LU85716A1 - Procede de preparation d'un nouveau compose complexe d'hemine ayant des applications medicales - Google Patents

Description

BL-3683/vdw

Procédé de préparation d'un nouveau composé complexe d'hémine ayant des applications médicales.

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un composé de lysinate d'hémine ou 5 d'arginate d'hémine hydrosoluble, physiologiquement actif et destiné à être utilisé dans des comprimés ou des capsules ou sous forme d'une substance sèche pour injection après reconstitution, par exemple, avec une solution saline stérile.

10 L'hémine est présente dans l'organisme sous forme d'un groupe prothétique de l'hémoglobine dans la plupart des cytochromes et dans certaines enzymes. L'hémoglobine est synthétisée dans la moelle osseuse. Lorsque des protéines d'hémine se décomposent, l'hé-15 mine est libérée, mais une faible partie seulement de celle-ci est utilisée dans la synthèse de nouvelles protéines d'hémine dans des conditions physiologiques normales. Sous l'action de l'oxygénase d'hémine, l'hémine est clivée en biliverdine qui est en outre 20 réduite en bilirubine. Bien entendu, l'hémoglobine naturelle intacte ne sert pas de substrat pour l'oxygénase d'hémine.

Des· déficiences dans la synthèse de l'hémoglobine peuvent être dues à la synthèse perturbée de 25 l'hémine ou de chaînes de globine. La synthèse de l'hémine peut être perturbée : a) par manque d'un composant nécessaire pour la synthèse, ou b) par dysfonction d'une enzyme catalysant la synthèse.

a) La déficience en fer est le facteur 30 limitatif dans la synthèse de l'hémine. L'organisme reçoit ses besoins quotidiens en fer (1-2 mg) par la nourriture. La déficience en fer peut être due à un régime alimentaire pauvre en fer ou éventuellement à la présence de composés fixant le fèr dans la nour-.35 riture. Des perturbations survenant dans le mécanisme

L

2 d’absorption du fer peuvent également conduire à une déficience en fer même si la nourriture a une teneur adéquate en fer. Quelle qu'en soit la cause, la déficience en fer conduit tôt ou tard à l'anémie.

5 En cas de déficience en vitamine Bg, qui se produit rarement, l'absorption du fer est normale mais son utilisation par les cellules est inhibée.

En conséquence, il se produit un certain type d'anémie sidéroblastique.

10 On traite l'anémie due à la déficience en fer soit par des préparations orales de fer (par exemple, le sulfate de fer ou le gluconate de fer) ou, plus rarement, avec des injections (sorbitol de fer). Lorsque le mécanisme d'absorption du fer est 15 perturbé, ces préparations orales classiques sont inutiles ; le fer ne pénètre même pas dans les cellules de la muqueuse intestinale. Contrairement au fer inorganique, le fer d'hémine (fer fixé à l'hémine) est absorbé par ces cellules même dans les cas d'absorp-20 tion perturbée du fer qui résistent à une thérapie orale classique. Dès lors, le fer d'hémine est le seul remède efficace connu pour le traitement oral des cas résistant à la thérapie. On a trouvé que le fer d'hémine était 4 à 5 fois mieux absorbé que le 25 fer inorganique même chez des sujets parfaitement sains (Seppanen H & Takkunen H: Suomen Lääkärilehti 36 : 2071-2072, 1981).

b) La synthèse de l'hémine est réglée par voie enzymatique. La fonction perturbée des enzymes 30 catalysant la synthèse de l'hémine peut être héréditaire ou due à des facteurs extérieurs. Elle conduit invariablement à une formation réduite d'hémine se manifestant par le développement d'une porphyrie ou de certains types d'anémie sidéroblastique ou d'autres 351 maladies.

. L· 3

La porphyrie fait partie du groupe le plus important de maladies résultant de la fonction perturbée des enzymes. Chez les patients atteints de porphyrie, il se produit une accumulation de porphy-5 rines (produits intermédiaires dans la synthèse de l'hémine), ainsi qu'une excrétion accrue de ces por-phyrines dans l'urine et les matières fécales. La plupart des types de porphyries se manifestent par des attaques aiguës qu'il est extrêmement difficile 10 de maîtriser.

Il peut parfois se développer des anémies sidéroblastiques de différents types en lieu et place de la porphyrie par suite du dysfonctionnement des enzymes participant à la synthèse de l'hémine. De 15 même, les anémies sidéroblastiques peuvent être soit héréditaires, soit acquises.

Jusqu'à présent, le traitement de la porphyrie a été basé principalement sur la suppression de certains médicaments et sur l'administration d'im-20 portantes quantités d'hydrates de carbone au cours des attaques aiguës ; toutefois, les effets ont été médiocres. Etant donné que l’étiologie de la porphyrie a été clarifiée, le traitement intraveineux avec des composés d'hémine (hématine) a continuellement 25 gagné du terrain. L'hématine s'est avérée efficace dans le traitement des attaques de porphyrie mais, chez plus de 50% des patients, elle a provoqué une thrombophlébite. De plus, elle est très instable et, par conséquent, elle n'est pas appropriée pour une 30 production à l'échelle industrielle. En conséquence, il existe très peu de possibilités de traitement efficace des patients atteints de porphyrie.

Le but de la présente invention a été la production d'un composé de fer d'hémine hydrosoluble “J "”r “ “

Jk- r 4 fer étant, pour ainsi dire, disponible dans la molécule d'hémine. Çe composé est destiné en premier lieu au traitement de la porphyrie dans laquelle la production normale de l'hémoglobine est perturbée 5 pour une raison ou l’autre. Etant donné que ce composé est destiné à une administration orale sous forme de comprimés ou de capsules, ainsi que sous forme d'injection, il doit être hydrosoluble.

L'hémine, qui est peu soluble dans l'eau, 10 peut être obtenue à l'état pur dans le sang par extraction avec un mélange d'acide chlorhydrique ou d'acide acétique hors d'une solution aqueuse d'érythrocytes hémolysants. Un autre procédé est basé sur l'extraction de l'hémine avec l'acétone, par 15 exemple, en présence d'histidylhistidine, de pilo-carpine ou d'imidazole à un pH de 7 (V/akid N.W. &

Helou K.Y. : Int. J. Biochem. 4 : 259-267, 1973).

Dans la demande de brevet PCT n° 813.749, on décrit un procédé de préparation d'un concentrât 20 hydrosoluble d'hémine comprenant environ 40% en poids/ poids d'hémine, le reste étant une "substance du sang" de nature inconnue. Ce produit est destiné à être utilisé sous forme lyophilisée en tant que supplément de fer pour la nourriture ou comme médicament anti-25 anémique.

L'inconvénient de ce procédé réside dans le fait que le produit final est un mélange d'hémine et d'une "substance du sang". Etant donné que ce dernier composant n'est pas uniforme, le mélange 30 est inapproprié pour l'injection.

Dans les hôpitaux, on a traité la porphyrie avec un mélange extemporané préparé en dissolvant l'hémine dans une solution stérile de carbonate de sodium (hématine). Etant donné que cette solution est ins-35 I table, elle ne peut être fabriquée comme produit com- • A-

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5 mercial à grande échelle. De plus, l'hématine provoque une thrombophlébite à l'endroit de l'injection dans environ 50% des cas, probablement par suite du pH élevé de la solution. C'est là un inconvénient ’ 5 sérieux réduisant considérablement l'utilité du produit.

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un composé hydrosoluble d'hémine en faisant réagir de l'hémine cristalline peu soluble 10 dans l'eau avec une base appropriée, par exemple, un s acide aminé tel que la L-lysine ou la L-arginine, dans un mélange de solvants contenant, par exemple, de l'eau et de l'acétone. La composition du solvant, c'est-à-dire la proportion du solvant organique vis-I 15 à-vis de l'eau, est étonnamment importante pour la valeur médicale du produit final. La teneur en eau dans le mélange de solvants est à ce point faible (environ 7%) que ni l'hémine, ni la L-arginine assez aisément soluble ne sont dissoutes. La réaction a 20 lieu avec agitation vigoureuse et le pH de la solution est contrôlé continuellement. On sépare le produit formé et on le sèche ; le composé d'hémine est ainsi obtenu sous forme sèche et il est soluble dans l'eau, ce qui est essentiel du point de vue médical et du 25 point de vue pharmacotechnique.

La molécule d'hémine contient deux groupes carboxy qui réagissent avec les groupes amino basiques de la L-lysine ou de la L-arginine.

On a dissous 1'arginate d'hémine et le 30 lysinate d'hémine préparés suivant l'invention dans ; l'eau, on a mesuré le pH des solutions et on l'a comparé à différents moment avec le pH d'un mélange mécanique d'hémine et de L-arginine dissous dans , « l'eau. Les résultats sont repris dans le tableau 1.

.1 % 6 ? r*.

1 · TABLEAU 1 |R I | 0 mi- | 60 mi- | 24 heu- 111 - 5 _ nute nutes res mk lArginate d'hémine 0,02937 g/25 ml | 8,22 | 8,22 | 8,22 B Lysinate d'hémine 0,02760 g/25 ml 8,10 7,97 8,13 |Hémlne + 0,01630 g/25 ml | | | K j L-arginine 0,01307 g/25 ml j 10,13 j 9,81 j 9,33 BB Les résultats de la mesure du pH révèlent BK que le pH de l'arginate d'hémlne et du lysinate HS d'hémine est stable (pH : environ 8) pendant une SK „· * période allant jusqu'à 24 heures. D'autre part, le

Hi là 15 pH du mélange mécanique diminue très lentement, pro- ^^B JB' bablement par suite de la réaction extrêmement lente entre les groupes carboxy de l'hémine et le groupe ^^^BraB; ami no du L-amino-acide. En conséquence, on ne peut obtenir un produit thérapeutiquement utile par ce 20 procédé. L'arginate d'hémine et le lysinate d'hémine préparés suivant l'invention sont constitués d'un ^^^B composé complexe dans lequel le L-amino-acide a réagi avec les groupes carboxy de l'hémine.

Afin de déterminer, d'une part, le rapport 25 molaire optimum entre les deux réactifs et, d'autre part, la composition la mieux appropriée du mélange de solvants, on a effectué les essais décrits ci-après avec l'hémine et l'arginine.

On a fait réagir l'hémine et la L-arginine 30 à l'état cristallin en proportions molaires de 1:2 et de 1:3 tout en agitant vigoureusement dans un mélange de solvants constitué d'un solvant organique et d'eau dans des proportions variables. Par filtra-tion, on a séparé les précipités formés, on les a ^ lavés les a Λ 7 * *

On a déterminé la solubilité dans l'eau en dissolvant, tout en agitant vigoureusement pendant environ 1 heure, environ 1 g d'arginate d'hémine 5 obtenu dans chaque essai dans 50 ml d'eau distillée.

On a soumis les solutions à une centrifugation (environ 3.500 tours/minute) et on a lavé le résidu avec 10 ml d'eau distillée et 10 ml d'acétone, après quoi, on l'a séché et pesé. Le résidu insoluble 20 était constitué principalement d'hémine n'ayant pas réagi. Les résultats des essais sont donnés dans le tableau 2. = ·, TABLEAU 2 25 Hémine/L-argïnine Solvant ml Tempéra- Résidu

Poids Proportion ture (°C) insoluble (g)_molaire___dans l'eau 6,52:3,48 1:2 Méthanol 300 20 Goudron 6,52:3,48 1:2 Ethanol 300 20 - 100% 20 6,52:5,22 1:3 " 300 40 20,2% 6,52:3,48 1:2 Isopropanol 300 20 - 100% 6,52:3,48 1:2 Isopropanol/ 300:20 20 21,2% eau 6,52:5,22 1:3 " 300:20 20 9,7% 25 6,52:3,48 1:2 Acétone/ean 300:15 20 16,8% 6,52:3,48 1:2 " 300:20 20 12,4% 6,52:5,22 1:3 " 300:10 20 ~ 100% 6,52:5,22 1:3 " 300:10 40 11,4% .

6,52:5,22 1:3 " 300:15 20 - 8,3% 30 6,52:5,22 1:3 " 300:20 20 0,3% 6,52:5,22 1:3 " 300:30 20 Goudron 6,52:5,22 1:3 " 150:10 20 4,2% 6,52:5,22 1:3 *« 150:12,5 20 Goudron i- * 8

Dans certains essais, la substance goudronneuse n'a pu être transformée en poudre.

On a trouvé que le rapport molaire pratique entre l'hémine et l'arginine était de 1:3 et que le . 5 mélange de solvants le mieux approprié était cons titué de 300 ml d'acétone et de 20 ml d'eau, étant donné que l'hémine nécessite un léger excès de L-arginine pour réagir correctement.

On a étudié l'effet local exercé par des 10 composés d'hémine infusés par voie intraveineuse sur des tissus périphériques en infusant 5 mg/kg dans la veine auriculaire de lapins blancs de Californie. Comme solution de référence, on a utilisé une solution classique de carbonate d'hémine (hématine).

15 Après infusion de la solution d'arginate d'hémine, le tissu entourant la veine est resté normal, c'est-à-dire qu'il ne s'est produit aucune inflammation stérile (thrombophlébite).

On a observé un résultat analogue après 20 infusion d'une solution correspondante de lysinate d'hémine. Dès lors, on peut conclure que les composés ne provoquent aucune thrombophlébite lorsqu'ils sont infusés par voie intraveineuse.

Lorsqu'on a administré une solution de carbo-25 nate d'hémine de la même manière, le tissu entourant la veine est devenu rouge et irrité, c'est-à-dire qu'il s'est développé une inflammation stérile manifeste (thrombophlébite). Trois jours après l'infusion de la solution de carbonate d'hémine, la thrombophlé-30 bite était toujours manifeste.

On a déterminé le caractère physiologique des différents composés d'hémine hydrosolubles en éprouvant l'aptitude de l'oxygénase d'hémine à cliver . les composés. Le substrat physiologique pour l'oxy-35 I génase d'hémine, à savoir la méthemalbumine, est clivé

K

k 9 par cette dernière en biliverdine qui est, en outre, réduite en bilirubine par la réductase de biliverdine. Dès lors, l'excès d'hémine que l'organisme ne peut utiliser, est décomposé, en premier lieu, par l'oxy-5 génase d'hémine en bilirubine et autres substances étroitement apparentées qui sont ensuite normalement excrétées. Dès lors, l'enzyme limitant la vitesse réactionnelle est l'oxygénase d'hémine. Dans les analyses enzymatiques effectuées par la Demanderesse 10 pour découvrir l'aptitude de l'arginate d'hémine et du lysinate d'hémine à faire office de substrats pour l'oxygénase d'hémine, l'activité du substrat de réfé-rence, à savoir la méthemalbumine, a été exprimée par 100. La valeur correspondante obtenue pour l'argi-15 nate d'hémine et le lysinate d'hémine était de 106.

On a trouvé que les activités des autres dérivés aminés d'hémine dans lesquels le composant aminé était la diéthanolamine, 1'éthylamine, la cyclohexylamine ou la pipéridine, étaient respectivement de 13, 21, 31 20 et 78. Les essais démontrent que l'arginate d'hémine et le lysinate d'hémine ont eu, dans l'organisme, un comportement analogue à celui de composés physiologiques normaux en ce qui concerne l'oxygénase d'hémine.

L'invention est mieux illustrée par les 25 exemples suivants.

Exemple 1

Pendant 10 à 15 heures, dans un becher comportant un agitateur mécanique et contenant un mélange de solvants constitué de 300 ml d'acétone et de 20 ml 30 d'eau, on a agité vigoureusement 6,52 g d'hémine cristalline (0,01M) et 3,48 g de L-arginine cristalline (0,02M). Par filtration, on a séparé le produit formé, on l'a lavé avec de l'acétone et on l'a séché. Rendement en arginate d'hémine : 9,5 g (95%). Résidu 35 « insoluble déterminé par le procédé ci-dessus : 0,14 g , 10 Γ (14%).

Exemple 2

On a traité 6,52 g d'hémine cristalline (Ο,ΟΙΜ) et 4,36 g de L-arginine cristalline (0,025M) 5 comme décrit à l'exemple 1. Rendement en arginate d'hémine : 11,1 g (environ 100%). Résidu insoluble : 0,042 g (4,2%).

Exemple 3

On a traité 6,52 g d'hémine cristalline 10 (Ο,ΟΙΜ) et 5,23 g de L-arginine cristalline (0,03M) comme décrit à l'exemple 1. Rendement en arginate d'hémine : 12 g (environ 102%). Résidu insoluble : 0,001 g (0,1%).

Exemple 4 15 On a traité 6,52 g d'hémine cristalline (Ο,ΟΙΜ) et 6,10 g de L-arginine cristalline (0,035M) comme décrit à l'exemple 1. Rendement en arginate d'hémine : 12 g (95%). Résidu insoluble : 0,0005 g (0,05%).

20 Exemple 5

On a traité 6,52 g d'hémine cristalline (Ο,ΟΙΜ) et 4,39 g de L-lysine cristalline (0,03M) comme décrit à l'exemple 1. Rendement en lysinate d'hémine : 10,8 g (99%). Résidu insoluble : 0,020 g 25 (2,8%).

Il apparaît que le rapport molaire optimal entre l'hémine et 1'arginate est de 1:3 (exemple 3), car ce rapport a donné le rendement maximum en arginate d'hémine, tandis que la quantité de résidu inso-30 /1 lubie était minimale.

λ e.

Claims (5)

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1. Procédé de préparation d'un nouveau composé d'hémine hydrosoluble et physiologiquement actif destiné à être utilisé comme matière première * 5 dans des comprimés ou des capsules ou sous forme d'une substance sèche pour la préparation d'injections destinées au traitement de différents types d'anémies, en particulier, les anémies associées à la porphyrie, caractérisé en ce qu'on fait réagir de l'hémine cris-10 talline avec un amino-acide basique, de préférence, la L-arginine ou la L-lysine, dans un mélange d'un solvant organique et d'eau, de préférence, d'acétone et d'eau, à la température ambiante, tout en agitant vigoureusement pendant 10 à 15 heures, pour former < 15 ainsi un composé complexe constitué d'arginate d'hémine ou de lysinate d'hémine respectivement.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport molaire entre l'hémine et la L-arginine est de 1:1 - 1:4, de préférence, 20 de 1:3.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport molaire entre l'hémine et la L-lysine est de 1:1-1:4, de préférence, de 1:3.

4. Procédé selon la revendication 1, carac-25 térisé en ce que le mélange de solvants est constitué d'acétone et d'eau dans un rapport de 300:10-300:25 (volume/volume), de préférence, de 300:20.

5. Procédé selon la revendication 1, carac- „ térisé en ce que l'arginate d'hémine ou le lysinate 30 d’hémine hydrosoluble formé lors de la réaction entre * l'hémine et la L-arginine ou la L-lysine est utilisé en poudre dans des capsules, sous forme d'une substance sèche pour injection après reconstitution avec une solution saline stérile, ou conjointement avec un 35 /1 véhicule dans des comprimés, pour le traitement de f 12 différents types d'anémies, en particulier, les anémies associées à la porphyrie. ^