DE19758745C2

DE19758745C2 - Laser-Scanning-Mikroskop

Info

Publication number: DE19758745C2
Application number: DE19758745A
Authority: DE
Inventors: Guenter Schoeppe; Stefan Wilhelm; Ulrich Simon; Hartmut Heinz; Bernhard Groebler
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 1997-01-27
Filing date: 1997-01-27
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2017-01-28
Also published as: DE19702753C2; DE19758745C5; DE19758746C2; DE19758748C2; DE19758744C2; DE19702753A1

Abstract

Konfokales Laserscanmikroskop mit einer Laseranordnung zur punktförmigen Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe und einem Detektionsstrahlengang mit mehreren, das Probenlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen registrierenden Detektoren, DOLLAR A wobei den Detektoren konfokale Detektionsblenden vorgeschaltet sind und die konfokalen Detektionsblenden (29) in Richtung der optischen Achse verschiebbar sind, um die chromatischen Aberrationen abbildender Elemente im Detektionstrahlengang (26.1-26.4) für jede detektierte Wellenlänge auszugleichen.

Description

Stand der Technik

Im Handbook of Biological Confocal Microscopy, Second Edition (James B. Pawley), Plenum Press New York and London 1995 ist auf Seite 519, Fig. 6 eine Fasereinkopplungsoptik beschrieben.

Auf Seite 595, Fig. 14 wird ein telezentrisches System für mehrere Detektionsstrahlengänge beschrieben.

US 5283433 zeigt eine Einkoppeloptik für Detektionsstrahlengänge.

DE 43 23 129 A1 beschreibt in Spalte 6 zentrierbare und bezüglich ihres Durchmessers variierbare Konfokalblenden.

US 5444528, US 5377003, US 5317379, US 5216484 beschreiben die Wirkungsweise eines AOTF.

US 5081350, EP 283256 A2, WO 90/00754 A1 beschreiben eine Faserverbindung zwischen Laser und Scaneinheit.

In EP 283256 A2 wird ein Mikroskop mit scannender Faser beschrieben, bei der an der Faser ausgangsseitig eine Optik befestigt ist, um das Licht in einem Lichtpunkt zu konvergieren. Zur Überwachung der Laserleistung ist eine Monitordiode vorgesehen.

In einem Laser-Scanning-Mikroskop werden beleuchtungsseitig mehrere Wellenlängen eingestrahlt und auch mehrere Wellenlängenbänder detektiert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, bei einer Beleuchtung mit mehreren Wellenlängen die Zuverlässigkeit des Meßergebnisses auf einfache Weise zu erhöhen.

Die Aufgabe wird bei einem Laserscanmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 durch die kennzeichnenden Merkmale gelöst.

Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Darstellung der Wirkungsweise und Vorteile der erfindungsgemäßen Lösung anhand der Ausführungsbeispiele gemäß der schematischen Darstellungen Fig. 1-6

Es zeigen:

Fig. 1 eine modulare Anordnung aus Mikroskop M, Scankopf S und Lasereinheit;

Fig. 2 eine Darstellung des Strahlverlaufs im Scankopf S;

Fig. 3 die optische Wirkung der verschieblichen Kollimationsoptik 16;

Fig. 4 die optische Wirkung der in Richtung der optischen Achse verschieblichen Pinholes;

Fig. 5 die optische Wirkung der senkrecht zur optischen Achse verschieblichen Pinholes bei verschiedenen reflektierenden Strahlteilern;

Fig. 6 Scankopf S. Mikroskop M sowie eine Faser hinter dem Pinhole im Detektionsstrahlengang.

1. In Fig. 1 sind schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein Scankopf S dargestellt, die eine gemeinsame optische Schnittstelle über eine Zwischenabbildung Z gemäß Fig. 2 ausweisen.

Der Scankopf S kann sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskopes sowie auch vorteilhaft an einen seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskopes angeschlossen sein. In Fig. 1 ist ein zwischen Auflichtscan und Durchlichtscan mittels eines schwenkbaren Spiegels 14 umschaltbarer mikroskopischer Strahlengang dargestellt, mit Lichtquelle 1, Beleuchtungsoptik 2, Strahlteiler 3, Objektiv 4, Probe 5, Kondensor 5, Lichtquelle 7, Empfängeranordnung 8, einer ersten Tubuslinse 9, einem Beobachtungsstrahlengang mit einer zweiten Tubuslinse 10 und einem Okular 11 sowie einem Strahlteiler zur Einkopplung des Scanstrahls.

Ein Lasermodul 13.1, 13.2 nimmt die Laser auf und ist über Lichtleitfasern 14.1, 14.2 mit der Lasereinkoppeleinheit des Scankopfes S verbunden.

Die Einkopplung der Lichtleitfasern 14.1, 14.2 erfolgt mittels einer verschieblichen Kollimationsoptik 16, auf die noch näher eingegangen wird, sowie Strahlumlenkelementen 17.1, 17.2.

Mittels eines teildurchlässigen Spiegels 18 wird ein Überwachungsstrahlengang in Richtung einer Monitordiode 19, der, vorteilhaft auf einem nicht dargestellten drehbaren Filterrad Linienfilter 21 sowie Neutralfilter 20 vorgeordnet sind, ausgeblendet.

Die eigentliche Scaneinheit besteht aus Scanningobjektiv 22, Scanner 23, Hauptstrahlteiler 24 und einer gemeinsamen Abbildungsoptik 25 für Detektionskanäle 26.1-26.4.

Ein Umlenkprisma 27 hinter der Abbildungsoptik 25 spiegelt die vom Objekt 5 kommende Strahlung in Richtung dichroitischer Strahleiler 28 im konvergenten Strahlengang der Abbildungsoptik 25, denen in Richtung und senkrecht zur optischen Achse verstellbare und in ihrem Durchmesser veränderbare Pinholes 29, individuell für jeden Detektionskanal sowie Emissionsfilter 30 und geeignete Empfängerelemente 31 (PMT, Photomultiplier) nachgeordnet sind.

Die Strahlteiler 27, 28 können vorteilhaft, wie in Fig. 5 schematisch dargestellt, als Teilerrad mit mehreren Positionen, motorisch durch Schrittmotoren umschaltbar, ausgebildet sein.

2. Vorteilhaft erfolgt eine Einkopplung von UV-Strahlung in Glasfaser 14.1, vorzugsweise einer Single-Mode-Glasfaser mittels eines AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) als Strahlablenker, d. h. wenn die Strahlung nicht auf den Fasereingang fallen soll, wird sie mittels des AOTF vom Fasereingang, beispielsweise in Richtung einer nicht dargestellten Lichtfalle, abgelenkt.

Die Einkoppeloptik 33 zur Einkopplung der Laserstrahlung weist zur Einkopplung nicht dargestellte Linsensysteme auf, deren Brennweite durch den Strahlquerschnitt der Laser und die für die optimale Einkopplung erforderliche numerische Apertur festgelegt ist.

Im Lasermodul 13.2 sind Einzel- und Multiwellenlängenlaser vorgesehen, die einzeln oder gemeinsam über einen AOTF in eine oder mehrere Fasern eingekoppelt werden.

Weiterhin kann die Einkopplung auch über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung mikroskopseitig nach Durchlaufen einer Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird.

Auch die Mischung der Strahlung verschiedener Laser am Fasereingang ist möglich und kann anhand der schematisch dargestellten, auswechselbar und schaltbar ausgebildeten Teilerspiegel 39 erfolgen.

3. Die in Fig. 2 und 3 divergent aus dem Faserende der Fasern 14.1, 2 an der Scaneinheit 5 austretende Laserstrahlung wird mittels der Kollimationsoptik 16 auf einen Unendlichstrahl kollimiert.

Das erfolgt vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung entlang der optischen Achse mittels einer über eine zentrale Ansteuereinheit 34 ansteuerbare Steuereinheit 37 eine Fokussierungsfunktion hat, indem ihr Abstand zum Ende der Lichtleitfaser 14.1, 2 an der Scaneinheit erfindungsgemäß veränderbar ist.

Die Wirkung der Verschiebung der Kollimationsoptik 16 ist schematisch in Fig. 3a und 3b dargestellt.

In Fig. 3a ist der Strahlverlauf für zwei unterschiedliche Wellenlängen λ1, λ2 dargestellt. Da für eine polychromatische Lichtquelle mittels einer feststehenden Abbildungsoptik in eine Bildebene nur für eine mittlere Wellenlänge des Spektralbereiches abgebildet wird, wird mittels der Ansteuereinheit 37 der Abstand von Faserende und Kollimationsoptik verändert. Für die beiden dargestellten Wellenlängen ergeben sich die Linsenstellungen S1, S2, um für beide Wellenlängen die gleiche Fokuslage zu gewährleisten.

Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, daß im Falle der Fluoreszenzmikroskopie die Fluoreszenzstrahlung im Fokus des auf unendlich eingestellten Objektives 4 entsteht und die Anregungsstrahlung in dieselbe Ebene fokussiert wird. Es können auch mehrere Fasern und Faserkollimatoren zur Einstellung unterschiedlicher chromatischer Kompensationen für unterschiedliche Anregungswellenlängen Verwendung finden.

Weiterhin kann hierdurch eine chromatische Korrektion der eingesetzten Optik, insbesondere der Mikroskopobjektive erfolgen.

Durch mehrere Einkoppelfasern und Kollimationsoptiken für unterschiedliche Wellenlängen können unabhängig verschiedene chromatische Kompensationen eingestellt werden.

Die variable Kollimation durch Verschiebung der Linse 16 kann auch zur Realisierung eines z-scans verwendet werden, indem mittels der verschieblichen Kollimatorlinse 16 der Fokus im Präparat in z-Richtung verschoben wird und ein optischer Schnitt nach dem anderen detektiert wird. Dies ist in Fig. 3b für eine Wellenlänge λ dargestellt, wobei den Stellungen S1, S2 die Fokuslagen F1, F2 entsprechen.

4. In Fig. 2 dient eine Monitordiode 19 (die auch, hier nicht dargestellt, eine vorgesetzte Fokussierlinse aufweisen kann) in Verbindung mit einem linien- oder bereichsselektiven Filterrad oder Filterschieber 21, angesteuert von einer Steuereinheit 36, zur permanenten Überwachung der in das Scanmodul eingekoppelten Laserstrahlung, insbesondere um die Leistung in einer bestimmten Laserlinie isoliert zu kontrollieren und gegebenenfalls mittels eines Regelsignales der Ansteuereinheit 34 zu stabilisieren.

Die Detektion mittels der Monitordiode 19 erfaßt das Laserrauschen und Variationen aufgrund des mechanisch- optischen Übertragungssystems.

Aus der detektierten momentanen Laserleistung kann dabei ein Fehlersignal abgeleitet werden, das on-line direkt auf den Laser oder einen dem Laser nachgeschalteten Intensitätsmodulator (ASOM, AOTF, EOM, Shutter) zwecks der Stabilisierung der in das Scanmodul eingestrahlten Laserleistung zurückwirkt.

Durch die Ansteuerung der Filtereinheit 21 kann somit eine wellenlängenweise Stabilisierung der Intensität und Laserleistungskontrolle erfolgen.

Durch eine Verbindung zur Detektion 31 (PMT) und jeweils zur zentralen Ansteuereinheit kann durch Bildung von Signalquotienen/oder Signalsubtraktion des Detektionssignales und des Monitorsignales der Diode 19 eine Rauschverminderung bewirkt werden, in dem, das entsprechende Sensorsignal eines Detektionskanals pixelweise als Pixel-Bildinformation auf das Signal der Monitordiode normiert wird (z. B. Division), um auf diese Weise Intensitätsfluktuationen im Bild zu verringern.

5. In Fig. 1 sind schematisch in verschiedener Weise verstellbare Pinholes 29 in den Detektionskanälen 26.1-26.4 dargestellt. Sie können insbesondere senkrecht zur optischen Achse oder in Richtung der optischen Achse verschiebbar angeordnet sowie in bekannter Weise in ihrem Durchmesser, beispielsweise mittels Scherenmechanismus oder Katzenauge veränderbar sein. Die Verstellung der Pinholedurchmesser gestattet ihre Anpassung an die Durchmesser der Airyscheibchen bei unterschiedlichen Beobachtungswellenlängen.

In Fig. 4 und 5 sind schematisch Ansteuermittel 38 für die Verstellung oder Verschiebung der einzelnen Pinholes dargestellt, die Datenleitungen zur zentralen Ansteuereinheit 34 aufweisen.

Die ansteuerbare Verschiebbarkeit der Pinholes in Richtung der optischen Achse ist in Fig. 4 schematisch dargestellt. Sie ist für den Ausgleich von optischen Fehlern, insbesondere chromatischen Längsaberrationen vorteilhaft. Diese Fehler können beim Scanobjektiv 22, aber auch beispielsweise bei der für die Detektionskanäle gemeinsamen Abbildungsoptik 25 auftreten.

Für unterschiedliche Wellenlängen λ1, λ2 ergeben sich durch chromatische Längsabweichungen unterschiedliche Fokuslagen, die unterschiedlichen Pinholelagen P1, P2 entsprechen.

Bei Auswechslung abbildender Optik, beispielsweise des Mikroskopobjektives, kann bei bekanntem chromatischen Längsfehler der eingesetzten Optik über die Ansteuereinheit 34 und Steuer- und Verschiebemittel 38 eine automatische Verschiebung der Pinholes entlang der optischen Achse erfolgen.

Es kann eine genaue Einstellung auf die verwendete Anregungswellenlänge erfolgen.

Durch eine gemeinsame Abbildungsoptik 25 für alle Detektionskanäle, die vorteilhaft nur aus einem optischen Glied besteht, wird das vom scanobjektiv 22 erzeugte, im Unendlichen liegende Bild in die Pinholeebene abgebildet. Die gemeinsame Abbildungsoptik 25 bewirkt eine verbesserte Transmissionseffizienz gegenüber bekannten Lösungen. Im Zusammenwirken der Abbildungsoptik mit individuell verstellbaren Pinholes in den einzelnen Detektionskanälen kann dennoch eine genaue Justierung erfolgen.

6. Im Strahlengang können unterschiedliche dichroitische Strahlteiler 28 eingesetzt werden, je nach verwendeter Wellenlänge, um nur diese zu sperren und einem Detektionsstrahlengang zuzuführen.

Es sind daher (nicht dargestellte) Teilerrevolver oder Teilerräder in verschiedenen Strahlengängen zur Einschwenkung unterschiedlicher, möglichst kleiner Teiler vorgesehen, insbesondere Teilerräder, deren Radachse in 45 Grad gegen die optische Achse geneigt ist, so daß die Teiler immer nur in der Reflexionsebene verschoben werden.

Da die auf den Tellerrädern angebrachten Teiler 28 nicht genau gleich justiert sein können oder Schwankungen innerhalb ihrer Justierung oder Standard-Keiltoleranzen unterschiedliche Strahlablenkwinkel verursachen können, erfolgt gemäß der Darstellung in Fig. 5 eine Verschiebung des jeweiligen Pinholes über Steuereinheit 38 senkrecht zur optischen Achse entsprechend der Strahlablenkung.

Hier sind schematisch zwei durch unterschiedliche Stellungen von Teilern 28.1, 28.2 auf einem nicht dargestellten durch eine Steuereinheit 36 angetriebenen Tellerrad dargestellt, die senkrecht zur optischen Achse verschobene Fokuslagen in der Ebene der Pinholes 29 bewirken.

Hierbei kann mittels der Ansteuereinheit 34 über die Steuereinheiten 36, 38 eine Kopplung der Stellung des Pinholes 29 mit der Teilerradstellung für die Teiler 28 erfolgen, d. h. für alle Tellerkonfigurationen verschiedener Tellerrevolver ist eine optimale Pinholeposiition abgespeichert und abrufbar.

Dies betrifft nicht nur die Stellung eines bestimmten Tellerrades, sonden auch die Stellung mehrerer Tellerräder, so daß immer die jeweils optimale Pinholepositon automatisch eingestellt wird.

7. In Fig. 6 ist schematisch dargestellt, wie am Pinhole 29, am Ausgang zum PMT hinter dem Pinhole, eine Lichtleitfaser 40 angesetzt werden kann, um durch das Pinhole des Detektionskanals die Strahlung zu einem externen Sensor 31 zu leiten.

Dies erfolgt vorteilhaft ohne zusätzliche Koppeloptik dicht hinter dem Pinhole mit Hilfe der Lichtleitfaser 38.

Da die Pinholeöffnung verstellbar ist, wird das Austauschen von Fasern mit unterschiedlichen Kerndurchmessern stark vereinfacht, indem die Pinholegröße an den Kerndurchmesser angepaßt wird.

Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen

M Mikroskop
S Scankopf

1

Lichtquelle

2

Beleuchtungsoptik

3

Strahlteiler

4

Objektiv

5

Probe

6

Kondensor

7

Lichtquelle

8

Empfänger

9

Tubuslinse

10

Tubuslinse

11

Okular

12

Strahlteiler

13.1

,

13.2

Laser

14

Lichtleitfasern

15

schwenkbarer Spiegel

16

Kollimationsoptik

17

Strahlumlenkelement

18

teildurchlässiger Spiegel

19

Monitordiode

20

Neutralfilter

21

Linienfilter

22

Scanobjektiv

23

Scanner

24

Hauptstrahlteiler

25

Abbildungsoptik

26.1-26.4

Detektionskanäle

27

Umlenkprisma

28

,

28.1

,

28.2

dichroitische Strahlteiler

29

verstellbare Pinholes (Lochblenden)

30

Emissionsfilter

31

PMT (Photomultiplier)

32

AOTF (Acousto Optical Tunable Filter)

33

Einkoppeloptik

34

zentrale Ansteuereinheit

35

,

36

,

37

,

38

lokale Ansteuereinheiten für Diode

19

, Filterwechsler

21

, Kollimatoroptik

16

, verstellbare Pinholes

29

39

Srahlteiler

40

Lichtleitfaser
S1, S2, F1, F2 Fokusstellungen
P1, P2 Pinholestellungen

Claims

1. Konfokales Laserscanmikroskop,
mit einer Laseranordnung zur punktförmigen Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe
und einem Detektionsstrahlengang mit mehreren, das Probenlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen registrierenden Detektoren,
wobei den Detektoren konfokale Detektionsblenden vorgeschaltet sind,
dadurch gekennzeichnet,
daß die konfokalen Detektionsblenden (29) in Richtung der optischen Achse verschiebbar sind, um die chromatischen Aberrationen abbildender Elemente im Detektionsstrahlengang (26.1-26.4) für jede detektierte Wellenlänge auszugleichen.

2. Konfokales Laserscanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Wechsel eines abbildenden optischen Elementes im Mikroskopstrahlengang eine Verschiebung der Detektionsblenden (29) in eine für dieses Element vorgesehene, abgespeicherte Stellung erfolgt.