CH644874A5 - Copolymere aus olefinen und alpha,beta-ungesaettigten polycarbonsaeureanhydriden, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung. - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft Copolymere, die in der immunoregulierenden Behandlung zur Tumor-Therapie brauchbar sind.

Obwohl das Gebiet der Tumor-Therapie bisher Gegenstand von ausgedehnten Forschungen war, wurden bis jetzt sehr wenige Verbindungen gefunden, die für eine derartige Verwendung wirksam sind.

Bei einer Forschungsrichtung wurden Versuche mit dem Ziel durchgeführt, das Immunsystem des Körpers zu manipulieren. Beispielsweise ist es ganz allgemein bekannt, dass die Thymusdrüse für die Entwicklung und die Alterung der immunologischen Fähigkeit von grosser Bedeutung ist. Die Thymusdrüse übt mittels verschiedenartiger Mechanismen, von denen angenommen wird, dass sie hauptsächlich hormonaler Art sind, eine steuernde Wirkung auf die von T-Lym-phozyten vermittelte Immunfunktion aus. Es wurden so eine Reihe von natürlich vorkommenden und synthetisch hergestellten Peptiden als Stimulantien und/oder Suppressoren dieses Immunsystems mit variierenden Ergebnissen untersucht.

Andere Mittel, von denen festgestellt wurde, dass sie eine unterstützende Immunaktivität aufweisen, schliessen beispielsweise Bacillus Calmette-Guerin (BCG), Corynebacte-rium parvum, Glucan, Levamisol und Tiloron, ein. Viele dieser Verbindungen erhöhen die Bildung von Antikörpern, wohingegen andere die durch die Zelle vermittelte Immunität entweder steigern oder inhibieren.

Ebenso wurden auch verschiedenartige biologisch aktive, synthetische Polyelektrolyte als brauchbare Antitumor-Mittel vorgeschlagen. So fanden Regelson und Holland für das Natriumsalz von Polyäthylensulfonat ein breites Spektrum der Antitumor-Aktivität [Nature (London) 181, 46 (1958)]. Später wurde von einer Anzahl Carbonsäure-Polymeren mit im wesentlichen hohem Molekulargewicht, beispielsweise Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure und Äthylen-Maleinsäu-reanhydrid-Copolymeres (EMA) festgestellt, dass sie eine, das Tumorwachstum hemmende Aktivität ähnlich derjenigen von Natriumpolyäthylensulfonat aufweisen [Regelson et al., Nature (London) 186, 778 bis 80 (1960); Regelson, «Water-Soluble Polymers», in «Polymer Science and Technology», Vol. 2 (Herausgeber N.K. Bikales), Seiten 161 bis 177, Plenum Press, New York, 1973]. Die antineoplastische Aktivität der

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Polymeren vom EMA-Typ ist ferner in dercanadischen Patentschrift 664 326 offenbart, welche der US-Patentanmeldung Serial No. 758 023, eingereicht am 28. Oktober 1958, jetzt fallengelassen, entspricht. Als brauchbares Molekulargewicht wird für diese Polymeren ein Bereich zwischen 500 und 1,5 Millionen angegeben. Von einem dieser Polymeren, dem Halb-amid,halb-ammoniumsalz von EMA mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 wurde später berichtet, dass es bei Nagetieren und Hunden chronisch toxisch wirkt (Mihich et al., Fed. Proceedings, Vol. 19, No. 1, Teil 1, März 1960). Eine chronische Toxizität wurde auch später von dem Polymeren mit dem Molekulargewicht von 2000 bis 3000 bei Hunden berichtet (Mihich et al., Fed. Proceedings, Vol. 20, No. 1, Teil 1, März 1961). Diese Toxizi-tätsbefunde sprachen gegen eine klinische Untersuchung der Polymeren.

Später zeigte das verwandte 1:2-Divinyläther-Maleinsäu-reanhydrid-Copolymere bei durch das National Cancer Institute durchgeführten Versuchen Antitumor-Aktivität [Breslow, Pure and Appi. Chem., 46, 103 bis 113 (1976)]. Dieses Copolymere ist auch als Pyran-Copolymeres oder DIVEMA bekannt, und eine wohlbekannte Probe wurde als NSC 46015 bezeichnet. Die Verwendung dieser Pyran-Copolymeren als Antitumor-Mittel ist auch in den US-Patentschriften 3 224 943 und 3 794 622 offenbart, in denen der Bereich von 5000 bis 30 000 als brauchbares Molekulargewicht beschrieben wurde. Die Antitumor-Aktivität des Pyran-Copolymeren wurde von einer Reihe von Autoren einer Immunopotenzie-rung oder einer Wirkung auf die Immun-Reizbeantwortung durch das retikuloendotheliale System (RES) durch Steigerung der Makrophagen-Funktion zugeschrieben [vgl. beispielsweise Breslow, Pure and Appi. Chem., 46, 103 bis 113 (1976); Mohr et al., Prog. Cancer Res. Ther., 7, 415 bis 426 (1978); Schultz et al., id., 7,459 bis 467 (1978); und Dean et al., Cancer Treatment Reports, 62, September 1978].

Ungeachtet der früher berichteten, chronischen Toxizität von verschiedenen Polymeren mit höherem Molekulargewicht vom EMA-Typ wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Untersuchungen durchgeführt, um die Polymeren dieses allgemeinen Typs weiterhin hinsichtlich ihrer immuno-regulierenden Aktivität zu bewerten. Neue Annäherungen und neue Verfahren der Bewertung wurden eingeführt, welche die Erkenntnis der immunoregulierenden Aktivität ohne begleitende Cytotoxizität ermöglichten. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass gewisse dieser in neuerer Zeit bewerteten Verbindungen keine direkte cytotoxische Aktivität besitzen, jedoch wurde überraschenderweise und unerwarteterweise gefunden, dass sie sehr wirksam gegen Tumor-Metastasen und Tumor-Rezidive nach Exzision oder Entfernung eines voluminösen Tumors sind. Demzufolge sind diese Verbindungen als besonders brauchbar in der Tumor-Therapie durch einen immunologischen Mechanismus indiziert. Sie sind brauchbar zur Verhinderung eines Tumor-Rezidivs oder einer Entwicklung von Metastasen, indem man sie nach der Exzision oder der Entfernung eines voluminösen Tumors durch den Chirurgen, nach Röntgenbestrahlung oder cytotoxischer Chemotherapie verabreicht.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde eine neue Gruppe von Verbindungen des oben erwähnten allgemeinen EMA-Typs synthetisiert, die gegen Tumor-Metastasen und Tumor-Rezidive bei Säugetieren wirksam sind, obwohl ihnen eine starke primäre Antitumor-Aktivität fehlt. Diese Verbindungen sind Copolymere aus Olefinmonomeren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und a,ß-ungesättigten Polycarbonsäure-anhydriden mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, die so derivati-siert sind, dass sie sowohl Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppen als auch Imidgruppen enthalten, wobei das underivatisierte Copolymer ein Zahlenmittel-Molekulargewicht im

Bereich von 300 bis 1500 hat und die Imidgruppen 5 bis 40 Gew.-°o der derivatisierten Gruppen ausmachen. Erläuternde Beispiele für derartige Olefinmonomeren sind Äthylen, Pro-pylen und Isobutylen; erläuternde Beispiele für derartige Polycarbonsäureanhydride sind Maleinsäureanhydrid, Citra-consäureanhydrid und Aconitsäureanhydrid. Von diesen monomeren Komponenten werden Äthylen und Maleinsäureanhydrid bevorzugt.

Die Struktureinheiten der bevorzugten Copolymere aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid können z.B. durch folgende Formeln wiedergegeben werden:

a) als Halb-amid,halb-carboxylatsalz vorliegende Struktureinheiten:

CK^—CK — CE — CK-

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o=c c=o

1 L +

NX2 0 Y

b) als Imid vorliegende Struktureinheiten:

' CHr— CH5—CH—CH~

2 2 1 1

o=c c=0 \/

N

35 worin

X ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Wasserstoffatom, ist,

Y ein Wasserstoffatom, Ammonium oder ein pharmazeutisch verträgliches Metallkation, vorzugsweise Ammonium, 40 bedeutet und

Z ein Wasserstoffatom, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Ammonium oder ein pharmazeutisch verträgliches Metallkation, vorzugsweise ein Wasserstoffatom, ist.

Die Einheiten der Formel (a) bzw. (b) bilden in der Regel 45 eine im wesentlichen lineare, ununterbrochene Kohlenstoffatomkette. 5 bis 40 Gew.-"/o der derivatisierten Gruppen sind Imidgruppen; der Rest besteht normalerweise hauptsächlich aus Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppen. Die Einheiten der Formel (a) und (b) können statistisch innerhalb der Kette 50 und/oder statistisch innerhalb des Copolymeren angeordnet sein. Es ist klar, dass ein kleiner Teil der Struktureinheiten (von dem angenommen wird, dass er kleiner als 10 Gew.-% ist) in Form von Monoammoniumcarboxylatsalz oder einem anderen pharmazeutisch verträglichen Monosalz und/oder 55 als Dicarbonsäure vorliegen kann, weil diese Einheiten aus . während der Herstellung dieser Verbindungen teilweise umgesetztem oder nicht umgesetztem Anhydrid entstanden sind.

Von den vorstehenden derivatisierten Gruppen ist die (a) 60 Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppe vorzugsweise Halb-amid.halb-ammoniumsalz und die (b) Imid-Gruppe vorzugsweise nichtsubstituiertes Imid.

. Die Struktureinheiten des bevorzugten Copolymeren aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid in seiner bevorzugten deri-05 vatisierten Form können durch die folgenden Formeln wiedergegeben werden:

a) als Halb-amid,halb-ammoniumsalz vorliegende Struktureinheiten:

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CH^— CH5—CH—CH

2 2 f I o=c c=o

I I. +

NH2 0 NHj b) als nichtsubstituiertes Imid vorliegende Struktureinhei- 10

ten:

-CH5—CH5— CH—CH—

2 2 I I o=c c=o

\/

N H

Wie oben bilden die Einheiten der Formel (a) bzw. (b) in der Regel eine im wesentlichen lineare, ununterbrochene Kohlenstoffatomkette. 5 bis 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen sind vorzugsweise nichtsubstituierte Imidgruppen, 25 während der Rest normalerweise hauptsächlich aus den bevorzugten Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppen besteht. Diese Einheiten können statistisch innerhalb der Kette und/oder statistisch innerhalb des Polymeren angeordnet sein. Es ist klar, dass ein kleiner Teil der Struktureinheiten 30 (von dem angenommen wird, dass er weniger als 10 Gew.-% beträgt)-als Monoammoniumcarboxylatsalz oder Dicarbon-säure zugegen sein kann, weil diese Einheiten aus während der Herstellung dieser Verbindungen teilweise umgesetztem oder nicht umgesetztem Anhydrid entstanden sind. 35

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind vorzugsweise wasserlöslich.

Die Erfindung wird ferner durch die anliegenden Zeichnungen erläutert, in welchen

Fig. 1 den Fingerprintbereich des Infrarot-Absorptions- 40 spektrums eines repräsentativen erfindungsgemässen Copolymeren zeigt, das so derivatisiert ist, dass die Imidgruppen 20 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen (vgl. das weiter unten folgende Beispiel 1, Stufe 3, Tabelle IV, Versuch 5).

Fig. 2 zeigt für Vergleichszwecke den Fingerprintbereich 45 des Infrarot-Absorptionsspektrums eines entsprechenden Copolymeren, das keine Imidgruppen enthält [vgl. das weiter unten folgende Beispiel 1, Stufe 2(a)].

Fig. 3 zeigt für Vergleichszwecke den Fingerprintbereich des Infrarot-Absorptionsspektrums eines entsprechenden 50 Copolymeren, das so derivatisiert ist, dass die derivatisierten Gruppen alle Imidgruppen sind (vgl. das weiter unten folgende Vergleichsbeispiel 1).

Obwohl die canadische Patentschrift 664 326 die Verwendung des Halb-amid,halb-ammoniumsalzes von Copolyme- 55 ren des EMA-Typs oder die Verwendung von Imiden oder partiell imidisierten Derivaten von Copolymeren des EMA-Typs im Hinblick auf ihre antineoplastische Aktivität offenbart, wird angenommen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen neu sind. Diese neuen Verbindungen haben über- 60 raschenderweise brauchbare, immunoregulierende Eigenschaften, die von den entsprechenden Polymeren, die nur die (a)- oder nur die (b)-Einheiten haben oder ein wesentlich höheres Molekulargewicht aufweisen, nicht gezeigt werden. Vergleichsweise wurde auch von den entsprechenden mono- 05 meren Bruchstücken dieser Verbindungen, nämlich von Suc-cinimid und Succinamidsäure (mit Ammoniak behandeltes Bernsteinsäureanhydrid), früher erwähnt, dass diese Verbindungen keine signifikante, tumorinhibierende Wirksamkeit besitzen [Regelson et al., Nature (London), 186,778 bis 780 (I960)].

Die nichtderivatisierten Copolymeren mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 1500, von denen die erfindungsgemässen Verbindungen abgeleitet sind, können nach wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden, wie sie beispielsweise in den US-Patentschriften 2 857 365,

2 913 437,2 938 016 und 2 980 653 beschrieben wurden. Typischerweise wird das Olefin, beispielsweise Äthylen, mit dem Polycarbonsäureanhydrid, beispielsweise mit Maleinsäureanhydrid, bei Temperaturen im Bereich von etwa 40 °C bis etwa 100 °C in Gegenwart eines freie Radikale bildenden Katalysators und eines flüssigen Lösungsmittels, das ein •Lösungsmittel für die Reaktionsteilnehmer und ein Nichtlö-sungsmittel für das gebildete Copolymere ist, umgesetzt. Die Polymerisation fördernde, freie Radikale bildende Katalysatoren vom herkömmlichen Peroxid-Typ und Azo-Typ sind für diesen Zweck hervorragend geeignet, und es wird beispielsweise Benzoylperoxid bevorzugt. Inerte Lösungsmittel, wie Benzol, Halogenbenzole und Halogenparaffine, sind brauchbare Lösungsmittel für die Polymerisationsreaktion. Jedoch ist ein alkylierter aromatischer Kohlenwasserstoff, der zumindest einen a-Wasserstoff besitzt, wie beispielsweise Äthylbenzol, Isopropylbenzol, Diisopropylbenzol, Toluol oder Xylol, ein bevorzugtes flüssiges Medium für die Polymerisationsreaktion, um das Molekulargewicht des Copolymerproduktes herabzusetzen, wie dies in der US-Patentschrift 2 913 437 beschrieben wurde.

Äthylbenzol wird als flüssiges Medium für den letztgenannten Zweck besonders bevorzugt. Das Copolymere enthält bevorzugterweise im wesentlichen äquimolare Mengen an Olefin- und Anhydrid-Einheiten, wie es durch Einsatz von etwa äquimolaren Mengen der reagierenden Monomeren erhalten wird. Das entstehende Copolymer-Produkt kann in fester Form erhalten und leicht durch Filtration, Zentrifugie-ren und dergleichen Trennverfahren gewonnen werden.

Es ist ersichtlich, dass der freiradikalische Initiator, und zwar sowohl durch Initiierung der Polymerisationsreaktion als auch durch anschliessende Absättigung der Endgruppen oder Telomerisation mit dem flüssigen alkylierten aromatischen Kohlenwasserstoff-Medium, die Einführung von verschiedenen organischen Gruppen in das Copolymer bewirken wird. Der Prozentgehalt dieser Anteile in dem gesamten Copolymer wird ansteigen, wenn das Molekulargewicht des Copolymeren abnimmt. Beispielsweise wird die Verwendung von Benzoylperoxid als freiradikalischer Initiator und Äthylbenzol als flüssiges Reaktionsmedium die Einführung ihrer entsprechenden aromatischen Gruppen in das Copolymere bewirken. Diese Gruppen werden einen höheren Prozentsatz der Gesamtstruktur der Copolymeren mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht von 300 als bei den Copolymeren mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht von 1500 ausmachen.

Es ist ferner zu erkennen, dass bei der Herstellung dieser Copolymeren mit einem Zahlenmittel-Molekulargewicht von 300 bis 1500 eine gewisse Menge eines Vernetzungsmittels in das Copolymere inkorporiert werden kann, um das Produkt hierdurch wasserunlöslich zu machen. Beispiele derartiger Vernetzungsmittel sind Vinyl- und Allylester, insbesondere die Acrylate und Crotonate, wie sie in der US-Patentschrift

3 165 486 beschrieben werden. Die Copolymeren können auch nach ihrer Derivatisierung auf verschiedene Weise unlöslich gemacht werden, wie beispielsweise durch Vernetzung mit Diamin, wie dies in der US-Patentschrift 3 554 985 beschrieben wurde, oder durch Aufbringen auf Träger, wie Bentonit, Latexteilchen oder Erythrocyten.

Es ist bekannt, dass Amid-Derivate der Copolymeren vom EMA-Typ durch Umsetzen des Copolymeren mit Ammoniak

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gas bei gewöhnlichen oder erhöhten Temperaturen hergestellt werden können, wie dies in der canadischen Patentschrift 664 326 und in den US-Patentschriften 2 883 287 und 3 157 595 beschrieben wurde. Es ist ferner bekannt, dass die Reaktion bei höheren Temperaturen dazu führt, die Imidbil-dung zu fördern, während eine Reaktion in inerten organischen flüssigen Lösungsmittelmedien, wie beispielsweise in Benzol, dazu verwendet werden kann, die Reaktionstemperatur zu steuern und die Imidbildung zu verzögern. Ein anderes bekanntes Verfahren zur Amidbildung umfasst die Reaktion des Copolymeren in flüssigem Ammoniak bei -33 °C.

Während die vorerwähnten Verfahren ganz allgemein zur Herstellung des Halb-amid,halb-ammoniumsalzes als Zwischenstufe zur Herstellung der Imid-enthaltenden Derivate brauchbar sind, sind sie wegen eines Zeit-Diffusionseffekts des Ammoniaks in den inneren Kern der EMA-Teilchen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unzulänglich, wie dies in dem nachstehenden Beispiel 2 beschrieben wird. Ein bevorzugtes Verfahren für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst zunächst das Auflösen des Copolymeren vom EMA-Typ in Aceton und anschliessend die Reaktion des aufgelösten Copolymeren mit flüssigem Ammoniak in Aceton. Das gewünschte Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Pro-dukt fällt aus der Lösung aus und kann dann leicht durch Filtration, Zentrifugieren und dergleichen Abtrennverfahren, wie sie weiter unten in Beispiel 1, Stufe 2, Teilen a, b und c, erläutert sind, gewonnen werden. Fig. 2 der anliegenden Zeichnungen zeigt das Infrarot-Spektrum des Halb-amid, halb-ammoniumsalz-Produkts des erwähnten Beispiels 1, Stufe 2(a), welches keine Imidgruppen enthält.

Die Herstellung des gewünschten, Imidgruppen enthaltenden Derivates kann bewirkt werden, indem man das Zwischenprodukt Halbamid,halb-ammoniumsalz mit Ammoniak unter weiterer Derivatisierung des Copolymeren derart umsetzt, dass es sowohl a) Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppen als auch b) Imid-Gruppen enthält, wobei die Imid-Gruppen von 5 bis 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen, und indem man gegebenenfalls die Halb-ammoniumsalz-Gruppe in andere pharmazeutisch verträgliche Salzgruppen umwandelt. Die Reaktion kann in geeigneten organischen Lösungsmittelmedien, wie beispielsweise in Toluol oder Xylol, bei Rückflusstemperaturen durchgeführt werden, bis der gewünschte Prozentgehalt an Imid-Gruppen gebildet ist, wie dies in den weiter unten stehenden Beispielen 1 und 2 erläutert wird. Die Rückflusstemperaturen können von etwa 50 bis etwa 200 °C, vorzugsweise von etwa 60 bis etwa 150 °C, und besonders bevorzugt von 100 bis 150 °C, variieren.

Fig. 1 der anliegenden Zeichnungen zeigt das Infrarot-Spektrum eines repräsentativen Beispiels (Beispiel 1, Stufe 3, Tabelle IV, Versuch 5) des gewünschten Copolymeren, das so derivatisiert worden ist, dass es sowohl a) Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppen als auch b) Imid-Gruppen enthält, wobei die Imidgruppen 20 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen. Das Copolymere dieses Beispiels hat im underivatisierten Zustand ein Zahlenmittel-Molekulargewicht von etwa 850, und der Wert von 20 Gew.-% Imidgruppen liegt innerhalb des bevorzugten Bereiches von 10 bis 25 Gew.-% Imidgruppen.

Für Vergleichszwecke wurde auch, wie dies in dem nachfolgenden Vergleichsbeispiel 1 erläutert wird, ein Imid-Deri-vat des EMA-Copolymeren mit 100 Gew.-% Imidgruppen hergestellt. Fig. 3 der Zeichnungen zeigt das Infrarot-Spektrum dieses Polymeren.

Eine detaillierte Beschreibung der Infrarot-Analyse zur Identifikation der verschiedenen, vorerwähnten funktionellen

Gruppen, wie sie in den Fig. 1 bis 3 erläutert werden, wird im Anschluss an Beispiel 1, Stufe 1 weiter unten gegeben.

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen für die immunoregulierende Behandlung zur Tumor-Therapie zu zeigen, wurden repräsentative Beispiele der Polymeren verschiedenen Untersuchungen wie folgt unterworfen:

In einer Versuchsreihe wurden die Polymeren in einem Virus-induzierten, nichtmetastatischen Maustumor-Modell untersucht. Das angewandte Modell war das SV-40-Virus-induzierte Fibrosarkom (mKSA) von syngenetischer BALB/c-Maus-Herkunft.

Dieser Mäusetumor, mKSA-TU5, wurde durch Kit et al., Int. J. Cancer, 4, 384 bis 392 (1969) produziert, und es ist von ihm nicht bekannt, dass er in syngenetischen BALB/c-Mäu-sen regrediert. In diesen Versuchsreihen standen die beobachteten Tumorregressionen in Beziehung zur Immunostimulation und Reduktion der Tumorbelastung in Übereinstimmung mit Dean et al., Int. J. Cancer, 16, 465 bis 475 (1975), der zeigte, dass mKSA Tumor-assoziierte Antigene besitzt, und dass bei Tieren, die an einem kleinen Tumor leiden, eine gute wechselseitige Beziehung mit einer zellvermittelten Immunität besteht. Die Mäuse wurden mit drei verschiedenen Dosen der zu untersuchenden Verbindung entweder vor oder nach oder sowohl vor und nach der Reizbehandlung mit lebensfähigen Tumorzellen bei einer TDioo und TDso behandelt. Das Wachstum der Tumoren wurde dann bei den behandelten Tieren gegenüber normalen, nicht behandelten Kontrollmäusen abgeschätzt. Bei diesen Versuchsreihen zeigten Polymere der vorliegenden Erfindung mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 850 eine wesentlich grössere Tumorregressionsaktivität, als die entsprechenden Polymeren mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 3000 und einem Molekulargewicht von 20 000 bis 50 000.

In einer anderen Versuchsreihe wurden repräsentative Polymere der vorliegenden Erfindung in einem chemischinduzierten, metastasierenden Ratten-Tumormodell untersucht. Das angewandte Modell war ein durch 3-Methylchol-anthren induzierter Blasenkrebs (BLCA) bei Fischer-344-Ratten [Prehn R.T. et al., J. Nat. Can. Inst., 18, 769 (1957) und Falk R. et al., Surgery, Oktober (1978)]. Von den Tumorzellen, die eine Passage in Zellkultur von über fünf Jahren hinter sich hatten, war es bekannt, dass sie nach subcutaner (SC) Implantation die Lungen innerhalb einer Woche nach der Implantation metastasieren. Die übliche Überlebenszeit nach der subcutanen Tumor-Implantation beträgt drei Wochen oder weniger.

In einem Teil dieser Versuche in dem metastasierenden Ratten-Tumormodell wurde das zu untersuchende Polymere periodisch in etwa Wochenintervallen während drei Wochen im Anschluss an die Tumor-Implantation verabreicht. Diese behandelten Tiere hatten eine Überlebensrate von mehr als das Dreifache derjenigen der unbehandelten Kontrolltiere und es wurde kein metastatisches Wachstum während der sechswöchigen Beobachtungsdauer notiert.

In einem anderen Teil dieser Versuche in dem metastasierenden Ratten-Tumormodell wurde das zu untersuchende Polymere als Hilfsmittel zur Tumorexzision an den Tagen 7 bis 10 nach der Tumorübertragung verabreicht. Die behandelten Tiere wurden auf ein Tumor-Rezidiv nach Exzision gegenüber unbehandelten Kontrolltieren beobachtet. Bei den Kontrolltieren war ein Wiederauftreten von Tumor innerhalb von sechs Wochen nach der Resektion zu 100% mit einer Durchschnittszeit von 32 Tagen zu beobachten, wohingegen bei den mit den bevorzugten Polymeren dieser Erfindung in einer Menge von 30 mg/kg behandelten Tieren während der ersten sechs Wochen keine Rezidive auftraten und nach 10 Wochen ein Tumor-Rezidiv bei nur 13% der Tiere beobachtet wurde.

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In wieder einer anderen Versuchsreihe wurden repräsentative Polymere der vorliegenden Erfindung bei Ratten vom normalen Lewis-Stamm untersucht, und es wurde gefunden, dass sie die Immun-Reizbeantwortung stimulieren, wie dies durch einen Anstieg der Antikörperbildung gezeigt wurde.

Wiederum andere Untersuchungen bei normalen Ratten vom Lewis-Stamm zeigten eine B-Zellen-Aktivierung durch repräsentative Polymere der vorliegenden Erfindung ohne die Gegenwart von T-Zellen, und demgemäss die Verwendung dieser Polymeren als Thymusfunktionsersatz. T-Zellen sind von der Thymusdrüse abstammende Lymphozyten, wohingegen B-Zellen Lymphozyten sind, die sich in dem Schleimbeuteläquivalent oder Knochenmark differenzieren.

Eine weitere Untersuchung bei Ratten vom normalen Lewis-Stamm auf eine Erhöhung der peritonealen Makrophagen und die Aktivität von Latex-Phagozytose der Makrophagen hat gezeigt, dass die immunoregulierende Wirkung dieser Polymeren auf die B-Zellen-Aktivität nicht durch Stimulation der Makrophagen-Aktivität bewirkt wird. Die Polymeren dieser Erfindung scheinen daher anders als die verwandten Pyran-Copolymeren des Standes der Technik zu wirken, welche durch das RES mittels Erhöhung der Makrophagen-Funktion wirksam werden.

Eine detaillierte Beschreibung der vorerwähnten und . anderer derartiger Untersuchungen und die entsprechenden Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tests 1 bis 16 niedergelegt.

Erfindungsgemäss können die oben definierten Polymeren einem Wirt in einer wirksamen immunoregulierenden Menge als Hilfsmittel zur Tumor-Chemotherapie, Tumor-Bestrahlungstherapie und/oder Tumorexzision verabreicht werden. Derartige Hilfsmittel bei der Tumor-Therapie können zu etwa der gleichen Zeit wie die Therapie oder innerhalb einer geeigneten Zeit vor oder nach einer derartigen Therapie verabreicht werden. Gewöhnlich wird eine derartige Verabreichung innerhalb eines Zeitraums von zwei Tagen unmittelbar vor und eines Monats-Zeitraums unmittelbar nach einer derartigen Therapie erfolgen. Untersuchungen zeigen, dass eine Clearance (Eliminierung aus dem Blut) eines bevorzugten, wasserlöslichen erfindungsgemässen Copolymeren in etwa 30 bis 60 Tagen erfolgt, und demzufolge ist es zu erwarten, dass eine Verabreichung von Booster-Dosen des Polymeren etwa alle sechs Wochen vorgenommen werden kann.

Die Copolymeren können sowohl parenteral als auch oral in Mengen beispielsweise im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht verabreicht werden. Sie können sowohl intravenös als auch intraperitoneal, vorzugsweise in wässeriger Lösung, wie als sterile Wasser- oder als Kochsalzlösung, verabreicht werden. Auf dem oralen Wege können sie in Form von Tabletten, Pulvern, Kapseln, Elixieren und dergleichen Dosierungsformen in Mischung mit üblichen festen und flüssigen Verbindungsmitteln, Trägern, Suspendiermittel 5 und Adjuvanten, wie beispielsweise mit Maisstärke, Lactose, Talk, Stearinsäure, Magnesiumstearat, Gelatine, Gummi arabicum und Robinia pseudacacia-Bohnengummis, Alkohol, Wasser, Dimethylsulfoxid (DMSO), Pflanzenölen und dergleichen Materialien, dargeboten werden. Die orale Dosie-10 rungsform ist vorzugsweise ein Feststoff, der zum Zeitpunkt der Verabreichung wieder in einer geeigneten flüssigen Mischung aufgelöst wird, um die Stabilität der zwei Gruppierungen aus (a) Halb-amid,halb-carboxylatsalz und (b) Imid aufrechtzuerhalten. Andere geeignete Dosierungen der Copo-15 lymeren zur Bewirkung eines gewünschten, immunoregulierenden Effekts können unter Bezugnahme auf die nachfolgenden spezifischen Beispiele bestimmt werden. Eine bevorzugte Dosierungsform der Verabreichung des Polymeren ist die in physiologischer Kochsalzlösung. 20 Die nachfolgenden detaillierten Beispiele und Vergleichsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, sollen diese jedoch keinesfalls beschränken. In allen Beispielen ist die prozentuale Ausbeute die prozentuale theoretische Ausbeute, basierend auf dem gewonnenen Produkt.

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Beispiel 1

Stufe 1 : Herstellung von EMA

Das gewünschte Rohmaterial Äthylen/Maleinsäurean-hydrid-Copolymere (EMA) wurde in einem heizbaren Reak-3o tor aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 1 gallon (3,79 1) hergestellt, der mit einer innenliegenden Kühlschlange für Wasser, einem magnetisch angetriebenen Rührer, der optimalerweise bei 1000 bis 1200 UpM betrieben wurde, einem Äthylen-Zuführstutzen und einem Stutzen, 35 durch welchen zusätzlicher Katalysator in Lösung in das Äthylen eingepresst werden konnte, versehen war. Proben oder der fertiggestellte Inhalt konnten durch einen Stutzen am Boden abgezogen werden. Hilfsvorrichtungen zur Heiz-und Kühlkontrolle waren vorgesehen. In einem typischen io Versuch, bestand die in den Reaktor eingebrachte Charge aus 1625 g (1875 ml) Äthylbenzol, 190 g (1,94 Mol) Maleinsäureanhydrid und 14,1 g (0,058 Mol) Benzoylperoxid, gelöst in 80 g (92 ml) Äthylbenzol. Das Katalysatorgefäss wurde nach Zugabe des Katalysators in den Reaktor mit einer zusätzli-45 chen Menge von 20,0 ml Äthylbenzol gespült. Der Reaktor wurde geschlossen und zweimal Äthylen bei Raumtemperatur aufgepresst und wieder entspannt, um die Luft in dem System zu verdrängen. Danach wurde die Temperatur auf 70 °C gebracht und bei dieser Temperatur während der Gesamt-

Tabelle I

Vers. Maleinsäureanhydrid- EMA-Produktgewinnung Wasserstoff Kohlenstoff Spezifische Viskosität Äquivalent-Umwandlung ("'<>) g (% Ausbeute) (%)* (%)* 1% DMF bei 25 °C** gewicht***

A

91,5

185 (68,8)

4,98

57,34

0,064

138,5

B

98,6

227 (83,6)

5,03

58,11

0,068

139,9

C

98,3

223 (82,1)

5,10

58,15

0,063

140,0

D

98,3

219(81,1)

5,04

58,24

0,066

139,1

E

97,9

223 (81,7)

5,10

57,89

0,063

140,6

F

97,9

225 (81,9)

5,12

58,14

0,061

141,5

G

98,6

224 (82,4)

5,11

58,05

0,064

140,1

* Mittelwert aus zwei Bestimmungen.

** Im wesentlichen gemäss dem ASTM D-2515-74-Verfahren; Ostwald-Viskosimeter.

*** Gewicht in Gramm enthaltend eine Moleinheit Anhydrid, bestimmt durch potentiometrische "pH-Titration einer wässerigen Lösung mit einer Standard-NaOH-Lösung.

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25

30

dauer der Polymerisation bei einem Äthylenbeschickungs- und druck von 200 psi (14 bar) gehalten. Nach dreistündiger Dauer der Polymerisation bei 70 °C und 200 psi (14 bar) Äthylendruck erfolgte eine Zugabe von 9,4 g (0,039 Mol) Benzoylperoxid in 60 g (70 ml) Äthylbenzol durch die Katalysa-tor-Zuführungsleitung, gefolgt von einer Spülung dieses Eingangsstutzens mit 20 ml Äthylbenzol. Das Rühren und Erhitzen auf 70 °C bei 200 psi (14 bar) Äthylenbeschickung wurde dann zusätzliche 14 Stunden lang fortgesetzt, um die Polymerisation zu vervollständigen. Am Ende des Versuches wurde der Reaktor abgekühlt und entspannt. Der Inhalt bestand aus einer Aufschlämmung des als Produkt erhaltenen Äthylen/ Maleinsäureanhydrid-Copolymeren (EMA) in Äthylbenzol und einer kleinen Menge an EMA-Produkt als glasartigem Überzug auf dem Rührer, der Kühlschlange und den Reaktoroberflächen. Diese Aufschlämmung wurde filtriert, danach mit dem glasigen Material, das durch Abkratzen entfernt worden war, vereinigt, und die Umwandlung von Maleinsäureanhydrid an dem Filtrat durch NaOH-Titration bis zum Endpunkt mit Phenolphthalein bestimmt.

Die gesamte EMA-Produkt-Aufarbeitung bestand aus der Filtration, der dreimaligen Extraktion (jeweils 1 Stunde) der Aufschlämmung mit 2 Liter Xylol bei Raumtemperatur,

gefolgt von 3 Extraktionen (jede 1 Stunde) mit 2 Liter Hexan und abschliessender Filtration. Zwischen allen Extraktionsstufen wurde ebenfalls eine Filtration durchgeführt. Das endgültige EMA-Produkt wurde über Nacht im Vakuum bei vollem Olpumen-Vakuum und einer Temperatur von 55 bis 60 D C getrocknet. Das so getrocknete EMA-Produkt wurde in einem Waring-Mischer 5 Minuten lang pulverisiert, um den kleineren Anteil an glasiertem Material bis zur Pulverkonsistenz zu zerkleinern. Die vorstehende Tabelle I gibt summarisch die bei sieben derartiger aufeinanderfolgenden EMA-Polymerisationen erzielten Ergebnisse wieder.

Die Molekulargewicht-Parameter wurden an dem EMA- 35 Produkt unter Verwendung des Präparates F als typischem Produkt bestimmt. Das Material wurde 24 Stunden lang bei 100 °C im Ölpumpen-Vakuum vakuumgetrocknet. Die Parameter wurden in trockenem Dimethylformamid (DMF)

bestimmt. Für das Präparat F wurde das durchschnittliche 40 Molekulargewicht (Zahlenmittel; Mn) zu 852 nach der Dampfdruckosmometrie in DMF bei 120 °C unter Verwendung eines Knauer-VP-Osmometers bestimmt. Das durchschnittliche Molekulargewicht (Gewichtsmittel; Mw) wurde unter Verwendung von enggewinkeltem Laser-Streulicht, wie- 45 derum in DMF, mit einem Chromatix-KMX-6-Instrument zu 5730 bestimmt. Die intrinsic viscosity in DMF bei 25 °C wurde durch Kapillarviskosimetrie unter Verwendung eines Cannon-Ubbelohde-Verdünnungsviskosimeters (Grösse 75)

durch Extrapolation von vier verschiedenen Konzentrationen 50 auf die Konzentration Null gemessen. Für die intrinsic viscosity des Präparates F wurde ein Wert von 0,0607 dl/g gefunden.

Ähnliche Bestimmungen von Mn, Mw und der intrinsic viscosity wurden in identischer Weise unter Verwendung eines 55 EMA-Präparates von höherer spezifischer Viskosität (0,11,1%, , DMF, 25 °C) durchgeführt. In diesem Falle wurde für die intrinsic viscosity ein Wert von 0,1227 dl/'g, für Mn ein Wert von 2264 und für Mw ein Wert von 12970 gefunden.

Unter Verwendung der vorstehenden Werte für zwei 60 EMA-Produkte mit variierender spezifischer Viskosität wurden die Konstanten K und a in der Staudinger-Gleichung,

[rj] = K x M", welche die intrinsic viscosity [rj] mit dem Molekulargewicht verknüpft, bestimmt. Die gefundenen Beziehungen waren :

[r)]25MF = 3,51 x 10~5 x Mw 0,86

Der Ausdruck «durchschnittliches Molekulargewicht», wie er in dieser Bechreibung mit Bezug auf die offenbarten und beanspruchten Copolymeren dieser Erfindung verwendet wird, soll das mittlere Molekulargewicht (Zahlenmittel) bedeuten.

Identifizierung der funktionellen Gruppen

Die Identifizierung der verschiedenen funktionellen Gruppen für alle Beispiele der polymeren Derivate, und zwar sowohl qualitativ als auch quantitativ, wurde mittels Infrarot-Analyse unter Verwendung eines Beckman IR-12-Spektro-photometers bewerkstelligt. Die Probenherstellung, die Extinktionsbereich-Zuordnungen und die Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses von Imid-Gruppen zu Amid-Gruppen wurden nach den Methoden durchgeführt, die entweder in «The Infrared Spectra of Complex Molecules», Bel-lamy, John Wiley and Sons, 1960, oder in «Practical Infra-red Spectroscopy», Cross, Butterworth, 1964, niedergelegt sind. Die Probenherstellung verwendete in allen Fällen Presslinge aus 2 mg Polymerem pro 250 mg trockener KBr-Zubereitung mit 70 mg der Mischung Polymeres/KBr pro Pressling. Die Lagen der absorbierenden Banden weren in Einheiten der Wellenzahl angegeben, die in reziproken Zentimetern (cm-1) angeführt werden, gewöhnlich als Bandfrequenzen bezeichnet.

Als qualitativer «Fingerabdruck» der Produktzusammensetzung bezüglich der Gegenwart oder Abwesenheit von gewissen Gruppen wurden die folgenden Bandfrequenz-Zuordnungen angenommen und verwendet:

Wellenzahl (cm-') Funktion

1. 5gliedriger Anhydrid-Ring, Dublett:

2. Undissoziierte aliphatische Säure (COOH):

3. Polymeres Imid,

1870-1830

Kleiner

1800-1760

Grösser

1725-1700

1715 Grösser

5gliedriger Ring, Dublett 1770 Kleiner

4. Polymeres primäres Amid, Amid-I-Bande:

1670 Grösser 1620 Kleiner

5. Carboxylation CCh

6. Methylen -CH2

1560-1570

1470-1450

[t||P5mf = 4,71 x 10_4x Mn0,72

7. Ammonium-(NH4l')-salz 1405-1400 von Carboxylat (Intensität hängt von der Natur des Kations ab)

c=o

Streckschwingung

C = 0

Streckschwingung c=o

Streckschwingung C = 0

Streckschwingung NH

Deformationsschwingung und C-N

Streckschwingung asymmetrische Streckschwingung C-H

Deformationsschwingung symmetrische Streckschwingung

644 874

8

Wellenzahl (cm""1) Funktion

8. Polymere mit einer 1180-1200 C-N

hohen Konzentration an Grösser Streckschwin-

Imid-Gruppen (über 60%) 1370-1350 gung enthalten auch ein Kleiner Dublett:

Ausser denjenigen, die in vorstehendem Punkt 3 gezeigt werden.

Für die quantitative Bestimmung des Imid/Amid-Gehal-tes eines Polymeren, das ausser der Ammoniumcarboxylat-Funktion beide Gruppen enthält, wurde ein Verhältnis der Absorptionsintensität der grösseren Imid-Bande bei 1715 cm-1 zur grösseren primären Amid-Bande bei 1670 cm-1 bestimmt. Der Imid-Gehalt wurde durch Vergleich des gemessenen Verhältnisses von Imid/Amid (oben) mit einer Standard-Kurve von Prozent Imid gegen Imid/Amid-Extink-tionsverhältnis bestimmt, hergestellt aus einer Reihe von Infrarot-Aufnahmen, erhalten durch Mischen von steigenden Mengen von reinem (etwa 100%) Imid (beschrieben in Beispiel 5) mit einem Polymeren, enthaltend kein Imid oder nichtionisiertes COOH, jedoch mit nur Amid- und ionisierten Carboxyl-Funktionen (beschrieben in Beispiel 2).

Für diese letztere Untersuchung des Imid/Amid-Verhält-nisses wurde dafür gesorgt, dass es sicher ist, dass nichtionisiertes Carboxyl nicht bei 1715 cm-1 anwesend ist, indem man zuerst die Probe in Wasser auflöste, den pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 10,0 einstellte und eine Gefriertrocknung durchführte, um irgendwelches nichtionisierte COOH in Ammoniumcarboxylat umzuwandeln. Derartige Verfahren erhöhen die Intensität der Carboxylat-Banden bei 1560 und 1400 cm-1, stellen jedoch sicher, dass die restliche Bande bei 1715 cm-1 tatsächlich von Imid herrührt.

In all den folgenden Ausführungen wird Bezug auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von funktionellen Gruppen und auf den Imid-Gehalt von Imid enthaltenden Polymeren auf der Basis der Anwesenheit oder Abwesenheit der obigen funktionellen Banden-Zuordnungen und der obigen Methode zur Bestimmung der quantitativen Imid/Amid-Bandeninten-sität-Verhältnisse genommen.

Stufe 2:

Herstellung von Halb-amid,halb-ammonium-COO~-salz von EMA (AEMA)

Frühere Verfahren zur Behandlung von EMA-Polymeren (wie sie in der US-Patentschrift 3 157 595 und der canadi-schen Patentschrift 664 326 offenbart worden sind) nach einem der drei Methoden, nämlich:

1. Trockenes Behandeln mit Ammoniak mittels Ammoniakgas bei gewöhnlichen Temperaturen mittels Einblasen von Ammoniak in heftig gerührtes EMA-Pulver;

2. Einblasen von Ammoniak in eine gerührte Aufschlämmung von EMA-Pulver in Benzol oder Hexan; oder

3. durch direkte Zugabe von festem EMA-Pulver zu einem gerührten Überschuss von flüssigem Ammoniak zur Bildung des Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylatsalzes von EMA haben sich als unzulänglich für die gegenwärtige Verwendung erwiesen.

Diese Unzulänglichkeit betrifft einen wesentlichen Zeit-Diffusionseffekt von Ammoniak in den inneren Kern von sogar sehr fein gemahlenen EMA-Teilchen. Auch bei einer verlängerten Reaktionszeit enthalten die so hergestellten Amid-Ammoniumsalz-Produkte stets restliche Mengen von nichtumgesetztem Anhydrid, annähernd 5 Gewichtsprozent,

wie dies durch die Anwesenheit von Anhydrid-Absorptionsbanden bei 1780 und 1850 cm-'-Frequenzen gezeigt wird.

Die nachfolgende bevorzugte Methode wurde entwickelt, um lange Reaktionszeiträume und schlechte Temperatursteuerung zu umgehen und Produkte zu bilden, die keine Anhydrid-Funktion enthalten.

a) EMA-Polymeres aus Stufe 1-F (80 g) wurde in 800 ml Aceton (analysenrein) gelöst und diese Lösung im Verlaufe eines Zeitraums von 20 Minuten zu einer gerührten Lösung von 100 ml flüssigem Ammoniak in 3 Liter Aceton bei

— 70 °C (Trockeneis-Aceton-Bad) zugegeben. Nach beendigter Zugabe liess man die gesamte Mischung sich allmählich auf Raumtemperatur erwärmen (4 Stunden), während welcher Zeit sich die Farbe des ausgefällten Produktes von

• anfänglich gelb in weiss änderte. Das Produkt wurde abfiltriert und nacheinander zweimal mit 2 Liter Aceton aufgeschlämmt, gefolgt von zweimaligem Aufschlämmen mit 1,5 Liter einer Aceton/Hexan-Mischung (50/50). Jede Aufschlämmstufe dauerte 30 Minuten. Das Endprodukt wurde abfiltriert und über Nacht bei 45 °C im Vakuum bei 20 bis 25 mm Hg getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 900 ml Wasser gelöst, durch ein 0,45-Mikron-Filter filtriert und gefriergetrocknet. Man erhielt 98,7 g (100% Ausbeute) Halb-amid, halb-ammoniumcarboxylsalz.

b) das vorstehende Verfahren (a) wurde wie folgt wiederholt unter Verwendung von EMA-Polymerem aus Stufe 1-F, wobei jedoch Wasser zu der ursprünglichen EMA-Lösung in Aceton zugegeben wurde. Das EMA (60 g) wurde in 500 ml Aceton plus 2,32 g Wasser gelöst und die Lösung am Rück-fluss 2 Stunden lang erhitzt. Die gekühlte Aceton-Lösung von EMA wurde unter Rühren innerhalb eines Zeitraums von 10 Minuten zu 2 Liter Aceton, die 3 Mol flüssiges Ammoniak enthielten, bei — 60 °C zugegeben. Man liess wie zuvor die Reaktions-Aufschlämmung sich auf Raumtemperatur erwärmen und arbeitete wie oben mit 2 Aufschlämmungen in 1,5 Liter Aceton und einer Aufschlämmung mit 1 Liter Hexan auf, filtrierte dann ab und trocknete über Nacht im Vakuum bei 40 °C und 20 bis 25 mm Hg. Das gewonnene Produkt bestand aus 84 g, was mehr als 100% Ausbeute war.

c) Ein drittes Präparat verwendete EMA-Polymeres aus Stufe 1-G. 100 g (0,714 Mol) EMA wurden 2 Stunden lang in 700 ml Aceton, das 3,85 g Wasser enthielt, am Rückfluss erhitzt. Die gekühlte Aceton-Lösung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 10 Minuten zu einer gerührten Lösung von 3,3 Liter Aceton, das 60 ml flüssiges Ammoniak enthielt, bei

— 50 °C zugegeben. Nach 1 Stunde bei — 50 °C liess man die Reaktions-Aufschlämmung sich allmählich auf Raumtemperatur erwärmen (2 Stunden). Das abfiltrierte Produkt wurde zweimal in 2 Liter Aceton (jeweils 30 Minuten) und zweimal in 2 Liter Hexan (jeweils 30 Minuten) aufgeschlämmt, filtriert und über Nacht bei 50 °C im vollen Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Das gewonnene trockene Halb-amid,halb-ammo-niumcarboxylsalz wog 115,6 g (93% Ausbeute).

Die Analyse der vorstehenden drei Präparate ist summarisch in der nachfolgenden Tabelle II niedergelegt.

Tabelle II

Präparat abc

Stickstoff (%; 13,40 14,18 14,19 Durchschnitt aus 2 Proben)

Funktionelle Zusammensetzung nach IR

Anhydrid Keines Keines Keines

Nichtdissoziiertes Keines Keines Keines COOH

Imid Keines Keines Keines

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

9

644 874

Präparat

Primäres Amid Ionisiertes C00~ Methylen -CHb--C00-NH4+

Vorwiegend Vorwiegend Vorwiegend Vorwiegend Vorwiegend Vorwiegend Ja Ja Ja

Vorwiegend Vorwiegend Vorwiegend und damit den prozentualen Imid-Gehalt festzusetzen- Die Ergebnisse sind in der Tabelle III niedergelegt.

Tabelle III

Zeitdauer unter Xylol-Rückfluss bei Probenentnahme pH-la pH-2b I/A-c Imidd Verh. Gew.-%

Stufe 3

Herstellung von partiellen Imid-Derivaten in Xylol

Eine 10-g-Probe des Halb-amid,halb-ammoniumcarboxyl-salzes von Stufe 2a wurde in 250 ml Xylol in einem 1-Liter-Kolben, der mit Rührer, Thermometer, Wasserabnahme-Falle und einem Gaseinleitungsrohr für Ammoniak versehen war, aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde während eines Zeitraums von 12 Stunden am Rückfluss erhitzt, wobei gleichzeitig ein stetiger Fluss von Ammoniak durch das Gaseinleitungsrohr aufrechterhalten wurde. Aliquote Proben der Pro-dukt-Aufschlämmung wurden zu verschiedenen Zeiten (vgl. Tabelle III) zur Analyse der Umwandlung in Imid mit der Zeit entnommen. Jede kleine Probe wurde durch drei aufeinanderfolgende Aufschlämmungen in 100 ml Hexan, Filtration und Trocknung bei 50 °C im Vakuum bei 20 bis 25 mm Hg aufgearbeitet. Der pH-Wert der 2%igen wässerigen Lösungen wurde sowohl vor als auch nach der weiteren Auflösung in Wasser, der pH-Wert-Einstellung auf 10,0 (NH4OH) und der Gefriertrocknung gemessen. Infrarot-Analysen wurden von allen Proben erhalten, um die Verhältnisse von Imid zu Amid

15 min

6,26

7,20

0,723

13,8

30 min

6,00

5,86

0,858

18,5

45 min

5,91

5,76

0,999

23,3

1 h

5,78

5,53

1,113

27,4

1,5 h

5,43

5,43

1,398

36,8

2h

5,27

5,76

1,501

40,2

3h

4,94

5,72

1,821

50,0

4h

4,78

5,38

-

-

6h

4,73

5,76

-

-

7,5 h

4,73

5.60

-

-

12h

-

_

-

_

a) Der pH-Wert der 2%igen wässerigen Lösung vor der pH-Werteinstellung.

b) pH-Wert einer 2%igen wässerigen Lösung, eingestellt 25 auf einen pH-Wert von 10, und gefriergetrocknet.

c) Verhältnis der IR-Bande-Absorptionsintensität bei einer Wellenzahl von 1715 cm _ 1 /1670 cm ~1.

d) Erhalten aus der Standard-Kurve von Zusammensetzung gegen I/A-Verhältnis.

Tabelle IV

Vers. Reaktionszeit Produktausbeute3 pH-lb pH-2c Stickstoffd I-Ae Imid1

Nr. unter Xylol-Rückfluss g (% Ausbeute) C'-'o) Verh. (%)

1

2 min

4,45 (90,1)

5,08

7,08

14,27

0,489

5,3

2

4 min

3,92 (92,6)

4,85

6,93

14,28

0,559

7,9

3

10 min

7,87 (80,5)

4,43

7,12

14,48

0,661

11,5

4

20 min

6,28(81,1)

4,52

6,74

13,82

0,798

16,5

5

30 min

6,15 (80,1)

3,99

6,39

13,67

0,911

20,4

6

45 min

6,30 (82,7)

4,60

6,69

13,71

1,020

24,1

7

1 h

6,30 (83,4)

4,70

6,22

13,80

1,139

28,2

8

1,5 h

6,15(82,6)

4,37

6,00

13,07

1,333

34,7

9

3,0 h

5,90 (81,9)

4,33

5,81

12,52

1,828

50,1

d Bei Versuch 1 wurden 5,0 g AEMA, bei Versuch 2 4,3 g, bei Versuch 3 10,0 g, bei den übrigen Versuchen 8,0 g eingesetzt. h pH-Wert einer 2%igen wässerigen Lösung vor der pH-Wert-Einstellung.

c pH-Wert einer 2°/oigen wässerigen Lösung, eingestellt auf einen pH-Wert von 10,0 und gefriergetrocknet.

d Erhalten bei einem pH-Wert-eingestellten, gefriergetrocknetem Produkt.

e Vgl. Fussnote (c) Tabelle III, gefriergetrocknetes Produkt.

1 Vgl. Fussnote (d) Tabelle III, gefriergetrocknetes Produkt.

Ein weiterer Satz von neun Einzeluntersuchungen wurde in Angriff genommen, wobei das Halb-amid,halb-ammoni-umcarboxylsalz von Stufe 2-b verwendet wurde. Jeder einzelne Versuch wurde in Xylol-Aufschlämmung für die notierte Zeit (Tabelle IV) am Rückfluss erhitzt und insgesamt aufgearbeitet. Die Trockenprodukte aus der Hexan-Wäsche wurden einzeln in 150 ml Wasser gelöst, mit NH4OH der pH-Wert auf 10,0 eingestellt, durch 0,20 Mikron-Filter filtriert und direkt in sterilen Serum-Flaschen gefriergetrocknet für eine in vivo-Tier-Bewertung. Die Ergebnisse und die Analysen der verschiedenen Versuche sind in der vorstehenden Tabelle IV niedergelegt.

Beispiel 2

Herstellung von partiellen Imid-Derivaten in Toluol

Partielle Imide von Halb-amid,halb-ammoniumcarboxyl-60 salz von EMA-Polymerem wurden im wesentlichen wie in Beispiel 1, Stufe 3 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Imidbildungsrate variiert wurde, indem man bei Toluol-Rückfluss (110 °C) in einer Toluol-Aufschlämmung, anstatt in Xylol, wie in Beispiel 1, Stufe 3, arbeitete.

o5 Der verwendete EMA stammte aus Stufe 1-F und das zur Herstellung des Halb-amid,halb-ammoniumsalzes angewandte Verfahren war das gleiche wie Stufe 2a ohne Wasserzugabe. Dieses Produkt zeigte grössere IR-Absorptionsban-

644 874

10

den für primäres Amid, ionisiertes Carboxyl und Ammoni-umcarboxylat ohne Anzeichen von Anhydrid oder Imid. 28 g dieses Amid-Ammoniumsalzes wurden in 1 Liter Toluol aufgeschlämmt und bis zum Rückfluss erhitzt. Nach 2 Stunden, 3,5 Stunden und 5 Stunden Rückflusszeit (Ende des Versuches) wurden 3 aliquote Teile entnommen. Die Produkte wurden durch Filtration isoliert, dreimal in 150 ml Toluol und dreimal in Petroläther aufgeschlämmt und 17 Stunden lang bei Raumtemperatur im Vakuum bei 25 mm Hg getrocknet. Die trockenen Produkte wurden dann in 100 ml Wasser gelöst, auf einen pH-Wert von 9,0 mit NH-tOH eingestellt, durch ein 0,20 Mikron-Filter filtriert und direkt in sterilen Serum-Fläschchen für In-vivo-Tier-Bewertung gefriergetrocknet. Die Ergebnisse waren folgende:

Toluol-Rückfluss

Produkt

Stickstoff

I/A-*

Imid**

(h)

(g)

(%)

Verh.

(%)

2

6,15

13,78

0,531

6,5

3,5

7,73

13,41

0,600

9,5

5

9,24

13,82

0,647

11,0

* Vgl. Fussnote (c) in Tabelle III - gefriergetrocknetes Produkt.

** Vgl. Fussnote (d) in Tabelle III - gefriergetrocknetes Produkt.

Vergleichsbeispiel 1

Herstellung eines vollständigen Imids von EMA EMA Sp. Visk. = 0,061

Das vollständige Imid von EMA wurde hergestellt, indem man 20 g des Produktes aus Stufe 2a in 250 ml Xylol als Aufschlämmung während eines Zeitraums von 18,5 Stunden unter einem konstanten Strom vom Ammoniak und unter Entfernen des Reaktionswassers in einer Dean-Stark-Falle am Rückfluss erhitzte. In der Falle wurden insgesamt 2,7 ml Wasser entfernt. Das Produkt wurde filtriert, dreimal mit Hexan aufgeschlämmt und über Nacht bei Raumtemperatur im Vakuum bei 25 mm Hg getrocknet. Das trockene Produkt wog 13,5 g, 84,3% Ausbeute. 3 g des Produktes wurden in 150 ml Wasser über Nacht gerührt, filtriert, mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Das Produkt hatte einen Stickstoffgehalt von 9,53% und eine IR-Analyse zeigte Absorptionsbanden nur bei Wellenzahlen von 1190,1360, 1715 und 1770 cm-1, typisch für eine Imid-Funktionalität. Es waren keine Amid-, Anhydrid-, ionisierte Carboxyl- oder Ammoni-umcarboxylat-Absorptionsbanden vorhanden.

Das obige vollständige Imid-Produkt wurde in verschiedenen Mischungen zusammen mit dem nicht-Imid-enthalten-den Halbamid,halb-ammoniumcarboxylatsalz aus Stufe 2a verwendet, um eine Imid/Amid-Infrarot-Zusammensetzungs-grundkurve aufzustellen, wie sie im Anschluss an Beispiel 1, Stufe 1 beschrieben wurde. Die angegebenen, auf einer analytischen Waage abgewogenen Mengen wurden unter Verwendung eines Wigglebug-Mischers in Mischern aus rostfreiem Stahl gemischt. Infrarot-Werte wurden an Presslingen der obigen Mischungen mit trockenem KBr unter Verwendung von 2 mg Polymer-Mischung auf 250 mg KBr bestimmt. Der Pellet bestand aus 70 mg Polymeres/KBr-Mischung pro Pressling. Die gesamte Grundkurve wurde aus den folgenden gemischten Zubereitungen aufgestellt:

Gewicht von vollständigem Imid von Vergleichsbeispiel 1 (mg)

Gewicht von 0% Imid von Stufe 2a

(mg)

Imid/Amid Absorptionsverhältnis

3

97

0,427

6

94

0,509

10

90

0,621

20

80

0,843

30

70

1,161

40

60

1,519

50

50

1,871

60

40

2,099

70

30

2,564

80

20

3,008

Vergleichsbeispiel 2

Herstellung eines vollständigen Imids von EMA EMA Sp. Visk = 0,66

Das vollständige Imid von EMA mit höherem Molekulargewicht, als das in Vergleichsbeispiel 1 verwendete, wurde unter Verwendung von EMA mit einer spezifischen Viskosität = 0,66 (1%, DMF, 25 °C) entsprechend einem Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 hergestellt. In diesem Falle wurde das mit Ammoniak behandelte EMA wie in Vergleichsbeispiel 3(a) hergestellt, indem man trockenes Ammoniakgas durch gerührtes EMA-Pulver bei einer Temperatur unterhalb 70 °C hindurchleitete. Das erhaltene Halb-amid,halb-ammo-niumcarboxylsalz von EMA-Pulver (spezifische Visk. = 0,66) wurde weiter bei erhöhter Temperatur erwärmt, um das Halb-amid in das Imid durch Abtreiben von Wasser umzuwandeln.

525 g des EMA mit einer spezifischen Viskosität von 0,66, das sich von Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylsalz ableitet, wurde heftig in einem Kessel mit einem Fassungsvermögen von 3 gallon (11,361), der mit Vorrichtungen zur Wasserabnahme und zum Einleiten eines kontinuierlichen Stroms von Ammoniakgas versehen war, gerührt. Die Temperatur wurde bis auf 122 °C angehoben, worauf Wasser in die Falle der Wasserabnahme zu fliessen begann. Nach 1 Stunde hatte die Temperatur 152 °C erreicht und 24 ml Wasser waren entfernt worden. Das Erhitzen unter Rühren und unter Druchströmen von Ammoniak wurde 5 Stunden lang fortgesetzt (insgesamt 6 Stunden), wobei eine Gesamtmenge von 54 ml Wasser erhalten wurde. Nach dem Abkühlen war das Produkt ein weisses mehliges Pulver. Der Stickstoffgehalt betrug 11,11% im Vergleich zum theoretischen Wert von 11,20%.

Dieses EMA-100%-Imid mit höherem Molekulargewicht wurde auf die Inhibierung von Tumorwachstum in einem unabhängigen Untersuchungslabor im Jahre 1958 untersucht und zeigte keine Aktivität (vgl. Test 15).

Vergleichsbeispiel 3

Herstellung von Halb-amid,halb-ammonium-COO--salz von EMA nach bekannten Verfahren mit und ohne Wasser a) Ein 4-Hals-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml wurde mit einem Teflon-Rührer, einem Thermometer, einem Gaseinleitungsrohr und einem Blasenzähler für den Gasausgang versehen. Das eintretende Ammoniakgas wurde durch einen Strömungsmesser geleitet, der den Durchfluss nur qualitativ anzeigte. In den Kolben wurden 25 g EMA aus Stufe 1-D eingebracht und das Pulver mit einer Geschwindigkeit von 500 UpM gerührt. Der eintretende Ammoniakstrom wurde auf einer solchen Höhe gehalten, dass von der Ausgangstemperatur aus 70 °C ohne Verwendung eines Heizmantels erreicht wurden. Nach 9 Minuten hatte das Pulver eine Temperatur von 70 °C erreicht, und es wurde die Eingangsmenge an Ammoniak so herabgesetzt, dass diese Tem5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

OD

11

644 874

peratur aufrechterhalten wurde. Eine Temperatur von 70 °C wurde während eines Zeitraums von 1 Stunde und 30 Minuten aufrechterhalten, nach welcher Zeit der Ammoniakeingang abgestellt und der Kolbeninhalt unter Stickstoff abgekühlt wurde. Die Ausbeute an trockenem, mit Ammoniak behandeltem EMA als Halbamid,halb-ammoniumcarboxylat betrug 30,8 g oder 98,8% Ausbeute. Der Prozentsatz Stickstoff betrug 14,01,14,18 und eine 2%ige wässerige Lösung hatte einen pH-Wert von 6,07. Die IR-Analyse zeigte Absorptionsbanden an für:

Nichtumgesetztes

Anhydrid bei 1780 und 1850

(weniger als 5%

geschätzt)

Primäres Amid bei 1670 und 1620

(vorwiegend)

Carboxylation bei 1565

(vorwiegend)

NH4+-Carboxylat bei 1405

(vorwiegend)

Imide

Keine

b) Eine zweite Ammoniakbehandlung von EMA aus Stufe 1D wurde wie unter (a) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das EMA zuerst mit Wasser, wie nachfolgend beschrieben, behandelt wurde, um die Reaktion mit Ammoniak zu verstärken und die Anhydrid-Komponente in dem Produkt herabzusetzen. 25 g EMA wurden bei 500 UpM bei 40 °C (Heizmantel) 6 Stunden lang in Gegenwart von 0,53 g (17 Molprozent) Wasser, das tropfenweise im Verlaufe der ersten 20 Minuten aus einer 1,0-ml-Injektionsspritze zugegeben wurde, gerührt. Nach 6 Stunden wurde das Pulver auf Raumtemperatur abgekühlt und die Behandlung mit Ammoniak wie unter (a) oben durchgeführt, wobei man die Temperatur in 10 Minuten auf 70 °C steigen liess. Die gesamte Zeit der Ammoniakbehandlung bei 70 °C betrug 1 Stunde und das Produkt wurde unter Stickstoff abgekühlt. Man erhielt 31,4 g oder 100,8% Ausbeute, wobei der Prozentgehalt an Stickstoff 14,02, 13,94 betrug und die 2%ige wässerige Lösung einen pH-Wert von 6,45 hatte. Die IR-Analyse lieferte die nachfolgenden Absorptionsbanden :

Nichtumgesetztes Anhydrid - Vorhanden, jedoch in viel geringerem Masse als in (a) Primäres Amid - Mehr als in (a)

Carboxylion - Mit NH^-Carboxylat

NH4+-Carboxylat - War gegenüber (a) erhöht

Imid - Nicht vorhanden

Vergleichsbeispiel 4

Kennzeichnung der früher hergestellten Produkte im wesentlichen wie in Vergleichsbeispiel 3

Während des Zeitraums von Juli 1956 bis Februar 1960 wurden die Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylatsalz-Deri-vate von mehreren Viskositätsgraden (verschiedenen Molekulargewichten) von EMA hergestellt und bewertet. Die Viskositätsgrade, angegeben als spezifische Viskosität bei 1,0 Gewichtsprozent in DMF bei 25 °C, lagen im Bereich von 1,19,0,60,0,11 bis 0,060. Die dem bestimmten Molekulargewicht (Mn) entsprechenden Werte waren 50 000 bis 60 000, 20 000 bis 30 000,2000 bis 3000 und 1000. Die ersten drei, d.h. die verwendeten EMA-Typen mit spezifischen Viskositäten von 0,11, 0,60 oder 1,19, wurden in einer grossen Versuchsanlage mit Ammoniak behandelt, wobei Produktmengen im Bereich von 600 bis 800 pounds (272 bis 363 kg) erhalten wurden. Das EMA mit der niedrigeren Viskosität (0,060) wurde in einer kleineren Laboratoriumsanlage mit Ammoniak behandelt, wobei 200 bis 300 g EMA eingesetzt wurden. Die Verfahren werden nachfolgend beschrieben, gefolgt von einer Kennzeichnung des zu dieser Zeit erhaltenen Produkts.

Übersicht über das Verfahren in der Versuchsanlage (über die EMA-Typen mit der spezifischen Viskosität von 1,19, 0,60 und 0,11)

Der verwendete Behälter zur Behandlung mit Ammoniak war ein «Stokes-Rotationstrockner, Modell 59AB» aus rostfreiem Stahl, der mit einem Mantel versehen war und ferner Vorrichtungen zur Einleitung von trockenem, wasserfreien Ammoniak über die Oberfläche des Inhalts enthielt, weiterhin einen Rührer, der mit 5,7 UpM lief und einen Rotaryhahn zum Abdichten des Bodens und Austragen des Endprodukts. Das Füllvolumen der Einheit betrug 40 cu. ft. (1133 1), das Arbeitsvolumen 27 cu. ft. (765 1) und die Mantelfläche betrug 63 sq. ft. (0,59 m2). In einem typischen Versuch wurde das Ammoniak-Behandlungsgefäss am Boden geschlossen und 500 bis 600 pounds (227 bis 272,4 kg) EMA der geeigneten Viskosität bei laufendem Rührer eingefüllt. Das EMA wurde bis auf 55 °C erhitzt, wonach es bis zu dem Ausmass von 0,15 bis 0,20 Mol Wasser pro Mol EMA durch Zugabe von Trok-kendampf mit einer Rate von 0,007 kg Dampf pro kg EMA während eines Zeitraums von 3 Stunden «oberhalb der Oberfläche» vorhydrolysiert wurde. Während dieses Zeitraums wurde die Temperatur auf einem Wert von 55 und 70 °C durch Einspeisen von Kühlwasser in den Mantel gehalten. Dann wurde wasserfreies gasförmiges Ammoniak in den Reaktor (über die Oberfläche des partiell hydrolysierten EMA) mit einer solchen Rate [etwa 5 bis 8 pounds (2,27 bis 3,63 kg) pro Stunde] eingeleitet, dass die Temperatur auf einem Wert zwischen 60 und 70 °C gehalten wurde, bis 2,0 Mol Ammoniak pro Mol EMA zugegeben worden waren. Nachdem das gesamte Ammoniak zugesetzt worden war, wurde das Produkt auf eine Temperatur von unterhalb 50 °C abgekühlt und in Vorratsbehälter überführt.

Laboratoriumsverfahren für EMA mit einer spezifischen Viskosität von 0,06

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte EMA wurde in ähnlicher Weise wie das in Beispiel 1, Stufe 1 beschriebene hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Reaktorcharge aus 267 g Maleinsäureanhydrid, 2089 ml Äthylbenzol, 45,8 ml n-ßutyl-aldehyd bestand und 13,20 g Benzoylperoxid insgesamt bei Beginn zugegeben wurden. Der Äthylendruck wurde während eines Zeitraums von 24 Stunden auf 200 psi (14 bar) und die Temperatur bei 70 °C gehalten. Die Menge an abschliessend aufgearbeitetem EMA-Produkt betrug 279 g, Ausbeute 73,3%, und die spezifische Viskosität war 0,060 bei 1 %iger Lösung in DMF bei 25 °C. In einen 4-Hals-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 5 Liter wurden 249 g festes EMA-Pulver mit einer spezifischen Viskosität von 0,060 eingebracht und 6 Stunden lang bei 45 bis 55 °C nach der anfänglich erfolgenden, tropfenweisen Zugabe von 5,3 g Wasser (15 Molprozent, bezogen auf EMA) heftig gerührt, um eine partielle Hydrolyse zu erzielen. Die Behandlung mit Ammoniak wurde unter Verwendung von trockenem, wasserfreien Ammoniakgas begonnen, das in das heftig gerührte feste EMA-Pulver eingeleitet wurde, wobei die Temperatur 18 Stunden lang bei 31° bis 32 °C gehalten wurde. Während dieses Zeitraums wurde eine langsame, jedoch ständige Aufnahme von Ammoniak beobachtet. Das Endprodukt wog 320 g, 103,3% Ausbeute.

Die Produkt-Kennzeichnung von all den vorstehenden Produkten ist in der vorstehenden Tabelle V niedergelegt.

Proben der Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylatsalze von EMA, die in den Jahren 1957 bis 1960 hergestellt und zu diesem Zeitpunkt, wie in Tabelle V beschrieben, gekennzeichnet worden waren, wurden in Glasflaschen mit gewöhnlichen Schraubdeckeln (nicht unter Stickstoff und auch nicht in irgendeiner Weise versiegelt) bis Anfang 1977 in einem Vorratsraum für allgemeine Zwecke aufbewahrt. Zu diesem Zeitpunkt (1977) wurden sie für eine weitere Bewertung dem

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

t>5

644 874

12

Tabelle V

Identifizierung

D

C

B

A

Verwendetes EMA, spez. Visk.*

1,19

0,60

0,11

0,060

Molekulargewichtsbereich:

50-60 000**

20-30 000**

^300***

1060***

Mit Ammoniak behandeltes Produkt:

CRD-Code

S-24

334

333

337

Herstellungsjahr

1957

1957

1956

1960

Stickstoff ("o)

15,83

16,86

14,80

13,83

IR-Kennzeichnung:

Versuchsdatum

-

22.5.59

8.6.59

5.7.60

Anhydrid

-

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Carbonsäure (COOH)

-

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Imid

-

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Primäres Amid

-

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Cargoxylation (COf)

-

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Ammoniumcarboxylat

-

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

* 1% DMF, 25 °C.

** Mn aus Viskosität-Mn-Kurve-Beziehung bestimmt.

*** Bestimmt im Dezember 1960 durch die ebullioskopische Methode, Siedepunktserhöhung in Aceton.

Tabelle VI

Mit Ammoniak behandeltes Produkt:

Identifizierungscode

S-24

334

333

337

Bezug zu Tabelle V

D

C

B

A

Stickstoff (" n)

14,02

12,46

12,53

12,62

IR-Kennzeichnung:

Versuchsjahr

1977

1978

1977

1977

Anhydrid

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Carbonsäure (COOH)

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Fehlt

Imid

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Primäres Amid

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Carboxylation (COi~)

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Ammoniumcarboxylat

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Vorhanden

Imid/Amid-Absorptionsverh.

0,890

0,922

1,180

0,950

Imid (%)

19,5

20,7

29,5

21,7

Tabelle VII

Verbindung (Tabelle V)

_*

B

C

EMA-spezifische Viskosität

-

0,060

0,11

0,60

Produktcode

U-1104*

CRD337**

CRD333

CRD334

Versuch 1 :

Dosis (mg/kg)

500

500

375

60

Tot/Gesamt

2/6

2/6

0/7

1/7

(T/C)i

0,89

0,45

0,337

0,180

Bemerkung

Verworfen

Fortgesetzt

Fortgesetzt

Fortgesetzt

Versuch 2:

Dosis (mg/kg)

-

500

375

60

Tot/Gesamt

-

2/6

1/7

2/6

(T/C)2

-

0,29

0,159

0,51

(T/'C)i x (T/Ch

-

0,13

0,053

0,093

Bemerkung

-

Fortgesetzt

Fortgesetzt

Fortgesetzt

Versuch 3 :

Dosis (mg/kg)

-

500

375

60

Tot/Gesamt

-

1/6

1/6

1/6

(T/C)3

-

0,77

0,15

0,50

(T/C)1X(T/C)2X(T/C)3

-

0,10

0,008

0,046

Bemerkung

-

Verworfen

Akzeptiert

Akzeptiert

* U-1104 war das Ammoniumsalz von Bernsteinsäurehalbamid (succinamic acid), der monomere funktionelle Anteil der Polymeren A, B und C.

** Zweimal untersucht. Zweiter Test bei Versuch 1 verworfen mit 500 mg/kg, tot/gesamt= 1/6 und (T/C)i = 1,39.

13

644 874

Lager entnommen (vgl. Tests 2 und 3). Vor der Wiederverwendung wurden die Materialien erneut gekennzeichnet, mit den Ergebnissen, wie sie in der Tabelle VI niedergelegt sind.

Es ist ersichtlich, dass die in den Jahren 1959 bis 1960 (Test 1) untersuchten polymeren Produkte, die zu diesem Zeitpunkt kein Imid enthielten, sowohl Ammoniak als auch Wasser verloren hatten und hierdurch während der langen Lagerzeit in Imid-enthaltende polymere Produkte überführt worden waren. Diese umgewandelten Produkte lieferten unerwarteterweise bei einer neueren Untersuchung in den Tests 2 und 3 verschiedenartige Ergebnisse im Vergleich zu den früheren Resultaten.

Produkt-Bewertung der Beispiele 8 bis 21 Test 1

Es wurden drei Molekulargewichtsabwandlungen von EMA-Halbamid,halb-ammoniumcarboxylat-Derivaten (die keine Imid-Funktion enthielten), wie sie in Vergleichsbeispiel 4, Tabelle V-A, -B und -C identifiziert wurden, in einem unabhängigen Untersuchungslaboratorium während der Jahre 1959 und 1960 unter Verwendung offizieller Verfahren für feste Sarcoma-180-Transplantate, wie sie durch das Cancer Chemotherapy National Service Center (CCNSC) spezifiziert und von dem Nation Institutes of Health erhalten wurden, bewertet. Das Verfahren bestimmt 2 Todesfälle bei sechs Tieren als toxische Grenze. Versuchs-T/C-Verhältnisse wurden als das Verhältnis des mittleren Tumorgewichts der behandelten Tiere zu dem mittleren Tumorgewicht der Kontrolltiere berechnet. Die T/C-Werte wurden für eine Reihe von drei Versuchen berechnet, wenn der vorhergehende Versuch innerhalb gestatteter Grenzen blieb. Das Material war annehmbar, wenn (T/C)i x (T/C)2 x(T/C)i kleiner als 0,08 nach dem Endversuch ist. Die Versuche wurden fortgesetzt, wenn (T/C)i kleiner als 0,54 und wenn (T/C)i x (T/C)2 kleiner als 0,20 waren. Die eingesetzten Tiere waren spezifizierte Schweizer Mäuse (CCNSC, Spezifikation XIV), die Drogenverabreichung war LP. (Spezifikation III) und die Dosisbestimmung erfolgte nach Spezifikation XII.

Die summarisch zusammengefassten Ergebnisse werden in der vorstehenden Tabelle VII gezeigt.

Es wurde gefolgert, dass, während die Toxizität mit Erniedrigung des Molekulargewichts verbessert wurde, Aktivität verlorenging, wenn die Grösse gegen den inaktiven monomeren Teil für diese Derivatserie abnahm. In dem oben erwähnten Zeitraum (1959 bis 1960) wurden keine ähnlichen Derivate, welche die Partialimid-Funktion enthielten, hergestellt oder nach CCNSC-Verfahren, oder irgendeinem anderen Verfahren, bewertet. Alle drei obigen Polymeren (A, B und C) wurden als wertlos ausgeschieden, wenn sie nach den CCNSC-Verfahren gegen Carcinoma 755 und Leukemia 1210 bewertet wurden.

Test 2

Die polymeren Zubereitungen (A, B und D) gemäss Tabelle VI, die aus drei EMA-Rohmaterialien mit verschiedenen spezifischen Viskositäten erhalten worden waren und demzufolge drei in weitem Umfang variierende Molekulargewichte aufwiesen, wurden an BALB/c-Mäuse nach drei Dosierungstabellen verabreicht, nämlich a) vor den (Tagen —9 und — 1), oder b) nach den (Tagen 1 und 9)

der Tumorübertragung mit SV40 umgewandelten Tumor-Zellen (als mKSA-TU5 bezeichnet), oder c) sowohl vor den (Tagen —9 und — 1), als auch nach den (Tagen 1 und 9) der Tumor-Herausforderung.

Die Verbindung wurde intraperitoneal (I.P.) in 3 Dosen zu 62,5,125,0 bzw. 250,0 mg/kg verabreicht. Die Tumor-Zellen wurden in einer Menge von 1 x 104-Zellen subcutan (SC) an eine Gruppe von Tieren, und in einer Menge von 1 x I03-Zel-len subcutan an eine andere Gruppe von Tieren geimpft. Das Wachstum der Tumoren bei den behandelten Mäusen gegenüber den normalen nicht behandelten Kontrollmäusen wurde dann bewertet. Die Ergebnisse sind summarisch in den Tabellen VIII-A, VIII-B und VIII-D niedergelegt. Aus der Tabelle VIII-A ist zu ersehen, dass bei Verwendung des Polymeren aus Tabelle VI-A bei Anwendung der Dosierungstabelle (a) 48% (17/36) der Tumor-herausgeforderten Mäuse gesund und frei von Tumor über den 58 Tage dauernden Beobachtungszeitraum blieben. Am Tag 61 wurden die tumorfreien Tiere erneut mit lebensfähigen Tumor-Zellen (mKSA-TU5; 1 x 104-Zellen; S.C.) erneut herausgefordert und 82% (14/17) blieben 37 Tage lang tumorfrei (d.h. immun) nach der Herausforderung.

Bei Verwendung der Dosierungstabelle (b), wo das Polymere von Tabelle VI-A nach der Tumor-Herausforderung verabreicht wird, blieben 42% (15/36) der Tiere nach 58tägiger Beobachtung tumorresistent. Nach erneuter Herausforderung (Tag 61) mit 1 x 10" lebensfähigen Tumor-Zellen blieben 80% (12/15) der Tiere nach der erneuten Herausforderung 37 Tage lang tumorfrei.

Von den Tieren, die nach der Dosierungstabelle (c) behandelt wurden, nach welcher das Polymere von Tabelle VI-A sowohl vor, als auch nach der Tumor-Herausforderung verabreicht wurde, blieben 28% (10/36) bis zum Tag 58 resistent, und alle diese tumorfreien Tiere waren gegenüber einer sekundären Tumor-Herausforderung immun.

Das Polymere aus Tabelle VI-B wurde nur an Mäusen untersucht, die mit 1 x 104 lebensfähigen mKSA-TU5-ZeIlen (SC) (vgl. Tabelle VIII-B) geimpft worden waren. Bei Verwendung der Dosierungstabelle (a) blieben 22% (4/18) der Mäuse während 51 Beobachtungstagen tumorfrei. Bei Verwendung der Dosierungstabelle (b) blieben 22% (4/18) der Tumor-herausgeforderten Mäuse ebenfalls 5! Tage lang frei von Tumor. In der Gruppe (c) blieben nur 11% (2/18) der Tiere 51 Tage lang tumorfrei. Am Tag 54 wurden alle vorstehenden tumorfreien Mäuse (10/54) mit 1 x 104 lebensfähigen mKSA-TU5-Zellen (SC) erneut herausgefordert, und es blieben alle 10 Tiere gegenüber der erneuten Tumor-Herausfor-derung 37 Tage lang tumorfrei (d.h. immun).

Das Polymere aus Tabelle VI-D wurde bei zwei Tumor-Herausforderungsschwellen wie das Polymere 7-VI-A oben (vgl. Tabelle VIII-D) untersucht. Da es ein viel höheres Molekulargewicht als die Polymeren der Beispiele 7A oder 7B hatte, betrug die Dosis für das Polymere 7D, das intraperitoneal verabreicht wurde, 75, 50 und 25 mg/kg, wie dies angemerkt ist. Mit der Behandlungstabelle (a) blieben 11% (4/36) der Tumor-herausgeforderten Mäuse nach 36 Beobachtungstagen tumorfrei. Von diesen blieben 75% (3/4) nach 37 Tagen der sekundären Tumor-Herausforderung tumorfrei. Bei der Dosierungstabelle (b) blieben 8% (3/36) der Tiere 36 Tage nach der ersten Tumor-Herausforderung tumorfrei und lediglich eines davon war gegenüber einer sekundären, erneuten Tumor-Herausforderung immun. Bei der Dosierungstabelle (c), wo das Polymere VI-D sowohl vor als auch nach dem Tumor verabreicht worden war, blieben 14% (5/36) 36 Tage tumorfrei und 4 von diesen 5 (80%) waren gegenüber einer sekundären, erneuten Tumor-Herausforderung immun.

Die Gesamtzahlen der tumorfreien Tiere in den Tabellen VIII-A, VIII-B und VIII-D am Ende der entsprechenden Beobachtungszeiträume stammten aus zwei Quellen, nämlich a) von solchen Tieren, die über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg tumorfrei waren, und b) von solchen Tieren, die während des Beobachtungszeitraums messbare Tumore entwickelten, die sich anschliessend zurückbildeten und vor dem Ende des Beobachtungszeitraums verschwanden.

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

t>5

644 874

14

Tabelle VI II-A

mKSA-TU5- Untersuchte Verbindung Dosis Behandlungsplan Tumorwachstum beim Tumorfrei

Tumor (mg/kg) Empfänger bis Tag 58 bis Tag 58

1 x 10+4SC

Kontrolle (Tab. VI-A)

-

-

6/6

0

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — 1

6/6

0

dito dito

125

dito

4/6

2

dito dito

62,5

dito

2/6

4

dito dito

250

Tage + 1 und +9

1/6

5

dito dito

125

dito

2/6

4

dito dito

62,5

dito

4/6

2

dito dito

250

Tage — 9 und — 1, + 1 und + 9

3/6

3

dito dito

125

dito

4/6

2

dito dito

62,5

dito

4/6

2

1 xl0+3SC

Kontrolle (Tab. VI-A)

-

-

6/6

0

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — I

1/6

5

dito dito

125

dito

2/6

4

dito dito

62,5

dito

4/6

2

dito dito

250

Tage +9 und + 1

3/6

3

dito dito

125

dito

6/6

0

dito dito

62,5

dito

5/6

1

dito dito

250

Tage —9 und — l, +9 und + 1

6/6

0

dito dito

125

dito

5/6

1

dito dito

62,5

dito

4/6

2

mKSA- Untersuchte

TU5-Tumor Verbindung Weg

Tabelle VIII-B

Dosis Behandlungsplan

(mg/kg)

Tumorwachstum Tumorfrei beim Empfänger bis Tag 51 bis Tag 51

I x 104 SC

Kontrolle (Tab. VI-B)

-

-

5/6

1

dito

Polymeres

250

Tage

— 9 und — 1

6/6

0

dito dito

125

dito

3/6

3

dito dito

62,5

dito

5/6

1

dito dito

250

Tage

+1 und +9

5/6

1

dito dito

125

dito

4/6

2

dito dito

62,5

dito

5/6

1

dito dito

250

Tage

— 9 und — 1, + 1 und +9

5/6

1

dito dito

125

dito

5/6

1

dito dito

62,5

dito

6/6

0

1 x 10'

Nicht durchgeführt

Ein Durchbruch der zurückgebildeten Tumore gegenüber denen, die ohne Rückbildung die ganze Zeit tumorfrei blieben, zeigte sowohl eine Abhängigkeit von der Tumorbelastung und von dem eingesetzten Polymeren an. Die Durchbruch-Übersicht von zurückgebildeten Tumoren aus der Gesamtzahl der tumorfreien Tiere wird in der Tabelle VIII-E gezeigt.

Test 3

Die polymere Zubereitung gemäss Tabelle VI-A wurde erneut wie in Test 2 oben untersucht, mit der Ausnahme, dass 10 Mäuse pro Versuchsgruppe eingesetzt und nur die Behandlungsschemata (a) und (b) verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX zusammengefasst.

Bei Verwendung der Dosierungstabelle (a), wo das Polymere am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tumor-Reizbehandlung verabreicht wurde, blieben 37% (22/60) der Tumor-herausgeforderten Mäuse über einen Beobachtungszeitraum von 61 Tagen hinweg tumorfrei. Am Tag 62 wurden 21 der tumorfreien Tiere erneut mit 1 x 104 mKSA-TU5-Tumor-Zellen

(SC) herausgefordert und nach weiteren 30 Tagen waren 90% (19/21) der Mäuse tumorfrei (immun).

50 In der zweiten Dosierungstabelle (b), wo das Polymere an den Tagen I und 9 nach der Tumor-Reizbehandlung verabreicht wurde, blieben 47% (28/60) der Mäuse über einen Beobachtungszeitraum von 61 Tagen hinweg tumorfrei. Von den 28 tumorfreien Mäusen (nach 61 Tagen) blieben 64% 55 (18/28) während 30 weiterer Tage im Anschluss an eine sekundäre, erneute Tumor-Reizbehandlung immun.

Test 4

Die polymere Zubereitung von Vergleichsbeispiel 3a, ein 60 EMA in fester Phase mit gasförmigem Ammoniak ohne Zusatz von Wasser behandelt, wurde an BALB/c-Mäuse unter Verwendung der Dosierungsschwellen und der Behandlungsschemata von Test 3 mit 10 Mäusen pro Testgruppe verabreicht. Die nach 61tägiger Beobachtung erhaltenen Daten o5 sind in der Tabelle X zusammengestellt. Bei Verwendung der Behandlungstabelle (a), wo das Polymere 3a am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tumor-Reizbehandlung mit mKSA-TU5-Tumor-Zellen verabreicht worden war, blieben 40%

15 644 874

Tabelle VIII-D

mKSA-TU5-

Untersuchte Verbindung Dosis

Behandlungsplan

Tumorwachstum beim

Tumorfrei

Tumor

(mg/kg)

Empfänger bis Tag 36

bis Tag 36

1 X !0-4SC

Kontrolle (Tabi. VI-d) -

6/6

0

dito

Polymeres

75

Tage —9 und

-1

6/6

0

dito dito

50

dito

5/6

1

dito dito

25

dito

6/6

0

dito dito

75

Tage + 1 und +9

6/6

0

dito dito

50

dito

6/6

0

dito dito

25

dito

5/6

I

dito dito

75

Tage —9 und -

- 1, + 1 und +9

6/6

0

dito dito

50

dito

6/6

0

dito dito

25

dito

6/6

0

1 x 10+3SC

Kontrolle (Tab. VI-D) -

_

6/6

0

dito

Polymeres

75

Tage —9 und

-1

6/6

0

dito dito

50

dito

4/6

2

dito dito

25

dito

5/6

1

dito dito

75

Tage +9 und

+ 1

6/6

0

dito dito

50

dito

6/6

0

dito dito

25

dito

4/6

2

dito dito

75

Tage —9 und -

- 1, + 1 und +9

6/6

0

dito dito

50

dito

5/6

1

dito dito

25

dito

2/6

4

Tabelle VIII-E

Ergebnisse

Polymeres

Tumordosis-

Völlig

Zurück

Gesamt

" h aus

Belastung tumorfrei*

gegangene

Zurückgegangen

Tabelle

Tumoren*4

VIII-A

Tabelle VI-A

1 X 10'

8

10

18

56

1 X 104

0

24

24

100

Gesamt

8

34

42

81

VIII-B

Tabelle VI-B

1 x 10'

NU***

NU***

NU***

NU***

1 x 104

1

9

10

90

Gesamt

1

9

10

90

VIII-D

Tabelle VI-D

1 x 10-'

10

0

10

0

1 x 104

0

2

2

100

Gesamt

10

~2

Ti

17

* Tumorfrei während des gesamten Beobachtungszeitraums - nicht zurückgegangen.

** Entwickelte Tumoren, die am Ende des Beobachtungszeitraums auf Null zurückgegangen sind.

*** Nicht untersucht.

TU5-Tumor-Zellen verabreicht wurde, blieben 30% (18/60) der Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei. Mit dem Behandlungsso schema (b), wo das Polymere 3b am Tag 1 und am Tag 9 nach der Tumor-Impfung verabreicht wurde, blieben 17% (10/60) der mit Tumor reizbehandelten Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei. Von den nach 61 Tagen insgesamt 28 tumorfreien Mäusen aus den Gruppen (a) plus (b) blieben 23 oder 82% 30 Tage 55 nach einer sekundären, erneuten Reizbehandlung mit 1 x 104-Tumor-Zellen tumorfrei.

Test 6

Die in den Tests 2 bis 5 beschriebene Bewertung wurde 60 auf ein zweites Tumor-Modellsystem ausgedehnt, das ein transplantationsfähiges Fischer-(F344)-Stamm-Ratte-3-Methyl-cholanthren-induziertes Blasenkarzinom war. Wenn dieser Tumor in normale Fischer-Ratten transplantiert wird, wächst er an dem primären Ort und metasiert spontan in die Lunge. o5 Ausserdem wird ein reizidiver Krebs immer nach einer chirurgischen Entfernung des Primär-Tumors beobachtet.

Die erste Untersuchung wurde zur Bestimmung der Wirkung des Polymeren aus Tabelle VI-A auf das Überleben von

(24/60) der Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei.

Bei Verwendung der Behandlungstabelle (b), wonach das Polymere 3a am Tag 1 und am Tag 9 nach der Tumor-Impfung verabreicht worden war, blieben 32% (19/60) der einer Tumor-Reizbehandlung unterzogenen Mäuse nach 61 Tagen tumorfrei. Von den nach 61 Tagen insgesamt 43 tumorfreien Mäusen aus den Gruppen (a) plus (b) blieben 36 oder 87% gegenüber einer sekundären Tumor-Reizbehandlung mit lebensfähigen Tumor-Zellen (1 x 104-Zellen) für einen Zeitraum von 30 Tagen immun.

Test 5

Die polymere Zubereitung von Vergleichsbeispiel 3b, ein EMA in der festen Phase mit gasförmigem Ammoniak unter Zusatz von Wasser behandelt, wurde an BALB/c-Mäuse unter Verwendung der Dosisschwellen und der Behandlungstabellen von Test 3 mit 10 Mäusen pro Testgruppe verabreicht. Die nach 61 Tagen Beobachtung erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle XI zusammengefasst. Mit dem Behandlungsschema (a), wo das Polymere 3b am Tag 9 und am Tag 1 vor der Tumor-Reizbehandlung mit mKSA-

644 874

16

Tabelle IX

mKSA-TU5-Tumor Untersuchte Verbindung Dosis Behandlungsplan Tumorwachstum beim Tumorfrei

(mg/kg) Empfänger bis Tag 61 bis Tag 61

1 x 10J SC

Kontrolle (Tab. VI-A)

-

-

10/10

0

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — 1

8/10

2

dito dito

125

dito

10/10

0

dito dito

62,5

dito

7/10

3

dito dito

250

Tage + 1 und +9

6/10

4

dito dito

125

dito

6/10

4-

dito dito

62,5

dito

7/10

3

1x10'SC

Kontrolle (Tab. VI-A)

-

-

5/10

5

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — 1

7/10

3

dito dito

125

dito

4/10

6

dito dito

62,5

dito •

2/10

8

dito dito

250

Tage + 1 und +9

7/10

3

dito dito

125

dito

5/10

5

dito dito

62,5

dito

1/10

9

Tabelle X

mKSa-TU5-Tumor Untersuchte Verbindung Dosis- Behandlungsplan Tumorwachstum beim Tumorfrei

(mg/kg) Empfänger bis Tag 61 bis Tag 61

1 xlO4 SC

Kontrolle

(Vergleichsbeispiel 3a)

—

9/10

1

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — 1

8/10

2

dito dito

125

dito

9/10

1

dito dito

62

dito

9/10

1

dito dito

250

Tage + 1 und +9

7/10

3

dito dito

125

dito

6/10

4

dito dito

62

dito

9/10

1

1x10' SC

Kontrolle

(Vergleichsbeispiel 3a)

-

-

8/10

2

dito

Polymeres

250

Tage — 9 und — 1

2/10

8

dito dito

125

dito

5/10

5

dito dito

62

dito

3/10

7

dito dito

250

Tage + 1 und +9

7/10

3

dito dito

125

dito

7/10

3

dito dito

62

dito

5/10

5

an Tumor leidenden Ratten und auf die Fähigkeit der Verbindung, Metastasenbildung zu verhindern, geplant.

Ratten vom Fischer-Stamm, von denen jede annähernd 250 g wog, wurde subcutan (Trokar) ein 2 x 2-mm-Tumor-Abschnitt implantiert. Nach 5, 12 und 18 Tagen nach der Tumor-Implantation wurden die an Tumor leidenden Ratten mit dem Polymeren in einer Dosis von 62 mg/kg durch Injektion in die Bauchhöhle behandelt. Insgesamt wurden 6 Tiere in dieser Weise behandelt. 4 Tiere mit implantiertem Tumor wurden nicht behandelt und dienten als Kontrolle. Alle Kontrolltiere gingen innerhalb 3 Wochen, oder durchschnittlich nach 15 Tagen nach der Tumor-Implanta-tion ein. 2 der behandelten Tiere starben nach 37 Tagen. Die 4 restlichen Tiere wurden am Tag 42 nach der Implantation getötet. Eine makropathologische Untersuchung zeigte, dass sie ein Hervortreten des primären Tumorwachstums aufwiesen, jedoch keine metastatische Lungenerkrankung zeigten.

Test 7

Eine zweite Untersuchung wurde zur Wiederholung des Tests 6 und zur Bestimmung der Wirkung einer niedrigeren Dosis und einer reduzierten Behandlungsfrequenz durchgeführt. Ratten vom Fischer-Stamm erhielten den gleichen Tumor-Typ implantiert und nach 8 Tagen im Anschluss an die Implantation wurden die an Tumor leidenden Ratten mit dem Polymeren aus Tabelle 7-VI-A in einer Dosis von 65

mg/kg oder 30 mg/kg mittels einer I.P.-Injektion behandelt. Jede Gruppe umfasste 4 Ratten. 16 Tage nach der Implantation erhielt die Gruppe mit der niedrigeren Dosis einen «Booster» von 30 mg/kg. Das Überleben wurde während eines Zeitraums von 6 Wochen beobachtet. Nach 6 Wochen wurden die überlebenden Tiere auf Anwesenheit von Metastasen in ihrer Lunge überprüft. 5 Tiere mit implantiertem so Tumor blieben als Kontrolle unbehandelt. Alle Kontrolltiere gingen an der Krankheit ein und überlebten die Tumor-Implantation durchschnittlich 23 Tage. Die Tiere der Gruppe mit vier Tieren, die eine Einzeldosis von 65 mg/kg an Polymerem erhalten hatten, waren nach 40 Tagen noch am 55 Leben und wurden dann getötet. Die Untersuchung zeigte, dass keine Metastasen vorhanden waren. Aus der Gruppe, die nach 16 Tagen einen 30 mg/kg-«Booster» erhalten hatte, starben zwei am Tag 35 und 36, und die restlichen zwei wurden am Tag 40 getötet. Wiederum zeigte das Untersuchungsergeb-60 nis, dass keine Metastasen vorhanden waren. Eine verlängerte Lebensdauer gegenüber den Kontrolltieren in beiden behandelten Gruppen war natürlich selbstverständlich.

Test 8

o5 Eine dritte Untersuchung wurde zur Bewertung der Fähigkeit des Polymeren aus Tabelle VI-A, ein Tumor-Rezidiv bei Fischer-Ratten, deren Primär-Tumor chirurgisch entfernt worden war, zu verhindern, geplant. Ratten vom Fischer-

45

17

Tabelle XI

644 874

mKSA-TU-5-Tumor Untersuchte Verbindung

Dosis (mg/kg)

Behandlungsplan

Tumorwachstum beim Tumorfrei Empfänger bis Tag 61 bis Tag 61

1 x 104 SC Kontrolle - - 10/10 0

(Vergleichsbeispiel 3b)

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — 1

8/10

2

dito dito

125

dito

9/10

1

dito dito

62

dito

7/10

3

dito dito

250

Tage + 1 und +9

8/10

2

dito dito

125

dito

7/10

3

dito dito

62

dito

10/10

0

IxIO'SC

Kontrolle

(Vergleichsbeispiel 3b)

-

-

4/10

6

dito

Polymeres

250

Tage —9 und — I

8/10

2

dito dito

125

dito

4/10

6

dito dito

62

dito

6/10

4

dito dito

250

Tage + 1 und +9

8/10

2

dito dito

125

dito

10/10

0

dito dito

62

dito

7/10

3

Stamm erhielten, wie in den Tests 6 und 7, eine Trokar-Implantation eines 2 x 2-mm-Tumor-Abschnittes. Man liess 25 dann den Tumor bis zu einer Grösse von 2 bis 3 cm Durchmesser wachsen. Zu diesem Zeitpunkt (8 Tage nach der Implantation) wurde der Tumor chirurgisch entfernt und gleichzeitig die Ratten mit einer Einzeldosis des Polymeren von 65 mg/kg oder 30 mg/kg durch I.P.-Injektion behandelt. 30 Hierbei waren die Ratten in zwei Gruppen zu je vier Ratten eingeteilt. Überleben und Tumor-Rezidiv wurden während eines Zeitraums von 7 Wochen beobachtet. Von der Gruppe, die 30 mg/kg des Polymeren bei der Tumor-Resektion erhalten hatte, waren alle vier Ratten nach 47 Tagen ohne irgend- 35 ein Anzeichen eines Tumor-Rezidivs am Leben. Von der Gruppe, die 65 mg/kg als Einzeldosis zu der Zeit der Resektion erhalten hatte, war eine am Tag 16 nach Tumor-Rezidiv verendet, während die anderen drei nach 47 Tagen ohne irgendeinen Anschein eines Tumor-Rezidivs am Leben 40

geblieben waren.

Test 9

Eine zweite Studie der Verhinderung eines Tumor-Rezi-divs wurde an Fischer-Ratten in ähnlicher Weise wie in Test 8 45 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass drei Polymere mit verschiedenen Imid-Gehalten eingesetzt wurden. Die Gehalte an Imid betrugen 0, 5 und 21,7 Prozent. Bei dieser Untersuchung wurde die Trokar-Implantation des Tumors, wie in den Tests 6,7 und 8 beschrieben, durchgeführt. Die Exzision aller 50 Tumoren wurde 14 Tage nach der Implantation durchgeführt.

1 Gruppe von vier Ratten wurde als Kontrollgruppe verwendet und erhielt zur Zeit der Exzision keine Behandlung. Das Tumor-Rezidiv betrug 100% an den Tagen 21, 33,40 und 44 nach der Exzision bei einer durchschnittlichen Rezidivzeit 55 von 34 Tagen. Aus dieser Kontrollgruppe starben zwei Ratten am Tag 44 und zwei blieben am Leben und wurden zu diesem Zeitpunkt getötet. Es wurden bei allen vier Tieren Metastasen festgestellt.

Eine zweite Gruppe von fünf Ratten erhielt eine Einzeldo- m sis I.P. von 30 mg/kg des Polymeren von Beispiel 1, Stufe 2a (0% Imid) zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion. Bei dieser Gruppe wurde ein Tumor-Rezidiv bei zwei Ratten am Tag 33 nach der Resektion und bei einer dritten Ratte am Tag 40 nach der Resektion festgestellt. Nach 55 Tagen hatten 3 von 5 Ratten (60%) ein Tumor-Rezidiv. Eine dritte Gruppe von sechs Ratten erhielt eine Einzeldosis I.P. von 30 mg/kg des Polymeren aus Beispiel 1, Stufe 3, Tabelle IV-1, mit 5% Imid-

Funktionalität, zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion. Während eines Zeitraums von 55 Tagen wurde bei keinem der Tiere ein Tumor-Rezidiv beobachtet. Am Tag 55 verendeten zwei dieser Ratten (ohne Tumor), und es wurde nach Prüfung festgestellt, dass keine Metastasen vorhanden waren.

Eine vierte Gruppe von sechs Ratten erhielt zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion eine Einzeldosis I.P. von 30 mg/kg des Polymeren aus Vergleichsbeispiel 4, Tabelle VI-A mit einem Gehalt von 21,7% Imid. In dieser Gruppe hatte ein Tier am Tag 21 ein Tumor-Rezidiv und ein zweites am Tag 43. Alle Tiere waren nach 55 Tagen noch am Leben. Da nur 2 Tiere von 6 ein Rezidiv aufwiesen, stellt dies einen Prozentsatz von 33% dar.

Test 10

Bei den in den Tests 6 bis 9 beschriebenen Tierversuchen wurden Polymere verwendet, die durch Injektion in die Bauchhöhle dosiert wurden. Dieses Beispiel erläutert die Brauchbarkeit einer Imid-enthaltenden Zubereitung, die zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion zur Verhinderung oder Verzögerung eines Tumor-Rezidivs oral verabreicht wird. Im Test 9 wurde bemerkt, dass Kontrolltiere, welche keine Droge zum Zeitpunkt der Tumor-Resektion erhielten, eine Durchschnittszeit für ein Tumor-Rezidiv von 34 Tagen zeigten.

In diesem Beispiel erhielt eine Gruppe von 10 Fischer-Ratten eine Trokar-Implantation eines Tumors wie in Test 6. Die entwickelten Tumoren wurden chirurgisch am Tag 13 nach der Implantation entfernt, und gleichzeitig wurde jeder Ratte oral 1 ml steriles Wasser mit 30 mg/kg des Imid-enthaltenden Polymeren von Vergleichsbeispiel 4, Tabelle VI-A (21,7% Imid) intubiert. Tumor-Rezidive wurden dann während eines Zeitraums von 10 Wochen beobachtet. Eine Ratte verendete zum Zeitpunkt der chirurgischen Tumor-Entfernung. Bei den restlichen 9 Ratten wurden kleine Tumor-Rezidive an 7 Tieren an den Tagen 42, 42, 42, 43, 46, 50 und 59 nach der Tumorexzision beobachtet. Zwei Ratten waren nach 70 Tagen frei von Tumor-Rezidiv.

Test 11

Der Zweck dieses Versuches bestand darin, zu bestimmen, ob die Einwirkung von Tumor-Zellen auf das Polymere von Vergleichsbeispiel 4-VI-A deren Antigenwirkung ändert und/ oder eine direkte zytotoxische Wirkung auf die Tumor-Zellen hat.

Tumor-Zellen wurden aus dem in Test 6 beschriebenen

644 874

18

BLCa-Tumor durch Exzision einer subcutanen Tumormasse hergestellt. Die Zellen wurden dann durch Auszupfen der Zellen aus dem Tumor unter zusätzlicher sanfter Trypsinisie-rung der Tumorstücke in Suspension gebracht. Die abgetrennten Zellen wurden dreimal in ausgeglichener Salzlösung (BSS) gewaschen und zur Bestimmung des Lebend/Tot-Ver-hältnisses gezählt. An diesem Punkt wurde eine 90- bis 95f"oige Zellpopulation erhalten.

Tumor-Zellen in einer Konzentration von 1 x 105-Zellen pro ml, in «Eagles minimal essential media» in Earl's BSS, plus 10% fötales Kalbsserum, wurden mit 30 mg/ml des Polymeren aus Tabelle VI-A inkubiert. Die Inkubation wurde bei 37 C während eines Zeitraums von 90 Minuten durchgeführt, worauf die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 g während 6 Minuten aus der Suspension abgetrennt wurden. Die Zellen wurden erneut auf Lebensfähigkeit geprüft, die sich von der Vorinkubationshöhe nicht verändert hatte. Das Verfahren wurde bei drei getrennten Gelegenheiten wiederholt.

Zellen aus diesem Versuch wurden männlichen Fischer-Ratten subcutan in einer Dosis von 1 x 106-Zellen injiziert. 5 Tiere wurden mit Polymerem behandelte Zellen injiziert und diese Tiere mit 5 Tieren verglichen, die Tumor-Zellen erhielten, die wie oben behandelt worden waren, jedoch ohne zugesetztes Polymeres. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XII niedergelegt.

Tabelle XII

Ratte

Kontrolltiere*

Versuchstiere**

Nr.

Tage zur Entwicklung eines 2-

-3 cm grossen Tumors

1

11

11

2

11

11

3

13

13

4

11

11

5

13

11

* 1 x 106-Tumor-Zellen, nicht inkubiert mit Polymerem, geimpft SC.

** 1 x 106-Tumor-Zellen, vorinkubiert mit Polymerem aus Tabelle VI-A, geimpft SC.

Es war kein Unterschied zwischen diesen Tieren in der Zeit der Tumorentwicklung. Weiterhin war das Wachstumsmuster des Tumors im Anschluss danach bei den zwei Gruppen vergleichbar. Die Schlussfolgerung aus diesen Versuchen ist die, dass bei den angewandten Dosen das Polymere aus Tabelle VI-A (21,7% Imid) keine direkte zytotoxische Wirkung auf BLCa-Tumor-Zellen hatte. Zusätzlich ändert eine Vorinkubation des Polymeren mit den Tumor-Zellen die 5 Antigenwirkung der Tumor-Zellen nicht.

Test 12

Die direkte Toxizität des Imid-enthaltenden Polymeren aus Tabelle VI-A wurde an normalen männlichen Fischer-10 Ratten bestimmt. Sowohl die I.P.- und die I.V.-Injektion des Polymeren bestand aus annähernd 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, welche die geeignete Menge an Polymerem enthielt. Zur Bestimmung der Toxizität wurde das Polymere in Dosen von 100 mg/kg mit ansteigenden Inkrementen zu 15 100 mg/kg bis zu 1000 mg/kg an fünf Tiere in jeder Dosisgruppe verabreicht. Das Polymere wurde sowohl intraperitoneal, als auch intravenös verabreicht. Bei Tieren, denen das Polymere auf intraperitonealem Wege verabreicht wurde, waren innerhalb der Beobachtungszeit von 30 Tagen bei einer 20 Gesamtmenge von 50 Ratten weder Toxizität noch Todesfälle festzustellen. Toxizität wurde jedoch beobachtet, wenn das Polymere in Dosen zu 800 mg/kg und höher auf intravenösem Weg verabreicht wurde. Eines aus fünf Tieren bei 800 mg/kg, zwei aus fünf Tieren bei 900 mg/kg und vier aus fünf 25 Tieren bei 1000 mg/kg schienen bei intravenöser Verabreichung des Polymeren Konvulsionen zu entwickeln und verendeten. Keine Toxizität oder Todesfälle wurden bei Tieren beobachtet, denen intravenöse Dosen von 700 mg/kg oder weniger während des Beobachtungszeitraums von 30 Tagen 30 (35 Tiere) verabreicht worden waren.

Nach Ende des 30tägigen Beobachtungszeitraums wurden die 85 überlebenden Ratten getötet, und das Gehirn, die Lunge, das Herz, die Leber, die Niere und die Milz von jeder Ratte makro- und mikropathologisch untersucht. Es wurden 35 in keinem der Organgewebe mit der verabreichten Droge assoziierte Abnormalitäten beobachtet.

Bei einer anderen Untersuchung wurde die Toxizität des obigen, I.P. verabreichten Polymeren mit der oralen Verabreichung verglichen. Das Polymere aus Beispiel 7-VI-A wurde in 40 Dosen von 100 mg/kg, 500 mg/kg und 1000 mg/kg entweder durch Injektion (I.P.), oder durch eine Magensonde (P.O.) an jede von fünf Fischer-Ratten pro Dosierungsgruppe verabreicht. Die Ratten wurden 14 Tage lang beobachtet, wobei keine Todesfälle oder ein Auftreten von toxischen Erschei-45 nungen eintraten. Nach 14 Tagen wurden alle Tiere, und zwar sowohl die der I.P.-, als auch der P.O.-Verabreichungsgruppe,

Tabelle XIII

Polymer-Quelle aus Beispiel Nr.

Prozent Imid aus IR-Imid/Amid-Verh.

Durchschnittliche Gesamtzahl der Tiere

IgM PFC-' 1 x 10" Milzzellen

Stimulationsindex*

Keine (kontrollvers.)

16

568

1,00

1, Stufe 2a

0

10

1564

2,75

1, Stufe 3 (IV-1)

5,3

6

1446

2,54

2

6,5

6

1478

2,60

1, Stufe 3 (IV-3)

11,5

10

1620

2,86

1, Stufe 3 (IV-4)

16,5

10

1770

3,12

-

16,0

6

1866

3,28

1, Stufe 3 (IV-6)

24,1

10

1968

3,46

-

24.4

6

1984

3,49

1, Stufe 3 (IV-7)

28.2

10

1992

3,51

-

32,6

6

1268

2,23

I, Stufe 3 (IV-8)

34,7

10

1664

2,93

1, Stufe 3 (IV-9)

50,1

10

926

1,63

* Kontrolle = 1,00

19

644 874

getötet,' und das Gehirn, die Lunge, das Herz, die Leber, die Niere und die Milz eines jeden Tieres makro- und mikropathologisch untersucht. Wiederum waren keine Abnormalitä-ten in irgendeinem der Organgewebe zu verzeichnen.

Test 13

Polymere der vorliegenden Erfindung, wie sie in Beispiel 1, Stufe 3 und Beispiel 2 beschrieben wurden, wurden in normalen Lewis-Ratten auf ihre Fähigkeit hin abgeschätzt, Immun-Reizbeantwortungen vermittels wachsender 19-S (IgM)-Antikörper produzierender Zellen zu heterologen Erythrozyten (Rote Schafsblutzellen, SRBC) durch die Stan-dard-«Jerne Plaque»-Bestimmungsmethode zu stimulieren. Vgl.: «Textbook of Immunology», J.T. Barrett, C.V. Mosby Company, 1978, und «Immunology», H.N. Eisen, Medicai Department, Harperand Row Publishers Inc., 1974. Bei einem typischen Test wird ein Tier, in diesem Falle Lewis-Ratten, mit 1 ml einer 1:5-Verdünnung von gewaschenen SRBC in physiologischer Kochsalzlösung über die Schwanzvene immunisiert. Zur gleichen Zeit werden den Tieren I.P.-Injektionen des angegebenen Polymeren in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. Nach 4 Tagen wird von den Milz-Zellen aus den immunisierten Tieren eine Kultur in einem Agarose-Gewebe-Kultursystem mit SRBC angelegt. Das Gewebe-Kulturmedium unterstützt das Wachstum und die Ausscheidung von Antikörper durch die Antikörper synthetisierenden Zellen. Diese Antikörper diffundieren aus der Ausgangszelle und heften sich an die Nachbarerythrozy-ten an. Serumkompliment (normales Meerschweinchenserum) wird zur Förderung der Lysis der RBC (Rote Blutzellen) zugegeben, die mit Antikörper unter Bildung einer klaren Fläche oder Plaque um die Antikörper-bildende Zelle herum überzogen worden sind. Derartige Plaquen (PFC) werden gezählt und als Anzahl der PFC pro 1 x 10°-Milz-Zellen angegeben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle XIII zusammenge-fasst. Alle polymeren Zubereitungen in der Tabelle XIII wurden bei 30 mg/kg untersucht.

Test 13A

In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Wirkungen des Polymeren aus Tabelle VI-A auf die IgM-Antikörper-Reizbeantwortung auf SRBC-Antigen (wiederum unter Verwendung der «Jerne Plaque»-Bestimmungsmethode, wie in Beispiel 20)

1. bei normalen Lewis-Ratten mit entweder I.P. oder oral verabreichtem Polymeren, und

2. in Lewis-Ratten als Ersatz für die Thymus-Funktion,

wiederum mit dem entweder I.P. oder oral verabreichtem Polymeren,

abgeschätzt. Im Falle 1. wurde das Verfahren gemäss dem Test 13 durchgeführt. Im Falle 2. wurde die normale Thymus-5 Funktion durch Thymektomie (Tx) bei erwachsenen Tieren beseitigt, was chirurgisch in einem Alter von 8 bis 12 Wochen und hohen Dosen einer Ganzbestrahlung (TBI), gefolgt von einer Knochenmarkzellen-Repopulation (BM) durchgeführt wurde. Die Thymektomie, die Ganzbestrahlung und die Kno-10 chenmarkzellen-Repopulation wurden alle nach Standard-Verfahren durchgeführt, wie sie von Falk, R.E. et al., Surgery, Oktober (1978), Falk, R.E. et al., Abstract, Canadian Society for Clinical Investigation, Jan. 24-27, 1978, Vancouver und Falk, R.E. et al.. Abstract, Royal College of Physicians and 15 Surgeons, Jan. 25-28, 1978, Vancouver, beschrieben worden sind.

In diesen Verfahren wurden die TBI und die BM-Repo-pulation am Tag nach der chirurgischen Thymektomie durchgeführt. Zur TBI wurden die Tiere unter Verwendung einer 20 13"Cäsium-Quelle (Atomic Energy of Canada) bestrahlt. Die Bestrahlungsdosis in dieser Vorrichtung ist durch den Lieferanten geeicht und wird in einer gleichmässigen Weise auf die gesamte Körperoberfläche der in dem Behälter placierten Tiere aufgebracht. Für die BM-Repopulation werden Suspen-25 sionen von Einzelzellen von Knochenmarkzellen durch Waschen der Röhrenknochen des Femurs und der Tibia in der Ratte mit einer ausgeglichenen Salzlösung (BSS) bei 4 CC hergestellt. Die Zeilen werden dreimal in BSS gewaschen und in einem Hämozytometerzur Bestimmung der Lebensfähig-30 keit und der geeigneten Zellverdünnung gezählt. Die Zellen wurden I.V. unter Verwendung von Präparaten verabreicht, die eine Lebensfähigkeit von mehr als 90° o aufwiesen. Bei jeder Ratte betrug die BM-Repopulation 1 x 10s-Zellen.

Die Mortalitätsrate der Tiere für das gesamte 35 Tx + TBI + BM-Verfahren war kleiner als 10u». Man liess diese Tiere sich dann während eines Zeitraums von 6 Wochen vor den Versuchen der IgM-Antikörper-Reizbeantwortung auf SRBC erholen.

Nach der Erholungsperiode wurde das Polymere von Bei-40 spiel 7-Tabelle VI-A und das SRBC wie in Beispiel 20 verabreicht. Die Ergebnisse des Gesamtversuches sind in der nachfolgenden Tabelle XIII-A niedergelegt.

Test 14

45 Neun Polymere mit variierendem Imid-Gehalt (0 bis 35°u), und identisch mit vielen von denen in Test 13, Tabelle XIII beschriebenen, wurden in Fischer-Ratten auf ihre Vergleich-

Tabelle XIII-A: IGM-Antikörper-Reizbeantwortung von Lewis-Ratten

Polymeres Tierbehandiung Anzahl Dosis (mg kg) Weg Mittlere Reizbeantwortung Stimulations-

der Tiere IgM ~ index***

PFC 1 x 10" Milzzellen

Keines

Normale unbehandelte Kontrolltiere

10

' —

174,2

Tabelle VI-A

Normal

10

30*.

-LP.

836,0

4,78

Tabelle VI-A

Normal

10

30*.

oral

865,6

4,96

Keines

Tx, 950R, BM Kontrolltiere**

10

-

73,6

—

Tabelle VI-A

Tx, 950R, BM**

10

30*.

■ I.P.

740,4

10,10

Tabelle VI-A

Tx, 950R. BM**

10

30*

'oral

474,0

6,42

* Ähnliche Ergebnisse wurden mit Dosen von 15 mg kg erhalten.

** Tx = Thymusentfernung. R = Rad Ganzbestrahlung. BM = Rekonstituiertes Knochenmark *:ï*Kontrolle = 1,00

644 874

20

Tabelle XIV

N- Polymerquelle Prozent Imid Dosis* Anzahl der Tiere mit Tumor-Rezidiv nach x Wochen nach r. Beispiel bzw. Tabelle (mg/kg) Tumor-Resektion

12345 6789 10

(-X)

1

Kontrolle

0

1

2

3

5

10

_

_

_

_

2

Beispiel 1, Stufe 2a

0

30

0

0

2

3

3

3

3

4

4

5

15

0

0

2

3

5

5

5

6

6

7

3

Tab. IV-1

5,3

30

0

0

0

0

0

1

1

1

2

3

15

0

0

2

2

2

2

2

2

2

3

4

0

6,5

30

0

0

0

0

0

0

0

0

1

O

X.

15

0

0

0

1

2

3

3

3

5

5

5

Tabelle IV-4

16,5

30

' 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

16

0

0

0

1

2

2

2

2

2

3

Tabelle VI-A

21,7

30

0

0

0

0

0

0

1

2

4

4

6* 7

Tabelle IV-6

24,1

30

0

0

0

0

1

1

1

1

1

1

15

0

0

0

0

0

1

1

2

2

2

8

24,4

30

0

0

0

0

0

0

0

0

1

3

15

0

0

0

1

3

5

5

6

6

6

9

Tabelle IV-7

28,2

30

0

0

1

3

5

5

5

5

6

6

15

0

0

0.

1

2

3

3

4

6

7

10

Tabelle IV-8

34,7

30

0

0

0

2

2

3

3

3

3

4

15

0

0

1

1

2

3

3

3

3

4

In Versuch Nr. 6 oral, in allen anderen intraperitoneal verabreicht. Alle Gruppen von 10 Ratten pro Dosis.

bare Leistung in der Verhinderung eines Rezidivs von primärem BLCa-Tumor nach Tumor-Resektion als Funktion des prozentualen Imid-Gehaltes bewertet. Das Versuchsverfahren entspricht dem in den Tests 8,9 und 10 beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme, dass in diesem Falle 10 Ratten für alle Dosisgruppen und Kontrollgruppen eingesetzt und die verschiedenen Imid-Zubereitungen sowohl in einer Dosis von 30 mg/kg, als auch in einer Dosis von 15 mg/kg durch I.P.-Injektion in 1 ml Kochsalzlösung verabreicht wurden.

Die Kontrolltiere erhielten nur 1 ml Kochsalzlösung I.P. An eine Gruppe zu 10 Tieren wurden 30 mg/kg des Polymeren aus Tabelle VI-A (21,7% Imid) oral verabreicht, wie dies 35 besonders vermerkt sei. Alle Tumoren wurden chirurgisch 11 Tage nach der Trokar-Implantation entfernt, und die Drogen wurden in Einzeldosen wie oben am Tag 1 nach der Tumor-exzision verabreicht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XIV niedergelegt. Von besonderem Interesse ist 40 die Tatsache, dass die durchschnittliche Tagesanzahl für ein

Tabelle XV

Arzneimitteldo

Mause

Mäuse

Anfängliches

Durchschnittsge

Durchschnittlich

Inhibierung sis

Beginn

Ende

Durchschnittsge wicht exzidiertes

Versuch/Kon

(mg-kg)*

wicht nach Beendigung

Tumorgewicht trolle

(g)

(g)

(g)

C'o)

25

5

5

27,0

31,4

1074,4

-9

Kontrolle

5

5

27,6

32,2

985,4

-

50

5

5

26,8

34,0

724,4

+ 26

Kontrolle

5

5

27,6

32,2

985,4

-

100

5

5

26,8

31,0

587,6

-16

Kontrolle

5

5

29,0

32,3

505,8

-

200

5

2

60% der Tiere verendeten

NB**

Kontrolle

5

5

29,0

32,3

505,8

-

400

5

3

40% der Tiere verendeten

NB**

Kontrolle

5

5

27,6

32,2

985,4

-

800

5

0

100% der Tiere verendeten

-

Kontrolle

5

5

27,6

-

-

-

* Männliche Schweizer Mäuse. S-180 durch Trokar SC. Dosis verabreicht an 6 aufeinanderfolgenden Tagen I.P. in 0,5 ml Kochsalzlösung nach Tumor-Implantation. Tiere wurden am Tag nach der letzten Injektion des Mittels getötet.

Nicht berechnet wegen akuter Toxizität.

21

644 874

Tumor-Rezidiv für die 10 Kontrolltiere 32,3 betrug, was mit dem Kontrolldurchschnitt von 34 Tagen (4 Ratten) in Test 9 gut vergleichbar ist.

Test 15

EMA mit 100% Imid (spezifische Viskosität = 0,66) aus Vergleichsbeispiel 2 wurde hinsichtlich seiner Tumorwachs-tums-Inhibierung in einem unabhängigen Untersuchungslabor nach dem folgenden Verfahren bewertet.

Festes Sarcoma 180 wurde mittels Trokar (2 mm Durchmesser) in die Flanke von männlichen Schweizer Mäusen implantiert. Das Polymere aus Vergleichsbeispiel 2 wurde durch I.P.-Injektion in der angegebenen Dosierung in 0,5 ml Kochsalzlösung an sechs aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, beginnend mit dem Tag 1 nach der Tumor-Implanta-tion. Gruppen von 5 Mäusen erhielten Dosen zu 25, 50 und 100 mg/kg, wie beschrieben. Höhere Dosen: 200,400 und 800 mg/kg erwiesen sich als toxisch, wie angegeben. Am Tag nach der letzten I.P.-Drogeninjektion wurden die Tiere getötet, der Tumor durch Obduktion entfernt und gewogen. Die Tumor-Inhibierung wurde berechnet als Prozent der Tumorgewichte von behandelten Tieren, geteilt durch die Tumorgewichte der Kontrolltiere. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XV zusammengefasst, aus denen hervorgeht, dass das EMA mit vollen 100% Imid keine Aktivität aufweist.

Test 16

Ein bevorzugtes Polymeres der vorliegenden Erfindung wurde in normalen männlichen Lewis-Ratten auf eine mögliche Aktivität hinsichtlich der Erhöhung der Anzahl der peritonealen Makrophagen und deren Aktivität, Polystyrol-Latexteilchen zu phagozytieren, untersucht, was bereits für eine Anzahl von Immunsystem-Modulatoren, wie Bacillus Calmette-Guerin (BCG), Pyran-Copolymeres und andere derartige Mittel, gezeigt worden ist.

An vier Gruppen zu sechs jungen erwachsenen (2 bis 4 Monate alt) normalen männlichen Lewis-Ratten wurde die Droge oder Kochsalzlösung (Kontrollversuche) wie folgt verabreicht: Die Gruppe 1 erhielt 1 ml Kochsalzlösung auf I.P.-Wege. Die Gruppe 2 erhielt das Polymere von Tabelle VI-A in einer Dosis von 30 mg/kg in 1 ml Kochsalzlösung, I.P. verabreicht. Die Gruppe 3 erhielt das Polymere von Tabelle VI-A in einer Dosis von 30 mg/kg in 1 ml Kochsalzlösung, oral verabreicht, und die Gruppe 4 erhielt 0,1 mg BCG in 1 ml Kochsalzlösung, I.P. verabreicht.

An den Tagen 1,3 und 5 nach der vorstehenden Verabreichung wurden zwei Tiere aus jeder der vorstehenden vier Gruppen getötet und die Bauchhöhlen-Zellen entnommen. Diese Entnahme ging nach folgendem Verfahren vor sich. 100 ml gekühltes RPMI 1640-Medium wurde I.P. injiziert und nach sanfter Massage die gesamte Bauchhöhlenflüssigkeit abgezogen, und die Zellen aus jeder einzelnen Bauchhöhle durch Ausschleudern bei 1000 UpM abgetrennt. Diese Zellen wurden mit NSE (nicht spezifische Esterase)-Farbstoff gefärbt und dreimal mit gekühltem (4 0 C) Medium gewaschen. Schliesslich wurden die Zellen aus jeder einzelnen Bauchöhle in 10 ml Medium suspendiert und gezählt, um die durchschnittliche Anzahl der Zellen, bestehend aus 80 bis 95% Phagozyt, erhalten aus jeder Bauchhöhle als Funktion des vorstehenden Gruppen-Typs der Behandlung und Zeit (Tage) nach der Behandlung, zu bestimmen.

Die Altexteilchen-Phagozytose-Aktivität eines jeden Satzes an Bauchhöhlen-Zellen wurde wie folgt bestimmt. Eine Suspension der vorstehenden Zellen wurde in einer Konzentration von 40 bis 50 Millionen Zellen pro ml eines 50%igen Fötal-Kalbserums plus RPMI-Medium in einem 5 1 Reagensrohr hergestellt. Zu der Suspension wurden 100 lamda Polystyrollatex (10% Feststoffe, Teilchendurchmesser= 1 Mikron,

Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana) zugegeben und die Mischung 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann ausgeschleudert, dreimal mit RPMI-Medium gewaschen und schliesslich erneut in 0,5 ml Kochsalzlösung suspendiert. Es wurden dann Objektträger mit den Zell-Suspensionen hergestellt und mikroskopisch untersucht, um das Ausmass der Altexteilchen-Phagozytose in die Phagozyt-Zellen zu bestimmen. Diejenigen Zellen, die 10 oder mehr Latexteilchen enthielten, wurden als positiv angesehen, und die Gesamtzahl derartiger Zellen (die 10 oder mehr Latexteilchen enthielten) als Prozent der Gesamtanzahl der Zellen in der Suspension angegeben.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle XVI für zweifach ausgeführte Versuche angegeben.

Die Ergebnisse in der Tabelle XVI zeigen schlüssig, dass das bevorzugte Polymere der vorliegenden Erfindung die peritonealen Makrophagen nicht über die Kontrollwerte hinaus erhöht, wenn es entweder I.P. oder oral verabreicht wird, und dass ferner die Latex-Phagozytose-Aktivität derartiger peritonealer Makrophagen gegenüber der normalen Makro-phagen-Aktivität nicht erhöht ist. Im Gegensatz hierzu erhöhen, wie dies durch die Ergebnisse bei BCG gezeigt wird, andere Immunsystem-Modulatoren die Anzahl der peritonealen Markophagen sehr stark, und es haben derartige Makrophagen eine stark erhöhte Latex-Phagozytose-Aktivität. Diese hohe Aktivität geht nach 3 Tagen und länger auf normale Werte zurück.

Im Gegensatz zu den vorstehenden Ergebnissen, welche zeigen, dass die Polymeren der vorliegenden Erfindung die Makrophagen-Funktion nicht aktivieren, ist aus den Ergebnissen in den Tests 13 und 13A zu ersehen, dass diese Polymeren ungeachtet dessen als B-Zellen-Modulatoren in normalen Tieren wirken und die B-Zellen Antikörper-Reizbeantwortung stimulieren, wenn sie entweder I.P. oder oral verabreicht werden. Ferner wird diese Wirkung sogar in Abwesenheit der Thymus-Funktion beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Polymeren der vorliegenden Erfindung als Thymus-Funktion-Ersatz bei der Aktivierung von B-Zellen für eine erhöhte Antikörperbildung wirken.

Es können durch Ersatz von anderen, im wesentlichen gleichwertigen Materialien für die in den vorstehenden Beispielen angeführten Materialien viele andere Beispiele ausgeführt werden, welche die Erfindung weiter erläutern.

So kann in den vorstehenden Beispielen Propylen für eine äquivalente Menge Äthylen als Erläuterung der definierten Olefinmonomeren mit im wesentlichen ähnlichen Ergebnissen eingesetzt werden.

Ferner kann auch mit im wesentlichen ähnlichen Ergebnissen in den vorstehenden Beispielen Citraconsäureanhydrid für eine äquivalente Menge Maleinsäureanhydrid als erläuternd für die definierten Polycarbonsäureanhydride eingesetzt werden.

Durch Lösungsmittel-Nichtlösungsmittel-Fraktionierung des oben im Beispiel 1, Stufe 1 hergestellten EMA-Polymeren können Polymere von noch niedrigerem durchschnittlichen Molekulargewicht hergestellt werden. Dieses Polymere von niedrigerem Molekulargewicht kann dann in den vorstehenden Beispielen mit im wesentlich ähnlichen Ergebnissen anstelle einer äquivalenten Menge des Polymeren von Beispiel 1, Stufe 1 eingesetzt werden.

Andere pharmazeutisch verträgliche Salze von Imiden der Erfindung können durch Umwandlung der Ammoniumsalz-Derivate in solche Salze, wie beispielsweise Natrium- und Kaliumsalze, hergestellt werden. Beispielsweise kann das Ammoniumsalz-Derivat von Beispiel 1, Stufe 3, Tabelle IV, Versuch 4, in das Halb-amid,halb-freies-carboxyl-Derivat durch Aufgeben einer 5%igen wässerigen Lösung des Ammoniumsalzes auf eine Säule eines schwach basischen Kationen-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

644 874

22

Tabelle XVI

Peritoneale Phagozytenzahl und Aktivität nach Behandlung gemäss der Beschreibung in Beispiel 23

Tötungstag nach Verabreichung des Mittels

Behandlung

Versuch 1 Versuch 2

Latex-Aufnahme Latex-Aufnahme

Anzahl der Zellen % der Zellen Anzahl der Zellen % der Zellen aus jeder mit über aus jeder mit über

Bauchöhlex 106 10 Latexteilchen Bauchöhlex 106 10 Latexteilchen

Kontrolle (1,0 ml Kochsalzlsg.)

10

25

3

29

18

31

3

21

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, I.P.*

5

27

11

30

9

27

13

25

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, Oral*

7

27

4

20

7

31

6

15

BCG, 0,1 mg, I.P.

27

97

26

90

33

97

28

84

Kontrolle (1,0 ml Kochsalzlsg.)

5

8

5

20

6

11

4

15

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, I.P.*

3

11

8

30

6

8

8

15

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, Oral*

5

20

8

11

5

8

6

10

BCG, 0,1 mg, I.P.

4

9

6

25

8

13

15

32

Kontrolle (1,0 ml Kochsalzlsg.)

3

26

1

16

2

28

1

7

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, I.P.*

5

45

5

12

6

37

3

10

Tabelle VI-A, 30 mg/kg, Oral*

2

45

1

15

13

37

1

11

BCG, 0,1 mg, I.P.

3

26

2

20

6

38

7

25

* Zellen vom Lymphozyt-Typ wurden bei allen Tieren, die mit dem Polymeren aus Beisp. 7-VI-A behandelt worden waren, aus Milz, Thymus, Lymphknoten und Knochenmark extrahiert, und es wurde in keinem Fall irgendeine Phagozytose-Aktivität bemerkt, die grösser als bei ähnlichen Zellen, die von den Kontrollratten erhalten wurden, war.

austauschers, beispielsweise Amberlit IRC-84 (vernetztes Acryl-Copolymeres, Rohm and Haas Company) erhalten werden. Die erhaltene Lösung in der freien Carboxylform kann dann mit entweder NaOH bzw. KOH neutralisiert, und die neutralisierte Lösung zur Gewinnung der entsprechenden Natrium- und Kaliumsalz-Derivate gefriergetrocknet werden.

Das EMA-Polymere von Beispiel 1, Stufe 1 mit niedrigem Molekulargewicht kann auch in das Halb-monomethyl-sekundäre-amid,haIb-monomethyIamin-carboxylatsalz nach dem Verfahren von Beispiel 1, Stufe 2(a) durch Umsetzen der Lösung von EMA und Aceton mit einer Lösung von Methylamin in Aceton, anstelle von Ammoniak in Aceton, umgewandelt werden. Das Produkt kann dann zur Gewinnung eines partiellen N-Methyl-substituierten Imid-Derivats, das eine Imid-Funktion, als auch sekundäre Methylamid-, ionisiertes COO-- und Amincarboxylat-Funktionen aufweist, in Xylol unter Rückfluss erhitzt werden.

Nähere erläuternde Verfahren zur Durchführung der vorerwähnten weiteren Beispiele mit den begleitenden Ergebnissen sind folgende:

Beispiel 3

In einer ähnlichen Weise, wie in Beispiel 1, Stufe 1 beschrieben, wurde ein Copolymeres aus Propylen und Maleinsäureanhydrid von niedrigem Molekulargewicht hergestellt. In den Reaktor wurden 196 g Maleinsäureanhydrid, gelöst in 1600 ml Äthylbenzol, das 7,30 g Benzoylperoxid enthielt, eingebracht. Die Temperatur wurde auf 80 ° C und der Druck auf 40 psi (2,8 kg/cm2) durch Zugabe von 42 g Propylen aus einem, auf einer Skala montierten Propylenzylinder 45 eingestellt. Anschliessend wurde der Propylendruck auf 40 psi (2,8 kg/cm2) während eines Zeitraums von 19 Stunden bei der Reaktionstemperatur von 80 °C gehalten. Am Ende des Versuches wurde die Bombe gekühlt und belüftet, und die Aufschlämmung von Propylen/Maleinsäureanhydrid-Copo-50 lymerem in Äthylbenzol, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet, indem man dreimal in Xylol aufschlämmte und extrahierte, anschliessend dreimal in Hexan aufschlämmte und extrahierte, filtrierte und bei 60 °C im vollen Ölpumpen-Vakuum trocknete. Das Endprodukt bestand aus 269 g (Aus-55 beute 87,3%) und eine l,0%ige Lösung in DMF bei 25 °C hatte eine spezifische Viskosität von 0,0590.

Das vorstehend hergestellte Propylen/Maleinsäurean-hydrid-CopoIymere-(PMA)-Produkt mit niedriger Viskosität wurde in das Halb-primäre-amid,halb-ammoniumcarboxylat-60 salz durch exakt das gleiche (für EMA) in Beispiel 1, Stufe 2a beschriebene Verfahren umgewandelt. Aus 26,0 g PMA wurden 36,3 g ofengetrocknetes (35 °C, 20 bis 25 mm Hg) Produkt erhalten (115,5% Ausbeute). Die funktionelle Zusammensetzung anhand der Infrarot-Analyse des Produkts zeigte o5 nur die Anwesenheit von primären Amid-, ionisierten Car-boxyl- und Ammoniumcarboxylat-Gruppen an. Eine Imid-Funktion war nicht vorhanden.

Das hergestellte Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylat-

23

644 874

einer 2%igen wässerigen Lösung war 5.43 vor der Einstellung und Gefriertrocknung. Nach der Einstellung auf einen pH-Wert von 9,5, Filtration und Gefriertrocknung war der pH-Wert 5,50, der Gehalt an Stickstoff 10,26% und der Imid-Gehalt 19,0 Gewichtsprozent, wie dies durch Infrarot-Analyse bestimmt wurde.

Das obige Imid-enthaltende Derivat von PMA wurde auf seine Antimetastase-Eigenschaften und nicht rezidivierenden Tumor nach Resektion in männlichen Fischer-Ratten unter Verwendung von BLCa-Tumor, wie in den Tests 6 und 8 beschrieben, bewertet. In der Kontrollgruppe waren 10 Tiere, die nach derTumorexzision (10 Tage nach der Implantation) keine Droge erhielten und 10 Tiere, die eine Einzeldosis von 30 mg/kg I.P. zum Zeitpunkt der Tumorexzision verabreicht bekamen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

n

Auftreten eines Rezidivs

Eintreten des Todes

Auftreten von Metastase beim Tod

Überlebende nach 16 Wochen

Kontrollen 10

10/10

10/10 (rezidiviert)

10/10 (rezidiviert)

0

18-50 Tage, durchschnittl.

48-67 Tage, durchschnittl.

32,7 Tage

59 Tage

Versuch* 10

3/10

3/3 (rezidiviert)

1/3 (rezidiviert)

7

30-38 Tage, durchschnittl.

61-70 Tage, durchschnittl.

34,7 Tage

66 Tage

* 30 mg/kg, Einzeldosis, I.P. am Tag der Tumorexzision. n = Anzahl der Tiere.

salz aus PMA mit einer spezifischen Viskosität von 0,059 wurde in eine, partielles Imid enthaltende Zubereitung nach dem in Beispiel 1, Stufe 3 beschriebenen Verfahren umgewandelt. Eine 20-g-Probe des Amid-ammoniumsalzes wurde in 400 ml Xylol aufgeschlämmt und die Aufschlämmung wie in 5 Beispiel 1, Stufe 3 am Rückfluss erhitzt. Die Aufschlämmung wurde 33 Minuten lang am Rückfluss erhitzt, wobei die Endtemperatur bei 139 ° C lag und 1,1ml Wasser gesammelt wurden. Das Produkt wurde wie beschrieben aufgearbeitet, und man erhielt 15,3 g Endprodukt (Ausbeute 79,6%). Die Infra- 10 rot-Analyse des Produkts zeigte, dass die 33-Minuten-Probe 19,0% Imid ausser der Amid- und Ammoniumcarboxylat-Funktionalität enthielt. Der Prozentsatz an Imid wurde in diesem Fall durch Bezugnahme auf die Standard-Imid/ Amid-Absorptionsverhältnis-Zusammensetzungskurve für 15 EMA, wie in Vergleichsbeispiel 1 bestimmt. Der pH-Wert

Beispiel 4

In ähnlicher Weise, wie in Beispiel 1, Stufe 1 beschrieben, 35 wurde ein Copolymeres aus Äthylen und Citraconsäurean-hydrid von niedrigem Molekulargewicht hergestellt. In diesem Falle bestand die Charge in dem Reaktor aus 228,0 g Citraconsäureanhydrid anstelle von Maleinsäureanhydrid, 1874 ml Äthylbenzol und 15,6 g Benzoylperoxid in 161 ml 40 Äthylbenzol. Der Äthylendruck wurde auf 200 psi (14 bar) gehalten und die Reaktion bei 70 °C während eines Gesamtzeitraums von 27,5 Stunden durchgeführt. Weitere Katalysa-tor-Zusätze wurden nach 3 Stunden und 20,5 Stunden gemacht, und zwar jeweils 10,4 g Benzoylperoxid in 108 ml 45 Äthylbenzol. Das Äthylen/Citraconsäureanhydrid-Copoly-mer-Produkt, das wie in Beispiel 1 aufgearbeitet wurde,

bestand aus 73,5 g (Ausbeute 23,4%). Die spezifische Viskosität (1,0% in DMF, 25 °C) des Copolymeren betrug 0,042.

29,5 g (0,21 Mol) Äthylen/Citraconsäureanhydrid-Copo- 50 lymeres mit niedriger Viskosität wurde in das Halb-amid,-halb-ammoniumcarboxylatsalz nach dem in Beispiel 1, Stufe 2a beschriebenen Verfahren umgewandelt, wobei man 37,0 g vakuumgetrocknetes Produkt (Ausbeute 103,0%) erhielt. Die Infrarot-Analyse zeigte die Gegenwart von Amid-, ionisiertem 55 Carboxyl- und Ammoniumcarboxylat-Funktionen, jedoch keine Imid-Funktionalität an. Ein partielles Imid des Amid-ammoniumcarboxylat-Derivats wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1, Stufe 3 durch Erhitzen einer Aufschlämmung von 20 g des obigen Amidsalzes während eines bo Zeitraums von 30 Minuten in Xylol (400 ml) unter Rückfluss hergestellt. Die Produktausbeute betrug 15,7 g (Ausbeute 83,6%), und das I/A-Absorptions(IR)-Verhältnis war 1,21, was 31,0% Imid entspricht, verglichen mit der Standardkurve für EMA, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben. Der Pro- 05 zentgehalt an Stickstoff betrug 9,24% und eine 5%ige Lösung in Wasser hatte einen pH-Wert von 5,31.

Das vorstehende, Imid-enthaltende Produkt von mit

Ammoniak behandeltem Äthylen/Citraconsäureanhydrid-Copolymerem wurde in männlichen Fischer-Ratten unter Verwendung von BLCa-Tumor auf Überlebens-, Nicht-rezi-div-, und Antimetastase-Eigenschaften nach Tumor-Resek-tion, wie in den Tests 6 und 8 beschrieben, bewertet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer EMA-Zubereitung mit sehr niedrigem Molekulargewicht, die durch Lösungsmittel-Nichtlösungsmittel-Fraktionierung von EMA-Polymeren gemäss Beispiel 1, Stufe 1 erhalten wurde. Aus 8 getrennten EMA-Präparaten wurden 1284 g EMA nach Trocknen über Nacht bei 80 °C und vollem Ölpumpen-Vakuum gesammelt. Diese 8 EMA-Produkte variierten in der spezifischen Viskosität (1%, DMF, 25 °C) von 0,051 bis 0,058 (Durchschnitt 0,053), und ihre Äquivalentgewichte variierten von 134 bis 142 vor der Lösungsmittel-Fraktionierung. Jeder der 8 Versuche ( 160 g) wurde in 500 ml Aceton gelöst und in 2,5 Liter Toluol, die während eines Zeitraums von 10 Minuten in einem 4-Liter-BechergIas heftig mit einem Lightning-Rührer gerührt wurden, ausgefällt. Das ausgefällte EMA wurde abfiltriert (wobei alle 8 primären Mutterlaugen-Filtrate für die weiter unten beschriebene Aufarbeitung von löslichem Polymeren aufgehoben wurden), und die Feststoffe wurden einmal in 2 Liter Toluol, und zweimal in 2 Liter Hexan aufgeschlämmt, filtriert und über Nacht bei 50 CC im vollen Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Von den 8 einzelnen Versuchen wurde eine Gesamtmenge von 1143 g des in Lösungsmittel unlöslichen EMA erhalten, das eine durchschnittliche spezifische Viskosität von 0,057 aufwies (die 8 durch Lösungsmittel ausgefällten einzelnen Versuche variierten in ihrer spezifischen Viskosität von 0,053 bis 0,060).

Die Aceton-Toluol-lösliche Polymer-Fraktion in den vorstehend erwähnten vereinigten, primären Mutterlaugen-Fil-

644 874

24

n Aultreten eines Rezidivs

Eintreten des Todes

Auftreten von Metastase beim Tod

Überlebende nach

16 Wochen

Kontrollen 10 10/10

18-50 Tage, durchschnittl. 32,7 Tage

Versuch* 9** 4/9

19-39 Tage, durchschnittl. 30 Tage

10/10 (rezidiviert) 48-67 Tage, durchschnittl. 59 Tage

4/4 (rezidiviert) 61-78 Tage, durchschnittl. 70,5 Tage

10/10 (rezidiviert)

0/4 (rezidiviert)

* 30 mg/kg, Einzeldosis, I.P. am Tag der Tumorexzision. Tumorexzision in 10 Tagen nach Tumorimplantierung. ;* Ein Todesfall bei der Tumorexzision. n = Anzahl der Tiere.

traten wurde durch Verdampfen aller Lösungsmittel in einem «Rotavap» auf einem siedenden Wasserbad bei 25 bis 30 mm Hg zu einem schweren Öl eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Aceton gelöst und in 1 Liter Toluol bei Raumtemperatur ausgefällt, wodurch man einen öligen, breiigen Feststoff erhielt. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Niederschlag erneut in 200 ml Aceton gelöst und in 1,2 Liter Xylol bei 0 °C erneut unter Bildung eines festen weissen Niederschlages ausgefällt. Dieses Produkt wurde abfiltriert, zweimal mit 400 ml Xylol und zweimal mit 300 ml Hexan gewaschen und über Nacht bei 50 °C in vollem Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Man erhielt 59 g Produkt mit einer spezifischen Viskosität (1%, DMF, 25 °C) von 0,031, einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 342 und einem Äquivalentgewicht (durch Titration) von 172,0. Der Kohlenstoff-Gehalt war 60,92, 60,61% und der Gehalt an Wasserstoff betrug 6,03, 6,12%.

15 • 5 g der obigen EMA-Fraktion mit der spezifischen Viskosität von 0,031 und dem Äquivalentgewicht von 172 wurden in das Halb-amid,halb-carboxylammoniumsalz nach dem Verfahren von Beispiel 1, Stufe 2a überführt, wodurch man 5,4 g eines ofengetrockneten Produkts (50 °C, Pumpenva-20 kuum) erhielt. 5 g dieses Halbamid,halb-carboxylammo-niumsalzes wurden nach dem Verfahren von Beispiel 1, Stufe 3 durch Erhitzen am Rückfluss in Xylol während eines Zeitraums von 1 Stunde in das partielle Imid umgewandelt. Als trockenes Endprodukt (50 °C, Pumpenvakuum) erhielt man 25 3,8 g. Diese Menge wurde in 70 g Wasser (pH-Wert 4,87) gelöst und mit NH4OH auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt, durch ein 0,2 um-Filter filtriert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Endprodukt hatte in 2,0%iger wässeriger Lösung einen pH-Wert von 5,1, einen Gesamtstickstoff-30 Gehalt von 12,27% und einen Imid-Gehalt von 25,0 Gewichtsprozent.

Auftreten eines Rezidivs

Eintreten des Todes

Auftreten von Metastase beim Tod

Überlebende nach 22 Wochen

Kontrollen* 10

Versuch*-** 10

10/10

21-37 Tage, durchschnittl.

29,7 Tage

6/10

21-60 Tage, durchschnittl. 39,7 Tage

10/10 (rezidiviert)

45-64 Tage, durchschnittl.

53,7 Tage

6/6 (rezidiviert)

47-102 Tage, durchschnittl.

71,7 Tage

10/10 (rezidiviert)

1 /6 (rezidiviert)

* Tumorexzision am Tag 11 nach Tumorimplantierung.

** 30 mg/kg, Einzeldosis, I.P., am Tag der Tumorexzision. n = Anzahl der Tiere.

Das Produkt wurde unter Verwendung von FBCa-Tumor in Fischer-344-Ratten auf Überleben, Nicht-Rezidiv und Antimetastasen nach der Tumor-Resektion bewertet (vgl. vor- so stehende Tabelle), wie dies in den Tests 6 und 8 beschrieben wurde.

Das Produkt wurde auch hinsichtlich seiner Fähigkeit bewertet, Immun-Reizbeantwortungen vermittels von wachsenden IgM-Antikörper-bildenden Zellen zu einer Stimula- 55 tion von roten Blutzellen vom Schaf (Antigen), wie in Test 13 beschrieben, mit folgenden Ergebnissen zu stimulieren:

60

Anzahl der Ratten

IgM-PFC/

Index-Kon-

in der Gruppe

1 x 10f,-Milzzel-

trolle = 1,0

len

Kontrolle

634

1,00

Test*

4

1173

1,85

: 30 mg/kg, I.P.

Beispiel 6

Die Herstellung und Brauchbarkeit von Natrium- und Kaliumsalzen der Imide gemäss der Erfindung wurde wie folgt gezeigt. Das Ammoniumsalz-Derivat wurde nach den in Beispiel 1, Stufen 1, 2a und 3-1V-5 beschriebenen Methoden hergestellt und hatte (als gefriergetrocknetes Produkt) die folgenden Analysenergebnisse:

Gesamtstickstoff (%) 14,15,13,99

% Stickstoff in NH^" 6,16, 6,09

pH-Wert in 2%iger wässeriger Lösung 6,28

Gewichtsprozent Imid nach LR. 20,5

Mäq. NH^/gnach NH3-Elektrode 4,31

Die entsprechenden Natrium- und Kaliumsalze des obigen erfindungsgemässen Imids wurden durch herkömmliche Ionenaustausch-Techniken unter Verwendung des Ionenaustauschers IRC-120 von Rohm und Haas in entweder der Natrium- oder Kaliumform hergestellt. Die Austauschsäulen wurden hergestellt, indem man 400 ml IRC-120 (H + -Form) in eine geeignete Säule einbrachte und das Na+-Harz durch

25

644 874

Auftreten eines Rezidivs

Eintreten des Todes

Auftreten von Metastase beim Tod

Überlebende nach

19 Wochen

Kontrollen* 10

Versuch*-** 10

10/10

30-66 Tage, durchschnittl.

47,5 Tage

3/10

32-59 Tage, durchschnittl. 49,3 Tage

10/10 (rezidiviert)

53-85 Tage, durchschnittl.

74,1 Tage

3/3 (rezidiviert)

56-86 Tage, durchschnittl.

75,0 Tage

10/10 (rezidiviert)

I /3 (rezidiviert)

* Tumorexzision am Tag 7 nach Tumorimplantierung.

** 30 mg/kg, Einzeldosis, I.P., am Tag der Tumorexzision. N = Anzahl der Tiere.

Behandlung mit 3,8 Liter einer l,0molaren NaCl-Lösung (oder im Falle von Kalium einer l,0molaren KCl-Lösung), gefolgt von 4 Liter Wasser, herstellte. Lösungen des obigen NH4+-Salzes des Imid-enthaltenden Polymeren wurden unter Verwendung von 5,0 g an gelöstem Polymeren in 200 ml Wasser hergestellt. Diese Lösungen wurden dann auf einen pH-Wert von 8,0 mit verdünntem NaOH (oder im Falle von Kalium mit KOH) eingestellt. Diese Lösungen mit eingestelltem pH-Wert wurden auf die entsprechenden Natrium- oder Kalium-Säulen mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/min aufgegeben, gefolgt von Wasser, bis in jedem Falle 500 ml der am Boden der Säule austretenden Flüssigkeit gesammelt worden waren. Diese austretende Flüssigkeit wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt und gefriergetrocknet. Die als Endprodukt erhaltenen, gefriergetrockneten Salze hatten die folgenden Eigenschaften:

Polymerquelle (Salz-Typ)

Anzahl der Ratten in der Gruppe

IgM-PFC/ 1 x 106-Milzellen

Index-Kontrolle = 1,0

Kontrolle

Ammonium

(NH4+)

2 4

500 1052

1,00 2,10

Polymerquelle (Salz-Typ)

Salzform

NH/

Na+

K +

Ausbeute (g)*

5,47

5,80

Stickstoff (% Gesamt)

14,07

7,77

7,00

mÄqu. NH^/g

4,31

0,034

0,036

NH4+ Umgewandelt in Salz (%)

-

99,3

99,3

Chlor (%)

-

1,25

1,22

Na oder K (%)

-

10,45

17,08

* Aus 5,00 g NH^-Salz, enthält NaCl oder KCl von der pH-Werteinstellung mit HCl.

Die oben erhaltenen Salze wurden zwei biologischen Bewertungen, wie nachfolgend beschrieben, unterworfen:

a) Das NH4+ -Stammsalz wurde in Fischer-344-Ratten unter Verwendung von FBCa-Tumor auf Überleben, NichtRezidiv und Antimetastasen nach der Tumör-Resektion (vgl. vorstehende Tabelle) wie in den Tests 6 und 8 mit den folgenden Ergebnissen bewertet.

b) Die obigen Salze wurden auf ihre Fähigkeit hin bewertet, Immun-Reizbeantwortungen vermittels wachsender IgM-Antikörper-produzierender Zellen zu heterologen Erythrozyten (SRBC, rote Blutzellen vom Schaf), wie in Test 13 beschrieben, mit den folgenden Ergebnissen zu stimulieren :

Anzahl der Ratten in der Gruppe

IgM-PFC/ 1 x 10"-Milzellen

Index-Kontrolle = 1,0

25

Kontrolle 4

534

1,00

Natrium 4

970

1,82

(Na+)*

Kalium (K+)* 4

1098

2,06

Kontrolle 2

538

1,00

Natrium 2

1373

2,55

(Na+)*

Kalium (K+)* 2

996

1,85

Natrium 3

1523

2,83

(Na+)**

Kalium (K+)**3

1058

1,97

Kontrolle 6

541

1,00

Natrium 5

1254

2,32

(Na+)*

Kalium (K+)* 5

1044

1,93

Natrium 6

1607

2,97

(Na+)**

Kalium (K+)**6

1003

1,85

* 30 mg/kg, I.P. verabreicht.

** 30 mg/kg, oral verabreicht.

Beispiel 7

45 EMA mit niedrigem Molekulargewicht aus Beispiel 1, Stufe 1-E (spezifische Viskosität = 0,063) wurde in das Halb-monomethylsekundäramid,halb-monomethylamin-carbox-ylatsalz nach dem folgenden Verfahren umgewandelt. Eine Lösung von 43,9 g (0,312 Mol) EMA in 440 ml reagierendem so Aceton wurde auf — 78 °C in einer Mischung aus Trockeneis-Aceton abgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 71 ml (54 g, 1,74 Mol) kondensiertes Methylamin und 100 ml zusätzliches Aceton zugegeben, um ein wirksames Rühren der ausgefällten Produktaufschlämmung zu gewährleisten. Nachdem die Auf-55 schlämmung des Methyl-amidaminsalzes sich auf Raumtemperatur erwärmt hatte (2 Stunden), wurde sie über Nacht weitergerührt, abfiltriert und frei von überschüssigem Amin durch dreimaliges Aufschlämmen in Aceton (jedesmal 500 ml) gewaschen und über Nacht bei 20 bis 25 mm Hg und 60 3 5 °C getrocknet. Man erhielt 78,3 g (Ausbeute 123,9%) des Halb-methyl-sekundäramid,halb-methylaminsalzes von EMA. Dieses Methyl-amid-aminsalz (20,0 g) wurde in 400 ml Xylol aufgeschlämmt und unter Rühren 5 Minuten lang unter Wasserabnahme am Rückfluss erhitzt und ein Strom Methyl-o5 amin durch die Aufschlämmun eingeleitet, wodurch 0,75 ml Wasser entfernt wurden. Das unlösliche Produkt wurde abfiltriert, einmal mit 400 ml Xylol, anschliessend mit 400 ml Hexan aufgeschlämmt, abfiltriert und bei 40 °C bei 20 bis 25

644 874

26

Auftreten eines Rezidivs

Eintreten des Todes

Auftreten von Metastase beim Tod

Überlebende nach

16 Wochen

Kontrollen 10

Versuch*

10

10/10

18-50 Tage, durchschnittl.

32,7 Tage

3/10

35-40 Tage, durchschnittl. 37,3 Tage

10/10 (rezidiviert) 48-67 Tage, durchschnittl. 59 Tage

3/3 (rezidiviert)

68-77 Tage, durchschnittl.

72,7 Tage

10/10 (rezidiviert) 0/3 (rezidiviert)

* 30 mg/kg, Einzeldosis, I.P., am Tag der Tumorresektion. Tumorexzision in 10 Tagen nach Tumorimplantierung. n = Anzahl der Tiere.

mm Hg Vakuum getrocknet. Man erhielt 16,4 g (Ausbeute 85,2%) des partiell N-Methyl-substituierten Imid-Derivats. Die Infrarot-Untersuchung des Produktes zeigte Imid-Funk-tionalität bei 1700 cm-1, als auch die Anwesenheit von sekundärem Methylamid bei 1645 cm - ionisiertem COO- und Amincarboxylat-Funktionen, an. Der Imid-Gehalt wurde zu 17,0% bestimmt, wie er aus der Standard-I/A-Absorptions-kurve für nichtsubstituierte Imid-primäres-amid-Zubereitun-gen gemäss der Beschreibung in Vergleichsbeispiel 1 abgelesen wird. Der Gehalt an Stickstoff betrug 11,41% und eine 2%ige wässerige Lösung hatte einen pH-Wert von 8,70.

Das obige N-Methylimid-enthaltende Produkt wurde in männlichen Fiseher-344-Ratten unter Einsatz von FBCa-Tumor auf Überleben, Nicht-Rezidiv- und Antimetastase-Eigenschaften nach Tumorexzision, wie in den Tests 6 und 8 beschrieben, mit den folgenden Ergebnissen (vgl. vorstehende Tabelle) bewertet.

Herstellung von EM A-Rohmaterial in einer Versuchsanlage Die Herstellungen von EMA-Rohmaterial und derivati-siertem Produkt gemäss Erfindung in grösserem Massstab wurden gemäss dem nachfolgenden Beispiel durchgeführt.

Beispiel 8

Stufe 1 : Herstellung von EMA

Das gewünschte Rohmaterial von Äthylen/Maleinsäure-anhydrid-Copolymerem (EMA) wurde in einem Autoklav aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 150 gallon (568 1) hergestellt, der mit einer 12 gallon (45,41) Druckflasche für die Zugabe des Initiators, einem mit Glas ausgekleideten, gerührten Reaktor, der zur Spülung mit N2 in geeigneter Weise abgedichtet war, in welchem die Reaktionsteilnehmer gemischt wurden, einem Turbinenrührer, einem 3 inch (7,62 cm) Boden-Austragventil und einem Mantel für entweder Erhitzen oder Kühlen versehen war. Alle drei Behälter wurden, bevor sie mit den Reaktionsteilnehmern beschickt wurden, dreimal mit N2 gespült. In den mit Glas ausgekleideten Mischer für die Reaktionsteilnehmer wurden 536 pounds (243 kg) Äthylbenzol und 66 pounds (30 kg) Maleinsäureanhydrid (MA) eingefüllt. Die Mischung wurde bis zur vollständigen Lösung auf 50 °C erhitzt. Zu dieser Lösung von MA in Äthylbenzol wurde eine Lösung von 2340 g Benzoylperoxid in 46,2 pounds (21 kg) Äthylbenzol, die in einem getrennten Behälter hergestellt worden war, zugegeben.

Die vorstehende Äthylbenzol-Lösung der Reaktionsteilnehmer wurde dann in den 150 gallon (568 l)-Autoklav aus rostfreiem Stahl eingebracht, der Mantel auf 40 °C erwärmt und ein leichter Äthylen-Strom durchgeleitet. Der Rührer

20 wurde mit einer Geschwindigkeit von 125 UpM betrieben. Nach der Zugabe wurde der Reaktionsbehälter mit 5 pounds (2,3 kg) Äthylbenzol in den Autoklav hinein ausgespült, abgetrennt und die Eingangsleitung mit einer Kappe verschlossen. Nach dem Füllen wurde der durchgespülte Autoklav 25 geschlossen und mit Äthylen auf 60 psig (5,2 bar) abgepresst und 5 Minuten lang bei diesem Druck gehalten. Die Abdichtdrucke wurden auf 25 bis 50 psig (2,75 bis 4,5 bar) über dem Reaktordruck eingestellt. Die Ansatztemperatur wurde auf 75 °C durch Heizen des Mantels mit einer Temperatur von 30 95 °C während eines Zeitraums von 45 Minuten gebracht, wonach der Reaktor mit Äthylen auf 200 psig (15 bar) abgepresst wurde. Als Nullzeit wurde der Zeitpunkt aufgezeichnet, zu welchem der Reaktorinhalt die Temperatur von 75 °C erreichte.

35 Es wurde eine Lösung von 1560 g Benzoylperocid in 62,1 pounds (28,2 kg) Äthylbenzol hergestellt und in die 12 gallon (45,4 1) Katalysator-Druckflasche eingefüllt. Nach 3 Stunden Reaktionsdauer des obigen Ansatzes bei 75 °C und 200 psig (15 bar) Äthylendruck wurde zum zweiten Mal Initiator in « den Autoklaven zugegeben und die Druckflasche mit 4 pounds (1,8 kg) Äthylbenzol gespült. Nach der zweiten Zugabe von Benzoylperoxid wurde der Reaktor bei 75° und 200 psig (15 bar) Äthylen für weitere 14 Stunden - insgesamt 17 Stunden - gehalten. Nach 17 Stunden Gesamtreaktionszeit 45 wurde das Reaktionsgemisch auf 25 °C abgekühlt, der Äthylendruck entspannt und der Reaktor dreimal mit Sticktoff gespült.

Die im Reaktor enthaltene EMA-Aufschlämmung in Äthylbenzol wurde durch das Boden-Austragsventil auf ein so Steinzeug-Knutsche-Vakuumfilter, das mit einem segeltuchartigen Baumwollfiltertuch versehen war, ausgetragen. Das Filter wurde mit einer Plastikfolie und einem Stickstoff-Mantel abgedeckt. Der nach der Filtration zurückbleibende nasse Kuchen wurde in 300 pounds (136 kg) Xylol wiederaufge-55 schlämmt, 15 Minuten lang gerührt und erneut abfiltriert. Dieses Wiederaufschlämmungsverfahren mit Xylol wurde dreimal wiederholt, gefolgt von drei Wiederaufschlämmung-Filter-Stufen unter Verwendung von 225 pounds (102 kg) Hexan. Der abschliessende hexanfeuchte Filterkuchen von bo EMA wurde in Trögen aus rostfreiem Stahl ausgebreitet und bei 50 °C in einem «Devine»-Vakuumtrogtrockner während eines Zeitraums von 48 bis 72 Stunden (so lange, bis kein Xylolgeruch mehr vorhanden war) getrocknet. Das getrocknete Endprodukt wog 78 pounds (35,38 kg). Die Ausbeute o5 betrug 82,8%. Insgesamt wurde eine Reihe von 4 Versuchen verschiedener Grösse wie folgt durchgeführt. Der vorstehende Versuch entspricht dem Versuch Nr. 3 in der nachstehenden Tabelle:

27

644 874

Vers.-Nr.

Temperatur

Ausbeute

Spez. Visk.

CO

Pounds (kg)

(IVDMF-25 °C)

1

70

25 (11,34)

0,063

2

75

50 (22,68)

0,053

3

75

78 (35,38)

0,051

4

75

25 (11,34)

0,052

Stufe 2: Herstellung des partiellen Imids von mit Ammoniak io behandeltem EMA

Die Behandlung mit Ammoniak und die Imidisierung von EMA (Produkt aus Stufe 1) wurde in einem mit Glas ausgekleideten Pfaudler-Reaktor mit einem Fassungsvermögen von 100 gallon (379 1) durchgeführt, der mit einem Blattrührer mit 15 abreissender Strömung am rücklaufenden Blatt und einem Umlenkblech-System, und einer Destillationsleitungsschleife aus rostfreiem Stahl mit einem Kühler versehen war, wodurch die Möglichkeit der Gesamtentfemung des Kondensats, oder die Rückführung einer beliebigen Destillat-Fraktion in den 20 Reaktor zurück sichergestellt war. Das System war mit zwei unabhängigen Beschickungsleitungen, die eine für Ammoniak, die andere für Flüssigkeit, versehen, die beide so angeordnet waren, dass sie unterhalb der Oberfläche der gerührten Reaktionsmischung endeten. Jede Leitung war mit einem 25 in der Leitung liegenden Patronenfilter und einem Rotameter zum Messen und Steuern der Durchflussgeschwindigkeiten versehen. Der Reaktormantel war sowohl für Durchleiten von Hochdruckdampf oder Kühlflüssigkeit, je nach Bedarf, vorgesehen. Die Eingangsleitung für die Flüssigkeiten war mit 30 einem mit Glas ausgekleideten Pfaudler-Behälter mit einem Fassungsvermögen von 25 gallon (95 1) verbunden, in welchem das EMA-Rohmaterial vor der Zugabe in den 100 gal-lon-(379 l)-Ammoniakbehandlungsreaktor in Aceton aufgelöst wurde. Die Endprodukte aus den 100 gallon-(379 l)Reak- 35 tor wurden durch Austragen des Inhaltes durch ein Bodenventil auf ein ummanteltes Vakuumfilter vom Knutsch-Typ aus rostfreiem Stahl gewonnen.

Eine typische Ammoniakbehandlungs- und partielle Imi-disierungssequenz wird nachfolgend beschrieben : 40

Der 100 gallon-(379 l)-Reaktor wurde mit 35 gallons bzw. 225 pounds (133 1 bzw. 102 kg) filtriertem Aceton, und der 25 gallon-(95 1)-Lösungsbehälter mit 21,5 gallons bzw. 138 pounds (81,41 bzw. 62,6 kg) filtriertem Aceton beschickt, und zwar beide Male unter einer Stickstoffatmosphäre. Zu den 45 21,5 gallons (81,41) Aceton in dem Lösungsbehälter wurden 47 pounds (21,3 kg) EMA-Copolymeres (hergestellt wie in Beispiel 29, Versuch 4) zugegeben, und bei 20 bis 30 °C so lange gerührt, bis eine vollständige Lösung erzielt worden war. Gleichzeitig wurde unterhalb der Oberfläche des Ace- so tons in dem 100 gallon-(379 l)-Reaktor Ammoniak mit einer Rate von 0,35 pounds (0,16 kg)/min im Verlaufe von 5 Minuten zugegeben. Dann wurde die obige EMA-Acetonlösung unter Druck durch das in der Leitung befindliche Filter mit linealer Strömungsrate während eines Zeitraums von 40 Minuten [4,6 Ib. (2,1 kg)/min)] in die gerührte Aceton-NHj-Lösung in den 100 gallon-(379 l)-Reaktor unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche eingeführt. Der Ammoniakzufluss in den 100 gaIlon-(379 l)-Reaktor wurde während der gesamten EMA-Zugabe-Zugabezeit auf einem Wert von 0,35 lb. (0,16 kg)/min gehalten. Während dieser Zeit liess man die Temperatur der Reaktionsmischung bis auf 44 bis 45 °C ansteigen, indem man keine Aussenkühlung anwandte. Die Ammoniak-Zugabe in einer Menge von 0,35 Ib. (0,16 kg)/min wurde 15 Minuten lang im Anschluss an die EMA-Zugabe fortgesetzt. Die Aufschlämmung des ausgefällten, mit Ammoniak behandelten EMA wurde dann auf 25 °C abgekühlt und zum Vaku-umfilter hin zwecks Gewinnung des festen, mit Ammoniak behandelten Produkts, ausgetragen.

Das abfiltrierte, mit Ammoniak behandelte Produkt, nämlich das Halb-amid,halb-ammoniumcarboxylatsalz, wurde durch hintereinander erfolgendes Wiederaufschlämmen (20 Minuten) dreimal in 47 gallon-(178 1)-Anteilen Aceton mit Filtration zwischen jeder Aufschlämmungsstufe und schliesslich zweimal in 47 gallon-(178 1)-Anteilen Hexan mit anschliessender Filtration behandelt, und so ein hexanfeuchter Filterkuchen des Produkts erhalten. Ein aliquoter Anteil dieses feuchten Filterkuchens wurde zur Analyse getrocknet und zeigte nach IR-Analyse kein Anhydrid, nur Amid und Ammoniumcarboxylatsalzgruppen. Der pH-Wert der wässerigen Lösung war 5,88 in 2,0%iger Konzentration.

Bei allen fünf durchgeführten derartigen Behandlungen mit Ammoniak wurden verschiedene Mengen an EMA - wie dies in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist - eingesetzt. Die vorstehende Beschreibung bezieht sich auf den Versuch Nr. 5 in der nachfolgenden Tabelle.

Die oben erhaltenen, hexanfeuchten Filterkuchen von mit Ammoniak behandeltem EMA wurden direkt in der Imidisie-rungsstufe des Derivatisierungsverfahrens wie folgt eingesetzt, welches die Imidisierung des mit Ammoniak behandelten Produktes aus Versuch Nr. 5 der nachfolgenden Tabelle beschreibt.

Der hexanfeuchte Filterkuchen aus dem vorstehenden Versuch Nr. 5 wurde in einen 100 gallon-(379 l)-Reaktor überführt, der 38 gallons bzw. 275 pounds (1441 bzw. 125 kg)

Xylol enthielt. Diese Aufschlämmung von mit Ammoniak behandeltem EMA in einem Mischlösungsmittel aus Hexan/ Toluol/Xylol wurde unter fortgesetztem Durchleiten von wasserfreiem Ammoniak in einer Menge von 0,044 lb. (20 g) $ /min zum Sieden erhitzt. Ein Rückfluss setzte bei 82 °C ein, und es wurde das gesamte, vorhandene Wasser azeotrop entfernt, und anschliessend das Hexan, bis die Temperatur der Reaktionsmischung 115 °C erreichte. Die Reaktionstemperatur wurde dann bei 115 °C bis 116 °C gehalten und während der Entfernung des bei dieser Temperatur durch die Imidisierung gebildeten Wassers bei Bedarf eine

T rockenprodukt-Analyse

Mit Eingesetztes EMA Hexanfeuchter Anhydrid ' Amid NHi1"-Salz pH-Wert einer Stickstoff

Ammoniak pounds (kg) Kuchen 2"oigen wässerigen ("u)

behandelt pounds (kg) Lsg.

Vers.-Nr.

1 12(5,44) NB* Fehlt Vorhanden Vorhanden 5,34 12,64

2 15,4(6,99) 46(20,87) Fehlt Vorhanden Vorhanden 6,27 12,55

3 35 (15,88) 115 (52,16) Fehlt Vórhanden Vorhanden 6,48 13,51

4 35 (15,88) 200(90,72) Fehlt Vorhanden Vorhanden 5,77 13,81

5 47 (21,32) NB* Fehlt Vorhanden Vorhanden 5,88 13,93

* NB = Nicht bestimmt.

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28

Toluol/Xylol-Mischung in einem Volumenverhältriis von 2:1 in Inkrementen zugegeben. Das Erhitzen unter Rückfluss wurde während eines Zeitraums von 7,5 Stunden unter azeo-troper Entfernung von Wasser und ununterbrochenem Einleiten von Ammoniak in einer Menge von 0,044 lb. (20 g)/min fortgesetzt, bis die gewünschte Umwandlung in Imid, wie sie durch Infrarot-Analyse bestimmt wurde, erreicht worden war (vgl. die nachfolgende Tabelle).

Ofengetrocknetes Imid, enthaltend mit Ammoniak behandeltes EMA Vers.-Nr. Zu Beginn Produktgewicht* Ausbeute „ Scheinbares Wässerige Gesamt- NH*-

eingesetztes EMA (kg) (°'ó) Imid nach IR Lösung Stickstoff Stickstoff pounds (kg) (%) pH-Wert 2% (%) (°)

Konz.

12(5,44) 15,4 (6,99) 35 (15,88) 47(21,32)

4,40 6,42 17,00 21,60

67,6 77,1

89.8

84.9

20,5 21,5 21,0 20,5

5.3

5.4 5,3 5,26

13,26 13,33 13,12 13,26

5,11 5,22 5,01 4,94

* Ofen-Trockengewicht bei 50 °C/3 Torr.

Sobald die gewünschte Umwandlung in Imid erreicht worden war, wurde die Reaktionsmischung abgekühlt, wie oben beschrieben filtriert und das Imid enthaltende Produkt abgetrennt, nachdem es wie oben dreimal unter Verwendung von Toluol [341 pounds (155 kg), 20 min], und anschliessend zweimal unter Verwendung von Hexan [263 pounds (119 kg), 20 min] wiederaufgeschlämmt worden war. Der abschliessend filtrierte, hexanfeuchte Filterkuchen wurde in Trögen aus rostfreiem Stahl im Vakuum (Ölpumpe) bei 50 °C während eines Zeitraums von 72 Stunden, oder bis der Vakuumofen-Druck unterhalb 3 Torr bei 50 °C war, getrocknet.

Insgesamt wurden vier Versuche durchgeführt, entsprechend den Versuchen 1,2,4 und 5 der obigen, mit Ammoniak behandelten EMA-Sequenz. Die zugehörigen Daten für diese Versuche sind in der vorstehenden Tabelle niedergelegt.

Wässerige Lösungen der obigen, im Ofen getrockneten Produkte wurden mit Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt, durch ein 0,2-um-Filter steril in Serumampullen filtriert und für den Endgebrauch gefriergetrocknet. Die abschliessenden Analysen für diese vier Versuche waren die nachfolgend angegebenen. Die Ergebnisse unterscheiden sich von den oben erhaltenen infolge der Reammo-niatisierung der Carboxylgruppen, die während des Trocknens im Ofen Ammoniak verloren.

Vers.-Nr.

Imid nach2%ige wässerige IR(%) Lösung (pH-Wert)

Stickstoff (%)

NH? -Stickstoff (%)

1

18,0

5,96

13,78

5,95

2

20,8

6,00

13,96

5,74

4

18,5

6,69

14,54

6,23

5

20,0

6,46

14,20

6,13

Beispiel 9

Laboratoriumssynthese von Imid enthaltendem, mit Ammoniak behandeltem EMA unter Verwendung eines AEMA-hex-anfeuchten Filterkuchens direkt in Xylol-Rückfluss ohne Trocknen

Es wurden Präparate im Laboratoriumsmassstab hergestellt, bei welchen das EMA in Aceton gelöst im Verlaufe verschiedener Zeiten zu einer Lösung von Aceton zugegeben wurde, in welche gasförmiges Ammoniak mit verschiedenen Durchflussraten eingeleitet wurde, und wobei man die Temperatur von Raumtemperatur (23 bis 25 °C) auf einen Bereich von 50 bis 53 °C ansteigen liess. Das ausgefällte, mit Ammoniak behandelte EMA wurde abfiltriert und die Aufschlämmung mit Aceton und anschliessend mit Hexan gewaschen und filtriert. Der hexanfeuchte Filterkuchen von mit Ammoniak behandeltem EMA wurde dann erneut in Xylol aufgeschlämmt und die gesamte Aufschlämmung zur Entfernung von Wasser in zwei Stufen erhitzt: (1) Azeotrope Entfernung von Wasser im Temperaturbereich von 75 bis 102 °C herrührend von der Reaktion von NH3 und Aceton, und anschliessend (2) Wasser gebildet während der partiellen Imidisierung des mit Ammoniak behandeltem EMA bei einer erhöhten Temperatur (122 bis 132 °C) nach der Entfernung von Hexan. Das partielle Imid-Endprodukt wurde durch Filtration und anschliessendes Aufschlämmen und Waschen mit Xylol und Hexan erhalten. 12 derartiger Versuche wurden gemacht, wie dies aus der nachfolgenden Tabelle zu ersehen ist. Die nachfolgende Beschreibung bezieht sich auf den Versuch Nr. 10 in dieser Tabelle.

EMA aus Beispiel 8, Stufe 1, Versuch 1 (280 g, 2,0 Mol) wurde in 1,1 Liter Aceton gelöst und durch Filterpapier filtriert. Diese EMA/Aceton-Lösung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 45 Minuten in 2,4 Liter Aceton in einem gerührten 5-Liter-Kolben zugegeben, der mit einem Rückflusskühler für azeotrope Entfernung, einem zusätzlichen Kolben und einem Einleitungsrohr für Ammoniak versehen war. Die Einleitungsrohre für das Ammoniak und die EMA/ Aceton-Lösung endeten unterhalb des Flüssigkeitsspiegels in dem 5-Liter-Kolben. Während des 45-Minuten-Zeitraums der EMA-Zugabe und während eines Zeitraums von 10 Minuten danach wurde Ammoniak in die reagierende Aufschlämmung in einer Menge von 0,081 Mol/min in einer Gesamtmenge von 4,44 Mol Ammoniak eingeleitet. Die EMA-Zugabe wurde 50 bei Raumtemperatur (23 °C) begonnen, und man liess die Reaktionstemperatur ohne irgendwelche Kühlung während des gesamten 45-Minuten-Zeitraums ansteigen. Die Endtemperatur der mit Ammoniak behandelten EMA-Aufschläm-mung in Aceton war 53,5 °C. Das mit Ammoniak behandelte ss Produkt wurde abfiltriert, zweimal in 2 Liter Aceton (jedesmal 30 min) und anschliessend zweimal in 2 Liter Hexan (jedesmal 30 min) aufgeschlämmt und filtriert. Der hexanfeuchte Filterkuchen wurde dann ohne Trocknen in 2,7 Liter Xylol zur Wasserentfernung und partieller Imidisierung 60 erneut aufgeschlämmt. Diese Hexan/Xylol-Aufschlämmung von mit Ammoniak behandeltem EMA wurde zur Entfernung von Wasser durch azeotrope Destillation in zwei Stufen bis zum Rückfluss erhitzt. Während dieses Gesamtverfahrens wurde Ammoniak kontinuierlich durch die Aufschlämmung 05 in einer Menge von 0,030 Mol/min eingeleitet. Die anfängliche Wasserentfernung begann bei 88 °C, und die Temperatur stieg im Verlaufe eines Zeitraums von 60 Minuten bis auf 101 °C, und es wurden 9,1 ml Wasser erhalten. Das Heizen

30

35

40

29

Herstellungs- und Versuchsbedingungen von Beispiel 31

644 874

EMA- Ammoniakzugabe HzO-Entfernung Nr. 1** HiO-Entfernung aus Ofengetrocknete

Zugabe* Imid*** Ausbeute

Vers. Zeit Gesamtzeit Rate Gesamte Zeit (min) (ml) Zeit (min) (ml) g (%)

Nr. (min) (min) (Mol/min) Molzahl

1

30

100

0,060

6,0

90

24,4

85

6,6

312

(93,7)

2

40

100

0,064

6,4

120

26,5

95

8,2

309

(93,1)

3

40

90

0,066

5,95

125

25,4

95

7,7

305

(92,3)

4

40

80

0,069

5,5

115

22,6

85

7,1

311

(93,7)

5

45

70

0,072

5,05

85

14,9

77

7,5

305

(91,9)

6

45

65

0,075

4,83

85

12,1

75

7,1

313

(94,4)

7

45

60

0,077

4,60

75

10,4

60

7,0

313

(94,3)

8

45

55

0,081

4,44

60

8,7

63

6,8

319

(96,3)

9

45

55

0,081

4,44

60

8,3

65

6,7

319

(96,2)

10

45

55

0,081

4,44

60

9,1

60

6,9

314

(94,5)

11

45

55

0,081

4,44

60

9,6

58

6,8

315

(94,6)

12

45

55

0,081

4,44

60

7,6

55

6,7

312

(94,0)

* Bei allen Versuchen wurden 2,0 Mol EMA aus Beispiel 29, Versuch 1, eingesetzt.

** Alle Temperaturen zwischen 80 und 102 °C.

*** Alle Temperaturen zwischen 122 und 133 °C.

wurde unter Hexan-Entfernung fortgesetzt, bis das aus der Imidbildung entstehende Wasser zuerst bei 125 °C erhalten wurde. Das Wasser aus der Imidisierung wurde im Verlaufe eines Zeitraums von 60 Minuten zwischen 125 °C und 132 °C 30 azeotrop entfernt, wobei man 6,9 ml Wasser erhielt. Nach der Imidisierung wurde die Aufschlämmung auf 100 °C abgekühlt, filtriert, durch erneutes Aufschlämmen während eines Zeitraums von 30 Minuten in 2 Liter Xylol und anschliessendes zweimaliges Aufschlämmen (jedesmal 30 min) in 2 Liter 35 Hexan gewaschen und filtriert. Das filtrierte Produkt wurde 15 Stunden bei 50 °C unter Ölpumpenvakuum bei 3 mm Hg getrocknet. Man erhielt 314 g ofengetrocknetes Produkt (Ausbeute 94,5%). Die Zusammenfassung von 12 derartigen Versuchen wird in der vorstehenden Tabelle gezeigt. Zur endgülti- « gen Verwendung des ofengetrockneten Produktes wurde dieses in Wasser (2 bis 5%) gelöst und der pH-Wert mit NH4OH auf 9,5 eingestellt, durch ein 0,2-um-Filter filtriert und in Serumampullen gefriergetrocknet. Die Eigenschaften der abschliessend im Ofen getrockneten und gefriergetrockneten « Produkte sind in der nachfolgenden Tabelle niedergelegt.

Eigenschaften der Produkte aus Beispiel 31

Ofengetrocknetes Produkt Gefriergetrocknetes Produkt

Vers. 2%ige Imid* 2%ige Imid* 50

Nr. wässerige (Gew.-%) wässerige (Gew.-%)

Lsg. Lsg.

(pH-Wert) (pH-Wert)

Die Gesamtmischung aller obigen Chargen (etwa 4000 g) hatte die folgende Analyse:

Ofengetrocknet:

pH-Wert der 2%igen wässerigen Lösung 5,02

Imid (Gewichtsprozent) 23,5 Gefriergetrocknet:

pH-Wert der 2%igen wässerigen Lösung 6,00

Imid (Gewichtsprozent) 19,5

Zwei Chargen von je 2000 g wurden mit NH4OH auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt, steril filtriert und in Serumampullen gefriergetrocknet. Jede Ampulle enthielt 0,5 g für die Endanwendung in Versuchen bei entweder menschlichen Patienten oder Tieren. Man erhielt 8000 derartiger Ampullen.

Die Analyse dieses Grossansatzes von Ampullen-Material war folgende:

pH-Wert der 2%igen wässerigen Lösung 6,27

Imid/Amid-Absorptionsverhältnis IR 0,888

Imid (Gewichtsprozent) 19,3

Gesamtstickstoff (%) 14,49 % Stickstoff als NH4+ 6,27

1

5,28

21,5

6,20

17,9

2

4,89

23,2

6,12

21,6

3

4,92

25,2

6,09

22,2

4

4,98

23,2

6,23 '

19,9

5

5,01

22,8

6,16

21,5

6

5,10

23,5

6,22

20,8

7

5,02

23,0

6,25

19,5

8

5,12

24,0

6,14

19,3

9

5,12

23,5

6,18

19,0

10

5,07

22,5

6,06

18,8

11

4,99

22,2

6,18

19,0

12

4,96

23,2

6,10

19,5

* Durch Infrarot-Analyse.

55

Test 17

Dieser Test verwendet das in Test 13 beschriebene Verfahren zur Bewertung normaler Lewis-Ratten auf ihre Fähigkeit, Immun-Reizbeantwortungen vermittels ansteigender IgM-60 Antikörper-produzierender Zellen zu heterologen Erythrozyten (rote Blutzellen vom Schaf, SRBC) zu stimulieren, mit der Ausnahme, dass in diesem Fall die Imid-Zubereitung gemäss der Erfindung durch intravenöse Dosierung über die Schwanzvene in Form von 1 ml einer physiologischen Koch-o5 salzlösung, welche die angegebene Dosismenge enthielt, verabreicht wurde. Alle anderen Einzelheiten waren die gleichen wie in Test 13. Die folgenden Ergebnisse (vgl. die nachfolgende Tabelle) wurden in zwei Versuchen erhalten.

644 874

30

Polymeres aus Beispiel 7-VI-A Polymeres aus Beispiel 3-1V-5

Intravenöse Dosierung IgM, PFC/'l x IO6, Stimulationsindex*** IgM, PFC/1 x 106, Stimulationsindex***

(mg/kg) Milzzellen Milzzellen

0 (Kontrolle)

562*

1,00

522***

1,00

32

1298

2,31

1406

2,69

16

1138

2,02

1282

2,46

8

1215

2,16

1684

3,23

4

1178

2,10

1882

3,61

2

1144

2,04

1238

2,37

1

1257

2,24

1100

2,11

0,5

1173

2,09

1844

3,53

0,1

1021

1,87

1022

1,96

* 5 Tiere pro Gruppe

** 2 Tiere pro Gruppe

*** Kontrolle = 1

Test 18

Ein bevorzugtes Beispiel der vorliegenden Erfindung, bestehend aus einem Copolymeren aus Äthylen und Malein-säureanhydrid mit einem Molekulargewicht von etwa 850, und so derivatisiert, dass es Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppen und Imid-Gruppen enthält, wobei die Imid-Gruppen etwa 20 Gewichtsprozent der Gruppen umfassen (im wesentlichen ähnlich wie in dem durch Fig. 1 erläuterten Beispiel), wurde am Menschen getestet. Während eines Zeitraums von mehreren Monaten in einer Phase I ergab eine klinische Untersuchung an bis zu 72 Patienten mit gastrointesti-nalem Krebs (einschliessend Magen-, Pankreas-, Kolon- und Rektumkrebs-Patienten), dass keine signifikante Toxizität bei der Verabreichung der Droge auf irgendeinem der Verabreichungswege, nämlich intraperitoneal, oral oder intravenös, festgestellt wurde und auch nach der Behandlung mit der Droge keine beschleunigte Weiterentwicklung der Krankheitssymptome zu verzeichnen war.

Beispiel 10

Wenn Isobutylen anstelle einer äquivalenten Menge Pro-

20

pylen in Beispiel 3 eingesetzt wird, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt.

Beispiel 11

Wenn man Dimethylmaleinsäureanhydrid anstelle einer äquivalenten Menge Citraconsäureanhydrid in Beispiel 4 einsetzt, werden im wesentlichen ähnliche Resultate erzielt.

Beispiel 12

30 Wenn EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 300 anstelle eines EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 342 in Beispiel 5 eingesetzt wird, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt.

35

Beispiel 13

Wenn EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 1500 für das EMA mit einem berechneten durchschnittlichen Molekulargewicht 40 (Zahlenmittel) von 342 in Beispiel 5 eingesetzt wird, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse erzielt.

2 Blatt Zeichnungen

Claims (21)

1. 644 874

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Copolymere aus Olefmmonomeren mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und a,ß-ungesättigten Polycarbonsäureanhydri-den mit 4 bis 6 KeWenstoffatomen, die so derivatisiert sind, dass sie sowohl Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppen als auch Imidgruppen enthalten, wobei das underivatisierte Copolymer ein Zahlenmittel-Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 1500 hat und die Imidgruppen 5 bis 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
2. 2. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Olefinmonomere Äthylen ist.
3. 3. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.
4. 4. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Olefinmonomere Äthylen und das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.
5. 5. Copolymere nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Zahlenmittel-Molekulargewicht des underivatisier-ten Copolymeren etwa 850 ist.
6. 6. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Halb-amid,haIb-carboxylatsalz-Qruppe die Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppe ist.
7. 7. Copolymere nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppe die Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppe ist.
8. 8. Copolymere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Imidgruppen 10 bis 25 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
9. 9. Copolymere nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Imidgruppen 10 bis 25 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
10. 10. Verfahren zur Herstellung der Copolymeren nach Anspruch 1, bei denen die Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppe die HaIb-methylamid,halb-methylammoniumsalz-Gruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit Halb-methylamid.halb-methylammoniumsalz-Gruppen derivati-sierte Copolymer, in welchem das underivatisierte Copolymer ein Zahlenmittel-Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 1500 hat, unter einem Methylaminstrom derart erhitzt, dass es neben den (a) Halb-methy!amid,halb-methylammoniumsalz-Gruppen auch (b) Methylimidgruppen enthält und die Methylimidgruppen 5 bis 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
11. 11. Verfahren zur Herstellung der Copolymeren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das mit Halb-amid,halb-ammoniumsalz-Gruppen derivatisierte Copolymer, in welchem das underivatisierte Copolymer ein Zahlenmittel-Molekulargewicht im Bereich von 300 bis 1500 hat, mit Ammoniak derart umsetzt, dass es neben den (a) Halb-amid, halb-ammoniumsalz-Gruppen auch (b) Imidgruppen enthält und die Imidgruppen 5 bis 40 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Xylol und/oder Toluol, bei Rückflusstemperatur durchgeführt wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Olefinmonomere Äthylen ist.
14. 14. Verfahren nach Anspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Olefinmonomere Äthylen und das Polycarbonsäureanhydrid Maleinsäureanhydrid ist.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Zahlenmittel-Molekulargewicht des underivatisier-ten Copolymeren etwa 850 ist.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniak derart umgesetzt wird, dass die Imidgruppen 10 bis 25 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mit Ammoniak derart umgesetzt wird, dass die Imidgruppen 10 bis 25 Gew.-% der derivatisierten Gruppen ausmachen.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur, bei der die Umsetzung mit Ammoniak erfolgt, im Bereich von 50 bis 200 °C, vorzugsweise im Bereich von 60 bis 150 °C und insbesondere im Bereich von 100 bis 150° C liegt.
20. 20. Verfahren zur Herstellung der Copolymeren nach Anspruch 1, in welchem die Halb-amid,halb-carboxylatsalz-Gruppe die Halb-amid,halb-natrium- oder halb-kaliumsalz-Gruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass man das Copolymer nach Anspruch 6 durch-eine Säule eines schwach basischen Kationenaustauschers leitet und die resultierende Lösung mit NaOH oder KOH neutralisiert.
21. 21. Verwendung der Copolymeren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines immunoregulierenden Mittels, dadurch gekennzeichnet, dass man ein solches Copolymer in physiologischer Kochsalzlösung auflöst.