JP2002536013A - 免疫応答改良化合物による樹状細胞の成熟化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で未成熟な樹状細胞を刺激することによって、樹状細胞の成熟化を誘導する方法。本発明の方法で成熟化された樹状細胞は、抗原提示能力が増加し、免疫治療薬として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、インビトロにおける樹状細胞の成熟化を誘導するための合成免疫応
答改良剤の用途に関する。本発明は、さらに、合成免疫応答改良剤を使用して、
樹状細胞を成熟化する方法と、樹状細胞の抗原提示能力を増強する方法と、Ｔ−
細胞刺激を増強する方法とに関する。本発明は、さらに、本発明の方法により成
熟化した樹状細胞を用いて作製した細胞アジュバントに関する。

【０００２】 背景技術 樹状細胞は、強力な抗原提示能力およびＴ−細胞媒介性免疫応答を開始する能
力について免疫系において重要な役割を果たすことが知られている。実際、樹状
細胞（「ＤＣ」）は、任意の他の周知の抗原提示細胞よりさらに効率的にＴ−細
胞を活性し、インビトロおよびインビボにおいて未処理のＴ−細胞の初期活性化
に必要とされる場合がある。これらの細胞は、皮膚、肺、腸、血液およびリンパ
系組織などの、外来抗原に通常暴露されている生体の位置一般に存在する。一般
に、ＤＣは未成熟型または成熟型と広義に分類される。未成熟なＤＣは効率的に
抗原を飲食し、処理するが、低いレベルの同時刺激分子しか発現しない。一方、
成熟したＤＣは高いレベルの同時刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６並
びにＨＬＡ−ＤＲを示す。また、成熟したＤＣはＣＤ８３を発現し、Ｔ−細胞の
活性を援助する高い量の種々のサイトカインおよびケモカインを分泌する。

【０００３】 未処理のＴ−細胞活性化に加えて、ＤＣは、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答のバラン
スに影響を与えることがある。いくつかの報告は、ＤＣは主にＴｈ１応答を活性
化し、主要な律速因子は活性化されたＤＣからのＩＬ−１２分泌であることを示
している。マカトニア（ＤＣ．Ｍａｃａｔｏｎｉａ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５４：５０７１（１９９５）。ヒルケンズ（Ｈｉｌｋｅｎｓ）ら、Ｂｌｏｏｄ
９０：１９２０（１９９７）。他の報告は、ＤＣはＴｈ１またはＴｈ２クロー
ンの形成を誘導することができることを示している。ロス（Ｒｏｔｈ）ら、Ｓｃ
ａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：６４６（１９９６）。証拠は、Ｔｈ１また
はＴｈ２応答を開始するＤＣの能力に、Ｔ−細胞に対するＤＣ比、ＤＣ起源組織
、ＤＣを処理するために使用される抗原の量、同時刺激分子の発現および抗原注
射経路を含む、多数の因子が影響することを示している。

【０００４】 抗原提示およびＴ−細胞活性化においてＤＣによって果たされる主要な役割に
より、免疫療法におけるＤＣの用途に多大な関心がもたれている。これは、ワク
チン学および癌免疫療法の分野において特に明らかである。組換えＤＮＡを使用
した失敗のないワクチンの開発に多大な努力がささげられてきたが、ＤＮＡワク
チンの失敗のない臨床使用は達成されていない。最近の証拠は、ＤＮＡワクチン
による効果的な免疫化にはＤＣ由来の組換え蛋白質発現が必要であることを示し
ている。さらに、動物モデルにおける免疫の増強は、サイトカインをコードする
ＤＮＡワクチンまたはＤＣ成熟化をアップレギュレーションするＣｐＧオリゴヌ
クレオチド配列を含有するＤＮＡワクチンを使用して達成された。最近、癌患者
から入手された同種ＤＣが癌免疫療法に使用されている。例えば、ＷＯ９８／２
３７２８を参照。従って、ＤＣを形成するための効率的なエクスビボ方法が失敗
のない免疫療法にまず必要である。

【０００５】 一般に、半ビボＤＣ形成の方法は、ＤＣ前駆細胞を入手するステップと、患者
に導入する前に細胞をインビトロでＤＣに分化させるステップとからなる。しか
し、ＤＣは最終分化されなければならいか、またはそれらは単球／マクロファー
ジに分化抑制（ｄｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）し、免疫賦活能力のほとん
どを喪失する。半ビボにおけるＤＣ成熟化は単球で条件下した培地、ＴＮＦ−α
、ＩＬ−１およびＩＬ−６などの組換えサイトカイン、ＬＰＳなどの細菌産物、
細菌ＤＮＡおよび架橋ＣＤ４０並びにサイトカインまたは同時刺激分子をコード
する遺伝子によるトランスフェクションでうまく達成された。これらの方法は成
熟化したＤＣを作製することができるが、ＤＣを成熟化するために組換え分子お
よび細胞上清を使用することには欠点がある。これらにはこれらの試薬のロット
間で品質および収率が一定しないこと並びに毒性または自己免疫性となる可能性
のある外来蛋白質の患者への導入が含まれる。このような試薬は産生に費用がか
かり、免疫療法の価格を法外に高価にする場合もある。現在知られている方法の
欠点を生ずることなく、インビトロにおいてＤＣを成熟化する、信頼性があり、
効率的な方法の必要性がある。

【０００６】 発明の開示 本発明者らは、ある種の免疫応答改良剤（ＩＲＭ）化合物がインビトロにおい
てＤＣの成熟化を誘導することができることを見出した。これらの化合物は、一
定した高いレベルの純度および強力さで容易に作製することができる小分子であ
る。これらの化合物を使用することによって、免疫療法剤として使用することが
できるＤＣを効率的且つ一定して成熟化することができる。本発明の方法に有用
なＩＲＭ化合物は、一般に、イミダゾキノリン型のものである；すなわち、それ
らは、イミダゾキノリン環系またはイミダゾピリジンもしくはイミダゾナフチリ
ジンなどの同様の環系を含有する構造を有する。

【０００７】 従って、本発明は、イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で樹状細胞を処理
するステップを含む樹状細胞をインビトロにおいて成熟化する方法と、本発明の
方法によって作製される樹状細胞集団とを提供する。

【０００８】 本発明はさらに、イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で樹状細胞を処理す
るステップを含む樹状細胞の抗原提示能力を増強する方法を提供する。

【０００９】 また、本発明は、イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で樹状細胞を処理し
、疾患に関連する抗原に成熟化した樹状細胞を暴露することによって、樹状細胞
をインビトロにおいて成熟化するステップを含む疾患を治療するための細胞アジ
ュバントを作製する方法を提供する。

【００１０】 発明の詳細な説明 ＩＲＭ化合物 本発明の方法に有用な化合物にはイミダゾキノリン型ＩＲＭ化合物が含まれる
。一般に、「イミダゾキノリン型ＩＲＭ化合物」という用語は、イミダゾキノリ
ン環系または免疫応答を改良する能力を有する同様の環系を含有する化合物をい
う。好ましいイミダゾキノリン型ＩＲＭ化合物は、以下の環系の１つ以上を含有
する：イミダゾキノリン、イミダゾピリジン、６，７融合型シクロアルキルイミ
ダゾピリジン、１，２−架橋型イミダゾキノリン、イミダゾナフチリジンおよび
イミダゾテトラナフチリジン。特に好ましいＩＲＭ化合物はイミダゾキノリン−
４−アミン環系を含有する。本発明の方法に有用な化合物はまた、典型的には、
宿主に投与したとき、または樹状細胞もしくは単球／マクロファージにインビト
ロにおいて適用したとき、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６および
ＩＬ−１２の１つ以上の産生を誘導する能力を有する。

【００１１】 本発明の方法に有用な免疫応答改良剤化合物は以下の式Ｉ〜ＩＸ（ｂ）によっ
て規定される化合物を含む。好ましい１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−
４−アミンは、式Ｉ〜Ｖ、

【化４】 （式中、 Ｒ₁₁は、炭素原子数１〜１０のアルキル、炭素原子数１〜６のヒドロキシアル
キル、アシルオキシアルキルのアシルオキシ部分が炭素原子数２〜４のアルカノ
イルオキシまたはベンゾイルオキシであり、アルキル部分が炭素原子数１〜６で
あるアシルオキシアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル置換
基が、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロ
ゲンからなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によってベンゼン環
に任意に置換されるが、ただし、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換
される場合には、前記部分は合わせて炭素原子数が６以下であるベンジル、（フ
ェニル）エチルおよびフェニルからなる群から選択され、 Ｒ₂₁は、水素、炭素原子数１〜８のアルキル、ベンジル、（フェニル）エチル
およびフェニル、またはフェニル置換基が、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素
原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立に選択される１つ
または２つの部分によってベンゼン環に任意に置換されるが、ただし、ベンゼン
環が２つの前記部分によって置換される場合には、部分は合わせて炭素原子数が
６以下であるベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、からなる群から選
択され、 各Ｒ₁は、炭素原子数１〜４のアルコキシ、ハロゲンおよび炭素原子数１〜４
のアルキルからなる群から独立に選択され、ｎは０〜２の整数であるが、ただし
、ｎが２である場合には、前記Ｒ₁基は合わせて炭素原子数が６以下である）

【化５】 （式中、 Ｒ₁₂は、炭素原子数２〜１０の直鎖または分岐鎖アルケニル並びに置換基が炭
素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルおよび炭素原子数３〜６のシクロア
ルキル、および炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルによって置換され
た炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる群から選択される炭素原子数２〜
１０の置換された直鎖または分岐鎖アルケニルからなる群から選択され、 Ｒ₂₂は、水素、炭素原子数１〜８の直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（
フェニル）エチル、およびフェニル、またはフェニル置換基が、炭素原子数１〜
４の直鎖または分岐鎖アルキル、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキ
シおよびハロゲンからなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によっ
てベンゼン環に任意に置換されるが、ただし、ベンゼン環が２つのこのような部
分によって置換される場合には、部分は合わせて炭素原子数が６以下であるベン
ジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、からなる群から選択され、 各Ｒ₂は、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび
炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から独立に選択され、
ｎは０〜２の整数であるが、ただし、ｎが２である場合には、前記Ｒ₂基は合わ
せて炭素原子数が６以下である）

【化６】 （式中、 Ｒ₂₃は、水素、炭素原子数１〜８の直鎖または分岐鎖アルキル、ベンジル、（
フェニル）エチルおよびフェニル、またはフェニル置換基が、炭素原子数１〜４
の直鎖または分岐鎖アルキル、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ
およびハロゲンからなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によって
ベンゼン環に任意に置換されるが、ただし、ベンゼン環が２つのこのような部分
によって置換される場合には、部分は合わせて炭素原子数が６以下であるベンジ
ル、（フェニル）エチルおよびフェニル、からなる群から選択され、 各Ｒ₃は、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンおよび
炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から独立に選択され、
ｎは０〜２の整数であるが、ただし、ｎが２である場合には、前記Ｒ₃基は合わ
せて炭素原子数が６以下である）

【化７】 （式中、 Ｒ₁₄は、−ＣＨＲ_xＲ_y（式中、Ｒ_yは水素または炭素−炭素結合であるが、た
だし、Ｒ_yが水素である場合には、Ｒ_xは炭素原子数１〜４のアルコキシ、炭素原
子１〜４のヒドロキシアルコキシ、炭素原子２〜１０の１−アルキニル、アルコ
キシアルキルのアルコキシ部分が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子
数１〜４のアルコキシアルキル、２−、３−または４−ピリジルであり、さらに
Ｒ_yが炭素−炭素結合である場合には、Ｒ_yおよびＲ_xは合わせて、ヒドロキシお
よび炭素原子数１〜４のヒドロキシアルキルからなる群から独立に選択される１
つ以上の置換基で任意に置換されたテトラヒドロフラニル基を形成し、 Ｒ₂₄は、水素、炭素原子数１〜４のアルキル、フェニル、置換フェニルの置換
基が炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲ
ンからなる群から選択される置換フェニルからなる群から選択され、 Ｒ₄は、水素、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンお
よび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択され、ｎ
は０〜２の整数であるが、ただし、ｎが２である場合には、前記Ｒ₄基は合わせ
て炭素原子数が６以下である）

【化８】 （式中、 Ｒ₁₅は、水素、炭素原子数１〜１０の直鎖または分岐鎖アルキル並びに置換基
が、炭素原子数３〜６のシクロアルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖または分
岐鎖アルキルによって置換された炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる群
から選択される炭素原子数１〜１０の置換された直鎖または分岐鎖アルキル、炭
素原子数２〜１０の直鎖または分岐鎖アルケニル並びに置換基が、炭素原子数３
〜６のシクロアルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルによ
って置換された炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる群から選択される炭
素原子数２〜１０の置換された直鎖または分岐鎖アルケニル、炭素原子数１〜６
のヒドロキシアルキル、アルコキルアルキルのアルコキシ部分が炭素原子数１〜
４で、アルキル部分が炭素原子数１〜６であるアルコキシアルキル、アシルオキ
シアルキルのアシルオキシ部分が炭素原子数２〜４のアルカノイルオキシまたは
ベンゾイルオキシで、アルキル部分が炭素原子数１〜６であるアシルオキシアル
キル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、またはフェニル置換基が
、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲン
からなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によってベンゼン環に任
意に置換されるが、ただし、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換され
る場合には、部分は合わせて炭素原子数が６以下であるベンジル、（フェニル）
エチルおよびフェニル、からなる群から選択され、 Ｒ₂₅は、

【化９】 （式中、 Ｒ_SおよびＲ_Tは、水素、炭素原子数１〜４のアルキル、フェニルおよび置換基
が、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲ
ンからなる群から選択される置換フェニルからなる群から独立に選択され、 Ｘは、炭素原子数１〜４のアルコキシ、アルコキシアルキルのアルコキシ部分
が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子数１〜４であるアルコキシアル
キル、炭素原子数１〜４のヒドロキシアルキル、炭素原子数１〜４のハロアルキ
ル、アルキルアミドのアルキル基が炭素原子数１〜４であるアルキルアミド、ア
ミノ、置換基がアルキルまたは炭素原子数１〜４のヒドロキシアルキルである置
換アミノ、アジド、クロロ、ヒドロキシ、１−モルホリノ、１−ピロリジノ、炭
素原子数１〜４のアルキルチオからなる群から選択され、 Ｒ₅は、水素、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンお
よび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択され、ｎ
は０〜２の整数であるが、ただし、ｎが２である場合には、前記Ｒ₅基は合わせ
て炭素原子数が６以下である）によって規定される。

【００１２】 ６，７位が融合した好ましいシクロアルキルイミダゾピリジン−４−アミンＩ
ＲＭ化合物は、以下の式ＶＩ、

【化１０】 （式中、ｍは、１、２または３であり、 Ｒ₁₆は、水素、炭素原子数３、４または５のシクロアルキル、炭素原子数１〜
１０の直鎖または分岐鎖アルキル並びに置換基が、炭素原子数３〜６のシクロア
ルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルによって置換された
炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる群から選択される炭素原子数１〜１
０の置換された直鎖または分岐鎖アルキル、炭素原子数１〜１０で、１つ以上の
フッ素または塩素原子を含有するのフルオロ−またはクロロアルキル、炭素原子
数２〜１０の直鎖または分岐鎖アルケニル並びに置換基が、炭素原子数３〜６の
シクロアルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルによって置
換された炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる群から選択される炭素原子
数２〜１０の置換された直鎖または分岐鎖アルケニル、炭素原子数１〜６のヒド
ロキシアルキル、アルコキルアルキルのアルコキシ部分が炭素原子数１〜４で、
アルキル部分が炭素原子数１〜６であるアルコキシアルキル、アシルオキシアル
キルのアシルオキシ部分が炭素原子数２〜４のアルカノイルオキシまたはベンゾ
イルオキシで、アルキル部分が炭素原子数１〜６であるアシルオキシアルキル、
ただし、このようなアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヒ
ドロキシアルキル、アルコキシアルキルまたはアシルオキシアルキル基は窒素原
子に直接結合する完全に炭素置換された炭素原子を有さず、ベンジル、（フェニ
ル）エチルおよびフェニル、またはフェニル置換基が、炭素原子数１〜４のアル
キル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立に選択
される１つまたは２つの部分によってベンゼン環に任意に置換されるが、ただし
、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換される場合には、部分は合わせ
て炭素原子数が６以下であるベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、 および−ＣＨＲ_xＲ_y （式中、 Ｒ_yは水素または炭素−炭素結合であるが、ただし、Ｒ_yが水素である場合には
、Ｒ_xは炭素原子数１〜４のアルコキシ、炭素原子１〜４のヒドロキシアルコキ
シ、炭素原子２〜１０の１−アルキニル、アルコキシアルキルのアルコキシ部分
が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子数１〜４のアルコキシアルキル
、２−、３−または４−ピリジルであり、さらにＲ_yが炭素−炭素結合である場
合には、Ｒ_yおよびＲ_xは合わせて、ヒドロキシおよび炭素原子数１〜４のヒドロ
キシアルキルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で任意に置換さ
れたテトラヒドロピラニル基を形成する） からなる群から選択され、 Ｒ₂₆は、水素、炭素原子数１〜８の直鎖または分岐鎖アルキル、炭素原子数１
〜６の直鎖または分岐鎖ヒドロキシアルキル、モルホリノアルキルのアルキル部
分が炭素原子数１〜４であるモルホリノアルキル、ベンジル、（フェニル）エチ
ルおよびフェニル、またはフェニル置換基が、メチル、メトキシおよびハロゲン
からなる群から選択される部分によってベンゼン環に任意に置換されたベンジル
、（フェニル）エチルおよびフェニル、並びに、 −Ｃ（Ｒ_S）（Ｒ_T）（Ｘ）（式中、Ｒ_sおよびＲ_Tは、水素、炭素原子数１〜４
のアルキル、フェニルおよび置換基が炭素原子１〜４のアルキル、炭素原子数１
〜４のアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される置換フェニルからな
る群から独立に選択され、 Ｘは、炭素原子数１〜４のアルコキシ、アルコキシアルキルのアルコキシ部分
が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子１〜４であるアルコキシアルキ
ル、炭素原子数１〜４のハロアルキル、アルキルアミドのアルキル基が炭素原子
数１〜４であるアルキルアミド、アミノ、置換基が炭素原子数１〜４のアルキル
またはヒドロキシアルキルである置換アミノ、アジド、炭素原子数１〜４のアル
キルチオ、ハロゲン、ヒドロキシ、モルホリノおよびモルホリノアルキルのアル
キル部分が炭素原子数１〜４であるモルホリノアルキルからなる群から選択され
る）からなる群から選択され、 Ｒ₆は、水素、フロロ、クロロ、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキ
ルおよび炭素原子数１〜４で、少なくとも１つのフッ素または塩素原子を含有す
る直鎖または分岐鎖フルオロ−またはクロロアルキルからなる群から選択される
）によって規定される。

【００１３】 好ましいイミダゾピリジン−４−アミンＩＲＭ化合物は、以下の式ＶＩＩ、

【化１１】 （式中、 Ｒ₁₇は、水素、−ＣＨ₂Ｒ_W（式中、Ｒ_Wは、炭素原子数１〜１０の直鎖、分岐
鎖または環状アルキル、炭素原子数２〜１０の直鎖または分岐鎖アルケニル、炭
素原子数１〜６の直鎖または分岐鎖ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキルの
アルコキシ部分が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子数１〜６である
アルコキシアルキルおよびフェニルエチルからなる群から選択される）および−
ＣＨ＝ＣＲ_ZＲ_Z（式中、各Ｒ_Zは、独立に、炭素原子数１〜６の直鎖、分岐鎖ま
たは環状アルキルである）からなる群から選択され、 Ｒ₂₇は、水素、炭素原子数１〜８の直鎖または分岐鎖アルキル、炭素原子数１
〜６の直鎖または分岐鎖ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキルのアルコキシ
部分が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子数１〜６のアルコキシアル
キル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、またはフェニル置換基が
、メチル、メトキシおよびハロゲンからなる群から選択される部分によってベン
ゼン環に任意に置換されたベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、並び
にモルホリノアルキルのアルキル部分が炭素原子数１〜４であるモルホリノアル
キル、からなる群から選択され、 Ｒ₆₇およびＲ₇₇は、独立に、水素および炭素原子数１〜５のアルキルからなる
群から選択されるが、ただし、Ｒ₆₇およびＲ₇₇が合わせて炭素原子数が６以下で
あり、さらにＲ₇₇が水素である場合には、Ｒ₆₇は水素以外であり、Ｒ₂₇は水素ま
たはモルホリノアルキル以外であり、さらに、Ｒ₆₇が水素である場合には、Ｒ₇₇ およびＲ₂₇は水素以外である）によって規定される。

【００１４】 １，２位が架橋した好ましいイミダゾキノリン−４−アミンＩＲＭ化合物は、
以下の式ＶＩＩＩ、

【化１２】 （式中、 Ｚは、 −（ＣＨ₂）_p−（式中、ｐは１〜４である）、 −（ＣＨ₂）_a−Ｃ（Ｒ_DＲ_E）（ＣＨ₂）_b−（式中、ａおよびｂは整数で、ａ＋
ｂは０〜３であり、Ｒ_Dは水素または炭素原子数１〜４のアルキルであり、Ｒ_Eは
、炭素原子数１〜４のアルキル、ヒドロキシ、−ＯＲ_F（式中、Ｒ_Fは炭素原子数
１〜４のアルキルである）および−ＮＲ_GＲ’_G（式中、Ｒ_GおよびＲ’_Gは、独立
に、水素または炭素原子数１〜４のアルキルである）からなる群から選択される
））および −（ＣＨ₂）_a−（Ｙ）−（ＣＨ₂）_b−（式中、ａおよびｂは整数で、ａ＋ｂは
０〜３であり、ＹはＯ、Ｓまたは−ＮＲ_J−（式中、Ｒ_Jは水素または炭素原子数
１〜４のアルキルである）である）からなる群から選択され、 ｑは０または１であり、Ｒ₈は、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１
〜４のアルコキシおよびハロゲンからなる群から選択される）によって規定され
る。

【００１５】 好ましいイミダゾナフチリジン−４−アミンおよびイミダゾテトラヒドロナフ
チリジン−４−アミンＩＲＭは、以下の式ＩＸ（ａ）およびＩＸ（ｂ）、

【化１３】 （式中、 Ａは、＝Ｎ−ＣＲ＝ＣＲ−ＣＲ＝、＝ＣＲ−Ｎ＝ＣＲ−ＣＲ＝、＝ＣＲ−ＣＲ
＝Ｎ−ＣＲ＝または＝ＣＲ−ＣＲ＝ＣＲ−Ｎ＝であり、 Ｒ₁₉は、 −水素、 未置換はたは、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −Ｎ₃、 オキソ、 −ハロゲン、 −ＮＯ₂、 −ＯＨおよび −ＳＨからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されるＣ_1-20 アルキルまたはＣ_2-20アルケニル並びに −Ｃ_1-20アルキル−ＮＲ₃₉−Ｑ−Ｘ−Ｒ₄₉または−Ｃ_2-20アルケニル−ＮＲ₃₉ −Ｑ−Ｘ−Ｒ₄₉（式中、Ｑは−ＣＯ−または−ＳＯ₂−であり、Ｘは単結合、−
Ｏ−または−ＮＲ₃₉−であり、Ｒ₄₉はアリール、ヘテロアリール、ヘテロサイク
リル、または未置換もしくは、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −ＮＲ₃₉−ＣＯ−Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｎ₃、 オキソ、 −ハロゲン、 −ＮＯ₂、 −ＯＨおよび −ＳＨからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換される−Ｃ_{1- 20} アルキルまたはＣ_2-20アルケニルであるか、またはＲ₄₉は、

【化１４】 （式中、Ｙは−Ｎ−または−ＣＲ−である）である）からなる群から選択され
、 Ｒ₂₉は、 −水素、 −Ｃ_1-10 アルキル、 −Ｃ_2-10 アルケニル、 −アリール、 −Ｃ_1-10アルキル−Ｏ−Ｃ_1-10−アルキル； −Ｃ_1-10アルキル−Ｏ−Ｃ_2-10アルケニルおよび −ＯＨ、 −ハロゲン、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −ＣＯ−Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −ＣＯ−Ｃ_1-10アルキル、 −Ｎ₃、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −ＣＯ−アリールおよび −ＣＯ−ヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基によって
置換される−Ｃ_1-10アルキルまたはＣ_2-10アルケニル からなる群から選択され、 各Ｒ₃₉は、水素およびＣ_1-10アルキルからなる群から独立に選択され、 各Ｒは、水素、Ｃ_1-10アルキル、Ｃ_1-10アルコキシ、ハロゲンおよびトリフル
オロメチルからなる群から独立に選択される）

【化１５】 （式中、 Ｂは、−ＮＲ−Ｃ（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−、−Ｃ（Ｒ）₂−ＮＲ−Ｃ
（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−、−Ｃ（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−ＮＲ−Ｃ（Ｒ）₂−または−
Ｃ（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−Ｃ（Ｒ）₂−ＮＲ−であり、 Ｒ₁₉は、 −水素、 未置換はたは、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −Ｎ₃、 オキソ、 −ハロゲン、 −ＮＯ₂、 −ＯＨおよび −ＳＨからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換されるＣ_1-20 アルキルまたはＣ_2-20アルケニル並びに −Ｃ_1-20アルキル−ＮＲ₃₉−Ｑ−Ｘ−Ｒ₄₉または−Ｃ_2-20アルケニル−ＮＲ₃₉ −Ｑ−Ｘ−Ｒ₄₉（式中、Ｑは−ＣＯ−または−ＳＯ₂−であり、Ｘは単結合、−
Ｏ−または−ＮＲ₃₉−であり、Ｒ₄₉はアリール、ヘテロアリール、ヘテロサイク
リル、または未置換もしくは、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｏ−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−アリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロアリール、 −Ｓ（Ｏ）_0-2−（Ｃ_1-20アルキル）_0-1−ヘテロサイクリル、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −ＮＲ₃₉−ＣＯ−Ｏ−Ｃ_1-20アルキル、 −Ｎ₃、 オキソ、 −ハロゲン、 −ＮＯ₂、 −ＯＨおよび −ＳＨからなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換される−Ｃ_{1- 20} アルキルまたはＣ_2-20アルケニルであるか、またはＲ₄₉は、

【化１６】 （式中、Ｙは−Ｎ−または−ＣＲ−である）である）からなる群から選択され
、 Ｒ₂₉は、 −水素、 −Ｃ_1-10アルキル、 −Ｃ_2-10アルケニル、 −アリール、 −Ｃ_1-10アルキル−Ｏ−Ｃ_1-10−アルキル； −Ｃ_1-10アルキル−Ｏ−Ｃ_2-10アルケニルおよび −ＯＨ、 −ハロゲン、 −Ｎ（Ｒ₃₉）₂、 −ＣＯ−Ｎ（Ｒ₃₆）₂、 −ＣＯ−Ｃ_1-10アルキル、 −Ｎ₃、 −アリール、 −ヘテロアリール、 −ヘテロサイクリル、 −ＣＯ−アリールおよび −ＣＯ−ヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基によって
置換される−Ｃ_1-10アルキルまたはＣ_2-10アルケニル からなる群から選択され、 各Ｒ₃₉は、水素およびＣ_1-10アルキルからなる群から独立に選択され、 各Ｒは、水素、Ｃ_1-10アルキル、Ｃ_1-10アルコキシ、ハロゲンおよびトリフル
オロメチルからなる群から独立に選択される） によって規定される。

【００１６】 上記の置換基Ｒ₁₁〜Ｒ₁₉は、種々の環系の１−位に位置するので、「１−置換
基」と一般に命名される。好ましい１−置換基には、炭素原子数１〜６のアルキ
ルおよび炭素原子数１〜６のヒドロキシアルキルが含まれる。さらに好ましくは
、１−置換基は２−メチルプロピルまたは２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル
である。

【００１７】 上記のＲ₂₁からＲ₂₉は、種々の環系の２−位の位置により「２−置換基」と一
般に命名される。好ましい２−置換基には、水素、炭素原子数１〜６のアルキル
、アルコキシアルキルのアルコキシ部分が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が
炭素原子数１〜４のアルコキシアルキルおよび炭素原子数１〜４のヒドロキシア
ルキルが含まれる。さらに好ましくは、２−置換基は水素、メチル、ブチル、ヒ
ドロキシメチル、エトキシメチルまたはメトキシエチルである。

【００１８】 ｎが０、１または２であってもよい場合には、ｎは、好ましくは、０または１
である。

【００１９】 本明細書において使用される、「アルキル」、「アルケニル」という用語およ
び「アルキ（ａｌｋ）」という接頭語は直鎖および分岐鎖基並びに環状基、すな
わち、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基を含む。これらの環状基は単環
式または多環式であってもよく、好ましくは、環炭素原子数３〜１０である。例
示的な環状基には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびア
ダマンチルが含まれる。アルキルおよびアルケニル基は、特に明記しないかぎり
炭素原子数１〜１０（または２〜１０）である。

【００２０】 本明細書において使用される「アリール」という用語には炭素環状芳香環また
は環系が含まれる。アリール基の例にはフェニル、ナフチル、ビフェニル、フル
オレニルおよびインデニルが含まれる。「ヘテロアリール」という用語には、少
なくとも１つの環状ヘテロ原子数（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ）を含有する芳香環また
は環系が含まれる。好適なヘテロアリール基には、フリル、チエニル、ピリジル
、キノリニル、テトラゾリル、イミダゾリル等が含まれる。

【００２１】 「ヘテロサイクリル」には、少なくとも１つの環状ヘテロ原子（例えば、Ｏ、
Ｓ、Ｎ）を含有する非芳香環または環系が含まれる。例示的なヘテロ環状基には
ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イミダ
ゾリジル等が含まれる。

【００２２】 アリール、ヘテロアリールおよびヘテロサイクリル基は未置換であっても、ま
たはＣ_1-20アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｎ（Ｒ₁₀）₂（式中、各Ｒ₁₀は、
独立に、水素、Ｃ_1-10アルキル、ＮＯ₂、Ｃ_1-20アルコキシ、Ｃ_1-20アルキルチ
オ、トリハロメチル、Ｃ_1-20アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカル
ボニル、（Ｃ_1-10アルキル）_0-1−アリール、（Ｃ_1-10アルキル）_0-1−ヘテロア
リール、ニトリル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキルの
アルキル基が炭素原子数１〜１０であるアリールアルキルおよびヘテロアリール
アルキルのアルキル基が炭素原子数１〜１０のヘテロアリールアルキルからなる
群から選択される）からなる群から選択される１つ以上の置換基によって置換さ
れてもよい。

【００２３】 本発明は、塩、ジアステレオマーおよび鏡像体などの異性体、溶媒和物、ポリ
モルフ等を含む、製薬学的に許容されうる形態のいずれかの形態の本明細書に記
載される化合物を含む。

【００２４】 上記のＩＲＭ化合物のうち、イミダゾキノリン構造を有するものが好ましい。
特に、式ＩおよびＶのイミダゾキノリン−４−アミン化合物が好ましい。化合物
４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５
−ｃ］キノリン−１−エタノールおよび１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イ
ミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンは特に好ましい。

【００２５】 本発明の方法に有用なＩＲＭ化合物は、例えば、参照として本明細書に組み入
れられている米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同
第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５
号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，
９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，７
５６，７４７号、同第４，９８８，８１５号、同第５，１７５，２９６号、同第
５，７４１，９０８号、同第５，３６７，０７６号、同第５，６９３，８１１号
および同第５，５２５，６１２号、並びに同時継続米国特許出願番号第０９／２
１０，１１４号にみられるように、当技術上周知である方法を使用して作製する
ことができる。

【００２６】 樹状細胞の成熟化 上記のＩＲＭ化合物は、半ビボでＤＣの成熟化を誘導することが見出されてい
る。一般に、成熟したＤＣはサイトカイン分泌、特定の細胞表面マーカーの発現
およびＴ−細胞を刺激する能力の増強などの特性を示す。

【００２７】 本発明の方法を使用して成熟化することができる樹状細胞は、当業者によって
容易に決定することができる任意の起源から入手することができる。例えば、未
成熟なＤＣは、血液、脾臓、骨髄、皮膚（例えば、ランゲルハンス細胞）等など
の組織からＤＣを単離することによって、または当技術上周知の方法を使用して
単球もしくは幹細胞の分化を誘導することによって入手することができる。ＤＣ
を入手する好ましい方法はヒト末梢血単核球細胞のサイトカイン誘導性分化を含
む。この方法は、例えば、ロマニ（Ｒｏｍａｎｉ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ１９６：１３７（１９９６）およびベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１９６：１２１（１９９６）によって記載
されている。特に好ましい方法は、ロマニ（Ｒｏｍａｎｉ）、上記によって記載
されている方法を使用して、ＣＤ１４＋末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−
４とともに培養するステップを含む。

【００２８】 このようにして得られるＤＣは未成熟状態であり、一般に、高い抗原捕獲およ
び処理能力を有するが、Ｔ−細胞刺激能は比較的低い。最適なＴ−細胞刺激能を
獲得するためには、ＤＣは安定な成熟状態でなければならない。成熟したＤＣは
、細胞表面マーカーＣＤ８３の発現を含む、数多くの特性によっておよびリンパ
球混合培養中に示される挙動によって同定することができる。この培養法におい
て、成熟したＤＣは未処理の同種Ｔ−細胞集団の増加および／または樹状細胞サ
イトカインの産生の増加を生ずる。好ましくは、成熟したＤＣは、同一起源から
入手されたが、いかなる外因的刺激にも接触させられていないＤＣ（「未成熟な
ＤＣ」）と比較したとき、未処理の同種Ｔ−細胞の少なくとも２倍の増殖の増加
を誘導し、および／または樹状細胞サイトカイン、特にＩＬ−１２およびＴＮＦ
−αの産生少なくとも３倍の増殖の増加を示す。未成熟なＤＣは上記の特性のい
くつかを示す場合があるが、未成熟なＤＣは、イミダゾキノリン型ＩＲＭ化合物
などの外因的刺激への暴露によって成熟化されたＤＣより低い程度でそれらの特
性を示す。未成熟なＤＣはＴ−細胞活性のかなり低い刺激体であるので、成熟し
たＤＣは安定であるべきで、未成熟な状態にもどるべきではない。

【００２９】 本発明の方法は、ＤＣを成熟化させるのに十分な量のイミダゾキノリン型ＩＲ
Ｍで、ＤＣを成熟化させるのに十分な時間ＤＣを刺激することによってＤＣを成
熟化することを含む。ＤＣは、当業者が容易に決定することができる条件下の組
織培養培地でインキュベーションされることが理解される。使用するＩＲＭの具
体的な量および暴露時間は、成熟化されるＤＣの起源、使用するＩＲＭ化合物の
強力さおよび他の特徴等を含む当業者によって考えられる数多くの因子によって
変わる。しかし、ＩＲＭは約０．１〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．５〜約２．０μ
ｇ／ｍｌの濃度で使用されることが本発明では好ましい。ＩＲＭ化合物は、ＤＣ
含有培地に添加される前に、好ましくは水または生理的緩衝液に可溶化される。
しかし、適宜、化合物をＤＭＳＯなどの少量の有機溶媒に溶解し、ＤＣ含有培地
に直接添加することができる。

【００３０】 ＤＣは、ＤＣを十分に成熟にさせるのに十分な時間にわたってＩＲＭ化合物に
よって刺激される。これは、ＤＣ含有培地試料を定期的に取り出し、樹状細胞サ
イトカインの分泌などの上記の特性の１つをアッセイすることによって決定する
ことができる。一般に、ＤＣは、測定される特性が最大レベルに達し、時間経過
してもそれ以上増加しない場合に、十分に成熟しているということができる。暴
露時間は当業者によって理解される因子（ＤＣの起源、ＩＲＭの濃度および強力
さ等を含むが、これらに限定されない）により変わるが、一般に、約１６〜２４
時間の刺激がＤＣを十分に成熟化させるのに必要とされる。

【００３１】 １種以上のイミダゾキノリン型ＩＲＭｓに暴露することによって成熟化された
樹状細胞はＣＤ８３を発現し、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０の発現が増加
する。また、ＩＲＭによって成熟化されたＤＣは数多くのサイトカイン、特に、
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−１２ｐ４０などの前−炎
症（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインを分泌する。

【００３２】 ＩＲＭによって成熟化された樹状細胞の用途 イミダゾキノリン型ＩＲＭｓに暴露することによって成熟化された樹状細胞は
、未成熟ＤＣと比較したとき、抗原提示能力が増強しており、被験者の免疫応答
を増強する種々の方法に使用することができる。例えば、成熟したＤＣを患者に
直接注射することができる。この場合には、ＤＣは、好ましくは、単球が同一患
者から入手された単球から誘導されたＤＣである。

【００３３】 ＤＣはまた、種々の免疫療法に使用することができる。このような例には、Ａ
ＩＤＳなどの免疫系の疾患を治療するための半ビボ細胞移植療法、Ｔ−細胞、特
に、免疫系の劣化によって特徴付けられる疾患を治療するために使用することが
できる抗原特異的なＴ−細胞の半ビボ発現、ＤＣ特異的マーカーを認識するモノ
クローナル抗体の形成、当技術上周知の方法による抗原活性化ＤＣの作製並びに
ワクチンおよびワクチンアジュバントの開発が含まれる。

【００３４】 １種以上のイミダゾキノリン型ＩＲＭｓに暴露することによって成熟化された
ＤＣの好ましい用途には、抗原活性化ＤＣおよび／またはＤＣ修飾抗原を使用す
るものが含まれる。本発明の抗原活性化ＤＣまたは細胞アジュバントは、一般に
、本発明の方法により成熟化されたＤＣを抗原に暴露することによって作製され
る。抗原は、天然型の蛋白質、炭水化物または核酸であってもよく、悪性新生物
細胞（例えば、腫瘍細胞）および感染菌（例えば、細菌、ウィルス、酵母、寄生
虫）を含む、いかなる好適な起源から誘導されてもよい。または、抗原は組換え
手段によって誘導されてもよい。

【００３５】 本発明の細胞アジュバントを疾患の治療に使用することができる。例えば、成
熟化したＤＣを腫瘍から誘導した抗原に暴露することによって作製された細胞ア
ジュバントを患者に投与し、それによって、患者における抗腫瘍免疫応答を誘導
することができる。同様に、感染菌から誘導した抗原にＤＣを暴露することによ
って作製された細胞アジュバントを患者に投与することによって、感染性疾患を
治療することができる。

【００３６】 本発明の方法によって成熟化された樹状細胞は、Ｔｈ１免疫応答の形成を助け
るＩＬ−１２およびＩＦＮ−αなどのサイトカインを産生する。Ｔｈ２応答では
なく、Ｔｈ１に対して免疫応答を偏らせる能力は、Ｔｈ２媒介性疾患を治療する
ための手段となることができる。このような疾患の例には、喘息、アレルギー性
鼻炎、全身性エリテマトーデス、湿疹、アトピー性皮膚炎オーメン（Ｏｍｍｅｎ
’ｓ）症候群（過好酸球増加症（ｈｙｐｅｒｓｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ）症候
群）、皮膚および全身リーシュマニア症などのある種の寄生虫感染症、トキソプ
ラズマ感染症およびトリパノソーマ感染症、例えばカンジダ症およびヒストプラ
ズマ症のようなある種の真菌感染症、並びにらい病および結核などのある種の細
胞内細菌感染症が含まれる。

【００３７】 実験 材料および方法 培養培地。本発明の検討全体にわたって完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）培地を使
用した。ｃＲＰＭＩは、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ハイクローン（Ｈｙクローン
）、ユタ州ローガン）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ
酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（ライフ
テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を補給した２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ１
６４０からなる。

【００３８】 試薬。末梢血から誘導したＣＤ１４⁺細胞は、ロマーニ（Ｒｏｍａｎｉ）およ
びベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）によって記載されているように、それぞれ８００Ｕ
／ｍｌおよび２５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦおよび組換えヒトＩＬ−
４（Ｒ ＆ Ｄコーポレーション（Ｒ ＆ Ｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ミ
ネソタ州ミネアポリス）を使用してＤＣに分化させた。破傷風トキソイド（カル
バイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州ラジョラ）をｃＲＰＭ
Ｉに溶解し、１０μｇ／ｍｌで使用した。化合物Ｒ−８４８（Ｓ−２８４６３）
、４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，
５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｍ．Ｗ．＝３１４．４は３Ｍファーマシュ
ーティカルズ（３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ミネソタ州セントポ
ールによって作製した。細胞培養検討では、ＨＣｌ塩を発熱物質不含の滅菌水に
溶解し、４ヶ月まで４℃においてストック溶液として保存した。内毒素レベルは
、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞アッセイにおいて検出レベル［
１ｐｇ／ｍｇ］未満であった。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０
５５：Ｂ５（シグマ ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州
セントルイス）由来の細菌ＬＰＳのストック溶液を発熱物質不含水に１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で溶解し、使用時まで４℃において保存した。

【００３９】 単球から誘導された樹状細胞（ＭＯ−ＤＣ）の作製。同意書を得た後、健康被
験者からヒストパーク ハイブリマックス（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ Ｈｙｂｒｉ
Ｍａｘ）−１０７７密度勾配（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いてＰＢＭＣを単離
した。製造業者の指示により、ＣＤ１４⁺マイクロビーズをＭｉｎｉＭＡＣＳ（
ミルテニイ バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、カリフォル
ニア州アウボーン）合わせて使用した陽性選択によってＣＤ１４⁺細胞を精製し
た。フローサイトメトリーによって評価したとき、純度は９０％より大きかった
。ロマーニ（Ｒｏｍａｎｉ）およびベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）、上記、によって
以前に記載されているように、６−ウェルプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）
、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中で、３ｍｌ ｃＲＰＭＩあたり２〜５×
１０⁶細胞の濃度で、８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦおよび２５ｎｇ／ｍｌＩＬ
−４とともにＣＤ１４⁺を培養した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を含有する新
鮮な培地を３日ごとに添加した。ＭＯ−ＤＣは、通常培養７日と８日の間で使用
した。対照として、劣化したリンパ球を同じ様式で培養した。

【００４０】 インビトロＭＯ−ＤＣ刺激。ＭＯ−ＤＣを、０．１〜８μｇ／ｍｌＲ−８４８
（１μｇ／ｍｌ＝３．２μＭ）または１μｇ／ｍｌ ＬＰＳで１〜９６時間刺激
した。その後、細胞を種々の細胞表面マーカーの発現についてフローサイトメト
リーによって分析し、細胞培養上清をＥＬＩＳＡによって種々のサイトカインお
よびケモカインについて分析した。

【００４１】 細胞表面および細胞内フローサイトメトリー。以下のモノクローナル抗体を使
用して、フローサイトメトリー分析によって細胞表面マーカー発現を評価した：
ＦＩＴＣ−結合型ＣＤ１ａ、クローンＮＡ１／３４ ＨＬＫ（アキュレイト ケ
ミカル（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ニューヨーク州ウェストベリ
ー）、ＰＥ−結合型ＣＤ１４、クローンＭφＰ９、ＰＥ−結合型ＣＤ８０、クロ
ーンＬ３０７．４、ＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合型ＨＬＡ−ＤＲ、クローンＬ２
４３、ＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合型γ１／γ２ａアイソタイプ対照、クローン
Ｘ４０およびＸ３９（全てベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ）製、カリフォルニア州マウンテンビュー）、ＰＥ−結合型ＣＤ４０
、クローンＥＡ−５（バイオソース インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、カリフォルニア州カマリロ）、ＰＥ−結合型
ＣＤ８３、クローンＨＢ１５ａ、ＰＥ−およびＦＩＴＣ−結合型γ１／γ１ ア
イソタイプ対照、クローン６７９．１Ｍｃ７（イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅ
ｃｈ）、フランス、マルセーユ）、ＰＥ−結合型ＣＤ８６、クローン２３３１（
ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンジエゴ）。細
胞（５×１０⁵）を、精製したＩｇＤ（ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏ
ｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））とともに４℃において１５分間インキュベーション
して、非特異的結合を遮断し、次いで細胞を、１０％ＦＣＳおよび０．１％アジ
化ナトリウムを含有するＰＢＳ中で４℃において抗体で３０分間染色した。ＰＢ
Ｓ中で洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーおよびセルクエスト（Ｃｅ
ｌｌ Ｑｕｅｓｔ）ソフトウェアー（ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を使用して細胞を分析した。

【００４２】 同種リンパ球活性化。製造業者の仕様書（Ｒ＆Ｄシステム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）ミネソタ州ミネアポリス）により、Ｔ−細胞精製カラム（Ｔ−Ｃｅｌｌ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ）を使用してＴ−細胞を単離した
。同種ＭＯ−ＤＣスティムレーター細胞を培地単独、Ｒ−８４８またはＬＰＳで
１、６または２４時間の種々の時間にわたって刺激し、次いで洗浄し、５０μｇ
／ｍｌマイトマイシンＣ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で３７℃において２０分間処
理した。その後、樹状細胞を洗浄し、ｃＲＰＭＩに再度懸濁し、９６−ウェルの
底の平らなマイクロタイタープレート（ＢＤ ラボウェアー（ＢＤ Ｌａｂｗａ
ｒｅ）中の精製したリスポンダーＴ−細胞（ウェルあたり１×１０⁵）に種々の
濃度（ウェルあたり１〜３２×１０³）で添加して、総容量を２００μｌとした
。３本組みの培養試料を３７℃において９６時間維持し、その後、時間細胞増殖
を［³Ｈ］−チミジン（［³Ｈ］−ＴｄＲ）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、
イリノイ州アーリントンハイツ）の取り込みによって評価した。各ウェルに１μ
Ｃｉ［³Ｈ］−ＴｄＲを添加し、１８時間後に回収した。結果は、３本組みのウ
ェルの平均ＣＰＭ±ＳＥＭとして表す。［³Ｈ］−ＴｄＲの添加前に、同じ培養
試料から上清を回収しＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−２について分析した。

【００４３】 同種Ｔ細胞活性化。同種Ｔ細胞およびＲ−８４８処理したＭＯ−ＤＣを、同種
Ｔ細胞刺激について記載されているように作製した。ＭＯ−ＤＣをＲ−８４８［
２μｇ／ｍｌ］および破傷風トキソイド［１０μｇ／ｍｌ］とともに２４時間培
養した。ＭＯ−ＤＣを洗浄し、ＰＢＭＣ−誘導されたＣＤ３⁺Ｔ細胞とともに漸
増濃度で７日間培養した。細胞増殖および分析を記載したように測定した。［³
Ｈ］−ＴｄＲの添加前に、同じ培養試料から上清を回収しＩＦＮ−γおよびＩＬ
−５について分析した。

【００４４】 サイトカイン分析。サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＴ
ＮＦ−α、ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）、ＩＦＮγ、ＩＬ−４およびＩＬ−２
キットはゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）か
ら購入した。ヒトＩＬ−６キットはバイオソース インターナショナル（Ｂｉｏ
ｓｏｕｒｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（カリフォルニア州カマリロ）
から入手した。ヒトＩＬ−５、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１およびＲＡ
ＮＴＥＳはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。全
てのＥＬＩＳＡは製造業者の仕様書により実施した。ＩＦＮ濃度はバイオアッセ
イ（４０）によって測定した。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β特異的抗体を使用し
て、どのＩ型ＩＦＮがＭＯ−ＤＣ上清に存在するかを測定した。全てのＥＬＩＳ
Ａｓの結果はｐｇ／ｍｌ単位で表すが、ＩＦＮ結果はＵ／ｍｌ単位で表す。

【００４５】 統計分析。データは対応のあるスチューデントのｔ−検定を使用して分析し、
ｐ≦０．０５である場合に、結果は統計的に有意差があると考えた。

【００４６】 ＤＣに対するＲ−８４８の成熟化の可能性を評価するために、ＭＯ−ＤＣをＲ
−８４８［０．１〜８μｇ／ｍｌ］またはＬＰＳ［１μｇ／ｍｌ］で２４時間処
理し、前方散乱／側方散乱特徴によって規定されるように、細胞表面ＣＤ８３お
よびＣＤ８６発現をＤＣ（ゲート型）集団についてフローサイトメトリーによっ
て分析した（図１Ａ）。図１Ｂの結果は、Ｒ−８４８は、未刺激（基剤）細胞と
比較したとき、ＭＯ−ＤＣのＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を増強することを証
明している。０．１μｇ／ｍｌＲ８４８の場合にはＣＤ８３またはＣＤ８６細胞
表面発現のどちらも増加が見られなかった。０．４、２および８μｇ／ｍｌＲ−
８４８の場合にはＣＤ８６発現の増強が明らかである。ＣＤ８３の細胞表面発現
の増強は２および８μｇ／ｍｌＲ−８４８で見られる。ＣＤ８３およびＣＤ８６
細胞表面発現はともにＬＰＳで増強され、これは、ＤＣのこれらの分子の発現を
増強することを示している。図１Ｃは、Ｒ−８４８処理したＭＯ−ＤＣの平均蛍
光強度（ＭＦＩ）の定量的なＣＤ８３およびＣＤ８６細胞表面発現を示している
。Ｒ−８４８は、用量依存的にＣＤ８３およびＣＤ８６発現の増加を誘導し、Ｃ
Ｄ８６発現は０．１〜０．４μｇ／ｍｌＲ−８４８の間で増加する。ＣＤ８３発
現は、０．４〜２μｇ／ｍｌＲ−８４８で有意に増加される。ＣＤ８３およびＣ
Ｄ８６発現の最大増加は２μｇ／ｍｌＲ−８４８で形成され、これは、ＣＤ８０
およびＣＤ８６の約３〜４倍の平均増加に相当する。比較すると、Ｒ−８４８に
よって誘導される最大ＣＤ８３およびＣＤ８６細胞表面発現は、ＬＰＳによって
誘導されるものと同等である。相対的な細胞数およびＭＦＩデータは共に相関し
ており、これは、Ｒ−８４８に応答してこれらの抗原を発現する細胞の数の増加
を示している。

【００４７】 ＣＤ８３およびＣＤ８６に加えて、ＤＣ成熟化を示す他の細胞表面分子もフロ
ーサイトメトリーによって検討した。ＭＯ−ＤＣを２μｇ／ｍｌＲ−８４８とと
もに２４時間培養し、図１に示すように最大ＣＤ８３およびＣＤ８６発現を得た
。細胞を、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＨＬＡ−
ＤＲの細胞表面発現について染色した。図２Ａは、基剤対照と比較したとき、Ｒ
−８４８は、ＣＤ８３およびＣＤ８６以外に、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現も
増強することを示している。図２Ｂおよび２Ｃは、細胞表面分子発現の定量的な
差を示している。ＣＤ８３およびＣＤ８６発現の増加と矛盾することなく、Ｒ−
８４８処理も基剤処理したＭＯ−ＤＣと比較して、ＣＤ８０およびＣＤ４０の２
倍の増加を誘導する。Ｒ−８４８は細胞表面ＨＬＡ−ＤＲ発現の増加を誘導する
が（図２Ａおよび２Ｃ）、増加は定量的に有意ではない。同様に、Ｒ−８４８が
誘導するＣＤ１ａ発現の減少は統計的に有意ではない。Ｒ−８４８刺激によるＨ
ＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１ａ発現のこれらの傾向は全ての実験において見られ、い
くつかの実験では、Ｒ−８４８で処理した細胞と基剤で処理した細胞の差は統計
的に有意であった。１μｇ／ｍｌで使用したＬＰＳは、Ｒ−８４８によって誘導
したものと同様のレベルまでＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の細
胞表面発現を増強した（データは示していない）。図１および２の結果は、Ｒ−
８４８は、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０発現の増加によって規
定されるＭＯ−ＤＣ成熟化を誘導することを証明している。これらのＤＣ成熟化
マーカーもＲ−８４８による４８、７２および９６時間刺激後に検討し、２μｇ
／ｍｌＲ−８４８との培養の２４時間後に最大ＤＣ成熟化マーカー発現が得られ
た。

【００４８】 Ｒ−８４８は、単球から誘導された樹状細胞からの前−炎症性（ｐｒｏ−ｉｎ
ｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導する 種々のサイトカインおよびケモカインの産生におけるＤＣ成熟化の結果。また
、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２などの成熟したＤＣによって産生される数多くの
サイトカインはＤＣ成熟化を誘導または増強することができる。従って、本発明
者らは、Ｒ−８４８が、ＤＣ成熟化の特徴であるＭＯ−ＤＣサイトカインおよび
ケモカイン分泌を誘導するかどうかを試験した。図１および２に示すように、Ｍ
Ｏ−ＤＣを種々の濃度のＲ−８４８で２４時間培養した。ＥＬＩＳＡまたはバイ
オアッセイによって分泌されたサイトカインおよびケモカインについて上清を分
析した。表Ｉの結果は、Ｒ−８４８で処理されたＭＯ−ＤＣは、基剤対照と比較
したとき、有意に多いＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、ＭＩＰ−
１αおよびＩＦＮ−αを産生することを示している。試験した全てのサイトカイ
ンの統計的に有意な量は２μｇ／ｍｌＲ−８４８で得られたが、ＩＬ−６、ＩＬ
−８およびＩＬ−１２は０．１〜０．４μｇ／ｍｌのＲ−８４８で誘導されると
思われるが、量は、基剤で処理したＭＯ−ＤＣによって産生されるものと比較し
て統計的に有意ではない。ＭＣＰ−１量は０．１〜８μｇ／ｍｌＲ−８４８で増
加したが、対照細胞によって産生される量と統計的に異ならなかった。中和作用
のあるＩＦＮ−αは生物活性の９５％より多くを阻害し、これは、Ｒ−８４８に
よって誘導されるＩＦＮはＩＦＮ−αであったことを示している。Ｒ−８４８と
同様に、ＬＰＳは、基剤対照群と比較したとき、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−
１２、ＭＩＰ−１αおよびＩＦＮ−αを有意に増強した。ＬＰＳによって誘導さ
れる最大サイトカインおよびケモカイン量は、Ｒ−８４８によって誘導される最
大量に匹敵する。

【００４９】 成熟化を生じさせるためにＭＯ−ＤＣをＲ−８４８に接触させなければならな
い時間の長さは、種々の時間にわたって細胞をＲ−８４８で刺激することによっ
て決定した。Ｒ−８４８またはＬＰＳによる種々の処理時間の後に、培養上清を
サイトカイン分泌について分析した。表Ｉおよび以前の検討の結果に基づいて、
ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２分泌をＤＣ成熟化のマーカーとして使用した。最初
に、ＭＯ−ＤＣを２μｇ／ｍｌＲ−８４８または１μｇ／ｍｌＬＰＳとともに１
、６または２４時間培養し、次いで培養直後にサイトカイン分泌について分析し
た（表ＩＩ、Ｉ、ＩＩおよびＶ群）。表ＩＩの結果は、ＭＯ−ＤＣは、Ｒ−８４
８による１時間の刺激後に最小量のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２を産生すること
を証明している。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２蛋白質の有意な増加は、Ｒ−８４
８による６時間の刺激後に上清中で検出される。２４時間もＲ−８４８処理もＴ
ＮＦ−αおよびＩＬ−１２分泌の有意な増加を生ずる。ＬＰＳは、Ｒ−８４８に
よって誘導されるより約２倍多くＴＮＦ−αを誘導したことを除いて、ＬＰＳ群
は、Ｒ−８４８処理した群と同じ動態でＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２を産生した
。ＬＰＳ処理したＭＯ−ＤＣは、Ｒ−８４８処理したＭＯ−ＤＣより約５倍多い
ＩＬ−１２を産生した。

【００５０】 表ＩＩの結果は、ＭＯ−ＤＣは、有意な量のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２を分
泌するためには、Ｒ−８４８またはＬＰＳによって１時間を超える刺激を必要と
することを示している。最大ＴＮＦ−α分泌はＲ−８４８またはＬＰＳによる１
〜６時間の刺激において達成され、最大ＩＬ−１２分泌はＲ−８４８またはＬＰ
Ｓによる６〜２４時間の刺激を必要とする。

【００５１】 ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２産生に加えて、最適な成熟化マーカー発現のため
に、ＭＯ−ＤＣがＲ−８４８とともに培養する必要のある時間の長さを決定する
ために、種々の時間にわたってＲ−８４８処理した後にＤＣ成熟化の細胞表面マ
ーカーもフローサイトメトリーによって検討した。２μｇ／ｍｌＲ−８４８また
は１μｇ／ｍｌＬＰＳで１時間刺激し、ＤＣ成熟化マーカーについて染色したＭ
Ｏ−ＤＣは、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０またはＨＬＡ−ＤＲの発
現の増加を示さなかった。Ｒ−８４８で６時間刺激し、成熟化マーカーについて
直後に染色したＭＯ−ＤＣはＣＤ８３の有意な増加を示したが、ＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ４０またはＨＬＡ−ＤＲの有意な増加を示さなかった（図３Ａおよび
３Ｂ）。ＣＤ４０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ発現は、６時間の培養後に、Ｒ
−８４８処理群において増加したが、培地対照と比較したとき、差は統計的に有
意でない。Ｒ−８４８処理したＭＯ−ＤＣと同様に、ＬＰＳ処理したＭＯ−ＤＣ
はＣＤ８３発現の増加を示したが、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ
−ＤＲ発現の変化は示さなかった。

【００５２】 ＭＯ−ＤＣを２μｇ／ｍｌＲ−８４８または１μｇ／ｍｌＬＰＳで１または６
時間刺激し、刺激を含有しないように洗浄し、次いでさらに２３時間培養（１時
間プラス）または１８時間（６時間プラス）してから、細胞表面ＤＣ成熟化マー
カー測定を実施した。２μｇ／ｍｌＲ−８４８または１μｇ／ｍｌＬＰＳで１時
間刺激したＭＯ−ＤＣは、２４時間の培養後にＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、
ＣＤ４０またはＨＬＡ−ＤＲの発現の増加を示さなかった。Ｒ−８４８で６時間
刺激したＭＯ−ＤＣはＣＤ８３およびＣＤ４０の発現の有意な増加を示すが、２
４時間の培養後では、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＨＬＡ−ＤＲの発現の有意な増
加を示さない（図３Ｃおよび３Ｄ）。ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲマーカーの発
現は上記のように増加するが、培地対照群と比較したとき、統計的に有意でない
。同じ結果は、同様に培養したＬＰＳ−刺激ＭＯ−ＤＣで得られた。

【００５３】 同種Ｔ細胞増殖およびＴ細胞サイトカイン分泌は、Ｒ−８４８処理した単球か
ら誘導した樹状細胞によって増加する ＤＣの機能的特徴がイミダゾキノリン処理によって変化するかどうかを判定す
るために、Ｒ−８４８で刺激したＭＯ−ＤＣを一次ＭＬＲで試験した。ＭＯ−Ｄ
Ｃを０．１〜８μｇ／ｍｌＲ−８４８または１μｇ／ｍｌＬＰＳで処理した。２
４時間後、刺激剤含有しないようにＭＯ−ＤＣを洗浄し、同種ＣＤ３強化末梢血
Ｔ細胞とともに９６時間培養し、それによって、［³Ｈ］チミジン取り込みによ
って細胞増殖を評価した。図４Ａの結果は、Ｒ−８４８処理したＭＯ−ＤＣは、
基剤処理した細胞よりさらに効率的な同種Ｔ細胞増殖の刺激物質であり、Ｒ−８
４８処理した細胞はＬＰＳ刺激した細胞と同様に効果的であったことを証明して
いる。基剤処理したＭＯ−ＤＣと比較してＴ細胞増殖の有意な差は、ＭＯ−ＤＣ
を２または８μｇ／ｍｌＲ−８４８で処理したとき見られる。

【００５４】 ９６時間の培養後に、ＭＬＲ上清をＴ細胞サイトカインについて分析した。Ｒ
−８４８処理したＭＯ−ＤＣは、基剤対照群と比較して、同種Ｔ細胞からのＩＬ
−２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γ分泌を増加する（図４Ｂ〜４Ｄ）。図４ＡのＭ
ＬＲ増殖結果と矛盾することなく、未処理のＭＯ−ＤＣ培養試料と比較して、２
および８μｇ／ｍｌＲ−８４８で処理したＭＯ−ＤＣを含有する培養試料によっ
てＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γ産生の有意な２〜３倍の増加が誘導され
た。Ｒ−８４８で刺激されたＭＯ−ＤＣによって誘導されるＴ細胞サイトカイン
は、ＬＰＳによって刺激されたＭＯ−ＤＣによって誘導されるサイトカインレベ
ルと同等であった。ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γ産生はＭＯ−ＤＣをＴ
細胞とともに培養することを必要とする。その理由は、ＭＯ−ＤＣだけまたはＴ
細胞だけを含有する培養試料は検出可能なレベルのＩＬ−２、ＩＬ−５またはＩ
ＦＮ−γを産生しなかったからである。また、Ｒ−８４８の存在下で、ＭＯ−Ｄ
Ｃを添加することなく培養したＴ細胞はＩＬ−２、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γを
産生しない。これらのデータは、Ｒ−８４８は、ＬＰＳによって誘導されるもの
と同等にＤＣ機能を増加することを示している。最大の増殖は、Ｒ−８４８で２
４時間刺激したＭＯ−ＤＣによって誘導されたが、Ｒ−８４８で６時間処理した
ＭＯ−ＤＣも、未処理のＭＯ−ＤＣと比較したとき、同種Ｔ細胞増殖を有意に増
加した。ＭＯ−ＤＣをＲ−８４８で６時間より短い時間にわたって処理したとき
、同種Ｔ細胞増殖は、未処理のＭＯ−ＤＣ対照と比較して、有意に増加されなか
った。

【００５５】 自己Ｔ細胞増殖およびＴ細胞サイトカイン分泌は、Ｒ−８４８処理した単球か
ら誘導される樹状細胞によって増加される。 ＭＯ−ＤＣ機能に対するＲ−８４８の影響も、破傷風トキソイドに対する自己
（同系）既往応答において試験した。ＭＯ−ＤＣを２μｇ／ｍｌＲ−８４８およ
び１０μｇ／ｍｌ破傷風トキソイドで２４時間処理した。化合物及び抗原を含有
しないようにＭＯ−ＤＣを洗浄し、次いで、同系ＣＤ３強化した末梢血Ｔ細胞と
ともに７日間培養し、この間に［³Ｈ］チミジン取り込みによって増殖を評価し
た。図５Ａおよび５Ｂの結果は、破傷風トキソイドで処理したＭＯ−ＤＣおよび
未処理のＭＯ−ＤＣは同じ量の同系Ｔ細胞増殖を誘導したことを示している。し
かし、Ｒ−８４８処理したＭＯ−ＤＣは、Ｒ−８４８で処理しなかったＭＯ−Ｄ
Ｃと比較して、２〜３倍Ｔ細胞増殖を増加した。自己ＭＯ−ＤＣ／Ｔ細胞系から
のサイトカイン分泌も分析した。ＩＦＮ−γ分泌は、Ｒ−８４８および破傷風ト
キソイドで処理したＭＯ−ＤＣを含有する上清においてのみ検出された（図５Ｃ
および５Ｄ）。Ｒ−８４８および破傷風トキソイドの両方で処理したＭＯ−ＤＣ
は、破傷風トキソイド抗原だけで培養したＭＯ−ＤＣより４〜１１倍多いＩＦＮ
−γを産生した。ＩＬ−５は、ＩＦＮ−γを含有する同じ培養上清のいずれにお
いても検出されなかった。図５のデータは、記憶Ｔ細胞ＩＦＮ−γ分泌はＲ−８
４８処理したＭＯ−ＤＣによって増加されるが、増殖は増加されないことを示し
ている。

【００５６】 図面の詳細な説明 図１：免疫応答改良剤Ｒ−８４８は、単球から誘導した樹状細胞（ＭＯ−ＤＣ
）のＣＤ８３およびＣＤ８６の細胞表面発現を増強する。ＭＯ−ＤＣは、材料お
よび方法において記載したように、ＣＤ１４⁺ＰＢＭＣからインビトロにおいて
作製した。ＭＯ−ＤＣ（２×１０⁵）は、０．１〜８μｇ／ｍｌＲ−８４８［０
．３２〜２６μＭ］または１μｇ／ｍｌＬＰＳで２４時間刺激した。Ａ、その後
細胞をＣＤ８３およびＣＤ８６細胞表面発現について染色し、ＭＯ−ＤＣゲート
型（ｇａｔｅｄ）集団をフローサイトメトリーによって分析した。Ｂ、結果は、
ゲート型（ｇａｔｅｄ）集団内で陽性に染色する相対細胞数として表す。実線は
Ｒ−８４８またはＬＰＳ処理を示し、破線は培地（基剤）対照を示す。Ａおよび
Ｂの結果は、６人の異なるドナーの６つの独立した実験を代表している。Ｃ、結
果は、６人の異なるドナーの６つの独立した実験の平均蛍光強度（ＭＦＩ）±Ｓ
ＥＭとして表す。^*Ｐ＜０．０５

【００５７】 図２：Ｒ−８４８は、ＭＯ−ＤＣの同時刺激分子の細胞表面発現を増強する。
ＭＯ−ＤＣ（２×１０⁵）は、２μｇ／ｍｌＲ−８４８で２４時間刺激した。そ
の後細胞をＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ
１ａの細胞表面発現について染色した。Ａ、結果は、ＭＯ−ＤＣゲート型（ｇａ
ｔｅｄ）集団内で陽性に染色する相対細胞数として表し、３人の異なるドナーの
３つの独立した実験を代表している。実線はＲ−８４８処理を示し、破線は培地
（基剤）対照を示す。Ｂ、Ｃ、結果は、３人の異なるドナーの少なくとも３つの
独立した実験のＭＦＩ±ＳＥＭとして表す。^*Ｐ＜０．０５

【００５８】 図３：単球から誘導した樹状細胞の成熟化にはＲ−８４８による１〜６時間の
刺激が必要である。ＭＯ−ＤＣ（２×１０⁵）は、２μｇ／ｍｌＲ−８４８で６
時間刺激した。Ａ、Ｂ、その後細胞をＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−
ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ１ａの細胞表面発現について染色した。Ｃ、Ｄ、細胞
を十分に洗浄し、さらに１８時間培養し、その後、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４
０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ１ａの細胞表面発現について染色した。
結果は、３人の異なるドナーの３つの独立した実験のＭＦＩ±ＳＥＭとして表す
。^*Ｐ＜０．０５

【００５９】 図４：Ｔ細胞集団およびＴ細胞サイトカイン産生は、一次ＭＬＲにおいてＲ−
８４８で処理したＭＯ−ＤＣによって増加する。ＭＯ−ＤＣ（２×１０⁵）は、
０．１〜８μｇ／ｍｌＲ−８４８または１μｇ／ｍｌＬＰＳで２４時間刺激した
。細胞を十分に洗浄し、漸増濃度で、１×１０⁵ＣＤ３強化同種Ｔ細胞とともに
３本組みで培養した。Ａ、９６時間後、［³Ｈ］チミジン取り込みによって増殖
を評価した。結果は、３人の異なるドナーの３つの独立した実験のＣＰＭ±ＳＥ
Ｍとして表す。４〜３２×１０³ＭＯ−ＤＣでは、Ｒ−８４８［２および８μｇ
／ｍｌ］およびＬＰＳ処理群の間に、基剤［０μｇ／ｍｌ］で処理した群と比較
して、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）が測定された。Ｂ〜Ｄ、材料および方法に
おいて記載したように、培養上清のＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γ蛋白質
を評価した。結果は、３人の異なるドナーの３つの独立した実験の平均ｐｇ／ｍ
ｌ±ＳＥＭとして表す。８〜３２×１０³ＭＯ−ＤＣでは、Ｒ−８４８［２およ
び８μｇ／ｍｌ］およびＬＰＳ処理群の間に、基剤［０μｇ／ｍｌ］で処理した
群と比較して、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）が測定された。

【００６０】 図５：自己Ｔ細胞増殖およびＴ細胞サイトカイン分泌は、破傷風トキソイドに
対する既往応答が、Ｒ−８４８で処理したＭＯ−ＤＣによって増加する。ＭＯ−
ＤＣ（２×１０⁵）は、２μｇ／ｍｌＲ−８４８および１０μｇ／ｍｌ破傷風ト
キソイドで２４時間刺激した。細胞を十分に洗浄し、漸増濃度で、１×１０⁵Ｃ
Ｄ３強化同系Ｔ細胞とともに３本組みで７日間培養した。Ａ、Ｂ、７日後、［³
Ｈ］チミジン取り込みによって増殖を評価した。Ｃ、Ｄ、材料および方法におい
て記載したように、培養上清のＩＦＮ−γ蛋白質を評価した。結果は、３人の異
なるドナーの３つの独立した実験の平均ｐｇ／ｍｌ±ＳＥＭとして表す。データ
ポイントのいくつかのの上に示す値はｐ−値＜０．０５を示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】 本発明は、本発明のいくつかの実施態様を参照して記載されている。上記の詳
細な説明および実施例は、理解を明確にするためだけに提供されており、不必要
な制限がそれらから理解するべきではない。本発明の精神および範囲から逸脱す
ることなく、記載されている実施態様に多数の変更を加えることができることが
当業者に明らかである。従って、本発明の範囲は、本明細書に記載されている方
法、組成物および構造物の正確な詳細に限定されるべきではなく、以下の請求の
範囲の内容によって限定されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＩＲＭ化合物４−アミノ−２−エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イ
ミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（Ｒ−８４８）のＣＤ８３およ
びＣＤ８６の細胞表面発現を増強する能力のグラフ図である。

【図２】 ＭＯ−ＤＣの同時刺激分子の細胞表面発現を増強するＲ−８４８の能力を示す
。

【図３】 ２μｇ／ｍｌのＲ−８４８による６時間の刺激後に種々のマーカーの細胞表面
発現によって測定したＤＣの成熟化を示す。

【図４】 一次ＭＬＲによって見たときの、Ｔ−細胞増殖およびＴ−細胞サイトカイン産
生についての、Ｒ−８４８によってＭＯ−ＤＣを処理する結果を図示する。

【図５】 破傷風トキソイドに対するＲ−８４８で処理したＭＯ−ＤＣの応答を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バシラコス，ジョン ピー． アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427， セント ポール，ピー．オー．ボックス 33427 (72)発明者 アオネン，コリー エル． アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427， セント ポール，ピー．オー．ボックス 33427 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB13 CA44 4C087 AA01 AA02 BB63 NA14 ZB21 ZB26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で未成熟な樹状細胞
   を刺激するステップを含む、前記未成熟な樹状細胞をインビトロにおいて成熟化
   する方法。
2. 【請求項２】 前記未成熟な樹状細胞が単球誘導型樹状細胞である請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記未成熟な樹状細胞が、ヒト末梢血単核細胞をＧＭ−ＣＳ
   ＦおよびＩＬ−４とともにインキュベーションすることによって得られる請求項
   １に記載の方法。
4. 【請求項４】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物が１Ｈ−イミダゾ［
   ４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物が式、 【化１】 （式中、 Ｒ₁₁は、炭素原子数１〜１０のアルキル、炭素原子数１〜６のヒドロキシアル
   キル、アシルオキシアルキルのアシルオキシ部分が炭素原子数２〜４のアルカノ
   イルオキシまたはベンゾイルオキシでありアルキル部分が炭素原子数１〜６であ
   るアシルオキシアルキル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル、この
   ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル置換基は、炭素原子数１〜４のア
   ルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲンからなる群から独立に選
   択される１つまたは２つの部分によってベンゼン環に任意に置換されるが、ただ
   し、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換される場合には、前記部分は
   合わせて炭素原子数が６以下である、からなる群から選択され、 Ｒ₂₁は、水素、炭素原子数１〜８のアルキル、ベンジル、（フェニル）エチル
   およびフェニル、このベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニル置換基は、
   炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲンか
   らなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によってベンゼン環に任意
   に置換されるが、ただし、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換される
   場合には、前記部分は合わせて炭素原子数が６未満である、からなる群から選択
   され、 各Ｒ₁は、炭素原子数１〜４のアルコキシ、ハロゲンおよび炭素原子数１〜４
   のアルキルからなる群から独立に選択され、ｎは０〜２の整数であるが、ただし
   、ｎが２である場合には、前記Ｒ₁基は合わせて炭素原子数が６以下である）の
   化合物またはその生理学的に許容されうる塩もしくは溶媒和物である請求項１に
   記載の方法。
6. 【請求項６】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物が４−アミノ−２−
   エトキシメチル−α，α−ジメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−
   １−エタノールである請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 得られる成熟した樹状細胞が未処理（ｎａｉｖｅ）の同種の
   Ｔ−細胞の増殖の少なくとも２倍の増加をもたらす、および／または樹状細胞サ
   イトカインの産生の少なくとも３倍増加を示す請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記未成熟な樹状細胞が約１６〜約２４時間刺激される請求
   項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法によって産生される成熟した樹状細胞
   集団。
10. 【請求項１０】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で樹状細胞を刺激
    するステップを含む、樹状細胞の抗原提示能力を増強する方法。
11. 【請求項１１】 疾患を治療するための細胞アジュバントを作製する方法で
    あって、 （ａ）イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物で樹状細胞を処理することによっ
    てインビトロにおいて樹状細胞を成熟化するステップと、 （ｂ）前記疾患に関連する抗原に前記成熟した樹状細胞を暴露するステップと を含む方法。
12. 【請求項１２】 前記疾患が腫瘍疾患であり、前記抗原が腫瘍細胞から誘導
    される請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記疾患が感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ
    ）によって生じ、前記抗原が前記感染因子から誘導される請求項１１に記載の方
    法。
14. 【請求項１４】 前記抗原が組換えによって誘導される請求項１１に記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 治療的に有効量の請求項１１に記載の細胞アジュバントを
    そのような治療を必要としている哺乳類に投与するステップを含む疾患を治療す
    る方法。
16. 【請求項１６】 イミダゾキノリン型ＩＲＭで刺激することによって成熟化
    した治療的に有効量の樹状細胞をそのような治療を必要としている哺乳類に投与
    するステップを含む、疾患を治療する方法。
17. 【請求項１７】 前記疾患が腫瘍疾患である請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記疾患がＴｈ２媒介性疾患である請求項１６に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 請求項１１に記載の方法によって作製される細胞アジュバ
    ント。
20. 【請求項２０】 イミダゾキノリン型免疫応答改良化合物が、式、 【化２】 （式中、 Ｒ₁₅は、水素；炭素原子数１〜１０の直鎖または分岐鎖アルキル、並びに置換
    基が、炭素原子数３〜６のシクロアルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖または
    分岐鎖アルキルによって置換された炭素原子数３〜６のシクロアルキルからなる
    群から選択される置換基で、置換された炭素原子数１〜１０の直鎖または分岐鎖
    アルキル；炭素原子数２〜１０の置換された直鎖または分岐鎖アルケニル、並び
    に置換基が、炭素原子数３〜６のシクロアルキルおよび炭素原子数１〜４の直鎖
    または分岐鎖アルキルによって置換された炭素原子数３〜６のシクロアルキルか
    らなる群から選択される置換基で、置換された炭素原子数２〜１０の直鎖または
    分岐鎖アルケニル；炭素原子数１〜６のヒドロキシアルキル；アルコキシアルキ
    ルのアルコキシ部分が炭素原子数１〜４で、アルキル部分が炭素原子数１〜６で
    あるアルコキシアルキル；アシルオキシアルキルのアシルオキシ部分が炭素原子
    数２〜４のアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、アルキル部分が
    炭素原子数１〜６であるアシルオキシアルキル；ベンジル；（フェニル）エチル
    ；およびフェニル；このベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は
    、炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲン
    からなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分によってベンゼン環に任
    意に置換されるが、ただし、前記ベンゼン環が２つの前記部分によって置換され
    る場合には、前記部分は合わせて炭素原子数が６以下である；からなる群から選
    択され、 Ｒ₂₅は、 【化３】 （式中、 Ｒ_SおよびＲ_Tは、水素、炭素原子数１〜４のアルキル、フェニル、および置換
    基が炭素原子数１〜４のアルキル、炭素原子数１〜４のアルコキシおよびハロゲ
    ンからなる群から選択される置換フェニルからなる群から独立に選択され、 Ｘは、炭素原子数１〜４のアルコキシ、アルコキシアルキルのアルコキシ部分
    が炭素原子数１〜４でアルキル部分が炭素原子数１〜４であるアルコキシアルキ
    ル、炭素原子数１〜４のヒドロキシアルキル、炭素原子数１〜４のハロアルキル
    、アルキルアミドのアルキル基が炭素原子数１〜４であるアルキルアミド、アミ
    ノ、置換基が炭素原子数１〜４のヒドロキシアルキルまたはアルキルである置換
    アミノ、アジド、クロロ、ヒドロキシ、１−モルホリノ、１−ピロリジノ、炭素
    原子数１〜４のアルキルチオからなる群から選択され、 Ｒ₅は、水素、炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルコキシ、ハロゲンお
    よび炭素原子数１〜４の直鎖または分岐鎖アルキルからなる群から選択され、ｎ
    は０〜２の整数であるが、ただし、ｎが２である場合には、前記Ｒ₅基は合わせ
    て炭素原子数が６以下である）の化合物またはその生理学的に許容されうる塩も
    しくは溶媒和物である請求項１に記載の方法。