DE1617813C

DE1617813C - Verfahren zur Herstellung eines knstal linen schwefelhaltigen Glycohpids

Info

Publication number: DE1617813C
Application number: DE19671617813
Authority: DE
Inventors: Yasunao Toyonaka Kurosawa Atsushi Ikeda Nishimura Haruo Ashiya Ogawa, (Japan)
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1966-06-14
Filing date: 1967-06-14
Publication date: 1973-04-12

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines kristallinen schwefelhaltigen Glycolipids. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung eines kristallinen schwefelhaltigen Glycolipids, das als pharmazeutisches Mittel mit Schutzwirkungen gegen verschiedene Infektionen durch pathogene Mikroorganismen ynd einigen anderen physiologisch oder pharmakologisch günstigen Wirkungen vorteilhaft ist, aus tierischen Geweben durch kombinierte Lösungsmittelextraktion und Kristallisation.

Als nichtkristallisiertes, schwefelhaltiges Glycolipid war das von G. Bl ix isolierte Kaliumsalz von Cerebrosidsulfat bekannt (G. B I i x, Z. physiol. Chem., 219, S. 82 [1933]). Ferner wurden bereits als Bestandteile dieses Lipids Sphingosin, Cerebronsäure, Galactose, Schwefelsäure und Kalium angegeben. Ein solches kristallines, schwefelhaltiges Glycolipid.i wie es nunmehr gefunden wurde, war jedoch noch nicht bekannt. Ferner wurde gefunden, daß sich das erfindungsgemäß hergestellte kristalline schwefelhaltige Glycolipid sowohl physikalisch als auch chemisch von dem bereits bekannten Cerebrosid unterscheidet, d. h., das erstere ist in Wasser kaum löslich, während das letztere leicht löslich ist, und der Hauptbasenbestandteil des ersteren ist Dihydrosphingosin, während er bei dem letzteren Sphingosin ist. Auf Grund dieser Tatsache ist das kristalline schwefelhaltige Glycolipid als neuer Stoff anzusehen. Außerdem wurden niemals die physiologischen oder pharmakologischen Eigenschaften von schwefelhaltigem Glycolipid angegeben, wahrscheinlich wegen seiner schwierigen Isolierung und Reinigung. Es wurde nun gefunden, daß das nunmehr isolierte kristalline schwefelhaltige Glycolipid verschiedene vorteilhafte medizinische Wirkungen ausübt und als pharmazeutisches Mittel verwendet werden kann. Ferner wurde gefunden, daß das kristalline schwefelhaltige Glycolipid durch eine einfache Arbeitsweise, die im wesentlichen aus Lösungsmittelextraktion und Kristallisation besteht, wirksam und vorteilhaft erhalten werden kann.

ίο Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellungeines kristallinen schwefelhaltigen Glycolipids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine rohe Sphingolipidfraktion aus tierischen Geweben, die das schwefelhaltige Glycolipid enthalten, mit Methanol, Pyridin, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid extrahiert,

b) den Extrakt auf eine Temperatur von etwa 0 bis 5°C kühlt,

c) die ausgefällte Sphingolipidfraktion mit Petroläther, Äther oder Aceton wäscht,

d) die erhaltene Sphingolipidfraktion in einem Gemisch aus etwa 2 Volumteilen Chloroform und I Volumteil Methanol suspendiert,

e) die Suspension mit Wasser schüttelt,

f) die erhaltene wäßrige Oberphase abtrennt und verwirft,

g) die Unterphase mit einem Gemisch aus etwa 45 Volumteilen Methanol und 55 Volumteilen Wasser schüttelt und

h) die dabei erhaltene Oberphase abtrennt und bei einer Temperatur von etwa —30 bis etwa +20°C zur Ausfällung des schwefelhaltigen Glycolipids in Formvon Kristallnadeln stehenläßt.
Die tierischen Gewebe, die als Rohmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren dienen, können beliebige derartige Gewebe sein, sofern sie das schwefelhaltige Glycolipid enthalten. Das normale Säugetiergehirn ist jedoch das am meisten bevorzugte Material, da die Nervengewebe im allgemeinen reich an dem schwefelhaltigen Glycolipid sind. Zweckmäßerigweise können Gehirne von Rindern, Pferden, Kaninchen, Hunden, Katzen, Meerschweinchen, Ratten und Mäusen verwendet werden.

Zunächst wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren also eine rohe Sphingolipidfraktion von dem tierischen Gewebematerial abgetrennt. Zu diesem Zweck werden die tierischen Gewebe mit einem Lösungsmittel, das Glycolipid zu lösen vermag, unter mildem Erwärmen, vorzugsweise auf eine Temperatur von etwa 30 bis 6O⁰C, extrahiert, und der Extrakt wird auf etwa 0 bis 5°C gekühlt, um eine rohe Sphingolipidfraktion auszufällen, wodurch die nichtlipoiden Verunreinigungen und die Phospholipide (hauptsächlich Glycerophospholipid) in der Mutterlauge zurückgehalten werden. Falls nötig, kann der Extrakt vor dem Kühlen unter vermindertem Druck eingeengt werden. Beispielhaft für das Lösungsmittel, das Glycolipid zu lösen vermag, sind niedere Alkanole, Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd u. dgl. Davon werden besonders niedere Alkanole bevorzugt, da sie für die Ausfällung der rohen Sphingolipidfraktion zweckmäßig sind.

Danach wird die so erhaltene rohe Sphingolipidfraktion durch Entfernung von nichtlipoiden und polyglycolipiden Verunreinigungen gereinigt. Die nichtlipoiden Verunreinigungen (hauptsächlich Cholesterin) werden durch Waschen der rohen Sphingolipidfraktion mit einem nichtpolaren oder wenig pola-

ren Lösungsmittel, ζ. B. Petroläther, Äther, Aceton od. dgl., entfernt. Anschließend wird die rohe Sphingolipidfraktion zur Entfernung von polyglycolipiden Verunreinigungen (hauptsächlich Gangliosid) mit Wasser gewaschen. Die Fraktion kann zwar zu diesem Zweck direkt mit Wasser gewaschen werden, vorteilhafterweise wird jedoch eine Lösung oder Suspension der Fraktion in einer Mischung aus 2 Volumteilen Chloroform und 1 Volumteil Methanol mit Wasser geschüttelt, da die Polyglycolipidverunreinigungen in Wasser, das ein niederes Alkanol enthält, leicht löslich sind. Statt Chloroform können auch andere niedere Halogenalkane, wie Methylenchlorid oder Trichloräthan, und statt Methanol auch andere niedere Alkanole, wie Äthanol, verwendet werden.

Die so gereinigte Sphingolipidfraktion wird anschließend einer Verteilung zwischen den zwei Phasen eines Lösungsmittelsystems unterworfen. Die in dieser Stufe durchgeführte Verteilung wird vorteilhaft in einem System aus niederem Halogenalkan, niederem Alkanol und Wasser vorgenommen. Die Sphingolipidfraktion wird in einer Mischung aus einem niederen Halogenalkan und einem niederen Alkanol gelöst, und die Lösung wird mit einer Mischung aus 45 Volumteilen Methanol und 55 Volumteilen Wasser geschüttelt. Statt Methanol können auch andere niedere Alkanole verwendet werden. Für das niedere Halogenalkan sind Methylenchlorid, Chloroform, Trichloräthan u. dgl. und für das niedere Alkanol Methanol, Äthanol u. dgl. beispielhaft. Durch diese Behandlung wird das gewünschte Lipid in der oberen Schicht verteilt, die zum größten Teil aus Wasser besteht, und scheidet sich allmählich in nadelartigen Kristallen ab, wenn man bei Zimmertemperatur (etwa 2O⁰C) oder an einem kalten Ort (etwa 10 bis etwa —30°C) stehenläßt. Falls nötig, können die Kristalle durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. einer Mischung aus einem niederen Halogenalkan, einem niederen Alkanol und Wasser, weitergereinigt werden.

Das so gereinigte schwefelhaltige Glycolipid besteht aus farblosen, nadelartigen Kristallen und zeigt im Dünnschichtchromatogramm einen einzigen Fleck. Es weist folgende Werte der Elementaranalyse auf:

C£O 11 O/
05,JJ /_o

P.

9,76%
1,68%
3,16%
4,00%
0,00%

Das Lipid hat ein Molekulargewicht von 838 auf Grund der Dampfdruckerniedrigung. Das Lipid weist einen scheinbaren Schmelzpunkt von 194 bis 196° C (Zersetzung) auf. Der optische Drehwert des Lipids als Lösung in Pyridin beträgt [a]i^s = +7,9° (c = 0,5). Das IR-Absorptionsspektrum des Lipids wurde mit Hilfe eines Kaliumbromidpreßlings bestimmt. Zu den charakteristischen Frequenzen gehören die folgenden: 3430, 2940, 2870, 1650, 1540, 1470, 1240, 1150, 1070, 990, 820, 725 cm-¹.

Das Lipid ist in Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 2:1), in Pyridin und in Dimethylformamid in der Wärme löslich und_sehr wenig löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äther, Petroläther, Hexan, Dioxan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylacetat, Benzol, Eisessig, wäßrigen Natriumhydroxyd, Salzsäure und Wasser.

Die Bestandteile des Lipids wurden durch Gaschromatographie nach Methanolyse in Gegenwart von Chlorwasserstoff wie folgt bestimmt:

Zucker:

Galactose

Fettsäure:
2-Hydroxy-fettsäure von

Base:

-23

-24

3%
35%
13%
47%

Sphingosin

Dihydrosphingosin 85%

Das kristalline, schwefelhaltige Glycolipid gemäß der Erfindung ist als pharmazeutisches Mittel, insbesondere zur Verhütung oder Behandlung verschiedener Bakterieninfektionen vorteilhaft. So wird durch intraperitoneale Injektion des kristallinen Lipids bei Mäusen ein hohes Maß an Schutz gegen Bakterieninfektionen erhalten. Beispielsweise bestätigen die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse, daß eine Vorbehandlung mit dem Lipid eine deutliche Schutzwirkung gegen Infektion durch Klebsiella pneumoniae bei Mäusen ergibt, wenn es einen Tag vor der Immunitätsprüfung intraperitoneal verabreicht wird.

Schutzwirkung von Lipid bei Mäusen gegen Klebsiellapneumoniae-Infektion

Intraperitoneal-	Intervalle	Comulative Mortalität an	3d	6d	1Od
injizierte Lipidmenge *	zwiscnen Behandlung und Infektion	den angegebenen Tagen (d) nach Infektion**	4	6	7
mcg/g	Tage	2d	5	5	5
50	1	1	4	5	5
100	1	0	10
200	1	0
0	1	5
(Gummi
arabikum)

45 *) Mit Gummiarabikum emulgiert.
**) Intraperitoneale Injektion 10-' mg/Maus.

Aus den Ergebnissen dieser Tabelle geht ferner hervor, daß die intraperitonale Injektion des Lipids die Resistenz von Mäusen gegen Bakterieninfektionen erhöhen kann.

Es wurde ferner nachgewiesen, daß eine Vorbehandlung mit dem Lipid eine beträchtliche Hemmwirkung gegenüber Ehrlich-Ascitestumor aufweist. Da das Lipid andererseits besondere Affinität zu Neurotransmittoren, z. B. Acetlycholin, Cholin, Adrenalin oder Noradrenalin, oder Neurotransmissionsblockern, z. B. d-Tubocurarin oder N-(2-Chloräthyl)-dibenzylaminhydrochlorid aufweist, kann es als protrahierendes Mittel für diese Mittel verwendet werden.

Ferner ist die Toxizität des Lipids so außerordentlich niedrig, daß es als pharmazeutisches Mittel ohne merkliche Nebenwirkungen verwendet werden kann. Es kann auf einer Vielzahl von an sich bekannten Wegen verabreicht werden, z. B. in Form von Tabletten, von denen jede beispielsweise aus 10 bis 500 mg des Lipids und einem bestimmten Anteil eines üblichen Trägers besteht.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel
Abtrennung von roher Sphingolipidfraktion

100 g Rattenhirn werden mit 1 1 reinem Methanol versetzt, homogenisiert und allmählich auf 4O⁰C erwärmt. Man filtriert die unlöslichen Stoffe ab und läßt das Filtrat über Nacht bei 0 bis 3⁰C stehen. Die weißen Niederschläge werden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet, wodurch 1,5 g rohe Sphingolipidfraktion als wachsartige Substanz erhalten werden.

Entfernung von Polyglycolipid

1,2 bis 1,6 g der wie vorstehend abgetrennten rohen Sphingolipidfraktion werden in einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 2:1) suspendiert, so daß das gesamte Volumen 35 ml beträgt. Man versetzt die Suspension mit 4,9 ml destilliertem Wasser, schüttelt die Mischung 10 Minuten lang intensiv durch und verwirft die abgeschiedene klare obere Schicht.

Abtrennung und Kristallisation des schwefelhaltigen Glycolipids

30 ml der abgetrennten unteren Schicht werden mit 20 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 45:55) versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten lang intensiv geschüttelt und dicht verschlossen 4 bis 10 Tage bei 20⁰C stehengelassen. Die beiden Phasen des Lösungsmittels werden getrennt, und das gewünschte kristalline schwefelhaltige Glycolipid wird von der klaren oberen Schicht in nadelartigen Kristallen abgetrennt. Die Kristalle werden abfiltriert, mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser und mit reinem Aceton gewaschen und getrocknet, wodurch 10 mg des gewünschten Lipids erhalten werden. Die Ausbeute beträgt 100 mg pro Kilogramm Rattenhirn.

Nach dieser Arbeitsweise kann die Kristallisation des gewünschten Lipids in 1 bis 2 Tagen durchgeführt ίο werden, wenn man die abgetrennte obere Schicht bei -2O⁰C stehenläßt.

Wenn man als Ausgangsmaterial Hirne von Rindern und Hunden verwendet, werden Ausbeuten von 20 bzw. 60 mg/kg erzielt.
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Umkristallisieren des schwefelhaltigen Glycolipids

Eine Mischung aus Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 2:1) und Wasser in einem Volumenverhältnis von 88:12 wird geschüttelt und zentrifugiert. Die obere Schicht wird verworfen. In der unteren Schicht (75 ml) sind die rohen Kristalle (50 mg) suspendiert. Diese Schicht wird mit 50 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 45:55) versetzt. Die Mischung wird 10 Minuten lang gründlich geschüttelt und zentrifugiert. Die klare obere Schicht wird abgetrennt und bei 20⁰C stehengelassen. Nach einigen Stunden scheidet sich das gewünschte reine Lipid in farblosen Nadeln ab, die abfiltriert und getrocknet werden. Die Ausbeute beim Umkristallisieren beträgt etwa 50 %.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines kristallinen, schwefelhaltigen Glycolipids, dadurch gekennzeichnet, daß man

b) den Extrakt auf eine Temperatur von etwa 0 bis 5'C kühlt,

d) die erhaltene Sphingolipidfraktion in einem Gemisch aus etwa 2 Volumteilen Chloroform und 1 Volumteil Methanol suspendiert,

d) die Suspension mit Wasser schüttelt,

f) die erhaltene wäßrige Oberphase abtrennt und verwirft,

h) die dabei erhaltene Oberphase abtrennt und bei einer Temperatur von etwa —30 bis etwa +20⁰C zur Ausfällung des schwefelhaltigen Glycolipids in Form von Kristall nadeln stehenläßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das abgetrennte kristalline, schwefelhaltige Glycolipid aus einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser umkristallisiert.