DD148780A5 - Verfahren zur herstellung von copolymeren aus olefinen und alpha,beta-ungesaettigten polycarbonsaeureanhydriden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung polymerer Verbindungen, die in der immunoregulierenden Behandlung der Tumor-Therapie brauchbar sind. Das Ziel und die Aufgabe der Erfindung bestanden darin, Verfahren zur Herstellung gewisser Copolymerer aus einem Olefinmonomeren mit von etwa 2 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen und einem alpa, beta-ungesaettigten Polycarbonsaeureanhydrid mit von 4 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen aufzufinden, die nichttoxische, zur immunoregulierenden Behandlung in der Tumor- Therapie brauchbare Produkte liefern. Diese Aufgabe wurde so geloest, dasz man ein Halbamid, halb-ammoniumsalz-Derivat des Copolymeren, in welchem das Copolymere ein Molekulargewicht im Bereich von etwa : 300 bis 1500 besitzt, zur weiteren Derivatbildung des Copolymeren mit Ammoniak umsetzt derart, dasz es sowohl (a) Halb-amid, halb-ammoniumsalz-Gruppen, und (b) Imid-Gruppen enthaelt, wobei die Imid-Gruppen von etwa 5 bis etwa 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen, und gegebenenfalls die Halb-ammoniumsalz-Gruppe in andere,pharmazeutisch vertraegliche Salzgruppen umwandelt.

Description

Diese Erfindung betrifft polymere Verbindungen, die in der immunoregulierenden Behandlung der Tumor-Therapie brauchbar sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Obwohl das Gebiet der Tumor-Therapie bisher Gegenstand von ausgedehnten Forschungen war, mirden bis jetzt sehr wenige Verbindungen gefunden, die für eine derartige Verwendung wirksam sind.

Bei einer Porschungsrichtung wurden Versuche mit dem Ziel durchgeführt, das Immunsystem des Körpers su raanipxilieren. Beispielsweise ist es ganz allgemein bekannt, dajß die Thymusdrüse für die Entwicklung und die Alterung der immunologischen Fähigkeit von großer Bedeutung ist. Die Thymusdrüse übt mittels verschiedenartiger Mechanismen, von denen angenommen wird, daß sie hauptsächlich hormonaler Art sind, eine steuernde Y/irkung auf die von T-Lymphosyten'vermittelte Immunfunktion aus. Es wurden so eine Reihe von natürlich vorkommenden und synthetisch hergestellten Peptiden als Stimulantien und/oder Suppressoren dieses Immunsysteins mit variierenden Ergebnissen untersucht.

Andere Mittel, von denen festgestellt wurde, daß sie eine unterstützende Immunaktivität aufweisen, schließen bei-

.\. 21854 0

spielBweise Bacillus Calmette-Guerin (BCQ), Corynebacterium parvum, Glucan, Levamisol und Tiloron, ein. Viele dieser Verbindungen erhöhen die Bildung von Antikörpern, wohingegen andere die durch die Zelle vermittelte Immunität entweder steigern oder inhibieren.

Ebenso wurden auch verschiedenartige biologisch aktive, synthetische Polyelektrolyte als brauchbare Antitumor-Mittel vorgeschlagen. So fanden Regelßon und Holland für das Natriumsais von Pölyäthylensulfonat ein breites Spektrum der Antitumor-Aktivität [Nature (London) l8l, kS (1958)3. Später wurde von einer An-sahl Carbonsäure-Folymeren mit im wesentlichen hohem Molekulargewicht, beispielsweise Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure und Äthylen-Maleinsfiureanhydrid-Copolymeres (EMA) feetgestellt, daß sie eine, das TuTBortfachstum hemmende Aktivität ähnlich derjenigen von NatriuBspolyäthylensulfonat aufweisen [Regelson et al.» Nature (London) 3J36, 778 bis 80 (I960); Regelson, ^RWater~ Soluble Poljfmers^j, in ^Polymer Science and 'Technology**, Vol. 2 (Herausgeber N.K. Bikales), Seiten I6i bis 177, Plenum Press, New York, 19733· Die antineoplastische Aktivität der Polymeren vom ΈΜΑ-Τνρ ist ferner in der cana&iechen Patentschrift 66^ 326 offenbart, weiche der US-Patentanmeldung Serial No. 758 023, eingereicht am 28. Oktober 3-958* jetst fallengelassen, entspricht. Ale brauchbares

-K-

Molekulargewicht rird für diese Polymeren ein Bereich zwischen 500 und 1,5 Millionen angegeben. Von einem dieser Polymeren, dem Halb-amid,halb-ammoniumsalz von EMA mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 mirde apäter berichtet, daß es bei Nagetieren und Hunden chronisch toxisch wirkt (Mihich et al., Fed. Proceedings, Vol. 19, No. 1, Teil 1, März I960). Eine chronische Toxizität wurde auch später von dem Polymeren mit dem Molekulargewicht von 2000 bis JOOO bei Hunden berichtet (Mihich et al-, Fed. Proceedings, Vol. 20, No. 1, Teil 1, "Mars I96I). Diese Tosisitätsbefunde sprachen gegen eine klinische Untersuchung der Polymeren.

Später seigte das verwandte 1:2-Divinyläther-M&leinsäu.reanhydrid-Copolymere bei durch das National Cancer Institute durchgeführten Vereuchen Antituiaor-Aktivität EBreslow, Pure and App).\ Ches., jjjS, 103 bis 113 (1976)]. Dieses Copolymere ist auch als Pyran-Copolymeres oder DIVEKiA bekannt, und eine wohlbekannte Probe wurde als NSC ^6015 beseichnet. Die Verwendung dieser Pyran-Copolymeren als Antitumor-Mittel ist auch in den US-Patentschriften 3 224 SkJ, und 3 79^ offenbart, in denen der Bereich von 5000 bis 30 000 als brauchbares Molekulargewicht beschrieben wurde. Die Antitumor-Aktivität des Pyran~Copolymeren tfurd© von einer Reihe von Autoren einer'Immunopotenzierung Oder einer Wirkung

1 85

auf die Immun-Reizbeantwortung durch das retikuloendotheliale System (RES) durch Steigerung der Makrophagen-Funktion zugeschrieben [vgl. beispielsweise Breslow, Pure and Appl. Chem., M, 103 bis 113 (1976); Mohr et al., Prog. Cancer Res. Tber., χ, 4l5 bis $26 (1978) j Schultz et al., id., ]_, $59 bis 467 (1978); und Dean et al., Cancer Treatment Reports, ί>2, September 1978].

Ziel der Erfindung

Ungeachtet der früher berichteten, chronischen Toxisität von verschiedenen Polymeren mit höherem Molekulargewicht vom EMA-Typ wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Untersuchungen durchgeführt, um die Polymeren dieses allgemeinen Typs weiterhin hinsichtlich ihrer immunoregulieren- den Aktivität su bewerten« Neue Annäherungen und neue Verfahren der Bewertung wurden eingeführt, welche die Erkenntnis der immunoregulierenden Aktivität ohne begleitende Cytotoxisität ermöglichten. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß gewisse dieser in neuerer Zeit bewerteten Verbindungen keine direkte eytotoxische Aktivität besitzen, jedoch wurde überraschenderweise und unerwarteterweise gefunden, daß ßie sehr wirksam gegen Tumor-Metastasen und Tumor-Residive nach Exsision oder Entfernung eines voluminösen Tumors sind. Demzufolge sind diese Verbindungen als besonders brauchbar in der Tumor-Therapie durch einen immunologischen Mechanismus indiziert. Sie aind brauchbar zur Verhinderung eines

Tumor-Rezidivs oder einer Entwicklung von Metastasen, indem man sie nach der Exzision oder der Entfernung eines voluminösen I¹UHiOrS durch den Chirurgen, nach Röntgenbestrahlung oder cytotoxiseher Chemotherapie verabreicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine neue Gruppe von Verbindungen des oben erwähnten allgemeinen EMA-Typs synthetisiert, die gegen Tumor-Metastasen und Tuiaor-Residive bei Säugetieren wirksam sind, obwohl ihnen eine starke primäre Antitumor-Aktivität fehlt. Diese Verbindungen sind Copolymere aus Olefinmonomeren mit von 2 bis etwa 4 Kohlenstoffatomen und α,β-ungesättigten Polycarbonsäureanhydriden mit von 4 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von etwa 300 bis etwa 1500, und zwar solche Derivate, daß sie sowohl eine Halb-amidjhalb-carboxylatsalz-Funktion und eine Imid-Punktion enthalten, und worin diese Imid-Punktion von etwa 5 bis etwa· ^O % der derivatißierten Punktion umfaßt. Erläuternde Beispiele für derartige Olefinmonomeren sind Kthylen. Propylen und Isobutylen; erläuternde Beispiele für derartige Polycarbonsäureanhydride sind Maleinsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid und Aconitsäureanhydrid. Von diesen monomeren Komponenten werden Äthylen und Maleinsäureanhydrid bevorzugt.

185

Das bevorzugte Copolymere aus Ethylen und Maleinsäureanhydrid in geeigneter Derivat-Form kann zum Zwecke einer näheren Erläuterung, jedoch keinesfalls einer Einschränkung, durch die nachfolgenden Struktureinheiten oder -gruppen gekennzeichnet werden: (a) Halb-amidjhalb-carboxylatsalE

-—CH₀—C-- CH—

²²I I

O=C C«0 NX«, 0~Y*

und (b) Imid

-CH₀—CH₀-CH-CH

²²Ii

worin I ©in Wasserstoffatom oder ein Alkylrest ait 1 bis %

Kohlenstoffatomen, und vorzugsweise ein Wasserstoffatom

Y ein Wasserstoff atom j, Ammonium oder ein pharaaseutisch verträgliches Metallkation, und vorsugsvieise Ammonium bedeutet, und

Z ein Wasserstoffatom, Älkyl mit 1 bis M Kohlenstoffato-

- κ- .218540

©en, Ammonium oder ein pharmazeutisch verträgliches Metallkation, und vorzugsweise ein Wasserstoffatom ist.

Di® Einheiten oder Gruppen (a) bzw. (b) sind entlang eines im wesentlichen linearen, ununterbrochenen Kohlenstoffatommoleküls verteilt. Von ettsa 5 % bis etwa ^O % dieser Einheiten sollten Imid-Einheiten, und der Rest hauptsächlich Halb-amid^halb-carboxylatealE-Einhaiten sein. Diese Einheiten können statistisch innerhalb der Kette und/oder statistisch innerhalb des Polymeren angeordnet sein. Es ist zn ersehen, daß ein kleiner Teil (von dem angenommen wird_s daß er kleiner als 10 % ist) von Monoammoniumcarboxyl- oder einer anderen pharmaseutiBch verträglichen Salsgruppe und/ oder Dicarboxy!gruppe ebenfallß vorhanden sein kann, der aus während der Herstellung dieser Verbindungen teilweise umgesetztem oder niehtumgeßetstern Anhydrid herrühren kann.

Von den vorstehenden derivatisierten Gruppen ist die (a) Halb-aiaidjhalb-carboxylatsals-Gruppe vorzugsweise HaIbamid_shalb-amKion5.umsala_s und die (b) Imid-Gruppe vorsugsweise nichtsubstituiertes Imide

Zum Zwecke der Erläuterung und ohne daß dies als Einschränkung anzusehen ist, kann wiederum das. bevorzugte Copolymere aus Xthylen und Maleinsäureanhydrid in seiner Vorzugspreisen

218540

Derivat-Form durch die nachfolgenden Struktureinheiten oder -gruppen wiedergegeben werden: (a) Halb-amid,halb-annaoniuiasalz

CH_O· H - C"

²²II

O*C CsO

NH 0"NHt

und (b) nichtsubstituiertes Imid

ΪΗ,—CH₀—CH—CH-l·

²²Ii

Wie oben sind die Einheiten oder Gruppen (a) bsw. (b) entlang eines im wesentlichen linearen, ununterbrochenen Kohlenstoff atom-Moleküls verteilt. Von etwa 5 % his etwa HO % dieser Einheiten sind vorzugsweise niehtsubstituiertes Imid, während der Rest hauptsächlich aus den bevorsug-' ten Halb-imidjhalb-aismoniumsals-Einheiten besteht. Diese Einheiten können statistisch innerhalb der Kette, oder statistisch innerhalb des Polymeren angeordnet sein. Eb ist EU ersehen, daß ein kleiner Teil (von dem angenommen wird, daß er weniger als 10 % beträgt) an Monoammoniumcarbosyl-

- te·-

oder Dic&rboxylgruppen zugegen sein kann, der sich aus während der Herstellung dieser Verbindungen teilweise umgeßetstem oder nichtumgesetstem Anhydrid ableitet.

Die polymeren, ionaunoregulierenden Mittel der vorliegenden Erfindung sind bevorsugtertreise wasserlöslich.

Die Erfindung wird ferner durch die-anliegenden Zeichnungen erläutert _s in welchen

Figur 1 den charakteristischen Bereich des Infrarot-Abscrptionsspektrums eines repräsentativen Polymeren dieser Erfindung seigt, das so derivatisiert ißt» daß es 20 % Imiö. enthält (vgl» das weiter unten stehende Beispiel 3_t Tabelle IV, Versuch 5).

Figur 2 seigt für Vergleiehßgviecke den charakteristioohen Bereich des Infrarot-Absorptionsspektrums eines entoprechenden PoljTneren, das 0 % Imid enthält [vgl» das weiter unten folgende Beispiel 2(a5J.

Figur 3 seigt für Vergleichsswecke den charakteristischen Bereich des Infrarot-Absorptionsspektrums eines entsprechenden Polymeren, das so derivatisiert ist, daß es 100 % Imid enthält (vgl. das weiter unten stehende Beispiel 5)·

to

-« - 21854 0

Obwohl die cana6ieche Patentschrift 664 326 die Verwendung des Halb-anddjhalb-affimoniiunsalses von Copolymeren des EMA-Typa, oder die Verwendung von Imiden, oder partiell imidisierten Derivaten von Copolymeren des EMA-Typs im Hinblick auf ihre antineoplastische Aktivität offenbart, wird angenommen, daß die spezifischen Polymeren der vorliegenden Erfindung, welche die Kombination von sowohl

(a) der Halb-amid,halb-carbos:ylatsals-Punktion, als auch

(b) der Imid-Funktion

in den hier definierten Verhältnissen aufweisen» und ein relativ niedriges durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von etwa 300 bis etwa 1500 besitzen, neu sind. Diese neuen Polymeren haben überraschenderweise brauchbare, immunoregulierende Eigenschaften, die von uen entsprechenden Polymeren, die nur die (a)- oder die (b)-Punktion besit-aen, odsr ein im wesentlichen höheres Molekulargewicht aufweisen, nicht geseigt werden. Vergleichsweise wurde auch von öen entsprechenden monomeren Bruchstücken dieser Polymeren, nämlich von Succinimid und Succinamidsäure (mit Ammoniak behandeltes Bernsteinsäureanhydrid) früher nicht erwähnt, daß dies© Verbindungen irgendeine signifikante, tuBiorinhibierend.® Wirksamkeit besitgen [Regelson et al., Nature (London), 106, 7?8 bis 780 (i960)].

Die nichtderi¥atisiert-en Copolyiaeren laifc niedrigem Moleku-

- /13. ·

2185 4 0

largewicht, die zur Herstellung der gewünschten immunoregulierenden Mittel der Torliegenden Erfindung eingesetzt werden, können nach wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden, wie sie beispielsweise in den US-Patentschriften 2 857 3β5> 2 913 437, 2 938 Οΐβ und 2 98Ο 653 beschrieben wurden. Typischerweise wird das Olefin, beispielsweise Äthylen, mit dem Polycarbonsäureanhydrid, beispielsweise mit Maleinsäureanhydrid, bei Temperaturen im Bereich von ettca 4O⁰C bis etwa iOO°C in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Katalysators und eines flüssigen Lösungsmittels, das ein Lösungsmittel für die Reaktionsteilnehmer und ein Nichtlösungsmittel für das gebildete Copolymere ist, umgesetzt. Die Polymerisation fördernde, freie Radikale bildende Katalysatoren vom herkömmlichen Peroxid-Typ und Azo-Typ- Bind für diesen Zweck hervorragend geeignet, und es wird beispielsweise Bensoylperoxid bevorsugt. Inerte Lösungsmittel, wie Benzol, Halogenbensole und Halogenparaffine sind brauchbare Lösungsmittel für die Polymerisationsrealction. Jedoch ist ein alkylierter aromatischer Kohlenwasserstoff, der Euraindest einen ex-Wasserstoff besitzt, vie beispielsweise Äthylbenzol, Isopropy!benzol, Diisopropylbenssol, Toluol oder XyIoI₅ ein bevorzugtes flüssiges Medium für die Polymerisationsreaktion, um das Molekulargewicht des Copolyxnerproduktes herabssusetsen, wie dies in der US-Patentschrift 2 92.3 ^37 beschrieben wurae« .

w- 21854 0

Äthylbenzol wird als flüssiges Medium für den letztgenannten Zweck besonders bevorzugt. Das Copolymere enthält bevor-Eugterweise im wesentlichen äquimolare Mengen an Olefinrest und Anhydrid-Rest, wie es durch Einsatz von etwa fiquimolaren Mengen der reagierenden Monomeren erhalten wird. Das entstehende Copolymer-Produkt wird in fester Form erhalten und leicht durch Filtration, Zentrifugieren und dergleichen Trennverfahren gewonnen.

Es ißt ersichtlich, daß der freiradikalische Initiator, und ewar sowohl durch Initiierung der Polymerisationsreaktion, als auch durch anschließende AbBättigung der Endgruppen oder Telomerisation mit dem alkylierten aromatischen Kohlenwasserstoff-Flüssigmedium die Einführung von verschiedenen organischen Anteilen in die polymere Struktur bewirken wird. Der Prosentgehalt dieser Anteile in der gesamten Polymer-Zubereitung wird ansteigen, wenn sich das Molekulargewicht des Polymeren erniedrigte Beispielsweise wird die Verwendung von Bensoylperosid als freiradikali-Bcher Initiator und Äthylbensol als flüssiges Reaktionsmedium diö Einführung ihrer entsprechenden aromatischen Anteile in die polymere Struktur bewirken» Diese Anteile werden einen höheren Prozentsatz der Qesamtstruktur der Polymeren mit einem Molekulargewicht von etwa 3.00, als bei den Polymeren mit einem Molekulargewicht von etwa 15OO ausmachen.

- 2 18 5

Es ist ferner zu erkennen, daß bei der Herstellung dieser Copolymeren mit niedrigem Molekulargewicht eine gewisse Menge eines Vernetsungsmitteis in das Copolymere inkorporiert «erden kann, um das Produkt hierdurch wasserunlöslich au machen. Beispiele derartiger Veroetsungsmittel sind Vinyl- und Allylester, insbesondere die Acrylate und Crotonate, wie sie in der DS-PatentBchrift 3 165 *S86 beschrieben werden. Die Copolymeren können auch nach ihrer Derivatis5^erung auf verschiedene Weise unlöslich gemacht werden, wie beispielsweise durch Vernetzung mit Diamin, wie dies in der US-Patentschrift 5 55¹* 985 beschrieben de, oder durch Aufbringen auf Träger, ή±& Bentonit, Latexteilchen, oder Erythrozyten.

Es ißt bekannt» daß Amid-Derivate der Copolymeren vom EMA-Typ durch Uiasetsen des Copolyraeren mit AmmoniakgaB bei gewöhnlichen oder erhöhten Temperaturen hergestellt werden können, wie dies in der canadischen Patentschrift 66^ 326 und in den US-Patentschriften 2 883 28? und 3 157 595 beschrieben wurde. Es ist ferner bekannt, daß die Reaktion bei höheren Temperaturen dasu führt, die Imidbildung su fördern, während eine Reaktion in inerten organischen flüs sigen Lößungsmittelsedien, wie beispielsweise in Bensol, dasu verwendet werden kann, die Reaktionstemperatur su steuern und die Imidbildung su ^ersögern_e Ein anderes be-

218540

kanntes Verfahren but Amidbildung umfaßt die Reaktion des Polymeren in flüssigem Ammoniak bei -33°C.

Während die vorerwähnten Verfahren gans allgemein jeut Herstellung des Halb-aMd,halb-ammoniumsals5e8 als Zwischenstufe zur Herstellung der Imid-enthaltenden Derivate brauchbar sind, sind sie wegen eines Zeit-Diffusionseffekts des Ammoniaks in den inneren Kern der EMA-Teilehen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unzulänglich, wie dies in dem nachstehenden Beispiel 2 beschrieben wird. Ein bevor-EUgtes Verfahren für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfaßt zunächst das Auflösen des Copolymeren vom EMA-Typ in Aceton, und anschließend die Reaktion des aufgelösten Polymeren mit flüssigem Ammoniak in Aceton* Das gewünschte Halb~aisd.d,halb-aHHnoniuaisalS"Produkt fällt aus der Lösung aus und kann dann leicht durch Filtration, Zentrifugieren und dergleichen Abtrennverfahren, wie sie weiter unten in Beispiel 2„ Teilen a, b und c, erlSutert eind» gewonnen werden» Fig. 2 der anliegenden Zeichnungen sseigt das Infrarot-Spektrum des Halb-amid_yhalb-amiBoniumsals-Produkts des ermähnten Beispiels 2(a)_s welches 0 % Imid enthält.

Die Herstellung des gewünschten_s Imid-enthaltenden Derivates kann bewirkt werden* indem man das Z^isühenprodukt HaIbarnid,halb-ammoniumsals mit Ammoniak unter weiterer Deriva-

tlslerung des Copolymeren derart uiasetst, daß es sowohl

(a) Halb-aiaid,halb-aimnoniumsals-Qruppen und

(b) Imid-Gruppen

enthält, wobei die Imid-Gruppen von etwa 5 bis et^a ftO Gewichtsprosent der derivatisierten Gruppen umfassen, und indem man gegebenenfalls die Halb-ammonlumsalsi-Gruppe in andere ph&rmaEeutisch verträgliche Salsgruppen umwandelt. Die Reaktion wira in geeigneten organischen Lösungsmittelmedien, td.e beispielsweise in Toluol oder Xylol, bei Rück« flußtemperaturen durchgeführt, bis der gewünschte Prosentgehalt an Imid-Derivaten gebildet ist, ^ie dies in den weiter unten stehenden Beispielen 3 und k erläutert wird. Die Rückflußteraper&turen können von et^*a 50⁰C bis etwa 2G0°C, vorsugsweise von etwa 60°C bis etwa 150⁰C, und besonders bevorzugt von 100⁰C bis 150⁰C variieren.

Fig. 1 der anliegenden Zeichnungen seigt das Infrarot-Spektrum eines repräsentativen Beispiels (Beispiel 3» Tabel le IV_t Versuch 5) des geiiünschten Polymeren, das so derivatisiert worden ist, daß es sowohl die

(a) Halb-amid^halb-airanoniuiasalE-PunVction, und

(b) die Imid-Funktion

enthält, und in welchem das Imid.20 $ der derivatisierten Gruppen ausmacht. Das Polymere dieses Beispiels hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 85O, und der

-»-' . 218540

Wert von 20 % Imid liegt innerhalb des bevorzugten Bereiches von etwa IO % biß etwa 25 % Imid.

Für Vergleichszwecke wurde auch, wie dies in dem nachfolgenden Beispiel 5 erläutert wird, ein Imid-Derivat des EMA-Copolymeren mit 100 % Imid hergestellt. Fig. 3 der Zeichnungen zeigt das Infrarot-Spektrum dieses Polymeren.

Eine detaillierte Beschreibung der Infrarot-Analyse zur Identifikation der verschiedenen, vorerwähnten funktioneilen Gruppen, wie sie in den Pig. I bis 3 erläutert werden, wird im Anschluß an Beispiel i weiter unten gegeben.

Um die Wirksamkeit der Polymeren der vorliegenden Erfindung für die iamunoregulierende Behandlung der Tumor-Therapie su seigen, wurden repräsentative Beispiele der Polymeren verschiedenen Untersuchungen wie folgt unterworfen:

In einsr Versuchsreihe wurden die Polymeren in einem Virusindusierten, niehtmetastatischen Maustumor-Modell untersucht. Das angewandte Modell war das SV-40-Virus-induzierte Fibrosarkom (mKSA)von syngenetischer BALB/c-Maus-Herkunft.

Dieser Mäusetumorj, mKSA-TU5, wurde durch Kit et al.» Int.

-S- 21 8540

J. Cancer, ^, 384 bis 392 (1969) produziert, und es ist von ihm nicht bekannt, daß er in syngenetischen BALB/c-Mäusen regrediert. In diesen Versuchsreihen standen die beobachteten Tumorregressionen in Beziehung zur Immunoßtimulation und Reduktion der Tumorbelastung in Übereinstimmung mit Dean et al., Int. J. Cancer, _16, 465 bis (1975)» der zeigte, daß mKSA Tumor-assoziierte Antigene besitzt, und daß bei Tieren, die an einem kleinen Tumor leiden, eine gute wechselseitige Beziehung mit einer sellvermittelten Immunität besteht. Die Mäuse wurden mit drei verschiedenen Dosen der zu untersuchenden Verbindung entweder vor oder nach oder sowohl vor und nach der Reissbehandlung mit lebensfähigen Tumorsellen bei einer TD₁₀Q und TD _cr. behandelt. Das Wachstum der Tumoren wurde dann bei den behandelten Tieren gegenüber normalen, nicht behandelten KontrollmäuBen abgeschätzt. Bei diesen Versuchsreihen zeigten Polymere der vorliegenden Erfindung mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etva 85O eine wesentlich größere Tumorregreesionsaktivität, als die enteprechenden Polymeren rait- einem Molekulargewicht von 2000 bis 3000 und einem Molekulargewicht von 20 000 bis 50 000«

In einer anderen Versuchsreihe wurden repräsentative Polymere der vorliegenden Erfindung in ein^m chemisch-inöusier ten, Eietastasierenden Ratten-Tumonaoäell untersucht. Das

-«- 21854 0

angewandte Modell war ein durch 3-Methylcholanthren indusierter Blasenkrebs (BLCA) bei Fischer~3¹*M-Ratten tPrehn R.T. et al., J. Nat. Can. Inst., 18, 769 (1957) und FaIk R. et al., Surgery, Oktober (1978)]. Von den Tumorzellen, die eine Passage in Zellkultur ^ron über fünf Jahren hinter eich hatten, ^ar es bekannt, daß sie nach subcutaner (SC) Implantation die Lungen innerhalb einer Woche nach der Implantation metastasieren. Die Übliche überlebenszeit nach der subeutanen Tumor-Implantation beträgt drei Wochen oder weniger.

In einem Teil dieser Versuche in dem metastasierenden Ratten-Tumormodell wurde das eu untersuchende Polymere periodisch in etwa Wocheninterrallen während drei Wochen im Anschluß an die Tumor-Iaplantation verabreicht. Diese behandelten Tiere hatten eine Überlebensrate von mehr als das Dreifache derjenigen der unbehandelten Kontrolltiere und es irarde kein metastatiaches Wachstum während der sechswöchigen Beobaehtungsdauer notiex^t.

In einem anderen Teil dieser Versuche in dem metastasierenden Ratten-Tumorinodell Kurde das au untersuchende Polymere als Hilfsmittel sur Tumorexsision an den Tagen 7 bis 10 nach der Tumorübertragung verabreicht. Die behandelten Tiere wurden auf ein Tuiaor-Residiv nach Essision gegenüber

unbehandelten Kontrolltieren beobachtet. Bei den Kontrolltieren war ©in Wiederauftreten von Tumor innerhalb von sechs Wochen nach der Resektion zu 100 % mit einer Durch-BchnittBseit von 32 Tagen su beobachten, wohingegen bei den mit den bevorsugten Polymeren dieser Erfindung in einer Menge von JO mg/kg behandelten Tieren während der ersten sechs Wochen keine Rezidive auftraten und nach 10 Wochen ein Tumor-Residiv bei nur 13 % der Tiere beobachtet wurde.

In wieder einer anderen Versuchsreihe mirden repräsentative Polymere der vorliegenden Erfindung bei Ratten vom normalen Lewis-Stamm untersucht, und es wurde gefunden, daß sie die Ißmun-Reisbeantwortung stimulieren, vris dies durch einen Anstieg der Antikörperbiläung geseigt

Wiederum andere Untersuchungen bei normalen Ratten vom Lewis-Stamm zeigten ein© B-Zellen-Aktivierung durch repräßentatiys Polymere der vorliegenden Erfindung ohne die Gegenwart von T-Zellen, und demgemäß die Verwendung dieser Polymeren als Thyrauafunktionsersatg,, T-Zellen sind von der Thymusdrüse abstammende Lymphozyten, wohingegen B-Zellen Lymphossyten sind, öle sich In dem Schleimbeuteläquivalent oder Knocheroaark dlfferensleren.

Eins weitere Untersuchung bei Ratten vom normalen Lewis-

21854 0

Staaim auf eine Erhöhung der peritonealen Makrophagen und die Aktivität von Latex-Phagosytose der Makrophagen hat geseigt, daß die immunoregulierende Wirkung dieser Polymeren auf die B-Zellen-Aktivität nicht durch Stimulation der Makrophagen-Aktivität bewirkt wird. Die Polymeren die-Bör Erfindung scheinen daher anders ale die verwandten Pyran-Copolymeren des Standes der Technik eu.wirken, welche durch das RES mittels Erhöhung der Makrophagen-Funktion wirksam werden.

Eine detaillierte Beschreibung der vorerwähnten und anderer derartiger Untersuchungen und die entsprechenden Ergebnisse sind in den nachfolgenden Beispielen 8 bis 23 niedergelegt«,

Ganz allgemein können die Polymeren der vorliegenden Erfindung einem Wirt in einer wirksamen iiamunoregulierende-n Menge als Hilfsmittel ssur Tumor-Chemotherapie „ Timor-Bestrahlungstherapie und/oder Tumorexsieien verabreicht werden. Derartige Hilfeiaittel in der Handhabung der Tumor—Therapie können zu etwa der gleichen Zeit wie die Therapie verabreicht werden, oder innerhalb einer geeigneten Zeit vor oder nach einer darartigen Therapie. Gewöhnlich wird eine derartige Verabreichung innerhalb eines Zeitraums von gwei Tagen unmittelbar vor und eines Monats-Zeitrauas unmittel-

bar nach einer derartigen Therapie erfolgen. Untersuchungen geigen, daß eine Klärung eines bevorzugten, wasserlöslichen Polymeren dieser Erfindung in ©twa 30 bis 60 Tagen erfolgt und demsufolge ist es su erwarten, daß eine Verabreichung von Booster-Dosen des Polymeren etwa alle sechs Wochen ermöglicht werden kann«

Die Polymeren können sowohl parenteral als auch oral in Kengen in beispielsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 Eg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. Sie können Eotiobl intravenös eis auch intraperitoneal, vorzugsweise in wässeriger Lösung, wie als sterile Wasser- oder als Kochsalzlösung verabreicht werden. Auf dem oralen Wege können sie in Form von Tabletten, Pulvern, Kapseln, Elixieren und dergleichen Dosierungsformen in Mischung mit üblichen festen und flüssigen Verbindungßmitteln, Trögern, Suspendiermittel und Adjuvantien, wie beispielsweise mit Maisßtärke, Lactose, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Gelatine, Gummi arabicum und Robinia pseudacacia-Bohnengummiß,Alkohol, Wasser, Dimethylsulfoxid (DMSO), Pflansenöle und dergleichen Materialien, dargeboten werden. Die orale Dosierungsform ist vorzugsweise in einer geeigneten flüssigen Mischung sum Zeitpunkt der Verabreichung in fester Form wiederaufgebaut, um die Stabilität der zwei Gruppierungen aus (a) Halb-amidjhalb-carboxylatsals und (b) Imid

5,3

-» - 218540

auf dem gewonnenen Produkt.

A u s f ü h r u η g 8 b e i β ρ i e 1 e Beispiel 1 Herstellung von EMA

Das gewünschte Rohmaterial Sthylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere (EMA) mirde in einem heizbaren Reaktor aus rostfreiea Stahl mit einem Passungsvermögen von 1 gallon (3,79 D hergestellt, der mit einer innenliegenden Kühlschlange für Wasser, einem magnetisch angetriebenen Rührer, der optimalenteise bei 1000 bis 1200 UpM betrieben mxrde, einem Xthylen-Euführstutsen und eines Stutsen, durch welchen zusätzlicher Katalysator in Lösung in das Xthylen eingepreßt werden konnte, versehen war. Proben oder der fertiggestellte Inhalt konnten durch einen Stutsen am Boden abgesogen werden r Hilfsvorrichtungen Eur Heis- und Kühlkontrolle waren vorgesehen. In einem typischen Versuch bestand die in den Reaktor eingebrachte Charge aus 1625 g (I875 ml) Xthylben--EOl, 190 g (1,9*1 Mol) Maleinsäureanhydrid und 14,1 g (0,058 Hol) Benhoylpercxid, gelöst in 80 g (92 ml) Xthylbensol. Das Katalysatorgefäß wirde nach Zugabe des Katalysators in den Reaktor mit einer zusätzlichen Mange von 20,0 ml Xthylbenzol gespült. Der Reaktor ^rurde geschlossen und sweimal Xthylen bei Raumtemperatur aufgepreßt und mieder entspannt, um die Luft in dem System zxx verdrängen.

185

aufrechtzuerhalten. Andere geeignet© Dosierungen der Polymeren zur Bewirkung eines ge^fünschten, iiamunoreguli er enden Effekts können unter Bezugnahme auf die nachfolgenden spezifischen Beispiele bestimmt werden. Eine bevorzugte Dosierungsfonn der Verabreichung des Polymeren ist die in physiologischer Kochsalslösung.

Zusammenfassend betrifft die vorliegende Erfindung Copolymere aus Olefinmonomeren mit von 2 bis etwa H Kohlenstoffatomen und a,3-ungesättigten Polyearboneäureanhydriden mit von k bis etwa β Kohlenstoffatomen, die ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von etwa JOO bis etwa I5OO aufweisen, und so derivatisiert sind, daß sie sowohl eine Halb-amid,halb-carboxylat8als-Punktion und eine Imid-Punktion besitzen, wobei die Imid-Funktion von etwa 5 % bis etwa *ίθ % der derivatisierten Funktion umfaßt» Diese Copolymeren sind brauchbar für die Handhabung der Tumor-Therapie £ur Verhinderung von Tumor-Residiven oder der Entwicklung von Metastasen durch einen immunorfegulierenden Mechanismus.

Die nachfolgenden detaillierten Beispiel© dienen sur weite ren Erläuterung der Erfindung, sollen diese jedoch keinesfalls beschränken» In allen Beispielen ist die prozentuale Ausbeute die prosentuale theoretische Ausbeute, basierend

Danach isurde die Temperatur auf 70°C gebracht und bei dieeer Temperatur während der Gesamtdauer der Polymerisation bei einem Xthylenbeschiekungsdruek von 200 psi (i4 kg/cm ) gehalten. Nach dreistündiger Dauer der Polymerisation bei 70⁰C und 200 psi (14 kg/cm²) Xthylendruek erfolgte eine Zugab© γόη 9«^ g (0,039 Mol) Bensoylperoxid in 60 g (70 ml) Xthylbensol durch (Sie Katalysator-Zuführungsleitung _p gefolgt von einer Spülung dieses Eingangsstutsens mit 20 ml Ethylbenzol. Das Rühren und Erhitzen auf 70⁰C bei 2Ö0 psi (1*1 kg/cm) Xthylenbegehickung wurde dann susätzliche 14 Stunden lang fortgesetzt _f um die Polymerisation su vervollständigen. Am Ende des Versuches wurde der Reaktor abgekühlt und entspannt. Der Inhalt bestand auE einer Aufschlämmung des als Produkt erhaltenen Ithylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymören (EKA) in Äthylbenzol und einer klei~ nen Menge an EMA-Produkt als glasartigem öbersug auf dem Rührer, der Kühlschlange und den Reaktoroberflächen. Diese Aufschlämiaung wurde filtriert, danach mit aera glasigen Material, das durch Abkratzen entfernt worden war, vereinigt, und die Umwandlung von Maleinsäureanhydrid an dem Filtrat durch KaOH-Titration bis ssum Endpunkt mit Phenolphthalein bestimmt»

Die gesamt© ΕΙΐΑ-Produkt-Äufarbeitung bestand aus der Filtration, der dreimaligen Extraktion (jeweils 1 Stunde) der

	Maleinsäure anhydrid-Um wandlung (Jf)	EMA-Produkt- Gewinnung g (% Ausbeute)	T a b e 1	le, I	Spezifische Viskosität >1% DKF bei 25°C*»	Äquivalent gewicht®®*
	91,5	185 (68,8)			0,064	138,5
Vers.	. 96,6	227 (83,6)	Wasserstoff	Kohlenstoff <*)·	0,068	139,9
A	98,3	223 (82,1)	4,98	57,34	0,063	140,0
B	98,3	219 (81,1)	5,03	58,11	0,066	139,1
C	97,9	223 (81,7)	5,10	58,15	0,063	140,6
D	97,9	225 (81,9)	5,04	58,24	«0,061	141,5
E-	* 98,6	224 (82,4)	5,10	57,89"	0,064	140,1
P		5,12	58,14
G	5,11	58,05

Mittelwert aus swei Bestimmungen. . . '

Im wesentlichen gemäß dem ASTM D-2515-74-Verfahren; Ostwald-Viskosimeter.

Gewicht in Gramm enthaltend ©ine Moleinheit Anhydrid, bestimmt durch potentiomstrlsche p_H~Titration einer wässerigen Lösung mit einer Standard-NaOH-Lösung·

Aufschlämmung. mit 2 Liter Xylol bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 Extraktionen (jede i Stunde) mit 2 Liter Hexan und abschließender Filtration. Zwischen allen Extraktionsstufen wurde ebenfalls eine Filtration durchgeführt. Das endgültige EM-Produkt wurde über Macht im Vakuum bei vollem Ölpumpen-Vakuura und einer Temperatur von 55° bis 60°C getrocknet. Das so getrocknete EMA-Produkt wurde in einem Waring-Miecher 5 Minuten lang pulverisiert, um den kleineren Anteil an glasiertem Material bis sur Pulverkonsistenz su serkleinern. Die vorstehende Tabelle I gibt summarisch die bei sieben derartiger aufeinanderfolgenden EMA-Polymerisationen'ersielten Ergebnisse wieder.

Die Molekulargewicht-Parameter morden an dem EMA-Produkt unter Verwendung des Präparates F als typischem Produkt bestimmt. Das Material wurde 24 Stunden lang bei 1OQ°C im ölpumpen-Vakuum vakutmgetrocknet. Die Parameter wurden in trockenes Dimethylformamid (DMF) bestimmt., Für das Präparat P wurde das durchschnittliche Molekulargewicht (Zahlenmittelg Fi ) zu 852 nach der Dampf drucko smome trie in DMP bei 120⁰C unter Verwendung eines Knauer-VP-Osmometers bestimmt. Das durchschnittIiehe Molekulargewicht (Gewichtemittel; M^) wurde unter Verwendung von engge^inkeltem Laser-Streulicht, wiederum in DMF_S mit e5.nem Chromatix-'KHX-o-Instrument au 5750 bestimmt. Di© intrinsic viscosity in DIiF bei 25°C

218540

durch Kapillarviskosiin@trie unter Verwendung eines Cannon-Ubbelohde-Verdünnungsviskosimeters (Größe 75) durch Extrapolation von vier verschiedenen Konzentrationen auf die Konzentration Null gemessen. Für die intrinsic viscosity des Präparates P wurde ein Wert von 0,0607 dl/g gefunden.

Ähnliche Bestimmungen von K , H^ und der intrinsic viscosity wurden in identischer Weise unter Verwendung eines EMA-Präparates von höherer spezifischer Viskosität (0,11, 1 $, OlAF, 25°C) durchgeführt. In diesem Falle wurde für die intrinsic viscosity ein Wert von 0,1227 dl/g, für M_n ein

Wert von 2 264 und für ft ein Wert von 12 970 gefunden.

Unter Verwendung der vorstehenden Werte für iswei EMA-Produkte mit variierender spezifischer Viskosität wurden die Konstanten K und α in der Staudinger-Gleichung, [η] - Κχ Μ^α, welche die intrinsic viscosity [n] mit dem Molekulargewicht verknüpft, bestimmt. Die gefundenen Beeiehungen waren:

ίο'" χ H_n ⁰'⁷²

- 3,51 * ίο"⁵

Der Ausdruck "durchschnittliches Molekulargewicht", wie er in dieser Beschreibung mit Besug auf die offenbarten und beanspruchten Copolymeren dieser Erfindung verwendet wird, soll das mittlere Molekulargewicht (Zahlenmittel) bedeuten.

Identifizierung der fimktionellenGrupjsen

Die Identifisierung der verschiedenen funktioneIlen Gruppen für alle Beispiele der polymeren Derivate, und swar sowohl qualitativ als auch quantitativ, mirde mittels Infrarot-Analyse unter Verwendung eines Beckman IR-12-Spektrophotometers bewerkstelligt. Die Probenher st ellung,, die Extinktionobereich-Zuordnungen und die Yerfsiiren eux⁵ Bestimmung des Verhältnisses von Imid-Gruppen su Amid-Qruppen wurden nach aen Methoden durchgeführt, die entweder in ^wThe Infrared Spectra of Complex Molecules", Bellamy _s John Wiley and Sons, 1960, oder in ^Practical Infra-red Spectroscopy", Cross* ButterteOrth, 196^» niedergelegt sind. Die Probenher-Btellimg verwendete in allen Fällen Preßlinge aus 2 mg Polymerem pro 250 ag trockener KBr-Zubereitung mit 70 mg der Mischung Polymeres/EBr pro Preßling. Die Lagen der absorbierenden Banden werden in Einheiten der Wellensahl angegeben, die in reziproken Zentimetern (cm ) angeführt werden, gewöhnlich als Banöfrequensen bezeichnet-.

2 1854 0

Als qualitativer "Fingerabdruck¹¹ der Produkt zusammensetzung bezüglich dor Gegenwart oder Abwesenheit von gewissen Gruppen wurden die folgenden Bandfrequenz-Zuordnungen angenommen und verwendet:

Wellensahl (cm"¹)

Punktion

i^hydrid-Hing Dublette:

2. Undissosdierte aliphati-Bch0 Säure (COOH):

5· Polymeres Iicid, 5glieclri~ ger Riiig, Dublette:

. Po3^nr>ers8 primäres toid-I-Bande

5. Carbosylaticn

6. ethylen -(2L,-

von Carboxylat (Intensität hängt von der Natur des Kations ab) 1870-1830 Kleiner OO Strecksehwin- I8OO-I76O Größer gung

I725-I7OO

I715 Größer I77O Kleiner

I67O Größer I62O Kleiner

1560-1570

1*170-1^50

1405-1^00

(X) Streckschwin-

Streeksehwinr gung

OO Strecksciadji-

gung HI Daforaations-

und C-K Strectochwingung

CHH DsfoKiations-

eyraoetrischa Streckschidüngung

8. Polymere ndt elnsr beten

Konsaitration an IMd-Önippssi . _:- (über 60 %) enthalten auch 1180-1200 Größer C-N Streckeine Dublette: 1370-1350 Kleiner

Außer äenjeni@3n_s die in etehsndan Punkt 3 geseigt den.

Für öle quantitative Bestimmung des Imid/Ämlä-Gehaltes eines Polymeren, das außer der ÄHmoniumearboxylat-Punktion beide Gruppen enthält, mirda ein Verhältnis der Absorptionslntenßität der größeren Imiö-Bande bei 1715 cm ^x sur größeren primären Ämid-Bande bei 16JO cm" bestimmt. Der Imid-Gehalt wurde durch Vergleich des gemeßsenen Verhältnisses von Imid/Amid (oben) mit einer Standard-Kurve von Present Imid gegen Imid/Ämiä-Extinktionsverhältnis bestimmt, hergestellt aus einer Reihe τοη Infrarot-Aufnahmen, erhalten durch Mißchen von steigenden Mengen von reinem (etwa 100 %) Iiaid (beschrieben in Beispiel 5) mit einem Polymeren, enthaltend kein Imid oder nichtionisiertes COOH_S jedoch mit nur Amid- und Ionisierten Carboxy!-Funktionen (beschrieben in Beispiel 2).

Für diese letztere Untersuchung des Imld/Arald-Verhältnisses wurde dafür gesorgt, daB es sicher ist, daß nichtionisiertes Carboxyl nicht bei 1715 cm anwesend·ist, Indem man zuerst die Probe in Wasser auflöste, den p^-Wert mit Ammo-

niumhydroxid auf 10,0 einstellte und eine Gefriertrocknung durchführte, um irgendwelches niehtionißierte COOH in Aasaoniuxacarbosylat umzuwandeln. Derartige Verfahren erhöhen die Intensität der Carboxylat-Banden bei I56O und 1^00 cm" , stellen jedoch sicher, daß die restlich© Bande bei 1715 cm tatsächlich von Iraid herrührt.

In all den folgenden Beispielen" wird Besug auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von funktioneilen Gruppen und auf den Imid-Gehalt von Imid enthaltenden Polymeren auf der Basis der Anwesenheit oder Abwesenheit der obigen funktionellen Banden-Zuordnungen und der obigen Methode sur Bestimmung der quantitativen. Imid/Amid-Bandenintensität-Verhältnias© genommen.

Beispiel 2

Herstellung von Halb-amid^halb-ammonium-COO -sals

von EHA CAEMA)

Frühere Verfahren sur Behandlung von EMA-Polymeren (wie sie in der US-Patentschrift 3 157 595 und der canadischen Patentschrift SSk 32o offenbart worden sind) nach einem der drei Methoden _f nämlich:

(1) Trockenes Behandeln mit Ammoniak mittels Ammoniakgas bei gewöhnlichen Temperaturen mittels Einblasen von

Ammoniak in heftig gerührtes EMA-Pulver;

(2) Einblasen von Ammoniak in eine gerührte Aufschlämmung von EMA-Pulver in Benzol oder Hexan; oder

(3) durch direkte Zugabe von festem EMA-Pulver su einem gerührten Oberschuß von flüssigem Ammoniak sur Bildung des Halb-amid,halb-=a33amoniuincarboxylatsalg;es von EMA

haben sich als unzulänglich für di@ gegenwärtige Verwendung erwiesen.

Diese Unzulänglichkeit betrifft einen wesentlichen Zeit-Diffusionseffekt von Ammoniak in ά&η inneren Kern von sogar sehr fein gemahlenen EMA-Teilehen. Auch bei einer verlängerten Reaktionszeit enthalten die so hergestellten Amid-Annnonitaasalg-Produkte stets restliche Mengen von nichturagesetstein Anhydrid, annähernd 5 Gewichtsprozent, wie dies durch die Anwesenheit von Anhydrid-Absorptionsbanden bei 1780 und 1850 cm" -Frequenzen gezeigt wird.

Die nachfolgende bevorsugte Methode wurde entwickelt, um lange Reaktionsseiträume und schlechte Temperatursteuerung EU umgehen und Produkte su bilden„ die keine Anhydrid-Funktion enthalten. ·

(a) EMA-Polymeres aus Beispiel 1-P (80 g) wurde in 8OO ml Aceton (analysenrein) gelöst und diese Lösung im Verlaufe eines Zeitraums von 20 Minuten su einer gerührten Lösung

νοη 100 ml flüssigem Assaoniak in 3 Liter Aeston bei ~70°C (Trockeneis-Aceton-Bad) sugegeben. Nach beendigter Zugabe ließ man die gesamte Mischung sich allmählich auf Raumtemperatur erwänaen (H Stunden), während welcher Zeit sich die Farbe des ausgefällten Produktes von anfänglich gelb in weiß änderte. Das Produkt mirde abfiltriert und nacheinander swimal mit 2 Liter Aceton aufgeschlämmt, gefolgt von zweimaligem Aufschlämmen mit 1,5 Liter einer Aceton/Hexan-Misehung (50/50). Jede Aufschltamstufe dauerte 30 Minuten. Das Endprodukt wurde abfiltriert und über Nacht bei ^5⁰C im Vakuum bei 20 bis 25 ram Kg getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 900 ml Wasser gelöst, durch ein 0,*?5~ Mikron-Filter filtriert und gefriergetrocknet. Man erhielt 98,7 g (100 % Ausbeute) Kalb-amid^halb-amsnoniuincarbosylsals.

(b) Das vorstehende Verfahren (a) wird© wie folgt wiederholt unter Verwendung γοη EMA-Polymereia aus Beispiel 1-F, wobei jedoch Wasser su der ursprünglichen. EMA-Lösung in Aceton zugegeben *mrde. Das EMA (60 ε) ^"urde in 500 ml Ace ton plus 2,32 g Wasser gelöst und die Lösung am Rückfluß 2 Stunden lang erhitzt. Die gekühlte Aceton-Löeung von EMA wurde unter Rühren innerhalb eines Zeitraums von 10 Minuten S5U 2 Liter Aceton, die 3 Mol flüssiges Ammoniak enthielten, bei -60⁰C sugegeben. Man ließ wie suvor die Reak-

tions-Aufsehläxasiung sich auf Raumtemperatur erwärmen und arbeitet® ni© oben mit 2 Aufs chläinmungen in 1,5 Liter Aceton und einer Aufschlämmung mit I Liter Hexan auf, filtrierte dann ab und trocknete über Nacht im Vakuum bei 40°C und 20 bis 25 sun Hg. Das gewonnene Produkt bestand aus 84 g, was mehr als 100 % Auebeute war.

(c) Ein drittes Präparat verwendete EMA-Polyraeres aus Beispiel i-Q. 100 g (0,7IiJ Mol) EMA wurden 2 Stunden lang in 700 ml Aceton, das 5,85 g Wasser enthielt, am Rückfluß erhitst. Die gekühlte Aeeton-Lösung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 10 Minuten su einer gerührten Lösung von 3,3 Liter Aceton, das 60 ml flüssiges Ammoniak enthielt, bei -50⁰C sugegeben» Nach 1 Stunde bei ~50°C ließ man die Reaktions-Aufsehläimnung sich allmählich auf Raumtemperatur erwärmen (2 Stunden)« Das abfiltrierte Produkt wurde zweimal in 2 Liter Aceton (jeweils 30 Minuten) und sweiiaal in 2 Liter Hexan (jeweils 30 Minuten) aufgeßchläimnt_s filtriert und über Nacht bei 5O⁰C im Tollen Ölpumpen-Yalcuum getrocknet» Das gewonnene trockene Halb-amid^halb-anraoniuiaearboxylwog 115*6 g (93 % Ausbeute)«

Die Analyse der vorstehenden drei Präparate ist summarisch in der nachfolgenden Tabelle II niedergelegt.

18 5

Tabelle

Il

Präparat

Stickstoff {%% Durchschnitt aus 2 Proben)

Funktionelle Zusammensetzung nach IR

Anhydrid	Keines	Keines	Keines	Keines
Nichtdissosiiertes COOH Keines	Vorwiegend	Keines	Keines
Imid	Versiegend	Keines	Keines
Primäres Amid	Ja	Vorwiegend	Vorwiegend
Ionisiertes COO*"	Vorwiegend	Vorwiegend	Vorwiegend
Methylen ~CH2~	Beispiel	Ja	Ja
-coo~mhJ	von partiellen Imid·	Vorwiegend	Vorwiegend
	3
Herstellung	-Derivaten	in Xylol

Eine 10 g-Probe des Kalb~©mid,halb~aininoniumcarboxylsalses von Beispiel 2a wurde in 250 ml Xylol in eines I-Liter-Kolben, der mit Rührer, Thermometer, Waseerabnahme-Falle und einem Gaseinleitungsrohr für Ammoniak versehen weit, aufgeßchläramt* Die Aufschlämmung wurde während· eines Zeitraums von. 12 Stunden am Rückfluß erhitzt, wobei gleichseitig ein

- /37 -

stetiger Fluß von Ammoniak durch das Gaseinleitungsrohr aufrechterhalten wurde. Aliquote Proben der Produkt~Aufsehlänmung wurden zu verschiedenen Zeiten (vgl. Tabelle III) sur Analyse der Umwandlung in Imid mit der Zeit entnommen. Jede kleine Probe wurde durch drei aufeinanderfolgende Aufschlämmungen in 100 ml Heran, Filtration und Trocknung bei 50⁰C im Vakuum bei 20 bis 25 vm Hg aufgearbeitet. Der p„-Wert der 2|igen wässerigen Lösungen wurde sowohl Tor, als such nach der weiteren Auflösung in Wasser, der p_H-Wert-Einstellung auf 10,0 (NH^OH) und der Gefriertrocknung gemessen« Infrarot-Analysen mirden von allen Proben erhalten, um die Verhältnisse von Imid zn Amid und damit den prosentualen Imid-Gahalt festzusetzen« Die Ergebnisse sind In der Tabelle III niedergelegt«.

	T a	b e	ί 1 1 e	III	Imld(d) Gew.-?
					13,8
Zeitdauer unter Xylol™ Rückfluß bei Proben- enfcnatess	Ph			)) l/A- ' Verh.	18,5
15 min	6,	26	7,20	0,723	23,3
30 min	6,	00	5,86	0,858	27,^
	5,	91	5,76	0,999	56,8
1 h	5,	78	5,53	1,113	40,2
1,5 h	5,	*3	5,^3	1*398
2 h	5,	27	5,76	1,501

21 85

Tabelle

III

(Fortsetzung)

Zeitdauer unter Sylcl-Küekfluß bei Eroban-

entnahme

P₁₁-:

-o(b)

Verh.

Iraid

Cd)

QeM,-%

3 h i| h 6 h

7,5 h

12 h

4,78

*,73 ή,73

5,72 5,38 5,76 5,60

1,821

50,0

(a) Der ρ„-Wert der 2$igen wässerigen Lösung vor der p„-Werteinstellung.

(b) Prt*"Wert einer Sligen wässerigen Lösung, eingestellt auf einen p„-Wert von 10, und gefriergetrocknet»

(c) Verhältnis der IR-Bande-Absorptionsintensität bei einer

Wellensahl von 1715 cBTViöTO cm (d) Erhalten aus der Standard-Kurve von Zusammensetzung gegen I/A~Verhältnis.

Ein weiterer Sats von neun Einseiuntersuchungen wurde in Angriff genommenj wobei das Halb-amidjhalb-aramoniuiacarboxylßala von Beispiel 2-b verwendet wurde. Jeder einseine Versuch v-mrde in Xylol-Aufschl&nmung für die notierte Eeit (Tabelle IV) am Rückfluß erhitzt und'insgesamt aufgearbeitet. Die Trockenprodukte aus der Hexan-Wäsche wurden einsein

	Reaktionszeit unter Xylol- Rüekfluß	Produkt ausbeute® g (% Ausbeute)	T a b e	11©	IV	I/A® Verh.	n« Imid
	2 min	4,45 (90,1)				0,489	5,3
Vers. Nr.	4 min	3,92 (92,6)		PH-2«	*· Stickstoff0	0,559	7,9
1	10 min	7,87 (80,5)	5,08	7,08	14,27	0,661	11,5
2	' 20 min	6,28 (81,1)	4,85	6,93	14,28	0,798	16,5
3	30 min	6,15 (80,1)	4,43	7,12	14,48	0,911	20,4
4	45 min ·	6,30 (82,7)	4,52	6,74	13,82	1,020	24,1
5	lh	6,30 (83a4)	3,99	6,39	13,67	1,139	28,2
6	1,5 h	6,15 (82,6)	4,60	6,69	13,71	1,333	34,7
7	3,0 h	5,90 (81,9)	4,70	6,22	13,80	1,828	50,1
8.		4,37	6,00	13,07
9	4,33	5,81	12,52

Bei Versuch 1 wurden 5,0 g AEMA, bei Versuch 2 4_S3 g, bei Versuch 3 10,0 g, bei den übrigen

Versuchen 8,0 g eingesatst. · '

p_H~Mert einer 2$igen wässerigen Lösung vor der p„~Wert~Einstellung. ,;

p„-Wert einer 2%igen wässerigen Lösung, eingestellt auf einen p_H~Wert von 10,0 und gefriergetrocknet. .

Erhalten bei einem p^-Wert-eingesteilten, gefriergetrocknetem Produkt. Vgl» Fußnote (c) Tabelle III, gefriergetrocknetes Produkt. Vgl.' Fußnote (d) Tabelle III, gefriergetrocknetes Produkt.

r. &"- .2 18540

in 150 al Wasser gelöst, sit HH^OH der p_H~Wert auf 10,0 eingestellt, durch O_f2O Mikron-Filter filtriert und direkt in sterilen Serum-Flaschen gefriergetrocknet für eine in vivo-Tier-Bewertung. Die Ergebnisse und die Analysen der verschiedenen Versuche sind in der vorstehenden Tabelle IV niedergelegt.

Beispiel §

Herstellung von partiellen Imid-Derivaten in Toluol

Partielle Imide Ton Halb-aaid»halb"affimoniuiscarboxylsals von Ef4A~Polymerem warden im wesentlichen wie in Beispiel 3 hergestellt, ro.it der Ausnahme _t daß die Ind.dbi!dungsrate variiert imrde, indem man bei Toluol-Rückfluß (110⁰C) in einer -Toluol-Aufschlämmung, anstatt in Xylol, *d.e in Beißpiel 3, arbeitete.

Das verwendete EMA stammte aus Beispiel 1-F und das sur Herstellung des Halb-amid,halb-aiainoniumsalses angewandte Verfahren war das gleiche wie Beispiel 2a ohne Wasser zugabe. Dieses Produkt geigte größere IR-Absorptionsbanden für primäres Amid, ionisiertes Carboxyl und Ammoniumsarboxylat ohne Aniseichen von Anhydrid oder Imid. 28 g dieses Amid-AEmoniumsalses mirden in i Liter Toluol aufgeschlämmt und bis sum Rückfluß erhitzte Nach 2 Stunden, 3,5 Stunden und.

5 Stunden Rüekflußseit (Ende des Versuches) mirden 3 aliquot© Teil© entnommen« Die Produkte mtrden durch Filtration isoliert, dreimal in 150 ml Toluol und dreimal in Petroläther auf ge schlämmt und 17 Stunden lang bei Raumtemperatur im Vakuum bei 25 am Hg getrocknet. Die trockenen Produkte wurden dann in 100 ®1 Wasser gelöst, auf einen p^-Wert von 9,0 mit NH^OH eingestellt, durch ein 0,20 Mikron-Filter filtriert und direkt in sterilen Serum-FlSschchen für in vivo-Tier-Bewertung gefriergetrocknet. Die Ergebnisse waren folgende:

Toluol-Rüekfluß (h)	Produkt (S)	Stickstoff I/A-* (%) Verh,	0,531	6	,5
' 2 .	6,15	13,78	0,600	9	,5
3,5	7,73	13,41	0,647	11	,0
5	9*24	13,82

Vgl. Fußnote (e) in Tabelle III - gefriergetrocknetes Produkt„

Vgl, Fußnote (d) in Tabelle III - gefriergetrocknetes

Produkt. ..· · .

- .= 218540

Beispiel 5

Herstellung eines vollständigen Imids von EMA EMA Sp. ViBk. « O,O6l

Das vollständige Imid von EMA wurde hergestellt, indem man 20 g des Produktes aus Beispiel 2a in 250 ml Xylol als Aufschlämmung während eines Zeitraums von 18,5 Stunden unter einem konstanten Strom von Ammoniak und unter Entfernen des Reaktionswassers in einer Dean-Stark-Falle am Rückfluß erhitzte«, In der Falle wurden insgesamt 2,7 ml Wasser entfernt. Das Produkt wurde filtriert, dreimal mit Hexan aufgeschlämiat und über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum bei 25 offli Hg getrocknet. Das trockene Produkt wog 13»5 g_s 8^*3 Ausbeute. 5 S des Produktes wurden in 150 ml Wasser über Nacht gerührt, filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet· Das Produkt hatte einen Stickstoffgehalt von 9*53 % und eine IR-Analyse geigte Absorptionsbanden nur bei Wellenzahlen von 1190, 1360, 1715 und 1770 cm"*¹, typisch für eine Iraid-Funktionalität. Es waren keine Amid-, Anhydrid-, ionisierte Carboxyl- oder Ainmoniumcarboxylat-Absorptionsbanden vorhanden·

Das obige vollständige Iiaid-Produkt wurde in verschiedenen Mischungen gusammen mit dem nicht-Imid-enthaltenden HaIbamid,halb-emmoniuiacarboxylatßalz aus Beispiel 2a verwendet,

um eine Imid/Ämid-Inf^arot-ZusammensetEungsgrundkurve auf-Eustellen, wie sie im Anschluß an Beispiel 1 beschrieben wurde.: Die angegebenen, auf einer analytischen Wage abgewogenen Mengen "mirden unter Verwendung eines Wigglebug-Kischers in Mischern aus rostfreiem Stahl gemischt. Infrarot-Werte mirden an Preßlingen der obigen Mischungen mit trockenem EBr unter Verwendung von 2 mg Polymer-Mischung auf 250 mg KBr bestimmt. Der Pellet bestand aus 70 mg Polymeres/KBr-Misehung pro Preßling. Die gesamte Grundkurve wurde aus den folgenden gemischten Zubereitungen aufgestellt :

Gewicht van vollstSndigesn Ind-d von Baispiel 5 (mg)	Gewicht ton 0 % Imid von Baispiel 2a (ng)	üsid/Änid Absorptions verhältnis
3	97
6	94	0,509
10	90	0,621
20	80	0,8*13
30	70	1,161
HO	.60	1,519
50	50	1,871
60	40	2,099
70	30	2,56*1
80	20	3*008

Beispiel 5-A

Herstellung eines vollständigen Imida von EMA EMA Sp. Visk «0,66

Das vollständige Imid von EMA mit höherem Molekulargewicht, als das in Beispiel 5 verwendete, wurde unter Verwendung von EMA mit einer spezifischen Viskosität « 0,66 (i %, DMF, 25°C) entsprechend einem Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 hergestellt. In diesem Falle wurde das mit Ammoniak behandelte EMA wie in Beispiel 6(a) hergestellt, indem man trockenes Amiaoniakgas durch gerührtes EMA-Pulver bei einer Temperatur unterhalb 70⁰C hindurchleitete. Das erhaltene Halb-amidjhalb-aismoniumcarboxylEals von EMA-Pulver (spezifische Visk. ε 0,66) wurde weiter bei erhöhter Temperatur erwärmt, um das Halb-amid in das Imid durch Abtreiben von Wasser umzuwandeln.

525 S des EMA mit einer spezifischen Viskosität von 0,66, das sich \*on Halb -amid, halb -ammoniumearbosy Is als ableitet-, wurde heftig in einem Kessel mit einem Fassungsvermögen von 3 gallon ' (11,36 1), der mit Vorrichtungen ssur Wasserabnahffie und sum Einleiten eines kontinuierlichen Stroms von Amiaoniakgas versehen war, gerührt. Di© Temperatur wurde bis auf 122⁰G angehoben, worauf ¥asoer in die Falle der Waaserabnahme su fließen begann. Nach 1 Stunde hatte die Tempera-

tür 152°C erreicht und 24 ml Wasser waren entfernt worden. Das Erhitsen unter Rühren und unter Durchströmen von Ammo niak mirde5 Stunden lang fortgesetzt (insgesamt 6 Stunden), wobei eine Gesamtmenge von $H ial Wasser erhalten ^rurde. Nach dem Abkühlen war das Produkt ein weißes mehliges Pulver· Der Stickstoffgehalt betrug 11,11 % im Vergleich sum theoretischen Wert von 11,20 %,

Dieses EMA~100 g-Imid mit höherem Molekulargewicht wurde auf die Inhlbie-rung von Tumorwachsturn in einem unabhängigen Untersuchungslabor im Jahre 1958 untersucht und geigte keine Aktivität (vgl. Beispiel 22).

Herstellungvon JBaIb-^ von EKA

nach bekannten Verfahren mit und ohne Wasser

(a) Ein 4-Hals~Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml wurde mit einem Teflon-Rührer, einem Thermometer, einem Gaseinleitungsrohr und einem Blasensähler für aen Gaßausgang versehen_e Das eintretende Ammoniakgas wurde durch einen Strömungsmesser geleitet, der den Durchfluß nur qualitativ anzeigte« In den Kolben wurden 25 β EMA aus Beispiel l-D eingebracht und das Pulver mit einer Geschwindigkeit von 500 UpM gerührt» Der eintretende Araraoniakstrom wurde auf

- .218540

einer solchen Höhe gehalten, daß von der Ausgangstemperatur aus 70⁰C ohne Verwendung eines HeiEmantels erreicht wurden. Nach 9 Minuten hatte das Pulver eine Temperatur von 70⁰C erreicht, und es mirde die Eingangemenge an Ammoniak bo herabgesetst, daß diese Temperatur aufrechterhalten wtrde. Eine Temperatur von 70°C %rarde während eines Zeitraums von 1 Stunde und JO Minuten aufrechterhalten, nach welcher Zeit der Ammoniakeingang abgestellt und der Kolbeninhalt unter Stickstoff abgekühlt mirde. Die Ausbeute an trockenem, mit Ammoniak behandeltem EMA als HaIbamidphalb-ammoniumearbosylat betrug 30,8 g oder 98,8 % Ausbeute» Der Prosentsats Stickstoff betrug 1*1,01, 1*1,18 und eine 2iige wässerige Lösung hatte einen p„-Wert von 6,07. Die IR-Analyse zeigte Absorptionsbanden an für:

Kichtuiagesetstes Anhydrid bei I78O und I85O (weniger als

5$ geschätzt)

Primäres Amid bei I67O und 1620 (vorwiegend)

Carbonylation bei 1565 " (vorliegend)

Küt-Carboxylat bei i*iO5 (vorwiegend)

Imide Keine

(b) Eine mweite Ammoniakbehandlung von EMA aus Beispiel ID wurde "wie unter (a) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das EMA zuerst mit Wasser_s wie nachfolgend beschrieben, behandelt ¥uröe_s um die Reaktion mit Ammoniak su verstärken und

185

di© Anhydrid-Komponente in dem Produkt herabsusetgen. 25 E EMA wurden bei 500 UpM bei Ίθ°Ο (Heismantel) 6 Stunden lang in Gegenwart von 0,53 g (i7 Molprosent) Wasser, das tropfenweise im Verlaufe der ersten 20 Minuten aus einer 1,0 ml InJektionsspritse sugegeben wurde, gerührt. Nach 6 Stunden wurde das PulYer auf Raumtemperatur abgekühlt und die Behandlung sit Ammoniak wie unter (a) oben durchgeführt, wobei man die Temperatur in 10 Minuten auf 70⁰C steigen ließ. Die gesamte Zeit der Aramoniakbehandlung bei 70⁰C betrug 1 Stunde und das Produkt wurde unter Stickstoff abgekühlt. Man erhielt 3i»^ g oder 100,8 % Ausbeute, uobei der Prosentgehalt an Stickstoff 1^,02, 13,94 betrug und die 2|ige wässerige Lösung einen p^-Wert von 6,*}5 hatte. Die IR-Analyse liefert© die nachfolgenden Absorptionsbanden: Nichtumgesetstes Anhydrid - Vorhanden, jedoch in viel

geringerem Maße als in (a)

Primäres Amid ' - Mehr als in (a)

Carbojcylion - Mit NHh-Carboxylat

KHk-Carbosjylat - War gegenüber (a) erhöht

Imid ' - Nicht vorhanden

- /48 -

- w- ' 21 8540

Beispiel 7

Kennzeichnung der früher hergestellten Produkte ira wesentlichen trie in Beispiel 6

Mährend des Zeitraums von Juli 1956 biB Februar I960 wurden die Halb-amidjhalb-amoniuffic&rboxylatsals-Derivate von mehreren Viskositätsgraden (verschiedenen Molekulargewichten) von EKA hergestellt und bewertet. Die ViskositätBgrade, angegeben als spesifisehe Viskosität bei 1,0 Gewichtsprozent in DMF bei 25°C, lagen im Bereich von 1,19, 0,60, 0,11 bis 0,06ö. Die dem bestimmten Molekulargewicht (M_n) entsprechenden Herte waren 50 000 bis 60 000, 20 000 bis 30 000, 2000 bis 3000 und 1000. Die ersten drei, d.h. die verwendeten EMA-Typen sdt spezifischen Viskositäten von 0,11, 0,60 oder 1,19» vrurden in einer großen Versuchsanlage )ait Affiinohiak behandelt, wobei Produktraengen im Bereich von 600 bis 800 pounds (272 bis 363 kg) erhalten mirden. Das EMA mit der niedrigeren Viskosität (0**060) wurde In einer kleineren Laboratoriumsanlage mit Ammoniak behandelt, wobei 200 bis 300 g EJfA eingesetzt wurden« Die Verfahren werden nachfolgend beschrieben, gefolgt von einer Kennzeichnung des zu dieser Zeit' erhaltenen Produkts.

218540

Übersicht über das Verfahren in der Versuchsanlage (Qber die EHA-Typen mit der spezifischen Viskosität Ton 1,19»

0,60 und O₈Il)

Der verwendete Behälter sur Behandlung mit Ammoniak war ein "Stokes-Rotationstroekner, Modell 59AB ^w aus rostfreiem Stahl, der mit einem Mantel versehen war und ferner Vorrichtungen zur Einleitung von trockenem, wasserfreien Ammoniak über die Oberfläche des Inhalts enthielt, weiterhin einen Rührer, der mit 5,7 UpM lief und einen Rotaryhahn sum Abdichten des Bodens und Austragen des Endprodukts. Das Füllvolumen der Einheit betrug ²IO cu.ft. (1133 D, das Arbeitsvolumen 27 cu, ft. (7^5 D und die Mantelfläche betrug 63 sq« ft. (0,59 m ). In einem typischen Versuch wurde das Ajüsoniak-Behandlungsgefäß am Boden geschlossen und 500 bis 6OO pounds (227 bis 272,4 kg) EMA der geeigneten Viskosität bei laufendem Rührer eingefüllt. Das EFiA mirde bis auf 55°C erhitzt, wonach es bis su dem Ausmaß von 0_$15 bis 0,20 Mol Wasser pro Mol EMA durch Zugabe von Trockendampf mit einer Rate von 0,007 kg Dampf pro kg EMA während eines Zeitraums von 3 Stunden ^oberhalb der Oberfläche" vorhydrolysiert wurde. Während dieses Zeitraums wurde die Temperatur auf einem Wert von 55° ^nd 7O⁰C durch Einspeisen von Kühlwasser in den Mantel gehalten» Dann wurde wasserfreies gasförmiges Ammoniak in den Reaktor (über die Oberfläche

« 2 185

partiell hydrolysieren EMA) mit einer solchen Rate [etwa 5 bis 8 pounds (2,27 bis 3*63 kg) pro Stunde] eingeleitet, daß die Temperatur auf einem Wert zwischen 60° und 70°C gehalten wurde, bis 2,0 Mol Ammoniak pro Mol EMA zugegeben worden waren. Nachdem das gesamte Ammoniak sugesetst worden war, wurde das Produkt auf eine Temperatur von unterhalb 50⁰C abgekühlt und in Vorratsbehälter überführt.

Lab Oratoriumsverfahren für EMA mit einer speeifischen Viskosität von 0,06

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte EIlA wurde in ähnlicher Weiee wie das in Beispiel 1 beschriebene hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Reaktoreharge aus 267 g Maleinsäureanhydrid, 2089 ml Äthylbenzol, 45,8 ml n-Butylaldehyd

bestand und 13,20 g Bensoylperoxid. insgesamt bei Beginn zugegeben uurden. Der Äthylendruck wurde während eines Zeit raums von 2k Stunden auf 200 psi (I^ kg/cm ) und die Temperatur bei 70⁰C gehalten. Die Menge an abschließend aufgearbeitetem EMA-Produkt. betrug'279 g, Ausbeute 73_?3 %, und die spezifische Viskosität war 0,060 bei i^iger Lösung in DMF bei 25⁰Ce In einen VRalG-Kolben mit einem Fassungs vermögen von 5 Liter wurden 2*S9 g festes EKA-Pulver mit einer spesifischen Viskosität von 0,060 eingebracht und 6 Stunden lang bei k5° his 55⁰C nach der anfänglich erfol-

Tabelle

Identifizierung:

Verwendetes EMA, spes. Visk.®

Molekulargewichtsbereich:

Mit Ammoniak behandeltes Produkts CRD-Code: Herstellungsj ahr ί Stickstoff (%)

JR-Kennaeichnung:

Versuchsdatum:. Anhydrid

Carbonsäur® (COOH) . Imid -

Primäres Amid Carbonylation (COg) Ammoniuacarboxylat

	C	B	A	\
D	0,60	0,11	0,060	O
1,19	20-30 000**	2300***	1060»®·	1
50-60 000**	334	333	337	ro
S-24	1957	1956	I960
1957	16,86	14,80	13,83
15,83	22.5.59	8.6.59	5.7.60
« „|,| UiJi	Pehlt	Fehlt	Fehlt
	Fehlt	Fehlt	Fehlt
	Pehlt	Fehlt	Fehlt
—-.	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
......

1% DMP₉ 25⁰C .

M aus Viskosität-iC-Kurve-Besiehung bestimmt.

Bestimmt im Desember I960 durch die ebullioskopische Methode, Siedepunktserhöhung in Aceton. ^

BA

genden, tropfenweisen Zugabe von 5>3 g Wasser (15 Molprozent, bezogen auf EKA) heftig gerührt, um eine partielle Hydrolyse au erzielen. Die Behandlung mit Ammoniak wurde unter Verwendung von trockenem, wasserfreien Ammoniakgae begonnen, das in das heftig gerührte feste EMA-Pulver eingeleitet inirde, wobei die Temperatur 18 Stunden lang bei 31° bis 32°C gehalten wurde. Während dieses Zeitraums wurde eine langsame, jedoch ständige Aufnahme von Ammoniak beobachtet. Das Endprodukt wog 320 g, 103,3 % Ausbeute.

Die Produkt-Kennseichnung von all den vorstehenden Produkten ist in der vorstehenden Tabelle Y niedergelegt.

Proben der Halb-amidjhalb-anraoniumcarboxylatsalsse von EMA, die in den Jahren 1957 bis i960 hergestellt und eu diesem Zeitpunkt, wie in Tabelle V beschrieben, gekennzeichnet worden waren, wurden in Glasflaschen mit gewöhnlichen Schraubdeckeln (nicht unter Stickstoff und auch nicht in irgendeiner Weiße versiegelt) bis Anfang 1977 in einem Vorratsraum für allgemeine Zwecke aufbev?ahrt. Zu diesem Zeitpunkt (1977) wurden sie für eine weitere Bewertung, dem Lager entnommen (vgl. Beispiele 9 und 10)_o Vor der Wiederverwendung wurden die Materialien erneut gekennzeichnet, mit den Ergebnissen, wie sie in der Tabelle VI niedergelegt sind.

- /95 -

Tabelle VI

Mit Ammoniak behandeltes Produkt

Identifizierungscode!

Besug su Tabelle V

Stickstoff

IR-Kennaeichnung : _r Versuchsjähr

Carbonsäur© (COOH) Imid

Primäres Amid Carboxylation (CO") Ammoniumcarboxylat

Imid/Amid-Absorptionsvsrh,

S-24	33*	333	337
D	C	B	A
1^,02	12,46	12,53	12,62
1977	1978	1977	1977
Fehlt	Fehlt	Fehlt	Fehlt
Fehlt	Fehlt	Fehlt	Fehlt
Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden	Vorhanden
0,890	0,922	1,180	0,950
19,5	20,7	29,5	21,7

1 85

Es ist ersichtlich, daß die in den Jahren 1959 bis I960 (Beispiel 8) untersuchten polymeren Produkte, die eu diesem Zeitpunkt kein Imid enthielten, sowohl Ammoniak als auch Wasser verloren hatten und hierdurch während der langen Lagerseit in Imid-enthaltende polymere Produkte Überführt worden waren. Diese umgewandelten Produkte lieferten unerwarteterweise bei einer neueren Untersuchung in den Beispielen 9 und 10 verschiedenartige Ergebnisse im Vergleich su den früheren Resultaten.

Produkt-Bewertung der Beispiele 8 bis 21 Beispiel 8

Ee wurden drei Molekulargewichtsabwandiungen von EMA-HaIb-Efflid^halb-aMücmiumcarboxylat-Derivaten (die keine Imid-Punktion enthielten), ifie sie in Beispiel 7-V-A, B und C identifiziert mirden, in einem unabhängigen Untersuchungslaboratorium während der Jahre 1959 und I960 unter Verwendung cffisieller Verfahren für feste Sarcoma-180-Transplan tate» wie sie durch das Cancer Chemotherapy National Service Center (CCHSC) spezifiziert und von dem Nation Institutes of Health erbalten wurden_s bewertet. Das Verfahren bestimmt 2 Todesfälle bei sechs Tieren ale toxische Qrense Versuehs-T/C-Verhältnisce wurden als das Verhältnis des

Tabelle VII

Verbindung (Tabelle V, Beisp. 7)

EMA'-sp©ζifische Viskosität Produktcod©

Versuch 1: Dosis (mg/kg)

Tot/Gesamt

Bemerkung

Versuch 2: Dosis (mgZkg) TotZGesamt (TZC)₂ (TZC)-, χ (TZC)₉

JL ά.

' Bemerkung

Versuch 3ϊ Dosis (mgZkg) TotZGesamt (TZC)₃ (TZC)₁ χ (TZC)₂

Bemerkung

0,060	0,11	0,60
Ü-11O*J® CRD3379*	CRD333	CRD334
500 500	375	60
2Z6 2Z6	0Z7	1Z7
0,89 0,^5	0,337	0,180
Verworfen Fortgesetzt	Fortgesetzt	Fortgesetzt
500	375	60
2Z6	1/7	2Z6
0,29	0,159	0,51
0,13	0,053	0,093
Fortgesetzt	Fortgesetzt	Fort ge es et zt
500	375	60
1Z6	1/6	1Z6
0,77	0,15	0,50
0,10	0,008	0,0l?6 ,;
—— Verworfen	Akzeptiert	Akzeptiert

^φ U-1104 wax* das Ammonlumsal^ Ton Bernsteinsäurehalbamid (succinainic acid), der monomere funktionella Anteil der Polymeren'A, B und C.

^ Zweimal untersucht. Zwoitsr Test boi Versuch 1 verworfen mit 500 mgZkg, totZgesamt « 1Z6 und. (TZC)₁ s 1,39.

- 5β·-

2185

mittleren Tumorgewichts der behandelten Tiere au dem mittleren Tumorgewicht der Kontrolltiere berechnet. Die TZC-Werte wurden für eine Reihe von drei Versuchen berechnet, wenn der vorhergehende Versuch innerhalb gestatteter Grenzen blieb. Das Material war annehmbar, wenn (TZC)₁ χ (T/C)₂ χ (TZC), kleiner als 0,08 nach dem Endversuch ist. Die Versuche wurden fortgesetst, wenn (TZC)₁ kleiner als 0,5*5 und wenn (TZC)₁ « (TZC)₂ kleiner als 0,20 waren. Die eingesetzten Tiere waren spesifisisrte Schweizer Mäuse (CCNSC, Spezifikation XIV), die Drogenverabreichnung war I.P. (Spe~ Eifikation III) und die Dosisbestimmung erfolgte nach Spe-Bifikation XII.

Die BUKsiaarisch zusammengefaßten Ergebnisse werden in der vorstehenden Tabelle VII gegeigt.

Es wurde gefolgert, daß, während die Toxisität mit Erniedrigung des Holelailargewichts verbessert wurde, Aktivität verlorenging, wenn die Größe gegen den inaktiven monomeren Teil für diese Derivatserie abnahm. In dem oben erwähnten Zeitraum (1959 bis i960) wurden keine ähnliehen Derivate, welehe die Partialimid-Funktion enthielten, hergestellt oder nach CCKSC-Verfahren, oder irgendeinem anderen Verfahren, bewertet* Alle drei obigen Polymeren (A, B und C) wurden als wertlos ausgeschieden, wenn sie nach den CCNSC-Verfahren

1 85

gegen Carcinoma 755 und Leukemia 1210 bewertet wurden.

Beispiel 9

Die polymeren Zubereitungen (A, B und D), die wie in Beispiel 7, Tabelle VI beschrieben, aus drei EMA-Rohmaterialien mit verschiedenen spezifischen Viskositäten erhalten worden waren, und demzufolge drei in weitem Umfang variierende Molekulargewichte aufwiesen, wurden an BALB/c-Mäuse nach drei Dosierungstabellen verabreicht, nämlich

(a) vor den ((Tagen -9 und -1), oder

(b) nach den (Tagen 1 und 9)

der Tumorübertragung mit SVHO umgewandelten Tumor-Zellen (als mKSA-TU5 bezeichnet), oder

(c) sowohl vor den (Tagen -9 und -1), als auch nach den (Tagen 1 und 9) der Tumor-Herausforderung.

Die Verbindung wurds intraperitoneal (I.P.) in 3 Dosen eu 62,5, 125,0 b£W„ 250,0 rag/kg verabreicht. Die Tumor-Zellen wurden in einer Menge.von 1 « 10 -Zellen eubcutan (SC) an eine Gruppe von Tieren, und in einer Menge von 1 χ 10 ⁵-Zellen subcutan an eine andere Gruppe von Tieren geimpft. Das Wachstum der Tumoren bei den behandelten Mäusen gegenüber* den normalen nicht behandelten Kontrollinäusen wurde dann bewertet. Die Ergebnisse sind summarisch in den Tabellen VIII-A, VIII-B und VIII-D niedergelegt. Aus der Tabelle

Tabelle VIII - A

mKSA-TU5-

Tujnor

Untersuchte Verbindung

Dosis (mg/kg)

Behandlungsplan

Tumorwachstura

beim Empfänger bis Tag 58

Tumorfrei bis Tag

10

SC π w π W O

η η η π

χ SC

η η

ft R W W

a it

4-3

Kontrolle

Beisp.7 - Tabelle VI-A

Polymeres β/β

rf

Kontrolle

Beisp.7 - Tabelle YI-A

Polymeres

250	Tag®	-9	und	-	-1	β/6
125		ti		und		U/6
62,5		Π				2/6
250	Tage	+1	und		+9	1/6
125		η		und	•	2/6
62,5		η				i}/6
	Tage	-9	und
250		+1	und	+9	3/6
125		η			Μ/δ
62,5		η			4/6
-				6/6
250	Tage	-9	-1	1/6
125		Π		2/6
62,5		η		Η/β
250	Tage	+9	+1	3/6
125		η		β/6
62,5		η		5/6

0 2

5 4 2

3 2 2 0

5 4 2

3 0 1

Tabelle VIII - A

	Untersucht®	(Fortsetzung)	Dosis	cenanui.ungspj.an	Tumorwachstum	Tumor .fr ei	{
	Verbindung		(mg/kg)	Tage -9 und -i,	beim Empfänger	bis Tag 58
mKSA-TU5-			*9 und +1	bis Tag 58		i ro
Tumor	Polymeres	250			0
1 χ 10*3	η	125		6/6	1
SC			π	5/6
Ti S?	η	62,5			2
		4/6
η η

Tabelle VIII - B

	Untersuchte Verbindung	Dosis (rag/kg)	Behandlungsplan	-	Tumorwaehstuia beim Empfänger bis Tag 51	Tumorfrei biß Tag 51
mKSA-TU5- Tuinor
Weg	Kontrolle		Tag® -9 und -1	5/6	1
1 χ ΙΟ*1	Beisp«7 - Tabelle VI-B
SC	Polymeres	250	η	6/6	0
η 33	π	125	Tags *1 und +9	3/6	3
» tt	π	62,5	B	5/6	1
π t?	ti	250	If	5/6	1
W W	Xt	125	Tag® -9 und -1,	4/6	2
Β η	η	62,5	♦1 und +9	5/6	1/
it n
	η	250		5/6	1
η ft		125		5/6	1
	π	62,5		6/6	0
η β	Nicht durchgeführt
1 χ ΙΟ3

Tabelle VIII - D

	Untersuchte Verbindung	Dosis, (mg/kg)	Behandlungsplan	Tumorwachsturn beim Empfänger bis Tag 36	Tumorfrei bis Tag 36
aKSA-TU5- Tumor	Kontrolle		_	6/6	Ö
I X 1O+4	Beisp.7 - Tabelle VI-D
SC	Polymeres	75	Tage -9 und -1	6/6	0
	η	50	w	5/6	1
η η	η	25		6/6	0
	η	75	Tage 4-1 und +9	6/6	O
ti H	η	50	«	6/6	0
η η	η	25		5/6	1 -
η β			Tage -9 und -1,
	π	75	*1 und ·*·9	6/6	0
β ti	β	50	B	6/6	0
η R	η	25	V	6/6	0
η η

Tabelle YIII - D

(Fortsetzung)

Tumor

Untersucht©

Verbindung

Dosis

(ag/kg)

Behandlungsplan

Turaorwaohstum

beim Empfänger bis Tag 36

Tumorfrei bis Tag

1 χ	10
	SC
η	η
η	«
π	W
η
η	B
«	K
λ	η

Kontrolle

Baisp. 7 - Tabelle VI-D

Polymeres 6/6

π π

it η π

π η

75	Tag®	-9 und	-1	6/6
50		m		4/6
25		m		5/6
75	Tage	*9 und	41	6/6
50		K		6/6
25		η		H/S
	Tage	-9 und
75		+1 und	♦9	6/6
50		B		5/6
25		B		2/6

0 2 1

0'

0 1 .4

21854

VIII-A Ist zu erraehen, daß bei Verwendung des Polymeren aus Beispiel 7-Tabelle VI-A bei Anwendung der Dosierungstabelle (a) 48 % (17/36) der Tuiaor-herausgeforderten Mäuse gesund und frei von Tumor über den 58 Tage dauernden Beobachtungszeitraum blieben. Am Tag 6l mirden die tumorfreien Tiere

erneut mit lebensfähigen Tumor-Zellen (mKSA-TÜ5; 1 χ 10 -

Zellen; S.C.) erneut herausgefordert und 82 % blieben 37 Tage lang tumorfrei (d.h. immun) nach der Herausforderung.

Bei Verwendung der Dosierungstabelle (b), wo das Polymere von Beispiel 7~Tabelle VI-A nach der Tumor-Herausforderung verabreicht wird, blieben k2 % (15/36) der Tiere nach 58tägiger Beobachtung tumorresistent. Nach erneuter Herausforderung (Tag 61) mit 1 « 10 lebensfähigen Tumor-Zellen blieben 80 % (12/15) der Tiere nach der erneuten Herausforderung 37 Tage lang tumorfrei.

Von den Tieren, die nach der Dosierungstabelle (c) behandelt mirden, nach welcher das Polymere von Beispiel 7~ Tabelle VI-A sowohl vor, als auch nach der Tumor-Herausforderung verabreicht wurde, blieben 28 % (IO/36) bis sum Tag 58 resistant, und alle diese tumorfreien Tiere waren gegenüber einer sekundären Tumor-Herausforderung immun.

1 85

Das Polymere aus Beispiel 7-Tabelle VI-B mirde nur an Mäusen untersucht, die mit 1 χ 10 lebensfähigen mKSA-TÜ5-Z©l len (SC) (vgl. Tabelle VIII-B) geimpft worden *raren. Bei Verwendung der Dosierungstabelle (a) blieben 22 $ (4/18) der Mäuse während 51 Beobachtungstagen tumorfrei. Bei Verwendung der Dosierungst&belle (b) blieben 22 % (4/18) der Tumor-herausgeforderten Mäuse ebenfalls 51 Tage lang frei von Tumor. In der Gruppe (c) blieben nur 11 % (2/18) der Tiere 51 Tage lang tumorfrei. Am Tag 5^ wurden alle vorstehenden tumorfreien Mäuse (10/5*0 mit 1 χ 10 lebensfähigen BiKSA-TUS-Zellen (SC) erneut herausgefordert, und es blieben alle 10 Tier® gegenüber der erneuten Turaor-Herausfarderung 37 Tage lang turaorfrei (d.h. immun).

Das Polymere aus Beispiel 7~Tabelle VI-D wurde bei Tumor-HerausforderungBschwellen wie das Polymere J-Yl-k oben (vgl. Tabelle "VTII-D) untersucht* Da es ein viel höheree Molekulargewicht als die Polymeren der Beispiele 7& oder 7B hatte, betrug die Dosis für das Polymere 7D_S das intraperitoneal verabreicht wurde, 75» 50 und 25 iag/kg_p wie dies angemerkt ißt» Mit der Behandlungstabelle (a) blieben 11 % (k/36) der· Tumor-berausgeforderten Mäuse nach 36 Beobachtungstagen tumorfrel» Von diesen blieben 75 % : (3A) nach 37 Tagen der sekundären Tumor-H^rausforderung tumorfrei. Bei der Dosierungstabelle (b) blieben 8 % (3/3β)

2 185

der Tiere 36 Tage nach der ersten Tumor-Herausforderung tumorfrei und lediglich eines davon war gegenüber einer Bekundären, erneuten Tuinor-Herausförderung immun. Bei der Dosierungetabelle (c), wo das Polymere 7-VI-D sowohl vor als auch nach dem Tumor verabreicht worden war, blieben 1Ί % (5/36) 36 Tage tumorfrei und V von diesen 5 (80 %) waren gegenüber einer sekundären, erneuten Tumor-Herausforderung immun.

Die Gesamtzahlen der· tumorfreien Tiere in den Tabellen VIII-A, VIII-B und VIII-D am Ende der entsprechenden Beobaehtungeseiträume stammten aus jswei Quellen, nämlich

(a) von solchen Tieren, die über den gesamten Beobachtungsseitraum hinweg tumorfrei waren, und

(b) von solchen Tieren, die während des BeobaehtungSEeitraums meßbare Tumore entwickelten, die sich ansehliessend Eurückbildeten und vor dem Ende des Beobachtungs-Eeitraums verschwanden.

Ein Durchbruch der surückgebildeten Tumore gegenüber denen, die ohne Rückbildung die ganse Zeit tumorfrei blieben, geigte sowohl ein© Abhängigkeit von der Tumorbelastung und von dem eingesetzten Polymeren an. Die Durchbruch-Übersicht von surückgebildeten Tumoren aus der Gesamtzahl der tumorfreien Tiere wird in der Tabelle VIII-rE geneigt«

Tabelle VIII

	Polymeres	Tumordosis- Belastung	Völlig tuxnorfr©!**	Zurück gegangen® Tumoren4**	Gesamt	JC Zurückgegangen
Ergebnisse aus Taball©	Beispiel 7 ~	1 χ 103	8	10	18	56
TLII-A	Tabelle VI-A	1 χ IO*	_o	ÜL		100
		Gesamt	8		42	81
	Beispiel 7 -	1 χ 105 •		NU«*»	NU«*»	NU·*»
αΐΐ-Β	Tabelle VI-B	1 χ ICT	_J.		10	52
		Gesamt	1	9	10	90
	Beispiel 7 -	1 s 103	10	O	10	* O
nii-D	Tabelle VI-D	ίχίΟ4	_0		-1	100
		Gesamt	10	2	12	17

Tumorfrei während des gesamten Beobachtungsseitraums - nicht zurückgegangen. Entwickelte Tumoren, die am End© des Beobachtungsseitraums auf Null zurückgegangen sind. Nicht untersucht.

1 as

Beispiel 1.0

Die polymere Zubereitung von Beiepiel 7-VI-A wurde erneut wie in Beispiel 9 oben untersucht, mit der Ausnahme, daß 10 Mäuse pro Versuchsgruppe eingesetzt und nur die Behandlungsschemata (a) und (b) verwendet mirden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX Eusammengefaßt.

Bei Verwendung der Dosierungstabelle (a)_swo das Polymere am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tumor-Reisbehandlung verab reicht wurde, blieben 37 % (22/60) der Tumor-herausgeforderten Mäuse über einen Beobachtungsseitraum von öl Tagen hinweg tumorfrei. Am Tag 62 mirden 21 der turaor-frelen Tiere erneut mit 1 * 10 xaKSA-TÜ5-Tumor-Zellen (SC) herausgefordert und nach i^eiteren 30 Tagen waren 90 % (19/21) der Mäuse tumorfrei (immun)»

In der zweiten Dosierungstabelle (b), wo das Polymere an den Tagen 1 und 9 nach der Tumor-Reisbehandlung verabreicht wurde, blieben 4? % (28/60) der Mäuse über einen Beobachtungsseitraum von 6l Tagen hinweg tumorfrei. Von aen 28 tumorfreien Mäusen (nach 61 Tagen) blieben 6*5 % (18/28) während 30 weiterer· Tage im Anschluß.an eine sekundäre, erneute Tumor-Reisbehandlung immun.

Tabelle IX

LKSÄ-TÜ5·

TUtaor

Untersuchte

Verbindung

Dosis (mg/kg)

Behandlungsplan

Tumorwachstum beim Empfänger bis Tag

Tumorfrei bis Tag

SCπ η ti

ft π

. % lose

B Π

Kontrolle

Beisp.7 - Tabelle VI-A

Polymeres

Kontrolle

Beisp.7 - Tabelle VI-A

Polymeres

π ft

w η

250 125

62,5

250 125 62,5

Tage -9 und -1

Tage Ί-l und +9

250	5	Tage	-9	und	-1
125			π
62,			w
250	5	Tage	41	und	♦9
125		a
62,		tt

10/10

8/10

10/10

7/10

6/10 6/10 7/10

5/10

7/10 4/10 2/10

7/10 5/10 1/10

2 0 3

6 8

3 5 9

-es-. 218540

Beispiel 11

Die polymere Zubereitung von Beispiel 6a, ein EHA in fester Phase mit gasförmigem Ammoniak ohne Zusatz von Wasser behandelt, wurde an BALB/c-Mäuse unter Verwendung der Dosierungsschwellen und der Behandlungsschemata von Beispiel mit 10 Mäusen pro Testgruppe verabreicht. Die nach 6ltägiger Beobachtung erhaltenen Daten sind in der Tabelle X susamaengestellt. Bei Verwendung der Behandlungstabelle (a), wo das Polymere 6a am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tumor-Reisbehandlung mit mKSA~TU5-Tumor-Zellen verabreicht worden war, blieben *}O % (2^/60) der Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei.

Bei Verwendung der Behandlungstabelle (b), wonach das Polymere 6a am Tag 1 und am Tag 9 nach der Tumor-Impfung verabreicht worden trar, blieben 32 % (19/60) der einer Tumor-Reisbehandlung unterzogenen Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei. Von den nach 61 Tagen insgesamt ^3 tumorfreien Mäusen aus den Gruppen (a) plus (b) blieben 36 oder 87 % gegenüber einer sekundären Tumor-Reizbehandlung mit lebensfähigen Tumor-Zellen (1 « 10 -Zellen) für einen Zeitraum von 30 Tagen immun.

Tabelle X

XSA-TU5-

Untersucht©

Verbindung

Dosis (mg/kg)

Behandlungsplan

Tumorwachstum beim Empfänger bis Tag

Tumorfrei bis Tag

χ 10'	Kontroll®
SC	Beispiel 6a
ts	Polymeres
R	π
Κ	π
K	B
H	fi
Π	R
ζ ΙΌ3	Kontrolle
SC	' Beispiel 6a
η	Polymeres
Tf
«
	η
»	π
	It

250 125

250

125 62

250

125 62

250

125

Tage -9 und -1

π η

Tage +1 und 4-9

Tage -9 und -1

Tage +1 und +9

9/10

8/10	2
9/10	1
9/10	1
7/10	3
6/10
9/10	1

8/10

2/10 5/10 3/10

7/10 7/10 5/10

8 5 7

3 3

το .

- η - 2 1 § 5

Beispiel 12

Die polymere Zubereitung von Beispiel 6b, ein EMA in der festen Phase mit gasförmigem Ammoniak unter Zusatz τοη Waaser behandelt, wurde an BALB/c-Mäuse unter Verwendung der Dosisschwellen und der Behandlungstabellen von Beispiel Kit 10 Mäusen pro Testgruppe verabreicht. Die nach 61 Tagen Beobachtung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XI zusammengefaßt. Mit dem Behandlungsschema (a), wo das Polymere 6b am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tusior-Reisbehandlung mit mKSA-TU5-Tumor-Zellen verabreicht wurde, blieben 30 % (18/60) der Mäuse nach 6l Tagen tumorfreie Mit dem BehandlungBschema (b), wo das Polymere 6b am Tag 1 und am Tag 9 nach der Tumor-Impfung verabreicht wurde, blieben 17 % (10/60) der mit Tumor reisbehandelten Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei. Von den nach 61 Tagen Insgesamt 28 tumorfreien Mäusen aus den Gruppen (a) plus (b) blieben 23 oder 82 % 30 Tage nach einer sekundären, erneuten Reisbehandlung mit 1 χ 10 "-Tumor-Zellen tumorfrei.

T a b © 1 1 © XI

1KSÄ-TÜ5-Tumor

Untersuchte Verbindung'

Dosis (mg/kg)

Behandlungsplan

Tumorwaohstum beim Empfänger bis Tag

Tumorfrei bis Tag

L χ	10 τ	Kontrolle
	SC	Beispiel 6b
ι	η	Polymeres
	η	te
	η	j?
1	η	π
ϊ		π '
f	R	η
L χ	ΙΟ5	Kontroll©
	SC	• Beispiel 6b
1	Tt	Polymeres
τ	π	π
C	Jt	"
It	H	M
		J?
9	B	Tt

250 125

250

125

250

125 62

250

125 62

Tage "9 und -1

Tage +1 und -»-9

Tage -9 und -1

Tag® *1 und

10/10

8/10	2
9/10	1
7/10	3
8/10	2
7/10	3
10/10	O

K/io

8/10 4/10 6/10

8/10 10/10 7/10

6 ü

2 O 3

- '2185

Beispiel 13

Die in den Beispielen 9 bis 1.2 beschriebene Bewertung wurde auf ein zweites Tuaor-Modellsystem ausgedehnt, das ein transplantationsfähiges Fischer- (F,hj,)-StannB-Ratte-3-Methyleholanthren-indusiertes Blasenkarsinom war. Wenn dieser Tumor in normale Fischer-Ratten transplantiert wird, wächst er an dem primären Ort und metastasiert spontan in die Lunge. Außerdem wird ein rezidiver Cancer immer nach einer chirurgischen Entfernung des Primär-Tuinors beobachtet.

Die erste Untersuchung mirde eut Bestimmung der Wirkung des Polymeren aus Beispiel f-YL-A auf das überleben von an Tu-. »or leidenden Ratten und auf die Fähigkeit der Verbindung, Metastasenbildung au verhindern, geplant.

Ratten vom Fischer-Stamm, von denen $eae annähernd 250 g wog, wurde subeutan (Trokar) ein 2 χ 2 mm Tumor-Abschnitt implantiert. Nach 5» 12 und 3.8 Tagen nach der Tumor-Implantation wurden die an Tumor leidenden Ratten mit dem Polymeren in einer Dosis von 62 mg/kg durch Injektion in die Bauchhöhle behandelt. Insgesamt wurden 6 Tiere in dieser Weise behandelt. § Tiere.®it implantiertem Tumor wurden nicht behandelt und dienten als Kontrolle'. Alle Kontrolltiere gingen innerhalb 3 Wochen, oder durchschnittlich nach

15 Tagen nach der Tumor-Implantation ein. 2 der behandelten Tiere starben nach 37 Tagen. Die 4 restlichen Tiere wurden am Tag 42 nach der Implantation getötet. Eine makropathologische Untersuchung seigte, daß sie ein Hervortreten des primären Tumorwachstums aufwiesen, jedoch keine metastatische Lurigenerkrankung zeigten.

Beispiel 14

Eine aweite Untersuchung mirde zur Wiederholung des Beispiels 13 und sur Bestimmung der Wirkung einer niedrigeren Dosis und einer reduzierten Behandlungsfrequens durchgeführt» Ratten vom Fischer-Stamm erhielten den gleichen Tumor-Typ implantiert und nach 8 Tagen im Anschluß an die Implantation wurden die an Tumor leidenden Ratten mit dem Polymeren'aus Beispiel 7~YI~A in einer Dosis von 65 mg/kg oder JO mg/kg mittels einer I.P.-Injektion behandelt. Jede Gruppe umfaßte 4 Ratten« 16 Tage nach der Implantation

* erhielt die Gruppe mit der niedrigeren Dosis einen "Booster" von 30 mg/kg. Das überleben wurde während eines Zeitraums von 6 Wochen beobachtet. Nach β Wochen wurden die überlebenden "tiere auf Anwesenheit von Metastasen in ihrer Lunge überprüft* 5 Tiere mit implantiertem Tumor blieben als Kontrolle unbehandelt. Alls Kontrolltiere gingen an der Krankheit ein und überlebten di© Tumor-Implantation durchschnitt-

- rs- -218540

lieh 23 Tage. Die Tiere der Gruppe mit vier Tieren, die eine EinzeldOBis von 65 mg/kg an Polymerem erhalten hatten, waren nach ko Tagen noch am Leben und wurden dann getötet. Die Untersuchung seigte, daß keine Metastasen vorhanden waren. Aus der Gruppe, die nach l6 Tagen einen 30 mg/kg-"Booster" erhalten hatte, starben zwei am Tag 35 und 36, und die restlichen awei wurden am Tag $0 getötet. Wiederum seigte } das Untersuchungsergebnis, daß keine Metastasen vorhanden waren. Eine verlängerte Lebensdauer gegenüber den Kontrolltieren in beiden behandelten Gruppen war natürlich selbstverständlich.

Beispiel 15

Eine dritte Untersuchung wurde sur Bewertung der Fähigkeit des Polymeren aus Beispiel 7-VI-A, ein Tumor-Rezidiv bei Fischer-Ratten, deren Primär-Tumor chirurgisch entfernt worden war, su verhindern, geplant* Ratten vom Fischer-Stamm erhielten, wie in den Beispielen 13 und 14, eine Trokar-Implantation eines 2 « 2 mm-Tumor-Abschnittes. Man ließ dann den Tumor bis su einer Größe von 2 bis 3 cm Durchmesser wachsen. Zu diesem Zeitpunkt (8 Tage nach der Implantation) wurde der Tumor chirurgisch entfernt und ' gleichseitig die Ratten mit einer Einseidosis des Polymeren von 65 mg/kg oder 30 mg/kg durch I.P.-Injektion.behan-

- .21-854

delt. Hierbei waren die Ratten in swei Gruppen zu je vier Ratten eingeteilt« überleben und Tumor-Residiv wurden während eines Zeitraums von 7 Wochen beobachtet. Von der Oruppe, die 30 mg/kg des Polymeren bei der Tumor-Resektion erhalten hatte, iraren alle vier Ratten nach ^7 Tagen ohne irgendein Anzeichen eines Tuiaor-ResidivB am Leben. Von der Gruppe, die 65 mg/kg als Einzeldosis eu der Zeit der Resektion erhalten hatte, rear eine am Tag 16 nach Tumor-Rezidiv verendet, viährend die anderen drei nach kl Tagen ohne irgendeinen Anschein eines Tumor-Residivs am Leben geblieben waren.

Beispiel 16

Eine sweit-e Studie der Verhinderung eines Tumor-Residivs wurde an Fischer-Ratten in ähnlicher Weise wie in Beispiel 15 durchgeführt, Eiit der Ausnahme, daß drei Polymere Eilt verschiedenen Imid-Gehalten eingesetzt wurden. Die Gehalte an ImIa betrugen 0, 5 und 21,7 Progent. Bei dieser Untersuchung wurde die Trokar-Implantation des Tumor», wie in den Beispielen 13» I^ und 15 beschrieben, durchgeführt. Die ExEision aller Tumoren wurde 14 Tage nach öer Implantation durchgeführt*

1 Gruppe von vier Ratten wurde als Kontrollgruppe verwendet und erhielt zur Zeit der Exsision keine Behandlung.. Das

- /Tk -

- η - · 2 1854 0

Tumor-Residiv betrug 100 % an den Tagen 21, 33» 40 und 44 nach der Exsision bei einer durchschnittlichen Rezidivzeit von 34 Tagen. Aus dieser Kontrollgruppe starben zwei Ratten am Tag 44 und zwei blieben am Leben und wurden zu diesem Zeitpunkt getötet. Es wurden bei allen vier Tieren Metastasen festgestellt.

Eine zweite Gruppe von fünf Ratten erhielt eine Einseidosis I.P. von 30 mg/kg des Polymeren von Beispiel 2a (0 % Imid) zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion. Bei dieser Gruppe wurde ein Tumor-Rezidiv bei zwei Ratten am Tag 33 nach der Resektion und bei einer dritten Ratte am Tag 40 nach der Resektion festgestellt. Nach 55 Tagen hatten 3 von 5 Ratten (60 %) ein Tuiaor-Residiv. Eine dritte Gruppe von sechs Ratten erhielt eine Einseidosis I.P. von 30 mg/kg des Polymeren aus Beispiel 3» Tabelle IV-I, mit 5 % Imid-Funktionalität, sum Zeitpunkt der Tumor-Resektion. Während eines Zeitraums von 55 Tagen wurde bei keinem der Tier© ein Tumor-Residiv beobachtet», Am Tag 55 verendeten zwei dieser Ratten (ohne Tumor), und es wurde nach Prüfung festgestellt, daß keine Metastasen vorhanden waren.

Eine vierte Gruppe von sechs Ratten erhielt sum Zeitpunkt der Tumor-Resektion eine Einseidosis I,P.. von 30 mg/kg des Polymeren aus Beispiel 7* Tabelle VI-A mit einem Gehalt von

rl·

21,7 % Imid. In dieser Gruppe hatte ein Tier am Tag 21 ein Tumor-Residiv und ein zweites am Tag $3· Alle Tiere ^aren nach 55 Tagen noch am Leben. Da nur 2 Tiere von 6 ein Resi- div aufwiesen, stellt dies einen Pro sent eats von 33 % dar.

Beispiel 17

Bei den in den Beispielen 13 bis 16 beschriebenen Tierversuchen wurden Polymere verwendet, die durch Injektion in die Bauchhöhle dosiert irurden. Dieses Beispiel erläutert die Brauchbarkeit einer Imid-enthaltenden Zubereitung, die gum Zeitpunkt der Tumor-Resektion &ur Verhinderung oder Verzögerung eines Tumor-Ressidivs oral verabreicht wird. Im Beispiel 16 wurde bemerkt, daß Kontrolltiere, welche keine Droge gum Zeitpunkt der Turaor-Resektion erhielten, eine Durchschnittszeit für ein Tumor-Residiv von 3^ Tagen geigten.

In diesem Beispiel erhielt ©ine Gruppe von 10 Fischer-Ratten eine Trokar-Implantation eines Tumors wie in Beispiel 13· Die entwickelten Tumoren wurden chirurgisch am Tag 13 nach der Implantation entfernt und gleichseitig ^mrde $eder Ratte oral 1 ml steriles Wasser mit 30 Kg/kg des Imid-enthaltenden Polymeren von Beispiel 7, Tabelle VI-A (21,7 % Imid} intubiert. Tumor-Rezidive wurden dann während eines

- /hx-

Τ-ί

-*«- .21 8540

Zeitraums von IO Wochen beobachtet. Eine Hatte verendete sum Zeitpunkt der chirurgischen Tumor-Entfernung. Bei den restlichen 9 Ratten wurden kleine Tumor-Rezidive an 7 Tieren an den Tagen 42, 42, 42, 43, 46, 50 und 59 nach der Tumorexsision beobachtet. Zwei Ratten waren nach 70 Tagen frei von Tumor-Rezidiv.

Beispiel 18

Der Zweck dieses Versuches bestand darin, jeu bestimmen, ob die Einwirkung von Tumor-Zellen auf das Polymere von Beispiel 7-VI-A deren Antigemtirkung ändert und/oder eine direkte sytotozischa Wirkung auf die Tumor-Zellen hat.

Tumor-Zellen wurden aus dem in Beispiel 13 beschriebenen BLCa-Tumor durch Essision einer subcutanen Tumoraiasso hergestellte Die Zellen wurden dann durch Auszupfen der Zellen aus dem Tumor unter susätslicher sanfter Trypsinisierung der Tuniorstüeke in Suspension gebracht. Die abgetrennten Zellen wurden dreimal in ausgeglichener Salzlösung (BSS) gewaschen und sur Bestimmung des Lebend/Tot-Verhältnisses gewählt. An diesem Punkt wurde eine 90- bis 95?ige Zellpopulation erhalten.

Tumor-Zellen in einer Konsentration von 1 « 10^-Zellen pro

- /feq -

.-τθ'-. 2 1 854 O

ml, in "Eagles minimal essential media" in Earl¹» BSS, plus 10 % fötales Kalbsseruni, wurden mit 30 mg/ml des Polymeren aus Beispiel 7-VI-A inkubiert. Die Inkubation wurde bei 37°C während eines Zeitraums von 90 Minuten durchgeführt, worauf die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 g während 6 Minuten auB der Suspension abgetrennt wurden. Die Zellen wurden erneut auf Lebensfähigkeit geprüft, die sich von der Vorinkubationshöhe nicht verändert hatte. Das Verfahren wurde bei drei getrennten Gelegenheiten wiederholt.

Zellen aus diesem Versuch wurden männlichen Fischer-Ratten ßubcutan In einer Dosis von 1 * 10 -Zellen injisiert. 5 Tieren wurden mit Polyinerem behandelte Zellen injisiert und diese Tiere mit 5 Tieren verglichen, die Tumor-Zellen erhielten, die wie oben behandelt worden waren, jedoch ohne sugesetstes Polymeres. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XII niedergelegt.

Tabelle XII

_{R fc}. _s Kontrolltiere® Versuchstiere**®

„„ Tage Eur Entwicklung eines 2-3 cm großen Tumors

1 11 ti

Z 11 ίί

3 *5 ¹^

k 11 . * 11

5 13 Ii

.». 218540

Fußnoten su Tabelle XII:

* 1 χ 10 -Tumor-Zellen, nicht inkubiert mit Polymerem, geimpft SC.

1 « 10 -Tumor-Zellen, vorinkubiert mit Polyraerem aus Beispiel 7-VI-A, geimpft SC.

Es war kein Unterschied Epischen diesen Tieren in der Zeit der Tumorentwicklung. Weiterhin >rar das Wachstumsrauster dee Tumors im Anschluß danach bei den swei Gruppen vergleichbar. Die Schlußfolgerung aus diesen Versuchen ist die, daß bei den angewandten Dosen das Polymere aus Beispiel 7-Tabelle VT-A (21,7 % Imid) keine direkte sytotoxische Wirkung auf BLCa-Tumor-Zellen hatte. Zusätzlich ändert ©ine Vorinkubation des Polymeren mit den Tumor-Zellen die Antigenwirkung der Tumor-Zellen nicht.

Beispiel 19

Die direkte Toxisität des Imid-enthaltenden Polymeren aus Beispiel 7"VI-A wurde an normalen männlichen Fischer-Ratten bestimmt. Sowohl die I.P.- und die I.V.-Injektion des Polymeren bestand aus annähernd 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, welche die geeignete Menge an Polymeren! enthielt. Zur Bestimmung der Toxisität mirde das Polymere in Dosen von 100 mg/kg mit ansteigenden Inicrementen zu. 100 rag/ kg bis su 1000 mg/kg an fünf Tiere in jeder Dosisgruppe

verabreicht. Das Polymere wurde sowohl intraperitoneal, als auch intravenös verabreicht. Bei Tieren, denen das Polymere auf intraperitonealera Wege verabreicht mirde, waren innerhalb der Beobachtungßjseit von 30 Tagen bei einer Gesamtmenge von 50 Ratten weder Toxisität noch Todesfälle festzustellen. Toxizltät wurde jedoch beobachtet, wenn das Polymere in Dosen su 800 mg/kg und höher auf intravenösem Weg verabreicht wurde. Eines aus fünf Tieren bei 800 mg/kg, »wei aus fünf Tieren bei 9Q0 mg/kg und vier aus fünf Tieren bei 1000 tag/kg schienen bei intravenöser Verabreichung des Polymeren Konvulsionen su entwickeln und verendeten. Keine Tosisitfit oder Todesfälle ^nirden bei Tieren beobachtet, denen intravenöse Dosen von 700 mg/kg oder weniger während des BeobachtungSEeitr&ums von 50 Tagen (35 Tiere) verabreicht worden waren«,

Nach Ende des 30tägigen Beobaehtungsseitr-aums wurden die 85 überlebenden Ratten getötet, und das Gehirn, die Lunge, das Hers, die Leber, die Niere und die Mils von jeder Ratte makro- und mikropathologißch untersucht. Es wurden in keinem der Organgewebe mit der verabreichten Droge assosiierte Abnormalitäten beobachtet.

Bei einer anderen Untersuchung wurde die Toxisität des obigen, I.P. verabreichten Polymeren mit der oralen Verabrei-

21 8540

chung verglichen. Daß Polymere aus Beispiel 7-VI-A wurde in Dosen von 100 mg/kg, 500 mg/kg und 1000 mg/kg entweder durch Injektion (I.P.), oder durch eine Magensonde (P.O.) an jede von fünf Fischer-Ratten pro Dosierungsgruppe verabreicht.. Die Ratten wurden 1*1 Tage lang beobachtet, wobei keine Todesfälle oder ein Auftreten von toxischen Erscheinungen eintraten. Nach 14 Tagen wurden alle Tiere, und Bwar sowohl die der I.P.-, als auch der P.O.-Verabreichungsgruppe, getötet, und das Gehirn, die Lunge, das Hers, die Leber, die Niere und die Milz eines jeden Tieres makro- und laikropathologisch untersucht. Wiederum waren kein© Abnormalitäten in irgendeinem der Organgewebe eu verzeichnen.

Beispiel 20

Polymere der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Beispielen 3 und *f beschrieben werden, wurden in normalen L©vfis-Ratten auf ihre Fähigkeit hin abgeschätzt, Immun-Reisbeantwortungen vermittels wachsender 19-S (IgM)-Antikörper produzierender Zellen eu heterologen Erythrozyten (Rote Schafsblutsellen, SRBC) durch die Standard- "Jerne Plaque"-Bestinnnungsmethode eu stimulieren. Vgl.: "Textbook of Immunology"» J.T. Barrett, CV. Mosby Company, 1978, und *Immunology*¹, H.N. Eisen, Medical Department, Harper and Row Publishers Inc«, 197¹J. Bei einem typischen Test wird ein Tier,

in diesem Falle L@wis-Ratten, iait 1 ml einer 1:5~Verdünnung von gewaschenen SRBC in physiologischer Kochsalslösung über die Schwanzvene iinmunisiert. Zur gleichen Zeit werden den Tieren I.P.-Injektionen des angegebenen Polymeren in 1 ml phyßiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Nach ή Tagen wird von den Milz-Zellen aus den israunisierten Tieren eine Kultur in einem Agarose-Oewebe-Kultursystem ait SRBC angelegt. Das Gewebe-Kulturmedium unterstütst das Wachstum und die Ausscheidung von Antikörper durch die Antikörper synthetisierenden Zellen. Diese Antikörper diffundieren aus der Ausgangsgelle und heften sich an die Naehbarerythroayten an. Seruiakompliraent (normales MeerschWeinehenserujn) wird sur Förderung der Lysis der RBC (Rote Blut-Eellen) Eugegeben, die mit Antikörper unter Bildung einer klaren Fläche oder Plaque um die Antikörper-bildend© Zelle herum überzogen worden sind. Derartige Plaquen (PFC) werden gewählt und als Anzahl der PFC pro i χ 10 ~i4ilg-Zellen angegeben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XIII susamraengefaßt. Alle polymeren Zubereitungen.in der Tabelle XIII wurden bei 30 rsg/kg untersucht.

Tabelle XIII

	Prozent Imid aus IR- Imid/Amid- Ve rh.	Durchschnittliche Gesamtsahl der Tiere	IgM PPC/ f- 1 χ 10° Milzsellen	Stimulationsindex·
Polymer-Quelle aus Beispiel Nr.	-	16	568	1,00 .
Keine (Kontrollvers.)	0	10	1564	2,75
2a	5,3	6	1446	2,54
3-IV-l	6,5	6	1478	2,60
	11,5	10	1620	2,86
3-IV-3	16,5	10	1770	3,12
'3-IV-4	16,0	6	1866	3,28
— .	24,1	10	1968	3,46
3-Γ7-6	24,4	6	1984	3,49
~~	28,2	10	1992	3,51
3-17-7	32,6	6	1268	2,23
	34,7	10	1664	2,93
3-IV-8	50,1	10	926	1,63
3-IV-9

Kontrolle * ι OO

-E- 218540

Beispiel 20-A

In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Wirkungen des Polymeren aus dem Beispiel 7-Tabelle VI-A auf die IgM-Antikörpei—Reizbeantwortung auf SRBC-Antigen (wiederum unter Verwendung der "Jerne Plaque"-Bestimmungsmethode, wie in Beispiel 20)

(1) bei normalen Lewis-Ratten mit entweder I.P. oder oral verabreichtem Polymeren, und

(2) in LeidLs-Ratten als Ersats für die Thymus-Funktion, wiederum mit dem entweder I.P. oder oral verabreichtem Polymeren,

abgeschätzt* Im Falle (1) wurde das Verfahren gemäß dem Beispiel 20 durchgeführt. Im Falle (2) miröe die normale Thyinus-Funkt ion durch Thymektomie (Ts) bei erwachsenen Tieren beseitigt, was chirurgisch in einem Alter von 8 bis 3.2 Wochen und hohen Dosen einer Gansbestrahlung (TBI), gefolgt von einer KnochenmarkEellen-Repopulation (BM) durch™ geführt wurde. Die Thymektomie, die Gansbestrahlung und die Knochenmarksellen-Repopulation wirden alle nach Standard-Verfahren durchgeführt, wie sie von PaIk, R.E, et al., Surgery, Oktober (1978), PaIk, R.E. et al., Abstract, Canadian Society for Clinical Investigation, Jan. 2*1-27, 1978, Vancouver und PaIk, R.E. et al., Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, Jan. 25-28^ 1978, Vancouver,

185

beschrieben worden sind.

In diesen Verfahren wurden die TBI und die BM-Repopulation

am Tag nach der chirurgischen Thymektomie durchgeführt.

137

Zur TBI mirden die Tiere unter Verwendung einer Cäsium-Quelle (Atomic Energy of Canada) bestrahlt. Die Bestrahlungsdosis in dieser Vorrichtung ist durch den Lieferanten geeicht und wird in einer gleichmäßigen WeiBe auf die gesamte Körperoberfläche der in dem Behälter placierten Tiere aufgebracht. Für die BM-Repopulation werden Suspensionen von Einzelteilen von Knochenmarkzeilen durch Waschen der Röhrenknochen des Femura und der Tibia in der Ratte mit einer ausgeglichenen Salzlösung (BSS) bei ¹I⁰C hergestellt. Die Zellen werden dreimal in BSS gewaschen und in einem Hämocytometer sur Bestimmung der Lebensfähigkeit und der geeigneten Zellverdünnung gesählt. Die Zellen wurden I.V. unter Vertfendung von Präparaten verabreicht_s die ein© Lebensfähigkeit ¥on mehr als 90 % aufwiesen. Bei jeder Ratte betrug die BM-Repopulation i χ 10-Zellen.

Die Mortalitätsrate der Tiere für das gesamte Tx + TBI * BM-Verfahren war kleiner als 10 %, Man ließ diese Tiere sich dann während eines Zeitraums von 6 Wochen vor den Versuchen der IgM-Antikörper-Reiabeantwortung auf SRBC erholen. .

^8>. 2 185

Nach der Erholungsperiode wurde das Polymere von Beispiel 7-Tabelle VI-A und das SRBC wie in Beispiel 20 verabreicht. Die Ergebnisse des GesfuatverBucb.es sind in der nachfolgenden Tabelle XIU-A niedergelegt.

Beispiel 21

Neun Polymere mit variierendem Iiaid-Öehalt (0 bis 35 %)_t und identisch mit vielen von denen in Beispiel 20, Tabelle XIII beschriebenen, wurden in Pischer-Ratten auf ihre vergleichbare Leistung in der Verhinderung eines Residivs von primärem BLCa-TuEor nach Tumor-Resektion als Punktion des prosentualen Imid-Gehalteß bewertet. Das Versucheverfahren entspricht dem in den Beispielen 15» 3.6 und 17 beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, daß in diesem Falle 10 Ratten für all© Dosiegruppen und Kontrollgruppen eingesetzt Vücid die verschiedenen. Imid-Zubereitungen sowohl in einer Dosis von 30 mg/kg, als auch in einer Dosis von 15 mg/kg durch I.P„"Injektion in 1 ml Kochsalslösung verabreicht mjtr&en. Die Kontrollfciere erhielten nur 1 Eil Koehsalslö&ung I.P, An eine Gruppe zu 10 Tieren mirden 30 mg/kg des Polymeren aus Beispiel 7-VI-Ä (21*7 % Imiö) oral verabreicht„ wie dies besonders vermerkt sei. Alle Tumoren wurden chirurgisch 11 Tag® nach der Trokar-Implantation entfernt, und die Dregen mirden in Einselöosen wi© oben am Tag 1

Tabelle XIII - A IgM-Antikorper-Relsbeantwortung von Lewie-Ratten

Polymeres

Tierbehandlung

Ansahl der Tiere

Dosis (mg/kg)

Weg Mittler® Reisbeantwortung

PFC/1 s

Stimulations-

Keines

Seispiel.7 -

Tabelle VI-A

Beispiel 7 Tabelle VI-A

Keines

Beispiel 7 -v Tabelle VT-A

Beispiel 7 Tabelle VI-A

Normale unbehandelte Kontrolltiere

Normal

Normal

Tx, 95OR, BM Kontrolltiere··

10 10

10 10

10 10

30*/oral

30^#/I.P.

30^e/oral17*1,2

836,0

865,6 73,6

7*0,4

4,78 4,96

10,10 6,42

Ähnliche Ergebnisse wurden mit Dosen von 15 mg/kg erhalten,

Tx « Thymusentfernung R * Rad Ganzbestrahlung BM a Rekonstituiertes Knochenmark

Kontrolle « 1,00

2 1 85

nach der Tumorexsision verabreicht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XIV niedergelegt. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, daß die durchschnittliche Tagesansahl für ein Tumor-Rezidiv für die 10 Kontroll tiere 32,3 betrug, was mit dem Kontrolldurchschnitt von 3*1 Tagen (*i Ratten) in Beispiel 16 gut vergleichbar ist.

Beispiel 22

EMA mit 100 % Imid (spezifische Viskosität « 0,66) aus Beispiel 5~A wurde hinsichtlich seiner Tuiaorwachs turns-Inhibierung in einem unabhängigen Untersuchungßlabor nach dem folgenden Verfahren bewertet.

Festes Sarcoma 180 wurde mittels Trokar (2 mm Durchmesser) in die Planke von männlichen schweißer Mäusen implantiert. Das Polymere aus Beispiel 5~A wurde durch I.P.-Injektion in der angegebenen Dosierung in 0,5 BiI Kochsalslösung an sechs aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, beginnend mit dem Tag 1 nach der Tumor-Implantation» Gruppen von 5 Musen erhielten Dosen zu 25, 50 und 100 mg/kg, wie beschrieben. Höhere Dosen; 200, 400 und 800 mg/kg erwiesen sich als toxisch, wie angegeben. Am Tag nach der letzten I.P.-Drogeninjektion wurden die Tiere getötet, der Tumor durch Obduktion entfernt und gewogen. Die Tumor-Inhibierung

Tabelle XIT

Polymer-Nr. Quell® Beispiel

Prosent

Imid (mg/kg)

X « 1

Ansahl der Tiere mit Tumor-Residiv

nach X Wochen nach Tumor-Resektion 3 4 5 6 7

10

Kontrolle

2a 0

3-rv-i

3-IV-4

6® 7-VI-A-3-IV-6

5,3

6,5

16,5

21,7

24,1

,4

3-IY-7 ' 28,2

3-IY-8

34,7

15

30 15

30 15

30 15.

30

30 • 15

30 15

30 15

30 15

2 2 2

0 2

0 0

0 0

0 0

0 0

1 0

0 1

.3

3 3

0 1

0 1

0 0

3 1

2 1

5 3

0 2

0 2

1 0

0 3

5 2

10 3 5

1 2

0 3

0 2

1 1

0 5

5 3

3 5

1 2

0 3

0 2

1 1

0 5

5 3

4 6

1 2

0 3

0 2

1 2

3 3

2 2

1 5

0 2

1 2

1 6

6 6

5 7

3 3

0 3

1 2

6 7

4 4

In Beispiel Nr. 6 oral, in allen anderen intraperitoneal verabreicht. Alle Gruppen von 10 Ratten

pro Dosis.

94 ' - 92 -

wurde berechnet als Present der Tumorgewichtö von behandelten Tieren, geteilt durch die Tuiaorgewichte der Kontrolltiere. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XV Busammengefaßt, aus denen hervorgeht, daß das EMA ait vollen 100 % Imid keine Aktivität aufweist.

Beispiel 2J>

Ein bevorzugtes Polymeres der vorliegenden Erfindung wurde in normalen männlichen Lewis-Ratten auf eine mögliche Aktivität hinsichtlieh der Erhöhung der Anssahl der peritonealen Makrophagcn und deren Aktivität, Polystyrol-Latexteilehen EU phago sy tieren, untersucht, was bereits für eine Ansahl von ImmunsyBtem-Modulatoren, wie Bacillus Calmette-Querin (BCG), Pyran-Copolyraerss und andere derartige Fdttel_$ ge~ Eeigt worden ist.

An vier Gruppen su sechs jungen Erwachsenen (2 bis 4 Monate alt) normalen männlichen Lewis-Ratten wurde die Droge oder Kochsalzlösung (Kontrollversuche) wie folgt verabreicht; Die Gruppe 1 erhielt i ml Kochsalzlösung auf I.P.Wege. Die Gruppe 2 erhielt das Polymere von Beispiel 7~T&bel-Ie VI-A in einer Dosis von 50 mg/kg in I ml Kochsalslösung, I.P. verabreicht. Die Gruppe 3 erhielt öas Polymere des Beispiels 7~Tabelle YI-A in einer Dosis von 30 mg/kg in

- /93. -

T a b e 1 1

Arsneimittel- Doais (ag/kg)®	Mäuse Beginn	Mäuse Ende	Anfängliches Durchschnitts gewicht (g)	Durchschnitts gewicht nach Beendigung (g)	> . Durchschnittlich exzidiertea Tumorgewicht (g)	Inhibiertmg Versuch/Kontrolle (?)	*	^V Ti %l· wP
25	5	5	27,0	31,4,	1074,4	-9	-
Kontrolle	5	5	27,6	32,2	985,4	-	- .
50	5	5	26,8	34,0	724,4	♦26
Kontrolle .	5	5	27,6	32,2	985,4	-
100	5	5	26,8	31,0	587,6	-16
Kontrolle	5 '	5	29,0	32,3	505,8	-
200	5	2	60 % der Tiere	verendeten.		nb··
Kontrolle	5	5	29,0	32,3	505,8
400	5	3	HO % der Tiere	verendeten.
Kontrolle	5	5	27,6	32,2	985,4
800	5	0	100 % der Tiere	verendeten.
Kontroll®	5	5	27,6

• Männliche schweizer Mäuse. S-I80 durch Trokar SC. Dosis verabreicht an 6 aufeinanderfolgenden Tagen I.P. in 0,5 ml Kochsalzlösung nach Tumor-Implantation. Tiere wurden am Tag nach der letsEten Injektion des Mittels getötet.

⁹ Nicht berechnet wegen akuter Toxiaität.

1 ml Kochs als lösung j, oral verabreicht, und dia Gruppe H erhielt 0,1 mg BCQ in 1 al Kochsalislösung, I.P. verabreicht.

An den Tagen 1, 3 und 5 nach der vorstehenden Verabreichung wurden zwei Tiere aus jeder der vorstehenden vier Gruppen getötet und die Bauchhöhlen-Zellen entnommen. Dies© Entnahme ging nach folgendem Verfahren vor sich. 100 ml gekühltes RPMI 1640-Mediura wurde I.P. injisiert und nach sanfter Massage die.gesamte Bauchhöhlenflüssigkeit abgesogen, und die Zellen aus jeder einzelnen Bauchhöhle durch Ausschleudern bei 1000 UpM abgetrennt. Diese Zellen wurden mit NSK (nicht spezifische Esterase)-Färbstoff gefärbt und dreimal lait gekühltem (*?°C) Medium gewaschen. Schließlich wurden die Zellen aus jeder einselnen Bauchhöhle in 10 ml Medium suspendiert und geEählt, um die durchschnittliche Ansah! der Zellen, bestehend aus 80 bis 95 % Phagozyt, erhalten aus jeder Bauchhöhle als Punktion des vorstehenden Gruppen-Typs der Behandlung und Zeit (Tage) nach der Behandsu bestimmenο

Die Latexteilchen-Phagosjrtoso-Aktivität eines jeden Satses an Bauchhöhlen-Zellen %rurae wie folgt bestimmt. Eine Suspension der vorstehenden Zellen wurds in einer Kongentration von *!0 bis 50 Millionen Zellen pro ml eines SO^igen Fötal-Kalbserums plus RPMI-Medium in einem 5 ß*X Reagens-

!>- 21854

rohr hergestellt. Zu der Suspension wurden 100 lamda Polystyrollatex (10 % Peststoffe, TeilchendurchmesBer * 1 Mikron, Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana) zugegeben und die Mischung 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann ausgeschleudert, dreimal mit RPMI-Medium gewaschen und schließlich erneut in 0,5 ml Kochsalzlösung suspendiert. Es wurden dann Objektträger mit den Zeil-Suspensionen hergestellt und mikroskopisch untersucht, um das Ausmaß der Latexteilchen-Phagosytoae in die Phagosyt-Zellen zu bestimmen. Diejenigen Zellen, die 10 oder mehr Latexteilchen enthielten, mirden als positiv angesehen, und die GesamtEahl derartiger Zellen (die 10 oder mehr Latexteilchen enthielten) als Prosent der Ges&mt&nsahl der Zellen in der Suspension angegeben.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle ΤΠ. für zweifach ausgeführte Versuche angegeben.

Die Ergebnisse in der Tabelle XVI seigen schlüssig, daß das bevorzugte Polymere dor Yorliegenden Erfindung die peritonealen Makrophagen nicht über die Kontrollierte hinaus erhöht, wenn es entweder I.P. oder oral verabreicht wird, und daß ferner die L&tex-Phagozytose-Aktivität derartiger peritonealer Makrophagen gegenüber der noiiaalen Makrophagen-Akfcivität nicht erhöht ist. Im Gegensats hiersu erhöhen,

Tabelle XVI

Peritoneale Phago&ytensahl und Aktivität nach	Kontrolle (1,0 ml Kbcbsalslsg.)	V © r ι	Behandlung gemäß der	Beschreibung in	Beispiel 23
	Bsp.7-VI-A, 30 mg/kg, I.P.% " · 1	Ansah! der Z®1 aus jeder Bauchhöhle χ	luch 1	V e r s u	cn 2
Tötungstsg tee Mittels	B8P.7-VI-A, 30 mg/kg, Oral®	10 18	Lot ex-Aufnahne	Anzahl der Zellen aus jeder , Bauchhöhle χ 10ö	.Latex-Auftiahae
BCQ, 0,1 mg, I.P..	5 9	2εη 55 der Zellen * mit übor 10b 10 Latexteilchen	3 3	% dsr Zellen B&t Übsr 10 L&tsxteilchen
Kontrolle (1,0 ml Kocbsalzlsg.)	7 β	25 31	11 13	29 21
• Bsp.7~VI-A, 30 mg/kg, I.P.· 3	27 33	27 27	1} 6	30 25
Bsp.7-Vl-A, 30 mg/kg, Oral®	5 β	27 31	26 28	20 15
BCQ, 0,1 mg, I.P.	3 β	97 97	5	90 ' 84
5 5	8 11	8 8	20 · 15
4 8	11 8	8 6	30 15
20 8	β 15	11 10
9 13	. 25 32

T a b e 1 1 ο XVI (Fortsetzung)

Tötungstag nach Verabreichung des Mittels

Behandlung

Versuch

Versuch

Latex^Aufnahna Latex-Aufnahme

Anzahl der Zellen % der Zellen Anzahl der Zellen % der Zellen

aus jeder g mit üb€r aus jeder g mit Ober Bauchhöhle χ IO 10 Latexteilchsn Bauchhöhl® χ 10 10 Latexteilchen

Kontrolle (1,0 ml Kochsalslsg.)

B8P.7-VI-A, 30 mg/kg, I.?.'

Bsp.7-VI-A, 30 mg/kg, Oral*

BCG, 0,1 mg₉ I.P.

3	26
2	28
5	15
6	37
2	45
13	37
3	26
6	38

1 1

5 3

2 7

16 7

10

15 11

20 25

Zellen vom Lymphosyt-Typ wurden bei allen Tieren, die mit dem Polymeren aus Beisp.7-VI-A behandelt worden waren, aus Mils, Thyinus, Lymphknoten und Knochenmark extrahiert, und es wurde in keinem Fall irgendein© Phagosytose-Aktivität bemerkt, die größer als bei ähnlichen Zellen, die von den Kontrollratt©n erhalten wurden, war.

-'.2t 8540

wie dies durch die Ergebnisse bei BCG geseigt wird, andere lESfflunsystem-Modulatoren die Ansahl der peritonealen Makrophagen sehr stark, und es haben derartige Makrophagen eine stark erhöhte Latex-Phagoaytose-Aktivität. Diese hohe Aktivität geht nach 3 Tagen und langer auf normale Werte surück«.

Im Gegensatz su den vorstehenden Ergebnissen, welche zei gen, daß die Polymeren der vorliegenden Erfindung die Makrophagen-Punktion nicht aktivieren, ist aus den Ergebnissen in den Beispielen 20 und 20A eu ersehen, daß diese Polymeren ungeachtet dessen als B-Zellen-Modulatoren in normalen Tieren wirken und die B-Zellen Antikörper-Reisbeantwortung Etimwlieren, wenn Bie entweder I.P. oder oral verabreicht werden. Ferner wird diese Wirkung sogar in Abwesenheit der Thymus-Funktion beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Polymeren der vorliegenden Erfindung als Thyraus--Funktion·" Ersats bei der Aktivierung von B-Zellen für eine erhöhte Antikörperbildung; wirken«

Es können durch Ersatz von anderen, im wesentlichen gleichwertigen Materialien für die in den vorstehenden Beispielen angeführten Materialien viele andere Beispiele ausgeführt werden, i?elche die · Erfindung weiter erläutern.

So kann, in den vorstehenden Beispielen Propylen für eine

218540

äquivalente Menge Äthylen als Erläuterung der definierten Olefinmonomeren mit im wesentlichen ähnlichen Ergebnissen eingesetzt werden.

Ferner kann auch mit im wesentlichen ähnlichen Ergebnissen in den vorstehenden Beispielen Citraconsäureanhydrid für eine äquivalente Menge Maleinsäureanhydrid als erläuternd für die definierten Polycarbonsaureanhydride eingesetst werden.

Durch LÖBungsmittel-NichtlösungsKittel-Praktionierung des oben im Beispiel 1 hergestellten EMA-Polymeren können Polymere von noch niedrigerem durchschnittlichen Molekulargewicht hergestellt werden. Dieses Polymere von niedrigerem Molekulargewicht kann dann in den vorstehenden Beispielen mit im wesentlich ähnlichen EBgebniesen anstelle einer äquivalenten Menge des Polymeren von Beispiel 1 eingesetzt werden*

Andere pharmaseutisch verträgliehe Salse von Imiden der Erfindung können durch Umwandlung der Aminoniumsala-Derivate in solche Salse_s wie beispielsweise Natrium- und Kaliumsal-εβ, hergestellt werden» Beispielsweise kann das Ammoniumsals-Derivat von Beispiel 3, Tabelle IV,-Versuch 4, in das Balb-amid,halb-freies carboxy!-Derivat durch Aufgeben einer

L·. 21854 0

wässerigen Lösung des Aiamohiumsalsses auf eine Säule βίηβΒ schwach basischen Kationenaustausch©^, beispielsweise Amberlit lRC-84 (vwnetstes Acryl-Copolymeres, Rohm and Haas Company) erhalten werden. Die erhaltene Lösung in der freien Carboxylforxa kann dann mit entweder NaOH bsw. KOH neutralisiert, und die neutralisierte Lösung zur Gewinnung der entsprechenden Natrium- und KaliuiaßalE-Derivate gefriergetrocknet werden.

Das EMA-Polyznere von Beispiel 1 mit niedrigem Molekulargewicht kann auch in das Halb-raonomethyl-sekundärs-amidshalbmonoffiethylamin-carboxylatsale naeh dem Verfahren von Beispiel 2(a) durch Umsetzen der Lösung von EMA und Aceton mit einer Lösung von Methylamin in Aceton, anstelle von Ammoniak in Aceton, umgewandelt werden. Das Produkt kann dann zur Gewinnung eines partiellen N-Methyl~substituiörten Imid-Derivats, das eine Imid-Punktion, als auch sekundäre Methy1-EMid-, ionisiertes C00~- und Aminearboxylat-Funktionen aufweist, in Xylol unter Rückfluß erhitst werden.

Nähere erläuternde Verfahren sur Durchführung der vorerwähnten weiteren Beispiele init äen begleitenden Ergebnissen Bind folgende:

- ιοα - * 21

Beispiel 2k

In einer ähnlichen Weiße, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein Copolymeres aus Propylen und Maleinsäureanhydrid von niedrigem Molekulargewicht hergestellt. In den Reaktor wurden 196 g Maleinsäureanhydrid, gelöst in 1600 ml Äthylbenzol, das 7»30 g Bensoylperoxid enthielt, eingebracht. Die Temperatur wurde auf 80°C und der Druck auf kO psi (2,8 kg/cm ) durch Zugabe von $2 g Propylen aus einem, auf einer Skala montierten Propylsnsylinder eingestellt. Anschließend wurde der Propylendruck auf MO psi (2,8 kg/cm*¹) während eines Zeitraums von 19 Stunden bei der Reaktionstemperatur τοπ 80°C gehalten» Am Ende des Versuches wurde die Bombe gekühlt und belüftet, und die Aufschlämmung von Propylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymerem in Äthylbensol, wie in Beispiel i beschrieben, aufgearbeitet, indem man dreimal in Xylol aufschlämmte und extrahierte, anschliessend dreimal in Hexan aufschlämmte' und extrahierte, filtrierte und bei 60°C im vollen ö!pumpen-Vakuum trocknete. Das Endprodukt bestand aus 269 g (Ausbeute 87,3 %) und eine !,O^ige Lösung in DMF bei 25°C hatte eine spezifische Viskosität von 0,0590.

Das vorstehend hergestellte Propylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere-(PMA)-Produkt mit niedriger Viskosität wurde in

AOA

das Halb-primäre-amidjhalb-aimoniuincarboxylatsalz durch exakt das gleiche (für EMA) in Beispiel 2a beschriebene Verfahren umgewandelt. Aus 26,0 g PMA mirden 36,3 g of angetrocknetes (35°C, 20 bia 25 ebb Hg) Produkt erhalten (115*5 % Ausbeute). Die funktionell© Zusammensetzung anhand der Infrarot-Analyse des Produkts zeigte nur die Anwesenheit von primären Amid-, ionisierten Carboxyl- und Ammoniumcarboxylat-Gruppen an. Eine Imid-Funktion war nicht vorhanden,

Das hergestellte Halb-.amidjhalb-ammoniumcarboxylatsalE aus PI4A mit einer spesifIschen Viskosität von 0,059 wurde in eine, partielles Imid enthaltende Zubereitung nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren umgewandelt. Eine 20 g Probe des Amid-aiaiiioniumsalEes wurde in ^00 ml Xylol aufgeßchlämmt und die Aufschlämmung wie in Beispiel 3 &ra Rückfluß erhitzt. Die Aufschlämmung t*\Arde 33 Minuten lang am Rückfluß erhitst, vrobei die Endtemperatur bei 139°C lag und 1,1 ml Wasser gesammelt wurden. Das Produkt wurde wie beschrieben aufgearbeitet, und man erhielt 15,3 g Endprodukt (Ausbeute 79*6 %). Die Infrarot-Analyse des Produkts zeigte, daß die 33 Minuten-Probe 19,0 % Imid außer der Amid und Ammoniumcarboxylat-Funktionalität enthielt. Der Prosent sats an Imid wrde in diesem Fall durch Bezugnahme auf die Standard-Imid/Ämid-Absorptionsverhältnis-iZusanmienBetKungB-

^Λαχ - - 2 1 85 4 0

kurve für EMA, wie in Beispiel 5 bestimmt. Der Pg-Wert einer 2£igen wässerigen Lösung war 5,43 vor der Einstellung und Gefriertrocknung· Nach der Einstellung auf einen p_H~Wert von 9,5, Filtration und Gefriertrocknung war der p_H-Wert 5,50, der Gehalt an Stickstoff 10,26 % und-der Imid-Gehalt 19,0 Gewichtsprosent, wie dies durch Infrarot-Analyse bestimmt wurde.

Das obige Imid-enthaltende Derivat von PMA wurde auf seine Antimetastase-Eigenschaften und nicht residivierenden Tumor nach Resektion in männlichen Fischer-Ratten unter Verwendung von BLCa-Turaor, wie in den Beispielen 13 und 15 beschrieben, bewertet. In der Kontrollgruppe ^aren 10 Tiere, die nach der TuRorexsißion (10 Tage nach der Implantation) keine Drog© erhielten und 10 Tiere, die eine Einseidosis von 30 mg/kg I.P. sum Zeitpunkt der Tuiaorexsision verabreicht, bekamen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

Beispiel 25

In ähnlicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein Copolymeres aus Xthylen und Citraconsäureanhydrid von niedrigem Molekulargewicht hergestellt. In diesem Falle bestand die Charge in dem Reaktor· aus 228,0 g Citraoonsäu-

Auftreten

eines

Residivs

Eintreten	Auftreten	überlebende
des	von Metastase	nach 16 Wochen
Todes	beim Tod

10/10

Kontrollen 10 18-50 Tage

Durchschnittl. 32,7

10/10 (residiviert) 48-67 Tage

Durchschnittl. 59 Tage 10/10 (residiviert)

3/10 3/3 (rezidiviert)

Versuch® 10 . 3Ο-38 Tage 61-70 Tage 1/3 (rezidiviert)

Durchschnittl. 3^,7 Tage Durchschnittlich 66 Tage

ag/kg, Einzisldosis, I.?. am Tag der Tumorexzision. η s Ans&hl aer Tier©.

- 21 8540

reanhydrid anstelle von Maleinsäureanhydrid, 187*1 ail Äthylbensol lind 15,6 g Bensoylperoxid in 161 ial Äthylbensol. Der Äthylendruck wurde auf 200 psi (I^ kg/cm ) gehalten und die Reaktion bei 70⁰C während eines Gesamtseitraums von 27,5 Stunden durchgeführt. Weitere Katalysator-ZuBätze wurden nach 3 Stunden und 20,5 Stunden gemacht, und zwar jeweils 10,i| g Benaoylperoxid in 108 ml Äthylbenzol. Das Äthylen/ Citraconsäureanhydrid-Copolymer-Produkt, das wie in Bei-Bpiel 1 aufgearbeitet wurde, bestand aus 73,5 g (Ausbeute

23.4 JO. Die spezifische Viskosität (1,0 % in DOT, 25°C) des Copolymeren betrug 0,0*12.

29.5 g (0,21 Mol) Äthylen/Citraconsäureanhydrid-Copolymeres mit niedriger Viekosität wurde in das Halb-amid,halbaemoniuiBcarboxylatsalE nach dem in Beispiel 2a beschriebenen Verfahren umgewandelt, w>bei man 37»O g vakuumgetrocknetes Produkt (Ausbeute 5.03,0 %) erhielt. Die Infrarot-Analyse seigtedie Gegenwart von Amid-, ionisiertem Carboxy1- und Ammoniumearboxylat-Funktionen, jedoch keine Imid-Funktionalität an. Ein partielles Imiö des Amid-ammoniumcarboxylat-Derivats wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3 durch Erhitzen einer Aufschlämmung von 20 g des obigen Amidsalses während eines Zeitraums von 30 Minuten in Xylol (400 al) unter Rückfluß hergestellt. Die Produktausbeute betrug 15,7 g (Ausbeute 83*6 %)» und das I/A-Absorp-

AqS

tions(XR)-Verhältnis war 1,21, was 31,0 % laid entspricht, verglichen mit der Standardkurve für EMA, wie in Beispiel 5 beschrieben* Der Prosentgehalt an Sticketoff betrug 9,2*5 % und ©ine 5$ige Lösung in Wasser hatte ©inen p„-Wert von 5,31.

Das vorstehende, Imid-enthaltende Produkt von mit Ammoniak behandeltem Äthylen/Citraeonsäureanhydrid-Copolyiaepem wurde in männlichen Fischer-Ratten unter Verwendung von BLCa-Tumor auf Überlebens-, Nicht-residlv-, und Antimetastsse-Eigenschaften nach Tumor-Resektion» wie in den Beispielen 13 und 15 beschrieben, bewertet· Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

B e 1 β ρ i e 1 26

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer EMA-Zube- ^: reitung mit ßehr niedrigem Molekulargewicht, die durch ^! Losungsmittel-Kichtlosungsmittel-Praktionierung von EMA- -^! Polymeren gemäß Beispiel 1 erhalten wurde. Aus 8 getrennten' EMA-Präparaten wurden 128*1 g EMA nach Trockrien Über Nacht bei 80⁰C und vollem Ölpumpen-Vakraum gesammelt. Diese 8 EMA-Produkte variierten in der spezifischen Viskosität (1 %, DMF, 25°C) von 0,051 bis 0,058 (Durchschnitt 0,053), und ihre Xquivalentgewichte variierten von 13^ bis 1^2 vor

Auftreten

eines Residlvs

Eintreten

des Todes Auftreten

von Metastase überlebende

beim Tod nach 16 Wochen

Kontrollen 10

10/10 18-50 Tag© Durchschnitt!. 32,7

10/10 (residiviert)

48-67 Tage Durchschnittlich 59 Tage

10/10 (rezidiviert)

'erauch®

¹ . 19-39 Tage Durchschnittlich 30 Tage

k/k (rezidiviert)

61-78 Tage Durschnitt1. 70,5 Tage

0/4 (reisidiviert)

⁹ 30 mg/kg₅ Einseidosis, X,P. am Tag der Tumorexzision. Tumorexsision in 10 Tagen nach Tinsorimplantierung,

⁹⁹ Ein Todesfall bei der Tumorexzision. η » Ansahl der Tiere.

4 eC *

1 854

der Lösungsaittel-Fraktionieriing«, Jeder der 8 Versuche (160 g) wurde in 500 ml Aceton gelöst und in 2,5 Liter Toluol, die während ©ines Zeitraums von 10 Minuten in einem Jj-Liter-B@cherglas heftig mit einem Lightning-Rührer gerührt wurden, ausgefällt. Das ausgefällte EMA mirde abfiltriert (wobei alle 8 primären Mutterlaugen-Filtrate für die weiter unten beschriebene Aufarbeitung von löslichem Polymeren aufgehoben tfurden), und die Feststoffe wurden einmal in 2 Liter Toluol, xind sweimal-in 2 Liter Hexan aufgeschlammt, filtriert und über Nacht bei 50°C im vollen Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Von den 8 einzelnen Versuchen wurde eine Gesamtmenge von 11^3 g des in Lösungsmittel unlöslichen EMA. erhalten, das eine durchschnittliche spezifische Viskosität von 0,057 aufwies (die 8 durch Lösungsmittel ausgefällten einseinen Versuche variierten in ihrer spezifischen Viskosität von 0,053 bis Ο,ΟβΟ).

Die Aeeton-Toluol-löslich© Polymer-Fre,ktion in den vorstehend erwähnten vereinigten, primären Mutteriaugen-Filtraten wurde durch Verdampfen aller Lösungsmittel in einem ^BRotavap^w auf einem siedenden Wasserbad bei 25 bis 30 ram Hg su einem schweren öl eingeengt« Der Rückstand wurde in 200 ml Aceton gelöst und in 1 Liter Toluol bei Raumtemperatur ausgefällt, wodurch man einen öligen-, breiigen Feststoff erhielt. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekan-

- /$09—

-218540

tiert und der Niederschlag erneut in 200 ml Aceton gelöst und in 1,2 Liter Xylol bei O⁰C erneut unter Bildung eines festen weißen Niederschlages ausgefällt. Dieses Produkt wurde abfiltriert, sweiiaal mit *J00 ml Xylol und zweimal mit 300 ml Hexan gewaschen und Ober Nacht bei 50°C in vollem Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Man erhielt 59 g Produkt mit einer spezifischen Viskosität (1 Ϊ, DMF, 25°C) von 0,031, einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 3**2 und einem Äquivalentgewicht (durch Titration) von 172,0. Der Kohlenstoff-Gehalt war 60,92, 60,6l % und der Gehalt an Wasserstoff betrug 6,03, 6,12 %.

5 g der obigen EMA-Praktion mit der speEifischen Viskosität von 0,031 und dem Äquivalentgewieht von 172 wurden in das Halb-amidjhalb-carboxylamisoniumBEls nach dem Verfahren von Beispiel 2a überführt, wodurch man 5*^ g eines ofengetrockneten Produkts (50⁰C, Pumpenvakuum) erhielt. 5 E dieses Halbamidshalb-carbosylammoniumsalses wurden nach dem Verfahren von Beispiel 3 durch Erhitzen am Rückfluß in Xylol während eines Zeitraums von 1 Stunde in das partielle Imid umgewandelt» Als trockenes Endprodukt (50⁰C, Pumpenvakuum) erhielt man 3»8 g. Diese Menge wurde in 70 g Wasser (p^-Wert 4,87) gelöst und mit NH^OH auf einen p_H~Wert von 9,¹J eingestellt, durch ein 0,2 Mikron-Filter filtriert und gefriergetrocknet« Das gefriergetrocknete Endprodukt

- /140—

Auftreten

eines Rezidivs

Eintreten

des Todes Auftreten von Metastase bein Tod

überlebende nach 22 Wochen

tontrollen*.

10/10 10 21-37 Tag©

Durchsehnittl. 29,7 Tage

10/10 (

il5-64 Tags Duröhschnittl. 53 J Tage

10/10 (rezidiviert)

6/10 10 21-60 Tage

DurchBcbnlttl» 39_S7 Tag»

S/6 (residiviert)

47-102 Tage DurchBchnittl. 71J Tage , 1/6 (rezidiviert)

® Tiimorexzision'an Tag 11 nach Tumorimplantierung. ^m 30 mg/kg, Einsaldosis, I.P.,am Tag der Tumorexzision, η « Anzahl der Tiere

AAO

hatte in 2,Obiger wässeriger Lösung einen p„-Wert von 5»1> einen Gesamtstickstoff-Gehalt von 12,27 % und einen TmId-Gehalt von 25>O Gewichtsprozent.

Das Produkt wurde unter Verwendung von FBCa-Tumor in Fischer^*!iJ-Ratten auf Überleben, Nicht-Rezidiv und AntimetastasQinach der Tumor-Resektion bewertet (vgl. vorstehende Tabelle), wie dies in den Beispielen 13 und 15 be- »chrieben wurde.

Das Produkt wurde auch hinsichtlich seiner Fähigkeit bewertet, Imiaun-Reisbeantwortungen vermittels von ifaehsenden IgM-Antikörper-bildenden Zellen zn einer Stimulation von roten Blutzellen vom Schaf (Antigen), wie in Beispiel 20 beschrieben, mit folgenden Ergebnissen su stimulieren:

IgM-PFG/

Anzahl der Ratten 1 * 10"- Indexin der Gruppe MilEsellen Kontrolle c 1,0

Kontrolle 2 63*1 1,00

Test· 4 . 1173 1>85

• 30 mg/kg, I.P.

- /112--

ΑΛΛ

Beispiel 27

Die Herstellung und Brauchbarkeit von Natrium- und Kaliumealsen der Imide gemäß der Erfindung wurde wi© folgt geseigt. Das AimBoniumsals-DeriYat mirds nach in d©n Beispielen 1, 2a und 3-IV-5 beschriebenen Methoden hergestellt und hatte (als gefriergetrocknetes Produkt) die folgenden Analysenergebnisse:

Qesamtstickstoff (%) 1^,15, 13»99

% Stickstoff in NH^ 6,16, 6,09

p„-Wert in 2?iger wässeriger Lösung 6,28

Gewichtßprogent Imia nach I*R. ..e*_e....... 20,5

Mq. HH^/g nach NH_-Elektrode ^,31

Die entsprechenden Natrium- und Kaliumealse des obigen erfindungsgemäßen Imids wurden durch herkömmliche Ionenaustausch-Techniken unter Verwendung des Ionenaustauschers IRC-Ä20 von Rohm und Haas in entweder der Natrium- oder Kaliumform hergestellt. Die Austauschsäulen wirden hergestellt, indem man ^00 ml IRC-120 (H^-Form) in eine geeignete Säule einbrachte und das Na -Hars durch Behandlung mit 3,8 Liter einer !,Omolaren NaCl-Lösung (oder im Falle von Kalium einer !,Oanolaren KCl-Lösung) > gefolgt von % Liter

4*

Hasser, herstellte. Lösungen des obigen NHh -Salses des

Auftreten

eines Rezidivs

Eintreten Todes Auftreten

von Metastase beim Tod

Überlebende nach 19 Wochen

Kontrollen® 10

10/10

30-66 Tag© Durchschnitt 1. 47,5 Tags

10/10 (residiriert)

53-35 Tage !Durchschnitt 1. 7^,1 Tage

10/10 (rezidiviert)

Versuch®'** 10

3/10

32-59 Tage Eürchschnittl. ty?»3 Tage

3/3 (residiviert)

56-86 Tage rurchachnittl. 75,0 Tage

1/3 (resddiviert)

Tumorexzision am Tag 7 nach Tumoriinplantierung.

mg/kg, Einseidosis, I.P., am Tag der Turnorexzision,

η « Anzahl der Tiere.

22ä 2 1 8540

Imid-enthaltend©n Polymeren -wurden unter Verwendung von 5,0 g an gelöstem Polymeren in 200 ml Wasser hergestellt. Diese Lösungen wurden dann auf einen p_H~¥ert von 8,0 mit verdünntem KaOH (oder im Falle von Kalium nit KOH) eingestellt. Diese Lösungen mit eingestelltem p„-Wert wurden auf die entsprechenden Natrium- oder Kalium-Säulen mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/min aufgegeben, gefolgt von Wasser, bis in jedem Falle 500 ml der am Boden der Säule austretenden Flüssigkeit gesammelt worden waren. Diese austretende Flüssigkeit wurde mit HCl auf einen p^-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt und gefriergetrocknet. Die als Endprodukt erhaltenen, gefriergetrockneten Sal&e hatten die folgenden Eigenschaften:

Salsfora	NHj.	Na*	K+
Ausbeute (g)s	-	5,47	5,80
Stickstoff {% Gesamt)	14,07	7,77	7,00
mXqu. NHt /g	4,31	0,03*1	0,036
NHh Umgewandelt in SaIa (JS)	-	99,3	99,3
Chlor (?)	-	1,25	1,22
Na oder K (%)		10,45	17,08

Aus 5*00 g NHJ-SaIs, enthält NaCl oder KCl von der p„-V?ert eins te llung Kit KCl.

-«5- - 21 85 4 0

Die oben erhaltenen Salze wurden zwei biologischen Bewertungen, wie nachfolgend beschrieben, unterworfen:

(a) Das NH^-Starnmealz wurde in Fischer-3^^-Ratten unter Verwendung von FBCa-Tumor auf überleben, Nicht-Rezidiv und AntimetastBBen nach der Tumor-Resektion (vgl. vorstehende Tabelle) wie in den Beispielen 13 und 15 mit den folgenden Ergebnissen bewertet.

(b) Die obigen Salze wurden auf ihre Fähigkeit hin bewertet, Iimnun-Reizbeantwortungen vermittels wachsender IgM-Antikörper-produzierender Zellen zu heterologen Erythrozyten (SRBC, rote Blutsellen vom Schaf), wie in Beispiel 20 beschrieben, Eilt den folgenden Ergebnissen zu stimulieren:

Polymer-Quelle Änsahl der Ratten ί^&£ if)»- Index-

- Sals-Typ - in der Gruppe Milzsellen ^Kontrolle "

Kontrolle 2

Ammonium (NH^) il

Kontrolle H

Natrium (Na*)® 4

Kalium (K*)· · i|

500	1,00
1052	2,10
53*	1,00
970	1,82
1098	2,06

Polymer-Quelle	Ansahl der Ratten	IgM-PFg/	Index-
- Sale-Typ -	in der Gruppe	Milgsellen	Kontrolle s 1,0
Kontrolle	2	538	1,00
Natrium (Na*)#	2	1373	2,55
Kalium (K*)®	2	996	1,85
Natrium (Ha*)*®	3	1523	2,83
Kalium (K*)··	3	1058	1,97
Kontrolle	6	541	1,00
Natrium (Na*)e	5	1254	2,32
Kalium (K*)e	5	1044	1,93
Natrium (Na*)··	6	1607	2,97
Kalium (Κ*)··	6	1003	1,85

30 Eig/kgj I.P. verabreicht. 30 mg/kg, oral verabreicht»

Beispiel 28

EMA mit niedriges Molekulargewicht aus Beispiel 1-E (spezi fische Viskosität ^ 0,063) wurde in das Halb-jaonomethylßekundäramidshalb-monomethylamin-carboxylatsals nach dem folgenden Verfahren umgewandelt. Eine Lösung von 43,9 g (0,312 Mol) EIiA in 440 101 reagierendem Aceton wurde auf -78⁰C in einer Mischung aus Trockeneis-Aceton abgekühlt. Eu dieser Lösung wurden 71 ml (54 g, 1,74 Mol) kondensier-

tes Methylamin und 100 ml zusätzliches Aceton zugegeben, um ein wirksames Rühren der ausgefällten Produktaufschlämmung KU gewährleisten. Nachdem die Aufschlämmung des Methyl-amidaminsalsses sich auf Raumtemperatur erwärmt hatte (2 Stunden), wurde sie über Nacht weitergerührt, abfiltriert und frei von überschüssigem Amin durch dreimaliges Aufschlämmen in Aceton (jedesmal 500 ml) gewaschen und über Nacht bei 20 bis 25 mm Hg und 35⁰C getrocknet. Man erhielt 78,3 g (Ausbeute 123,9 %) des Halb-methyl-sekundäramidjhalb-methylaminsalses von EMA. Dieses Methyl-amid-aminsale (20,0 g) wurde in 400 ml Xylol auf geschlämmt und unter Rühren 5 Minuten lang unter Wasserabnahme am Rückfluß erhitzt und ein Strom Methylamin durch die Aufschlämmung eingeleitet, wodurch 0,75 ml Wasser entfernt wurden. Das unlösliche Produkt wurde abfiltriert, einmal mit 400 ml Xylol, anschliesßend mit 400 ml Hexan aufgeschlämmt, abfiltriert und bei IK)⁰C bei 20 bis 25 ram Hg Vakuum getrocknet. Man erhielt 16»*? g (Ausbeute 85,2 %) des partiell N-Methyl-substituierten Imid-Derivats. Die Infrarot-Untersuchung des Produktes seigte Imid-Punktionalität bei 1700 cm , als auch die An-Wesenheit von sekundärem Methyiamid bei 1645 cm , ionisiertem COO** und Amincarboxylat-Punktionen, an. Der Imid-Gehalt tmrde su 17»0 % bestimmt, wie er aus der Standard-I/A-Absorptionskurve für nichtsubstituierte Imid-primäresamid-Zubereitungen gemäß der Beschreibung in Beispiel 5

Auftreten

eines

Rezidivs

Eintreten Todes Auftreten

von Metastase überlebende

beim Tod nach 16 Wochen

Kontrollen

10/10 18-50 Tags

Durchschnitt 1. 32,7 Tage

10/10 (residiviert)

48-6? Tage Durchschnittlich 10/10 (residivi@rt)

Versuch®

3/10 35-^0 Tage

techschnitt1. 37,3 Tag®

3/3 (residiviert)

68-77 Tag© Durchschnitt!. 72 J Tag® 0/3 (rezidiviert)

mg/kg, Einzeldosis, I.P., am Tag der TumorreSektion. Tumorezsislon in 10 Tagen nach Tuiaoriinplantierung.

η « Ansahl der Tiere.

""'-' - 2 1 85

abgelesen wird. Der Gehalt an Stickstoff betrug 11,41 Jf und eine 2?ige wässerige Lösung hatte einen p„-Wert von 8,70. .

Das obige N-Methylimid-enthaltende Produkt wurde in männlichen Fischer-^^-Ratten unter Einsats von PBCa-Tumor auf überleben, Nieht-Residiv- und Antimetastase-Eigenschaf ten nach Tumerexslsion, wie in den Beispielen 13 und 15 beschrieben, mit den folgenden Ergebnissen (vgl. vorstehende Tabelle) bewertet.

Herstellung von BMA-Rohmaterial in einer Versuchsanlage

Die Herstellungen von EMA-Rohmaterial und derivatisiertem Produkt gemäß Erfindung in größerem Maßstab wurden gemäß den nachfolgenden swei Beispielen durchgeführt.

Beispiel 29

Herstellung von EMA

Das gevfünschte Rohmaterial von Äthylen/Maleinsäureanhydrid Copolymerem (EMA) wurde in einera Autoklav aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 150 gallon (563 1) hergestellt, der mit einer 12 gallon (^5,.4 1) Druckflasche für die Zugabe des Initiators /einem mit Glas ausgekleide-

/M b

ten, gerührten Reaktor, der sur Spülung siit N- in geeigneter Weise abgedichtet war, in welchem die Reaktionsteilnehmer gemischt isfurden, einem Turbinenrührer, einem 3 inch (7>β2 cm) Boden-Austragv©ntil und einem !hantel für entweder Erhitsen oder Kühlen, versehen war. Alle drei Behälter wurden, bevor sie mit den Reaktionsteilnehinern beschickt wurden, dreimal mit K₂ gespült. In den mit Glas ausgekleideten Mischer für di® Reaktionsteilnehmer wurden 536 pounds (2*?3 kg) ÄtbylbenEol und 66 pounds (30 kg) Maleinsäureanhydrid (MA) eingefüllt. Die Mischung mirde bis ssur vollständigen Lösung auf 50⁰C erhitzt. Zu dieser Lösung von MA in XtnylbenEol wurde eine Lösung von 23^0 g Benssoylperoxid in 46,2 pounds (21 kg) Äthylbensol, die in einem getrennten Behälter hergestellt worden ^ar, Eugegeben.

Die vorstehende Xthylbenaol-Lösung der Reaktionsteilnehmer wurde dann in den 150 gallon. (568 1)«Autoklav aus rostfreiem Stahl eingebracht _t der Mantel auf 40°C erwärmt und ein leichter Xthylen-Stroa durchgeleitet. Der Rührer wurde mit einer Geschwindigkeit von 125 UpM betrieben. Nach der Zugabe wurde der Reaktionsbehälter mit 5 pounds (2,3 kg) Xthy!benzol in ά&η Autoklav hinein ausgespült, abgetrennt und die Eingangsleitung mit einer Kappe verschloßsen. Nach dem Füllen mirde der durchgespülte Autoklav geschlossen und Ethylen auf 60 psig (5_S2 kg/cm ) abgepreßt und 5 Kimi-

2 1 854 0

ten lang bei diesem Druck gehalten. Die Abdichtdrucke wurden auf 25 bis 50 psig (2,75 bis 4,5 kg/cia²) Ober dem Reak tordruck eingestellt. Die Ansät et emperatur wurde auf '7¹J⁰C durch Heizen des Mantels mit einer Temperatur von 95°C während eines Zeitraums von 45 Minuten gebracht, wonach der Reaktor mit Äthylen auf 200 psig (15 kg/cm ) abgepreßt wurde. Als Nullzeit wurde der Zeitpunkt aufgezeichnet, zu welchem der Reaktorinhalt die Temperatur von 75⁰C erreichte.

Eb wurde eine Lösung von 156Ο g Benzoylperoxid in 62,1 pounds (28,2 kg) Äthylbensol hergestellt und in die 12 gallon (45,4 1) Katalysator-Druckflasche eingefüllt. Nach 3 Stunden Reaktionedauer des obigen Ansatzes bei 75°C und 200 psig (15 kg/cm ) Äthylendruek wurde sum Ekelten Mal Initiator in den Autoklaven zugegeben und die Druckflasche mit 4 pounds (1,8 kg) Xthylbensol gespült. Nach der streiten Zugabe von Bensoylperoxid wurde der Reaktor bei 75° und 200 psig (15 kg/cm ) Äthylen für weitere 14 Stunden - insgesamt 17 Stunden - gehalten. Nach 17 Stunden Gesamtreaktionsseit wurde das Reaktionsgeiiiisch auf 25⁰C abgekühlt, der Äthylendruck entspannt'und der Reaktor dreimal mit Stickstoff gespült. .

Die im Reaktor enthaltene EMA-Aufschlämmung in Äthylbensol

2185 4 0

wurde durch das Boden-Austragsvcmtil auf ein StöinEeug-Knutsehe-Vakuumfilter, daß mit einem segeltuchartigen Baumwollfiltertuch versehen %rar, ausgetragen. Das Filter wurde mit einer Plastikfolie und einem Stickstoff-Mantel abge-" deckt. Der nach der Filtration zurückbleibende nasse Kuchen wurde in 300 pounds (136 kg) Xylol wiederaufgeschlämmt, 15 Minuten lang gerührt und erneut abfiltriert. Dieses Wiederaufs chläimnungsverfahren mit Xylol wurde dreiiaal wiederholt, gefolgt von drei Wiederaufschlämmung-Filter-Stufen unter Verwendung von 225 pounds (102 kg) Hexan. Der abrschließende hexanfeuchte Filterkuchen von EMA •mirde in Trögen aus· rostfreiem Stahl ausgebreitet und bei 50⁰C in einen ^BDeYine"-Vakuumtrogtrookner während eines Zeitraums von HB bis 72 Stunden (so lange, bis kein Xylolgeruch mehr vorhanden war) getrocknet. Das getrocknete Endprodukt wog 78 pounds (35*38 kg). Die Ausbeute betrug 82,8 %« Insgesamt wurde eine Reihe von ^l Versuchen verschiedener Größe wie folgt durchgeführt. Der vorstehende Versuch entspricht dem Versuch Kr. 3 in der nachstehenden Tabelle:

218540

Vers.-Nr.	Temperatur (°C)	Ausbeute Pounds (kg)	(11,31J)	Spez. Visk. (1JS-DMF-25 C)
1	70		(22,68)	0,063
2	75	50	(35,38)	0,053
3	75	78	(11,3*0	0,051
	75	25	30	0,052
	Bei	spiel
	Herstellung des	partiellen	Imids von mit
	Ammoniak behandeltem EMA

Die Behandlung mit Ammoniak und die Imidisierung von EMA (Produkt aus Beispiel 29) wurde in einem mit Glas ausgeklei deten Pfaudler-Reaktor mit einem FaBsungsvermögen von 100 gallon (379 1) durchgeführt, der mit einem BlattrQhrer mit abreißender Strömung am rücklaufenden Blatt und einem Umlenkblech-Systern, und einer Destillationsleitungsschleife aus rostfreiem Stahl mit einem Kühler versehen var, wodurch die Möglichkeit der Gesamtentfernung des Kondensats, oder die Rückführung einer beliebigen Destillat-Fraktion in den Reaktor surück siehergestellt war. Das System war mit swei unabhängigen Besehiekungsleitungen, die eine für Ammoniak, die andere für Flüssigkeit, versehen, die beide

-»*- 2 18540

so angeordnet waren, daß eie unterhalb der Oberfläche der gerührten Reaktionsmischung endeten. Jede Leitung war mit einem in der Leitung liegenden Patronenfilter und einem Rotameter zum Messen und Steuern der Durchflußgeschwindigkeiten versehen. Der Reaktormantel war sowohl für Durchleiten von Hochdruckdampf oder Kühlflüssigkeit, Je nach Bedarf, vorgesehen. Die Eingangsleitung für die Flüssigkeiten war mit einem mit Glas ausgekleideten Pfaudier-Behälter mit einem Fassungsvermögen von 25 gallon (95 1) verbunden, in welchem das EMA-Rohmaterial vor der Zugabe in den 100 gallon-(379 1)-Ammoniakbehandlungsreaktor in Aceton aufgelöst wurde. Die Endprodukte aus den 100 gallon-(379 I) Reaktor wurden durch Austragen des Inhaltes durch ein Boden ventil auf ein ummanteltes Vakuumfilter vom Knutsch-Typ aus rostfreiem Stahl gewonnen.

Eine typisch© Ammoniakb©handlunge- und partielle Imidisierungssequens wird nachfolgend beschrieben;

Der 100 gallon-(379 1)-Reaktor wurde mit 35 gallons bsw. 225 pounds (133 1 bsw. 102 kg) filtriertem Aceton, und der 25 gallön-(95 1)-Lo8ungsbehülter init 21,5 gallons bzw.

pounds (Bl₉H 1 bzw. 62,6 kg) filtriertem Aceton beschickt, und zwar beide Male unter eir>er Stickst off atmosphäre. Zu den 21,5 gallons (31,4 1) Aceton in dem Lösungsbehälter

wurden ή? pounds (21,3 kg) EMA-Copolymeres (hergestellt wie in Beispiel 29, Versuch 4) zugegeben, und bei 20 bis JO⁰C so lange gerährt, bis eine vollständige Lösung erzielt worden war. Gleichseitig wurde unterhalb der Oberfläche des Acetone in dem 100 gallon-(379 1)-Reaktor Ammoniak mit einer Rate von 0,35 pounds (0,16 kg)/rain im Verlaufe von 5 Minuten zugegeben. Dann wurde die obige EMA-Acetonlösung unter Druck durch das in der Leitung befindliche Filter mit linealer Strömungsrate während eines Zeitraums von ^O Minuten (*!,6 Ib. (2,1 kg)/min) in die gerührte Aceton-ΝΗ,-Lösung in den 100 gallon-(379 1)-Reaktor unterhalb der Flüssigkeitsoberflache eingeführt. Der Ammoniakzufluß in den 100 gallon-(379 1)-Reaktor mirde während der gesamten EMA-Zugabe-Zugabeseit auf einem Wert von 0,35 Ib. (0,16 kg)/ min gehalten. Während dieser Zeit ließ man die Temperatur der Reaktionsmiscliung bis auf *5*l^o bis 4 5° C ansteigen, indem man keine Außenkühlung anwandte. Die Ammoniak-Zugabe in einer Menge von 0,35 lh. (0,16 leg)/min mirde 15 Minuten lang im Anschluß an die EMA-Zugabö fortgesetst. Die Aufschlämmung des ausgefällten, mit Ammoniak behandelten ERA wurde dann auf 25⁰C abgekühlt und sum Vakuumfilter hin ssweeks Gewinnung des festen, mit Ammoniak behandelten Produkts, ausgetragen.

Das ab filtrierte, mit Ammoniak behandelte Produkt, nämlich

U5*

das Ealb-amidjhalb-aiamoniumcarboxylatsalz» wurde durch hintereinander erfolgendes WiederaufsehlSiraaen (20 Minuten) dreimal in 47 gallon-(178 1)-Anteil©n Aceton mit Filtration Bwißchen jeder Aufschläramungsstufe und schließlich zweimal in *17 gallon-(178 1)-Anteilen Hexan mit anschließender Filtration behandelt, und so ein hexanfeuchter Filterkuchen des Produkts erhalten. Ein aliquoter Anteil dieses feuchten Filterkuchens wurde but Analyse getrocknet und seigte nach IR-Analyse kein Anhydrid, nur Amid und AraBoniumcarboxylatBalsgruppen, Der p„-Wert der wässerigen Lösung war 5,88 in 2,Obiger Konsentration«,

Bei allen fünf durchgeführten derartigen Behandlungen mit Aiamoniak wurden verschiedene Mengen an EMA - wie dies in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist - eingesetzt. Die vorstehende Beschreibung besieht sich auf den Versuch Nr. in der nachfolgenden Tabelle.

Die oben erhaltenen, heocanfeuchten Filterkuchen von mit Ammoniak behandeltem EMA wurden direkt in der Imidisierungsstufe des Deri^atiEierungSYerfahrens wie folgt eingesetst,, welches die Iraidisierüng des mit Ammoniak behandelten Produktes aus Versuch Nr«. 5 der nachfolgenden Tabelle beschreibt.

	Eingesetztes EMA pounds (kg)	Hexanfeuchter Kuchen pounds (kg)	Anhydrid	Trockenprodukt-Analyse	nhJ- Salz	einer 2£igen "wässerigen Lsg.	Stickstoff	m υπ
It ;Amnoniak behandelt Vers.-Nr·	12 ( 5,ill»)	NB®	Fehlt	Amid	Verharrt«	5,34	12,64	O
1	15,4 ( 6,99)	46 (20,87)	Fehlt	Vorhanden	Vorhanden	6,27	12,55
2	35 (15,88)	115 (52,16)	Fehlt	Vorhanden	Vorhanden	6,48	13,51
3	35 (15,88)	200 (90,72)	Fehlt	Vorhanden	Vorhanden	5,77	13,81
4	47 (21,32)	NB*	Fehlt	Vorhanden	Vorhanden	5,88	13,93
5	bestimmt			Vorhanden
• 'HB »Nicht 1

/IZT

Der hexanfeuchfce Filterkuchen aus dem vorstehenden Versuch Nr. 5 wurde in einen 100 gallon-(379 1)-Reaktor überführt, der 38 gallons bzw. 275 pounds (144 1 bzw, 125 kg) Toluol und 19 gallons bzw. 138 pounds (72 1 bzw. 63 kg) Xylol enthielt. Diese Aufschlämmung von mit Ammoniak behandeltem EMA in einem Misehlösungsmittel aus Eexan/Toluol/Xylol wurde unter fortgesetztem Durchleiten von wasserfreiem Ammoniak in einer Menge von 0,044 Ib. (20 g)/min zum Sie den erhitzt. Ein Rückfluß setzte bei 82°C ein, und es wur de das gesamte, vorhandene Wasser azeotrop entfernt, und anschließend das Hexan, bis die Temperatur der Reaktions-BiiBchung 115°C erreichte. Die Reaktionstemperatur wurde dann bei 115°0 bis 116°C gehalten und während der Entfernung des bei dieser Temperatur durch die Imidisierung gebildeten Wassers bei Bedarf eine Toluol/Xylol-Mischung in einem Volumenverhältnis von 2:1 in Inkrementen zugegeben. Das Erhitzen unter Rückfluß irurde während eines Zeitraums von 7j> 5 Stunden unter aseotroper Entfernung von Was ser und ununterbrochenem Einleiten von Ammoniak in einer Menge von Q,044 Ib. (20 g)/ain fortgesetzt, bis die gewünschte Umwandlung in Imid, wie sie durch Infrarot-Analyse bestimmt wurde, erreicht worden war (vgl. die nachfolgende Tabelle). "

Sobald die gewünschte Umwandlung in Imid erreicht worden

	Zu Beginn eingesetztes EMA pounds (kg)	(5,44)	Ofengetrocknetes Imid»	Ausbeute < (W	enthaltend mit	Ammoniak	behandeltes EMA	nhJ- Stick- ßtoff
Y@rs.-Nr.	12	4 (6,99)	Erodukt- (kg)	67,6	Scheinbares , Imid ^ nach IR F (%) 2	Is serige Lösung η ·. % Konz.	Jtickstoff (W	5,11
1	15,	(15,88)	4,40	77,1	20,5	5,3	13,26	5,22
2	35	(21,32)	6,42	89,8	21,5	5,4	13,33	5,01
4	47	17,00	84,9	21,0	5,3	13,12	* 4,94
5	21,60	20,5	5,26	13,26

^Ofen-Trockengewicht bei 50 C/3 Torr.

- 218540

war, wurde die Reaktionsmischung abgekühlt, wie oben beechrieben filtriert und das Imid enthaltende Produkt abgetrennt, nachdem es wie oben dreimal unter Verwendung von Toluol [341 pounds (155 kg), 20 min], und anschließend zweimal unter Verwendung von Hexan [263 pounds (119 kg), 20 min] wiederaufgeschlämmt worden war. Der abschließend filtrierte, hexanfeuchte Filterkuchen wurde in Trögen aus rostfreiem Stahl im Vakuum (ölpumpe) bei 50⁰C während eines Zeitraums von 72 Stunden, oder bis der Vakuumofen-Druck unterhalb 3 Torr bei 50⁰C war, getrocknet.

Insgesamt wurden vier Versuche durchgeführt, entsprechend den Versuchen 1, 2, H und 5 der obigen, mit Ammoniak behanäelten EMA-Sequenz«, Die zugehörigen Daten für diese Versuche sind in der vorstehenden Tabelle niedergelegt.

Wässerige Lösungen der obigen, im Ofen getrockneten Produkte wurden mit Aramoniinnhydroxia auf einen p„-Wert von 9*5 eingestellt, durch ein 0,2-Mikron-Filter steril in Serumampullen filtriert und für den Endgebrauch gefriergetrocknet. Die abschließenden Analysen für diese vier Versuche waren die nachfolgend angegebenen« Die Ergebnisse unterscheiden sich von den oben erhaltenen infolge der Reaxnmoniatisierung der Carboxylgruppen, die während des Trocknens im Ofen Ammoniak verloren·

218540

Vers. Np.	Imid nach IR (JQ	2£ige ^ Lösung	Stickstoff ) (?)	NHj-Stickstoff
1	18,0		13,78	5,95
2	20,8		13,96	5,74
4	. 18,5		14,54	6,23
5	20,0		14,20	6,13
äs serige (Pg-fefert
5,96
6,00
6,69
6,46

Beispiel 31

Laboratoriumssynthese von Irnid enthaltendem,mit Ammoniak behandeltem EMA unter Verwendung eines AEMA-hexanfeuchten Filterkuchens direkt in Xylol-Rückfluß ohne Trocknen

Es wurden Präparate im Laboratoriumsmaßstab hergestellt, bei welchen das EMA in Aceton gelöst im Verlaufe verschiedener Zeiten su einer Lösung von Aceton sugegeben wurde, in welche gasförmiges Ammoniak mit verschiedenen Durchflußraten eingeleitet wurde, und wobei man die Temperatur von Raumtemperatur (23° bis 25°C) auf einen Bereich von 50° bis 53°C ansteigen ließ. Das ausgefällte, mit Ammoniak behandelte EM wurde abfiltriert und die Aufschlämmung mit Aceton und anschließend mit Hexan gewaschen und filtriert. Der hexanfeuchte Filterkuchen von mit Ammoniak behandeltem EMA

- /252 -

-Z- 2 185

wurde aann erneut in Xylol aufgeschlämme und die gesamte Aufschlämmung sur Entfernung von Wasser in swei Stufen erhitzt: (1) Äseotrope Entfernung von Wasser im Temperaturbereich von 75° bis 102⁰C herrührend vor* der Reaktion von KH, und Aceton, und anschließend (2) Wasser gebildet während der partiellen Iiaidisierung des mit Ammoniak behandeltem EMA bei einer erhöhten Temperatur (122° bis 132°C ) nach der Entfernung von Hexan.. Das partielle Imid-Endprodukt wurde durch Filtration und anschließendes Aufschlämmen und Waschen mit Xylol und Hexan erhalten. 12 derartiger Versuche mirden gemacht, wie dies aus der nachfolgenden Tabelle eu ersehen ißt. Die nachfolgende Beschreibung besieht sich auf den Versuch Nr. 10 in dieser Tabelle.

EMA aus Beispiel 29» Versuch 1 (280 g, 2,0 Hol) wurde in 1,1 Liter Aceton gelöst und durch Filterpapier filtriert. Diese EMA/Aeeton-Lösung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 45 Minuten in 2,4 Liter Aceton in einem gerührten 5-Liter-Kolben zugegeben, der mit einem Rückflußkühler für aseotrope Entfernung, einem susätslichen Kolben und einem Einleitungsrohr für Ammoniak versehen war. Die Einleitungßrohre für das Ammoniak und die EMA/Aceton-Lösung endeten unterhalb des PlÜBsigkeitsspiegels in dem 5-Liter-Kolben. Während des 45"Minufcen~Zeitraunm der EMA-Zugabe und während eines Zeitraums von 10 Minuten danach wurd© Ammoniak in die

Hersiellungs- und Versuchsbedingungen von Beispiel 31

	EM-Zugabe®	Amraoniaksugab©	(tol/min)	Molzahl	HgO-Entfemjtng	Nr.1®*	HgO-Ehtfernung	mm ürnid*®*	Ofengetrocknete	(?)
	ί/dXy (min)		0,060	6,0	Zeit (min)	(ml)	Zeit (min)	(ml)	g	(93,7)
	30	(min)	0,064	6,4	90	24,4	85	6,6	312	(93,1)
V(Ki ο. Hr.	40	100	0,066	5,95	120	26,5	95	8,2	309-	(92,3)
1	40	100	0,069	5,5	125	25,4	95	7,7	305	(93,7)
2	40	90	0,072	5,05	115	22,6	85	7,1	311	(91,9)
3	45	80	0,075	4,83	85	14,9	77	7,5	. 305	(94,4)
4	45	. 70"	0,077	4,60	85	12,1	75	7,1	313	(94,3)
5	45	65 :	0,081	4,44	75	10,4	60	7,0	313	(96,3)
6	45	60	0,081	4,44	60	8,7	63	6,8	.319	(96,2)
7 {	45	55	0,081	4,44	60	8,3	65	6,7	319	(94,5)
.8	45	551'1	0,081	4,4*?	60	9,1	60	6,9	314	(94,6)
9	'45	55	0,081	4,44	60	9,S	58	6,8	315	(94,0)
10	45 .	55 "			60	7,6	55	6,7	312
11		55 :
12

allen Versuchen mirden 2,0 Mol EMA aus Beispiel 29, Versuch 1, eingesetct.

Temperaturen zwischen 80°C und 102⁰C

♦♦•Alle Temperaturen zwischen 122°C und 133°C

reagierende Aufschlämmung in einer Menge von 0,081 Mol/min in einer Gesamtmenge von ^,$4 KoI Ammoniak ©ingeleitet· Die EMA-Zugabe wurde bei Raumtemperatur (23°C) begonnen und man ließ die Reaktionstempöratur ohne irgendwelche Kühlung während des gesamten 45-Minuten-Zeitraums ansteigen. Di© Endtemperatur der mit Ammoniak behandelten EMA-AufßchlSmmung in Aceton war 53>5°C. Das mit Ammoniak behandelte Produkt wurde abfiltriert, sweimal in 2 Liter Aceton (jedesmal 30 min) und anschließend sweimal in 2 Liter Hexan (jedesmal 30 min).aufgeschlämmt und filtriert. Der hexanfeuchte Filterkuchen wurde dann ohne Trocknen in 2,7 Liter Xylol eut Wasssrentfernung und partieller Imidißierung erneut aufgeschlämmt. Dies© Hexan/Xylol-Aufschlämmung von mit Äaiaioriiak behandeltem EMA wurde sur Entfernung von Wasser durch a^eotrope Destillation in swsi Stufen bis sum Rückfluß erhitzt» Während dieses Gesamtverfahrens mir- Ue Ammoniak kontinuierlich durch die Aufschlämmung in einer Menge von 0,030 Mol/min eingeleitet. Die anfängliche Was~ eerentfernung begann bei 88°C, und die Temperatur stieg im Verlaufe eines Zeitraums von 60 Minuten bis auf 101°C, und es wurden 9,1 ml Wasser erhalten. Das Heisen. wurde unter Hexan-Entfernung fortgesetst_f bis das aus aer Imidbildung entstehende ¥a3ser sueret bei 125°C erhalten wurde. Das Was ser aus der Iraidisierung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 60 Minuten arischen 125⁰C und 152°C azeotrop entfernt,

- «5 -' 2 1 854 0

wobei man 6,9 sil Wasser erhielt. Nach der Imidisierung wurde die Aufschlämmung auf 100⁰C abgekühlt, filtriert, durch erneutes Aufschlämmen während eines Zeitraums von 30 Minuten in 2 Liter Xylol und anschließendes zweimaliges Aufschlämmen (jedesmal 30 min) in 2 Liter Hexan gewaschen und filtriert. Das filtrierte Produkt wurde 15 Stunden bei 50°C unter ülpumpenvakuura bei 3 em Hg getrocknet. Man erhielt 31¹I g ofengetrocknetes Produkt (Ausbeute 9^,5 %)· Die Zusammenfassung von 12 derartigen Versuchen wird in der vorstehenden Tabelle gezeigt. Zur endgültigen Verwendung des ofengetrockneten Produktes wurde dieses in Wasser (2 bis 5 %) gelöst und der p_H-Wert mit NH₁^OH auf 9,5 eingestellt, durch ein 0,2-Mikron-Pilter filtriert und in Ssrumampullen gefriergetrocknet. Die Eigenschaften der abschließend im Ofen getrockneten und gefriergetrockneten Produkte sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

Eigenschaften der Produkte aus Beispiel 31

	Ofengetrocknetes	Produkt	Gefriergetrocknetes	Produkt
	2^ige wässerige Lsg.	Isnid® (Ctew.-^)	2#ige wässerige Lsg.	Iraid*
Vers. Kr.	5,28 4,89 4,92	21,5 23,2 25,2 23,2	6,20 6,12 6,09 6,23	17,9 21,6 22,2 19.9
1 2 3

	Ofengetrocknet©8	Produkt	Gefriergetrocknetes	Produkt
Vers. Nr.	2$ige ^ässsrigs Lßg· (Pjj-^srt)	3kiö® (Gew.-g)	2?ige wässerige Lag. (Pg-^srt)	3Md*
5	5,01	22,8	6,16	21,5
6	5,10	23,5	6,22	20,8
7	5,02	23,0	6,25	19,5
8	5,12	24,0	6,1**	19,3
9	. 5,12 .	23,5	6,18	19,0
10	5,07	22,5	6,06	18,8
11	*, 99	22,2	6,18	19,0
12	^,96	23,2	6,10	19,5

^m Durch Infrarot-Analyse.

Die Ge samt mischung aller obigen Chargen (etwa *S000 g) hatte die folgende Analyse:

Ofengetrocknet t p„-Wert der 2?igen wässerigen

Imiä (Gewichtsprosent) «..··.. 23,5

Gefriergetrocknet: p„~Viert der 2%igen wässerigen

Imid (Gewichtsprozent) 19,5

Zwei Chargen von je 2000 g wurden mit HHhOH auf einen

-w- 21854 0

Wert von 9,5 eingestellt, steril filtriert und in Serumampullen gefriergetrocknet. Jede Ampulle enthielt 0,5 g für die Endantsendung in Versuchen bei entweder menschlichen Patienten oder Tieren. Man erhielt 8000 derartiger Ampullen.

Die Analyse dieses Großansatzes von Ampullen-Material war

folgende:

p„-Wert der 2£igen wässerigen Lösung . 6,27

Imid/Amid-Absorptionsverhältnis IR 0,888

Xmid (Gewichtsprozent) 19»3

Gesamtstickstoff (?) 14,1*9

% Stickstoff als NhJ 6,27

Das oben beschriebene Endprodukt der großen Charge wurde in j männlichen Fisöher-J^-Ratten unter Verwendung von FBCa- ₍

Tumor auf überleben, Nicht-Residiv und Antimetastase-Eigen- j

schäften nach Tumorexaision bewertet, wie dies in den Beispielen 13 und 15 beschrieben wurde, wobei die folgenden Ergebnisse (vgl. nachfolgende Tabelle) erhalten wurden:

Auftreten

©ines. Rezidivs

Eintreten

des Todes Auftreten

von Metastase

beim Tod

Überlebende

nach 16 Wochen

(112 Tagen)

10/10 ntrolXen· 10 18-77 Tagen

Durchochnittl· 45,4 Tag®

10/10 (residiviert)

51-95 Tage Durohedhnittl. 7β,8 Taga 10/10 (reaidiviert)

10

0/10

0/10

Tumoroxs'ision in 7 Tagen nach Tumorimplantierung,

mg/kg, EinseldosiEj I.P.₉ am Tag der Tumorexsision.

η s Ansah! der Tier©

-*»-· 2 1

Beispiel 32

Dieses Beispiel verwendet das in Beispiel 20 beschriebene Verfahren zur Bewertung normaler Lewis-Ratten auf ihre Fähigkeit, Immun-Reizbeanttiortungen vermittels ansteigender IgM-Antikörper-produzierender Zellen zu heterologen Erythrozyten (rote Blutsellen vom Schaf, SRBC) zu stimulieren, mit der Ausnahme, daß in diesem Fall die Imid-Zube reitung gemäß der Erfindung durch intravenöse Dosierung über die Schwansvene in Form von 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, welche die angegebene Dosismenge ent hielt, verabreicht wurde. Alle anderen Einzelheiten waren die gleichen wie in Beispiel 20. Die folgenden Ergebnisse (vgl. die nachfolgende Tabelle) wurden in swei Versuchen erhalten.

Beispiel 33

Ein bevorsugtes Beispiel der vorliegenden Erfindung, beste hend aus einem Copolymeren aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid mit einem Molekulargewicht von etwa 850, und so derivatisiert, daß es Halb-amid,halb·-ammoniums als-Gruppen und Imid-Gruppen enthält, wobei die Imid-Gruppen etwa 20 Gewichtsprozent der Gruppen umfassen (im wesentlichen ähnlich wie in dem durch Fig. 1 erläuterten Beispiel), wurde

Polymeres aus Beispiel 7-VX-A

Intravenöse Dosierung (mg/kg)	PFC/1 χ 10° Kile-jsellen	Stlnulationsindex···
0 (Kontrolle)	562*	1,00
32	1298	2S31
16	1138	2,02
8	1215	2,16
k	1178	2,10
2	1144	2,04
t	1257	2,24
0,5	1173	2,09
0,1	1021	1,87

Polymeres aus Beispiel 3-IV-5

PFC/i χ 10^b Stiniulationsindex^* Milszellen

522®φ	i,00
1406	2,69
1282	2,46
1684	3,23
1882	3,61
1238	2,37
1100	2,11
1844	3,53
1022	1,96

5 Tiere pro Gruppe 2 Tier® pro Gruppe '♦·'· Kontrolle « 1

-*2- 218540

am Menschen getestet. Während eines Zeitraums von mehreren Monaten in einer Phase I ergab eine klinische Untersuchung an bis EU 72 Patienten iait gastrointestinalem Cancer (einschließend Magen-, Pankreas-, Kolon- und Rektumcancer-Patienten), daß keine signifikante Toxieität bei der Verabreichung der Droge auf irgendeinem der Verabreichungswege, nämlich intraperitoneal, oral oder intravenös, festgestellt wurde und auch nach der Behandlung mit der Droge keine beschleunigte Heiterentwicklung der KrankheitsSymptome au verseichnen war.

Beispiel 3*1

Wenn Isobutylen anstelle einer äquivalenten Menge Propylen in Beispiel 24 eingesetst wird, werden im wesentlichen ahnliche Ergebnisse ersielt.

Beispiel 35

Wenn man Dimethy!maleinsäureanhydrid anstell© einer äquivalenten Meng© Citraconsäureanhydrid in Beispiel 25 einsetzt, werden im wesentlichen ähnliehe Resultate ersielt.

- AHA -

Beispiel 36

Wenn EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 300 anstelle eines EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 3^2 in Beispiel 26 eingesetst wird, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt.

Beispiel 37

Wenn EMA mit einem berechneten durchschnittliehen Molekulargewicht (Eahlenmittel) von 1500 für das EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlen-Kittel) von. 3^2 in Beispiel 26 eingesetzt wird, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt»

Selbstverständlich können nach Kenntnisnahme der Torstehenden Beschreibung sowie der Ansprüche von jedem auf'die sem Gebiete tätigen Fachmann weitere Modifizierungen vorgenommen br,^. durchgeführt werden, die jedoch in Übereinstimmung mit der Beschreibung und den anliegenden Pateniansprüeben innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen. ·

Claims (2)

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines iminunoregulierenden Derivates eines Copolymeren aus einem Olefinmonomeren mit von etwa 2 bis etwa ¹I Kohlenstoffatomen und einem et,B-ungesättigten Polycarbonsäureanhydrid mit von *J bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, gekennzeichnet da durch, daß man ein Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Derivat des Copolymeren, in welchem das Copolymere ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 300 bis etwa 15ΟΟ besitzt, zur weiteren Derivatbildung des Copolymeren mit Ammoniak umsetzt derart, daß es sowohl

(a) Halb-amid,halb-ammonium8alz~Gruppen, und

(b) Imidgruppen enthält,

wobei die Imidgruppen von etwa 5 bis etwa kO Gewichtsprozent der derivatisierten Gruppen ausmachen, und gegebenenfalls die Halb-ammoniumsalz-Gruppe in andere, pharmazeutisch verträgliche Salzgruppen umwandelt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Reaktion in einem organischen
Lösungsmittelmedium bei Rückflußtemperatur durchgeführt

wird. '.'.-'

3· Verfahren nach Punkt 2_t gekennzeichnet

dadurch, daß das organische Lösutigsmittelmedium Xylol und/oder Toluol ist.

k. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Olefinmonomere Äthylen ißt.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Olefinmonomere Äthylen und das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.

7« Verfahren nach Punkt k, gekennzeichnet dadurch, daß das durchschnittliche Molekulargewicht etwa 850 ist. ·

8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Halb-atnidjhalb-carboxylatsalz-Gruppe die Halb-amia,halb~airanoniumsalz-Gruppe ist.

9» Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß die Kalb-amidjhalb-carboxylatsals-Gruppe die Kalb-amid^halb-ammoniumsalz-Gruppe ist.

2.1 85

10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Imidgruppe von etwa 10 bis etwa

25 % der derivatisierten Gruppen umfaßt.

11. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Imidgruppe von etwa 10 bis etwa

25 % der derivatisierten Gruppen umfaßt.

12. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet d a d u r c h, daß die Temperatur im Bereich von etwa 50⁰C bis etwa 200⁰C liegt.

13. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur im Bereich von etwa 60°C bis etwa 15O°C liegt.

Ik, Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur im Bereich von etwa 100⁰C bis etwa 150⁰C liegt.

Hiei7U.„jiL$eiten Tabellen

WELLENLÄNGE IN MIKRON

6 7

2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100

WELLENZAHL CM~¹

FIG. f.

2 1 854 0 -

WELLENLÄNGE IN MIKRON

W
«
O
H
CO
CO
vs.
a

IOO 90 80 70 60 50 40 30 20 IO O

2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100

WELLENZAlIL CM ~¹

FIG.

WELLENLÄNGE IN MIKRON

6

2000 1900 1800 i?00 1600 1500 1400 1300 1200 1100

WELLENZAHL CM~¹

h ill