DE3446887C2 - Verfahren zur Herstellung von physiologisch aktivem, wasserlöslichem Hämin-arginat bzw. Hämin-lysinat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer physiologisch aktiven wasserlöslichen Hämin­ arginat- oder Häminlysinat-Verbindung, die in Tabletten oder Kapseln oder als Trockensubstanz für die Injektion nach der Rekonstitution, beispielsweise mit steriler Salzlösung, verwendet werden kann.

Hämin tritt im Organismus als prosthetische Gruppe von Hämoglobin in den meisten Cytochromen und in bestimmten Enzymen auf. Hämoglobin wird im Knochenmark synthetisiert. Wenn sich Häminproteine zersetzen, wird Hämin freigesetzt, jedoch wird nur ein geringer Teil davon bei der Synthese neuer Häminproteine bei normalen physiologischen Bedingungen verwendet. Hämin wird durch die Ein­ wirkung von Häminoxigenase in Biliverdin gespalten, welches weiter zu Bilirubin reduziert wird. Natives, intaktes Hämoglobin dient natürlich nicht als Substrat für Häminoxigenase.

Fehler bei der Hämoglobin-Synthese können durch eine gestörte Synthese von Hämin oder von Globinketten hervor­ gerufen werden. Die Hämin-Synthese kann gestört sein wegen (a) eines Mangels an einer für die Synthese er­ forderlichen Komponente oder (b) der Fehlfunktion eines die Synthese katalysierenden Enzyms.

(a) Eisenmangel ist in der Hämin-Synthese der begrenzende Faktor. Der Organismus erhält seinen täglichen Bedarf an Eisen (1 bis 2 mg) mit der Nahrung. Eisen­ mangel kann auf Eisenmangel in der Nahrung oder möglicher­ weise auf die Anwesenheit eisenbindender Verbindungen in der Nahrung zurückzuführen sein. Störungen in dem Eisen-Absorptionsmechanismus können ebenfalls zu Eisenmangel führen trotz eines ausreichenden Eisengehalts in der Nahrung. Unabhängig von der Ursache führt Eisen­ mangel früher oder später zu Anämie.

Bei dem selten vorkommenden Vitamin-B₆-Mangel ist die Ab­ sorption von Eisen normal, jedoch ist seine Ausnutzung durch die Zeilen inhibiert. Als Folge davon entwickelt sich eine bestimmte Art von sideroblastischer Anämie.

Anämie durch Eisenmangel wird entweder mit oralen Eisen­ zubereitungen (z. B. Eisensulfat oder Eisengluconat) oder, seltener, durch Injektionen (Eisensorbit) behandelt. Wenn der Eisen-Absorptionsmechanismus gestört ist, sind diese bekannten oralen Arzneimittel nutzlos; das Eisen dringt nicht einmal in die Zellen der intestinalen Schleimhaut ein. Im Gegensatz zu anorganischem Eisen wird Hämineisen, in dem das Eisen an Hämin gebunden ist, von diesen Zellen selbst in den Fällen einer gestörten Eisenabsoption ab­ sorbiert, welche gegenüber der bekannten oralen Therapie resistent sind. Somit ist Hämineisen das einzige bekannte, wirksame Arzneimittel für die orale Behandlung von therapieresistenten Fällen. Es wurde gefunden, daß Hämin­ eisen vier- bis fünfmal besser absorbiert wird als anorganisches Eisen, selbst bei sehr gesunden Menschen (Seppänen H. und Takkunen H., Suomen Lääkärilehti 36, 2071-2072, 1981).

(b) Die Synthese von Hämin wird enzymatisch reguliert. Die verminderte Funktion von die Hämin-Synthese katalysierenden Enzymen kann entweder erblich oder auf äußere Faktoren zurückzuführen sein. Sie führt unweigerlich zu einer erniedrigten Bildung von Hämin, was sich durch die Entwicklung von Porphyrie und bestimmten Arten von sideroblastischer Anämie oder anderen Krankheiten manifestiert.

Porphyrie ist die wichtigste Gruppe von Krankheiten als Folge verminderter Enzymfunktion. Bei Porphyrie-Patienten besteht bei einer Ansammlung der Porphyrine (Zwischen­ produkte bei der Hämin-Synthese) und eine erhöhte Aus­ scheidung dieser Produkte im Urin und Faeces. Die meisten Arten von Porphyrie manifestieren sich durch akute Anfälle, die schwierig zu beherrschen sind.

Manchmal können sich sideroblastische Anämien unterschiedlicher Art anstelle von Porphyrie als Folge der Fehl­ funktion von Enzymen, die an der Hämin-Synthese teilnehmen, entwickeln. Die sideroblastischen Anämien können ebenfalls entweder erblich oder nicht erblich sein.

Die Behandlung von Porphyrie hat bis jetzt prinzipiell darauf beruht, bestimmte Arzneimittel zu vermeiden und große Mengen an Kohlenhydraten während der akuten Anfälle zu verabreichen, aber die Wirkung ist mäßig. Da die Ätio­ logie von Porphyrie geklärt wurde, hat die intravenöse Behandlung mit Häminverbindungen (Hämatin) kontinuierlich Beachtung gefunden. Hämatin ist bei der Behandlung von Porphyrie-Anfällen wirksam, verursacht jedoch bei mehr als 50% der Patienten eine Thrombophlebitis. Weiterhin ist es sehr instabil, und daher ist seine Herstellung in industriellem Maßstab ungeeignet. Es bestehen sehr wenig Möglichkeiten für eine wirksame Behandlung von Porphyrie-Patienten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine wasserlösliche Hämineisen-Verbindung zur Behandlung bestimmter Arten von Anämie zur Verfügung zu stellen, wobei das Eisen leicht verfügbar ist, wie beispielsweise in dem Häminmolekül. Die Verbindung soll für die Behandlung von Porphyrie geeignet sein, wo die normale Bildung von Hämoglobin aus dem einen oder anderen Grund gestört ist. Da die Verbindung für die orale Verabreichung in Tabletten oder Kapseln wie auch für die Injektion geeignet sein soll, muß sie wasserlöslich sein.

Hämin, welches in Wasser mäßig löslich ist, kann in reiner Form aus Blut durch Extraktion mit einem Gemisch aus Chlorwasserstoff- oder Essigsäure aus einer Wasser­ lösung von hämolysierenden Erythrozyten erhalten werden. Ein anderes Verfahren beruht auf der Extraktion von Hämin mit Aceton in Anwesenheit von z. B. Histidylhistidin, Pilocarpin oder Imidazol bei einem pH-Wert von 7,0 (N. W. Wakid und K. Y. Helou, Int.J.Biochem. 4, 259-267, 1973).

In der PCT-Patentanmeldung Nr. 813749 (PCT/F181/00026) wird ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Häminkonzentrats beschrieben, bei dem etwa 40% (Gew./Gew.) Hämin erhalten werden und der Rest eine "Blutsubstanz" unbekannter Natur ist. Das Produkt soll in lyophili­ sierter Form als Eisenergänzung in Nahrungsmitteln oder als anti-anämisches Arzneimittel eingesetzt werden.

Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß das End­ produkt ein Gemisch aus Hämin und einer "Blutsubstanz" ist. Da die letztere Komponente nicht einheitlich ist, ist das Gemisch für die Injektion ungeeignet.

Porphyrie wurde in Krankenhäusern mit einem Gemisch be­ handelt, das extempore durch Auflösen von Hämin in einer sterilen Natriumcarbonatlösung (Hämatin) erhalten wurde. Da diese Lösung instabil ist, kann sie nicht als Handels­ produkt in großem Maßstab hergestellt werden. Außerdem verursacht Hämatin eine Thrombophlebitis an der Injektions­ stelle in etwa 50% der Fälle, vermutlich wegen des hohen pH-Werts der Lösung. Dies ist ein großer Nach­ teil, der die Brauchbarkeit des Produktes beachtlich verringert.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von phy­ siologisch aktivem, wasserlöslichem Häminarginat bzw. Hämin­ lysinat, das dadurch gekennzeichnet wird, daß man kristallines Hämin mit L-Arginin bzw. L-Lysin im Molverhältnis 1 : 2 bis 1 : 4 in einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Isopropanol und Aceton, und Wasser, wobei der Wassergehalt maximal 7%, bezogen auf das Lösungs­ mittelgemisch beträgt, bei Raumtemperaturen unter heftigem Rühren während 10 bis 15 Stunden umsetzt. Die Zusammensetzung des Lösungsmittels, d. h. das Verhältnis an organischem Lösungsmittel zu Wasser, ist überraschenderweise für den medizinischen Wert des Endproduktes wichtig. Der Wasser­ gehalt in dem Lösungsmittelgemisch ist so niedrig (etwa 7%), daß weder Hämin noch das mäßig lösliche L-Arginin aufgelöst werden. Die Reaktion findet unter heftigem Rühren statt und der pH-Wert der Lösung wird kontinuierlich kontrolliert. Das gebildete Produkt wird abgetrennt und getrocknet; die Häminverbindung wird so in trockener Form erhalten und ist in Wasser löslich, was für die Medizin aus pharmakologischer Sicht wichtig ist.

Das Häminmolekül enthält zwei Carboxylgruppen, die mit den basischen Aminogruppen von L-Lysin oder L-Arginin reagieren.

Häminarginat und Häminlysinat, die erfindungsgemäß her­ gestellt wurden, werden in Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösungen wird bestimmt und zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit dem pH-Wert eines mechanischen Gemisches aus Hämin und L-Arginin, gelöst in Wasser, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Die Ergebnisse der pH-Messungen zeigen, daß der pH von Häminarginat und Häminlysinat bis zu etwa 24 h stabil ist (pH etwa 8). Der pH-Wert eines mechanischen Gemisches nimmt andererseits sehr langsam ab, vermutlich bedingt durch die extrem langsame Reaktion zwischen den Carboxyl­ gruppen in dem Hämin und der Aminogruppe in der L-Amino­ säure. Daher kann nach diesem Verfahren kein therapeutisch brauchbares Produkt erhalten werden. Häminarginat und Häminlysinat, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, bestehen aus einer Komplexverbindung, in der die L-Amino­ säure mit den Hämincarboxylen reagiert hat.

Um einerseits die optimale molare Beziehung zwischen den beiden Reaktionsteilnehmern und andererseits die ge­ eignetste Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches zu bestimmen, wurden die folgenden Versuche mit Hämin und Arginin durchgeführt.

Kristallines Hämin und L-Arginin in molaren Verhältnissen von 1 : 2 und 1 : 3 wurden unter heftigem Rühren in einem Lösungsmittelgemisch umgesetzt, welches aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser in unterschiedlichen Anteilen bestand. Die gebildeten Niederschläge wurden ab­ filtriert, gewaschen und getrocknet.

Die Löslichkeit in Wasser wurde bestimmt, indem man unter heftigem Rühren während etwa einer Stunde etwa 1,0 g des bei jedem Versuch erhaltenen Häminarginats in 50 ml destilliertem Wasser auflöste.

Die Lösungen werden zentrifugiert (etwa 3500 U/min) und der Rückstand wird mit 10 ml destilliertem Wasser und 10 ml Aceton gewaschen, danach getrocknet und abgewogen. Der unlösliche Rückstand besteht hauptsächlich aus nicht­ umgesetztem Hämin. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Die sich bei einigen Versuchen gebildete teerige Substanz konnte nicht in Pulverform überführt werden.

Der praktische molare Anteil von Hämin zu Arginin beträgt 1 : 3 und das geeignetste Lösungsmittelgemisch besteht aus 300 ml Aceton und 20 ml Wasser, da Hämin einen geringen Überschuß an L-Argin benötigt, damit es richtig reagiert.

Die lokale Wirkung von intravenös infundierten Häminver­ bindungen auf das umgebende Gewebe wird untersucht, indem man 5 mg/kg in die aurikulare Vene von California White Kaninchen infundiert. Als Vergleichslösung wurde eine bekannte Hämincarbonatlösung (Hämatin) verwendet.

Nach der Infusion der Häminarginatlösung bleibt das die Vene umgebende Gewebe normal, d. h. man beobachtet keine sterile Inflammation (Thrombophlebitis).

Ein ähnliches Ergebnis wird nach der Infusion einer ent­ sprechenden Häminlysinatlösung erhalten. Man kann somit daraus schließen, daß die Verbindungen keine Thrombo­ phlebitis verursachen, wenn sie intravenös infundiert werden.

Wird eine Hämincarbonatlösung auf gleiche Weise verab­ reicht, verfärbt sich das Gewebe um die Vene rot und wird gereizt, d. h. es manifestiert sich eine sterile In­ flammation (Thrombophlebitis). 3 Tage nach der Infusion von Hämincarbonatlösung wird die Thrombophlebitis noch manifest.

Der physiologische Charakter der unterschiedlichen, wasser­ löslichen Häminverbindungen wird geprüft, indem man die Fähigkeit von Häminoxigenase untersucht, die Verbindungen zu spalten. Das physiologische Substrat für Hämin­ oxigenase, Methemalbumin, wird dadurch in Biliverdin ge­ spalten, welches weiter zu Bilirubin durch Biliverdin- Reduktase reduziert wird. Es wird somit ein Überschuß an Hämin, den der Organismus nicht ausnutzen kann, zuerst durch Häminoxigenase in Bilirubin und andere, eng ver­ wandte Substanzen zersetzt, die normalerweise ausgeschieden werden. Das die Reaktionsrate begrenzende Enzym ist somit Häminoxigenase.

Bei den enzymatischen Analysen, die durchgeführt wurden, um beispielsweise die Fähigkeit von Häminarginat und Häminlysinat, als Substrate für Häminoxigenase zu dienen, herauszufinden, wurde die Aktivität des Vergleichssubstrats Methemalbumin mit 100 angenommen. Der entsprechende Wert, den man für Häminarginat und Häminlysinat erhält, beträgt 106. Die Aktivitäten der anderen Häminamin- Derivate betragen, wenn die Aminkomponente Dietha­ nolamin, Ethylamin, Cyclohexylamin oder Piperidin ist, 13, 21, 31 bzw. 78. Die Versuche zeigen, daß Häminarginat und Häminlysinat sich im Organismus hinsichtlich der Häminoxigenase wie normale physiologische Verbindungen verhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

6,52 g (0,01 M) kristallines Hämin und 3,48 g (0,02 M) kristallines L-Arginin werden 10 bis 15 h in einem Becherglas, das mit einem mechanischen Rührer ausgerüstet ist und ein Lösungsmittelgemisch aus 300 ml Aceton und 20 ml Wasser enthält, heftig gerührt. Das gebildete Produkt wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute an Häminarginat = 9,5 g (95%); unlöslicher Rückstand, bestimmt nach dem obigen Verfahren = 0,14 g (14%).

Beispiel 2

6,52 g (0,01 M) kristallines Hämin und 4,36 g (0,025 M) kristallines L-Arginin werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Ausbeute an Häminarginat = 11,1 g (etwa 100%); unlöslicher Rückstand = 0,042 g (4,2%).

Beispiel 3

6,52 g (0,01 M) kristallines Hämin und 5,23 g (0,03 M) kristallines L-Arginin werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Ausbeute an Häminarginat = 12,0 g (etwa 102%); unlöslicher Rückstand = 0,001 g (0,1%).

Beispiel 4

6,52 g (0,01 M) kristallines Hämin und 6,10 g (0,035 M) kristallines L-Arginin werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Ausbeute an Häminarginat = 12,0 g (95%); unlöslicher Rückstand = 0,0005 g (0,05%).

Beispiel 5

6,52 g (0,01 M) kristallines Hämin und 4,39 g (0,03 M) kristallines L-Lysin werden gemäß Beispiel 1 behandelt. Ausbeute an Häminlysinat = 10,8 g (99%); unlöslicher Rückstand = 0,020 g (2,8%).

Es scheint, daß der optimale molare Anteil des Hämins zu Arginat 1 : 3 (Beispiel 3) beträgt, da man hiermit die höchste Ausbeute an Häminarginat erhält, während die Menge an unlöslichem Rückstand minimal ist.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von physiologisch aktivem, wasserlöslichem Häminarginat bzw. Häminlysinat, dadurch gekennzeichnet, daß man kristallines Hämin mit L-Arginin bzw. L-Lysin im Molverhältnis 1 : 2 bis 1 : 4 in einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus Methanol, Ethanol, Isopropanol und Aceton, und Wasser, wobei der Wassergehalt maximal 7%, bezogen auf das Lösungsmittelgemisch beträgt, bei Raumtemperatur unter heftigem Rühren während 10 bis 15 Stunden umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittelgemisch Aceton und Wasser in einem Anteil von 300 : 10 bis 300 : 25 Vol./Vol. umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittelgemisch Aceton und Wasser in einem Anteil von 300 : 20 Vol./Vol. umfaßt.

4. Verwendung des Produkts nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Behandlung verschiedener Arten von Anämie.

5. Verwendung des Produkts nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Behandlung von Anämie, die mit Porphyrie assoziiert ist.