DE3687705T2 - Molekulare zuechtung. - Google Patents

Molekulare zuechtung.

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DE3687705T2 DE8686905070T DE3687705T DE3687705T2 DE 3687705 T2 DE3687705 T2 DE 3687705T2 DE 8686905070 T DE8686905070 T DE 8686905070T DE 3687705 T DE3687705 T DE 3687705T DE 3687705 T2 DE3687705 T2 DE 3687705T2
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Es ist eine umfassende Literatur entwickelt worden, die die Möglichkeit aufzeigt, Polypeptidsequenzen in einer großen Vielfalt von zellularen Wirten zu erzeugen. Zahlreiche Gene sind aus Säugetieren und Viren isoliert worden, mit die Transkriptions- und Translations-Einleitung und -Termination steuernden Signalen aus einer anderen Quelle als dem strukturellen Gen verbunden und in Wirte eingeführt worden, bei denen diese Steuersignale funktionell sind. Häufig wird das interessierende Peptid hergestellt, um für einen physiologischen Zweck verwendet zu werden. In vielen Situationen ist es für die physiologische Wirksamkeit notwendig, daß nicht nur die korrekte oder im wesentlichen korrekte Aminosäuresequenz vorhanden ist, sondern das Peptid muß sich richtig falten, einschließlich richtiger Disulfidbrückenbildung, und kann weiteres Verarbeiten erfordern, wie Acetylierung, Glykosylierung oder Methylierung.
  • Zur wirtschaftlichen Erzeugung wäre es erwünscht, einzellige Mikroorganismen zu verwenden, die in großen Fermentationsbehältern gezüchtet werden könnten, keine anspruchsvollen Nährstoffanforderungen stellen und relativ wirtschaftlich zu halten sind. Bakterien wie E.coli, B.subtilis oder ähnliche, Pilze wie Hefe, Candida, Fadenpilze oder ähnliche bieten wirtschaftliche Möglichkeiten zur Erzeugung einer großen Vielfalt von Peptiden. Aufgrund des wesentlichen Unterschieds in der Art der einzelligen Mikroorganismen und Säugetierzellen scheint sich das Falten und Verarbeiten in einer Säugetierzelle von dem bei Organismen niedrigerer Ordnung wesentlich zu unterscheiden. Daher kann es sein, daß die aus den einzelligen Mikroorganismen erhaltenen Produkte nicht richtig verarbeitet oder gefaltet worden sind, um einen wesentlichen Anteil der oder die gesamte physiologische Wirksamkeit des von einem nativen Wirt erhaltenen natürlich auftretenden Peptids zu verwirklichen.
  • Daher bleibt wesentliches Interesse daran bestehen, alternative wirtschaftliche Systeme zum Erzeugen von Peptiden zu schaffen, bei denen hohe Ausbeuten erzielt werden können und mit denen die Produkte wesentlich in einer Form erzeugt werden können, die ein hohes Ausmaß an physiologischer Wirksamkeit liefert, die dem Wildtyppeptid eigen ist, das die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz aufweist.
    • Kurze Beschreibung der relevanten Literatur
  • Literaturstellen, die sich mit der Expression verschiedener Interferone beschäftigen, umfassen Goeddel et al., "Nucleic Acids Res." (1980) 8:4057-4074; Goeddel "Nature" (1980) 287: 411-415; Yelverton et al., "Nucleic Acids Res." (1981) 9: 731-741; Gray et al., Nature (1982) 295:503-508; Devos et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10:2487-2501; Gray und Goeddel, "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" (1983) 80:5842-5846; Scahill et al., "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" (1983) 80:4654-4658. Siehe auch Horsch et al., "Science" (1985) 227:1229-1231.
  • Kloningvektoren in einem weiten Wirtbereich werden von Knauf und Nester, "Plasmid" (1982) 8:45-54, beschrieben. Die Nukleotidsequenz der T-DNA-Region wird von Barker et al., "Plant Molecular Biology" (1983) 2:335-350 beschrieben. Siehe auch EPA 0 116 718 und PCT WO 84/02913.
  • Die WO-A-85/04899 Agracetus offenbart ein Plasmid, das eine Sequenz enthält, die für reifes Säugetier-β-Interferon kodiert.
  • Die WO-A-84/02913 Monsanto lehrt zwei chimäre Genkonstruktionen, die für Rinderwachstumshormon kodieren. Das erste weist (i) den Sojabohnenpromotor sbss und 5' untranslatierte Region; (ii) die Rinderwachstumshormonkodierungssequenz; und (iii) die Ti-Plasmid-NOS untranslatierte Region auf. Das zweite chimäre Gen weist anstelle der Sojabohnensequenz den NOS-Promotor und die 5' untranslatierte Region auf. Bezuglich der Verwendung der chimären Gene wird keine Offenbarung gemacht.
  • Die WO-A-84/02920 Monsanto offenbart ein Verfahren zum Einführen unselektierbarer Gene in Pflanzenzellgenome durch Kombinieren des unselektierbaren Gens mit einem selektierbaren Gen in der T-Region (dem Teil des tumorinduzierenden (Ti) Plasmids von Agrobacterium tumefaciens, der in das Pflanzengenom eintritt) und der transferierten T-DNA.
  • Fraley et al. (1985), "Biotechnology" 3(7), S.629-635 geben an, daß für Mäusedihydrofolat und menschliches Choriongonadotropin kodierende Gene in Pflanzen eingeführt und exprimiert worden sind.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Für die effiziente Erzeugung von physiologisch wirksamen Säugetierproteinen wird gesorgt, indem funktionelle Konstrukte, die das Säugetierstrukturgen enthalten, in eine Pflanzenzelle eingeführt werden. Das Konstrukt kann das gewünschte Peptid in einer isolierbaren Form exprimieren. Die Pflanzenzellen können in Kultur gezüchtet oder in einem geeigneten Nährstoffmedium oder Boden kultiviert und das Säugetierprotein geerntet werden. Insbesondere T-DNA-Transformation kann zur Integration des Konstrukts in das Pflanzengenom unter Bedingungen verwendet werden, unter denen die Zellen zum Erzeugen von Pflanzen verwendet werden können.
    • BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es werden neue DNA-Sequenzen geschaffen, die in Pflanzenzellen für die Expression physiologisch aktiver Säugetierpeptide funktionelle Konstrukte umfassen. Die Konstrukte schaffen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungs- und -Terminations-Steuersignale, welche mit dem in das Pflanzengenom integrierten Konstrukt für die effiziente Expression des Strukturgens sorgen. Je nachdem, ob die Zellen in Kultur gezüchtet oder in Boden oder anderem Medium kultiviert werden, können diese Zellen oder Pflanzen geerntet, und das gewünschte Produkt nach herkömmlichen Techniken extrahiert und gereinigt werden.
  • Zunächst wird das Konstrukt zum Einfuhren in die Pflanze betrachtet. Während das Konstrukt entweder DNA oder RNA sein kann, ist das Konstrukt meist DNA, obwohl das Konstrukt schließlich als RNA in die Pflanzenzelle eingeführt werden kann, wie als ein Virus. Ein wichtiges Element des Konstrukts ist die Transkriptionskassette, die die Transkriptionseinleitungsregion enthält und die in einen regulierenden Bereich und den üblicherweise proximale RNA-Polymerase bindenden Bereich, das für das interessierende Säugetierpeptid kodierende strukturelle Gen und eine Terminatorregion unterteilt werden kann, die für die Termination von Transkription und Translation sorgt. Ein weiteres
  • wichtiges Element ist die Regulierung der Expression bei einem speziellen Differenzierungsstadium in einem bestimmten Pflanzenteil, z. B. Wurzeln, Blätter, Stengel oder ahnlichem. In vielen Situationen wird ein Polypeptidleadersignal wünschenswert sein, welches das Produkt zu einer bestimmten Organelle leitet. Das ist von wesentlicher Bedeutung, wenn die Organelle am richtigen Verarbeiten des Peptids beteiligt sein kann.
  • Es kann eine große Vielfalt von Transkriptions-Einleitungsregionen verwendet werden, die induzierbar, z. B. gewebespezifisch, oder konstitutiv sind. Die Transkriptions-Einleitungsregionen können von den tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium kommen, insbesondere den mit T-DNA assoziierten Genen, oder von Viren oder Pflanzen. Zu den T-DNA-Transkriptions-Einleitungsregionen, die Verwendung finden können, gehören diejenigen Regionen, die mit Octopinsynthase, Nopalinsynthase, Mannopinsynthase, Transkript 7 und ähnlichem assoziiert sind. Von den viralen Transkriptions-Einleitungsregionen sind der Caulimovirus-Promotor voller Länge und der Region VI-Promotor eingeschlossen. Von den Pflanzen-Transkriptions-Einleitungsregionen sind es die Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase-kleine Untereinheitsregion, die lichtinduzierbar ist, oder die Napin- oder andere Samenproteinregion zur Bildung im Samen.
  • Die Transkriptions-Einleitungsregionen können von ihren natürlichen Stellen in einem Wirt isoliert werden oder können sequenziert und synthetisiert werden, daß sie die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Sequenz wie die Wildtypregion aufweisen. Wenn induzierbare Regulierung gewünscht wird, können Bereiche von verschiedenen Quellen erhalten werden, so daß ein regulierender Bereich von einer Quelle erhalten und mit einem RNA-Polymerasebindungsbereich von einer anderen Quelle verbunden werden kann. Auf diese Art kann für die Verwendung eines starken RNA-Polymerasebindungsbereichs gesorgt werden, der mit einem strukturellen Gen assoziiert ist, während er einen mit einem anderen strukturellen Gen assoziierten regulierenden Bereich aufweist. Diese hybrid-regulierenden Regionen können besondere Verwendung finden, wenn es erwünscht wird, die Produktion des gewünschten Gens in einer bestimmten Phase beim Wachstum der Pflanze zu induzieren oder das Produkt in einem speziellen Pflanzenteil angeordnet zu haben, wie in Samen, Blättern und ähnlichem. Es kann jede die Transkriptionstermination regulierende Region verwendet werden, die in Pflanzen funktionell ist, z. B. prokaryotisch oder eukaryotisch, von T-DNA, Pflanzen, Viren oder Säugetieren.
  • Das strukturelle Gen kann jedes Säugetiergen von Interesse sein, einschließlich viraler pathogener Säugetiergene. Es ist eine große Vielzahl von Genen isoliert und gezeigt worden, daß sie zur Produktion in einzelligen Mikroorganismen fähig sind, bis zu verschiedenen Graden an biologischer Wirkung und Wirksamkeiten, und in Säugetierzellen, wobei immer zu bedenken ist, daß die Säugetierzellen transformierte Zellen sind, so daß jedes Produkt sorgfältig gereinigt werden muß, um die völlige Abwesenheit einer jeglichen Nukleinsäureverunreinigung zu gewährleisten. Strukturelle Gene, die von Interesse sind, umfassen, α-, β- und γ-Interferone, Immunoglobuline, wobei die strukturellen Gene für die leichten und schweren Ketten kodieren und wünschenswert Zusammenfügung in der Pflanzenzelle auftritt, Lymphokine wie Interleukine 1, 2 und 3, Wachstumsfaktoren, einschließlich insulinartigem Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor-α, -β usw., Wachstumshormon, Insulin, Kollagenplasminogenaktivator, Blutfaktoren wie die Faktoren I bis XII, Histokompatibilitätsantigene, Enzyme oder andere Säugetierproteine, insbesondere menschliche Proteine.
  • Von den mit viralen Pathogenen assoziierten Antigenen sind die Kern- und Hüllproteine von Leukämie- und lymphotropischen Retroviren eingeschlossen, wie HTLV-I, -II und -III, Katzenleukämievirus usw., Oberflächenantigene von Herpes simplex-Virus, Hepatitis B-Virus, Adenovirus und ähnliche.
  • Andere als die oben angeführten Peptide von Interesse sind Peptide, die physiologisch verabreicht werden können, wobei das Wachstum in Pflanzen die Wahrscheinlichkeit von Verunreinigungen verringert, die bei der Verabreichung an einen Säugetierwirt negative Reaktion verursachen.
  • Pflanzen können auch bei der Herstellung anderer Proteine als solcher Verwendung finden, die an einen Wirt zu verabreichen sind, wobei das Säugetierprotein, wie ein Enzym, Falten und/oder Verarbeiten erfordern kann, das in einzelligen Mikroorganismen nicht verfügbar ist. Pflanzen können nicht nur verwendet werden, um das reife Peptid herzustellen, sondern es kann in vielen Fällen wünschenswert sein, den Vorläufer herzustellen, was Spaltung und Zusammenfügen erfordern kann, entweder endogen oder exogen zur Pflanze. Es können Peptide hergestellt werden, die ein natürlich auftretendes Transit- oder Leaderpeptid oder ein Transit- oder Leaderpeptid von einem Pflanzenpeptid aufweisen. Das Transitpeptid dient dazu, das gesamte Peptidprodukt dem Verarbeiten und Reifen des Peptids zu unterwerfen. Derartiges Verarbeiten kann spezifische Peptidspaltung einschließen, z. B. das Entfernen des Transitpeptids, Glykosylierung an Glykosylierungsstellen, Falten mit der geeigneten Bildung von Disulfidbrücken.
  • Es kann jeder zweckmäßige Terminator verwendet werden, der für die wirksame Termination in Verbindung mit einer speziellen Transkriptions-Einleitungsregion sorgt. Der Terminator kann die Terminatorregion sein, die normalerweise mit der Transkriptions-Einleitungsregion assoziiert oder mit einer anderen Transkriptions-Einleitungsregion assoziiert ist, solange die Region in Pflanzen funktionell ist.
  • Um Pflanzenzellen auszuwählen, die das Konstrukt erfolgreich integriert haben, ist das/die Expressionskonstrukt oder -kassette üblicherweise mit einem Marker verbunden. Der Marker läßt entweder Screening oder Selektion zu, üblicherweise Selektion. Es ist eine Anzahl verschiedener antibiotischer Resistenzgene bekannt, die in Pflanzen Verwendung finden können, um als Marker zu dienen. Diese Gene umfassen Enzyme, die Resistenz gegen Kanamycin, Chloramphenicol, G418, Gentamycin und ähnliche bieten. Diese Gene weisen Transkriptions- und Translations-Einleitungs- und Terminations-regulierende Regionen auf, welche die gleichen oder andere als die für das strukturelle Gen von Interesse verwendeten Regionen sein können. Üblicherweise wird konstitutive Expression und nicht induzierbare Expression geschaffen.
  • Zusätzlich zur Kassette und dem Marker können, je nach der Art, auf die das DNA-Konstrukt in die Pflanzenzelle eingebracht wird, andere Sequenzen notwendig sein. Wenn das Agrobacterium tumorinduzierende System verwendet werden soll, ist eine oder beide der T-DNA-Begrenzungen eines Ti- oder Ri-Plasmids vorhanden, insbesondere die rechte Begrenzungsregion. Jede Begrenzungsregion hat im allgemeinen etwa 1 bis 1,5 kbp.
  • Das DNA-Konstrukt aus Kassette, Marker und T-DNA kann dann auf vielfältige Arten verwendet werden. Zur Integration in ein Ti- oder Ri-Plasmid kann das Konstrukt in einen geeigneten Agrobacterium-Stamm eingeführt werden, der das tumorinduzierende Plasmid trägt, wodurch das Konstrukt in das tumorinduzierende Plasmid integriert werden kann und dann auf Pflanzenzellen Übertragen werden kann. Alternativ dazu kann das Konstrukt mit einem Breitspektrumreplikationssystem, wie einem P1-Inkompatibilitätsreplikationssystem, verbunden und in ein Agrobacterium transformiert werden, das ein bewaffnetes oder entwaffnetes tumorinduzierendes Plasmid enthält. Es tritt Integration auf, und Transfer zur Pflanzenzelle des Konstrukts gemeinsam mit anderen Genen und Markern. Wenn der Transfer mit einem bewaffneten tumorinduzierenden Plasmid (Ti oder Ri-T-DNA enthaltenden Plasmid) erfolgt, werden Gene transferiert, welche die Tumorbildung verleihen, so daß Gallen gebildet werden können. Mit entwaffneten Tumorplasmiden (denen T-DNA fehlt) können die Tumor verursachenden Gene nicht transferiert werden und es tritt keine Bildung von Gallen auf. Es kann ein Transposon verwendet werden, das das Konstrukt und das für Transposase kodierende Gen enthält, wie im Ac-Ds-System. Es kann ein virales System eingesetzt werden, das für die Integration in das Wirtsgenom sorgt.
  • Der Transfer des DNA-Konstrukts in die Pflanzenzelle kann durch Infektion mit A-tumefaciens oder A.rhizogenes, Mikroinjektion, Liposomfusion, virale Infektion oder ähnliches erfolgen. Die spezielle Art, wie die DNA zur Integration in die Pflanzenzelle eingeführt wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend.
  • Üblicherweise wird das Konstrukt mit einem prokaryotischen Replikationssystem verbunden, beispielsweise einem in E.coli funktionellen System, um Klonen in den verschiedenen Stadien der Herstellung des Konstrukts zuzulassen. Es ist eine große Vielfalt von Replikationssystemen verfügbar, sowohl Plasmid als auch Phage, wie ColE1, λ usw.
  • Pflanzenzellen, die eingesetzt werden, können entweder monocotyle oder dicotyle sein, und werden je nach der Art gewählt, auf die das gewünschte Gen zu erzeugen und zu ernten ist. Zu Pflanzen, die verwendet werden können, gehören Tabak, Sonnenblume, Mais, Zuckerrohr, Sojabohne, Tomate, Luzerne, Senf, Zuckerrübe, Rübsamen usw. Das Produkt ist in Pflanzenteilen wie Samen, Blättern, Frucht, Wurzeln, Stengeln, Knollen oder Kombinationen davon zu finden. So kann das interessierende Peptid der einzige Zweck des Ziehens der Pflanze oder ein zusätzliches Produkt sein.
  • Das Konstrukt wird auf herkömmliche Weise hergestellt. DNA-Sequenzen können durch den Einsatz von Sonden bestimmt werden, die auf der Basis bekannter Aminosäuresequenzen oder die vorhergehende Isolierung der gesamten oder von Fragmenten von mRNA oder chromosomaler DNA konstruiert werden können. Die Sequenzen können restriktionsgemappt oder sequenziert und das gesamte Gen durch verschiedene Techniken erhalten werden, wie Walking, unter Verwendung einer Vielzahl von Primern oder ähnlichem. Sobald die Sequenz isoliert worden ist, kann sie an andere Sequenzen ligiert werden, entweder direkt oder über Linker, wobei die Linker keine oder Abschnitte von Kodierungssequenzen bieten. Auf Basis der verfügbaren Restriktionsstellen, der Abwesenheit von Restriktionsstellen, der Fähigkeit, Restriktionsstellen einzuführen, der Verfügbarkeit bestimmter Fragmente, der Gegenwart von Sequenzen, die Exzision erfordern und ähnlichem können verschiedene Strategien entwickelt werden. Die spezielle Strategie hängt vom Gen ab, das verwendet wird, den speziellen regulatorischen Systemen, der Verfügbarkeit von Vektoren, die eine oder mehrere der gewünschten Sequenzen aufweisen sowie von anderen praktischen Überlegungen.
  • Die Art, wie das Konstrukt in Pflanzen eingeführt wird, kann stark variiert werden. Das ist bereits durch die verschiedenen Sequenzen zum Ausdruck gekommen, die im Konstrukt eingeschlossen sein können. Von besonderem Interesse ist die Gegenwart von T-DNA zur Integration in Verbindung mit den vir-Genen des Ti-Plasmids, das auf einem anderen Plasmid vorhanden sein kann, als demjenigen, welches das fremde Gen enthält. So kann die erforderliche genetische Fähigkeit zur Integration in die Pflanzenzelle in Verbindung mit der Infektion mit Agrobacterium oder der Einführung der DNA auf andere Weise geschaffen werden. Beschreibungen des Einführens von DNA in Pflanzen sind in Pedersen et al., "Plant Cell Reports" (1983) 2:201-204; Hooykaas-Van Slogteren et al., "Nature" (1984) 311:763-764; de Cleene and de Ley, "The Botanical Review" (1976) 42:389-466 und den darin angeführten Literaturstellen zu finden, die alle durch Verweis hierin eingeschlossen sind.
  • Die transformierten Pflanzenzellen werden dann in geeignetem Nährmedium gezogen, um ausgewählten Calli zu schaffen, worin Pflanzenzellen oder Protoplasten modifiziert worden sind. Sobald der Callus sich gebildet hat, kann das Medium dann gewechselt werden, um Wurzel- und Schößlingsbildung anzuregen, und die resultierenden Schößlinge werden zu geeignetem Wachstumsmedium übertragen, um Pflanzen zu ziehen. Wenn die Pflanzen bis zum gewünschten Stadium gezogen worden sind, können die Pflanzen oder Pflanzenteile, z. B. Samen, Frucht oder ähnliches, geerntet werden, und das gewünschte Produkt auf herkömmliche Arten isoliert werden. Danach kann das Gen aus Samen regeneriert werden, so daß der Vorgang des Regenerierens aus Calli nicht wiederholt werden muß. Die Pflanze kann zermahlen und mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden, chromatographiert, kristallisiert, mit Lösungsmittel extrahiert werden usw. Das Rohprodukt kann dann je nach der Art des Produktes gereinigt werden.
  • In manchen Fällen kann es weder notwendig noch wünschenswert sein, das Säugetierproteinprodukt aus der Pflanze zu extrahieren und zu isolieren. Wenn das Produkt eine physiologische Wirkung bei der Aufnahme haben kann, kann es ausreichen, daß das Produkt bei der Pflanze behalten wird. Das gilt, wenn der Pflanzenteil genießbar ist, wie als Futter, das Nähreigenschaften aufweisen könnte, wie Rinderwachstumshormon, Samen, Nüsse, Obst und Gemüse, die Proteine einschließen könnten, die an der Regulierung der Verdauung oder ähnlichem beteiligt sind.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
    • VERSUCHE
  • Das HindIII-SmaI-Fragment von Tn5, das das gesamte strukturelle Gen für APHII enthielt (Jorgensen et al., "Mol.Gen." (1979) 177:65), wurde in pUC8 geklont (Vieira und Messing "Gene" (1982) 19:259), wodurch das Fragment in ein HindIII-EcoRI-Fragment umgewandelt wurde, da es eine EcoRI-Stelle unmittelbar angrenzend an die SmaI-Stelle gibt. Das den 3'-Abschnitt des APHII-Gens enthaltende PstI-EcoRI-Fragment wurde dann mit einem EcoRI-BamHI-SalI-PstI-Linker in die EcoRI-Stelle von pUC7 kombiniert (pCGN546W). Da dieses Konstrukt keine Kanamycinresistenz verleiht, wurde Kanamycinresistenz durch Einfügen des BglII-PstI-Fragments des APHII-Gens in die BamHI-PstI-Stelle erhalten (pCGN546X). Dieser Vorgang stellt das APHII-Gen wieder zusammen, so daß die EcoRI-Stellen das Gen flankieren. Ein ATG-Kodon befand sich stromaufwärts vom und außerhalb des Leserahmens mit dem ATG-Einleitungskodon von APHII. Das unerwünschte ATG wurde vermieden, indem ein Sau3A-PstI-Fragment vom 5'-Ende von APHII, welchem Fragment das überflüssige ATG fehlt, in die BamHI-PstI-Stelle von pCGN546W eingefügt wurde, um Plasmid pCGN550 zu schaffen.
  • Das das APHII-Gen enthaltende EcoRI-Fragment wurde dann in die einzige EcoRI-Stelle von pCGN451 geklont, das eine Octopinsynthasekassette zur Expression enthält, um pCGN552 zu schaffen.
  • pCGN451 enthält eine Octopinkassette, die etwa 1556 bp der 5'-Nichtkodierungsregion enthält, die über einen EcoRI-Linker mit der 3'-Nichtkodierungsregion des Octopinsynthasegens von pTiA6 verschmolzen war. Die pTi-Koordinaten sind 11,207 bis 12,823 für die 3'-Region und 13,643 bis 15,208 für die 5'-Region, wie von Barker et al., "Plant Mol.Biol." (1983) 2:325 definiert.
  • Das 5'-Fragment wurde folgendermaßen erhalten: Ein kleines subgeklontes Fragment, das das 5'-Ende der Kodierungsregion enthielt, wurde als ein BamHI-EcoRI-Fragment in pBr322 als Plasmid pCGN407 geklont. Das BamHI-EcoRI-Fragment weist eine XmnI-Stelle in der Kodierungsregion auf, während pBR322 zwei XmnI-Stellen aufweist. pCGN407 wurde mit XmnI digeriert, mit Bal31-Nuklease reseziert und EcoRI-Linker zu den Fragmenten hinzugefügt. Nach der EcoRI- und BamHI-Digestion wurden die Fragmente größenfraktioniert, die Fraktionen geklont und sequenziert. In einem Fall waren die gesamte Kodierungsregion und 10 bp der 5' untranslatierten Sequenzen entfernt worden, wodurch die 5' untranskribierte Region, die mRNA-Capstelle und 16 bp der 5' untranslatierten Region (zu einer BamHI-Stelle) intakt gelassen wurden. Dieses kleine Fragment wurde durch Größenfraktionierung auf einem 7% Acrylamidgel erhalten und etwa 130 bp lange Fragmente eluiert. Diese größenfraktionierte DNA wurde in M13 mp9 ligiert und mehrere Klone sequenziert, und die Sequenz mit der bekannten Sequenz des Octopinsynthasegens verglichen. Das M13-Konstrukt wurde als p14 bezeichnet, welches Plasmid mit BamHI und EcoRI digeriert wurde, um das kleine Fragment zu schaffen, das an ein XhoI- bis BamHI-Fragment ligiert wurde, das stromaufwärts 5'-Sequenzen von pTiA6 enthielt (Garfinkel und Nester, "J.Bacteriol." (1980) 144:732), sowie an ein EcoRI- bis XhoI-Fragment, das die 3'-Sequenzen enthielt. Das resultierende Xhol-Fragment wurde in die XhoI-Stelle eines pUC8-Derivats geklont, das als pCGN426 bezeichnet wurde. Dieses Plasmid unterscheidet sich von pUC8 dadurch, daß es die einzige EcoRI-Stelle mit DNA-Polymerase I aufgefüllt hat und die PstI- und HindIII-Stelle durch Nukleaseverunreinigung von HincII-Restriktionsendonuklease verloren hat, als ein XhoI-Linker in die einzige HincII-Stelle von pUC8 eingefügt wurde. Das resultierende Plasmid PCGN451 weist eine einzige EcoRI-Stelle zur Einfügung einer Proteinkodierungssequenz zwischen der 5'-Nichtkodierungsregion (die 1,550 bp 5' nichttranskribierte Sequenz enthält, die den rechten Rand der T-DNA, die mRNA-Capstelle und 16 bp 5' untranslatierter Sequenz einschließt) und der 3'-Region (die 267 bp der Kodierungsregion, das Stopkodon, 196 bp der 3' untranslatierten DNA, die PolyA-Stelle und 1,153 bp der 3' untranskribierten Sequenz enthält) auf. pCGN451 bietet auch den rechten T-DNA-Rand.
  • Das resultierende Plasmid pCGN451, das die ocs 5' und die ocs 3' in der richtigen Ausrichtung aufweist, wurde mit EcoRI und dem EcoRI-Fragment von pCGN551 digeriert, das das intakte Kanamycinresistenzgen in die EcoRI-Stelle eingefügt enthielt, um pCGN 552 zu schaffen, das das Kanamycinresistenzgen in der richtigen Ausrichtung aufweist.
  • Dieses ocs/KAN-Gen wurde verwendet, um einen auswählbaren Marker für den binären Trans-Typ-Vektor pCGN587 zu schaffen.
  • Der 5'-Abschnitt der durch Engineering hergestellten Octopinsynthasepromotorkassette besteht aus TiA6-DNA vom XhoI an bp 15208-13644 (Barkersche Numerierung), die auch die im T-DNA-Transfer implizierte T-DNA-Begrenzungssequenz (Rand) enthält. Im Plasmid pCGN587 bietet das ocs/KAN-Gen von pCGN552 einen selektierbaren Marker sowie den rechten Rand. Die linke Begrenzungsregion wurde vom HindIII-EcoRI-Fragment als ein KpnI-EcoRI-Fragment in pCGN565 wiedergeklont, um pCGN580 zu schaffen. pCGN565 ist ein Klonungsvektor, der auf pUC8-Cm basiert, aber pUC18-Linker enthielt. pCGN580 wurde mit BamHI linearisiert und verwendet, um das kleinere BglII-Fragment von pVCK102 zu ersetzen (Knauf und Nester "Plasmid" (1982) 8:45), wodurch pCGN585 geschaffen wurde. Durch Ersetzen des kleineren SalI-Fragments von pCGN585 mit dem XhoI-Fragment von pCGN552, das das ocs/KAN-Gen enthielt, wurde pCGN587 erhalten.
  • pCGN807 wird von pBR322 abgeleitet, enthält das Tetrazyklinresistenzgen, weist etwa 300 bp einer Sequenz auf, die den trp-Promotor 5' einschließt, zu einer 750 bp-Sequenz, die die gesamte Mäuse-γ-Interferon strukturelle cDNA und eine 3'-untranslatierte Region einschließt, mit dem in Gray und Goeddel "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" (1983) 80:5842-5846 beschriebenen Gen. Der Promotor und das Gen sind ein EcoRI-Fragment mit etwa 834 bp. pCGN807 wurde mit EcoRI und HpaI digeriert, welches Fragment in pEMBL18+ eingefügt wurde, das mit EcoRI und SmaI digeriert worden war, um pCGN808 zu erzeugen. pEMBL18+ (Dente et al., "Nucleic Acids Res." (1983) 11:1645) unterscheidet sich von den pEMBL-Plasmiden dadurch, daß es den pUC18-Linker in das β-Galaktosidasegen eingefügt aufweist. pCGN808 wurde mit EcoRI und BamHI digeriert, um ein 540 bp-Fragment zu schaffen, das in pCGN46 eingefügt wurde, das mit EcoRI und BamHI digeriert worden war, um dafür zu sorgen, daß das Mäuseγ-Interferon-cDNA-Gen sich in der richtigen Ausrichtung bezogen auf die Mannopinsynthase (mas)-5'-Transkriptionseinleitungsregion und die ocs-3'-Transkriptionsterminationsregion befindet (pCGN809).
  • Ein EcoRI-Fragment mit etwa 5,5 kbp (Eco13 oder EcoC), das einen Abschnitt der T-R-DNA tragt (Barker et al., "Plant Mol.Biol." (1983) 2:325), die die Mannopinsynthasepromotorregion (PMAS) einschließt, wurde in einen als pVK232 bezeichneten Vektor geklont. Nach der Digestion von pVK232 mit EcoRI wurde Eco13 in die EcoRI-Stelle von pACYC184 eingefügt, um Plasmid pCGN14 zu ergeben. pCGN14 wurde mit SphI und ClaI (jeweils an Position 21562 und 20128 der Barker et al. Sequenz, oben) digeriert, um die PMAS-Region zu entfernen, die in pUC19 (Pharmacia, Inc.) eingefügt war, das mit SphI und AccI digeriert worden war, um pCGN40 zu ergeben. Die PMAS-Region schließt im Inneren eine ClaI-Erkennungsstelle ein, die methyliert wird, um der Digestion standzuhalten. pCGN40 wurde mit EcoRV und EcoRI digeriert, wobei die EcoRV-Stelle sich in der T-DNA befindet, während die EcoRI-Stelle sich im Polylinker von pUC19 befindet, um ein Fragment zu schaffen, das die PMAS-Region aufweist. pCGN451, das die Octopinsynthasekassette enthält, wurde mit SmaI und EcoRI digeriert und das größere Fragment isoliert, von dem die Octopinsynthase-5'-Region entfernt worden war. Die EcoRV-EcoRI-PMAS-Region wurde in pCGN451 für die Octopinsynthase-5'-Region substituiert, wo die Transkriptions-Einleitungs- und Terminationsregionen durch einen Polylinker getrennt wurden, um pCGN46 zu schaffen.
  • Um das Plasmid pCGN809 auf einen binären T-DNA-Vektor pCGN587 mit weitem Wirtsbereich einzubringen, wurde pCGN809 in einen E.coli polA1-Mutanten transformiert, der pCGN587 enthielt. Die beiden Plasmide pCGN587 und pCGN809 haben zwei Homologieregionen gemeinsam, an denen Rekombination auftreten kann: an den ocs-3'-Regionen des APHII-Gens und des γ-Interferongens und an den pUC-Ursprüngen der beiden Plasmide, führt die Rekombination an jeder der Stellen zu einem Plasmid, das sowohl das γ-Interferongen als auch das APHII-Gen als intakte Expressionseinheiten enthält. Im polA1-Mutanten kann das pCGN809-Plasmid, das einen pUC-Replikationsursprung aufweist, nur durch Integration in das pCGN587-Plasmid überleben, das ein Replikationssystem mit einem weiten Wirtsbereich aufweist. Da das pCGN809-Konstrukt Ampicillinresistenz aufweist, kann das chimäre Plasmid pCGN810 ausgewählt werden. Der transformierte E.coli-Wirt wurde in einem Nährstoffmedium gezüchtet, das 100 ug/ml Ampicillin enthielt, und die überlebenden Klone isoliert. Plasmid pCGN810 wurde dann nach dem Verfahren von Ditta et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" (1978) 77:7347 in A.tumefaciens C58 gepaart (Watson et al., "J.Bacteriol." (1974) 123:255). pCGN810 wurde ebenfalls in A.tumefaciens K61 gepaart, das ein entwaffnetes Ti-Plasmid enthält, im Vergleich zu C58, das die genetische Fähigkeit zur Nopalinexpression aufweist und ein bewaffnetes Ti-Plasmid ist. Das transformierte Agrobakterium wurde mit Carbenicillin (50 ug/ml) und Streptomycin (150 ug/ml) bei 30ºC für zwei oder drei aufeinanderfolgende Abstriche ausgewählt. Nach dem Wachstum unter Selektion wurde DNA isoliert und mit BamHI und EcoRI Restriktion unterworfen und durch Sondenhybridisierung verifiziert. Das geklonte pCGN808 wurde als eine nicktranslatierte Sonde verwendet und bestätigte die Gegenwart eines 565 bp-γ-Interferonfragments sowohl im Expressionsvektor pCGN46 als auch im T-DNA-Plasmid pCGN587 im bewaffneten und entwaffneten Agrobacterium.
  • Vier pCGN810-Konstrukte sowohl in C58 als auch in K61 wurden gemeinsam mit Nicotiana tabacum xanthii-Protoplasten kultiviert, und Klumpen transformierter Zellen, die in 100 ug/ml Kanamycin ausgewählt wurden, wurden für weiteres Wachstum und Regeneration in Pflanzen in feste Medien übertragen, die Kanamycin (100 ug/ml) enthielten.
  • Tabakblätterscheiben wurden gemeinsam mit pCGN810 in C58 und K61-Agrobacterium-Stämmen kultiviert, und die Scheiben in selektive Medien mit Kanamycin (100 ug/ml) zum Wachstum zum Erhalt von Callus übertragen.
  • Sterile Tabakpflanzen wurden durch Einstich am Stamm mit A.tumefaciens C58 (pCGN810) geimpft, was zur Erzeugung von Gallengewebe führte, das ausgeschnitten und auf feste Medien übertragen wurde, die Kanamycin enthielten (100 ug/ml). Nach beträchtlicher Callusvermehrung wurde der Großteil des durch Gallen induzierten Callusmaterials zur mRNA- und Proteinanalyse geerntet.
  • Eine kleine Teilmenge des Gallencallusmaterials begann auf dem Kanamycinmedium ohne Hormone zu sprießen. Sobald sie zu den Sprießmedien übertragen waren, hatte die Schößlingsentwicklung bei den meisten der Pflänzchen ein normales Aussehen, obwohl einige teratomaartig waren. Die Pflänzchen wurden in Wurzelbildungsmedium übertragen, das Kanamycin enthielt (100 ug/ml), und die meisten der Pflänzchen mit normaler Morphologie wurzelten.
  • Der Rest des durch Gallen induzierten Callusmaterials wurde vereinigt und für vorbereitende Expressionsanalyse für γ-Interferon im Vergleich zu Kontrollcallus (mit A-tumefaciens C58(pCGN587) transformierte Pflanzenzellen) verwendet. Nach der Extraktion des Pflanzenmaterials und Immunausfällung mit Antiseren gegen γ-Interferon wurde der Extrakt auf 15% SDS-PAGE Elektrophorese unterzogen, an Nitrozellulose elektrogeblottet und mit γ-Interferon-Antiseren blockiert. Radioaktiv markiertes S.aureus-Protein A wurde an den Filter hybridisiert, um an alle Immunkomplexe zu binden, die sich gebildet hatten. Im transformierten Pflanzengewebe (A.tumefaciens C58(pCGN810)) verlief ein sichtbares Band mit der gleichen Größe wie die γ-Interferonproben der positiven Kontrolle.
  • Die Analyse der nach einem oligo-dT-prep der gesamten RNA erhaltenen mRNA wurde unter Verwendung von nicktranslatierten isolierten Genfragmenten an das Tn5-Kanamycingen (in pCGN587) und das γ-Interferonfragment (in pCGN808) durchgeführt. Die Northern-Daten zeigten ein Signal sowohl in pCGN587 als auch in pCGN810-mRNA-preps, die mit dem Kanamycinfragment hybridisierten. Nur die transformierte pCGN810-Probe hybridisierte mit der γ-Interferongensonde, die zwei mRNA-Spezies aufweist, die jede in einer Nichtkodierungs-3'-Sequenz mit unterschiedlicher Größe endet.
  • Proben wurden hergestellt und durch Bioassay auf Mäuse-γ-Interferon untersucht. Die Proben wurden folgendermaßen hergestellt: Zu gefrorenem Tabaksgewebe aus Gewebekultur (1,6 oder 1,0 g), das in flüssigem Stickstoff gemahlen wurde, wurden 5 bzw. 2,5 ml Extraktionspuffer (1M NaCl, 25 mg/ml BSA, 10 mM DTT, 10 mM Zystein, 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4) hinzugefügt, und das Mahlen wurde fortgesetzt, bis die Mischung flüssig war. Die Flüssigkeit wurde dann zweimal bei 16K UpM 20 Minuten lang zentrifugiert, wobei die Flüssigkeit nach der ersten Trennung in eine frische Röhre übertragen wurde. Die Probe wurde dann auf 5 ml verdünnt und 0,5 ml Kontrollporenglaskugeln (CPG) (gewaschen und autoklaviert) wurden hinzugefügt und die Mischung bei 4ºC 4 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde dann auf eine silanbehandelte Pasteurpipettensäule geladen, die Säule mit 3 ml 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1M NaCl gewaschen und das Produkt mit 5 ml 1M NaCl 30% Äthylenglykol eluiert. Das von der Säule eluierte Material wurde dann über Nacht gegen 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1M NaCl dialysiert. Der Dialysepuffer wurde einmal nach 3 Stunden gewechselt. Die dialysierte Probe wurde mit einem Millipore Eintauch-CX 10,000 Ultrafilter auf weniger als etwa 1 ml konzentriert, und dann wurde eine Verdünnungsreihe mit BSA-Puffer (1M NaCl, 20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 25 mg/ml BSA) gemacht. Vergleichsproben wurden aus transformiertem und untransformiertem Tabak hergestellt, bei dem kein γ-Interferongen eingeführt war, wobei das Gewebe mit γ-Interferon ergänzt oder nicht ergänzt war. Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse an. TABELLE Gewebe¹ Verdünnung² γ-IFN-Wirksamkeit³ ¹ UT - nicht transformiertes Tabakgewebe T - mit fremder DNA transformiertes Tabakgewebe T - γIFN - mit Mäuse-γ-IFN-Gen transformiertes Tabakgewebe A - kein Mäuse γ-IFN hinzugefügt B - vor der Reinigungsbehandlung 5 ug γ-IFN zu 5 ml Probe hinzugefügt ² 0 = 0.5; 1 = 10&supmin;¹; 2 = 10&supmin;²; 3 = 10&supmin;³ ³ Assayverfahren in Yip et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" (1982) 79:1820-1824 beschrieben
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, daß physiologisch wirksame Säugetierproteine in Pflanzenzellen erzeugt werden können. Stabile Botschaften werden durch Transkription des in das Pflanzengenom integrierten Säugetiergens erzeugt, welche Botschaft dann in das Säugetierprodukt translatiert werden kann, um physiologisch wirksame Proteine zu schaffen. Das Säugetierprotein kann leicht frei von schädlichen Verunreinigungen isoliert werden, wie onkogener DNA, Exotoxinen und ähnlichem. Außerdem können die Produkte verarbeitet werden, um ein reifes Produkt zu schaffen, das die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Struktur und Zusammensetzung aufweist wie das natürlich auftretende Peptidprodukt. u Obwohl die vorangehende Erfindung zum Zweck eines klaren Verständnisses detailliert mittels Veranschaulichung und Beispielen beschrieben worden ist, ist offensichtlich, daß bestimmte Abänderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims (13)

1. Verfahren zur Erzeugung eines Säugetierpeptids, welches umfaßt:
das Züchten von Pflanzenzellen, die eine integrierte Sequenz enthalten, die umfaßt
eine erste Expressionskassette, die in der Transkriptionsrichtung (1) eine in den genannten Pflanzenzellen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, (2) ein für das genannte Säugetierpeptid kodierendes strukturelles Gen und (3) eine Terminationsregion aufweist,
wodurch das genannte strukturelle Gen exprimiert wird, um das genannte Säugetierpeptid zu erzeugen; und
das Isolieren des genannten Säugetierpeptids im wesentlichen frei von Pflanzenzellbestandteilen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die genannte integrierte Sequenz eine zweite Expressionskassette einschließt, die in der Transkriptionsrichtung (1) eine in den genannten Pflanzen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, (2) ein strukturelles Gen, das für ein Peptid kodiert, das die Selektion von das genannte Peptid exprimierenden Pflanzenzellen zuläßt, und (3) eine Terminationsregion aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die genannte Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion zumindest teilweise von einer Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion eines Ti- oder Ri-Plasmids abgeleitet ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die genannte Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion die Expression von Mannopinsynthase, Octopinsynthase oder Nopalinsynthase reguliert.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die genannte Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion der genannten ersten Expressionskassette von einem Pflanzengen abgeleitet ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die genannte integrierte Sequenz eine Begrenzungsregion von T-DNA umfaßt.
7. Verfahren zur Erzeugung eines Interferons, welches umfaßt:
das Züchten von Pflanzenzellen, die eine integrierte Sequenz enthalten, umfassend:
eine erste Expressionskassette, die in der Transkriptionsrichtung (1) eine Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, die in den genannten Pflanzenzellen funktionell ist und von einer Region abgeleitet ist, weiche die Expression eines T-DNA-Gens reguliert, (2) ein für ein Interferon kodierendes strukturelles Gen und (3) eine in den genannten Pflanzenzellen funktionelle Terminationsregion aufweist,
wodurch das genannte strukturelle Gen exprimiert wird, um das genannte Interferon zu erzeugen, und
das Isolieren des genannten Interferons im wesentlichen frei von Pflanzenzellbestandteilen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die genannte integrierte Sequenz eine zweite Expressionskassette einschließt, die in der Transkriptionsrichtung (1) eine in den genannten Pflanzenzellen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, (2) ein strukturelles Gen, das für ein Enzym kodiert, das antibiotische Resistenz verleiht und (3) eine T-DNA-Begrenzung aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die genannte Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion der ersten Expressionskassette die Expression des Mannopinsynthasegens von T-DNA reguliert.
10. Expressionskassette, die eine DNA-Sequenz umfaßt, die in der Transkriptionsrichtung eine in Pflanzenzellen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, ein für ein Säugetierpeptid kodierendes strukturelles Gen und eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationsregion aufweist.
11. Expressionskassette nach Anspruch 10, die mit der genannten DNA-Sequenz verbunden eine zweite Expressionskassette einschließt, die eine zweite in Pflanzenzellen funktionelle Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, ein strukturelles Gen, das für ein Peptid kodiert, das eine phänotypische Eigenschaft der Fähigkeit von Selektion in Pflanzenzellen bietet, und eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationsregion umfaßt.
12. Expressionskassette nach Anspruch 11, die eine T-DNA-Begrenzung einschließt.
13. DNA-Konstrukt, das eine erste Expressionskassette umfaßt, die in der Transkriptionsrichtung eine die Expression von Mannopinsynthase von T-DNA regulierende Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, ein für γ-Interferon kodierendes strukturelles Gen und eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationsregion aufweist, eine zweite Expressionskassette, die in der Transkriptionsrichtung eine die Expression von Octopinsynthase von T-DNA regulierende Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, ein strukturelles Gen, das für ein Pflanzenzellen antibiotische Resistenz verleihendes Enyzm kodiert, und eine in Pflanzenzellen funktionelle Terminationsregion umfaßt, und eine T-DNA-Begrenzung.
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