DE2443741B2 - Verfahren zur gemeinsamen bestimmung der isoenzyme 4 und 5 der ldh - Google Patents

Description

1,0 bis 150 mM Triäthanolaminpuffer, pH 7,0,

20 bis 350 mM Na-Lactat (Natriumsalz der DL-

Milch&äure),

0,01 bis I₁OmM Phenazinmethosulfat (PMS),
0,1 bis 1OmM Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid

(NAD*) und
0,01 bis 1,5 mM Nitro-blau-tetrazoliumchlorid

(NBT)

enthält.

11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es

(o

5,0 mM Triäthanolaminpuffer, pH 7,0,
67,5 mM Na-Lactat,
0,1 mM Phenazinmethosulfat (PMS),
1,5 mM Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD*) und

0,3 mM Nitro-blau-tetrazolium-chlorid (NBT)

12. Diagnostisches Mittel zur Feststellung einer pathologischen Veränderung im unteren weiblichen Genitaltrakt, dadurch gekennzeichnet daß es aus einem Träger, insbesondere einem Tampon besteht, der ein Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 11 trägt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung der Isoenzyme 4 und 5 der LDH, mittels Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat

Es ist bekannt daß Lactatdehydrogenase, üblicherweise LDH genannt, in fünf Isoformen auftritt. Bei der Aktivitätsbestimmung einzelner Isoenzyme sind unterschiedliche Substrat- und pH-Optima wichtige Merkmale, die für die einzelnen Isoenzyme noch nicht vollständig bekannt waren.

Zur Bestimmung aller Isoenzyme hat man bisher entweder die Isoenzyme elektrophoretisch getrennt (vgl. z. B. »Die Isoenzyme der Lactatdehydrogenase«. Reihe Biochemie und Klinik von S. L. Kowalewski, erschienen im G. Thieme Verlag, Stuttgart [1972], S. 29) oder die gesamte LDH in Lösung gehalten, die LDH-2 bis -5 gebunden und das am häufigster vorkommende LDH-i bestimmt. Eine Übersicht über die derzeitige Standardarbeitsmethode findet sich z. B. in dem Buch »Enzymatische Analyse«, Band I, Verlag Chemie, Weinheim 1970, S. 557. Danach wird für den Umsatz von Lactat zu Pyruvat ein pH-Optimum zwischen 8,3 und 8,9 vorgeschrieben. Tatsächlich wird bei allen bekannten Bestimmungsmethoden ein basischer oder höchstens etwa neutraler pH-Bereich angewandt, um die Isoenzyme möglichst vollständig zu erfassen.

Es wurde jedoch festgestellt, daß einzelne Isoenzyme durch pH-Veränderung ineinander übergehen können, also eine Konformationsänderung stattfindet, was natürlich zu einer Verschiebung der tatsächlichen Werte der einzelnen Isoenzyme führen würde.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die bei den bekannten Verfahren auftretenden, komplizierten Arbeitsgänge des Trennens und die immer wieder festzustellenden Ungenauigkeiten der Gesamterfassung auszumerzen und eine optimale Bestimmung der LDH-lsoenzyme 4 und 5 zu gewährleisten, welche für die Untersuchung gewisser pathologischer Veränderungen bei Mensch und Tier von besonderem Interesse sind. Weiterhin soll die Erfindung ein Reagens und ein diagnostisches Mittel mit einer speziellen Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens aufzeigen.

Es wurde festgestellt, daß eine Absenkung des pH-Wertes unter den Neutralpunkt bei der an sich bekannten Umsetzung von Lactat und NAD zu Pyruvat zu einer optimalen Erfassung der Isoenzyme 4 und 5 führt, wobei selbstverständlich eines der beiden Enzyme für sich alleine vorliegen kann oder beide gemeinsam vorliegen können.

Die Lösung der Aufgabe besteht darin, daß der Umsatz bei pH 6 bis 6,5 durchgeführt wird. Der pH-Wert ist pufferspezifisch, schwankt also etwas je nach dem angewandten Puffersystem, jedoch liegt das Optimum für die meisten Puffer und für alle praktisch vorkommenden Arbeiten im angegebenen Bereich. Für den am häufigsten verwendeten Triäthanolamin-NaOH-Puffer liegt das Optimum bei einem pH von 6,3 bis 6,4. Dieser pH ist jedoch bei praktisch allen Puffern

sehr gut zur Erfassung von LDH-4 und -5 geeignet, die beispielsweise innerhalb einer Flüssigkeit auftreten können. Für den Umsatz genügt eine geringe Menge Flüssigkeit, er wird jedoch zweckmäßig im flüssigen Medium durchgeführt

Der Umsatz erfolgt in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur von ca. 37° C Dabei werden die Koenzymmengen so eingestellt, daß sie für die vorliegenden Isoenzyme optimal ausreichen, was unter Berücksichtigung der folgenden Angaben mit wenigen Routineversuchen bestimmt werden kann.

Es ist bekannt, daß die Bestimmung der Isoenzyme 4 und 5 der LDH von großer Wichtigkeit ist, weil man sie bei anormalem Gewebewachstum oder Leukämie oder sonstigen Krankheiten in merklicher konzentration im Serum ode.· anderen Körperflüssigkeiten findet, während sie sonst überwiegend im Gewebe festgehalten werden, insbesondere kann man feststellen, daß sie bei pathologischen Veränderungen im unteren weiblichen Genitaltrakt in der Vaginalflüssigkeit enthalten sind. Ihre Bestimmung gestattet daher eine Frühdiagnose auf pathologische Veränderungen.

Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode ist für alle Körperflüssigkeiten anwendbar.

Während bei der Standardmethode (vgl. Enzymatische Analyse, Band I, a. a. O.) ein pH-Optimum zwischen 8,3 und 8,9 vorgeschrieben ist, wird erfindungsgemäß bewußt von diesem pH-Bereich abgewichen. Der Grund für die Festlegung des oben gezeigten basischen pH-Bereiches ist darin zu suchen, daß bei der Reaktion

Lactat + NAD⁺;

LDH

= Pyruvat + NADH + H ⁺

ein Proton im stöchiometrischen Verhältnis zum Lactat-Umsatz entsteht. Um dieses Gleichgewicht der LDH nach rechts zu treiben, arbeitet man im alkalischen Bereich. Erfindungsgemäß wird dagegen z. B. bei der Bestimmung im Serum oder Plasma die zu untersuchende Probe vorzugsweise mit Triäthanolamin-NaOH auf etwa pH 6,3 bis 6,4 gepuffert und auch das zur Untersuchung verwendete Testreagens wird auf diesen Wert eingestellt. Für Überschlagsbestimmungen genügt eine Einstellung auf einen pH-Wert von 6,0 bis 6,5. Bei Serum-Albumin wird in an sich bekannter Weise Glutathion zugesetzt.

Demgemäß sind die Isoenzyme 4 und 5 der Lactatdehydrogenase bei pH 6,3 bis 6,4 optimal zu erfassen, wenn dafür gesorgt ist, daß das Reaktionsgleichgewicht der Formel

LDH

Lactat + NAD^+:

= Pyruvat + NADH + H ⁺

durch Folgereaktionen nach rechts verschoben wird. Dies erfolgt in bekannter Weise durch Zugabe von Phenazinmethosulfat, durch welches das Koenzym NADH stets wieder oxidiert wird.

Bei gewissen Körperflüssigkeiten sind jedoch die oben beschriebenen Verhältnisse deswegen anders, weil sie einen ausgeprägten, von pH 6,3 bis 6,4 abweichenden Eigen-pH-Wert aufweisen. Eine solche Körperflüssigkeit ist insbesondere die Vaginalflüssigkeit. deren pH-Wert bei etwa 4 liegt. Hier muß durch die verwendete Testkombination der optimale pH-Wert beim Umsatz eingestellt werden, was bedeutet, daß die Testkombination einen höheren pH-Wert aufweist, der dann durch den pH-Wert der Vaginalflüssigkfcit auf etwa pH 6 bis 6,5, vorzugsweise 6,3 bis 6,4, gezogen wird.

Demgemäß besteht eine vorzugsweise Weiterbildung

der Erfindung darin, daß das verwendete Puffersystem bzw. das eingesetzte Reagens oder diagnostische Mittel

S einen solchen pH-Wert aufweist, daß bei einem von pH 6 bis 6,5 abweichenden Eigen-pH-Wert der zu untersuchenden Körperflüssigkeit beim Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat ein pH von 6 bis 6,5, insbesondere 6,3 bis 6,4, eingestellt

ίο wird. Bei Verwendung eines Trockenpräparates muß somit dieser pH nach Auflösen desselben vorliegen. Für den Spezialfall der Untersuchung einer Vaginalflüssigkeit, die selbst nicht in ihrem ursprünglichen pH-Wert verändei ist, eignet sich insbesondere die Anwendung der Bestimmung mit Triäthanolamin-NaOH-Puffer, wobei die Testkombination auf pH 7,0 eingestellt wird, während bei auf pH 6,3 bis 6,4 eingestellten Untersuchungsproben auch die Tesitkombination auf diesen Wert eingestellt ist.

jo Die Erfindung betrifft auch ein diagnostisches Mittel zur Feststellv.ng einer etwaigen pathologischen Veränderung im unteren weiblichen Genitaltrakt, welches aus einem Träger, insbesondere einem Tampon besteht, der ein erfindungsgemäßes Reagens trägt. Durch Eintauchen in die Vagina oder z. B. Vaginalflüssigkeit oder einen Abstrich wird die Reaktion mit den in der Vagina vorhandenen LDH-Isoenzymen bei einem pH von etwa 6,0 bis 6,5, insbesondere 6,3 bis 6,4, bewirkt.

Ein erfindungsgemäßes Reagens besteht aus einer

jo Lösung folgender Zusammensetzung:

Vorzugsweiser
Testansatz

Unterer und
oberer Grenzbereich

Triäthanolamin-NaOH- 5,OmM 1,0-15OmM Puffer, pH 7,0

Na-Lactat (Natriumsalz 67,5 mM 20—35OmM

der D,L-Mi'ichsäure)
Phenazinmethosulfat O₁ImM 0,01-1.OmM

(PMS)

Nikotinamid-Adenon- 1,5 mM 0,1 —1OmM

Dinucleotid (NAD⁺)

Nitro-blau-tetrazolium- 0,3 mM 0,01 —1,5 mM Chlorid (NBT)

Das Vorliegen von LDH in der Vaginalflüssigkeit wird dadurch angezeigt, daß nach etwa 5 bis 10 Minuten der Tampon eine blaue Färbung durch die bekannte Bildung von Formazan oder Phenazinmethosulfat annimmt.

Bei einem diagnostischen Mittel, das in der Vagina angewandt werden soll, ist ein Puffer auszuwählen, der stabil und gewebefreundlich ist. Hierzu eignet sich besonders gut Triäthanolamin-NAOH-Puffer.

Die Testkombination kann auf die zu verwendenden Träger, insbesondere ein Tampon, in jeder beliebigen Weise aufgebracht werden. Es ist bekannt, daß der Umgang mit solchen Testkombinationen lichtgeschützt erfolgen muß und der mit der Testkombination versehene Träger weitgehend unter Lichlabschluß aufbewahrt werden muß bis er zur Anwendung gelangt. 7.wi" vorteilhafte Methoden des Einbringens der Testkombination in ein Tampon sind ein Injizieren von ca. 2 ml der bevorzugten Testkombination oder die Imprägnierung eines Tamponendes in einer Länge von etwa V4 cm mit ebenfalls etwa 2 ml Testkombination und das anschließende Trocknen, insbesondere Gefrier-

trocknen des Tampons. Die Testkombination kann aber auch beispielsweise lediglich auf eine Rückholschnur aufgebracht werden, die später bei Bedarf leicht vom Tampon zu entfernen ist. Sehr günstig ist auch das Aufbringen der Testkombination .of ein band- oder s kordeiförmiges Baumwollerzeugnis, das in den Tampon eingesetzt wird.

Da bei der Anwendung auf die Schne!lbestir.imung einer pathologischen Veränderung im unteren weiblichen Geriiialtrakt durch Einbringen in die Vagina natürlich nicht bekannt ist, wieviel Vaginalflüssigkeit vorhanden ist und die Menge von Fall zu Fall ebenso wie der mögliche pH-Wert der Vaginalflüssigkeit schwankt, ist eine große Pufferkapazität in der Testkombination vorzusehen, damit bei der eigentlichen Bestimmung am Reaktionsort ein pH-Wert von 6 bis 6,5, insbesondere etwa 6,3 bis 6,4, eingehalten wird. Da die Pufferkapazität der in der Rückholschnir vorliegenden Testkombination hierbei in der Praxis manchmal nicht ausreicht, ist es zweckmäßig, in diesem Fall eine größere Menge Puffersubstanz in dem Tampon unterzubringen, so daß eine hinreichende Pufferung jedenfalls an dem dem Tampon nächstliegenden Teil der Rückholschnur gewährleistet ist.

Derartige mit der Testkombination versehene Träger müssen nicht vom Arzt angewandt werden, sondern jede Frau kann die Anwendung selbst vornehmen. Eine Blaufärbung nach 15- bis 30minütigem Verbleib des Tampons in der Vagina zeigt die Gefahr einer pathologischen Veränderung an und ist ein Warnzeit chen, den Arzt aufzusuchen.

Soll jedoch der benutzte Tampon oder die Rückholschnur oder Rückholkordel z. B. archiviert werden, was insbesondere bei der Anwendung durch den Arzt der Fall sein kann, oder wenn die Patientin den Tampon dem Arzt zuschicken will, soll eine Nachbehandlung des benutzten Tampons erfolgen, und zwar um die Geruchsbelästigung zu beseitigen, den Tampon zu desinfizieren und die Stabilisierung der Verfärbung zur Aufbewahrung über längere Zeiträume zu gewährleisten. Es hat sich gezeigt, daß diese Nachbehandlung durch Eintauchen der zur Untersuchung verwendeten Tampons in eine 20°/oige Paraloidlösung (Paraloid der Firma Merck, 20%ig in Toluol gelöst) erfoigen kann.

Während die bisherigen Methoden der LDH-Bestimmung ausgesprochene Labormethoden sind, die überdies die eingangs beschriebenen Nachteile aufweisen, besteht also hier die Möglichkeit einer schnellen hinreichend quantitativen Bestimmung für gewisse Anwendungszwecke, beispielsweise für Vaginalflüssigkeit, durch den ungeschuiten Benutze-. Dies ist insbesondere wichtig bei Geschwulstpatienten. Bei einer großen Zahl von Geschwulstpatienten wurden nach der Literatur bis heute 26 Enzyme untersucht. Die LDH besitzt die höchste diagnostische Empfindlichkeit; im Serum (nicht Exkreten) wird eine Erhöhung zwischen 40 bis 90% gefunden. Bei erwiesenem Tumor hat die serielle Bestimmung der LDH im Serum sich zur Verlaufs- und Therapiekontrolle geeignet. Eine LDH-Erhöhung ist zwar keineswegs tumorspezifisch. Sie stellt aber immer einen Hinweis auf eine ernsthafte Erkrankung dar und ist im Zusammenhang mit weiteren Merkmalen geeignet, die Vermutungsdiagnose eines Tumors zu stützen.

Das vorliegende, bevorzugte Reagens, aufgebracht auf Tampons, wurde bei Reihenuntersuchungen an ca. 100 gesunden Frauen und bei Patientinnen mit Carcinoma colli uteri. Carcinoma corporis und Carcinoma in situ durchgeführt. Für beste Resultate wird der Tampon für 15 bis 30 Minuten eingelegt. Nach Herausnahme können folgende Verfärbungen unmittelbar festgestellt werden:

keine Verfärbung
rosa Verfärbung
hellblau mit violett Stich
blau
dunkelblau

negativ
noch negath

Tritt eine blaue (+ +) oder eine dunkelblaue (+ + +) Verfärbung auf, so lag in allen Fällen ein Karzinom vor, das immer mit den pathologischen Befunden übereinstimmte. Bei hellblauer Verfärbung konnte fast ausnahmslos die Diagnose »Umwandlungszone« bestätigt werden. Eine rosa Verfärbung fand sich bisher nur bei gesunden Frauen (auch bei Schwangeren bis zum 15. Tag).

Das Bestimmungsverfahren in vitro, also z. B. die Untersuchung von Serum oder Plasma, wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Die einzige notwendige Abänderung ist die Einstellung eines pufferspezifischen pH-Wertes, z. B. um 6 bis 6,5, gegenüber dem bisher benutzten, stark basischen pH-Wert, so daß hier eine nähere Beschreibung nicht erforderlich ist. Für Absolutbestimmungen kann eine Eichung des Farbumschlags an Hand einer Standard-LDH-Probe vorgenommen werden. Die Eichprobe kann, wie für die Konservierung des Tampons beschrieben, für einige Zeit farbkonserviert werden.

Die folgenden Beispiele zeigen noch zwei Möglichkeiten, die Testkombination auf ein Tampon aufzubrin

a) Eintauchmethode

Handelsübliche Hygiene-Tampons werden mit einem 1 cm breiten Tesaband in der Mitte gürtelähnlich ein- bis zweimal streng anliegend umwickelt. Die Umhüllung des Tampons wird an der Gegenseite des Tampons, an dem sich der Herausziehfaden befindet, geöffnet. Damit liegt die Zylinderfläche des Tampons frei. Von handelsüblichen Reagenzgläsern vom Inhalt 18 ml (DIN-Format) wird die Bodenkuppe abgesprengt. In die so erhaltene Glasrohre wird das Tampon derart eingeführt, daß das an einer Seite geöffnete Tampon mit seiner Ebene flächengleich mit dem Röhrenende abschließt. Der Herausziehfaden wird am anderen Ende der Röhre mit Heftpflaster, Tesaband oder dergleichen befestigt. Die Seite der Röhre mit der geöffneten Tamponhülle wird in eine erfindungsgemäße Reagens-Lösung getaucht. Pro Tampon werden 2,0 ml aufgesaugt bzw. aufgesogen. Das Ansetzen der Lösung und sämtliche hier geschilderten Manipulationen, die in Verbindung mit der Testkombinationslösung erfolgen, sind in der Dunkelkammer bei monochromatischem Licht (Photoleuchte im roten Bereich, »Rotlicht«) durchzuführen.

Die auf diese Weise präparierten Tampons samt Glasröhrchen werden in der Dunkelheit gefriertrocknet (lyophilisiert). Die getrockneten Tampons werden aus den Röhrchen entfernt, z. B. am Herausziehfaden und stets in der Dunkelheit bzw. in der Dunkelkammer bei Photolicht mit lichtundurchlässigem Papier bzw. Folien bzw. gefärbtem Papier verpackt und iichtgeschützt aufbewahrt.

b) Injektionsmethode

Die folgenden Arbeiten werden in der Dunkelkammer durchgeführt. Mit Hilfe einer 2-mI-Spritze werden 2,0 ml der Reagenslösung in den Tampon injiziert. An der Gegenseite des Tampons, an dem sich der Herausziehfaden befindet, sticht man die Injektionsnadel durch die Umhüllung in den Tampon und führt, während man langsam spritzt, die Nadel in Längsrichtung bis zum anderen Ende des Tampons durch. Somit hat man erreicht, daß der Tampon gleichmäßig durchfeuchtet ist. Anschließend werden die Tampons gefriertrocknet und wie unter a) verpackt und aufbewahrt.

Die Reagensmischung kann grundsätzlich auf jeden saugfähigen Träger aufgebracht werden. Für die Bestimmung der Vaginalflüssigkeit oder in der Vagina haben sich transparente Folien als sehr zweckmäßig erwiesen, z. B. Zelluloseacetatfolie, wie sie für Elektrophoresezwecke benutzt wird oder das Produkt »Parafilm M« der Firma American Chemcompany. An der Stelle, an denen die Folien mit LDH durch Auflegen in Verbindung kommen, findet eine Verfärbung in Richtung Blau statt. Derartige Folien haben den Vorteil, daß sie mechanisch fester sind als z. B. Filterpapier und zur Stabilisierung oder Archivierung zudem völlig transparent gemacht werden können. Dabei bleibt die Farbintensität völlig unverändert.

Folien mit einer Fläche von 1,5 bis 2,0 cm² können zweckmäßig vom Facharzt bei einem colposcopischen Eingriff auf eine vermutete Schleimhautveränderung in der Vagina angewandt werden. An der Stelle, wo sich Zellhaufen befinden, die tumorös sind, findet punktuell eine Verfärbung statt analog den Tampons.

Das folgende Beispiel zeigt eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen von Laboruntersuchungen. Der Pipettierplan bei der Untersuchung ist wie folgt:

Pro Küvette werden zusammenpipettiert:

1,80 ml TRA-Puffer,0,05M,pH6,2

0,10 ml Pyruvat(7mg/ml)

0,05 ml NADH (10 mg/ml)

0,03 ml H₂O

0,02 ml LDH-4bzw.LDH-5(5mg/ml)

LDH-4 und -5 können selbstverständlich, wie schon erwähnt, einzeln oder im Gemisch vorliegen. Bei Eichungen wird Reinsubstanz verwendet, bei üblichen Laborprüfuntersuchungen die gleiche Menge an zu untersuchendem Serum. Die Bestimmung selbst erfolgt in bekannter Weise.

609538/43C

Claims (10)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur gemeinsamen Bestimmung der Isoenzyme 4 und 5 der LDH, mittels Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat dadurch gekennzeichnet, daß der Umsatz bei pH 6 bis 6,5 durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Umsatz bei pH 6,3 bis 6,4 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffersystem Triäthanolamin-NaOH verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die zu untersuchende Körperflüssigkeit als auch das zur Untersuchung verwendete Testreagens auf einen pH-Wert von 6,3 bis 6,4 eingestellt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Puffersystem einen solchen pH-Wert aufweist, daß bei einem von pH 6 bis 6,5 abweichenden Eigen-pH-Wert der zu untersuchenden Körperflüssigkeit beim Umsatz von Lactat und Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid zu Pyruvat ein pH von 6 bis 6,5, insbesondere etwa 6,3 bis 6,4 eingestellt wird.

6. Reagens zur gemeinsamen Bestimmung der Isoenzyme 4 und 5 der Lactatdehydrogenase enthaltend Lactat, Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid, ein Tetrazoliumsalz und einem Puffer, gegebenenfalls auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das System auf einen solchen pH-Wert eingestellt ist, daß zusammen mit der Probe ein pH-Wert von 6 bis 6,5 vorliegt.

7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein pH-Wert von 6,3 bis 6,4 einstellt.

8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Untersuchung von Vaginalflüssigkeit auf pH 7,0 eingestellt ist.

9. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es als Puffer Triäthanolamin-NaOH enthält.

10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,daß es