DE202017007242U1

DE202017007242U1 - Dendritischer Zell-Potenz-Test

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Publication number: DE202017007242U1
Application number: DE202017007242.4U
Authority: DE
Original assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Current assignee: Medigene Immunotherapies GmbH
Priority date: 2017-09-05
Filing date: 2017-09-05
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2027-09-06

Abstract

Kit umfassend:- TLR7/8 Agonist,- lösliches CD40L,- ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist,- ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist,- ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist, und- ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist, wobei die für IL-10 und IL-12 spezifischen primären Bindungsproteine auf einem Träger immobilisiert sind, wobei der Träger gleichmäßig mit den für IL-10 und IL-12 spezifischen primären Bindungsproteine beschichtet ist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung der Potenz von DCs, das die folgenden Schritte umfasst: Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist, Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den stimulierten dendritischen Zellen. Dadurch kann festgestellt werden, ob die dendritischen Zellen eine gute Eignung zur Aktivierung von T-Zellen und Natürlichen Killerzellen (NK) haben. Die Erfindung umfasst zudem ein Verfahren zur Stimulierung dendritischer Zellen, das den Schritt der Stimulierung der dendritischen Zellen mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist umfasst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Antigenbeladene dendritische Zellen sind in der Lage, naive T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) vorzubereiten und können daher als Impfstoffe in der Anti-Tumor-Immuntherapie oder bei der Behandlung chronischer Virusinfektionen eingesetzt werden. Diese Tumorvakzine induzieren eine erhöhte T-Zell-Antwort gegen die krankheitsassoziierten Antigene, indem sie zytotoxische T-Lymphozyten stimulieren (Subklewe et al.). Klinische Studien haben gezeigt, dass die DC-basierte Immuntherapie sicher ist und dass die Verabreichung von in vitro modifizierten dendritischen Zellen zu einer Verstärkung der spezifischen Immunität führt.
In der Vergangenheit hat sich die Immunüberwachung nur auf die Aspekte der antwortenden T-Zellen konzentriert, während die DC-Seite der Immunantwort meist übersehen wurde. Dies kann zum Teil auf Schwierigkeiten bei der Bestimmung relevanter DC-Funktionen für die Analyse zurückzuführen sein. Um T-Zellen in einer Krebsimmuntherapie optimal zu aktivieren, müssen drei Signale von den dendritischen Zellen (DCs) geliefert werden. Erstens muss das richtige Antigen in ausreichender Menge durch MHC-Komplexe präsentiert werden, um TCRs zu aktivieren (Signal 1); zweitens müssen aktivierende kostimulatorische Moleküle wie CD80/CD86 gegenüber negativen regulatorischen Molekülen auf der DC-Oberfläche dominieren (Signal 2), um die T-Zellen positiv zu stimulieren; und drittens sollte die bioaktive Form des Zytokins IL-12 in Abwesenheit von IL-10 sezerniert werden, um die T-Zellen in eine Th1/Tc1-Richtung zu polarisieren (Signal 3). Signal 1 und Signal 2 können mit Hilfe der Durchflusszytometrie überwacht werden. Signal 3 kann durch Nachahmung der DC-T-Zellinteraktion über CD40/CD40L-Bindung gemessen werden.
Die Qualität der zur Verabreichung erzeugten dendritischen Zellen kann jedoch variieren. Diese Variation der dendritischen Zellen beeinflusst ihre Fähigkeit, T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zu aktivieren. Die Qualität der dendritischen Zellen hängt von ihrer Herkunft, ihrer Differenzierung und ihrem Reifungsstatus ab. Selbst wenn das gleiche Reifungsprotokoll und normale gesunde Spender verwendet werden, variiert die T-Zell-Aktivierungsfähigkeit zwischen den Individuen erheblich.
Daher ist es notwendig, die Eignung der dendritischen Zellen für den Einsatz als hochwirksame Impfstoffe zu überwachen.
Da die Methoden zur Prüfung der Potenz der dendritischen Zellen notwendig sein werden, um eine zuverlässige Impfstofftherapie zu ermöglichen, ist es wünschenswert, dass die Tests robust und kostengünstig sind und nach guten Herstellungsstandards (GMP) durchgeführt werden können.
Der Standardtest für die Wirksamkeit des DC-Impfstoffs ist die Hochregulation von CD80 auf der Oberfläche der dendritischen Zellen. Dieser Assay wird von den Zulassungsbehörden akzeptiert, spiegelt aber nicht die tatsächliche Funktionalität der dendritischen Zellen wider. Der CD80-Test unterscheidet nicht zwischen dendritischen Zellen mit hoher IL-12- und niedriger IL-10-Sekretion, die eine überlegene T-Zelle mit NK-Aktivierungsfähigkeit aufweisen, und Gleichstromzellen, die niedriges IL-12 und hohes IL-10 sezernieren.
Dendritische Zellen müssen aktiviert werden, um eine T-Zell-Aktivierung zu induzieren. In einem Standardassay zur Messung der Potenz dendritischer Zellen werden dendritische Zellen mit L929-Maus-Fibroblasten inkubiert, die CD40L exprimieren und bestrahlt wurden. Durch die Interaktion des auf den Fibroblasten der Maus exprimierten CD40L und des CD40 an der dendritischen Zelle werden die dendritischen Zellen aktiviert. Dieser Ansatz ist nachteilig, da die Co-Kultur der bestrahlten Mausfibroblasten und der dendritischen Zellen mühsam, zeitaufwendig, kostspielig, schwer zu standardisieren und schwer auf GMP-Standards anzuwenden ist. Außerdem ist eine Bestrahlungseinheit erforderlich.
Der Standard-Einzelzellassay für Zytokine ist die intrazelluläre Färbung und der Nachweis mittels Durchflusszytometrie. Es ermöglicht den Nachweis von IL-12 und 11-10 in einem Assay. Das Problem dieses Ansatzes besteht darin, dass die intrazelluläre Färbung keine tatsächliche Sekretion zeigt, sondern lediglich den bei der Stimulation induzierten intrazellulären Zytokinspiegel misst. Der Nachweis von interzellulären Zytokinen bedeutet daher nicht, dass diese Zytokine von den Zellen ausgeschieden werden. Wenn ein Zytokin bereits vor der Stimulation in den Zellen gespeichert ist, ist eine Ableitung der tatsächlichen Sekretion nicht möglich. Nur wenn die gemessenen Werte signifikant ansteigen, kann indirekt abgeleitet werden, dass eine Hochregulierung des Zytokins durch die Stimulation vorliegt. Die tatsächlichen Werte der sezernierten Zytokine werden nicht erfasst. Wenn der Zytokinspiegel unverändert bleibt, könnte es sein, dass es keinen Anstieg der Zytokine gibt oder dass es einen Anstieg gibt, der aber genauso schnell wie der Abbau der intrazellulären Zytokine erfolgt, so dass kein Anstieg feststellbar ist. Reife DCs können IL-10 normalerweise über einen längeren Zeitraum speichern, und wenn IL-10 sezerniert wird, wird es nicht in den intrazellulären Färbungsdaten, wie z.B. den Durchflusszytometriedaten, reflektiert.
Daher besteht ein Bedarf an Methoden zur robusten, kostengünstigen und einfachen Prüfung der dendritischen Zellpotenz, die nach guten Herstellungsstandards (GMP) durchgeführt werden können und die die Sekretion von IL-12 und IL-10 direkt messen.
ZIELE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Daher bezieht sich ein erster Aspekt der Erfindung auf eine Methode zur Bestimmung der Potenz von DCs, die die folgende Schritte umfasst: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L- und TLR7/8-Agonisten, (b) Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a).
Diese Methode erlaubt eine präzise Vorhersage der Fähigkeit der dendritischen Zellen, eine Immunantwort der T-Zellen und NK-Zellen auszulösen, da sie das faktische Sekretionsniveau der Marker-Zytokine IL-12 und IL-10 misst, was eine präzise Vorhersage der Potenz der dendritischen Zellen erlaubt. Darüber hinaus ist die Methode robust, einfach und kostengünstig.
„Potenz der dendritischen Zellen“ bezieht sich auf die Fähigkeit der dendritischen Zellen, T-Zellen und/oder NK-Zellen zu aktivieren. Dendritische Zellen mit einer hohen Potenz im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet also, dass die dendritischen Zellen in der Lage sind, T-Zellen und/oder NK-Zellen zu aktivieren. Insbesondere sind hochpotente dendritische Zellen im Rahmen der Erfindung in der Lage, T-Zellen in einen Th1/Tc1-Phänotyp zu polarisieren, der durch eine Sekretion von IFNγ durch die T-Zellen und keine oder reduzierte Expression von IL-4 derselben Zellen gekennzeichnet ist, und/oder NK-Zellen zur Expression hoher CD69-Spiegel und zur Sekretion von IFNγ zu aktivieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Messung auf Einzelzellebene durchgeführt. Die im Stand der Technik verwendeten Assays messen nur die Zellmarker in der Bulk-Kultur und können daher keine korrekte Analyse heterogener Populationen liefern. Aus den Ergebnissen ist nicht klar, ob nur eine geringe Anzahl von Zellen hohe Mengen an Zytokinen oder ob eine hohe Anzahl von Zellen geringe Mengen eines bestimmten Analyten produziert. Zudem ist es nicht möglich, zu erkennen, ob Zellen beide Analyten gleichzeitig produzieren. Um den Potenzstatus einer heterogenen dendritischen Zellpopulation gezielt zu bestimmen, ist die Einzelzellmessung vorteilhaft.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der TLR7/8-Agonist 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5 -c]chinolin-1-ethanol (R848).
Die Inkubation von dendritischen Zellen mit einer Kombination aus löslichem CD40L und R848 ist besonders vorteilhaft, da sie die Stimulation mit den CD40L-transfizierten L929-Zellen für dendritische Zellen nachahmt, die sich in ihren Reifungsbedingungen unterschieden, z.B. die mit verschiedenen Reifungscocktails inkubiert wurden. Daher stellen die von CD40L und R848 eine universelle Zusammensetzung zur Stimulierung der dendritischen Zellen dar.
Die Methode kann ferner den Schritt (c) Klassifizierung der dendritischen Zellpotenz auf der Grundlage des Sekretionsprofils von IL-12 und IL-10 umfassen. Dabei wird eine dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-12- zu IL-10-Sekretion von mehr als 1 aufweist, als dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK) klassifiziert.
Die dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und NK-Zellen kann einen Phänotyp mit hohen CD80-Expressionsniveaus, hohen CD86-Expressionsniveaus, niedrigen CD14-Expressionsniveaus und niedrigen B7H1-Expressionsniveaus aufweisen.
Dendritische Zellen mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen können T-Zellen in einen Th1/Tc1-Phänotyp polarisieren. Der Th1/Tc1-Phänotyp ist durch eine Sekretion von IFNγ durch die T-Zellen und keine oder reduzierte Expression von IL-4 gekennzeichnet.
Dendritische Zellen mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von NK-Zellen können NK-Zellen aktivieren, um hohe CD69-Spiegel zu exprimieren und IFNγ zu sezernieren.
Insbesondere umfasst Schritt (b) der Methode die folgenden Schritte:

i) Inkubation der dendritischen Zellen mit einem primären Bindeprotein für IL-10 und einem primären Bindeprotein, das für IL-12 spezifisch ist,
ii) Nachweis der Bindung des Maker-Proteins an das primäre Bindungsprotein durch ein sekundäres Bindungsprotein.

Typischerweise erfolgt die Stimulation nur durch Bindung von CD40L und TLR7/8-Agonist an die dendritischen Zellen.
Bei der Methode der Erfindung wird CD40L den dendritischen Zellen nicht durch eine Zelllinie präsentiert. Da die dendritischen Zellen durch Inkubation mit der löslichen Form von CD40L aktiviert werden, ist es nicht notwendig, die dendritischen Zellen mit einer anderen Zelllinie, wie z.B. L929 Mausfibroblasten, die CD40L exprimieren, zu kokultivieren. Dadurch kann eine mühsame, zeitaufwendige und schwer zu standardisierende Zellkultur vermieden werden. Darüber hinaus bedeutet dies, dass kein Bestrahlungsschritt durchgeführt werden muss, um sicherzustellen, dass die L929-Mauszellen nicht weiter proliferieren, was in der Tat dazu führen würde, dass die L929-Zellen die menschlichen dendritischen Zellen überwachsen, was die Durchführung des Assays unmöglich macht. Für die Methode der Erfindung ist daher eine Bestrahlungseinheit, die nicht in jedem Krankenhaus vorhanden ist, nicht notwendig.
In einigen Ausführungsformen sind die primären Bindungsproteine, die spezifisch für IL-10 und IL-12 sind, auf einem Träger immobilisiert. Dabei kann der Träger gleichmäßig mit den primären Bindungsproteinen für IL-10 und IL-12 beschichtet werden. Dies ermöglicht die Messung der Sekretion von IL-10 und IL-12 auf Einzelzellebene. Typischerweise ist der Träger eine Multi-Well-Platte. In der Regel ist das primäre Bindungsprotein ein Antikörper. Das sekundäre Bindungsprotein kann auch ein Antikörper sein.
Das sekundäre Bindungsprotein kann mit einem Detektionsmarker markiert werden. Typischerweise ist das sekundäre Bindungsprotein mit einer fluoreszierenden funktionellen Gruppe oder Marker markiert.
In der Regel handelt es sich bei den bei der Methode der Erfindung verwendeten dendritischen Zellen um gereifte dendritische Zellen. Gereifte dendritische Zellen, wenn sie mit der erfindungsgemäßen Methode stimuliert werden, drücken das erforderliche Verhältnis von IL-12 zu IL-10 aus. Die Reifung der dendritischen Zellen kann z.B. durch Inkubation mit einem Reifungscocktail erfolgen.
Vorzugsweise werden dendritische Zellen in der Methode der Erfindung verwendet, die durch einen Reifungscocktail aus IL1β, TNFα, INFγ, TLR7/8-Agonist und Prostaglandin E2 gereift sind.
Mehr bevorzugt werden dendritische Zellen in der Methode der Erfindung verwendet, die durch folgende Schritte gereift sind:

i) Bereitstellung von Monozyten; ii) Inkubation der Monozyten aus Schritt i) mit IL-4 und GM-CSF; iii) Inkubation der Monozyten aus Schritt ii) mit IL-4 und GM-CSF in Kombination mit einem Reifungscocktail, der IL1β, TNFα, INFγ, TLR7/8-Agonist und Prostaglandin E2 enthält.

Die Inkubation von Schritt ii) kann mindestens 2 Tage dauern. Die Inkubation von Schritt iii) kann mindestens 12 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, dauern.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stimulierung dendritischer Zellen, das folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung dendritischer Zellen, und b) Stimulierung der dendritischen Zellen mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von löslichen CD40L- und TLR7/8-Agonisten zur Stimulierung dendritischer Zellen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Kit, das aus folgenden Teilen besteht:

- TLR7/8 Agonist,
- lösliches CD40L,
- ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist,
- ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist,
- ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist, und
- ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist.

Das Kit kann zum Beispiel folgende Komponenten umfassen:

(i) eine Zusammensetzung, die TLR7/8-Agonist und CD40L enthält,
(ii) eine Zusammensetzung, die ein primäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein primäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst, und
(iii) eine Zusammensetzung, die ein sekundäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein sekundäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst.

Das primäre Bindungsprotein kann vorzugsweise ein Antikörper sein und/oder wobei das sekundäre Bindungsprotein ein Antikörper ist. Typischerweise ist der TLR7/8-Agonist R848.
Figurenliste

: DC-Stimulation
: Drei Signale sind für eine optimale DC-Stimulation erforderlich DCs sind starke Aktivatoren von T-Zellen und beeinflussen den Charakter der Effektor-T-Zelle durch die Interaktion zwischen den DCs und der T-Zelle. Für eine optimale Aktivierung müssen drei Signale von den DCs geliefert werden Signal 1: Antigenpräsentation über MHC/Peptid und den entsprechenden TCR Signal 2: Aktivieren des ko-stimulatorischen Signals CD80/CD86, das CD28 aktiviert Signal 3: Sekretion von aktivierenden Zytokinen, z.B. IL-12 und Abwesenheit von hemmenden Zytokinen, z.B. IL-10; adaptiert von De Koker, 2011.
: In einem konventionellen Signal 3 Assay werden DCs mit einer murinen Fibroblasten-Zelllinie L929, die humanes CD40L für 24 h exprimiert, kokultiviert. Die in den Kulturüberstand sezernierten Zytokine IL-12p70 und IL-10 werden mit einem kommerziellen Sandwich-ELISA (z.B. R&D-Systems) bestimmt. Der Assay ist nachteilig, da er eine Bestrahlungseinheit erfordert, eine aufwendige Zellkultur evolviert, was die Verwendung des Assays in einer GMP-Anlage erschwert. Außerdem ist der Test auf Einzelzellebene spezifisch.
bis : Vergleich zwischen konventioneller und CD40L-Stimulation von dendritischen Zellen in einem IL-10/IL-12-ELISA
zeigt die IL-10/IL-12-Sekretion in DC, die mit dem MDG-Cocktail gereift und mit CD40L in verschiedenen Kombinationen mit R848, IFN-γ und LPS stimuliert wurde, im Vergleich zum herkömmlichen Signal 3 Assay. (IL-10/IL-12 ELISA)
zeigt die gleichen Experimente mit Jonuleit-gereiften DCs. In beiden Assays zeigt die CD40L-Stimulation vergleichbare Ergebnisse mit dem konventionellen Signal 2 Assay in Bezug auf die IL-12-Sekretion, jedoch nicht für IL-10, wenn die CD40L-Stimulation allein verwendet wird. (IL-10/IL-12 ELISA)
Die und zeigen, dass R848 als kostimulatorisches Reagenz für eine optimale IL-10-Sekretion insbesondere bei unreifen DCs (iDCs) und Jonuleit-reifen DCs notwendig ist. zeigt IL-10/IL-12-ELISA-Daten. zeigt die Daten die durch die Methode der Erfindung generiert wurden (ELISPOT Sig.3 CD40L)
bis : Doppelfarben-IL-10/IL-12-ELISPOT, aber nicht Durchflusszytometrie zeigt eine mit dem ELISA vergleichbare Potenz der dendritischen Zellen
zeigt die ELISPOT-Daten von zwei verschiedenen Spendern für IL-12 und IL-10. Die Stimulation wurde mit 20000 Zellen und 1µl CD40L/100µl ([v/v]) Medium zusammen mit R848 durchgeführt. Spender 1 ist ein Produzent mit hohem IL-10-Gehalt, während Spender 2 hauptsächlich IL-12 produziert.
zeigt die gleichen Spender in einem herkömmlichen Signal-3-Test. Beide Assays zeigen sehr vergleichbare Ergebnisse. Im Gegensatz zum dc IL-10/IL-12 ELISPOT konnte die flusszytometrische Analyse von intrazellulärem IL-12 und IL-10 nur vergleichbare Ergebnisse zu den IL-12-Sekretionsdaten zeigen, nicht aber für IL-10. Dies ist wahrscheinlich auf die intrazelluläre IL-10-Speicherung zurückzuführen.
zeigt einen Vergleich der IL-12- und IL-10-Sekretion nach einem konventionellen Signal-3-Assay, der mit einem ELISA oder einer entsprechenden intrazellulären Durchflusszytometrie (FACS)-Färbung von IL-12 und IL-10 von Zellen desselben Spenders ermittelt wurde. Die Ergebnisse der intrazellulären Färbung, wie sie durch FACS ermittelt wird, sind nicht mit der Sekretion, wie sie durch ELISA ermittelt wird, vergleichbar, insbesondere im Hinblick auf IL-10. Dies lässt sich dadurch erklären, dass FACS das gesamte intrazellulär gespeicherte IL-10 misst, während ELISA sezerniertes IL-10 nachweist.
Einzelzell-IL-10/IL-12-Assay (ELISPOT) In der oberen Reihe zeigt das erste Bild die Anzahl der IL12 produzierenden reifen dendritischen Zellen (die mit unserem eigenen Cocktail gereift sind), das zweite Bild die Anzahl der IL-10 produzierenden Zellen in der gleichen Vertiefung und das dritte Bild die Anzahl der Spots doppelt positiver Zellen. In der zweiten Zeile unten sind die entsprechenden Daten für unreife dendritische Zellen dargestellt. (Human IL-10/IL-12 Double-Color ELISPOT-Kit (CTL); Zellzahl: 20.000 Zellen/Vertiefung, 1,1µl/110µl CD40L+R848) Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass unreife DCs (iDCs) die Hauptquelle von IL-10 bei gesunden Spendern sind.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevor die Erfindung im Hinblick auf einige ihrer bevorzugten Ausführungsformen im Detail beschrieben wird, werden die folgenden allgemeinen Definitionen gegeben.
Die vorliegende Erfindung, wie sie im Folgenden veranschaulicht wird, kann in geeigneter Weise praktiziert werden, wenn kein Element oder keine Elemente, Einschränkungen oder Beschränkungen vorhanden sind, die hier nicht ausdrücklich offenbart werden.
Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf bestimmte Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf bestimmte Figuren beschrieben, aber die Erfindung ist nicht darauf beschränkt, sondern nur durch die Ansprüche.
Wenn der Begriff „umfassend“ in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, schließt er andere Elemente nicht aus. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „bestehend aus“ als bevorzugte Verkörperung des Begriffs „bestehend aus“ angesehen. Wenn im Folgenden eine Gruppe so definiert wird, dass sie mindestens eine bestimmte Anzahl von Ausführungsformen umfasst, ist dies auch so zu verstehen, dass eine Gruppe, die vorzugsweise nur aus diesen Ausführungsformen besteht, offengelegt wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „erhalten“ als bevorzugte Verkörperung des Begriffs „erhältlich“ angesehen. Wenn im Folgenden z.B. ein Antikörper als aus einer bestimmten Quelle erhältlich definiert wird, so ist darunter auch ein Antikörper zu verstehen, der aus dieser Quelle gewonnen wird.
Wenn ein unbestimmter oder bestimmter Artikel verwendet wird, wenn auf ein Einzelsubstantiv Bezug genommen wird, z.B. „ein“, „einer“, „eines“ oder „der“, „die“, „das“ schließt dies eine Mehrzahl dieses Substantivs ein, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist. Die Begriffe „ungefähr“ oder „etwa“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnen ein Intervall der Genauigkeit, das der Fachmann versteht, um die technische Wirkung des betreffenden Merkmals noch zu gewährleisten. Der Begriff bezeichnet in der Regel eine Abweichung vom angegebenen Zahlenwert von ±10%, vorzugsweise von ±5%.
Fachbegriffe werden nach ihrem gesunden Menschenverstand verwendet. Wenn bestimmten Begriffen eine bestimmte Bedeutung übertragen wird, werden im Folgenden Definitionen von Begriffen angegeben, in deren Zusammenhang die Begriffe verwendet werden.
Im Allgemeinen bezieht sich die Erfindung auf eine Methode zur Bestimmung der Potenz von DCs, die folgende Schritte umfasst: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und optional TLR7/8-Agonist, (b) Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a).
Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung der Potenz von DCs, das folgende Schritte umfasst: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L- und TLR7/8-Agonisten, (b) Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a).
Dendritische Zellen exprimieren CD40 an der Zelloberfläche. CD40-CD-40L Interaktion stimulieren dendritische Zellen. „Lösliches CD40L“ bezieht sich auf eine modifizierte Version des Membranassoziates CD40L (auch CD154 oder CD40 Ligand genannt). Der Begriff „lösliches CD40L“ schließt verkürzte Versionen von CD40L ein, die seine Transmembrandomäne nicht enthalten. Der Begriff „lösliches CD40L“ umfasst auch CD40L-Oligomere, insbesondere modifizierte CD40L-Oligomere, wie z.B. trimere CD40-Ligandmoleküle, die über die Kollagendomäne von Adiponectin/ACRP30/AdipoQ, wie z.B. MEGACD40L (Enzo Life Science GmbH, Lörrach, Deutschland), künstlich verknüpft sind. Das lösliche CD40L kann möglicherweise die natürliche, membranunterstützte Aggregation von CD40L stimulieren. CD40L kann in einer Konzentration von 10 ng/ml bis 100 µg/ml verwendet werden, vorzugsweise 1 ng/ml bis 10 µg/ml, wie z.B. 1 µg/ml. Die Inkubation mit CD40L kann mindestens 12 h, vorzugsweise 12 h bis 48 h, besser noch etwa 24 h dauern.
TLR7/8 wird auch als Toll-like-Rezeptor 7/8 bezeichnet. Vorzugsweise ist der TLR7/8-Agonist TLR7/8-Agonist ist 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]chinolin-1-ethanol (R848), der in WO 00/47719 beschrieben ist und von Invivogen, San Diego, USA, bezogen werden kann. Der TLR7/8-Agonist, vorzugsweise R848, könnte in einer Konzentration zwischen 0,2 und 5 µg/ml, vorzugsweise 0,5 µg/ml bis 2 µg/ml, bevorzugter 1 µg/ml, verwendet werden. Die Inkubation mit TLR7/8-Agonist, insbesondere R848, kann mindestens 12 h, vorzugsweise 12 h bis 48 h, besser gesagt etwa 24 h dauern.
Der TLR7/8-Agonist und CD40L können den dendritischen Zellen in Kombination oder nacheinander zugegeben werden.
Die Inkubation mit der Kombination von CD40L und TLR7/8-Agonist ist besonders vorteilhaft, da sie die Stimulation mit den CD40L-transfizierten L929-Zellen für dendritische Zellen nachahmt, die sich in ihren Reifungsbedingungen unterschieden, z.B. die mit verschiedenen Reifungscocktails inkubiert wurden. Daher stellen CD40L und TLR7/8-Agonist eine universelle Zusammensetzung zur Stimulierung von dendritischen Zellen dar.
Wichtig ist, dass die vorliegende Erfindung die Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen misst. Dies bedeutet, dass die IL-12- und IL-10-Moleküle, die in das Medium sezerniert werden, gemessen werden und nicht der intrazelluläre IL-12- und IL-10-Gehalt. Wie bereits oben beschrieben, entspricht der intrazelluläre Gehalt der Interleukine nicht unbedingt den sezernierten Werten. Dies gilt insbesondere für IL-10.
Typischerweise können die dendritischen Zellen auf Trägerplatten plattiert werden, die mit dem primären Bindungsprotein IL-10 und dem primären Bindungsprotein IL-12 beschichtet sind. Die stimulierende Lösung, die CD40L und optional TLR7/8-Agonist enthält, kann nach der Plattierung oder vor der Plattierung der dendritischen Zellen zugegeben werden. Nach der Inkubationszeit wird das sekundäre Bindungsprotein hinzugefügt. Die Inkubationszeit kann 6 bis 48 h, vorzugsweise 12 bis 36 h, am besten 24 h betragen.
Die Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 bezieht sich also auf den Nachweis der Markerproteine, durch Inkubation mit spezifischen Bindungsproteinen an IL-10 und IL-12, die den Nachweis der Markerproteine vermitteln. Ein Bindungsprotein kann also durch eine Markierung modifiziert werden, z.B. durch eine Fluoreszenzmarkierung oder durch ein Enzym, das eine Reaktion fördert, die den Nachweis des Markerproteins unter Verwendung eines spezifischen Substrats ermöglicht, z.B. Meerrettich Peroxidase für IL-10 und alkalische Phosphatase für IL-12).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Messung auf Einzelzellebene durchgeführt. Jede Methode, die in der Lage ist, Interleukin-Sekretionen auf Einzelzellniveau zu messen, könnte angewendet werden. Diese Methode misst also nicht die Interleukin-Sekretion in der Bulk-Kultur, d.h. die Summe der Interleukine in einer Zellpopulation, sondern misst die Interleukin-Sekretion individuell pro Zelle. Wie bereits oben erwähnt, ist dies vorteilhaft, da der Interleukinstatus heterogener Zellpopulationen, die Zellen mit unterschiedlichen Interleukinsekretionen enthalten, genauer analysiert werden kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich also auf eine Methode zur Bestimmung der Potenz von DCs, die folgende Schritte umfasst: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und R848, (b) Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a),
wobei der Assay auf Einzelzellebene durchgeführt wird.
Die Methode kann ferner den Schritt (c) Klassifizierung der dendritischen Zellpotenz auf der Grundlage des Sekretionsprofils von IL-12 und IL-10 umfassen. Mit anderen Worten, die Methode umfasst Schritt (c) Klassifizierung, ob die dendritische Zelle eine hohe Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und/oder NK-Zellen hat. Dabei wird eine dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-12- zu IL-10-Sekretion von mehr als 1 aufweist, als dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und NK-Zellen klassifiziert. Vorzugsweise wird die dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-12- zu IL-10-Sekretion von mehr als 5 aufweist, wie z.B. mehr als 10, mehr als 20, mehr als 30, mehr als 40, mehr als 50, mehr als 60, mehr als 70, mehr als 80, als dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und/oder NK-Zellen klassifiziert. Das Verhältnis von IL-12 zu IL-10 liegt in der Regel unter 10.000, z.B. unter 5.000, weniger als 1.000 oder weniger als 500.
Umgekehrt wird eine dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-10- zu IL-12-Sekretion von mehr als 1 aufweist, als dendritische Zelle klassifiziert, die die Immunantwort hemmt.
Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf eine Methode zur Bestimmung der Potenz von DCs, die folgende Schritte umfasst: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und R848, (b) Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a),
(c) Klassifizierung, ob die dendritische Zelle eine hohe Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und/oder NK-Zellen hat; wobei eine dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-12- zu IL-10-Sekretion von mehr als 1 zeigt, als dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und/oder NK-Zellen klassifiziert wird;
wobei der Assay auf Einzelzellebene durchgeführt wird.
Die dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und NK-Zellen kann einen Phänotyp mit hohen CD80-Expressionsniveaus, hohen CD86-Expressionsniveaus, niedrigen CD14-Expressionsniveaus und niedrigen B7H1-Expressionsniveaus aufweisen. (Lichtenegger et al.; Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeways Immunobiologie).
Dendritische Zellen mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen können T-Zellen in einen Th1/Tc1-Phänotyp polarisieren. Der Th1/Tc1-Phänotyp ist durch eine Sekretion von IFNγ durch die T-Zellen und keine oder reduzierte Expression von IL-4 gekennzeichnet. Dendritische Zellen mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von NK-Zellen können NK-Zellen aktivieren, um hohe CD69-Spiegel zu exprimieren und IFNγ zu sezernieren. (Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeway's Immunbiologie).
Typischerweise erfolgt die Stimulation nur durch Bindung von löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist an die dendritischen Zellen. Das bedeutet, dass keine weiteren Stimuli, z.B. Inkubation mit anderen Molekülen, zur Stimulation der dendritischen Zellen notwendig sind. Insbesondere ist es nicht notwendig, dass das Transmembranprotein CD40L den dendritischen Zellen in seiner in der Zellmembran verankerten Transmembranform präsentiert wird, wie z.B. bestrahlte L929-Mausfibroblasten, die CD40L exprimieren. Daher ist es nicht notwendig, dass die Methode einen Bestrahlungsschritt beinhaltet.
Insbesondere umfasst Schritt (b) der Methode die folgenden Schritte:

Der Nachweis von Schritt ii) kann durch Bindung des sekundären Bindungsproteins an den Komplex aus Markerprotein und primärem Bindungsprotein erfolgen. Alternativ könnte das sekundäre Bindungsprotein ausschließlich an das primäre Bindungsprotein binden (ohne Interaktion mit dem primären Bindungsprotein). In diesem Fall werden aufgrund von Waschschritten vor Schritt ii) Markerproteine, die nicht an das primäre Bindungsprotein gebunden sind, entfernt.
In einigen Verkörperungen sind die primären Bindungsproteine, die spezifisch für IL-10 und IL-12 sind, auf einem Träger immobilisiert. Dabei kann der Träger gleichmäßig mit den primären Bindungsproteinen für IL-10 und IL-12 beschichtet werden. Dies ermöglicht die Messung der Sekretion von IL-10 und IL-12 auf Einzelzellebene. Typischerweise ist der Träger eine Multi-Well-Platte. In der Regel ist das primäre Bindungsprotein ein Antikörper. Das sekundäre Bindungsprotein kann auch ein Antikörper sein.
Das sekundäre Bindungsprotein kann mit einem Detektionsmarker markiert werden. Typischerweise wird das sekundäre Bindungsprotein durch ein Enzym fluoreszenzmarkiert oder modifiziert, das eine Reaktion fördert, die den Nachweis des Markerproteins ermöglicht.
In der Regel handelt es sich bei den dendritischen Zellen, die bei der Methode der Erfindung verwendet werden, um gereifte dendritische Zellen. Gereifte dendritische Zellen, wenn sie mit CD40L (und dem TLR7/8-Agonisten) stimuliert werden, exprimieren das erforderliche Verhältnis von IL-12 zu IL-10. Die Reifung der dendritischen Zellen kann z.B. durch Inkubation mit einem Reifungscocktail erfolgen.
Typischerweise können reife dendritische Zellen durch ein Verfahren erzeugt werden, das die folgenden Schritte umfasst: i) Bereitstellung von Monozyten; ii) Inkubation der Monozyten aus Schritt i) mit IL-4 und GM-CSF; iii) Inkubation der Monozyten aus Schritt ii) mit IL-4 und GM-CSF in Kombination mit einem Reifungscocktail.
Der Reifungscocktail kann mindestens eine der Komponenten aus der Gruppe bestehend aus IL-β, TNF-α, IFN-γ, TLR7/8-Agonist, PGE2- und TLR3-Agonist oder eine Kombination davon umfassen. Der TLR7/8-Agonist kann R848 oder CL075 sein. Der TLR3-Agonist kann poly(I:C) sein. In einer bestimmten Ausführungsform kann der Reifungscocktail eine Kombination aus ILIβ, TNFα, INFγ, TLR7/8-Agonist und Prostaglandin E2 umfassen. Der TLR7/8-Agonist kann R848 oder CL075 sein.
Vorzugsweise ist der TLR7/8-Agonist R848.
Der Reifungscocktail kann 1-50 ng/ml TNFα, 1-50 ng/ml IL-1β, 500-10.000 U/ml INFγ, 0,2-5 µg/ml TLR7/8-Agonist und 50-5.000 ng/ml Prostaglandin E2 PG und optional 10-50 ng/ml TLR3-Agonist; bevorzugterweise kann der Cocktail 10 ng/ml TNF-α, 10 ng/ml IL-1β, 5.000 U/ml IFNγ, 1 ug/ml R848 und 250 ng/ml Prostaglandin E2 enthalten.
Die Inkubation von Schritt ii) kann 3 Tage dauern. Die Inkubation von Schritt iii) kann mindestens 24 Stunden dauern.
Alternativ könnte auch der Jonuleit-Cocktail verwendet werden. Der Jonuleit-Cocktail wird in Jonuleit et al. beschrieben und umfasst TNFα, IL-lβ, IL-6 und Prostaglandin E2. Der Jonuleit-Cocktail besteht insbesondere aus 10ng/ml TNF-alpha, 10ng/ml IL-1β, 15ng/ml IL-6 und 1000ng/ml Prostaglandin E2.
Die dendritischen Zellen können von Spendern stammende antigenpräsentierende Zellen sein, z.B. isolierte Monozyten, die zu dendritischen Zellen gereift sind. Gesättigte dendritische Zellen können durch die Methode der Erfindung optimal stimuliert werden.
Typischerweise sind die dendritischen Zellen autologe Zellen, d.h. von einem Patienten gewonnene Zellen, die entsprechend der Lehre der Erfindung behandelt und dann dem gleichen Patienten wieder verabreicht werden. Beispielsweise werden Monozyten von einem Patienten isoliert, zu dendritischen Zellen gereift und wie hier beschrieben behandelt, um das gewünschte Antigen zu exprimieren, und dann dem gleichen Patienten verabreicht.
Dem Fachmann sind die Reifungsprotokolle für dendritische Zellen bekannt. Die Reifung von dendritischen Zellen, die zur Immuntherapie der akuten Myloid-Leukämie verwendet werden, wird in Subklewe et al. offengelegt; Bürdek et al. beschreiben ein dreitägiges Reifungsprotokoll für dendritische Zellen.
Monozyten können z.B. periphere mononukleäre Blutzellen sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Stimulierung dendritischer Zellen, das folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung dendritischer Zellen, und b) Stimulierung der dendritischen Zellen mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Bausatz, der aus folgenden Teilen besteht:

Das für das Markerprotein spezifische sekundäre Bindungsprotein (entweder IL-12 oder IL-10) kann den Komplex aus dem Markerprotein und dem primären Bindungsprotein binden oder nur an das primäre Bindungsprotein (ohne Wechselwirkung mit dem primären Bindungsprotein) binden.
Der Bausatz kann zum Beispiel folgende Komponenten umfassen:

Das primäre Bindungsprotein kann vorzugsweise ein Antikörper sein und/oder das sekundäre Bindungsprotein ist ein Antikörper. Typischerweise ist der TLR7/8-Agonist R848.
Der Begriff „Bindungsprotein“ umfasst nicht nur Antikörper und deren Bindungsfragmente, sondern auch andere Moleküle, wie Nicht-Antikörper-Protein-Gerüstproteine und Aptamere.
Die Antikörper können anhand ihrer schweren Kette in fünf Hauptklassen unterschieden werden, die Antikörper IgM (µ), IgD (δ), IgG (y), IgA (α) und IgE (ε), wobei die IgG-Antikörper den grössten Anteil ausmachen. Die Immunglobuline lassen sich darüber hinaus anhand ihrer leichten Ketten in die Isotypen κ und λ differenzieren.
Experimente
Dendritische Zellen, die mit MDG oder Jonuleit-Cocktail gereift und mit CD40L allein und in Kombination mit R848/IFN und LPS stimuliert wurden
Die Monozyten werden mit adhärenter Isolierung isoliert, gefolgt von der Erzeugung dendritischer Zellen für 3 Tage unter Verwendung von IL-4 und GMSCF. Danach wurden dendritische Zellen mit MDG-Cocktail und IL-4 und GMCSF für 24 h gereift. Im Falle von Jonuleit-Cocktails wurden die Zellen für 6 Tage mit IL-4 und GMSCF inkubiert. Dann wurden die Zellen mit dem Jonuleit-Cocktail (und IL-4 und GMCSF) für 24 h inkubiert. Für alle Assays wurden gefrorene dendritische Zellen verwendet, die am Tag vor dem Assay aufgetaut und in DC-Medium bis zum Beginn des Assays inkubiert wurden. Die Stimulation wird für 24 Stunden in einer 96-Well-Platte durchgeführt. Dafür wurden pro Vertiefung 11.000 dendritische Zellen ausgesät. 1,1µl CD40L in 110µl DC Medium (VLE RPMI 1640 mit 1,5% Humanserum)1 µg/ml LPS und R848 wurden hinzugefügt.
Der Elisa-Test wurde nach den Protokollen des humanen IL-10, IL12p70 bzw. des DuoSet ELISA-Kits (R&D Systems, Inc, Minneapolis, USA) durchgeführt.
IL-10/IL-12 Elispot-Test
Der IL-10/IL-12 Elispot-Test wurde nach dem Protokoll des Human IL-10/IL-12 Double-Color ELISPOT-Kits von (C.T.L. Cellular technology Limited, Cleaveland, USA) durchgeführt.
Jonuleit-Cocktail
10ng/ml TNF, 10 ng/ml IL-lß, 15 ng/ml IL-6 und 1.000 ng/ml Prostaglandin E2 (= PGE2)
MDG-Cocktail
10 ng/ml TNF-α,10 ng/ml IL-1β, 5.000 U/ml IFNγ, 1 µg/ml R848 und 250 ng/ml
Prostaglandin E2.
Die Beschreibung umfasst ferner die folgenden Aspekte

Aspekt 1. Verfahren zur Bestimmung der Potenz von DCs, die die folgenden Schritte umfasst:
1. (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist,
2. (b) die Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a).
Aspekt 2. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, bei dem die Messung auf Einzelzellenebene durchgeführt wird.
Aspekt 3. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei der TLR7/8-Agonist 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]chinolin-1-ethanol (R848) ist.
Aspekt 4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Aspekte, wobei das Verfahren ferner den folgenden Schritt umfasst:
- (c) Klassifizierung der dendritischen Zellpotenz auf der Grundlage des Sekretionsprofils von IL-12 und IL-10.
Aspekt 5. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei eine dendritische Zelle, die ein Verhältnis von IL-12- zu IL-10-Sekretion von mehr als 1 aufweist, als dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK) klassifiziert wird.
Aspekt 6. Verfahren nach Aspekt 5, wobei die dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen und NK-Zellen einen Phänotyp mit hohen CD80-Expressionsniveaus, hohen CD86-Expressionsniveaus, niedrigen CD14-Expressionsniveaus und niedrigen B7H1-Expressionsniveaus aufweisen.
Aspekt 7. Verfahren nach Aspekt 5 oder 6, wobei die dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von T-Zellen; T-Zellen in einen Th1/Tc1-Phänotyp polarisiert.
Aspekt 8. Verfahren nach Aspekt 7, wobei der Th1/Tc1-Phänotyp durch eine Sekretion von IFNγ durch die T-Zellen und keine oder reduzierte Expression von II,-4 gekennzeichnet ist.
Aspekt 9. Verfahren nach den Aspekten 5 bis 8, wobei die dendritische Zelle mit einer hohen Fähigkeit zur Aktivierung von NK-Zellen, NK-Zellen aktiviert hohe Mengen an CD69 zu exprimieren und IFNγ zu sezernieren.
Aspekt 10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Aspekte, wobei Schritt (b) die folgenden Schritte umfasst:
1. i) Inkubation der dendritischen Zellen mit einem primären Bindeprotein für IL-10 und einem primären Bindeprotein, das für IL-12 spezifisch ist,
2. ii) Nachweis der Bindung des Marker-Proteins an das primäre Bindungsprotein durch ein sekundäres Bindungsprotein.
Aspekt 11. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, wobei die Stimulation nur durch Bindung von löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist an die dendritischen Zellen erfolgt.
Aspekt 12. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, bei dem CD40L den dendritischen Zellen nicht durch eine Zelllinie präsentiert wird.
Aspekt 13. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, bei dem die dendritischen Zellen nicht mit einer anderen Zelllinie kokultiviert werden.
Aspekt 14. Verfahren nach einem der vorstehenden Aspekte, bei dem kein Bestrahlungsschritt angewendet wird.
Aspekt 15. Verfahren nach den Aspekten 10 bis 14, bei dem die primären, für IL-10 und IL-12 spezifischen Bindungsproteine auf einem Träger immobilisiert werden.
Aspekt 16. Verfahren nach Aspekt 15, wobei der Träger gleichmäßig mit den primären Bindungsproteinen für IL-10 und IL-12 beschichtet wird.
Aspekt 17. Verfahren nach Aspekt 15 oder 16, wobei der Träger eine Multiwell-Platte ist.
Aspekt 18. Methode nach einem der Aspekte 10 bis 17, bei der das primäre Bindungsprotein ein Antikörper ist.
Aspekt 19. Methode nach einem der Aspekte 10 bis 18, bei der das sekundäre Bindungsprotein ein Antikörper ist.
Aspekt 20. Methode nach den Aspekten 10 bis 19, bei der das sekundäre Bindungsprotein fluoreszenzmarkiert wird.
Aspekt 21. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die dendritischen Zellen gereifte dendritische Zellen sind.
Aspekt 22. Verfahren nach Aspekt 21, wobei die Reifung der dendritischen Zellen durch Inkubation mit einem Reifungscocktail erfolgt.
Aspekt 23. Verfahren zur Stimulierung dendritischer Zellen, das die folgenden Schritte umfasst:
1. a) die Bereitstellung von dendritischen Zellen, und
2. b) Stimulierung der dendritischen Zellen mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist.
Aspekt 24. Verwendung von löslichen CD40L- und TLR7/8-Agonisten zur Stimulation dendritischer Zellen.
Aspekt 25. Kit umfassend:
- - TLR7/8 Agonist,
- - lösliches CD40L,
- - ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist,
- - ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist,
- - ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist, und
- - ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist.
Aspekt 26. Kit gemäß Aspekt 25 umfassend:
1. (i) eine Zusammensetzung, die TLR7/8-Agonist und CD40L enthält,
2. (ii) eine Zusammensetzung, die ein primäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein primäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst, und
3. (iii) eine Zusammensetzung, die ein sekundäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein sekundäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst.
Aspekt 27. Kit nach Aspekt 25 oder 26, wobei das primäre Bindungsprotein ein Antikörper ist und/oder wobei das sekundäre Bindungsprotein ein Antikörper ist.
Aspekt 28. Verfahren nach Aspekt 23, Verwendung nach Aspekt 24, Kit nach den
Aspekten 25 bis 27, wobei der TLR7/8-Agonist R848 ist.

REFERENZEN

Bürdek „Three-day dendritic cells for vaccine developement: Antigen uptake; processing and presentation „Journal of Translational Medicine (2010) 8:90
De Koker, et al „Designing polymeric particles for antigen delivery" Chem Soc Rev 2011 40(1):320-39; 2011)
Jonuleit et al. „Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions." Eur J Immunol., (1997), vol. 27(12): 3135-42
Lichtenegger „CD86 and IL-12p70 are key players for T Helper 1 polarization and Natural Killer Cell Activation by Tell-Like Receptor-Induced Dendritic Cells" PLOS ONE, vol. 7(9) (e44266)
Murphy K. & Weaver C.: Janeway's Immunobiology 9th Edition, Garland Science
Subklewe et al. „New generation dendritic cell vaccine for immunotherapy of acute myeloid leukemia." Cancer Immunol Immunother (2014) 63: 1093-1103

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 0047719 [0043]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Bürdek „Three-day dendritic cells for vaccine developement: Antigen uptake; processing and presentation „Journal of Translational Medicine (2010) 8:90 [0081]
De Koker, et al „Designing polymeric particles for antigen delivery“ Chem Soc Rev 2011 40(1):320-39; 2011) [0081]
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Lichtenegger „CD86 and IL-12p70 are key players for T Helper 1 polarization and Natural Killer Cell Activation by Tell-Like Receptor-Induced Dendritic Cells“ PLOS ONE, vol. 7(9) (e44266) [0081]
Murphy K. & Weaver C.: Janeway's Immunobiology 9th Edition, Garland Science [0081]
Subklewe et al. „New generation dendritic cell vaccine for immunotherapy of acute myeloid leukemia.“ Cancer Immunol Immunother (2014) 63: 1093-1103 [0081]

Claims

Kit umfassend: - TLR7/8 Agonist, - lösliches CD40L, - ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist, - ein primäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist, - ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-10 ist, und - ein sekundäres Bindungsprotein, das spezifisch für IL-12 ist, wobei die für IL-10 und IL-12 spezifischen primären Bindungsproteine auf einem Träger immobilisiert sind, wobei der Träger gleichmäßig mit den für IL-10 und IL-12 spezifischen primären Bindungsproteine beschichtet ist.
Kit gemäß Schutzanspruch 1, umfassend: (i) eine Zusammensetzung, die TLR7/8-Agonist und CD40L enthält, (ii) eine Zusammensetzung, die ein primäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein primäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst, und (iii) eine Zusammensetzung, die ein sekundäres, für IL-10 spezifisches Bindungsprotein und ein sekundäres, für IL-12 spezifisches Bindungsprotein umfasst.
Kit nach Schutzanspruch 25 oder 26, wobei das primäre Bindungsprotein ein Antikörper ist.
Kit nach einem der vorhergehenden Schutzansprüchen, wobei das sekundäre Bindungsprotein ein Antikörper ist.
Kit nach einem der vorhergehenden Schutzansprüchen, bei der das sekundäre Bindungsprotein fluoreszenzmarkiert wird.
Kit nach einem der vorhergehenden Schutzansprüchen, wobei der TLR7/8-Agonist R848 ist.
Kit nach einem der vorhergehenden Schutzansprüchen, wobei der Träger eine Multiwell-Platte ist.
Kit nach einem der der vorhergehenden Schutzansprüchen, wobei der TLR7/8-Agonist 4-Amino-2-ethoxymethyl-α,α-dimethyl-1H-imidazol[4,5-c]chinolin-1-ethanol (R848) ist.
Kit nach einem der vorhergehenden Schutzansprüchen, wobei das Kit zur Durchführung der folgenden Schritte geeignet ist: (a) Stimulierung dendritischer Zellen durch Inkubation mit löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist, (b) die Messung der Sekretion der Markerproteine IL-10 und IL-12 aus den dendritischen Zellen von (a).
Kit nach einem der vorstehenden Schutzansprüchen, wobei das Kit geeignet ist die Stimulation von dendritischen Zellen nur durch Bindung von löslichem CD40L und TLR7/8-Agonist zu bewirken.
Kit nach einem der vorstehenden Schutzansprüchen, wobei das Kit geeignet ist Messungen auf Einzelzellebene durchzuführen.