DE2443741A1 - Verfahren zur gemeinsamen bestimmung der isoenzyme der lactatdehydrogenase - Google Patents

Verfahren zur gemeinsamen bestimmung der isoenzyme der lactatdehydrogenase

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Description

DR. MÜLLER-BORE OIPL.-INC-. C-RO-ENING niPL.-CHEM. DR. DEUFEL
DIPL.-CHEM. DR. SCHÖN! DiPL.-PHYS. HERTEL
PATENTANWÄLTE
Kommanditgesellschaft Schwarzhaupt
5 Köln 1 ·
Sachsenring 37-47
S 97-1
Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung der Isoenzyme der Lactatdehydrogena se
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung der Isoenzyme der Lactatdehydrogenase (LDH) mittels Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+) zu Pyruvat.
Es ist bekannt, daß Lactatdehydrogenase, üblicherweise LDH
genannt, in fünf Isoformen auftritt. Bei der Aktivitätsbestimmung einzelner Isoenzyme sind unterschiedliche Substrat- und pH-Optima wichtige Merkmale, die für die einzelnen Isoenzyme noch nicht vollständig bekannt waren.
Zur Bestimmung aller Isoenzyme hat man bisher entweder die
Isoenzyme elektrophoretisch getrennt (vergl. z. B. "Die Isoenzyme der Lactatdehydrogenase", Reihe Biochemie und Klinik
von S. L. Kowalewski, erschienen im G. Thieme Verlag, Stuttgart 1972, Seite 29) oder die gesamte LDH in Lösung gehalten, die
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LDH-2 bis -5 gebunden und das am häufigsten vorkommende LDH-1 bestimmt. Eine Übersicht über die derzeitige Standanrdarbeitsmethode findet sich z. B. in dem Buch "Enzymatische Analyse", Band I, Verlag Chemie, Weinheim 1970, Seite 557. Danach wird für den Umsatz von Lactat zu Pyruvat ein pH-Optimum zwischen 8,3 und 8,9 vorgeschrieben. Tatsächlich wird bei allen bekannten Bestimmungsmethoden ein basischer oder höchstens etwa neutraler pH-Bereich angewandt, um die Isoenzyme möglichst vollständig zu erfassen. ....
Von Lamprecht et al. (Cardiology £6: 371 - 375 (1971/72) und Portschritte der chemischen Chemie, Enzyme und Hormone, Verlag der Wiener medizinischen Akademie 1972, S. 277 "bis 283 wurde festgestellt, daß einzelne Isoenzyme durch pH-Veränderung ineinander übergehen können, also eine Konformationsänderung stattfindet.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die bei dem bekannten Verfahren auftretenden komplizierten Arbeitsgänge des Trennens und die immer wieder festzustellenden Ungenauigkeiten der Gesamterfassung auszumerzen und eine optimale Bestimmung der LDH-I so enzyme (3) + 4- + 5 zu gewährleisten.-. Weiterhin soll die Erfindung eine Reagenskombination und spezielle Anwendungsmöglichkeiten des Verfahrens aufzeigen.
Es wurde festgestellt, daß eine Absenkung des pH-Wertes unter den Neutralpunkt bei der an sich bekannten Umsetzung von Lactat und NAD zu Pyruvat zu einer optimalen Erfassung, der Isoenzyme 4 und. 5 führt.
Erfindungsgegenstand ist demnach ein Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung mehrerer oder aller Isoenzyme der Lactatdehydrogenase (LDH), insbesondere der Isoenzyme 4 und 5» mittels Umsatz von Lactat \md ITikotinamid-Adenin-DinucIeotid (NAD ) zu Pyruvat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Umsatz bei
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einers, für das angewandto Puffer&ysteji spezifisch pH-Wert, "bei rlTiäthanolamin-NaOH-Puffer einem pH von 6,3 "bis 6,4 durchgeführt wird. Mir den Umsatz genügt eine geringe Menge Flüssigkeit, er v/ird jedoch zweckmäßig ira flüssigen Medium durchgeführt..
Es -wurde nämlich weiter festgestellt, daß das Optimum der gemeinsamen Bestimmung mehrerer Isoenzyme auch pufferabhängig ist. 51Ur die meisten Puffer liegt dieses Optimum "bei etwa pH 6 - 6,5- Mir Phosphatpuffer liegt dagegen z. B. das Optimum für das Isoenzym 5 "bei pH 7»9- Ein saurer pH-Wert eignet sich jedoch wesentlich besser zur gemeinsamen Bestimmung mehrerer Isoenzyme. Ein pH von etwa 6,3 "bis 6,4 eignet sich insbesondere zur gemeinsamen Erfassung von LDH 4 und 55 die beispielsweise in der Vaginalflüssigkeit auftreten können. ."
Vorzugsweise wird, im Umsatzmedium eine große Pufferkapazität bereitgestellt. Dies hat den Vorteil, daß auch bei der Untersuchung von Körperflüssigkeiten mit stark von pH 6 abweichendem pH-Wert der optimale pH beim Umsatz weder unter- noch überschritten wird.
Der Umsatz erfolgt in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur von ca. 37 °C. Dabei werden die Ko enzymni engen so eingestellt, daß sie für alle vorliegenden Isoenzyme optimal ausreichen, was unter Berücksichtigung der folgenden Angaben mit wenigen Routineversuchen bestimmt werden kann.
Die Bestimmung von LDH ist von großer Wichtigkeit insbesondere bei der Untersuchung von Körperflüssigkeiten. Während diese Isoenzyme beim gesunden Menschen überwiegend im Gewebe festgehalten werden, findet man sie bei anormalem Gewebewachstum. oder bei Leukämie oder sonstigen Krankheiten in merklicher Konzentration im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten. Ins-, besondere kann man feststellen, daß sie bei pathologischen Veränderungen im unteren weiblichen Genitaltrakt in der Vaginalflüssigkeit enthalten sind.
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Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode ist für alle Körperflüssigkeiten anwendbar. Die Einstellung des pH-Wertes der zu untersuchenden Probe hängt vom Eigen-pH-Wert der Probe ab. In jedem lall soll für den Umsatz selbst ein pH von 6,3 bis 6,4, insbesondere etwa 6,3, vorliegen. Demgemäß ist die Zusammensetzung des Reagens zur Durchführung der Bestimmung einzustellen.
Während bei der Standardmethode (vergl. Enzymatische Analyse, Band I a.a.O.) ein pH-Optimum zwischen 8,3 und 8,9 vorgeschrieben ist, wird erfindungsgemäß bewußt von diesem pH-Bereich abgewichen. Der Grund für die Festlegung des oben gezeigten basischen pH-Bereiches ist darin zu suchen, daß bei der Reaktion
LDH
Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+
ein Proton im stöchiometrischen Verhältnis zum Lactat-Umsatz entsteht. Um dieses Gleichgewicht der LDH nach rechts zu treiben, arbeitet man im alkalischen Bereich.
Erfindungsgemäß wird dagegen z. B. bei der Bestimmung im Serum oder Plasma die zu untersuchende Probe mit Triäthanolamin-NaOH auf etwa pH 6,3 bis 6,4 gepuffert und auch die zur Untersuchung verwendete Testkombination (Testreagens) auf diesen Wert eingestellt. Grob gesagt und für Überschlagsbestimmungen wird ein pH-Wert von 6,0 bis 6,5 eingestellt und derart gepuffert, daß bei der Bestimmung selbst ein pH-Wert von 6,3 bis 6,4 vorliegt. Bei Serum-Albumin wird in an sich bekannter Weise Glutathion zugesetzt.
Die Isoenzyme der Lactatdehydrogenase sind bei pH 6,3 bis 6,4 optimal zu erfassen, wenn dafür gesorgt ist, daß das Reaktionsgleichgewicht der Formel
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■ + LDH +
Lactat + NAD+ - ^ Pyruvat + NADH + H+
durch I'olgereaktionen nach rechts verschoben wird. Zu diesem Zweck wird Phenazinmethosulfat, durch welches das Koenzym NADH stets wieder oxidiert wird, zugegeben.
Bei gewissen Körperflüssigkeiten sind jedoch, die oben, beschriebenen Verhältnisse desx^egen anders, weil sie einen ausgeprägten, von pH 6,3 bis 6,4 abweichenden Eigen-pPI-Wert aufweisen. Eine solche Körperflüssigkeit ist insbesondere die Vaginalflüssigkeit, deren pH-Wert bei etwa 4 liegt. Hier muß durch die verwendete Testkombination der optimale pH-Wert beim Umsatz eingestellt werden, was bedeutet, daß die Testkombination einen höheren pH-Wert aufweist, der dann durch den pH-Wert der Vaginalflüssigkeit auf etwa pH 6 bis 6,5 gezogen wird.
Demgemäß betrifft die Erfindung gemäß einer weiteren Ausbildung eine Testkocfoination bestehend aus Lactat, Nikotinanid-Adenin-Dinucleotid (NAD ) und einem Tetrazoliurasalz zur Sichtbarmachung der enzyinati sehen HAD-Ke suction, die auf einen derartigen pH-Wert gepuffert ist, daß beim eigentlichen Umsatz in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit ein pufferspezifischer pH-Wert von 6,3 bis 6,4 z. B. für Triäthanolamin-NaOH-Puffer oder ' andere sauer einstellbare Puffer mit Ausnahme von Phosphat-Puffer vorliegt. Bei Verwendung eines Trockenpräparates muß somit dieser pH nach Auflösen desselben vorliegen. Ein pH von ca. 6,0 bis 6,5 ist größenordnungsmäßig geeignet.
Für den Spezialfall der Untersuchung einer Vaginalflüssigkeit, die selbst nicht in ihrem ursprünglichen pH-Wert verändert ist, eignet sich insbesondere die Anwendung der Bestimmung mit Triäthanolamin-NaOH-Puffer, wobei die Testkombination auf pH 7*0 eingestellt wird, während bei auf pH 6,3 bis 6,4
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2U3741
— ο
eingestellten Untersuchungsproben auch die Testkombination auf diesen Wert eingestellt ist.
Demgemäß betrifft die Erfindung weiterhin die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erf ind.ungs gemäß en Testkombination auf den Spezialfall der Untersuchung von Vaginalflüssigkeit in der Vagina mittels eines Testmaterials zur Feststellung einer etwaigen pathologischen Veränderung im unteren weiblichen Genitaltrakt, wobei die Testkombination auf geeignete Träger, insbesondere einen Tampon, aber auch z. B. Teststreifen, aufgebracht ist und durch Eintauchen in die Vagina die Reaktion mit den in der Vagina vorhandenen LDH-Isoenzymen bei pH etwa 6,0 bis 6,5, insbesondere 6,3 bis 6,4, bewirkt wird.
Die Testkombination besteht aus einer Lösung folgender Zusammensetzung:
vorzugswei- unterer und ser Test- oberer Grenzansatz bereich
Triäthanolamin-NaOH-Puffer, pH 7,0 Na-Lactat (Natriumsalz der D, L-Milchsäure) Phenazinmethosulfat (PMS)
Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+)
Nitro-blau-tetrazoliumchlorid (NBT)
Diese Testkombination wird lichtgeschützt auf einen geeigneten Träger aufgetragen, insbesondere einen Tampon/ und dieser lichtgeschützt aufbewahrt, bis er angewendet werden
soll.
5,0 mM 1,0 - 150 mM
67,5 mM 20 - 350 mM
0,1 mM 0,01 -1, 0 mM
1,5 mM 0,1 - 10 mM
0,3 mM 0,01 - 1 5 mM
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Das Vorliegen von LDH in der Vaginalflüssigkeit wird dadurch angezeigt, daß nach etwa 5 his 10 Minuten der Tampon eine blaue l'ärbung annimmt. Es findet folgender Reaktionsahlauf statt: . .
'■+ LDH +
1. Lactat + NAD+ ;==^ Pyruvat + NADH + H+
2. NADH + Phenazinmethosulfat + H+ ■ >
NAD+ + red. Phenazinmethosulfat
3. red. Phenazinmethosulfat + Nitro-blau-tetrazoliumchlorid —^ Formazan + Phenazinmethosulfat.
Da die zweite und auch die dritte zum Lactatumsatz gekoppelte Reaktion das gebildete reduzierte Koenzym ebenso abzieht, wie die erste Reaktion, d. h. das Gleichgewicht des Lactat-Umsatzes dadurch noch stärker nach rechts verlagert wird, wird bei Abpufferung des Testansatzes auf pH 7,0 nach Einlegen des Tampons der tatsächliche Umsatz bei einem pH um 6, insb. 6,3 bis 6,4- ablaufen. Dabei werden die Isoenzyme, insbesondere LDH-4 und LDH-5, die bei abnormalen Veränderungen der Vaginalflüssigkeit vorliegen können, optimal erfaßt.
Bei den Testkombinationen, die in der Vagina angewandt werden sollen, ist ein Puffer auszuwählen, der stabil und gewebsfreundlich ist. Hierzu eignet sich besonders gut Triäthanolamin-NaOH-Puffer. ·
Die Testkombination kann auf die zu verwendenden Träger, insbesondere ein. Tampon, in jeder beliebigen Weise aufgebracht werden. Es ist bekannt, daß der Umgang mit solchen Testkombinationen lichtgeschützt erfolgen muß und der mit der Testkombination versehene Träger weitgehend unter Lichtabschluß aufbewahrt werden muß bis er zur Anwendung gelangt. Zwei vorteilhafte Methoden des Einbringens der Testkombination in ein Tampon
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sind ein Injizieren von ca. 2 ml der bevorzugten Testkombination oder die Imprägnierung eines Tamponendes in einer Länge von etwa 3/4 cm mit ebenfalls etwa 2 ml Testkombination und das anschließende Trocknen, insbesondere Gefriertrocknen des Tampons. Die Testkombination kann aber auch, beispielsweise lediglich auf eine Rückholschnur aufgebracht werden, die später bei Bedarf leicht vom Tampon zu entfernen ist. Sehr günstig ist auch das Aufbringen der Testkombination auf ein band- oder kordeiförmiges Baumwollerzeugnis,das in den Tampon eingesetzt wird.
Da bei der Anwendung auf die Schnellbestimmung einer pathologischen Veränderung im unteren weiblichen Genitaltrakt durch Einbringen in die Vagina natürlich nicht bekannt ist, wieviel Vaginalflüssigkeit vorhanden ist und die Menge von Fall zu Fall ebenso wie der mögliche pH-Wert der Vaginalflüssigkeit schwankt, ist eine große Pufferkapazität in der Testkombination vorzusehen, damit bei der eigentlichen Bestimmung am Reaktionsort ein pH-Wert von 6 bis 6,5, insbesondere etwa 6,3 bis 6,4, eingehalten wird. Da die Pufferkapazität der in der Rückholschnur vorliegenden Testkombination hierbei in der Praxis manchmal nicht ausreicht, ist es zweckmäßig, in diesem Fall eine größere Menge Puffersubstanz in dem Tampon unterzubringen, so daß eine hinreichende Pufferung jedenfalls an dem dem Tampon nächstliegenden Teil der Rückholschnur gewährleistet ist.
Derartige mit der Testkombination versehene Träger müssen nicht vom Arzt angewandt werden, sondern jede Frau kann die Anwendung selbst vornehmen. Eine Blaufärbung nach 15- bis 30-minütigem Verbleib des Tampons in der Vagina zeigt die Gefahr einer pathologischen Veränderung an und ist ein Warnzeichen, den Arzt aufzusuchen.
Soll jedoch der benutzte Tampon oder die Rückholschnur oder Rückholkordel z. B. archiviert werden, was insbesondere bei der
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Anwendung durch den Arzt der Fall sein kann, oder wenn die Patientin den Tampon dem Arzt zuschicken will, soll eine Nachbehandlung des benutzten Tampons erfolgen, und zwar um die Geruchsbelästigung zu beseitigen, den Tampon zu desinfizieren und die Stabilisierung der Verfärbung zur Aufbewahrung über längere Zeiträume zu gewährleisten. Es wurde weiter gefunden, daß diese Nachbehandlung durch Eintauchen der zur Untersuchung verwendeten Tampons in eine 20 i&ige Pa r al ο i dl ö sung (Paraloid der Firma Merck,20 %ig in Toluol gelöst) erfolgen kann.
Während die bisherigen Methoden der LDH-BeStimmung ausgesprochene Labormethoden sind, die überdies die eingangs beschriebenen Nachteile aufweisen, besteht also hier die Möglichkeit einer schnellen hinreichend quantitativen Bestimmung für gewisse Anwendungsz\'iecke, beispielsweise für Vaginalflüssigkeit, durch den ungeschulten Benutzer. Dies ist insbesondere wichtig bei Geschwulstpatienten. Bei einer großen Zahl von Geschwulstpatienten wurden nach der Literatur bis heute 26 Enzyme untersucht. Die LDH besitzt die höchste diagnostische Empfindlichkeit; im Serum (nicht Exkreten) wird eine Erhöhung zwischen 40 bis 90 % gefunden. Bei erwiesenem Tumor hat die serielle Bestimmung der LDH im Serum sich zur Verlaufs- und Therapiekontrolle geeignet. Eine LDH-Erhöhung ist zwar keineswegs tumorspezifisch. Sie stellt aber immer einen Hinweis auf eine ernsthafte Erkrankung dar und ist im Zusammenhang mit weiteren Merkmalen geeignet, die Vermutungsdiagnose eines Tumors zu stützen.
Die vorliegende, bevorzugte Testkombination, aufgebracht auf Tampons, wurde bei Reihenuntersuchungen an ca. 100 gesunden Frauen und bei Patientinnen mit Carcinoma colli uteri, Carcinoma corporis und Carcinoma in situ durchgeführt. Für beste Resultate wird der Tampon für 15 bis 30 Minuten eingelegt. Nach Herausnahme können folgende Verfärbungen unmittelbar festgestellt v/erden:
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- ίο -
keine Verfärbung negativ
rosa Verfärbung noch, negativ hellblau mit violett Stich +
blau . ++ dunkelblau +++
Tritt eine blaue (++) oder eine dunkelblaue (+++) Verfärbung auf, so lag in allen Fällen ein Karzinom vor, das immer mit den pathologischen Befunden übereinstimmte. Bei hellblauer Verfärbung konnte fast ausnahmslos die Diagnose "Umwandlungszone" bestätigt werden. Eine rosa Verfärbung fand sich bisher nur bei gesunden Frauen (auch bei Schwangeren bis zum I5. Tag).
Das Bestimmungsverfahren in vitro, also z. B. die Untersuchung von Serum oder Plasma, wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Die einzige notwendige Abänderung ist die Einstellung eines pufferspezifischen pH-Wertes, z. B. um 6 bis 6,5» gegenüber dem bisher benutzten, stark basischen pH-Wert, so daß hier eine nähere Beschreibung nicht erforderlich ist. Für Absolutbestimmungen kann eine Eichung des Farbumschlages- anhand einer Standard-LDH-Probe vorgenommen v/erden. Die Eichprobe kann,wie für die Konservierung des Tampons beschrieben, für einige Zeit farbkonserviert werden.
Die folgenden Beispiele zeigen noch zwei Möglichkeiten, die Testkombination auf ein Tampon aufzubringen.
a) Eintauchmethode
Übliche Hygiene-Tampons, z. B. "o.b." der Firma Dr. Carl Hahn, werden mit einem 1 cm breiten Tesaband in der Mitte gürtelähnlich ein- bis zweimal streng anliegend umwickelt. Die Umhüllung des Tampons wird, an der Gegenseite des Tampons, an dem sich der Herausziehfaden befindet, geöffnet. Damit
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liegt die Zylinderfläche des Tampons frei. Von handelsüblichen Reagenzgläsern vom Inhalt 18 ml (DIN-Format, ■ Firma Schott, Mainz) wird die Bodenkuppe abgesprengt. In die so erhaltene Glasrohre wird das Tampon derart eingeführt, daß das an einer Seite geöffnete Tampon mit seiner Ebene flächengleich mit dem Röhrenende abschließt. Der Herausziehfaden wird am anderen Ende der Bohre mit Heftpflaster, Tesaband oder dergleichen befestigt. Die Seite der EÖhre mit der geöffneten Tamponhülle wird in die unter 1) genannte Lösung getaucht. Pro Tampon werden 2,0 ml aufgesaugt bzw. aufgesogen. Das Ansetzen der Lösung und sämtliche hier geschilderten Manipulationen, die in Verbindung mit der Testkombinationslösung erfolgen, sind in der Dunkelkammer bei monochromatischem Licht (Photoleuchte im roten Bereich, "Eotlicht", durchzuführen.
Die auf diese Weise präparierten Tampons samt Glasröhrchen werden in der Dunkelheit gefriertrocknet (lyophilisiert). Die getrockneten Tampons werden aus den Eöhrchen entfernt, z. B. am'Herausziehfaden und stets in der Dunkelheit bzw. in der Dunkelkammer bei Photolicht mit lichtundurchlässigem Papier bzw. Folien bzw. gefärbtem Papier verpackt und lichtgeschützt aufbewahrt..
b) Injektionsmethode
Die folgenden Arbeiten werden in der Dunkelkammer durchgeführt. Mit Hilfe einer 2-ml-Spritze werden 2,0 ml der Testkombinationslösung unter 1) in den Tampon injiziert. An der Gegenseite des Tampons, an dem sich der Herausziehfaden befindet, sticht man die Injektionsnadel durch die Umhüllung in den Tampon und führt, während man langsam spritzt, die Nadel in Längsrichtung bis zum anderen Ende des Tampons durch. Somit hat man erreicht, daß der Tampon gleichmäßig durchfeuchtet ist. Anschließend werden die Tampons gefriertrocknet
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und wie unter a) verpackt und aufbewahrt.
Die Reagensmischung kann grundsätzlich auf jeden saugfähigen Träger aufgebracht werden. I1Ur die Bestimmung der Vaginalflüssigkeit oder in der Vagina haben sich transparente Folien als sehr zweckmäßig erwiesen, z. B. Zelluloseacetatfolie, wie sie für Elektrophoresezwecke benutzt wird oder das Produkt "Parafilm M" der Firma American Chemcompany. An der Stelle, an denen die Folien mit LDH durch Auflegen in Verbindung kommen, findet eine Verfärbung in Richtung Blau statt. Derartige Folien haben den Vorteil, daß sie mechanisch fester sind als z. B. Filterpapier und zur Stabilisierung oder Archivierung zudem völlig transparent gemacht werden können. Dabei bleibt die Farbintensität völlig unverändert.
Als Transparenzbäder für Zelluloseacetatfolien können verwendet werden:
a) Methanol:Eisessig im Verhältnis 85 : 15»
b) Isobutanol:Dioxan im Verhältnis 1 : 1 bis 5 '· 7
c) Methyläthylketon:Dioxan im Verhältnis 3 : 2
d) Essigester:Dioxan im Verhältnis J : 2
e) Methanol:Eisessig:Glyzerin im Verhältnis 87 : 12 : 1
Für die Parafilmfolie eignet sich kurzes Eintauchen in 7i5 %ige Essigsäurelösung.
Es kann auch eine Ölbehandlung vorgenommen werden. Hierbei eignet sich Whitemore-Oil 120 oder Ondino-Oil 17 (Shell).
Diese Folien mit einer Fläche von 1,5 bis 2,0 cm können zweckmäßig vom Facharzt bei einem colposcopischen Eingriff auf eine vermutete Schleimhautveranderung in der Vagina angewandt -werden. An der Stelle, wo sich Zellhaufen befinden, die tumorÖs sind, findet punktuell eine Verfärbung statt analog den Tampons.
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Claims (13)

  1. Patentanspräche
    Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung mehrerer oder aller Isoenzyme der Lactatdehydrogenase, insbesondere der Isoenzyme 4 und 5, mittels Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß der Umsatz bei einem pufferspezifischen pH-Wert, insbesondere 6 bis 6,5 durchgeführt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Umsatz in einem flüssigen Hedium durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Umsatz mit einem Puffersystem durchgeführt wird, bei dem das Bestimmungsoptimum unter Konformationsänderung der Isoenzyme im sauren pH-Bereich liegt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in einem Triäthanolamin-NaOH-Puffersystem pH 6 bis 6,5» insbesondere 6,3 bis 6,4, durchgeführt wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die zu untersuchende Körperflüssigkeit als auch das zur Untersuchung verwendete I'estreagens bzw. die Testkombination auf einen pH-Wert von 6,3 bis 6,4 eingestellt werden.
  6. 6. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Testkombination auf einen solchen pH-Wert eingestellt wird, daß bei einem von pH 6 bis 6,5 abweichenden Eigen-pH-Wert der zu untersuchenden Körperflüssigkeit beim Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Fyruvat ein pH von 6 bis 6,5» insbesondere etwa 6,3 bis 6,4, vorliegt. ~~
    609814/0979
    - u-
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
    gekennzeichnet, daß in Testreagens und/oder der zu untersuchenden Körperflüssigkeit eine zur Aufrechterhaltung eines pH-Wei'ts von 6,3 bis 6,4 bei der Bestimmung ausreichende Pufferkapasität vorliegt.
  8. 8. Reagens bzw. Testkombination zur gemeinsamen Bestimmung aller oder mehrerer Isoenzyme der Lactatdehydrogenase mittels Umsatz von Lactat und Hikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat, dadurch gekennzeichnet, daß das Lactat, Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid und ein Tetrazoliumsalz zur Sichtbarmachung der enzymatischen ITAD-Redukticn enthaltende Reaktionsgemische bei Zinsatz eines Trockenpräparates nach Auflösen desselben, auf einen pufferspezifischen pH-V.'ert, im Falle von Triäthanolamin-KaOH einen solchen 6 bis 6,5, insbesondere von 6,3 bis 6,4 gepuffert ist.
  9. 9. Abänderung des Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen derartigen pH-Wert gepuffert ist, daß beim Umsatz mit einer einen von etwa 6 bis 6,5 ab1.·:eichenden Eigen-pH-Wert aufweisenden Körperflüssigkeit sich ein pH-Wert von etwa 6,3 bis 6,4 einstellt.
  10. 10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Untersuchung von Vaginalflüssigkeit auf pH 7»0 gepuffert ist.
  11. 11. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffer Triäthanolamin-NaCH enthält.
    8098U/097 9
  12. 12. Reagens nach Anspruch 11, dadurch, gekennzeichnet, daß es 1,0 bis 150 mM Triäthanolaminpuffer, pH 7,0, 20 bis 350 mM Na-Lactat (Natriumsalz der DL-Milchsäure), 0,01 bis 1,0 inM Phenazinmetho sulfat (PKS), 0,1 bis 10 mM Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (KAD+) und 0,01 bis 1,5 mM Nitro-blau-tetrazoliuiachlorid (IiBT) enthält.
  13. 13. Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es 5,0 mK Triäthanolaminpuffer, pH 7,0, 67,5 »Μ Na-Lactat,
    0,1 KiH Phenazinmetho sulfat (PI-IS),
    1,5 eM Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (IvAD+), und 0,3 mM Nitro-blau-tetrazolium-chlorid (IiET) enthält.
    . Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Feststellung einer pathologischen Veränderung im unteren vreiblichen Genitaltrakt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit dem Testreagens nach Anspruch 12 versehenen Träger, insbesondere einen Tampon, in die Vagina einführt und nach mindestens 10 Minuten den Träger auf das Auftreten einer Blaufärbung überprüft und den Träger dann gegebenenfalls zur Konservierung in eine 20 %ige Lösung von selbstvernetzendea Acrylharz in Toluol (Paraloidlösung) eintaucht und trocknet.
    814/0979
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