DE10260903A1

DE10260903A1 - Neue Perhydrolasen

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Publication number: DE10260903A1
Application number: DE10260903A
Authority: DE
Inventors: Susanne Dr. Schmitz; Laura Polányi-Bald; Inken PRÜSER; Regina Dr. Stehr; Karl-Heinz Dr. Maurer
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-07-08
Also published as: US20050281773A1; JP2006510383A; WO2004058961A1; AU2003294841A1; EP1572997A1; JP4505337B2; US7510859B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Perhydrolasen, Verfahren zu ihrer Gewinnung, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, Haarwaschmittel, Mund-, Zahn- und Zahnprothesenpflegemittel, Kosmetika, Therapeutika, Waschmittel, Reinigungsmittel, Nachspülmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel und Maschinengeschirrspülmittel, enthaltend neue Perhydrolasen sowie Verwendung der neuen Perhydrolasen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Perhydrolasen, Verfahren zu Ihrer Gewinnung, Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, Haarwaschmittel, Mund-, Zahn- und Zahnprothesenpflegemittel, Kosmetika, Therapeutika, Waschmittel, Reinigungsmittel, Nachspülmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel und Maschinengeschirrspülmittel, enthaltend neue Perhydrolasen sowie Verwendungen der neuen Perhydrolasen
Für die herkömmliche chemische Bleiche von Wäsche werden anorganische, hoch alkalische Wasserstoffperoxidlieferanten wie Percarbonat oder Perborat in Kombination mit Bleichboostern (TAED oder NOBS) eingesetzt. Dieses Standard-Bleichsystem ist aber nur bei Temperaturen ab 60°C voll wirksam. Für den Niedrigtemperaturbereich steht kein optimales Bleichsystem zur Verfügung. Ausserdem kommt es häufig zu lokalen "spotting"-Effekten bei gefärbten Textilien. Die Bleichkomponente Wasserstoffperoxid entsteht durch spontanen Zerfall des Salzes und führt damit schnell aber kurzfristig zu hohen Konzentrationen. Eine schonende, verzögerte Bleiche bei milderem pH ist nicht möglich.
Für den Einsatz in schwach basischen Matrizes z.B. Flüssigformulierungen steht ebenfalls kein optimales Bleichsystem zur Verfügung.
Proteasen können aus Percarbonsäureester mit Hilfe von Wasserstoffperoxid Percarbonsäure als bleichendes Agens freisetzen: CH₃CH₂CH₂COOCH₃ + H₂O₂ → CH₃CH₂CH₂COOOH + CH₃OH
Diese Nebenreaktion der Proteasen reichte bisher nicht für einen wirtschaftlichen Einsatz von Proteasen als Bleichenzyme in Wasch- und Reinigungsmitteln aus.
Für die Haarfärbung wird herkömmlich eine Bleiche zur Nivellierung von Grautönen vor der Färbung mit Wasserstoffperoxid und Ammoniaklösung durchgeführt. Die kurzfristig hohen Wasserstoffperoxidkonzentrationen in Kombination mit dem alkalischen pH führen zu einer deutlichen Haarschädigung. Eine Vorbehandlung ohne geruchsbelästigen Ammoniak mit kontinuierlicher Wasserstoffperoxidfreisetzung bei neutralem oder schwach basischem pH steht nicht zur Verfügung.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich durch Modifizierung einer Protease (Subtilisin Carlsberg) mittels Zufallsmutagenese Perhydrolasen generieren ließen, die unter weitgehender Vermeidung der dem einschlägigen Stand der Technik anhaftenden Nachteile in Bleichsystemen eingesetzt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Perhydrolase, deren Aminosäuresequenz der in Seq. 23 [Subtilisin Carlsberg (Wildtyp, komplett incl. Signal und Propeptid)] angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen trägt, die ausgewählt sind unter 11, 15, 21, 38, 50, 54, 58, 77, 83, 89, 93, 96, 107, 120, 134, 135, 136, 140, 147, 150, 154, 155, 160, 161, 171, 179, 180, 181, 194, 205, 208, 213, 216, 217, 238, 239, 251, 253, 257, 261.
Vorzugsweise entspricht die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Perhydrolase der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz, trägt jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen, die ausgewählt sind unter 11, 58, 77, 89, 96, 117 120, 134, 135, 136, 140, 147, 150, 161, 208, 216, 217, 238.
Bevorzugt entspricht die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Perhydrolase der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz, trägt jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen, die ausgewählt sind unter 58, 89, 96, 117, 216, 217.
Besonders bevorzugt entspricht die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Perhydrolase der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz, trägt jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen, die durch folgende Tabelle charakterisiert sind:
wobei
in der ersten Spalte die Nummer der jeweiligen Sequenz,
in der zweiten Spalte das Substitutionsmuster derart angegeben ist, daß
der erste Buchstabe die eliminierte Aminosäure bezeichnet,
die Zahl zwischen den beiden Buchstaben die Sequenzposition der Substitution angibt und
der zweite Buchstabe die eingefügte Aminosäure bezeichnet.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Perhydrolase, deren Aminosäuresequenz mit einer der in den Seq. 1 bis 9, angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.
Gleichfalls besonders bevorzugt ist eine für eine Perhydrolase kodierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz einen Teil enthält, der mit einer der in Seq. 10 bis 18, angegebenen Nukleotidsequenzen zu mindestens 60 %, mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, beson ders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch eine Perhydrolase, erhältlich durch ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäurenaustausch aus einer erfindungsgemäßen Perhydrolase sowie eine Perhydrolase, erhältlich durch Derivatisierung, Fragmentierung, Deletionsmutation oder Insertionsmutation einer erfindungsgemäßen Perhydrolase.
Die erfindungsgemäßen Perhydrolasen basieren auf Subtilisin Carlsberg, dessen perhydrolytische Eigenschaften mittels Zufallsmutagenese auf die Substrate Percarbonsäureester und Wasserstoffperoxid angepasst wurden, mit dem Ziel, die Fähigkeit zur Perhydrolyse von Percarbonsäureester mittels Wasserstoffperoxid zu Persäure zu verstärken und so eine Bleichenzym unter anderem für den Einsatz in Waschmittel zu generieren bei gleichzeitiger Reduktion der hydrolytischen Aktivität
Die erfindungsgemäßen Perhydrolasen weisen vorteilhafterweise eine hohe spezifische Percarbonsäurebildungsrate auf.
Das pH-Profil der erfindungsgemäßen Enzyme ist kompatibel mit dem erforderlichen alkalischen pH bei technischem Einsatz sowie mit typischen Produkten wie Wasch- und Reinigungsmitteln und Haarfärbungen.
Im folgenden bedeutet ein Ausdruck der Form „mindestens X %" „X % bis 100 % (einschließlich der Eckwerte X und 100 und aller ganzzahligen und nicht ganzzahligen Prozentwerte dazwischen)".
Unter einem Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist dreidimensionale Struktur annehmendes Polymer zu verstehen. In der vorliegenden Anmeldung werden die 19 proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biokatalytische Funktion ausübt.
Zahlreiche Proteinewerden als sogenannte Präproteine oder Präproproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid und / oder Propeptid gebildet. Unter einem Signalpeptid ist der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedingungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Proprotein abgespalten. Das Propeptid gewährleistet die korrekte Faltung und des Proteins und wird vom reifen, katalytisch aktiven Protein autokatalytisch abgespalten.
Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen Peptide, das heißt die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt.
Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimie renden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, daß verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so daß eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotidsequenzen abgeleitet werden kann (Degeneriertheit des genetischen Codes). Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden und angegebene Nukleotidsequenzen sind jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge anzusehen.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Herstellung rekombinanter Proteine. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, daß die Gene für die interessierenden Proteine in einen für die Produktion geeigneten Wirtsorganismus eingebracht und von diesem transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch über solche, die bewirken, daß das interessierende Gen im Wirtsorganismus in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren gegentischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette bezeichnet. Sie muß dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus besser:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press.
Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert oder rekombiniert werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions- Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions- substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine oder solche, die vollständig translatierten Genen entsprechen, und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.
Den Fragmenten entsprechen auf Nukleinsäure-Ebene die Teilsequenzen.
Unter chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, die von Nukleinsäureketten kodiert werden, die natürlicherweise von verschiedenen oder aus demselben Organismus stammen. Dieses Vorgehen wird auch Rekombinationsmutagenese genannt. Der Sinn einer solchen Rekombination kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf welche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteinen sind solche Varianten zu verstehen, die über an sich bekannte Methoden durch Einfügen eines Nukleinsäure-, beziehungsweise Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in chimären Proteinen.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den Wirtsorganismus erfolgen. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blokkierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen.
Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, daß sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefaßt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Man unterscheidet in der Gentechnik einerseits zwischen solchen Vektoren, die der Lagerung und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit dienen, den sogenannten Klonierungsvektoren, und andererseits denen, die die Funktion erfüllen, das interessierende Gen in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt, die Expression des betreffenden Proteins zu ermöglichen. Diese Vektoren werden als Expressionsvektoren bezeichnet.
Durch Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, läßt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.
Solch ein Vergleich geschieht dadurch, daß ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Codon-Usage. Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben Positionen widergegeben. Ein weiter gefaßter Homologiebegrift bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
Die Erstellung eines Alignments ist der erste Schritt zur Definition eines Sequenzraums. Dieser hypothetische Raum umfaßt sämtliche durch Permutation in Einzelpositionen abzuleitenden Sequenzen, die sich unter Berücksichtigung aller in den betreffenden Einzelpositionen des Alignments auftretenden Variationen ergeben. Jedes hypothetisch mögliche Proteinmolekül bildet einen Punkt in diesem Sequenzraum. Beispielsweise begründen zwei Aminosäuresequenzen, die bei weitgehender Identität an lediglich zwei verschiedenen Stellen jeweils zwei verschiedene Aminosäuren aufweisen, somit einen Sequenzraum von vier verschiedenen Aminosäuresequenzen. Ein sehr großer Sequenzraum wird erhalten, wenn zu einzelnen Sequenzen eines Raums jeweils weitere homologe Sequenzen gefunden werden. Über solche, jeweils paarweise bestehenden hohen Homologien können auch sehr niedrig homologe Sequenzen als einem Sequenzraum zugehörig erkannt werden.
Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz beschrieben. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Die molekularbiologische Dimension der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine.
Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren, sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.
Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine. Sie stellen insofern Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar, als die Sequenzen der enthaltenen erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereiche jeweils innerhalb der oben näher bezeichneten Homologiebereiche liegen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Klonierungsvektoren. Diese eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.
Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind. Expressionsvektoren ermöglichen, daß das zugehörige Protein heterolog, also in einem anderen Organismus als dem, aus dem es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einem das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtsorganismus über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, daß natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.
Die In-vivo-Synthese eines erfindungsgemäßen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Organismen, das heißt Prokaryonten, Eukaryonten oder Archea. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch gut handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen nach dem Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systeme die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermitteln werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtsorganismen gewonnen werden.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertre ter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so daß sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.
Eine Variante dieses Versuchsprinzips stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.
Bevorzugte Wirtszellen sind solche der Gattung Bacillus, Besonders bevorzugt Bacillus subtilis und Bacillus lichenifirmis, aber auch Bacillus amyloliquefaciens.
Auch eukaryontische Zellen können sich zur Produktion erfindungsgemäßer Proteine eignen. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Dazu gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccaride.
Die Wirtszellen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Organismen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.
Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik wohlbekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar; gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode.
Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden, die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden.
Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, daß unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfodert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme.
Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Proteins aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahrer bekannt, wie Fällung z.B durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jeoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen.
Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.
Durch Klonierung und Expression können die erfindungsgemäßen Perhydrolasen in der für den technischen Einsatz erforderlichen Menge zur Verfügung gestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Perhydrolasen weisen ein pH-Optimum vorzugsweise im alkalischen Bereich von etwa pH 7 bis pH 12, besonders bevorzugt pH 8 bis pH 10 auf.
Das Temperatur-Optimum der erfindungsgemäßen Perhydrolasen liegt etwa im Bereich von 20 bis 60°C, insbesondere bei etwa 30-50°C.
Eine erfindungsgemäße Perhydrolase wird vorzugsweise in solchen Mengen eingesetzt, daß das gesamte Mittel eine Perhydrolase-Aktivität von 0,05 bis 5 ppmAO/μg vorzugsweise 0,2 bis 1,2 ppmAO/μg aufweist. Mittel mit Perhydrolase-Aktivitäten in den genannten Bereichen weisen eine für übliche europäische maschinelle Waschverfahren ausreichend rasche Percarbonsäurefreisetzung auf, wohingegegen die Steigerung der enthaltenen Perhydrolasemenge auf höhere Aktivitäten in der Regel keine entsprechend hohe Steigerung der Bleichleistung ergibt.
Die Menge des im erfindungsgemäßen Waschmittel enthaltenen Substrats für die Perhydrolase richtet sich nach der zum Erzielen des gewünschten Bleichergebnisses erforderlichen Percarbonsäuremenge und kann durch den Fachmann in gewünschter Weise eingestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Oligonukleotid, insbesondere ein PCR-Primer, mit einer der in Seq. 19 bis 22 angegebenen Sequenzen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind zur Identifizierung und/oder Gewinnung einer neuen Perhydrolase verwendbar.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Perhydrolase kann unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Perhydrolase zur Fusion oder Verknüpfung mit einem anderen Protein, insbesondere zur Entwicklung eines neuen Enzyms, oder unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Fusion mit einer anderen Nukleinsäure, insbesondere zur Entwicklung eines neuen Enzyms. erfolgen.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind:
Ein Vektor, der einen erfindungsgemäßen Nukleinsäurebereich enthält und der beispielsweise ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein kann. Außerdem eine Wirtszelle, die eines der erfindungsgemäßen Proteine oder Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors. Bevorzugtermaßen ist die Wirtszelle ein Bakterium, insbesondere eines, das das gebildete Protein oder Derivat ins umgebende Medium sezerniert. Die erfin dungsgemäße Wirtszelle kann der Gattung Escherichia, insbesondere der Species Escherichia coli oder der Gattung Bacillus, vorzugsweise der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus angehören. Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational modifiziert.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Verwendungen der erfindungsgemäßen Perhydrolasen als Wasserstoffperoxid in situ erzeugende Agenzien.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist die Verwendung zur Bleiche, zur Farbübertragungsinhibierung und zur Desinfektion.
Die erfindungsgemäßen Perhydrolasen können vorteilhaft in Körperpflegemittel, Haarnraschmittel, Haarpflegemittel, Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflegemittel, Kosmetika, Waschmittel, Reinigungsmittel, Nachspülmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Desinfektionsmittel und Mittel zur bleichenden oder desinfizierenden Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder eingebracht werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Wasch-, oder Bleichmittel, enthaltend ein Bleichsystem, das in der Lage ist, unter Anwendungsbedingungen des Mittels Wasserstoffperoxid zu erzeugen, und gegebenenfalls synthetisches Tensid, organischen und/oder anorganischen Builder sowie sonstige übliche Bleich- oder Waschmittelbestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß das Bleichsystem aus einer erfindungsgemäßen Perhydrolase und einem Substrat für die Perhydrolase sowie einer Wasserstoffperoxidquelle besteht.
Das Substrat ist vorzugsweise ausgewählt unter Methyl-, Ethyl- oder Glycerinestern von Butter-, Capron- oder Octansäure, bevorzugt Buttersäuremethyl ester, Capronsäuremethylester, Octansäuremethylester, Trioctanin besonders und besonders bevorzugt: Buttersäuremethylester.
Die Wasserstoffperoxid-Quelle ist insbesondere ausgewählt unter Natriumpercarbonat, Natriumperborat oder Kaliummonopersulfat-Tripelsalz, Salzmischungen von Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 3 (pH 5,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 1 (pH 7,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 3 zu 1 (>pH 9) und besonders bevorzugt H₂O₂.
Das erfindungsgemäße Wasch-, oder Bleichmittel weist vorzugsweise eine perhydrolytische Aktivität von 0,05 bis 5 ppmAO/μg vorzugsweise 0,2 bis 1,2 ppmAO/μg auf; es liegt bevorzugtermaßen als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, vor. Alternativ kann es aber auch in Form eines Formkörpers, insbesondere eines sogenannten Tabs oder eines Granulates oder eines pastenförmigen oder flüssigen Waschmittels vorliegen, insbesondere in Form eines nicht-wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wäßrigen Paste oder in Form eines wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.
Das erfindungsgemäße Wasch-, oder Bleichmittel kann in einem Behältnis verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird, insbesondere kann die Perhydrolase und/oder das Substrat für dieses Enzym mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym und/oder dessen Substrat undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym und/oder dessen Substrat wird.
Das erfindungsgemäße Wasch-, oder Bleichmittel enthält vorzugsweise zusätzlich zum Bleichsystem

– 5 Gew.-% bis 70 Gew.-%, insbesondere 10 Gew.-% bis 50 Gew.-% Tensid,
– 10 Gew.-% bis 65 Gew.-%, insbesondere 12 Gew.-% bis 60 Gew.-% wasserlösliches, wasserdispergierbares anorganisches Buildermaterial,
– 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 2 Gew.-% bis 8 Gew.-%, wasserlösliche organische Buildersubstanzen,
– nicht über 15 Gew.-% feste anorganische und/oder organische Säuren beziehungsweise saure Salze,
– nicht über 5 Gew.-% Komplexbildner für Schwermetalle,
– nicht über 5 Gew.-% Vergrauungsinhibitor,
– nicht über 5 Gew.-% Farbübertragungsinhibitor und
– nicht über 5 Gew.-% Schauminhibitor.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Haarwasch- und/oder Haarpflegemittel, enthaltend erfindungsgemäße Perhydrolasen.
Die Haarwasch- und/oder Haarpflegemittel sowie Schaumbäder, Duschbäder, Cremes, Gele, Lotionen, alkoholische und wäßrig/alkoholische Lösungen, Emulsionen, Wachs/ Fett-Massen, Stiftpräparate, Puder oder Salben, die erfindungsgemäße Perhydrolasen umfassen, können als Hilfs- und Zusatzstoffe milde Tenside, Ölkörper, Emulgatoren, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdickungsmittel, Polymere, Siliconverbindungen, Fette, Wachse, Stabilisatoren, biogene Wirkstoffe, Deodorantien, Antitranspirantien, Antischuppenmittel, Filmbildner, Quellmittel, UV-Licht-schutzfaktoren, Antioxidantien, Hydrotrope, Konservierungsmittel, Insektenrepellentien, Selbstbräuner, Solubilisatoren, Parfümöle, Farbstoffe und dergleichen enthalten.
Typische Beispiele für geeignete milde, d.h. besonders hautverträgliche Tenside sind Fettalkoholpolyglycolethersulfate, Monoglyceridsulfate, Mono- und/oder Dialkylsulfosuccinate, Fettsäureisethionate, Fettsäuresarcosinate, Fettsäuretauride, Fettsäureglutamate, ⟐-Olefinsulfonate, Ethercarbonsäuren, Alkyloligoglucoside, Fettsäureglucamide, Alkylamidobetaine und/oder Proteinfettsäurekondensate, letztere vorzugsweise auf Basis von Weizenproteinen.
Als Ölkörper kommen beispielsweise Guerbetalkohole auf Basis von Fettalkoholen mit 6 bis 18, vorzugsweise 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, Ester von linearen C₆-C₂₂-Fettsäuren mit linearen C₆-C₂₂-Fettalkoholen, Ester von verzweigten C₆-C₁ ₃-Carbonsäuren mit linearen C₆-C₂₂-Fettalkoholen, wie z.B. Myristylmyristat, Myristylpalmitat, Myristylstearat, Myristylisostearat, Myristyloleat, Myristylbehenat, Myristylerucat, Cetylmyristat, Cetylpalmitat, Cetylstearat, Cetylisostearat, Cetyloleat, Cetylbehenat, Cetylerucat, Stearylmyristat, Stearylpalmitat, Stearylstearat, Stearylisostearat, Stearyloleat, Stearylbehenat, Stearylerucat, Isostearylmyristat, Isostearylpalmitat, Isostearylstearat, Isostearylisostearat, Isostearyloleat, Isostearylbehenat, Isostearyloleat, Oleylmyristat, Oleylpalmitat, Oleylstearat, Oleylisostearat, Oleyloleat, Oleylbehenat, Oleylerucat, Behenylmyristat, Behenylpalmitat, Behenylstearat, Behenylisostearat, Behenyloleat, Behenylbehenat, Behenylerucat, Erucylmyristat, Erucylpalmitat, Erucylstearat, Erucylisostearat, Erucyloleat, Erucylbehenat und Erucylerucat. Daneben eignen sich Ester von linearen C₆-C₂₂-Fettsäuren mit verzweigten Alkoholen, insbesondere 2-Ethylhexanol, Ester von Hydroxycarbonsäuren mit linearen oder verzweigten C₆-C₂₂-Fettalkoholen, insbesondere Dioctyl Malate, Ester von linearen und/oder verzweigten Fettsäuren mit mehrwertigen Alkoholen (wie z.B. Propylenglycol, Dimerdiol oder Trimertriol) und/oder Guerbetalkoholen, Triglyceride auf Basis C₆-C₁₀-Fettsäuren, flüssige Mono-/Di-/Triglyceridmischungen auf Basis von C₆-C₁ ₈-Fettsäuren, Ester von C₆-C₂₂-Fettalkoholen und/oder Guerbetalkoholen mit aromatischen Carbonsäuren, insbesondere Benzoesäure, Ester von C₂-C₁ ₂-Dicarbonsäuren mit linearen oder verzweigten Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoftatomen oder Polyolen mit 2 bis 10 Kohlenstoftatomen und 2 bis 6 Hydroxylgruppen, pflanzliche Öle, verzweigte primäre Alkohole, substituierte Cyclohexane, lineare und verzweigte C₆-C₂₂-Fettalkoholcarbonate, Guerbetcarbonate, Ester der Benzoesäure mit linearen und/oder verzweigten C₆-C₂₂-Alkoholen (z.B. Finsolv^® TN), lineare oder verzweigte, symmetrische oder unsymmetrische Dialkylether mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe, Ringöffnungsprodukte von epoxidierten Fettsäureestern mit Polyolen, Siliconöle und/oder aliphatische bzw. naphthenische Kohlenwasserstoffe, wie z.B. wie Squalan, Squalen oder Dialkylcyclohexane in Betracht.
Als Emulgatoren kommen beispielsweise nichtionogene Tenside aus mindestens einer der folgenden Gruppen in Frage:

(1) Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/ oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen, an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe sowie Alkylamine mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest;
(2) C_12/18-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin;
(3) Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoftatomen und deren Ethylenoxidanlagerungsprodukte;
(4) Alkyl- und/oder Alkenylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alk(en)ylrest und deren ethoxylierte Analoga;
(5) Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
(6) Polyol- und insbesondere Polyglycerinester;
(7) Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
(8) Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C_6/22-Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Zuckeralkohole (z.B. Sorbit), Alkylglucoside (z.B. Methylglucosid, Butylglucosid, Laurylglucosid) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose);
(9) Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEGalkylphosphate und deren Salze;
(10) Wollwachsalkohole;
(11) Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate;
(12) Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol gemäß DE 1165574 PS und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methylglucose und Polyolen, vorzugsweise Glycerin oder Polyglycerin,
(13) Polyalkylenglycole sowie
(14) Glycerincarbonat.

Die Anlagerungsprodukte von Ethylenoxid und/oder von Propylenoxid an Fettalkohole, Fettsäuren, Alkylphenole, Glycerinmono- und -diester sowie Sorbitanmono- und -diester von Fettsäuren oder an Ricinusöl stellen bekannte, im Handel erhältliche Produkte dar. Es handelt sich dabei um Homologengemische, deren mittlerer Alkoxylierungsgrad dem Verhältnis der Stoffmengen von Ethylenoxid und/ oder Propylenoxid und Substrat, mit denen die Anlagerungsreaktion durchgeführt wird, entspricht. C_12/18-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von Ethylenoxid an Glycerin sind aus DE 2024051 PS als Rückfettungsmittel für kosmetische Zubereitungen bekannt.
Alkyl- und/oder Alkenylmono- und -oligoglycoside, ihre Herstellung und ihre Verwendung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ihre Herstellung erfolgt insbesondere durch Umsetzung von Glucose oder Oligosacchariden mit primären Alkoholen mit 8 bis 18 C-Atomen. Bezüglich des Glycosidrestes gilt, daß sowohl Monoglycoside, bei denen ein cyclischer Zuckerrest glycosidisch an den Fettalkohol gebunden ist, als auch oligomere Glycoside mit einem Oligomerisationsgrad bis vorzugsweise etwa 8 geeignet sind. Der Oligomerisierungsgrad ist dabei ein statistischer Mittelwert, dem eine für solche technischen Produkte übliche Homologenverteilung zugrunde liegt.
Typische Beispiele für geeignete Polyglycerinester sind Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate (Dehymuls^® PGPH), Polyglycerin-3-Diisostearate (Lameform^® TGI), Polyglyceryl-4 Isostearate (Isolan^® GI 34), Polyglyceryl-3 Oleate, Diisostearoyl Polyglyceryl-3 Diisostearate (Isolan^® PDI), Polyglyceryl-3 Methylglucose Distearate (Tego Care^® 450), Polyglyceryl-3 Beeswax (Cera Bellina^®), Polyglyceryl-4 Caprate (Polyglycerol Caprate T2010/90), Polyglyceryl-3 Cetyl Ether (Chimexane^® NL), Polyglyceryl-3 Distearate (Cremophor^® GS 32) und Polyglyceryl Polyricinoleate (Admul^® WOL 1403) Polyglyceryl Dimerate Isostearate sowie deren Gemische.
Weiterhin können als Emulgatoren zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktiven Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine Carboxylat- und eine Sulfonatgruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosalkyldimethylammoniumglycinat, N-Acylaminopropyl-N,N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacylaminopropyldimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3-hydroxyethylimidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethylcarboxymethylglycinat. Besonders bevorzugt ist das unter der CTFA-Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat. Ebenfalls geeignete Emulgatoren sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C₈ _/1 ₈-Alkyl- oder -Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine -COOH- oder -SO₃H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N-Alkylpropionsäuren, N-Alkylaminobuttersäuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hydroxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyltaurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkylaminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe. Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkylaminopropionat, das Kokosacylaminoethylaminopropionat und das C₁₂ _/1 ₈-Acylsarcosin. Neben den ampholytischen kommen auch quartäre Emulgatoren in Betracht, wobei solche vom Typ der Esterquats, vorzugsweise methylquaternierte Difettsäuretriethanolaminester-Salze, besonders bevorzugt sind.
Als Überfettungsmittel können Substanzen wie beispielsweise Lanolin und Lecithin sowie polyethoxylierte oder acylierte Lanolin- und Lecithinderivate, Polyolfettsäureester, Monoglyceride und Fettsäurealkanolamide verwendet werden, wobei die letzteren gleichzeitig als Schaumstabilisatoren dienen.
Als Perlglanzwachse kommen beispielsweise in Frage: Alkylenglycolester, speziell Ethylenglycoldistearat; Fettsäurealkanolamide, speziell Kokosfettsäurediethanolamid; Partialglyceride, speziell Stearinsäuremonoglycerid; Ester von mehrwertigen, gegebenenfalls hydroxysubstituierte Carbonsäuren mit Fettalkoholen mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, speziell langkettige Ester der Weinsäure; Fettstoffe, wie beispielsweise Fettalkohole, Fettketone, Fettaldehyde, Fettether und Fettcarbonate, die in Summe mindestens 24 Kohlenstoffatome aufweisen, speziell Lauron und Distearylether; Fettsäuren wie Stearinsäure, Hydroxystearinsäure oder Behensäure, Ringöftnungsprodukte von Olefinepoxiden mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen mit Fettalkoholen mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und/oder Polyolen mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen und 2 bis 10 Hydroxylgruppen sowie deren Mischungen.
Als Konsistenzgeber kommen in erster Linie Fettalkohole oder Hydroxyfettalkohole mit 12 bis 22 und vorzugsweise 16 bis 18 Kohlenstoffatomen und daneben Partialglyceride, Fettsäuren oder Hydroxyfettsäuren in Betracht. Bevorzugt ist eine Kombination dieser Stoffe mit Alkyloligoglucosiden und/oder Fettsäure-N-methylglucamiden gleicher Kettenlänge und/oder Polyglycerinpoly-12-hydroxystearaten.
Geeignete Verdickungsmittel sind beispielsweise Aerosil-Typen (hydrophile Kieselsäuren), Polysaccharide, insbesondere Xanthan-Gum, Guar-Guar, Agar-Agar, Alginate und Tylosen, Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose, ferner höhermolekulare Polyethylenglycolmono- und -diester von Fettsäuren, Polyacrylate, (z.B. Carbopole^® von Goodrich oder Synthalene^® von Sigma), Polyacrylamide, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, Tenside wie beispielsweise ethoxylierte Fettsäureglyceride, Ester von Fettsäuren mit Polyolen wie beispielsweise Pentaerythrit oder Trimethylolpropan, Fettalkoholethoxylate mit eingeengter Homologenverteilung oder Alkyloligoglucoside sowie Elektrolyte wie Kochsalz und Ammoniumchlorid.
Geeignete kationische Polymere sind beispielsweise kationische Cellulosederivate, wie z.B. eine quaternierte Hydroxyethylcellulose, die unter der Bezeichnung Polymer JR 400^® von Amerchol erhältlich ist, kationische Stärke, Copolymere von Diallylammoniumsalzen und Acrylamiden, quaternierte Vinylpyrrolidon/Vinylimidazol-Polymere, wie z.B. Luviquat^® (BASF), Kondensationsprodukte von Polyglycolen und Aminen, quaternierte Kollagenpolypeptide, wie beispielsweise Lauryldimonium hydroxypropyl hydrolyzed collagen (Lamequat^®L/Grünau), quaternierte Weizenpolypeptide, Polyethylenimin, kationische Siliconpolymere, wie z.B. Amidomethicone, Copolymere der Adipinsäure und Dimethylaminohydroxypropyldiethylentriamin (Cartaretine^®/Sandoz), Copolymere der Acrylsäure mit Dimethyldiallylammoniumchlorid (Merquat^® 550/Chemviron), Polyaminopolyamide, wie z.B. beschrieben in der FR 2252840 A sowie deren vernetzte wasserlöslichen Polymere, kationische Chitinderivate wie beispielsweise quaterniertes Chitosan, gegebenenfalls mikrokristallin verteilt, Kondensationsprodukte aus Dihalogenalkylen, wie z.B. Dibrombutan mit Bisdialkylaminen, wie z.B. Bis-Dimethylamino-1,3-propan, kationischer Guar-Gum, wie z.B. Jaguar^® CBS, Jaguar^® C-17, Jaguar^® C-16 der Firma Celanese, quaternierte Ammoniumsalz-Polymere, wie z.B. Mirapol^® A-15, Mirapol^® AD-1, Mirapol^® AZ-1 der Firma Miranol.
Als anionische, zwitterionische, amphotere und nichtionische Polymere kommen beispielsweise Vinylacetat/Crotonsäure-Copolymere, Vinylpyrrolidon/Vinylacrylat-Copolymere, Vinylacetat/Butylmaleat/ Isobornylacrylat-Copolymere, Methylvinylether/Maleinsäureanhydrid-Copolymere und deren Ester, unvernetzte und mit Polyolen vernetzte Polyacrylsäuren, Acrylamidopropyltrimethylammoniumchlorid/Acrylat-Copolymere, Octylacrylamid/Methylmethacrylat/tert.Butylaminoethylmethacrylat/2-Hydroxyproyl-methacrylat-Copolymere, Polyvinylpyrrolidon, Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymere, Vinylpyrrolidon/ Dimethylaminoethylmethacrylat/Vinylcaprolactam-Terpolymere sowie gegebenenfalls derivatisierte Celluloseether und Silicone in Frage.
Geeignete Siliconverbindungen sind beispielsweise Dimethylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, cyclische Silicone sowie amino-, fettsäure-, alkohol-, polyether-, epoxy-, fluor-, glykosid- und/oder alkylmodifizierte Siliconverbindungen, die bei Raumtemperatur sowohl flüssig als auch harzförmig vorliegen können. Weiterhin geeignet sind Simethicone, bei denen es sich um Mischungen aus Dimethiconen mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 200 bis 300 Dimethylsiloxan-Einheiten und hydrierten Silicaten handelt. Eine detaillierte Übersicht über geeignete flüchtige Silicone findet sich zudem von Todd et al. in Cosm.Toil. 91, 27 (1976).
Typische Beispiele für Fette sind Glyceride, als Wachse kommen u.a. natürliche Wachse, wie z.B. Candelillawachs, Carnaubawachs, Japanwachs, Espartograswachs, Korkwachs, Guarumawachs, Reis-keimölwachs, Zuckerrohrwachs, Ouricurywachs, Montanwachs, Bienenwachs, Schellackwachs, Walrat, Lanolin (Wollwachs), Bürzelfett, Ceresin, Ozokerit (Erdwachs), Petrolatum, Paraffinwachse, Mikrowachse; chemisch modifizierte Wachse (Hartwachse), wie z.B. Montanesterwachse, Sasolwachse, hydrierte Jojobawachse sowie synthetische Wachse, wie z.B. Polyalkylenwachse und Polyethylenglycolwachse in Frage.
Als Stabilisatoren können Metallsalze von Fettsäuren, wie z.B. Magnesium-, Aluminium- und/oder Zinkstearat bzw. -ricinoleat eingesetzt werden.
Unter biogenen Wirkstoffen sind beispielsweise Tocopherol, Tocopherolacetat, Tocopherolpalmitat, Ascorbinsäure, Desoxyribonucleinsäure, Retinol, Bisabolol, Allantoin, Phytantriol, Panthenol, AHA-Säuren, Aminosäuren, Ceramide, Pseudoceramide, essentielle Öle, Pflanzenextrakte und Vitaminkomplexe zu verstehen.
Kosmetische Deodorantien (Desodorantien) wirken Körpergerüchen entgegen, überdecken oder beseitigen sie. Körpergerüche entstehen durch die Einwirkung von Hautbakterien auf apokrinen Schweiß, wobei unangenehm riechende Abbauprodukte gebildet werden. Dementsprechend enthalten Deodorantien Wirkstoffe, die als keimhemmende Mittel, Enzyminhibitoren, Geruchsabsorber oder Geruchsüberdecker fungieren.
Als keimhemmende Mittel, die gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Kosmetika zugesetzt werden können, sind grundsätzlich alle gegen grampositive Bakterien wirksamen Stoffe geeignet, wie z. B. 4-Hydroxybenzoesäure und ihre Salze und Ester, N-(4-Chlorphenyl)-N'-(3,4 dichlorphenyl)harnstoff, 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Triclosan), 4-Chlor-3,5-dimethylphenol, 2,2'-Methylen-bis(6-brom-4-chlorphenol), 3-Methyl-4-(1-methylethyl)phenol, 2-Benzyl-4-chlorphenol, 3-(4-Chlorphenoxy)-1,2-propandiol, 3-1od-2-propinylbutylcarbamat, Chlorhexidin, 3,4,4'-Trichlorcarbanilid (TTC), antibakterielle Riechstoffe, Menthol, Minzöl, Phenoxyethanol, Glycerinmonolaurat (GML), Diglycerinmonocaprinat (DMC), Salicylsäure-N-alkylamide wie z. B. Salicylsäure-n-octylamid oder Salicylsäure-n-decylamid.
Enzyminhibitoren können den erfindungsgemäßen Kosmetika ebenfalls zugesetzt werden. Beispielsweise sind Esteraseinhibitoren möglicherweise geeignete Enzyminhibitoren. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um Trialkylcitrate wie Trimethylcitrat, Tripropylcitrat, Triisopropylcitrat, Tributylcitrat und insbesondere Triethylcitrat (Hydagen^® CAT, Henkel KGaA, Düsseldorf/FRG). Die Stoffe inhibieren die Enzymaktivität und reduzieren dadurch die Geruchsbildung. Weitere Stoffe, die als Esteraseinhibitoren in Betracht kommen, sind Sterolsulfate oder -phosphate, wie beispielsweise Lanosterin-, Cholesterin-, Campesterin-, Stigmasterin- und Sitosterinsulfat bzw -phosphat, Dicarbonsäuren und deren Ester, wie beispielsweise Glutarsäure, Glutarsäuremonoethylester, Glutarsäurediethylester, Adipinsäure, Adipinsäuremonoethylester, Adipinsäurediethylester, Malonsäure und Malonsäurediethylester, Hydroxycarbnonsäuren und deren Ester wie beispielsweise Citronensäure, Äpfelsäure, Weinsäure oder Weinsäurediethylester, sowie Zinkglycinat.
Als Geruchsabsorber eignen sich Stoffe, die geruchsbildende Verbindungen aufnehmen und weitgehend festhalten können. Sie senken den Partialdruck der einzelnen Komponenten und verringern so auch ihre Ausbreitungsgeschwindigkeit. Wichtig ist, daß dabei Parfums unbeeinträchtigt bleiben müssen. Geruchsabsorber haben keine Wirksamkeit gegen Bakterien. Sie enthalten beispielsweise als Hauptbestandteil ein komplexes Zinksalz der Ricinolsäure oder spezielle, weitgehend geruchsneutrale Duftstoffe, die dem Fachmann als "Fixateure" bekannt sind, wie z. B. Extrakte von Labdanum bzw. Styrax oder bestimmte Abietinsäurederivate. Als Geruchsüberdecker fungieren Riechstoffe oder Parfümöle, die zusätzlich zu ihrer Funktion als Geruchsüberdecker den Deodorantien ihre jeweilige Duftnote verleihen. Als Parfümöle seien beispielsweise genannt Gemische aus natürlichen und synthetischen Riechstoffen. Natürliche Riechstoffe sind Extrakte von Blüten, Stengeln und Blättern, Früchten, Fruchtschalen, Wurzeln, Hölzern, Kräutern und Gräsern, Nadeln und Zweigen sowie Harzen und Balsamen. Weiterhin kommen tierische Rohstoffe in Frage, wie beispielsweise Zibet und Castoreum. Typische synthetische Riechstoffverbindungen sind Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe.
Antitranspirantien (Antiperspirantien) reduzieren durch Beeinflussung der Aktivität der ekkrinen Schweißdrüsen die Schweißbildung, und wirken somit Achselnässe und Körpergeruch entgegen. Wässrige oder wasserfreie Formulierungen von Antitranspirantien enthalten typischerweise folgende Inhaltsstoffe:

(a) adstringierende Wirkstoffe,
(b) Ölkomponenten,
(c) nichtionische Emulgatoren,
(d) Coemulgatoren,
(e) Konsistenzgeber,
(f) Hilfsstoffe wie z. B. Verdicker oder Komplexierungsmittel und/oder
(g) nichtwässrige Lösungsmittel wie z. B. Ethanol, Propylenglykol und/oder Glycerin.

Als adstringierende Antitranspirant-Wirkstoffe eignen sich vor allem Salze des Aluminiums, Zirkoniums oder des Zinks. Solche geeigneten antihydrotisch wirksamen Wirkstoffe sind z.B. Aluminiumchlorid, Aluminiumchlorhydrat, Aluminiumdichlorhydrat, Aluminiumsesquichlorhydrat und deren Komplexverbindungen z. B. mit Propylenglycol-1,2. Aluminiumhydroxyallantoinat, Aluminiumchloridtartrat, Aluminium-Zirkonium-Trichlorohydrat, Aluminium-Zirkonium-tetrachlorohydrat, Aluminium-Zirkonium-pentachlorohydrat und deren Komplexverbindungen z. B. mit Aminosäuren wie Glycin.
Daneben können in Antitranspirantien übliche öllösliche und wasserlösliche Hilfsmittel in geringeren Mengen enthalten sein. Solche öllöslichen Hilfsmittel können z.B. sein:

– entzündungshemmende, hautschützende oder wohlriechende ätherische Öle,
– synthetische hautschützende Wirkstoffe und/oder
– öllösliche Parfümöle.

Übliche wasserlösliche Zusätze sind z.B. Konservierungsmittel, wasserlösliche Duftstoffe, pH-Wert-Stellmittel, z.B. Puffergemische, wasserlösliche Verdikkungsmittel, z.B. wasserlösliche natürliche oder synthetische Polymere wie z.B. Xanthan-Gum, Hydroxyethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder hochmolekulare Polyethylenoxide.
Als Antischuppenmittel können Climbazol, Octopirox und Zinkpyrethion eingesetzt werden.
Gebräuchliche Filmbildner sind beispielsweise Chitosan, mikrokristallines Chitosan, quaterniertes Chitosan, Polyvinylpyrrolidon, Vinylpyrnolidon-Vinylacetat-Copolymerisate, Polymere der Acrylsäureneihe, quaternäre Cellulose-Derivate, Kollagen, Hyaluronsäure bzw. deren Salze und ähnliche Verbindungen.
Als Quellmittel für wäßrige Phasen können Montmonillonite, Clay Mineralstoffe, Pemulen sowie alkylmodifizierte Carbopoltypen (Goodrich) dienen. Weitere geeignete Polymere bzw. Quellmittel können der Übersicht von R.Lochhead in Cosm.Toil. 108, 95 (1993) entnommen werden.
Unter UV-Lichtschutzfaktoren sind beispielsweise bei Raumtemperatur flüssig oder kristallin vorliegende organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z.B. Wärme wieder abzugeben. UVB-Filter können öllöslich oder wasserlöslich sein. Als öllösliche Substanzen sind z.B. zu nennen:

– 3-Benzylidencampher bzw. 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, z.B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher wie in der EP 0693471 B1 beschrieben;
– 4-Aminobenzoesäunedenivate, vorzugsweise 4-Dimethylamino)benzoesäure-2-ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylesten und 4-(Dimethylamino)benzoesäureamylester;
– Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäune-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene);
– Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäune-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-isopnopylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester;
– Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon;
– Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester;
– Triazinderivate, wie z.B. 2,4,6-Trianilino-(p-garbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb^® HEB);
– Propan-1,3-dione, wie z.B. 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion;
– Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben.

Als wasserlösliche Substanzen kommen in Frage:

– 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze;
– Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze;
– Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie z.B. 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzolsulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)-sulfonsäure und deren Salze.

Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse Metalloxide bzw. Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d.h. hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind gecoatete Titandioxide, wie z.B. Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex^® T2000 (Merck). Als hydrophobe Coatingmittel kommen dabei vor allem Silicone und dabei speziell Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. In Sonnenschutzmitteln werden bevorzugt sogenannte Mikro- oder Nanopigmente eingesetzt. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P.Finkel in SÖFW-Journal 122, 543 (1996) zu entnehmen.
Neben den beiden vorgenannten Gruppen primärer Lichtschutzstoffe können auch sekundäre Lichtschutzmittel vom Typ der Antioxidantien eingesetzt werden, die die photochemische Reaktionskette unterbrechen, welche ausgelöst wird, wenn UV-Strahlung in die Haut eindringt. Typische Beispiele hierfür sind Aminosäuren (z.B. Glycin, Histidin, Tyrosin, Tryptophan) und deren Derivate, Imidazole (z.B. Urocaninsäure) und deren Derivate, Peptide wie D,L-Carnosin, D-Carnosin, L-Carnosin und deren Derivate (z.B. Anserin), Carotinoide, Carotine (z.B. α-Carotin, β-Carotin, Lycopin) und deren Derivate, Chlorogensäure und deren Derivate, Liponsäure und deren Derivate (z.B. Dihydroliponsäure), Aurothioglucose, Propylthiouracil und andere Thiole (z.B. Thioredoxin, Glutathion, Cystein, Cystin, Cystamin und deren Glycosyl-, N-Acetyl-, Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Amyl-, Butyl- und Lauryl-, Palmitoyl-, Oleyl-, γ-Linoleyl-, Cholesteryl- und Glycerylester) sowie deren Salze, Dilaurylthiodipropionat, Distearylthiodipropionat, Thiodipropionsäure und deren Derivate (Ester, Ether, Peptide, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Salze) sowie Sulfoximinverbindungen (z.B. Buthioninsulfoximine, Homocysteinsulfoximin, Butioninsulfone, Penta-, Hexa-, Heptathioninsulfoximin) in sehr geringen verträglichen Dosierungen (z.B. pmol bis μmol/kg), ferner (Metall)-Chelatoren (z.B. α-Hydroxyfettsäuren, Palmitinsäure, Phytinsäure, Lactoferrin), α-Hydroxysäuren (z.B. Citronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure), Huminsäure, Gallensäure, Gallenextrakte, Bilirubin, Biliverdin, EDTA, EGTA und deren Derivate, ungesättigte Fettsäuren und deren Derivate (z.B. γ-Linolensäure, Linolsäure, Ölsäure), Folsäure und deren Derivate, Ubichinon und Ubichinol und deren Derivate, Vitamin C und Derivate (z.B. Ascorbylpalmitat, Mg-Ascorbylphosphat, Ascorbylacetat), Tocopherole und Derivate (z.B. Vitamin-E-acetat), Vitamin A und Derivate (Vitamin-A-palmitat) sowie Koniferylbenzoat des Benzoeharzes, Rutinsäure und deren Derivate, α-Glycosylrutin, Ferulasäure, Furfurylidenglucitol, Carnosin, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Nordihydroguajakharzsäure, Nordihydroguajaretsäure, Trihydroxybutyrophenon, Harnsäure und deren Derivate, Mannose und deren Derivate, Superoxid-Dismutase, Zink und dessen Derivate (z.B. ZnO, ZnSO₄) Selen und dessen Derivate (z.B. Selen-Methionin), Stilbene und deren Derivate (z.B. Stilbenoxid, trans-Stilbenoxid) und die erfindungsgemäß geeigneten Derivate (Salze, Ester, Ether, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide) dieser genannten Wirkstoffe.
Zur Verbesserung des Fließverhaltens können ferner Hydrotrope, wie beispielsweise Ethanol, Isopropylalkohol, oder Polyole eingesetzt werden. Polyole, die hier in Betracht kommen, besitzen vorzugsweise 2 bis 15 Kohlenstoftatome und mindestens zwei Hydroxylgruppen. Die Polyole können noch weitere funktionelle Gruppen, insbesondere Aminogruppen, enthalten bzw. mit Stickstoff modifiziert sein. Typische Beispiele sind

– Glycerin;
– Alkylenglycole, wie beispielsweise Ethylenglycol, Diethylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol, Hexylenglycol sowie Polyethylenglycole mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 bis 1.000 Dalton;
– technische Oligoglyceringemische mit einem Eigenkondensationsgrad von 1,5 bis 10 wie etwa technische Diglyceringemische mit einem Diglyceringehalt von 40 bis 50 Gew.-%;
– Methyolverbindungen, wie insbesondere Trimethylolethan, Trimethylolpropan, Trimethylolbutan, Pentaerythrit und Dipentaerythrit;
– Niedrigalkylglucoside, insbesondere solche mit 1 bis 8 Kohlenstoffen im Alkylrest, wie beispielsweise Methyl- und Butylglucosid;
– Zuckeralkohole mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Sorbit oder Mannit,
– Zucker mit 5 bis 12 Kohlenstoftatomen, wie beispielsweise Glucose oder Saccharose;
– Aminozucker, wie beispielsweise Glucamin;
– Dialkoholamine, wie Diethanolamin oder 2-Amino-1,3-propandiol.

Als Konservierungsmittel eignen sich beispielsweise Phenoxyethanol, Formaldehydlösung, Parabene, Pentandiol oder Sorbinsäure sowie die in Anlage 6, Teil A und B der Kosmetikverordnung aufgeführten weiteren Stoffklassen. Als Insekten-Repellentien kommen N,N-Diethyl-m-toluamid, 1,2-Pentandiol oder Ethyl Butylacetylaminopropionate in Frage, als Selbstbräuner eignet sich Dihydroxyaceton.
Als Parfümöle seien genannt Gemische aus natürlichen und synthetischen Riechstoffen. Natürliche Riechstoffe sind Extrakte von Blüten (Lilie, Lavendel, Rosen, Jasmin, Neroli, Ylang-Ylang), Stengeln und Blättern (Geranium, Patchouli, Petitgrain), Früchten (Anis, Koriander, Kümmel, Wacholder), Fruchtschalen (Bergamotte, Zitrone, Orangen), Wurzeln (Macis; Angelica, Sellerie, Kardamon, Costus, Iris, Calmus), Hölzern (Pinien-, Sandel-, Guajak-, Zedern-, Rosenholz), Kräutern und Gräsern (Estragon, Lemongras, Salbei, Thymian), Nadeln und Zweigen (Fichte, Tanne, Kiefer, Latschen), Harzen und Balsamen (Galbanum, Elemi, Benzoe, Myrrhe, Olibanum, Opoponax). Weiterhin kommen tierische Rohstoffe in Frage, wie beispielsweise Zibet und Castoreum. Typische synthetische Riechstoffverbindungen sind Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstofte.
Als Farbstoffe können die für kosmetische Zwecke geeigneten und zugelassenen Substanzen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der Publikation "Kosmetische Färbemittel" der Farbstoffkommission der Deutschen For schungsgemeinschaft, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, S.81-106 zusammengestellt sind. Diese Farbstoffe werden üblicherweise in Konzentrationen von 0,001 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Mischung, eingesetzt.
Der Gesamtanteil der Hilfs- und Zusatzstoffe kann 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 40 Gew.-% – bezogen auf die Mittel – betragen. Die Herstellung der Mittel kann durch übliche Kalt – oder Heißprozesse erfolgen; vorzugsweise arbeitet man nach der Phaseninversionstemperatur-Methode.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oxidationsfärbemittel zum Färben von Keratinfasern, enthaltend erfindungsgemäße Perhydrolasen, eine Wasserstoffperoxidquelle und Substrate für die Perhydrolasen. Als Keratinfasern sind dabei Wolle, Federn, Pelze und insbesondere menschliche Haare zu verstehen.
Die Substrate sind vorzugsweise ausgewählt unter Methyl-, Ethyl- oder Glycerinestern von Butter-, Capron- oder Octansäure, bevorzugt Buttersäuremethylester, Capronsäuremethylester, Octansäuremethylester, Trioctaninbesonders und besonders bevorzugt: Buttersäuremethylester.
Die Wasserstoffperoxid-Quelle ist insbesondere ausgewählt unter Natriumpercarbonat, Natriumperborat oder Kaliummonopersulfat-Tripelsalz, Salzmischungen von Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 3 (pH 5,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 1 (pH 7,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 3 zu 1 (>pH 9) und besonders bevorzugt H₂O₂.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Oxidationsmittel werden die Oxidationsfarbstoffvorprodukte sowie die Perhydrolasen in einen geeigneten wäßrigen Träger eingearbeitet. Solche Träger sind z. B. verdickte wäßrige Lösungen, Cremes (Emulsionen), Gele oder tensidhaltige schäumende Zubereitungen, z. B. Shampoos oder Schaumaerosole oder andere Zubereitungen, die für die Anwendung auf dem Haar geeignet sind.
Grundsätzlich sind auch wasserfreie Pulver als Träger geeignet; in diesem Falle werden die Oxidationsfärbemittel unmittelbar vor der Anwendung in Wasser gelöst oder dispergiert. Als Trägerkomponenten werden bevorzugt

– Netz- und Emulgiermittel
– Verdickungsmittel Reduktionsmittel (Antioxidantien)
– haarpflegende Zusätze
- Duftstoffe und
- Lösungsmittel wie z. B. Wasser, Glycole oder niedere Alkohole

Als Netz- und Emulgiermittel eignen sich z. B. anionische, zwitterionische, ampholytische und nichtionische Tenside. Auch kationische Tenside können zur Erzielung bestimmter Effekte eingesetzt werden.
Als Verdickungsmittel eignen sich die wasserlöslichen hochmolekularen Polysaccharid-Derivate oder Polypep-tide, z. B. Cellulose- oder Stärkeether, Gelatine, Pflanzengumme, Biopolymere (Xanthan-Gum) oder wasserlösliche synthetische Polymere wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyethylenoxide, Polyacrylamide, Polyurethane, Polyacrylate und andere.
Weiterhin kann man tensidhaltige Zubereitungen auch durch Solubilisierung oder Emulgierung von polaren Lipiden verdicken. Solche Lipide sind z. B. Fettalkohole mit 12-18 C-Atomen, (freie) Fettsäuren mit 12-18 C-Atomen, Fettsäurepartialglyceride, Sorbitanfettsäureester, Fettsäurealkanolamide, niedrig oxethylierte Fettsäuren oder Fettalkohole, Lecithine, Sterine. Schließlich kann man gelförmige Träger auch auf Basis wässriger Seifengele, z. B. von Ammonium-Oleat, erzeugen.
Reduktionsmittel (Antioxidantien), die dem Träger zugesetzt werden, um eine vorzeitige oxidative Entwicklung des Farbstoffs vor der Anwendung auf dem Haar zu verhindern, sind z. B. Natriumsulfit oder Natriumascorbat.
Haarpflegende Zusätze können z.B. Fette, Öle oder Wachse in emulgierter Form, strukturgebende Additive wie z. B. Glucose oder Pyridoxin, avivierende Komponenten wie z. B. wasserlösliche Proteine, Proteinabbauprodukte, Aminosäuren, wasserlösliche kationische Polymere, Silicone, Vitamine, Panthenol oder Pflanzenextrakte sein.
Schließlich können Duftstoffe und Lösungsmittel wie z. B. Glycole wie 1,2-Propylenglycole, Glycerin, Glycolether wie z. B. Butylglycol, Ethyldiglycol oder niedere einwertige Alkohole wie Ethanol oder Isopropanol enthalten sein.
Zusätzlich können noch weitere Hilfsmittel enthalten sein, die die Stabilität und Anwendungseigenschaften der Oxdationsfärbemittel verbessern, z. B. Komplexbildner wie EDTA, NTA oder Organophosphonate, Quell- und Penetrationsmittel wie z. B. Harnstoff, Guanidin, Hydrogencarbonate, Puffersalze wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumcitrat, Ammoniumsulfat oder Alkanolammoniumsalze und gegebenenfalls Treibgase.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflege, insbesondere Prothesenreiniger, enthaltend erfindungsgemäße Perhydrolasen sowie Wasserstoffquellen und Perhydrolasesubstrate zur Bleiche oder zur Desinfektion.
Die Substrate sind vorzugsweise ausgewählt unter Methyl-, Ethyl- oder Glycerinestern von Butter-, Capron- oder Octansäure, bevorzugt Buttersäuremethylester, Capronsäuremethylester, Octansäuremethylester, Trioctaninbesonders und besonders bevorzugt: Buttersäuremethylester.
Die Wasserstoffperoxid-Quelle ist insbesondere ausgewählt unter Natriumpercarbonat, Natriumperborat oder Kaliummonopersulfat-Tripelsalz, Salzmischungen von Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 3 (pH 5,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 1 (pH 7,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 3 zu 1 (>pH 9) und besonders bevorzugt H₂O₂.
Bei Teilprothesen bzw. Gebissen eignet sich sowohl die Darreichung als Gebissreinigungstabletten, als auch als Mundspülung bzw. Mundwasser oder als Zahnpasta.
Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel können beispielsweise als Mundwasser, Gel, flüssige Zahnputzlotion, steife Zahnpaste, Gebissreiniger oder Prothesenhaftcreme vorliegen.
Hierzu ist es erforderlich, die erfindungsgemäße Perhydrolasen in einen geeigneten Träger einzuarbeiten.
Als Träger können z.B. auch pulverförmige Zubereitungen oder wässrigalkoholische Lösungen dienen, die als Mundwässer 0 bis 15 Gew.-% Ethanol, 1 bis 1,5 Gew.-% Aromaöle und 0,01 bis 0,5 Gew.-% Süßstoffe oder als Mundwasser-Konzentrate 15 bis 60 Gew.-% Ethanol, 0,05 bis 5 Gew.-% Aromaöle, 0,1 bis 3 Gew.-% Süßstoffe sowie ggf. weitere Hilfsstoffe enthalten können und vor Gebrauch mit Wasser verdünnt werden. Die Konzentration der Komponenten muss dabei so hoch gewählt werden, dass nach Verdünnung die genannten Konzentrationsuntergrenzen bei der Anwendung nicht unterschritten werden.
Als Träger können aber auch Gele sowie mehr oder weniger fließfähige Pasten dienen, die aus flexiblen Kunststoffbehältern oder Tuben ausgedrückt und mit Hilfe einer Zahnbürste auf die Zähne aufgetragen werden. Solche Produkte enthalten höhere Mengen an Feuchthaltemitteln und Bindemitteln oder Konsistenzreglern und Polierkomponenten. Darüber hinaus sind auch in diesen Zubereitungen Aromaöle, Süßstoffe und Wasser enthalten.
Als Feuchthaltemittel können dabei z.B. Glycerin, Sorbit, Xylit, Propylenglykole, Polyethenylenglycole oder Gemische dieser Polyole, insbesondere solche Polyethenylenglycole mit Molekulargewichten von 200 bis 800 (von 400 – 2000 ) verwendet werden enthalten sein. Bevorzugt ist als Feuchthaltemittel Sorbit in einer Menge von 25 – 40 Gew.-% enthalten.
Als Antizahnstein-Wirkstoffe und als Demineralisierungs-Inhibitoren können kondensierten Phosphate in Form ihrer Alkalisalze, bevorzugt in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze enthalten sein. Die wäßrigen Lösungen dieser Phosphate reagieren aufgrund hydrolytischer Effekte alkalisch. Durch Säurezusatz wird der pH-Wert der erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel auf die bevorzugten Werte von 7,5 – 9 eingestellt.
Es können auch Gemische verschiedener kondensierter Phosphate oder auch hydratisierte Salze der kondensierten Phosphate eingesetzt werden. Die spezifizierten Mengen von 2 – 12 Gew.-% beziehen sich jedoch auf die wasserfreien Salze. Bevorzugt ist als kondensiertes Phosphat ein Natrium- oder Kaliumtripolyphosphat in einer Menge von 5 – 10 Gew.-% der Zusammensetzung enthalten.
Ein bevorzugt enthaltener Wirkstoff ist eine karieshemmende Fluorverbindung, bevorzugt aus der Gruppe der Fluoride oder Monofluorophosphate in einer Menge von 0,1 – 0,5 Gew.-% Fluor. Geeignete Fluorverbindungen sind z.B. Natriummonofluorophosphat (Na₂PO₃F), Kaliummonofluorophosphat, Natrium- oder Kaliumfluorid, Zinnfluorid oder das Fluorid einer organischen Aminoverbindung.
Als Bindemittel und Konsistenzregler dienen z.B. natürliche und synthetische wasserlösliche Polymere wie Carragheen, Traganth, Guar, Stärke und deren nichtionogene Derivate wie z.B. Hydroxypropylguar, Hydroxyethylstärke, Celluloseether wie z.B. Hydroxyethylcellulose oder Methylhydroxypropylcellulose. Auch Agar-Agar, Xanthan-Gum, Pektine, wasserlösliche Carboxyvinylpolymere (z.B. Carbopol^®-Typen), Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, höhermolekulare Polyethylenglykole (Molekulargewicht 10³ bis 10⁶ D). Weitere Stoffe, die sich zur Viskositätskontrolle eignen, sind Schichtsilikare wie z.B. Montmorillonit-Tone, kolloidale Verdickungskieselsäuren, z.B. Aerogel-Kieselsäure oder pyrogene Kieselsäuren.
Als Polierkomponenten können alle hierfür bekannten Poliermittel, bevorzugt aber Fällungs- und Gelkieselsäuren, Aluminiumhydroxid, Aluminiumsilicat, Aluminiumoxid, Aluminiumoxidtrihydrat, unlösliches Natriummetaphosphat, Calciumpyrophosphat, Calciumhydrogenphosphat, Dicalciumphosphat, Kreide, Hydroxylapatit, Hydrotalcite, Talkum, Magnesiumaluminiumsilicat (Veegum^®), Calciumsulfat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumoxid, Natriumaluminiumsilikate, z.B. Zeolith A oder organische Polymere, z.B. Polymethacrylat, eingesetzt werden. Die Poliermittel werden vorzugsweise in kleineren Mengen von z.B. 1 – 10 Gew.-% verwendet.
Die erfindungsgemäßen Zahn- und/oder Mundpflegeprodukte können durch Zugabe von Aromaölen und Süßungsmitteln in ihren organoleptischen Eigenschaften verbessert werden. Als Aromaöle kommen alle für Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel gebräuchlichen natürlichen und synthetischen Aromen in Frage. Natürliche Aromen können sowohl in Form der aus den Drogen isolierten etherischen Öle als auch der aus diesen isolierten Einzelkomponenten verwendet werden. Bevorzugt sollte wenigstens ein Aromaöl aus der Gruppe Pfefferminzöl, Krauseminzöl, Anisöl, Kümmelöl, Eukalyptusöl, Fenchelöl, Zimtöl, Geraniumöl, Salbeiöl, Thymianöl, Majoranöl, Basilikumöl, Citrusöl, Gaultheriaöl oder eine oder mehrere daraus isolierte synthetisch erzeugten Komponenten dieser Öle enthalten sein. Die wichtigsten Komponenten der genannten Öle sind z.B. Menthol, Carvon, Anethol, Cineol, Eugenol, Zimtaldehyd, Geraniol, Citronellol, Linalool, Salven, Thymol, Terpinen, Terpinol, Methylchavicol und Methylsalicylat. Weitere geeignete Aromen sind z.B. Menthylacetat, Vanillin, Jonone, Linalylacetat, Rhodinol und Piperiton. Als Süßungsmittel eignen sich entweder natürliche Zucker wie Sucrose, Maltose, Lactose und Fructose oder synthetische Süßstoffe wie z.B. Saccharin-Natriumsalz, Natriumcyclamat oder Aspartam.
Als Tenside sind dabei insbesondere Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycoside einsetzbar. Ihre Herstellung und Verwendung als oberflächenaktive Stoffe sind beispielsweise aus US-A-3 839 318 , US-A-3 707 535 , US-A-3 547 828 DE-A-19 43 689 , DE-A-20 36 472 und DE-A-30 01 064 sowie EP-A-77 167 bekannt. Bezüglich des Glycosidrestes gilt, daß sowohl Monoglycoside (x = 1), bei denen ein Pentose- oder Hexoserest glycosidisch an einen primären Alkohol mit 4 bis 16 C-Atomen gebunden ist, als auch oligomere Glycoside mit einem Oligomerisationsgrad x bis 10 geeignet sind. Der Oligomerisationsgrad ist dabei ein statistischer Mittelwert, dem eine für solche technischen Produkte übliche Homologenverteilung zugrunde liegt.
Bevorzugt eignet sich als Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycosid ein Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glucosid der Formel RO(C₆H₁₀O)_x-H, in der R eine Alkyl- und/oder Alkenyl-gruppe mit 8 bis 14 C-Atomen ist und x einen Mittelwert von 1 bis 4 hat. Besonders bevorzugt sind Alkyloligoglucoside auf Basis von gehärtetem C_12/14-Kokosalkohol mit einem DP von 1 bis 3. Das Alkyl- und/oder Alkenyl-glycosid-Tensid kann sehr sparsam verwendet werden, wobei bereits Mengen von 0,005 bis 1 Gew.-% ausreichend sind.
Außer den genannten Alkylglucosid-Tensiden können auch andere nichtionische, ampholytische und kationische Tenside enthalten sein, als da beispielsweise sind: Fettalkoholpolyglycolethersulfate, Monoglyceridsulfate, Monoglyceridethersulfate, Mono- und/oder Dialkylsulfosuccinate, Fettsäureisethionate, Fettsäuresarcosinate, Fettsäuretauride, Fettsäureglutamate, Ethercarbonsäuren, Fettsäureglucamide, Alkylamido-betaine und/oder Proteinfettsäurekondensate, letztere vorzugsweise auf Basis von Weizenproteinen. Insbesondere zur Solubilisierung der meist wasserunlöslichen Aromaöle kann ein nichtionogener Lösungsvermittler aus der Gruppe der oberflächenaktiven Verbindungen erforderlich sein. Besonders geeignet für diesen Zweck sind z.B. oxethylierte Fettsäureglyceride, oxethylierte Fettsäuresorbitanpartialester oder Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan-Oxethylaten. Lösungsvermittler aus der Gruppe der oxethylierten Fettsäureglyceride umfassen vor allem Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Mono- und Diglyceride von linearen Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen oder an Triglyceride von Hydroxyfettsäuren wie Oxystearinsäure oder Ricinolsäure. Weitere geeignete Lösungsvermittler sind oxethylierte Fettsäuresorbitanpartialester; das sind bevorzugt Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Sorbitanmonoester und Sorbitandiester von Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen. Ebenfalls geeignete Lösungsvermittler sind Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan-Oxethylaten; das sind bevorzugt Mono- und Diester von C₁ ₂-C₁ ₈-Fettsäuren und Anlagerungsprodukten von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an 1 Mol Glycerin oder an 1 Mol Sorbit.
Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel enthalten bevorzugt als Lösungsvermittler für gegebenenfalls enthaltene Aromaöle Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an gehärtetes oder ungehärtetes Rizinusöl (d.h. an Oxystearinsäure- oder Ricinolsäure-triglycerid), an Glyzerin-mono- und/oder -distearat oder an Sorbitanmono- und/oder -distearat.
Weitere übliche Zusätze für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege mittel sind z.B.

– Pigmente, z.B. Titandioxid, und/oder Farbstoffe
– pH-Stellmittel und Puffersubstanzen wie z.B. Natriumbicarbonat, Natriumcitrat, Natriumbenzoat, Zitronensäure, Phosphorsäure oder saure Salze, z.B. NaH₂PO₄
– wundheilende und entzündungshemmende Stolle wie z.B. Allantoin, Harnstoff, Panthenol, Azulen bzw. Kamillenextrakt
– weitere gegen Zahnstein wirksame Stoffe wie z.B. Organophosphonate, z.B. Hydroxyethandiphosphonate oder Azacycloheptandiphosphonat
– Konservierungsstoffe wie z.B. Sorbinsäure-Salze, p-Hydroxybenzoesäure-Ester.
– Plaque-Inhibitoren wie z.B. Hexachlorophen, Chlorhexidin, Hexetidin, Triclosan, Bromchlorophen, Phenylsalicylsäureester.

In einer besonderen Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine Mundspülung, ein Mundwasser, ein Prothesenreiniger oder ein Prothese haftmittel.
Für erfindungsgemäß bevorzugten Prothesenreiniger, insbesondere Prothesenreinigungstabletten und -pulver, eignen sich neben den schon genannten Inhaltsstoffen für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege zusätzlich noch Per-Verbindungen wie beispielsweise Peroxoborat, Peroxomonosulfat oder Percarbonat. Sie haben den Vorteil, dass sie neben der Bleichwirkung gleichzeitig auch desodorierend und/oder desinfizierend wirken. Der Einsatz solcher Per-Verbindungen in Prothesenreinigern beträgt zwischen 0,01 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,5 und 5 Gew.-%.
Als weitere Inhaltsstoffe sind auch Enzyme, wie z.B. Proteasen und Carbohydrase, zum Abbau von Proteinen und Kohlenhydraten geeignet. Der pH-Wert kann zwischen pH 4 und pH 12, insbesondere zwischen pH 5 und pH 11 liegen.
Für die Prothesenreinigungstabletten sind zusätzlich noch weitere Hilfsstoffe notwendig, wie beispielsweise Mittel, die einen sprudelnden Effekt hervorrufen, wie z.B. CO₂ freisetzende Stoffe wie Natriumhydrogencarbonat, Füllstoffe, z.B. Natriumsulfat oder Dextrose, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Fließregulierungsmittel, wie beispielsweise kolloidales Siliziumdioxid und Granuliermittel, wie die bereits erwähnten hochmolekularen Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon.
Prothesenhaftmittel können als Pulver, Cremes, Folien oder Flüssigkeiten angeboten werden und unterstützen die Haftung der Prothesen.
Als Wirkstoffe sind natürliche und synthetische Quellstoffe geeignet. Als natürliche Quellstoffe sind neben Alginaten auch Pflanzengummen, wie z.B. Gummi arabicum, Traganth und Karaya-Gummi sowie natürlicher Kautschuk aufzufassen. Insbesondere haben sich Alginate und synthetische Quellstofte, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, hochmolekulare Ethylenoxid-Copolymere, Salze der Poly(vinyl-ether-co-maleinsäure) und Polyacrylamide.
Als Hilfsstoffe für pastöse und flüssige Produkte eignen sich besonders hydrophobe Grundlagen, insbesondere Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Weißes Vaselin (DAB) oder Paraffinöl.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiel 1 : Expression der Protease Subtilisin Carlsberg aus Bacillus licheniformis DSM 641
Aus der chromosomalen DNA des Bacillus licheniformis Stammes DSM 461 wurde mit folgenden Primern via PCR der für die Protease Subtilisin Carlsberg kodierende Bereich incl. Promotorsegeunz amplifiziert nach folgendem PCR-Programm amplifiziert: Denaturierung 94 °C, 4 min, 30 Zyklen 94 °C, 30 s, 50 °C, 30 s, 72° C, 100 s und abschließend 72 °C, 7 min. Das PCR-Produkt wird nach beendeter Reaktion mittels Qiaquick PCR-Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und nach Restriktionsverdau in die Pstl-/Xmal-Site des Bacillus-Expressionsvektors pBC2 kloniert und via Protoplastentransformation in Bacillus subtilis DB104 transformiert.
PSC-s: CCCGGGACCTCTTTCCCTGCC
PSC-as: CTCGAGTATGTTATTGAGCGG
Das erhaltenen Amplikon wurde mit Aval geschnitten und in den ebenfalls mit Aval linearisierten Vektor pBC16 (siehe Anhang 1), ligiert (ergibt Vektor pBC-SC, siehe Anhang 2) und in Bacillus subtilis DB 104 nach einem Standard-Protoplastentransformations-Protokoll transformiert. Der Transformationsansatz wurde auf Tetracyclinhaltigen Agarplatten (1,5% Agar, 0,5% NaCl, 0,1% KHP₂O₄, 0,1% Hefeextrakt, 2% Pepton, pH10) mit 5 mM Tetracyclin 72h bei 37°C regeneriert und dann zur Selektion proteasebildender Transformanden auf einen milchpulverhaltige Agarplatte (1,5% Agar, 0,5% NaCl, 0,1% KHP₂O₄, 0,1 % Hefeextrakt, 2% Pepton, 1 % Milchpulver, pH 10) mit 5 mM Tetracyclin überstempelt.
Beispiel 2: Darstellung von Perhydrolasen via Error-prone Mutagenese aus Subtilisin Carlsberg.
Der 100 μl Ansatz für die Error-prone PCR enthält 10μl 10×Mutagenesepuffer (Taq-Puffer Fa. Gibco), 4μl dNTP-Mix Qe 200μmol/l Endkonzentration), 1 μl dGTP/dATP (je 1 mmol/l), 0,2 μmol jedes Primers (Sequenz siehe unten), 5-15 ng Template-DNA (Subtilisin Carlsberg), und 4 μl MgCl₂ (2 mmol/l), 0,7 μl MnCl2 (0,35 mmol/l) und eine entsprechende Menge H₂O. Anschliessend werden 5U Taq-Polymerase zugegeben und der Ansatz folgendem Temperaturprogramm unterzogen: Denaturierung 94 °C, 4 min, 30 Zyklen 94 °C, 30 s, 50 °C, 30 s, 72° C, 100 s und abschliessend 72 °C, 7 min. Das PCR-Produkt wird nach beendeter Reaktion mittels Qiaquick PCR-Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und nach Restriktionsverdau in die Nhel- / Xhol-Site des Bacillus-Expressionsvektors pBC-SC kloniert und via Protoplastentransformation in Bacillus subtilis DB104 transformiert.
Sequenzen der verwendeten Primer:
P300-s: GCGCTTAAGGAAGTCAAAAATGATCCG
P300-as: CTATTTGCTCGAGTATACTATTGAGCG
Beispiel 3: Expression der Perhydrolase in Bacillus subtilis DB104 und Screenen nach perhydrolytischer und hydrolytischer Aktivität.
Die in Beispiel 1 gewonnenen Mutanten werden in 1 ml TBY-Medium (10g/l Typton, 5g/l Hefeextrakt, 5g/l NaCl) mit 15μg/ml Tetracyclin 48h bei 37°C und 800rpm inkubiert. Der Kulturüberstand wird mittels Aftinitätschromatographie von den Medienbestandteilen abgetrennt und in den folgenden Tests eingesetzt.
Der Proteingehalt wird mittels des Micro-BCA-Protein Assay Reagent Kit (Fa. Pierce) bestimmt, wobei 150μl Kit-Reagenz mit 75μl Wasser und 75μl Kulturüberstand 2h bei 37°C inkubiert werden und aus der Adsorption bei 562nm der Proteingehalt berechnet wird.
Zur Bestimmung der hydrolytischen Aktivität werden 25μl des Kulturüberstandes mit 222,5μl 20mM Tris/HCl-Puffer pH 8,6 und 2,5μl 110mM suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (AAPF) in DMSO versetzt. Die Adsorptionszunahme bei 405nm wird über einen Zeitraum von 10 min verfolgt.
Zur Bestimmung der perhydrolytischen Aktivität werden 100μl des Kulturüberstandes mit 30μl 100mM Phosphatpufter pH9, 50μl 200mM Buttersäuremethylester (Fa. Aldrich), 20μl 313mM Wasserstoffperoxid versetzt und 15min bei 37°C inkubiert. Anschliessend werden 50μl 1,5M Essigsäure mit 0,03mg/ml Kaliumjodid sowie 50μl 0,14mM 2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)Diammoniumsalz (Sigma) hinzugegeben, weitere 10min bei Raumtemperatur inkubiert und die Adsorption bei 405nm gemessen.
Beispiel 4: Perhydrolytische und hydrolytischen Aktivität der gefundenen "Perhydrolasen"
Perhydrolase proteolytische Aktivität [U(AAPF)/μg] perhydrolytische Aktivtät [ppmAO/μl]
Sequenzen:

Claims

Perhydrolase, deren Aminosäuresequenz der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen trägt, die ausgewählt sind unter 11, 15, 21, 38, 50, 54, 58, 77, 83, 89, 93, 96, 107, 120, 134, 135, 136, 140, 147, 150, 154, 155, 160, 161, 171, 179, 180, 181, 194, 205, 208, 213, 216, 217, 238, 239, 251, 253, 257, 261.
Perhydrolase nach Anspruch 1, deren Aminosäuresequenz der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen trägt, die ausgewählt sind unter 11, 58, 77, 89, 96, 117 120, 134, 135, 136, 140, 147, 150, 161, 208, 216, 217, 238.
Perhydrolase nach Anspruch 1 oder 2, deren Aminosäuresequenz der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen trägt, die ausgewählt sind unter 58, 89, 96, 117, 216, 217.
Perhydrolase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, deren Aminosäuresequenz der in Seq. 23 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, jedoch Mutationen an den Sequenzpositionen trägt, die durch folgende Tabelle charakterisiert sind:
wobei in der ersten Spalte die Nummer der jeweiligen Sequenz, in der zweiten Spalte das Substitutionsmuster derart angegeben ist, daß der erste Buchstabe die eliminierte Aminosäure bezeichnet, die Zahl zwischen den beiden Buchstaben die Sequenzposition der Substitution angibt und der zweite Buchstabe die eingefügte Aminosäure bezeichnet.
Perhydrolase, deren Aminosäuresequenz mit einer der in den Seq. 1 bis 9, zu mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % übereinstimmt.
Für eine Perhydrolase kodierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz einen Teil enthält, der mit einer der in Seq. 10 bis 18 angegebenen Nukleotidsequenzen zu mindestens 60 %, mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % und ganz besonders bevorzugt zu 100 % identisch ist.
Perhydrolase, erhältlich durch ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäurenaustausch aus einer Perhydrolase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Perhydrolase, erhältlich durch Derivatisierung, Fragmentierung, Deletionsmutation oder Insertionsmutation einer Perhydrolase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Oligonukleotid, insbesondere PCR-Primer, mit einer der in Seq. 19 bis 22 angegebenen Sequenzen.
Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 9 zur Identifizierung und/oder Gewinnung einer neuen Perhydrolase.
Verwendung einer Perhydrolase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8, zur Fusion oder Verknüpfung mit einem anderen Protein, insbesondere zur Entwicklung eines neuen Enzyms.
Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 und 9 zur Fusion mit einer anderen Nukleinsäure, insbesondere zur Entwicklung eines neuen Enzyms.
Vektor, insbesondere Klonierungsvektor oder Expressionsvektor, der einen der in den Ansprüchen 6 und 9 bezeichneten Nukleinsäurebereiche enthält.
Wirtszelle, die eines der in den Ansprüchen 1 bis 5, 7 oder 8 bezeichneten Proteine oder Derivate exprimiert oder zu dessen Expression angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 13.
Wirtszelle gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, das das gebildete Protein oder Derivat ins umgebende Medium sezerniert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie der Gattung Bacillus, vorzugsweise der Species Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus angehört.
Wirtszelle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine eukaryontische Zelle ist, insbesondere eine, die das gebildete Protein posttranslational modifiziert.
Verwendung einer Perhydrolase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8, als Percarbonsäure in situ erzeugendes Agens, insbesondere zur Bleiche, zur Farbübertragungsinhibierung und zur Desinfektion.
Körperpflegemittel, Haarwaschmittel, Haarpflegemittel, Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflegemittel, Kosmetika, Waschmittel, Reinigungsmittel, Nachspülmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Desinfektionsmittel und Mittel zur bleichenden oder desinfizierenden Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, enthaltend eine Perhydrolase gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8.
Wasch-, oder Bleichmittel, enthaltend ein Bleichsystem, das in der Lage ist, unter Anwendungsbedingungen des Mittels Percarbonsäure zu erzeugen, und gegebenenfalls synthetisches Tensid, organischen und/oder anorganischen Builder sowie sonstige übliche Bleich- oder Waschmittelbestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß das Bleichsystem aus einer Perhydrolase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8, einer Wasserstoffperoxid-Quelle und einem Substrat für die Perhydrolase besteht.
Mittel nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ausgewählt ist unter Methyl-, Ethyl- oder Glycerinestern von Butter-, Capron- oder Octansäure, bevorzugt Buttersäuremethylester, Capronsäuremethylester, Octansäuremethylester, Trioctaninbesonders und besonders bevorzugt: Buttersäuremethylester.
Mittel nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserstoffperoxid-Quelle ausgewählt ist unter Natriumpercarbonat, Natriumperborat oder Kaliummonopersulfat-Tripelsalz, Salzmischungen von Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 3 (pH 5,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 1 zu 1 (pH 7,5); Percarbonat / Kaliumpersulfat im Verhältnis 3 zu 1 (>pH 9) und besonders bevorzugt H₂O₂.
Mittel nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine perhydrolytische Aktivität von 0,05 bis 5 ppmAO/μg vorzugsweise 0,2 bis 1,2 ppmAO/μg aufweist.
Mittel nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß es als Tab, Granulat oder als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, vorliegt.
Mittel nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines pastenförmigen oder flüssigen Waschmittels vorliegt.
Mittel nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines nicht-wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wäßrigen Paste vorliegt.
Mittel nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Perhydrolase und/oder das Substrat für dieses Enzym und/oder die Wasserstoffperoxid-Quelle mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym und/oder dessen Substrat undurchlässigen Substanz umhüllt ist, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym und/oder dessen Substrat wird.
Mittel nach einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zum Bleichsystem – 5 Gew.-% bis 70 Gew.-%, insbesondere 10 Gew.-% bis 50 Gew.-% Tensid, – 10 Gew.-% bis 65 Gew.-%, insbesondere 12 Gew.-% bis 60 Gew.-% wasserlösliches, wasserdispergierbares anorganisches Buildermaterial, – 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 2 Gew.-% bis 8 Gew.-%, wasserlösliche organische Buildersubstanzen, – nicht über 15 Gew.-% feste anorganische und/oder organische Säuren beziehungsweise saure Salze, – nicht über 5 Gew.-% Komplexbildner für Schwermetalle, – nicht über 5 Gew.-% Vergrauungsinhibitor, – nicht über 5 Gew.-% Farbübertragungsinhibitor und – nicht über 5 Gew.-% Schauminhibitor enthält.
Haarwasch- und/oder Haarpflegemittel, enthaltend Perhydrolasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8.
Oxidationsfärbemittel zum Färben von Keratinfasern, insbesondere von Haaren, enthaltend Perhydrolasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8.
Mittel zur Zahnprothesenpflege, insbesondere Prothesenreiniger, enthaltend Perhydrolasen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 8.