DE1617813A1 - Kristallines schwefelhaltiges Glycolipid und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

DR. L M. M A AS DIL W, G. PFEIFFER tATENTANWÄtTE MOHCHEN 23 UNGEIEISTIASSE 25

P 1077

Shlonogi & Ce. Ltd., Osaka, Japan Kristallines schwefelhaltiges Glycolipid und Verfahren

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zu seiner Herstellung

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Die Erfindung besieht sich auf ein kristallines schwefel- -haltiges Glycolipid. Insbesondere betrifft die Erfindung ein kristallines schwefelhaltiges Glycolipid, das als pharmazeutisches Mittel alt Schutswirkungen gegen ver~ · schiedene Infektionen durch pathogene Mikroorgenismen und einigen anderen physiologisch oder pharm&kologisoh günstigen Wirkungen vorteilhaft ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses schwefelhaltigeA Glyoolipids aus tierlechen Geweben durch kombinierte Solventextraktion und Kristallisation.

Als nichtkristallisiertes,.schwefelhaltiges Glyoolipid war das von G. BlIx isolierte Kaiiumeal* vonCerebrosidsulfat

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bekannt £ß. Blixi Z. physioi. Chem._f 219, 82 (1933).] Ferner wurden bereits als Bestandteile dieses Lipide Sphingosin, Cerebroneäure, Galactose, Schwefelsäure und Kalium vorgeeehlagen. Ein solches kristallines, schwefelhaltiges Glycolipid, wie es nunmehr gefunden wurde, war jedoch noch nicht bekannt. Ferner wurde gefunden, daß das. kristalline, schwefelhaltige Glycolipid geaäß der Erfindung sich sowohl physikalisch als auQh chemisch von dem bereits bekannten Cerebrosid unterscheidet, d.h. das erstere ist in Via8βer kaum löslich, während das letztere leicht löslich ist und der Hauptbasenbestandteil des ersteren ist Bihydrosphingosin, während er bei den letsteren Sphingosin ' ist. Aufgrund dieser Tatsache ist das kristalline, schwefelhaltige Glycolipid als neuer Stoff aosuaehen. Auseerdee wurden niesele die physiologischen oder, ptaarnakologlachen Eigenschaften von schwefelhaltige« Glycolipid angegeben, wahrscheinlich wegen eeiner schwierigen leolierang und Reinigung. Se wurde nun gefunden,' dat da* nunaehr isolierte kristalline schwefelhaltige ölycolipid verschiedene Tortellhafte- Bedieinische Wirkungen ausübt und ale pharaaseutische· Mittel verwendet werden kann. Ferner wurde gefunden, del das kristalline schwefelhaltige Glycolipid durch eine einfache Arbeitsweise, die Io wesentlichen au« Solventextraktion und Kristallisation besteht, wirkeaa und vorteilhaft erhalten werden kann.

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Gegenstand der Erfindung ist daher.ein neue« kristallines, schwefelhaltiges Glycoli^id, das etch durch medisinieohe Wirkungen suezelehnet, sowie ein neues und einfaches ferfahren eur Herstellung des kristallinen, schwefelhaltigen Glycolipids aus tierischen Geweben. Im folgenden werden die Substanz sowie die Verfahren su seiner Herstellung in allgemeinen und im eineeinen erläutert.

ErfindungsgemäB kann dasgewünschte Lipid durch (1) Extraktion einer rohen ^hingolipidfraktion aus tierischen Geweben* die schwefelhaltiges Glycolipid enthalten, mit einem Lösungsmittel, das Glycollpid bu lösen vermag* (2) Entfernung von nichtlipoiden undpolygljeolipiden Verunreinigungen, (3) Verteilung der verbleibenden Sphingolipidfraktion swischen den ewei Phasen eines-.LSauiigemitteleyetsms aus einem wässrigen, niederen Alkenol und einen niederen Halogenalkane das ein niederes Alkanol enthält, sur Abtrennung des gewiine- r§@a Lipids in kristalliner Form von der Schicht aus wässrigem niederen Alkanol und» falls erforderlich, (4) Umkristallisieren erhalten werden· · . . ,

Die tierischen Gewebe, die als Rohmaterial fUr da· erfindungegemäßt Verfahren dienen, können btliebige derartig« Gewebe sein, sofern sie das schwefelhaltige ölyo>olipi*!5ai· halten. Bas normale Säugetiergehirn 1st jedoch das sa meisten tefcorzugte Material, da die Herrengewebe im allgemeinen

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reich an dem schwefelhaltigen Glycolipid sind. Zweckmäßiger> weiae können Gehirne von Rindern, Pferden· Kuninchen, Hunden, Katzen, Meerschweinchen, Ratten Und Mäusen verwendet werden.

In der ersten Stufe wird eine rohe Sphingolipidfraktion Ton tfem tierldhen Gewebematerial abgetrennt. Zu diesem Zweck werden die tierischen Gewebe mit einem Lösungemittel, das Glycolipid zu löeeen vermag, unter mildem Erwärmen , vorzugsweise auf eine Temperatur von et a 30 bis 60⁰C₉ extrahiert und der Extrakt wird auf etwa O bis 5^GC gekühlt, um eine rohe Sphingolipidfraktion auszufällen, wodurch die nichtlipoiden Verunreinigungen und die Phospholipide (. hauptsächlich Glyoerohospholipid) in der Mutterlauge zurückgehalten werden# Falle nötig, kenn der Extr&kt vor dem KUhlen unter vermindertem Brück eingeengt werden. Beispielhaft flir das Lösungsmittel, das Glycolipid zu lösen vermag, sind niedere Alkenole, Pyridin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd und dergleichen. Davon werden besonder« niedere Alkenole bevorzugt, da sie fUr die Ausfällung der rohen Sphingolipidfraktion zweckmäßig sind.

In der zweiten Stufe wird die so erhalten· rohe Sphlttgolipidfraktion durch Entfernung von nichtlipäidtn und polyglyooliplden Verunreinigungen gereinigt. Die nichtlipoiden Verunrei-

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tii?sia

reinigungen (hauptsächlich Ghloeeterln) werden durch Waschen der rohen Sphingolipidf ralttidn mit einen niohtpolaren oder wenig polaren Lösungsmittel, 8. B, Petroläther, ith«r_t Aceton oder dergleichen, entfernt. Anschließend wird die rohe Sphingolipidfraktion nur Entfernung tor polyÄrcolipidtn Yerunreinigungen (hauptsächlich Gangliosid) mit Wasser gewaschen. Die fraktion: kann six dieses Zweck direkt «it Waster gewaschen werden» Ee wird jedoch vorgtsogen, eine Lösung oder Suepeneion der Fraktion in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B. einer Mischung aus einem niederen Halögenalkan (beispielsweise Methylenchlorid, Chloroform, Trichlοräthaη) und eines nieder«ς Alkenol (beispieleweie· Methanol, Äthanol), mit Wasser eu echtittela, da die PoIyglycolipidrerunreinigungen in Waaeer, das ein niederes Alkenol enthält, leicht löslich sind. "..'

In der dritten Stufe wird die so gereinigte Sphingolipidfraktion einer Verteilung zwischen den swei Phasen eines LöBungeaitteleysterna unterworfen. Die in dieser Stufe durchge- -führte Yertβllung wird Torteilhaft in eine» System aus niedere« Halogenalkan, niederem Alkanol und Wasser Torgenoeeen. Die Sphingolipidfraktion wird in einer Mischung aus einem niederen Hfilogenalkan und einem niederen Alkanol gelöst und die Löeung wird mit einer Mischung aus einem niederen Alkanol und Waseer geschüttelt* Tür das niedere Halogenalkan sind tfethylenehlorid, Chloroform, Triohlorätkan und dergleichen und tür

ft0ff27/ft*t- *

das niedere Alkanal Methanol, Äthanol und dergleichen beispielhaft. Bürch diese Behandlung wird das gewünschte MpId in der oberen Schicht verteilt, die zum gröSteri 'Stell aus Wasser besteht, und scheidet sich allmählich in nadelartigen Kristallen ab, wenn man bei Zimmertemperatur (etwa 20°C) oder an einem kalten Ort (etwa 10⁰C bis etwa -30⁰G) stehen läßt. Falls nötig, können die Kristalle durch Umkristallisieren aus.einem geeigneten Lösungsmittel« κ.B. einer Mischung aus einem niederen Halogenalkane einem niederen AlkandLund Wasser, weiter gereinigt werden.

Das so gereinigteschwefelhaltige Slyeolipid besteht aus farblosen, nadelartigen Kristallen und zeigt im DUnnscbfchtehromatogramm einen einzigen Fleck. Ss weist folgen de Werte der ElernentaranaIyse auf:

C 58,531 Ü _r

H %Ί6 ft

Κ T_P68 5i

S 5.t6?C

K 4*00 5i

P 0,00 ?C ^i;

Bas LIpId hat ein Molekulargewicht τοπ 838 auf Grund der Dampfdruckerniedrlgung. Bas Lipid weist einen scheinbaren Sohacls-

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punkt von 194 - 196°G (Zere.) auf. Der optische Drehwert dee Lipids ale Lösung in Pyridin beträgt /*J J⁵ « +?#9° (c«0,5). Dae IR-Absorptionespektruta dee Lipide Wurde mit Hilfe eines Kaliumbromidpreßlinge bestimmt. Zu den oharftkteristlsoheii Frequenzen gehören die folgendem 3430, 2940, 2870, 1650,

■ ·

1540, 1470, 1240, 1150, 1070, 990, 820, 725 eef¹. Da β Lipid ist In Chloroforst/taethanal (VolueenTtrhältnie 2 : 1), in Pyridin und in Dimethylformamid in der Wärm« IUelich und eehr wenig löslich in Methanol♦ Äthanol, Aoeton, Äther, Petroläther, Hexan, Ploxan, Chlorofora, Tetrachlorkohlenstoff, Xthylacetat, Bensol, Bieessig, wfieerigen latriu·- hydroxyd, Salseäure und Vaaeer.

Die Bestandteile des Lipide wissnlen daroh nach Methanolyae in Geges^eii⁵! Ton Chla^j®es@retoff wie folgt beatimntx

Zucker:	*
Oalactoee
Pettsäuret	3 %
2-Hydroxy-fetteäure von	35>
C20	13 ■>
C22	47 3C
C23
C24

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ι υ ι /u ι

Base:

Sphingosin 15 i» Dihydrosphingosin 85 ί> ·

Das kristalline, schwefelhaltige Glycolipid gemäß der Erfindung ist als pharmazeutisches Mittel, insbesondere zur Verhütung oder Behandlung verschiedener Bakterieninfektionen, vorteilhaft. So wird durch intraperitoneele Injektion des kristallinen Lipide bei Mäusen ein hohes MaB an Schutz gegen Bakterieninfektionen erhalten. Beispielsweise bestätigen die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse, daß eine Vorbehandlung mit dem Lipid eine deutliche Schutzwirkung gegen Infektion durch Klebelells pneumoniaβ bei Mäusen ergibt, wenn es. einen Tag vor.der ImmunitätsprUfung intraperitoneal verabreicht wird.

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ID I/Ö IO

!Tabelle

Schutzwirkung τοπ Lipid bei Mäusen gegen KLebeiellapneumoniae-Infektion

intraperitoneal- Intervale «wischen Cumulative Mortalität injizierte Lipid- Behandlung und ' an den angegebenen menge* Infektion, Tage Tage_n <d) „ach .

mcg/g Infektion **

2d 3d 6d

50 1 t 4 6 7

100 1 0 5,5 5

200 1 ο 4 5 5

0 (Gummi arabicum) 1 5 10

* mit Gummi arabicuo emulgiert

** Intraperitoneale Injektion, 1Q~* ng/fefnue

Aua den Ergebnissen diee@x> Tabelle geht f«rner h®rror₅ daß die intraperitonele Iajektioa d®e Lipide die Resieten^ τοη Mäusen gegen Bakterieninfektionen erhöhen kann.

Ea wurde ferner nochgewiesen., da0 eine Vorbehandlung mit den Lipid eine beträchtliche Hemmwirkung gegenüber Ehrlich - Aaoitestuaor aufweiet, Da das Lipid andererseits besonder« Affinität

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zu Neurotransmittoren ₉ z.B. Acetylcholln« Cholin, Adrenalin oder Noradrenalin, oder Neurotranamiasionsblockern, z.B. d-Tuboourarin oder H-(2-Chlorättiyl)--dibenzylaminhydrochlorid aufweist, kann es als protrahierendes Mittel für diese Mittel verwendet werden.

Ferner iat die Toxlzität dee Lipids so ausserordentlich niedrig, daß es als pharmazeutisches Mittel ohne merkliche Nebenwirkungen verwendet werden kann. Ea , kann auf einer Vielzahl von an eich bekannten Wegen verabreicht werden, z.B, in Form von Tabletten, von denen jede beispielsweise aus 10 - 500 mg des Lipids und einem bestimmten Anteil eines üblichen Trägers besteht.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung ohne sie zu beschränken.

Beispiel Abtrennung von roher Sphingolipldfraktion

100 g Rattenhirn werden mit 1 1 reinem Methanol versetzt, homogenisiert und allmählich auf 4O⁰Cerwärmt. Man filtriert die unlöslichen Stoffe ab und läßt das Piltrat Über Nacht bei 0 - 3⁰C stehen. Die weißen Niederschläge werden abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet, wodurch 1,5 g rohe Sphingollpidfraktion als wachsartige Substanz erhalten werden,

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IbI/ö I J

Entfernung von Polyglycol!pid

1_a2>- 1₉6 g der ^wIe voreteiiend alJgeti-önötfin rohen Sphingolipidfraktion werden in einer Mischung aus Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 2«ti; suspendiert, so daß das gesamte Volumen 35 al beträgt. Man ^ersetzt,die Suspension mit 4_f9 ml destilliertem Wasser, schüttelt die Mischung 10 Min, lang intensiv durch und verwirft die abgeBchiedene klare obere Schicht*

Abtrennung und Kristallisation dea /schwefelhalti^en Glycolipids

30 ml der abgetrennten unteren Schicht werden mit 20 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (Volutnenverhältnis 45 ' 55) versetzt. Die Mischung wird 10: Min» lang intensiv geschüttelt, und dicht verschlosoen 4 - 10 Tage bei 20⁰C stehen gelassen. Die beiden Phasen des Lösungemittels werden getrennt und das gewünschte kristalline schwefelhaltige Glycolipid wird von der klaren oberen Schicht in nadelartigen Kristallen abgetrennt* Die Kristalle werden abfiltriert, mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser und mit reinem Aceton gewaschen und getrocknet, wodurch 10 mg des gewünschten Lipide erhalten werden. Die Ausbeute beträgt 100 tag pro kg Rattehhirfi«

Nach dieser Arbeitsweise kann die Kristallisation des gewünschten Lipids in 1 - 2 Tagen durchgeführt werden, wenn man die abge*·? .

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BAD ORIGINAL

trennte obere Schicht bei -2O⁰C stehen läßt.

Wenn man als A.usgangsmaterial Hirne von Rindern und Hunden verwendet, werden Ausbeuten von 20 mg/kg bzw* 60 mg/kg erzielt«

Umkristabilisieren des schwefelhaltigen Glycoliptds

Eine Mischung aus Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis 2:1) und Wasser in einem Volumenverhältnie von 88 : 12 wird geschüttelt und zentrifugiert. Die obere Schicht wird verworfen. In der unteren Schicht (75 ml) sind die rohen Kristalle (.50 mg) suspendiert. Diese Schicht wird mit 50 ml einer Misahung aus Methanol und Wasser (Volumenverhältnie 45 * 55) versetzt. Die Mischung wird 10 Min. lang gründlich geschüttelt und zentrifugiert. Die klare obere Schicht wird abgetrennt und bei 20⁰C stehen gelassen« Nach einigen Stunden scheidet sich das gewünschte reine Lipid in farblosen Nadeln ab, die abfiltriert und getrocknet werden. Die Ausbeute beim'Umkristallisieren beträgt etwa 50 56,

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Claims (1)

1. Pat e nt a n a p r ti oh β

   To Verfahren zur Herstellung eines kristallinen, schwefelhaltigen Glyeolipids, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Sphingolipidfraktion aus tierischen Gewesen, die das schwefelhaltige Glyeolipid enthalten, mit einem Lösungs mittel extrahiert, das GXycolipid zu lösen vermag, die rohe Sphingolipidfraktion mit einem nichtpolaren oder wenig polaren Lösungsmittel und einem Lösungsmittel wäscht, das Polyglycolipid zu lösen vermag, und die gereinigte Sphingolipidfraktion zwischen den beidenPhasen einer Mischung aus einem wässrigen niederen Alkanol und einem niederen Halogen alkane das ein niederes Alkenol enthält, sur !!»trennung des schwefelhaltigen Glycolipids in krittalliner*"Vera der wässrigen Schicht Tertellt* ..-.*

   man- das abgetrennt®
   aus einer Mischung ®Q^c©
   ai@d©r@Et Alkanol uad

   Verfahren nach Äisepnsefe-.I,. dadurch gek@ssaseichne^₉ iaS als Löstaagsnittel, das HXfeolipid zu W®m ^erma^.-aiß nie-.

   «leres Alken©!, Pjriiia₉ Birne thvlfprmamid oder - .M^stlaylavlf oxyd-

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein als nichtpolares oder wenig polares Lösungsmittel sum Waschen der rohen Sphingolipidfraktion Petroläther, Äther oder Aceton ▼erwendet·.

   5. Verfahren nach Anspruch 1« dadurch gekenaseichnet, d*8 man als Lösungsmittel, das Folfglyoollpld su lösen veriag, Wasser oder eine Mischung aus Wasser, und einem niederen

   Alkanol verwendet.

   6. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch gekennseichnet, daß

   man die Extraktion der rohen Sphingolipidfraktion durch Behandlung der tierischen Geweoe mit einem niederen Alkanol bei etwa 30 - 60⁰C, Filtrieren der Mischling und Abkühlen dee Filtrate auf etwa 0 - 3*0 sur Ausfällung der roheu Sphingolipidfraktion durchführt.

   7, Sin schwefelhaltiges Glyeolipid is Worm fsrfelos«? artiger Kristalle Bit folgendes Werfe·» Ss?

   Kohlenstoff 58,33 ί Vaeserstoff 9.76 * Stickstoff 1,68 * Sohwefel 3/16 * Saliua 4.ÖÖ * Ph sphor * 0,00 f>

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   mit einem Molekulargewicht von etwa 858; einem seile inbaren Schmelzpunkt von 194 - 196⁰C (Zers.); einem optischen Drehwert

   als Lösung in Fyridin von j/J J⁵ ■* +7*9° (e-OaSh einem Infrarotabsorptionsspektrum (Kaliumbromidpreßling) mit den charakteristischen Frequenzen 5450, 2940, 28*70, 1650« 1540, 147O₉ 1240, 1150, 1070, 990, 82Q, 725 cm"¹ ₉ das In Chloroform/Methanol (Volumenverhältnia 2:1), in Pyridin und in Dimethylformamid in der Wärme löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, Xther.» Petroläther, Hexan, Dioxam, Chloroform, Tetra-,

   chiorkohlenstoff, Ithylacetat, Benzol, Sisessig, wässrigem Na-

   sehr triumhydroxyd, Salzsäure und Wasser/echlecht löslich ist.

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