MO-DC verstärkt wird.
1. Die die Immunantwort modifizierende Verbindung R-848 erhöht die Zelloberflächenexpression von CD83 und CD86 auf von Monozyten abstammenden dendritischen Zellen (MO-DC). MO-DC wurden in vitro aus CD14-positiven PBMC erzeugt, wie in "Materialien und Verfahren" beschrieben ist. MO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang mit 0,1-8 μg/ml R-848 [0,32-26 μM] oder mit 1 μg/ml LPS stimuliert. A, Die Zellen wurden anschließend auf CD83- und CD86-Zelloberflächenexpression gefärbt, und die MO-DC-gegatete Population wurde durchflusszytometrisch analysiert. B, Die Ergebnisse sind als die relative Zellzahl ausgedrückt, welche innerhalb der gegateten Population positiv gefärbt sind. Die durchgezogenen Linien zeigen eine Behandlung mit R-848 oder LPS, und die gepunkteten Linien zeigen Mediumkontrollen (Vehikelkontrollen). Die Ergebnisse in A und B zeigen sechs unabhängige Experimente mit sechs verschiedenen Spendern. C, Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ± SEM aus sechs verschiedenen Experimenten mit sechs verschiedenen Spendern. *p ≤ 0,05.
2. R-848 erhöht die Zelloberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle auf MO-DC. MO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang mit 2 μg/ml R-848 stimuliert. Anschließend wurden die Zellen auf Zelloberflächenexpression von CD80, CD86, CD40, HLA-DR, CD83 und CD1a gefärbt. A, Die Ergebnisse sind als die relative Zellzahl ausgedrückt, welche innerhalb der gegateten MO-DC-Population positiv gefärbt sind und sind dargestellt als drei unabhängige Experimente mit drei verschiedenen Spendern. Die durchgezogenen Linien zeigen eine Behandlung mit R-848 und die gepunkteten Linien zeigen Mediumkontrollen (Vehikelkontrollen). B, C, Die Ergebnisse sind ausgedrückt als MFI ± SEM aus mindes tens drei verschiedenen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern. *p ≤ 0,05.
3. Die Reifung von Monozyten abstammender dendritischer Zellen erfordert eine Stimulation mit R-848 für 1 bis 6 Stunden. MO-DC (2 × 10⁵) wurden 6 Stunden lang mit 2 μg/ml R-848 stimuliert. A, B, Anschließend wurden die Zellen auf Zelloberflächenexpression von CD80, CD86, CD40, HLA-DR, CD83 und CD1a gefärbt. C, D, Die Zellen wurden ausführlich gewaschen, weitere 18 Stunden kultiviert und anschließend auf Zelloberflächenexpression von CD80, CD86, CD40, HLA-DR, CD83 und CD1a gefärbt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als MFI ± SEM aus drei verschiedenen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern. *p ≤ 0,05.
4. T-Zell-Proliferation und T-Zell-Zytokinproduktion werden durch R-848-behandelte MO-DC in einer primären MLR erhöht. MO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang mit 0,1-8 μg/ml R-848 oder 1 μg/ml LPS stimuliert. Die Zellen wurden ausführlich gewaschen und in abgestuften Dosen mit 1 × 10⁵ CD3-angereicherten allogenen T-Zellen in Dreifachausführungen kultiviert. A, Die Proliferation wurde nach 96 Stunden durch Einbau von [³H]Thymidin bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als CPM ± SEM von drei unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern. Statistisch signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) wurden zwischen den mit R-848 [2 und 8 μg/ml] und LPS behandelten Gruppen im Vergleich zur mit Vehikel [0 μg/ml] behandelten Gruppe mit 4 - 32 × 10³ MO-DC bestimmt. B-D, In den Kulturüberständen wurden IL-2-, IL-5- und IFN-γ-Protein wie in „Materialien und Verfahren" beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere pg/ml ± SEM von drei unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern. Statistisch signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) wurden zwischen den mit R-848 [2 und 8 μg/ml] und LPS behandelten Gruppen im Vergleich zur mit Vehikel [0 μg/ml] behandelten Gruppe mit 8 - 32 × 10³ MO-DC bestimmt.

5. Die Proliferation autologer T-Zellen und die Zytokinsekretion von T-Zellen werden durch mit R-848 behandelte MO-DC in einer anamnestischen Antwort auf Tetanus-Toxoid erhöht. MO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang mit 2 μg/ml R-848 oder 10 μg/ml Tetanus-Toxoid stimuliert. Die Zellen wurden ausführlich gewaschen und in abgestuften Dosen sieben Tage lang mit 1 × 10⁵ CD3-angereicherten syngenen T-Zellen in Dreifachausführungen kultiviert. A, B, Die Proliferation wurde nach sieben Tagen durch Einbau von [³H]Thymidin bestimmt. C, D, In den Kulturüberständen wurde IFN-γ-Protein wie in „Materialien und Verfahren" beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere pg/ml ± SEM von drei unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern. Die über einigen Datenpunkten angegebenen Werte entsprechen p-Werten ≤ 0,05. Tabelle I. R-848 stimuliert MO-DC-Zytokin- und Chemokinsekretion^a

Behandlung [μg/ml]	IFN-α	TNF-α	IL-6	IL-8	IL-12	MCP-1	MIP-1α
0 (Vehikel)	3 ± 2	5 ± 2	3 ± 2	305 ± 77	27 ± 11	1742 ± 646	46 ± 46
0,1 R-848	8 ± 3	6 ± 3	20 ± 12	425 ± 132	70 ± 21	3603 ± 2158	57 ± 57
0,4 R-848	8 ± 3	14 +4	399 ± 208	5125 ± 2430	106 ± 27	4864 ± 2213	511 ± 314
2,0 R-848	27 ± 7*	1540 ± 371	6729 ± 1888*	50092 ± 10385*	15984 ± 3860*	12941 ± 5802	15412 ± 5244*
8,0 R-848	41 ± 12*	2208 ± 240*	9690 ± 1269*	66988 ± 11863*	19640 ± 3966*	16249 ± 7661	25956 ± 5782*
1,0 LPS	59 ± 12*	2246 ± 438*	10134 ± 1687*	64668 ± 12407*	15593 ± 2755*	11006 ± 4485	36243 ± 8676*

^aMO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ in cRPMI kultiviert, das abgestufte Dosen von R-848 oder LPS enthielt.

Kulturüberstände wurden gesammelt und bis zur Analyse durch ELISA oder durch Bioassay bei -70°C gelagert. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM aus fünf unabhängigen Experimenten mit fünf verschiedenen Spendern angegeben. Alle Werte sind in pg/ml angegeben, außer IFN-α, welches in E/ml angegeben ist.

*p ≤ 0,05 im Vergleich mit den Zytokinmengen in der Vehikelkontrolle.

^a

Behandlungsdauer (Std.)^b	Behandlung^c	TNF-α	IL-12
1	Vehikel	1 ± 1	73 + 37
	R-848	32 ± 10*	65 + 18
	LPS	51 + 8*	44 + 19

6	Vehikel	3 + 3	92 + 99
	R-848	1053 + 707*	4446 + 2438*
	LPS	2679 + 557*	6160 + 1109*

24	Vehikel	3 + 4	107 + 32
	R-848	335 + 201*	13153 + 5484*
	LPS	1675 + 665*	21167 + 1050*

^aMO-DC (2 × 10⁵) wurden 24 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ in cRPMI kultiviert, das abgestufte Dosen von R-848 oder LPS enthielt. Kulturüberstände wurden gesammelt und bis zur Analyse durch ELISA bei -70°C gelagert. Die Daten sind als mittlere pg/ml ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Spendern angegeben.
^bBehandlungsdauer (Std.) ist die Länge der Zeit, die die MO-DC mit R-848 oder LPs kultiviert wurden.
^cMO-DC wurden für den angegebenen Zeitraum mit 2 μg/ml R-848, 1 μg/ml LPS oder Vehikel (PBS) behandelt.
*p ≤ 0,05 im Vergleich mit den Zytokinmengen in der Vehikelkontrolle.

Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf mehrere Ausführungsformen davon beschrieben. Die obige ausführliche Beschreibung und die obigen Beispiele sind nur zur Klärung des Verständnisses bereitgestellt worden, und es versteht sich, dass sich daraus keine unnötigen Einschränkungen ergeben. Einem Fachmann ist klar, dass die beschriebenen Ausführungsformen auf vielerlei Weise verändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Der Umfang der Erfindung ist daher nicht auf die genauen Details der hierin beschriebenen Verfahren, Zusammensetzungen und Strukturen beschränkt, sondern eher durch die Formulierung der folgenden Ansprüche.

Claims

Verfahren der in-vitro-Reifung unreifer dendritischer Zellen, umfassend das Stimulieren der unreifen dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den unreifen dendritischen Zellen um von Monozyten stammende dendritische Zellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die unreifen dendritischen Zellen durch Inkubieren humaner mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut mit GM-CSF und IL-4 erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die die Immunantwort modifizierende Verbindung vom Imidazochinolintyp ein 1H-Imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die die Immunantwort modifizierende Verbindung vom Imidazochinolintyp eine Verbindung mit folgender Formel ist:
wobei R₁₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen, Hydroxalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl, wobei es sich bei der Acyloxy-Einheit um Alkanoyloxy mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen oder Benzoyloxy handelt und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl besteht, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten; R₂₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis acht Kohlenstoffatomen, Benzyl, (Phenyl)ethyl und Phenyl besteht, wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten, und jedes R₁ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₁-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Solvat davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp um 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die resultierenden reifen dendritischen Zellen in der Lage sind, mindestens einen zweifachen Anstieg der Proliferation naiver allogener T-Zellen auszulösen, und/oder mindestens eine dreifache Steigerung der Produktion von Zytokinen aus dendritischen Zellen aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die unreifen dendritischen Zellen etwa 16 bis etwa 24 Stunden stimuliert werden.
In-vitro-Verfahren der Verstärkung der antigenpräsentierenden Fähigkeit von dendritischen Zellen, umfassend das Stimulieren der dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem enthält.
Verfahren zur Herstellung eines zellulären Adjuvans für die Behandlung einer Krankheit, umfassend: (a) Reifen dendritischer Zellen in vitro durch Behandeln der dendritischen Zellen mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2-überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem enthält, und (b) Aussetzen der reifen dendritischen Zellen einem Antigen, das mit der Krankheit verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Krankheit um eine Neoplasie handelt und das Antigen aus neoplastischen Zellen stammt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Krankheit von einem infektiösen Erreger verursacht wird und das Antigen von dem infektiösen Erreger stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Antigen rekombinant abgeleitet wurde.
Verwendung dendritischer Zellen, die durch Stimulation mit einer die Immunantwort modifizierenden Verbindung vom Imidazochinolintyp gereift wurden, wobei die Verbindung ein Imidazochinolin-, Imidazopyridin-, 6,7-fusioniertes Cycloalkylimidazopyridin-, 1,2- überbrücktes Imidazochinolin-, Imidazonaphthyridin- oder Imidazotetrahydronaphthyridin-Ringsystem umfasst, für die Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Krankheit, wobei einem Säugetier, das eine solche Behandlung benötigt, eine therapeutisch wirksame Dosis von dendritischen Zellen verabreicht wird, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus einem Tumor, Infektionen, Asthma, allergischer Rhinitis, systemischem Lupus erythematodes, Ekzem, atopischer Dermatitis, Omenn-Syndrom (Hypereosinophilie-Syndrom), parasitären Infektionen, ausgewählt aus kutanen und systemischen Leishmaniasen, einer Toxoplasma-Infektion und Trypanosomen-Infektion, Pilzinfektionen, ausgewählt aus Candidiasis und Histoplasmose und intrazellulären bakteriellen Infektionen, ausgewählt aus Lepra und Tuberkulose.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Krankheit um eine Neoplasie handelt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Krankheit um eine Th2-vermittelte Krankheit handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die die Immunantwort modifizierende Verbindung vom Imidazochinolintyp eine Verbindung mit folgender Formel ist:
wobei R₁₅ aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Wasserstoff; geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen und substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis zehn Kohlenstoffatomen besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, besteht; geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen und substituiertem geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkenyl mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen und Cycloalkyl mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen, substituiert durch ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, besteht; Hydroxyalkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen; Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatomen enthält und die Alkyl-Einheit ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält; Acyloxyalkyl, wobei es sich bei der Acyloxy-Einheit um Alkanoyloxy mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen oder Benzoyloxy handelt und die Alkyleinheit eines bis sechs Kohlenstoffatome enthält; Benzyl; (Phenyl)ethyl; und Phenyl; wobei der Benzyl-, (Phenyl)ethyl- oder Phenylsubstituent am Benzolring gegebenenfalls durch eine oder zwei Einheiten substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, welche aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen besteht, unter der Maßgabe, dass, wenn der Benzolring durch zwei der Einheiten substituiert ist, die Einheiten zusammen nicht mehr als sechs Kohlenstoffatome enthalten;
ist, wobei R_S und R_T unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Phenyl und substituiertem Phenyl besteht, wobei der Substituent aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen und Halogen ausgewählt ist; X aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkoxyalkyl, wobei die Alkoxy-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome und die Alkyl-Einheit ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Haloalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Alkylamido, wobei die Alkylgruppe ein bis vier Kohlenstoffatome enthält, Amino, substituiertem Amino, wobei der Substituent Alkyl oder Hydroxyalkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen ist, Azido, Chloro, Hydroxy, 1-Morpholino, 1-Pyrrolidino, Alkylthio mit einem bis vier Kohlenstoffatomen; und R₅ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkoxy mit einem bis vier Kohlenstoffatomen, Halogen und geradkettigem oder verzweigtkettigem Alkyl mit einem bis vier Kohlenstoffatomen besteht, und n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist, unter der Maßgabe, dass, wenn n 2 ist, die R₅-Gruppen zusammen nicht mehr als sechs Koh lenstoffatome enthalten, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Solvat davon.