DD249028A5 - Verfahren zur herstellung einer neuen haemin-komplexverbindung mit medizinischer verwendbarkeit - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen, physiologisch aktiven, wasserloeslischen Komplexverbindung von Haeminarginat oder Haeminlysinat. Erfindungsgemaess reagieren kristallines Haemin und die Aminosaeure L-Arginin- oder L-Lysin einem molaren Verhaeltnis von 1:3 bei Zimmertemperatur unter starkem Ruehren ueber einen Zeitraum von 10 bis 15 Stunden in einem Loesungsmittelgemisch aus Aceton und Wasser 300:20 Vol/Vol miteinander. Das gebildete Haeminarginat oder Haeminylsinat ist eine pulverfoermige, stabile Verbindung und geeignet fuer den Einsatz als Ausgangsmaterial in Tabletten oder Kapseln oder als Trockensubstanz fuer die Zubereitung von Injektionsloesungen zur Behandlung verschiedener Anaemiearten, insbesondere mit Porphyria verbundener Anaemien.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer physiologisch aktiven, wasserlöslichen Häminarginat- oder Häminlysinatverbindung, die in Tabletten oder Kapseln oder als Trockensubstanz zur Injektion nach Wiederauflösung z. B. mit steriler Salzlösung eingesetzt werden kann.

Bekannte technische Lösungen

Hämin tritt im Organismus als prosthetische Gruppe von Hämoglobin in den meisten Cytochromen und in bestimmten Enzymen auf. Hämoglobin wird im Knochenmark synthetisiert. Wenn Häminproteine zersetzt werden, wird Hämin freigesetzt, jedoch wird nur ein geringer Teil davon für die Synthese von neuen Häminproteinen unter normalen physiologischen Bedingungen verwendet. Hämin wird durch Häminoxygenase in Biliverdin gespalten, das weiter zu Bilirubin reduziert wird. Natürliches, intaktes Hämoglobin dient natürlich nicht als Substrat von Häminoxygenase.

Defekte in der Hämoglobinsynthese können zur gestörten Synthese von Hämin oder von Globinketten führen. Die Häminsynthese kann gestört werden a) durch Fehlen von für die Synthese notwendigen Komponenten oder b) durch Funktionsstörungen eines die Synthese katalysierenden Enzyms.

a) Eisenmangel ist der beschränkende Faktor der Häminsynthese.

Der Organismus benötigt täglich 1-2 mg Eisen über die Nahrung. Eisenmangel kann auftreten durch ein Schonkostdefizit an Eisen oder möglicherweise durch das Vorhandensein von eisenbindenden Verbindungen in der Nahrung. Störungen im Eisenabsorptionsmechanismus können auch zum Eisenmangel führen, unabhängig von entsprechendem Eisengehalt der Nahrung. Abgesehen von der Ursache führt Eisenmangel früher oder später zu Anämie.

Beim selten auftretenden Vitamin B₆-Mangel ist die Eisenabsorption normal, jedoch die Verwertung durch die Zellen ist gehemmt. Im Ergebnis entwickelt sich ein bestimmter Typ von sideroblastischer Anämie.

Eisenmangelanämie wird entweder mit oralen Eisenpräparaten (z. B. Eisensulfat oder Eisengluconat) oder seltener mit Injektionen (Eisensorbitol) behandelt. Wenn der Eisenabsorptionsmechanismus gestört ist, sind diese konventionellen Präparate nicht verwendbar; das Eisen dringt nicht einfach in die Zellen der Darmschleimhaut ein. Im Gegensatz zum anorganischen Eisen, wird das Hämin-Eisen, bei dem das Eisen an Hämin gebunden ist, durch diese Zellen absorbiert gerade in solchen Fällen von gestörter Eisenabsorption, denen gegenüber die konventionelle orale Therapie nicht anschlägt. Somit ist das Hämin-Eisen das einzige bekannte, wirksame Heilmittel zur oralen Behandlung von theapieresistenten Fällen. Es wurde gefunden, daß Hämin-Eisen vier- bisfünfmal besser von gleichen Testsubjekten als anorganisches Eisen absorbiert wird (Seppänen, H. und Takkunen, H.; Suomen Lääkärilehti 36: 2071-2072,1981).

b) Die Häminsynthese wird enzymatisch reguliert. Eine schädigende Funktion der Enzyme, die die Häminsynthese katalysieren, kann entweder erblich sein oder von äußeren Faktoren verursacht werden. Das führt unausweichlich zu abgebauten Häminformen, was sich durch das Auftreten von Porphyrie oder bestimmten Arten sideroblastischer Anämie oder anderen Krankheiten zeigt.

Porphyrie gehört zur wichtigsten Krankheitsgruppe, die sich durch eine geschädigte Enzymfunktion ergibt. Bei Porphyriepatienten tritt ein Um lauf von Porphyrinen, Zwischenprodukten der Häminsynthese und eine gesteigerte Absonderung dieser in den Urin und Stuhl auf. Die meisten Arten der Porphyrie zeigen sich durch akute Anfälle, die äußerst schwierig zu beherrschen sind.

Teilweise können sich sideroblastische Anämien verschiedener Art anstelle von Porphyrie entwickeln als Ergebnis der Funktionsstörung von Enzymen, die an der Häminsynthese teilnehmen. Sideroböastische Anämien können auch entweder erblich oder erworben sein.

Die Behandlung der Prophyrie basiert bis heute prinzipiell auf der Vermeidung bestimmter Arzneistoffe und der Verabreichung großer Mengen Kohlehydrate während der akuten Anfälle, die Wirkung ist jedoch gering. Da die Äthiologie der Porphyrie aufgeklärt worden ist, hat die intravenöse Behandlung mit Häminverbindungen (Hämatin) kontinuierlich zugenommen. Hämatin hat sich bei der Behandlung von Porphyrieanfällen als wirksam erwiesen, jedoch ist bei mehr als 50% der Patienten Thrombophlebitis aufgetreten. Darüber hinaus ist es sehr instabil und damit für die Produktion im industriellen Maßstab ungeeignet. Es gibt somit nur geringe Möglichkeiten zur effektiven Behandlung von Porphyriepatienten. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine wasserlösliche Hämin-Eisen-Verbindung zur Behandlung von verschiedenen Anämiearten herzustellen, bei der das Eisen im Häminmolekül vorhanden ist. Die Verbindung ist in erster Linie zur Prophyriebehandlung gedacht, wo die normale Hämoglobinproduktion aus dem einen oder anderen Grunde gestört ist. Da die Verbindung sowohl für die orale Verabreichung in Tabletten oder Kapseln als auch für die Injektion geeignet sein soll, muß sie wasserlöslich sein.

Das nur geringfügig in Wasser lösliche Hämin kann man in reiner Form aus Blut durch Extraktion mit einem Gemisch aus Salzsäure oder Essigsäure aus einer wäßrigen Lösung hämolysierter Erythrocyten erhalten. Ein anderes Verfahren beruhtauf der Extraktion von Hämin mit Aceton in Anwesenheit von z.B. Histidy I histidin, Pilocarpin oder Imidazol bei pH 7,0 (Wa kid, N.W. und Helon, K. Y., Int. J. Biochem. 4:259-267,1973).

Die PCT-Patentanmeldung Nr. 813749 (PCT/FI 81/00026) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Häminkonzentrats,in dem etwa 40% (Masse/Masse) Hämin sind und der Rest eine „Blutsubstanz" unbekannter Art. Das Produkt ist vorgesehen, in lyophilisierter Form als eine Eisenergänzung in Nahrungsmitteln oder als antianämisches Arzneimittel eingesetzt zu werden. Der Nachteil dieses Verfahrens ist, daß das Endprodukt ein Gemisch von Hämin und der „Blutsubstanz" ist. Da die letztere Komponente nicht gleichbleibend ist, ist das Gemisch für die Injektion ungeeignet.

Porphyrie wurde in Kliniken mit einem Gemisch behandelt, das man unmittelbar vorher durch Lösen von Hämin in einer sterilen Natriumkarbonatlösung (Hämatin) hergestellt hatte. Da diese Lösung instabil ist, kann sie nicht als Handelsprodukt großtechnisch hergestellt werden. Darüber hinaus ruft Hämatin Thrombophlebitis der Injektionsstelle bei etwa 50% der Fälle vor, vermutlich wegen des hohen pH-Wertes der Lösung. Das ist ein ernsthafter Nachteil, der die Verwendbarkeit des Produktes beträchtlich verringert.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, diese Nachteile im wesentlichen auszuräumen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine wasserlösliche Hämin-Eisen-Verbindung zur Behandlung von verschiedenen Anämiearten herzustellen, bei der das Eisen im Häminmolekül vorhanden ist.

Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung einer wasserlöslichen Häminverbindung in einer geringfügigen Reaktion von wasserlöslichem, kristallinem Hämin mit einer geeigneten Base, z. B. einer Aminosäure wie L-Ly si η oder L-Arginin, in einem Lösungsmittelgemisch, das Wasser und Aceton enthält. Die Zusammensetzung des Lösungsmittels, d.h. der Anteil von organischem Lösungsmittel und Wasser, ist überraschend von Bedeutung für den medizinischen Wert des Endproduktes. Der Wassergehalt im Lösungsmittelgemisch ist so gering (etwa 7%), daß weder Hämin noch das gut lösliche L-Arginin gelöst wird.

Die Reaktion erfolgt unter starkem Rühren und der pH-Wert der Lösung wird kontinuierlich kontrolliert. Das gebildete Produkt wird abgetrennt und getrocknet; die Häminverbindung wird auf diese Weise in trockener Form erhalten und ist in Wasser löslich, was sowohl in medizinischer als auch in pharmakotechnischer Beziehung wesentlich ist.

Das Harn in molekül enthält zwei Carboxy gruppen, die mit den basischen Aminogruppen von L-Lysin oder L-Arginin reagieren.

Erfindungsgemäß hergestelltes Häminarginat und Häminlysinat wurden in Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösungen gemessen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit dem pH-Wert eines mechanischen Gemisches von Hämin und L-Arginin gelöst in Wasser verglichen.

Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 zu ersehen.

Tabelle 1

pH-Wert OMin. 60 Min. 24 h

Häminarginat 0,02937 g/25 ml 8,22 8,22 8,22

Häminlysinat 0,02760g/25ml 8,10 7,97 8,13

Hämin+ 0,01630g/25ml 10,13 9,81 9,33

L-Arginin 0,01307 g/25 ml 10,13 9,81 9,33

Die Ergebnisse der pH-Messungen zeigen, daß der pH-Wert von Häminarginat und Häminlysinat stabil ist (pH etwa 8) für bis zu 24 Stunden. Der pH-Wert des mechanischen Gemisches verringert sich dagegen sehr langsam, wahrscheinlich wegen der extrem langsamen Reaktion zwischen den Carboxygruppen im Hämin und der Aminogruppe in der L-Aminosäure. Mittels dieses Verfahrens kann daher kein therapeutisch nützliches Produkt erhalten werden. Häminarginat und Häminlysinat, die erfindungsgemäß hergestellt werden, bestehen aus einer Komplexverbindung, in der die L-Aminosäure mit den Hämincarboxygruppen reagiert hat.

Um sowohl die optimale molare Beziehung zwischen den beiden Reaktionsteilnehmern zu bestimmen, als auch die geeignetste Zusammensetzung des Lösungsmittelgemisches, wurden mit Hämin und Arginin die folgenden Tests durchgeführt:

Man ließ kristallines Hämin und, L-Arginin in molaren Verhältnissen von 1:2 und 1:3 miteinander reagieren, wobei stark gerührt und ein Lösungsmittelgemisch, bestehend aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser in unterschiedlichen Anteilen eingesetzt wurde. Die gebildeten Niederschläge wurden abfiltriert, gewaschen und getrocknet.

Die Löslichkeit im Wasser wurde durch Auflösen von etwa 1,0g Häminarginat, das in jedem Versuch erhalten wurde, in 50ml destilliertem Wasser unter starkem Rühren über etwa eine Stunde bestimmt.

Die Lösungen wurden zentrifugiert (etwa mit 3500 U/min) und der Rest mit 10ml destilliertem Wasser und 10ml Aceton gewaschen, anschließend getrocknet und gewogen. Der unlösliche Rest bestand im wesentlichen aus nicht umgesetztem Hämin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 enthalten.

Hämin: L-Arginin

Masse	Molverhältnis	Lösungsmittel	ml	Temp. 0C	wasserunlöslicher
					Rest
6,52:3,48	1:2	Methanol	300	20	Teer
6,52:3,48	1:2	Ethanol	300	20	= 100%
6,52:5,22	1:3	Ethanol	300	40	20,2 %
6,52:3,48	1:2	Isopropanol	» 300	20	= 100%
6,52:3,48	1:2	i-Propanol/Wasser	300:20	20	21,2%
6,52:5,22	1:3	i-Propanol/Wasser	300:20	20	9,7%
6,52:3,48	1:2	Aceton/Wasser	300:15	20	16,8%
6,52:3,48	1:2	Aceton/Wasser	300:20	20	12,4%
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	300:10	20	= 100%
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	300:10	40	11,4%
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	300:15	20	8,3 %
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	300:20	20	0,3%
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	300:30	20	Teer
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	150:10	20	4,2 %
6,52:5,22	1:3	Aceton/Wasser	150:12,5	20	Teer

die in einigen Versuchen erhaltene teerige Substanz konnte nicht in eine Pulverform überführt werden.

Das praktisch andere Verhältnis von Hämin zu Arginin wurde bei 1:3 gefunden, und das geeignetste Lösungsmittelgemisch war 300ml Aceton und 20ml Wasser, das Hämin einen leichten L-Arginin-Überschuß für die gute Reaktion braucht.

Die lokale Wirkung von intravenös infundierten Häminverbindungen auf das umgebende Gewebe wurde untersucht durch Infundieren von 5mg/kg in die Auricularvene von Kaninchen des Typs „California White". Als Referenzlösung wurde eine übliche Häminkarbonatlösung (Hämatin) benutzt. Nach der Infusion der Häminarginatlösung erschien das Umgebungsgewebe der Vene normal, d. h. keine sterile Entzündung (Thrombophlebitis) trat auf.

Ein ähnliches Ergebnis war nach Infusion einer entsprechenden Häminlysinatlösung zu beobachten. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß die Verbindungen bei intravenöser Infusion keine Thrombophlebitis hervorrufen.

Wenn eine Häminkarbonatlösung in gleicher Weise verabreicht wird, wird das Gewebe um die Vene herum rot und gereizt, d. h.

es entwickelt sich eine sterile Entzündung (Thrombophlebitis). Drei Tage nach der Infusion der Häminkarbonatlösung war die Thrombophlebitis noch vorhanden.

Der physiologische Charakter der verschiedenen wasserlöslichen Häminverbindungen wurde eingeschätzt, indem die Fähigkeit von Häminoxygenase getestet wurde, die Verbindungen zu spalten. Das physiologische Substrat für Häminoxygenase, Methämalbumin, wurde dabei in Biliverdin gespalten, das weiter zu Bilirubin durch Biliverdinreduktase reduziert wurde. Somit wird das überschüssige Hämin, das der Organismus nicht braucht, zersetzt, und zwar in erster Linie durch Häminoxygenase in Bilirubin und andere verwandte Substanzen, die dann normal ausgeschieden werden. Das die Reaktionsrate beschränkende Enzym ist somit Häminoxygenase.

Bei durchgeführten enzymatischen Analysen mit dem Ziel, einerseits die Fähigkeit von Häminarginat und Häminlysinat, als Substrate für Häminoxygenase zu dienen, herauszufinden, wurde die Aktivität des Bezugssubstrates Methämalbumin als 100 ausgedrückt. Der entsprechende Wert, derfürHäminarginst und Häminlysinat erhalten wurde, lag bei 106. Die Aktivitäten anderer Häminaminderivate, bei denen die Aminkomponente Diethanolamin, Ethyiamin, Cyclohexylamin oder Piperidin war, lagen entsprechend bei 13, 21, 31 und 78. Die Tests zeigen, daß Häminarginat und Häminlysinat sich im Hinblick auf Häminoxygenase im Organismus wie normale physiologische Verbindungen verhalten.

Die Erfindung wird am besten durch folgende Beispiele erläutert:

Beispie! 1

6,52g kristallines Hämin (0,01 Mol) und 3,48g kristallines L-Arginin (0,02 Mol) wurden in einem Becherglas, das mit einem mechanischen Rührer versehen war und ein Lösungsmittelgemisch aus 300 ml Aceton und 20 ml Wasser enthielt, stark für 10 bis 15 Stunden gerührt. Das gebildete Produkt wurde abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute an Häminarginat: 9,5g (95%). Unlöslicher Rest, bestimmt durch die oben genannte Methode: 0,14g (14%).

Beispiel 2

6,52g kristallines Hämin (0,01 Mol) und 4,36g kristallines L-Arginin (0,025 Mol) wurden wie im Beispiel 1 beschrieben^handelt. Ausbeute an Häminarginat: 11,1g (etwa 100%); unlöslicher Rest: 0,042g (4,2%).

Beispiel 3

6,52g kristallines Hämin (0,01 Mol) und 5,23g kristallines L-Arginin (0,03 Mol) wurden₍wie im Beispiel 1 beschrieben₍behandelt. Ausbeute an Häminarginat: 12,0g (etwa 102%); unlöslicher Rest: 0,001 g (0,1 %).

Beispiel 4

6,52g kristallines Hämin (0,01 Mol) und 6,10g kristallines L-Arginin (0,035 Mol) wurden wie im Beispiel 1 beschriebe^behandelt. Ausbeute an Häminarginat: 12,0g (95%); unlöslicher Rest: 0,0005g (0,05%).

Beispiel 5

6,52g kristallines Hämin (0,01 Mol) und 4,39g kristallines L-Lysin (0,03 Mol) wurde^wie im Beispiel 1 beschriebe^behandelt. Ausbeute an Häminlysinat: 10,8g (99%); unlöslicher Rest: 0,020g (2,8%).

Es scheint so, daß das optimale molare Verhältnis von Hämin zum Arginat 1:3 ist (Beispiel 3), da hierbei die höchste Ausbeute an Häminarginat erhalten wurde, während die Menge an unlöslichem Rest minimal war.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung einer neuen, physiologisch aktiven, wasserlöslichen Häminverbindung zum Einsatz als Ausgangsprodukt für Tabellen oder Kapseln oder als Trockensubstanz zur Herstellung von Injektionen für die Behandlung verschiedener Anämiearten, insbesondere mit Porphyria einhergehender Anämien, gekennzeichnet dadurch, daß kristallines Hämin mit einer basischen Aminosäure, vorzugsweise L-Arginin oder L-Lysin, in einem Gemisch vor organischem Lösungsmittel und Wasser, vorzugsweise Aceton und Wasser, bei Zimmertemperatur unter starkem Rühren für 10 bis 15 Stunden miteinander umgesetzt werden, wobei eine Komplexverbindung gebildet wurde, die aus Häminarginat bzw. Häminlysinat besteht.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das molare Verhältnis von Hämin zu L-Arginin 1:1 bis 1:4 beträgt, vorzugsweise 1:3.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das molare Verhältnis von Hämin zu L-Lysin 1:1 bis 1:4 beträgt, vorzugsweise 1:3.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Lösungsmittelgemisch aus Aceton und Wasser in einem Verhältnis von 300:10 bis 300:25 Vof/Vol besteht, vorzugsweise 300:20.