FI68060B - Foerfarande foer framstaellning av polymera immunoregulatoraemnen - Google Patents

Description

'»jgzfA ΓΒ1 m kuulutusjulkaisu ,Rn,n

ΜζΓ® 11 UTLÄG G NIN G SSKRI FT OöUOU

C <45) " - J‘ 1 lf·* 'S"~~v (51) Kv.ik.>t.ci.‘ C 08 F 8/30, A 61 K 31/785 (21) Patenttihikemus — Patentansökning 800158 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 21 .01 .80 (H) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 21 .01 .80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 23 07 80

Patentti* ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksi panon |a kuul.julkaisun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 2y.03.o5 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 22.01 .79 USA(US) 005638 (71) Monsanto Company, 800 North Lindbergh Boulevard, St. Louis, Missouri 63166, USA(US) (72) Joseph Edward Fields, Ballwin, Missouri,

Samuel Simon Asculai, Creve Coeur, Missouri,

John Harpster Johnson, Kirkwood, Missouri, USA(US) (?M Oy Koi ster Ab (5^) Menetelmä polymeeristen immunosäätöaineiden valmistamiseksi -Förfarande för framstä11 ning av polymera immunoregulatorämnen Tämä keksintö koskee menetelmää polymeeristen yhdisteiden valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia kasvannaisterapian immunosäätökäsittelyssä.

Vaikka kasvannaisterapiaa on tutkittu laajalti, niin tehokkaita yhdisteitä siinä käytettäväksi on toistaiseksi löytynyt sangen vähän.

Eräänä ratkaisuna on koetettu manipuloida kehon immuunisysteemiä. On esimerkiksi yleisesti tiedossa, että kateenkorvarauhasella on suuri merkitys immuniteetin kehittymiseen ja häviämiseen. Kateenkorvarauhanen kontrolloi erilaisin, oletettavasti pääasiassa hormonaalisin mekanismein T-lymfosyyttivälitteistä (T = kateen-korva) immuunifunktiota. Näin ollen useita erilaisia luonnossa esiintyviä ja synteettisesti valmistettuja peptidejä on vaihte-levin tuloksin kokeiltu käytettäviksi tämän immuunisysteemin stimulantteina ja/tai ehkäisijöinä.

Muita aineita, joiden on havaittu vaikuttavan edistävästi immunoaktiviteettiin, ovat esimerkiksi Bacillus Calmette-Guerin 2 68060 (BCG), Corynebacterium parbum, glukaani, levamisoli ja tiloroni. Jotkin näistä yhdisteistä lisäävät vasta-aineiden muodostusta, kun taas toiset edistävät tai ehkäisevät soluvälitteistä immuniteettia.

Kasvaintenvastaisina aineina käytettäviksi on ehdotettu myös erilaisia biologisesti aktiivisia synteettisiä polyelektrolyyttejä. Regelson ja Holland havaitsivat natriumpolyetyleenisulfonaatilla olevan laaja antituumoriaktiviteettispektri hiirillä. Nature (Lontoo) 181, 46 (1958). Monilla, pääasiassa korkeamolekyylipainoisilla karboksyylihappopolymeereilla, esimerkiksi polyakryylihapolla, po-lymetakryylihapolla ja etyleeni-maleiinihappoanhydridikopolymeeril-la (EMÄ) havaittiin myös olevan samankaltaista antineoplastista aktiviteettia kuin natriumpolyetyleenisulfonaatilla, Regelson et ai., Nature (Lontoo), 186, 778-780 (I960)? Regelson, "Water-Soluble Polymers", teoksessa "Polymer Science and Technology", voi. 2 (toim. N.K. Bikales), s. 161-177, Plenum Press, New York, 1973. EMA-tyyp-pisten polymeerien antineoplastista aktiviteettia on käsitelty myös CA-patenttijulkaisussa 664 326 (vastaa peruutettua US-patentr tihakemusta 758 023). Näiden polymeerien käyttökelpoiseksi mole-kyylipainoalueeksi on ilmoitettu 500 - 1 500 000. Yhden näistä polymeereistä, nimittäin EMÄ:n, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 20 000 - 30 000,puoliamidipuoliammoniumsuolan ilmoitettiin olevan jyrsijöille ja koirille kroonisesti myrkyllistä, Mihich et ai., Fed. Proceedings, voi. 19, n:o 1, osa 1, maaliskuu 1960. Mihich et ai., Fed. Proceedings, voi. 20, n:o 1, osa 1, maaliskuu 1961, ilmoittivat myöhemmin kroonista myrkyllisyyttä koirilla todetun myös polymeereillä, joiden molekyylipaino on 2 000 - 3 000. Näiden myrkylli-syyshavaintojen johdosta ei näiden polymeerien kliinisiä kokeita voitu pitää mielekkäinä.

Laitoksessa the National Cancer Institute suoritetuissa kokeissa havaittiin tämän jälkeen läheisellä 1:2 divinyylieetteri-maleiinihappoanhydridikopolymeerilla olevan kasvaintenvastaista aktiviteettia, Breslow, Pure & Appi. Chem., 46, 103-113 (1976). Tämä kopolymeeri tunnetaan myös pyraanikopolymeerina (DIVEMA), ja yksi niistä tunnetaan nimellä NSC 46015. Näiden pyraanikopolymeerien käyttö on esitetty myös US-patenttijulkaisuissa 3 224 932 ja 3 794 622, joissa esitettyjen kopolymeerien molekyylipainot ovat 5 000 - 30 000. Useissa eri julkaisuissa, joista esimerkkinä mainittakoon Breslow, Pure & Appi. Chem. 46, 103-13 (1976); Mohr

II

3 68060 et ai., Prog. Cancer Res. Ther. 7, 415-26 (1978); Schultz et al., id. 7, 459-67 (1978); ja Dean et al., Cancer Treatment Reports 62, syyskuu 1978 on esitetty pyraanikopolymeerien antituumoriak-tiviteetin johtuvan immunopotentoitumisesta tai vaikutuksesta immuunivasteeseen retikuloendoteliaalisysteemin (RES) kautta mikro-fagifunktiota edistämällä.

Huolimatta aikaisemmin ilmoitetusta korkeamolekyylipainois-ten EMÄ-tyyppisten polymeerien kroonisesta myrkyllisyydestä, suoritettiin tutkimustyötä tämän tyyppisten polymeerien immunosäätö-aktiviteetin arvioimiseksi. Käytettiin uusia tutkimustapoja ja arviointimenetelmiä, joiden avulla immunosäätöaktiviteettivoitiin tunnistaa ilman siihen liittyvää sytotoksisuutta. Havaittiin, että tietyillä täten viime aikoina arvioiduilla yhdisteillä ei ollut suoranaista sytotoksista aktiviteettia, vaan että ne olivat yllättäen ja odottamatta erittäin tehokkaita kasvannaisten metastaasien ja kasvannaisen uudelleensyntymisen ehkäisijöitä itse kasvannaisen poisleikkaamisen tai poiston jälkeen. Nämä yhdisteet ovat siten indikoituja käytettäviksi erityisesti immunologiseen mekanismiin perustuvassa kasvannaisterapiassa. Niitä voidaan käyttää ehkäisemään kasvannaisen uudelleen syntymistä tai metastaasien kehittymistä antamalla niitä lääkkeeksi alkuperäisen kasvannaisen poiston jälkeen kirurgisesti, röntgen-säteiden tai sytotoksien kemoterapian avulla.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä immunosäätö-vaikutusta omaavan kopolymeerijohdannaisten valmistamiseksi kopo-lymeerista, joka koostuu olefiinimonomeerista, jossa on noin 2-4 hiiliatomia, ja oc ,/>> -tyydyttämättömästä dikarboksyylihappoanhyd-ridistä, jossa on 4 - noin 6 hiiliatomia, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että mainitun kopolymeerin puoliamidi-puoliammonium-suolajohdannainen, jolla kopolymeeri11a on molekyylipaino noin 300-1500, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa orgaanisessa liuottimessa palautusjäähdytyslämpötilassa sellaisen kopolymeeri-johdannaisen valmistamiseksi, joka sisältää sekä (a) puoliamidi-puoliammoniumsuolaryhmiä että (b) imidiryhmiä, joiden osuus mainituista johdannaisryhmistä on noin 5-40 paino-%, ja mahdollisesti puoliammoniumsuolaryhraä muutetaan muuksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaryhmäksi.

Edullisten etyleenimaleiinihappoanhydridijohdannaisten valaisemiseksi esitetään seuraavat rakenneyksiköt eli ryhmät: 4 68060 (a) puoliamidi-puolikarboksylaattisuola -ch2-ch2-ch-ch- 0=C C=0 ' ' - +

NX20 Y

ja (b) imidi -ch9-ch9-ch-ch-~ δ z , , 0=C C=0 \ /

N

Z

joissa kaavoissa X on vety tai C^^-alkyyli, edullisesti vety, Y on vety, ammonium tai farmaseuttisesti hyväksyttävä metallikationi, edullisesti ammonium, ja Z on vety, C^_^-alkyyli, ammonium tai farmaseuttisesti hyväksyttävä metallikationi, edullisesti vety.

(a)- ja (b)-yksiköt ovat jakautuneet olennaisesti lineaariseen jatkuvaan hiiliatomiketjuun. Näistä yksiköistä tulisi noin 5 -noin 40 % olla imidiyksiköitä ja loppujen pääasiassa puoliamidi-puolikarboksylaattisuolayksiköitä. Nämä yksiköt voivat sijaita mielivaltaisesti ketjussa ja/tai mielivaltaisesti polymeerissä. On huomattava, että polymeerissä voi olla pieni osuus (oletettavasti alle 10 %) farmaseuttisesti hyväksyttäviä monoammoniumkarboksyyli- ja/tai dikarboksyyliryhmiä, joita voi syntyä yhdisteiden valmistuksessa osittain reagoineesta tai reagoimattomasta anhydridistä.

Edellä olevista johdannaisryhmistä (a) puoliamidi-puolikarb-oksylaattisuolaryhmä on edullisesti puoliami-puoliammoniumsuola ja (b) imidiryhmä on edullisesti substituoimaton imidi.

Edullisten etyleeni-maleiinihappoanhydridijohdannaisten valaisemiseksi esitetään seuraavat rakenneyksiköt:

II

5 68060 (a) puoliamidi-puoliammoniumsuola - CH? - CH - CH - CH - L Z , f o=c c=o nh2 o"nh4+ (b) substituoimaton imidi

- CH„ - CH„ - CH - CH

z z , , o=c c=o \/

H

Kuten edellä mainittiin (a)- ja (b)-yksiköt ovat jakautuneet olennaisesti lineaariseen, jatkuvaan hiiliatomiketjuun. Noin 5 -40 % yksiköistä on edullisesti substituoimattomia imidiyksiköi-tä ja loput pääasiassa edullisia puoliamidi-puoliammoniumsuolayk-siköitä. Yksiköt voivat sijaita mielivaltaisesti ketjussa tai polymeerissä. On huomattava, että polymeerissä voi olla pieni osuus (oletettavasti alle 10 %) monoammoniumkarboksyyli- tai dikarboksyy-liryhmiä, joita voi syntyä yhdisteiden valmistuksessa osittain reagoineesta tai reagoimattomasta anhydridistä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut immunosäätö-aineet ovat edullisesti vesiliukoisia.

Keksintöä valaistaan edelleen liitteenä olevien piirrosten avulla.

Kuviossa 1 on keksinnön mukaisen, 20 % imidiä sisältävän polymeerin (ks. esimerkki 3, taulukko IV, ajo 5) infrapuna-absorptio-spektrin tunnistusalue.

Kuviossa 2 on vertailuksi esitetty vastaavan 0 % imidiä sisältävän polymeerin (ks. esimerkki 2a) infrapuna-absorptiospektrin tunnistusalue.

Kuviossa 3 on vertailuksi esitetty vastaavan 100 % imidiä sisältävän polymeerin (ks. esimerkki 5) imfrapuna-absorptiospektrin tunnistusalue.

Vaikka CA-patenttijulkaisussa 664 326 on esitetty EMA-tyyppisten kopolymeerien puoliamidi-puoliammoniumsuoloja tai EMA-tyyppisten kopolymeerien imidejä tai osittain imidoituja johdannai- 6 68060 siä käytettäviksi antineoplastisina aineina, uskotaan, että esillä olevan keksinnön mukaiset polymeerit, joissa on määritellyissä suhteissa sekä (a) puoliamidi-puolikarboksylaattisuolafunktio että (b) imidifunktio, ja joilla on suhteellisen alhainen keskimääräinen mo-lekyylipaino, noin 300 - 1500, ovat uusia. Näillä uusilla polymeereillä on odottamattomia, käyttökelpoisia immunosäätövaikutuk-sia, joita vastaavilla polymeereillä, jotka sisältävät vain (a) -tai vain (b)-funktion tai joiden molekyylipaino on olennaisesti korkeampi, ei ole. Vertailun vuoksi voidaan myös mainita, ettei näiden polymeerien vastaavilla monomeeriyksiköillä, nimittäin sukkinimidil-lä ja sukkinaamihapolla (ammonoitu meripihkahappoanhydridi) kirjallisuustietojen mukaan ole merkitsevää kasvaintenvastaista vaikutusta /Regelson et ai.. Nature (Lontoo) 186, (1960) 778-7807·

Keksinnön mukaisten immunosäätöaineiden valmistuksessa käytetyt alhaismolekyylipainoiset kopolymeerit, joista valmistetaan haluttuja johdannaisia, voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin, joita on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 2 857 365, 2 913 437, 2 938 016 ja 2 980 653. Tyypillisesti olefiini, esimerkiksi etyleeni, saatetaan reagoimaan polykarboksyylihappoanhydridin, esimerkiksi maleiinihappoanhydridin kanssa noin 40 - 100°C:ssa reaktiota edistävän vapaaradikaalikatalysaattorin läsnäollessa ja sellaisessa liuottimessa, johon reaktantit liukenevat, mutta muodostunut välituotepolymeeri on liukenematon. Tavanomaiset peroksi-dityyppiset ja atsotyyppiset vapaaradikaalipolymerointikatalysaat-torit, edullisesti bentsoyyliperoksidi, ovat erittäin sopivia tähän tarkoitukseen. Inerttinä liuottimena polymerointireaktiossa voidaan käyttää esimerkiksi bentseeniä, halogeenibentseenejä ja halogeeni-parafiineja. Edullisesti polymerointireaktioon käytetään kuitenkin kopolymeerituotteen molekyyliapinon saamiseksi alhaiseksi US-pa-tenttijulkaisussa 2 913 437 kuvatulla tavalla alkyloitua aromaattista hiilivetyä, jossa on ainakin yksi Qf-vety, kuten esimerkiksi etyylibentseeniä, isopropyylibentseeniä, di-isopropyylibentsee-niä, tolueenia tai ksyleeniä. Edullinen nestemäinen väliaine on etyylibentseeni. Kopolymeeri sisältää edullisesti olennaisesti ek-vimolaariset määrät olefiiniryhmiä ja anhydridiryhmiä, mikä saavutetaan käyttämällä monomeerireaktantteja suunnilleen ekviraolaariset määrät. Kopolymeerituote saadaan kiinteässä muodossa ja voidaan helposti ottaa talteen suodattamalla, linkoamalla tai muulla erotusmenetelmällä.

il 7 68060

On huomattava, että vapaaradikaali-initiaattorin käyttö sekä reaktion alkuunsaattamisessa että polymerointireaktion aikana ja sitten alkyloidulla aromaattisella hiilivetynesteväliaineella tapahtuva reaktion päättäminen tai telomerisaatio aiheuttaa erilaisten orgaanisten ryhmien liittymisen polymeerirakenteeseen. Näiden ryhmien prosenttimäärä koko polymeerissä kasvaa vapaaradikaali-initiat-terina bentsoyyliperoksidia ja nestemäisenä reaktioväliaineena etyy-libentseeniä liittyy molempien aromaattisia ryhmiä polymeerin rakenteeseen. Näiden ryhmien prosenttiosuus on suurempi sellaisissa polymeereissä, joiden molekyylipaino on noin 300 kuin sellaisissa, joiden molekyylipaino on noin 1 500.

Edelleen on huomattava, että näiden alhaismolekyylipainois-ten kopolymeerien valmistuksessa voidaan käyttää tietty määrä verk-koutusainetta, jolloin saadaan veteen liukenematon tuote. Esimerkkejä tällaisista verkkoutusaineita ovat vinyyli- ja allyyliesterit, varsinkin niiden akrylaatit tai krotonaatit, joita on kuvattu US-patenttijulkaisussa 3 165 486. Kopolymeerit voidaan saada liukenemattomiksi myös johdannaisen muodostamisen jälkeen erilaisin menetelmin, esimerkiksi verkkouttamalla diamiinin avulla, kuten US-patenttijulkaisussa 3 554 985 on kuvattu, tai kiinnittämällä ne kantaja-aineisiin, kuten bentsoniittiin, lateksihiukkasiin tai pu-naverisoluihin.

EMA-tyyppisten kopolymeerien amidijohdannaisten valmistus saattamalla kopolymeeri reagoimaan ammoniakkikaasun kanssa huoneen lämpötilassa tai korotetussa lämpötilassa on tunnettu esimerkiksi CA-patenttijulkaisusta 664 326 ja US-patenttijulkaisuista 2 883 287 ja 3 157 595. On myös tunnettua, että käytettäessä korkeampia reaktiolämpötiloja reaktio suosii imidin muodostusta, kun taas suorittamalla reaktio inertissä orgaanisessa liuottimessa, kuten bentseenissä, reaktiolämpötilaa voidaan säätää ja imidin muodostusta hidastaa. Eräänä mahdollisuutena amidin muodostuksen edistämiseksi on suorittaa polymeerin reaktio nestemäisessä ammoniakissa -33°C:ssa.

Vaikka edellä kuvatut menetelmät ovat yleisesti käyttökelpoisia valmistettaessa imidipitoisten johdannaisten välituotteena puoliamidi-puoliammoniumsuolaa, niin näiden menetelmien haittana on keksinnön tarkoitusperien kannalta ammoniakin aika-diffuusioilmiö EMA-hiukkasten sisimpään, kuten esimerkissä 2 on kuvattu. Keksinnön 8 68060 mukaisesti edullinen menetelmä suoritetaan liuottamalla ensim EMA-tyyppinen kopolymeeri asetoniin ja saattamalla sitten liuonnut polymeeri reagoimaan asetonissa nestemäisen ammoniakin kanssa. Haluttu tuote, puoliamidi-puoliammoniumsuola saostuu liuoksesta ja voidaan helposti erottaa suodattamalla, linkoamalla tai muulla menetelmällä, kuten esimerkin 2 osissa a, b ja c on kuvattu. Kuviossa 2 on esitetty esimerkin 2a puoliamidi-puoliammoniumsuolan (0 % imidiä) IR-spektri.

Halutun imidipitoisen johdannaisen valmistus voidaan suorittaa saattamalla välituote, puoliamidi-puoliammoniumsuola reagoimaan edelleen ammoniakin kanssa kopolymeerijohdannaisen saamiseksi, joka sisältää sekä (a) puoliamidi-puoliammoniumsuolaryhmiä että (b) imi-diryhmiä, ja jossa imidiryhmien osuus on noin 5 - 40 paino-% johdannaisryhmien määrästä, ja mahdollisesti muuttamalla puoliammo-niumsuolaryhmä muuksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaryhmäk-si. Reaktio suoritetaan sopivassa orgaanisessa liuottimessa, kuten tolueenissa tai ksyleenissä, palautusjäähdytyslämpötilassa, kunnes sopiva määrä imidijohdannaista on muodostunut; reaktiota on lähemmin kuvattu esimerkeissä 3 ja 4. Palautusjäähdytyslämpötilat voivat vaihdella noin 50°C:sta noin 200°C:seen, edullisesti lämpötila on noin 60 - 100°C ja edullisimmin 100-150°C.

Liitteenä olevassa kuviossa 1 on sellaisen polymeerin IR-spektri (esimerkki 3, taulukko IV, ajo 5), joka sisältää sekä (a) puoliamidi-puoliammoniumsuolafunktion että (b) imidifunktion, ja jossa imidifunktion osuus on 20 %. Tämän esimerkin polymeerillä on molekyylipaino noin 850 ja imidifunktio-osuus (20 %) on edullisella alueella, joka on noin 10 - 25 %.

Vertailutarkoituksissa valmistettiin myös EMA-kopolymeerin 100 %:n imidijohdannainen (esimerkki 5). Kuviossa 3 on tämän polymeerin IR-spektri.

Erilaisten edellä mainittujen funktionaalisten ryhmien identifioimiseen käytetty infrapuna-analyysi, jonka tulokset on esitetty kuvioissa 1-3, kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkin 1 yhteydessä .

Keksinnön mukaisten polymeerien tehokkuuden osoittamiseksi kasvaintenvastaisessa terapiassa immunosäädön avulla suoritettiin polymeerien edustaville esimerkeille erilaisia, seuraavassa kuvattuja kokeita.

9 68060

Eräässä koesarjassa polymeerejä kokeiltiin hiiren virusin-dusoitujen, ei-metastaattisten kasvainten suhteen. Kokeessa käytettiin saman poikueen BALB/c-hiirestä peräisin olevan SV40-viruksen aikaansaamaa fibrosarkomaa (m KSA). Tämän hiirikasvannaisen, mKSA-TUS, keksivät Kit et ai. Int. J. Cancer 4, (1969) 384-392, ja tiedetään, ettei se parane samanaikaisesti syntyneissä BALB/c-hiiris-sä. Tässä koesarjassa havaittu kasvannaisen regressio oli verrannollinen immunostimulaatioon ja kasvannaisen koon pieneneminen noudatti Dean1 in et ai., Int. J. Cancer, 16, (1975) 465-475, koetuloksia, joiden mukaan mKSArssa oli kasvannaiseen liittyviä antigeenejä ja että pienissä eläimissä, joilla oli kasvannaisia, saatiin hyvä korrelaatio soluvälitteisen immuniteetin kanssa. Hiiriä käsiteltiin koeyhdisteen kolmella eri annoksella joko ennen tartuttamista elävillä kasvannaissoluilla annoksilla TD^qq ja TD,-q tai tartuttamisen jälkeen tai sekä ennen että jälkeen. Kasvannaisten kasvu arvioitiin sitten vertaamalla kasvua käsitellyillä hiirillä ja normaaleilla, käsittelemättömillä kontrollihiirillä. Tässä koesarjassa sellaisilla keksinnön mukaisilla yhdisteillä, joiden molekyylipaino oli noin 850, oli olennaisesti suurempi kasvannaisen regeressioaktiviteetti kuin vastaavilla polymeereillä, joiden molekyylipaino oli 2 000 -3 000 tai 20 000 - 50 000.

Toisessa koesarjassa keksinnön mukaisia edustavia polymeerejä kokeiltiin rotan kemiallisesti indusoidun, metastaaseja muodostavan kasvannaisen suhteen. Kokeet suoritettiin Fischer 344 -rotilla 3-metyylikolantreenilla aikaansaatujen virtsarakkokasvannaisten (BLCA) suhteen. Menetelmän ovat kuvanneet R.T. Prehn et ai., J. Nat. Can. Inst. 18, (1957) 769 ja R. Falk et ai., Surgery, lokakuu 1978.

Kasvannaissoluille oli suoritettu läpikulkuja viiden vuoden ajan ja niiden tiedettiin ihonalaisessa (se) kudoksen istutuksessa aiheuttavan etäpesäkkeitä keuhkoihin viikon kuluessa istutuksesta. Ihonalaisen kasvannaisistutuksen jälkeen tavallinen elossa pysymisaika on korkeintaan kolme viikkoa.

Kokeen yhdessä osassa rotalle, johon oli istutettu etäpesäkkeitä aiheuttavia kasvannaissoluja, annettiin koepolymeeria kasvsn-naissolujen istutuksen jälkeen jaksoittain noin viikon väliaijoin kolmen viikon ajan. Näiden eläinten henkiinjäämissuhde oli noin kolminkertainen käsittelemättömiin kontrollieläimiin verrattuna, eikä niissä havaittu kuuden viikon tarkkailuaikana etäpesäkkeiden kasvua.

10 68060 Näiden kokeiden toisessa osassa kokeiltiin etäpesäkkeiden muodostumista rotilla, joilla oli ollut kasvannainen, antamalla koe-polymeeriä kasvannaisen poiston jälkeen 7-10 päivänä kasvannaisen istuttamisen jälkeen. Käsitellyillä eläimillä tarkkailtiin kasvannaisen uudelleenmuodostumista poiston jälkeen ja verrattiin käsittelemättömiin kontrollieläimiin. Kontrollieläimillä kasvannaisten uudelleenmuodostumista tapahtui 100-%risesti kuuden viikon kuluessa poisleikkaamisesta keskimääräisen ajan ollessa 32 vrk, kun taas keksinnön mukaisilla edullisilla yhdisteillä 30 mg/kg annoksella käsitellyillä eläimillä ei kuuden viikon aikana esiintynyt kasvannaisen muodostumista ja 10 viikon jälkeen havaittiin kasvannaisen muodostumista vain 13 %:lla eläimistä.

Vielä eräässä koesarjassa keksinnön mukaisia edustavia polymeerejä kokeiltiin normaaleille Lewis-kantaan kuuluvilla rotilla, ja niiden havaittiin edistävän immuunivastetta, mikä voitiin todeta vasta-ainemuodostuksen lisäyksestä.

Eräissä kokeissa normaaleilla Lewis-rotilla todettiin keksinnön mukaisten edustavien polymeerien saavan aikaan B-soluaktivoin-tia ilman että T-soluja oli läsnä, mikä seikka osoittaa näitä polymeerejä voitavan käyttää kateenkorvan funktion korvaajina. T-solut ovat kateenkorvasta peräisin olevia lymfosyyttejä ja B-solut ovat lymfosyyttejä, jotka erottuvat limapussissa tai luuytimessä.

Normaaleilla Lewis-rotilla suoritetuissa kokeissa saatu pe-ritoneelisten makrofagien lisääntyminen ja makrofagien fagosytoosin lateksiaktiviteetti osoittivat, ettei näiden polymeerien immunosää-tövaikutus B-soluaktiviteettiin johdu makrofagiaktiviteetin stimuloinnista. Keksinnön mukaiset polymeerit näyttävät siten toimivan eri tavalla kuin aikaisemmin tunnetut läheiset pyraanikopolymeerit, jotka edistävät makrofagifunktiota RESrin avulla.

Edellä esitettyjen ja muiden kokeiden ja niiden tulosten yksityiskohtainen kuvaus on jäljempänä esimerkeissä 8-23.

Keksinnön mukaisia polymeerejä voidaan yleensä antaa hoidettavalle potilaalle kasvannaisen kemoterapian, säteilyterapian ja/tai kasvannaisen poiston yhteydessä immunosäädön kannalta tehokkaita määriä. Niitä voidaan kasvannaisterapiassa antaa suunnilleen samanaikaisesti terapian kanssa tai sopivana ajankohtana ennen terapiaa tai sen jälkeen. Yleensä tämä ajankohta on sopivasti kahden vuorokauden aikana välittömästi ennen terapiaa ja kuukauden ajan heti il 11 68060 terapian jälkeen. Tutkimuksissa on osoittautunut, että keksinnön mukaisen edullisen vesiliukoisen polymeerin häviäminen kehosta tapahtuu noin 30-60 vuorokaudessa, ja näin ollen polymeerin tehostusan-noksia voidaan sopivasti antaa noin joka kuudes viikko.

Polymeerejä voidaan antaa parenteraalisti sekä myös oraalisesti esimerkiksi määrinä noin 1 - 100 mg/k.ehonpaino-kg. Niitä voidaan antaa sekä intravenöösisti että intraperitoneaalisti edullisesti vesiliuoksina esimerkiksi steriilissä vedessä tai suolaliuoksessa. Oraalisesti niitä voidaan antaa tabletteina, jauheina, kapseleina, eliksiireinä tai muina annosmuotoina sekoitettuina tavanomaisten kiinteiden tai nestemäisten laimennusaineiden, kantaja-aineiden, suspendointiaineiden ja apuaineiden kanssa, kuten maissi-tärkkelyksen, laktoosin, talkin, steariinihapon, magnesiumstearaa-tin, gelatiinin, akaasiakumin ja lekustkumin, alkoholin, veden, di-metyylisulfoksidin (DMSO), kasviöljyjen ym. kanssa. Oraalinen annos on edullisesti kiinteä, joka rekonstituoidaan sopivaan nesteseokseen lääkeannon ajankohtana, jotta kaksoisryhmät (a) puoliamidi-puoli-karboksylaattisuola ja (b) imidi pysyisivät stabiileina. Muina sopivia polymeerien annosmuotoja halutun immunosäätöterapian saamiseksi on esitetty jäljempänä olevissa esimerkeissä. Edullinen polymeerin annosmuoto on sen liuos fysiologisessa suolaliuoksessa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat yksityiskohtaisesti keksintöä. Kaikissa esimerkeissä saanto-% tarkoittaa talteenotetun tuotteen määrä %:eina teoreettisesta.

Esimerkki 1 EMÄ:n valmistus Lähtöaine etyleeni/maleiinihappoanhydridikopolymeeri (EMÄ) valmistettiin kuumennetussa 4 litran ruostumattomasta teräksestä olevassa reaktorissa, joka oli varustettu sisäisellä vesijäähdytys-kierukalla, magneettisekoittajalla, jonka edullinen kierrosnopeus oli 1 000 - 1 200 r/min, etyleenin sisäänjohtoputkella ja putkella, jonka kautta etyleenin paineen avulla voitiin lisätä lisämäärä katalysaattoria liuoksena. Pohjassa olevan poistoaukon kautta voitiin ottaa näytteitä tai laskea ulos lopputuote. Varusteisiin kuului myös kuumennuslaite ja jäähdytyssäätölaite. Tyypillisessä ajossa reaktoriin pantiin 1 625 g (1 875 ml) etyylibentseeniä, 190 g (1,94 mol) 12 68060 maleiinihappoanhydridiä ja 14,1 g (0,058 mol) bentsoyyliperoksidia liuotettuna 80 g:aan (92 ml) etyylibentseeniä. Katalysaattoriastia huuhdottiin reaktoriin 20,0 ml:n lisämäärällä etyylibentseeniä. Reaktori suljettiin ja huuhdottiin huoneen lämpötilassa kahdesti etyleenillä ilman poistamiseksi systeemistä. Sitten lämpötila korotettiin 70°C:seen ja pidettiin siinä samalla johtaen koko polyme-roinnin ajan etyleeniä paineella 1 380 kPa. Kolmen tunnin polyme-roinnin jälkeen 70°C:ssa 1 380 kPa:n etyleenipaineessa reaktoriin lisättiin katalysaattorin lisäysjohdon kautta 9,4 g (0,039 mol) bentsoyyliperoksidia 60 g:ssa (70 ml) etyylibentseeniä ja lisäyksen jälkeen huuhdottiin vielä 20 ml:11a etyylibentseeniä. Sekoitusta ja kuumennusta 70°C:ssa 1 380 kPa:n paineessa jatkettiin sitten vielä 14 tuntia polymerisaatioreaktion saamiseksi täydelliseksi. Ajon päätyttyä reaktori jäähdytettiin ja avattiin; sen sisältö koostui ety-leeni/maleiinihappoanhydridikopolymeerin (EMÄ) etyylibentseenilietteestä ja pienestä määrästä tuotetta (EMÄ) kiinnittyneenä lasimai-sena sekoittimeen, jäähdytyskierukkaan ja reaktorin pintaan. Lasittunut materiaali poistettiin pinnoilta raaputtamalla ja suodatettiin yhdessä lietteen kanssa. Maleiinihappoanhydridin reagoimisas-te määritettiin suodoksesta titraamalla NaOHrlla (fenolftaleiini).

EMA-tuotteen talteenottamiseksi suoritettiin seuraavat työvaiheet: lietteen suodatus, kolme kertaa lietteen uutto (tunnin ajan joka kerta) 2 litralla ksyleeniä huoneen lämpötilassa, sitten kolme uuttoa (1 h kukin) 2 litralla heksaania ja loppusuodatus. Kunkin uuttovaiheen välillä suodatettiin. EMA-lopputuote tyhjökuivattiin öljypumpputyhjössä 55-60°C:ssa. Saatu kuiva EMA-tuote jauhettiin Waring-sekoittimessa viiden minuutin ajan, jotta vähäinen lasittuneen materiaalin määrä saataisiin hienoksi jauheeksi. Taulukossa I on esitetty tulokset seitsemästä peräkkäin suoritetusta EMA-poly-meroinnista.

13 68060

Ai

O

• p •H ·Η P I—I CO Ή <D tn co ω ro -H > 0 Cd d X -.ns

•H PC

<0 B >1

O, -P

H d -P

•P -HO)

-P Ό -P

d tn o o h vo tn h Vh -H

d) - Cd P

.H oo σ\ o ov o h o τί :cd cd ro ro ro h* h· >sr d «d £> rHrHi—IrHrHiHrH Cd g *H -P · > CO (0 (0 a: c ή

Cl] Ή iH

r- O CU l g co tn g Ai

1 Cl, H (3 O

•HS tn p 3

to D (N tp -H

0 I Ή

Ai dP Q O I

(f) c te

Hd h* oo ro vo ro -h n* S -h o > VO VO VO VO VO VO ID E-f (d (ti en - ooooooo en Ο 'z

•H -H ^ <C I

Cd -p OOOOOOO C -H

H C -P U -H O T3 •h jjo -P a; p O g 0) tn tn -h cd

Ai O -P cm id ra Ό

Ai en Ai C

p -H S Λ

γΗ·η tf h ra tf ra ra td -P

cd Hr, ro <—i i—i m oo iH o d d tn cd -h h v v v ^ ^ d :td

Eh-η oo oo oo oo oo d) > cd

Kdp tn m tn tn in in in h :cd i—i O -P Ή H d) co ro o h< o cn H :rd :cd en -Pr-I OOrHOrHrHrH ,H W Ai

d) - - ** ·.·.* «· rH -H CC

>öp ^rmininininin -h en cd

P P

• -p :id -P

—' O d) -H *H

df> > i t) +)

1 - P -H -H I

id !0 PSC

dJ-HOoovoiH>-ir~cri'sr -HOOd, -P -H -P - - - - Ai Ai >1 O-PCOOrOCNr-HrHrHfM CO en ,d Cd cdididiooooooooooooo d) -h d h

-plnjfd '—· —r Cd rH

i en en id) < — ιηΓ^Γοσιηιη^ d T5 d en

g Cd 00 (N CN r-H nj (N (N CUi-HO-H

H-PtraHNNNCNCNN COCd^iP

Ai > -H -P

>1 -P tn d)

id -p en a: B

Ο,Ή # ·Ρ O C>- O

Cd T) I p f-l -H

Λ p tn :id >1 h hj -Hp-HiniDrococyioio ad-POd cd g.......e-poo)

-η>ι-.-ΙιΗοοοοοογ~γ-οο d) 6 -P

•HACOOVCTiCTiCXvOiOtyi fi -P O

d) e tra d; -h d o, iH cd Cd Ό P d)

Cd O d) AC 3d Ό d S Oi p Cd :cd AC 0) « S X in O O ~ ~ r- •ro ·> <CQUQWChO Ή <n ro < d 14 68060 EMÄ-tuotteen molekyylipainoparametrit määritettiin edellä olevasta tyypillisestä tuotteesta F. Materiaalia tyhjökuivattiin 24 tuntia 100°C:ssa öljypumpputyhjössä. Parametrit määritettiin kuivassa dimetyyliformamidissa (DMF). Valmisteen F keskimääräiseksi nume-romolekyylipainoksi (Mn) saatiin 852; määritys suoritettiin höyryn-paineosmometrillä (Knauer VP Osmometer) DMF:ssa 120°C:ssa. Keskimääräinen molekyylipaino (Mw) määritettiin pienikulmaisella laser-sädesironnalla DMFissa (Chromatix KMX-6), ja sen arvoksi saatiin 5 730. Rajaviskositeetti DMF:ssä 25°C:ssa mitattiin kapillaarivis-kosimetrillä käyttäen Cannon Ubbelohde -laimennusviskosimetriä (koko 75) ja ekstrapoloimalla neljän eri konsentraation tulokset nolla-konsentraatioon. Valmisteen F rajaviskositeetti oli 0,0607 dl/g.

Vastaavat M^:n, M^:n ja rajaviskositeetin määritykset tehtiin samalla tavalla korkeamman ominaisviskositeetin omaavista EMA-valmisteista (0,11, 1 %, DMF, 25°C). Tässä tapauksessa rajaviskosi-teetiksi saatiin 0,1227 dl/g, M oli 2 264 ja M 12 970.

Käyttämällä edellä saatujen kahden EMA-tuotteen erilaisia ominaisviskositeetin arvoja, laskettiin standardiyhtälön vakiot K ja 0(, joiden ra javiskositeetin ja molekyylipainon välinen suh de on seuraava A/ = KM01. Näiden suureiden keskinäiset suhteet olivat ^250 = 4'71 x 10~4 Mn °'72 3a = 3,51 x 10"5 Mw 0,86

Sekä selityksessä että patenttivaatimuksissa käytettynä ilmaisulla "keskimääräinen molekyylipaino" tarkoitetaan numero-keski-määräistä-molekyylipainoa.

Funktionaalisten ryhmien identifiointi

Kaikkien polymeerijohdannaisten erilaisten funktionaalisten ryhmien sekä kvalitatiiviseen että kvantitatiiviseen määritykseen käytettiin IR-analyysiä (Beckman IR-12 spetrofotometri). Näytteiden valmistus, absorbanssifrekvenssien merkitykset ja menetelmät imidi-ryhmien ja amidiryhmittymien suhteen määrittämiseksi suoritettiin teoksessa "The Infra-red Spektra of Complex Molecules", Bellamy,

John Wiley and Sons, 1960, tai teoksessa "Practical Infra-red 15 68060

Spektroscopy", Cross, Butterworth, 1964, esitetyllä tavalla. Näytteiden valmistukseen käytettiin kaikissa tapauksissa puristettuja kiekkoja, jotka sisälsivät 2 mg polymeeria/250 mg KBr. Sekapolymee-ria/KBr-kiekon paino oli 70 mg. Absorptiomaksimien asema on ilmoitettu aaltolukuina, joiden yksikkö on cm \ ja joita tavallisesti kutsutaan frekvensseiksi.

Tuotteen kvalitatiivisen "sormenjäljen" saamiseksi, joka sormenjälki osoittaa tiettyjen ryhmien läsnäolon tai puuttumisen, käytettiin seuraavia nauhamaksimifrekvenssejä:

Aaltoluku (cm "S Funktio 1. 5-jäseninen rengashydridi 1870-1830 heikompi C=0 venytys dubletti 1800-1760 vahvempi 2. Dissosioitumaton alifaattinen happo (COOH): 1725-1700 C=0 venytys 3. Polymeerin imidi, 5-jäseninen 1715 vahvempi C=0 venytys rengas, dubletti: 1770 heikompi 4. Polymeerin primaarinen amidi: 1670 vahvempi C=0 venytys

Amidi-I-nauha 1620 heikompi NH deformaatio ja C-N venytys 5. Karboksylaatti-ioni C02 1560-1570 asymmetrinen venytys 6. Metyleeni -CH_- 1470-1450 C-H deformaa tio 7. Ammonium(NH.+) karboksylaatti- 1405-1400 symmetrinen suola (intensiteetti riippuu venytys kationin luonteesta) 8. Polymeerit, joissa on suuri 1180-1200 vahvempi C-N venytys imidiryhmäkonsentraatio (yli 1370-1350 heikompi 60 %), sisältävät kohdassa 3 olevan lisäksi dubletin

Imidi/amidi-pitoisuuden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi polymeerissä, joka ammoniumkarboksylaattifunktion lisäksi sisältää näitä molempia ryhmiä, määritettiin vahvemman imidimaksimi (1 715 cm ja vahvemman amidimaksimin (1 670 cm absorbanssien intensiteettien suhde. Imidi-sisältö määritettiin vertaamalla edellä mitattua imidi/amidi-suhdetta standardikäyrään, jossa on imidi-%:n riippuvaisuus imidi/amidi-absorbanssisuhteesta} standardikäyrä saatiin määrittämällä IR-absorptio näytteistä, jotka valmistettiin sekoittamalla kasvavia määriä puhdasta (noin 100-%:ista) imidiä (kuvattu esimerkissä 5) polymeerin kanssa, joka ei sisältänyt imidiä eikä 16 68060 ionoitumattomia COOH-ryhmiä, vaan ainoastaan amidia ja ionoituneita karboksyyliryhmiä (kuvattu esimerkissä 2).

Tässä viimeksi mainitussa kokeessa imidi/amidi-suhteen määrittämiseksi pidettiin huolta siitä, ettei frekvenssissä 1 715 cm-'1' näkynyt ionoitumatonta karboksyyliä, liuottamalla näyte ensin veteen, säätämällä pH ammoniumhydroksidilla arvoon 10,0 ja kylmäkui-vaamalla näyte, jolloin ionoitumaton COOH muuttui ammoniumkarboksy-laatiksi. Tämä menettely vahvistaa karboksylaatti.maksimien (1 560 ja 1 400 cm "*) intensiteettiä ja samalla varmistaa, että jäljelle jäänyt maksimi (1 715 cm 1) ja imidi-maksimi.

Kaikissa seuraavissa esimerkeissä viittaukset funktionaalisten ryhmien läsnäoloon tai puuttumiseen ja imidipitoisten polymeerien imidipitoisuuteen perustuvat edellä kuvatulla menetelmällä saatuun funktionaalisten ryhmien läsnäoloa tai puuttumista osoittaviin tuloksiin ja kvantitatiiviseen imidi/amidi-intensiteetti-suhteen määritykseen.

Esimerkki 2 EMÄ:n puoliamidi-puoliammonium-COO -suolan (AEMA) valmistus

Aikaisempia menetelmiä EMA-polymeerien ammonoimiseksi EMÄ:n puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaattisuolan saamiseksi (US-patent-tijulkaisu 3 157 595 ja CA-patenttijulkaisu 664 326) ovat: (1) kuiva ammonointi johtamalla ammoniakkikaasua huoneen lämpötilassa voimakkaasti sekoitettuun kuivaan EMÄ-jauheeseen, (2) ammoniakin johtaminen sekoitettuun EMA-jauheen bentseeni-tai heksaanilietteeseen, (3) kiinteän EMA-jauheen lisääminen suoraan sekoitettuun nestemäiseen ammoniakkiin, jota käytetään ylimäärin. Näillä menetelmillä on kuitenkin esillä olevan keksinnön kannalta puutteita johtuen ammoniakin diffundoitumisen hitaudesta hienoksi jauhettujen EMA-hiukkasten sisimpään. Pitkienkin reaktioaikojen jälkeen valmistetut amidi-ammoniumsuola-tuotteet sisältävät aina jäännösmääriä reagoimatonta anhydridiä, jonka määrä saattaa kohota jopa 5 paino-%:iin asti, kuten anhydridin absorbanssiraaksimit frekvensseillä 1 780 ja 1 850 cm osoittavat.

Tuotteiden valmistamiseksi, jotka eivät sisällä anhydridi-funktiota, kehitettiin seuraava edullinen menetelmä, jossa vältetään pitkät reaktioajot ja huonot lämpötilasäädöt.

ti 17 68060 (a) Esimerkin 1-F EMA-polymeeri (80 g) liuotettiin 800 ml: aan asetonia (AR-laatu) ja liuos lisättiin -70°C:ssa (kuivajää-asetoni-haude) 20 minuutin kuluessa sekoittaen liuokseen, jossa oli 100 ml nestemäistä ammoniakkia 3 litrassa asetonia. Lisäyksen jälkeen seos sai vähitellen (neljän tunnin kuluessa) lämmetä huoneen lämpötilaan, jolloin saostuneen tuotteen alkuperäinen keltainen väri muuttui valkeaksi. Tuote suodatettiin ja pestiin Imettämällä kaksi kertaa asetoniin (2 1) ja sen jälkeen kaksi kertaa asetoni/heksaani-seok-seen 50/50 (1,5 1). Kukin liettämisvaihe kesti 30 minuuttia. Lopputuote suodatettiin ja kuivattiin yön yli 45°C:ssa 20-25 mm Hg tyhjössä. Kuivattu tuote liuotettiin 900 ml:aan vettä, liuos suodatettiin 0,45 ^um suodattimena ja suodos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 98,7 g (100 %:n saanto) puoliamidi-puoliammoniumkarboksyylisuo-laa.

(b) Kohdan (a) menetelmä toistettiin käyttäen esimerkin 1-F EMA-polymeeria, jonka asetoniliuokseen kuitenkin lisättiin vettä.

EMÄ (60 g) liuotettiin 500 mlraan asetonia ja 2,32 g:aan vettä, ja liuosta keitettiin palautusjäähdyttäen kaksi tuntia. EMÄ:n jäähdytetty asetoniliuos lisättiin -60°C:ssa sekoittaen 10 minuutin aikana liuokseen, joka sisälsi 3 moolia nestemäistä ammoniakkia 2 litrassa asetonia. Saatu liete sai lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä käsiteltiin samoin kuin edellä 2 x 1,5 litralla asetonia ja 1 x 1 litralla heksaania, se suodatettiin ja kuivattiin 40°C:ssa 20-25 mm Hg tyhjössä yön yli. Saatiin 84 g kuivaa tuotetta (yli 100 %:n saanto).

(c) Kolmannessa valmistuksessa käytettiin esimerkin 1-G EMÄ polymeeriä. 100 g (0,714 mol) EMA:a keitettiin palautusjäähdyttäen kaksi tuntia 700 ml:ssa asetonia ja 3,85 g:ssa vettä. Jäähtynyt asetoniliuos lisättiin 10 minuutin aikana sekoittaen -50°C:ssa 3,3 litraan asetonia, joka sisälsi 60 ml nestemäistä ammoniakkia. Tunnin kuluttua reaktioseoksen annettiin lämmetä -50°C:sta huoneen lämpötilaan (kaksi tuntia). Suodatettu tuote lietettiin kaksi kertaa 2 litraan asetonia (30 minuutin käsittely kummallakin kerralla) ja kaksi kertaa 2 litraan heksaania (30 minuutin käsittely kummallakin kerralla), suodatettiin ja kuivattiin yön yli 50°C:ssa täydessä öljypumpputyhjössä. Saatiin 115,6 g (93 %:n saanto) kuivaa puoli-amidi-puoliammoniumkarboksyylisuolaa.

Edellä valmistettujen tuotteiden analyysit on koottu taulukkoon II.

18 68060

Taulukko II

Valmistus abc

Typpi-% (2:n määrityksen keskiarvo)

Funktionaaliset ryhmät (IR-analyysi)

Anhydridi ei ole ei ole ei ole

Dissosioitumaton COOH ei ole ei ole ei ole

Imidi ei ole ei ole ei ole

Primaarinen amidi huomat- huomat- huomattavasti tavasti tavasti

Ionoitunut COO huomat- huomat- huomattavasti tavasti tavasti

Metyleeni -CI^- on on on -COO-NH^+ huomat- huomat- huomattavasti tavasti tavasti

Esimerkki 3

Osittaisimidi-johdannaisten valmistus ksyleenissä 10 g:n näyte esimerkissä 2a valmistettua puoliamidi-puoli-ammoniumkarboksyylisuolaa lietettiin 250 ml:aan ksyleeniä 1 litran pullossa, joka oli varustettu sekoittajalla, lämpömittarilla, veden-poistoloukulla ja putkella ammoniakin sisäänjohtamista varten. Lietettä keitettiin palautusjäähdyttäen 12 tuntia samalla koko ajan johtaen siihen ammoniakkia. Lietteestä otettiin tiettyinä ajankohtina näytteitä (ks. taulukko III), joista määritettiin imidin muodostuminen ajan funktiona. Jokainen pieni näyte lietettiin heksaa-niin (3 x 100 ml), suodatettiin ja kuivattiin 50°C:ssa 20-25 mm Hg tyhjössä. Näytteen 2-%risen vesiliuoksen pH määritettiin, näyte liuotettiin veteen, pH säädettiin 10,0:ksi (NH^OH) ja kylmäkuivattuina kylmäkuivatun tuotteen 2-%risen vesiliuoksen pH määritettiin. Kaikista näytteistä otettiin IR-analyysit imidi/amidi-suhteen saamiseksi ja siten imidi-pitoisuuden saamiseksi. Tulokset nähdään taulukossa lii.

Il 19 68060

Taulukko III

Keittoaika pH-la^ pH-2b* I/A suhdeC^ Imidiä, paino-%d^ ksyleenissä näytettä otettaessa 15 min 6,26 7,20 0,723 13,8 30 min 6,00 5,86 0,858 18,5 45 min 5,91 5,76 0,999 23,3 1 h 5,78 5,53 1,113 27,4 1.5 h 5,43 5,43 1,398 36,8 2 h 5,27 5,76 1,501 40,2 3 h 4,94 5,72 1,821 50,0 4 h 4,78 5,38 6 h 4,73 5,76 7.5 h 4,73 5,60 12 h - a) 2-%risen vesiliuoksen pH ennen pH-säätöä b) pH 10reen säädetyn kylmäkuivatun tuotteen 2-%risen vesiliuoksen pH.

c) IR-absorbanssi-intensiteettien suhde aaltoluvuilla 1 715 cra_d -1 670 cm .

d) Saatu I/A-standardikäyrästä.

Suoritettiin vielä yhdeksän eri koetta käyttäen esimerkin 2b puoliamidi-puoliammoniumkarboksyylisuolaa. Kussakin kokeessa ksyiee-nilietettä keitettiin palautusjäähdyttäen taulukossa IV ilmoitettu aika ja loppukäsittely suoritettiin koko näytteelle. Heksaanipesun jälkeen saadut kuivatut tuotteet liuotettiin jokainen 150 ml:aan vettä, liuoksen pH säädettiin 10,0:ksi NH^OHrlla, liuos suodatettiin 0,20 ^,um suot imellä ja kylmäkuivattiin välittömästi steriileissä seerumipulloissa in vivo eläinkokeissa käytettäviksi. Eri ajojen saannot ja analyysit on esitetty taulukossa IV.

20 68060 <α tn tn

•H

P

£ «J tn tn

— -H

ω λ; •H Π(Τιΐηυ-)·^,ιΗ<ΝΓ~·Η ·Η

Ό --------- CO

h mn-r-icoo^oo^o Ai

g ι—I «H ΓΜ CN CN m LO

h ro

Tl tT> Q) O'tO'ii—ICOHOCTirOCO ·

Ό Ό ooinvorTiiHoaoomcN o K

< xl «•incot— aiOrHmoo - Oi \ P ' o

H W OOOOOr—IrHrHiH H C

ai tn n λ: — o υ <ϋ p

dP Γ- 00 CO (N Γ- i—IO[— (N tn -H

i cNCN-^ooior-ooom tn .—i -H - O -r-f ft ^•^r^romrommcN -n tn ft i—I rH i—I r—I i—I r—( i—I r-H r-H CO 0) >1 > · E-i - (O · · tn C P ~ ~ 0) tn Q) Q)

> n w <u 4J -P

H .—. - -H Q) O O

Λ ΟΟΠΝ^ΛΟΙΙΝΟΗ 'Sf ·· -P P P

O (N OiTir-Ht— miOCNOOO c>P-P-P-P

Αϋ I - - - -..... 10 AC W nroncDroicrcrcin in ηι 3 o o

P ft -P -P -P

Ή (0 · C P P

p 0) :iO Q) (0 (0 (0 <0 0) :0 0) P > >

8h ο -P -P tn -Η -H

(0 ooLnrocN<TiOor-m -n :(0 P :3 0) 3) .H ooo^rmc^cor-rom (Ο :<0 o P Ai Ai I -'v------ (0t)(0:r0 :/0

K - l P > g S

ft (0 -H I—i I—I

P ft c P >1 >1 __.— .. 0 ^ i; x .-- 1—IVOUli-Hi—IC^'S’VOOi < G P :(0 ^

CrH --------- g Q) ro g <D * ocNiOrHOfMncNiH ω C > Ή ^ <1)0 cncnoooooooooooooo <! G -H >1 Ο Ό

P P - - ^ - O P X

4) Sup tn Ai a) a)

OiO'-'LncMr-.comooLno EC :<0 :(0 P P

p (0 ^crioocNi-immiHcn. 0 ftg-P-H-H

E->0)tn'-'--^--- - 1—I 0) -H *H

^mr-vovocoiovDin in G >1 >1 > > o a: -p (0 (0

G tn οι I—I iH

I -H A! P Ό (0 (0 >1 -H 0 >1 :(0

0) -P 3S P '-(0 H H

a: -p -h q) tn h h

0) · I—I Ό I H H

(0 -p ·Η :<C EC

-V PC PC >1 10 :(0 ft P P

•H :(0 C C -H -H -H -H JP :r0 O 0) 0) O O

(00) -H -H g g g g A! “ > >1 Ai Ai

0 0) g g x! m .G 00 G P G G

-P-Η ooom - I—I COPi—ΙΉ -P G (N^r-HCNro^Ti—Ir-Hro fO aj CD CL) 33 33 •H 0) (0 0) 0) ·· -P (0 (0 did) 0) 0) ·Η Ο Ή -P -p

►*< rH 0) -H ·. ,-H M

O O d(> :(0 η ·π I EC :<0 0) 0) < (0 (N ft 2 « * o o ri ·· ιΗηίΓο^ιηιοη-οοσι ^ < G r-H (0 32 O 'O Q) 11 2i 68 0 60

Esimerkki 4

Osittais-imidi-johdannaisten valmistus tolueenissa EMA-polymeerin puoliamidi-puoliammoniumkarboksyylisuolan osit-tais-imidit valmistettiin pääasiassa samoin kuin esimerkissä 3 ; imi-dimuodostuksen nopeutta vaihdeltiin kuitenkin keittämällä reaktio-seosta palautusjäähdyttäen tolueenissa (110°C) ksyleenin sijasta.

Käytettiin esimerkissä 1-F valmistettua EMA-tuctetta, josta oli valmistettu esimerkin 2a mukaisesti puoliamidi-puoliammonium-suola ilman vesilisäystä. Tämän tuotteen iR-spektrissä oli vahvat primaarista amidia, ionoitunutta karboksyyliä ja ammoniumkarboksy-laattia osoittavat nauhat; anhydridiä tai imidiä osoittavia nauhoja ei sen sijaan ollut. 28 g tätä amidi-ammoniumsuolaa lietettiin yhteen litraan tolueenia ja seosta keitettiin palautusjäähdyttäen.

Siitä otettiin näytteet kahden tunnin, 3,5 tunnin ja viiden tunnin (ajon päättyminen) keittämisen jälkeen. Tuotteet eristettiin suodattamalla, Imettämällä tolueeniin (3 x 150 ml) ja petrolieetteriin (3 x) ja kuivaamalla huoneen lämpötilassa 25 mm Hg tyhjössä 17 tuntia. Kuivat tuotteet liuotettiin 100 ml:aan vettä, liuoksen pH säädettiin 9,0:ksi NH^OH:lla, liuos suodatettiin 0,20 ^um suotimella ja kylmäkuivattiin välittömästi steriileissä seerumipulloissa in vivo eläinkokeissa käytettäviksi. Saatiin seuraavat tulokset:

Keittoaika (h) Saatu tuote- Typpi-% I/Aa) Imidi-%k) tolueenissa määrä (g) 2 6,15 13,78 0,531 6,5 3,5 7,73 13,41 0,600 9,5 5 9,24 13,82 0,647 11,0 a) Ks. taulukon III alaviite c (kylmäkuivattu tuote).

b) Ks. taulukon III alaviite d (kylmäkuivattu tuote).

Esimerkki 5 EMÄ:n täys-imidin valmistus, EMÄ:n ominaisviskositeetti = 0,061 EMÄ:n täys-imidi valmistettiin keittämällä palautusjäähdyttäen esimerkin 2a tuotetta (20 g) 250 ml:ssa ksyleeniä 18,5 tuntia johtaen reaktioseokseen koko ajan ammoniakkia ja poistaen reaktio-vettä Dean-Star-loukun avulla. Loukkuun kertyi kaikkiaan 2,7 ml vettä. Tuote suodatettiin, lietettiin kolme kertaa heksaaniin ja 68060 kuivattiin yön yli huoneen lämpötilassa 25 mm Hg tyhjössä. Kuivan tuotteen paino oli 13,5 g (84,3 %:n saanto). 3 g tuotetta sekoitettiin 150 ml:ssa vettä yön yli, tuote suodatettiin, suodatin pestiin vedellä ja tuote kylmäkuivattiin. Sen typpipitoisuus oli 9,53 % ja IR-spektrissä oli absorptiot ainoastaan aaltoluvuilla 1190, 1360, 1715 ja 1770 cm jotka ovat tyypillisiä imidifunktiolle. IR-spektrissä ei näkynyt amidia, anhydridiä, ionoitunutta karboksyyliä tai ammoniumkarboksylaattia osoittavia absorptiomaksimeja.

Edellä saatua täys-imidituotetta käytettiin erilaisina seoksina imidiä sisältämättömien puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaat-tisuolan (esimerkistä 2a) kanssa esimerkin 1 lopussa kuvatun imidi/ amidi-suhdetta osoittavan IR-standardikäyrän saamiseksi seuraavasti:

Ilmoitetut ainemäärät, jotka punnittiin analyysivaa'alla, sekoitettiin ruostumattomasta teräksestä tehdyssä sekoittimessa käyttäen Wigglebug-mikseriä. Seoksista puristettiin kuivan KBr:n kanssa kiekkoja (2 mg polymeeriseosta/250 mg KBr), joita käytettiin IR-määrityksiin. Kukin kiekko sisälsi 70 mg polymeeri/KBr-seosta. Standardikäyrä piirrettiin seuraavien seosten perusteella:

Esimerkin 5 Esimerkin 2a Imidi/amidi- täys-imidiä, mg 0 %-imidiä, mg absorbanssisuhde 3 97 0,427 6 94 0,509 10 90 0,621 20 80 0,843 30 70 1,616 40 60 1,519 50 50 1,871 60 40 2,099 70 30 2,564 80 20 3,008

Esimerkki 5-A

EMA:n täys-imidin valmistus, EMA:n ominaisviskositeetti = 0,66 EMÄ:n täys-imidi, jolla oli korkeampi molekyylipaino kuin esimerkissä 5 valmistetulla tuotteella, valmistettiin käyttäen EMÄ:a, jonka ominaisviskositeetti oli 0,66 (1 %, DMF, 25°C), mikä vastaa molekyylipainoa 20 000 - 30 000. Ammonoitu EMÄ valmistettiin tässä tapauksessa samoin kuin esimerkissä 6a johtamalla kuivaa ammoniakki- il 23 6 8 0 6 0 kaasua sekoitetun EMA-jauheen lävitse alle 70°C:n lämpötilassa. Saatua EMÄ:n puoliamidi-puoliammoniumkarboksyylisuolajauhetta (ominais-viskositeetti = 0,66) kuumennettiin edelleen puoliamidin muuttamiseksi imidiksi poistamalla vettä.

525 g EMÄ:n puoliamidi-puoliammoniumkarboksyylisuolaa sekoitettiin voimakkaasti samalla jatkuvasti johtaen ammoniakkikaasua 11 litran kattilassa, joka oli varustettu vedenerottajalla. Lämpötila kohotettiin 122°C:seen, jolloin vettä alkoi kertyä vedenerottimeen. Tunnin kuluttua lämpötila oli 152°C ja vettä oli poistunut 24 ml. Kuumennusta ja ammoniakin johtamista jatkettiin vielä viisi tuntia (kaikkiaan kuusi tuntia), jolloin vettä erottui 54 ml. Jäähtynyt tuote oli valkeaa jauhetta. Sen N-% oli 11,11 (teoreettinen N-% 11,20) .

Tämän korkeampimolekyylipainoisen EMA:n 100-%risen imidin kykyä estää kasvannaisten kasvua kokeiltiin riippumattomassa koelaboratoriossa vuonna 1958. Sillä ei ollut lainkaan kasvaintenvastais-ta aktiviteettia (ks. esimerkki 22).

Esimerkki 6 EMÄ:n puoliamidi-puoliammonium-COO -suolan valmistus tunnetuin menetelmin veden kanssa ja ilman vettä (a) 500 ml:n 4-kaulakolvi oli varustettu teflon-sekoittajalla, lämpömittarilla, kaasunsisäänjohtoputkella ja kaasun poistoput-kella. Ammoniakkia johdettiin virtausmittarin lävitse virtausnopeuden seuraamiseksi kvalitatiivisesti. Kolviin pantiin 25 g esimerkin 1 D EMA-jauhetta. Sitä sekoitettiin 500 r/min ja siihen johdettiin ammoniakkia sellaisella nopeudella, että lämpötila kohosi huoneen lämpötilasta 70°C:seen ilman kuumennusta kuumennusvaipan avulla.

Jauhe saavutti 70°C:n lämpötilan yhdeksässä minuutissa ja kaasun virtausnopeutta alennettiin, niin että tämä lämpötila pysyi. Lämpötila pidettiin 70°C:ssa 1,5 tuntia, minkä jälkeen ammoniakkivirta pysäytettiin ja reaktioseos jäähdytettiin typpikehässä. Kuivan am-monoidun EMÄ:n puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaatin saanto oli 30,8 g (98,8 %). Sen N-% oli 14,01, 14,18 ja 2-%:isen vesiliuoksen pH oli 6,07. IR-absorptiomaksimit osoittivat seuraavaa:

Reagoimaton anhydridi 1750 ja 1850 (arvio: alle 5 %) primaarinen amidi 1670 ja 1620 (vahva) karboksylaatti-ioni 1565 (vahva) NH^+-karboksylaatti 1405 (vahva) imidit ei ollut 24 6 8 0 6 0 (b) Esimerkin ID EMÄ:n toinen ammonointi suoritettiin samoin kuin kohdassa (a) paitsi, että EMA:a käsiteltiin ensin vedellä sen ja ammoniakin välisen reaktion edistämiseksi ja tuotteen sisältämän anhydridiosuuden vähentämiseksi. 25 g EMÄ:a sekoitettiin kierrosno-peudella 500 r/min 40°C:ssa (kuumennusvaippa) kuusi tuntia veden (0,53 g, 17 mol-%) läsnäollessa, jota lisättiin tipoittain 1,0 ml:n ruiskuneulalla ensimmäisten 20 minuutin aikana. Kuuden tunnin kuluttua jauhe jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja ammonointi suoritettiin samoin kuin edellä kohdassa (a), jolloin lämpötila sai nousta 70°C:seen 10 minuutissa. Ammonointiaika 70°C:ssa oli kaikkiaan yksi tunti, ja tuote jäähdytettiin typpikehässä. Saatiin 31,4 g tuotetta (saanto 100,8 %), jonka N-% oli 14,02, 13,94 ja 2-%:isen vesiliuoksen pH 6,45. IR-absorptiomaksimit osoittivat seuraavaa: reagoimaton anhydridi: sitä oli huomattavasti vähemmän kuin kohdassa (a) primaarinen amidi: vahva samoin kuin kohdassa (a) karboksyyli-ioni NH^-karboksylaatti vahvehmpi kuin NH^+-karboksylaatti kohdassa (a) imidit: ei ollut

Esimerkki 7

Aikaisemmin valmistettujen tuotteiden karakterisointi olennaisesti samoin kuin esimerkissä 6

Heinäkuusta 1956 helmikuuhun 1960 valmistettiin useita erilaisen viskositeetin omaavia (erilainen molekyylipaino) EMÄ:n puo-liamidi-puoliammoniumkarboksylaattisuolajohdannaisia. Niiden ominais-viskositeetit olivat (1,0 paino-%, DMF, 25°C) 1,19, 0,60, 0,11 ja 0,060. Vastaavat arvioidut molekyylipainot (Mn) olivat 50 000 -60 000, 20 000 - 30 000, 2 000 - 3 000 ja 1 000. Kolme ensimmäistä, so. EMÄ 0,11, 0,60 ja 1,19, ammonoitiin puolisuuressa laitteistossa, jossa tuotetta saatiin 270-360 kg. Alempiviskoosinen (0,060) EMÄ ammonoitiin pienemmässä laboratoriolaitteistossa käyttäen 200-300 g EMA:a. Käytetyt menetelmät ja niissä silloin saadut tulokset esitetään seuraavassa.

Puolisuuressa mittakaavassa suoritettu valmistus (EMÄ:n omi-naisviskositeetit 1,19, 0,60 ja 0,11): Ammonointiastiana oli vaipalla varustettu ruostumattomasta teräksestä valmistettu Stokes-kier-tokuivaaja, malli 59AB, joka oli varustettu sopivin laittein kuivan 25 6 8 0 6 0 höyryn ja vedettömän ammoniakin johtamista varten sisällön pinnan yläpuolelle, sekoittimella, jonka kiertonopeus oli 5,7 r/min ja kierrettävällä venttiilillä pohjan sulkemiseksi ja lopputuotteen 3 ulospäästämiseksi. Yksikön "täysi" tilavuus oli 1,1 m ja "työs- 3 2 kentely" tilavuus 0,76 m ja vaipalla varustettu pinta oli 5,8 m .

Tyypillisessä ajossa ammonointilaitteen pohja suljettiin ja siihen pantiin samalla sekoittaen 227-272 kg sopivan viskositeetin omaavaa EMÄ:a. EMÄ hydrolysoitiin johtamalla pinnan yläpuolelle 0,15 -0,20 mol vettä kuivana höyrynä 0,007 kg höyryä EMA-kg:aa kohti kolmen tunnin ajan. Lämpötila pidettiin tällöin 55-70°C:ssa johtamalla vettä jäähdytysvaippaan. Reaktoriin (osittain hydrolysoidun EMÄ:n pinnan yläpuolelle) johdettiin sitten vedetöntä ammoniakkikaasua sellaisella nopeudella, että lämpötila pysyi 60-70°C:ssa (noin 2,3 - 3,6 kg tunnissa), kunnes ammoniakkia oli lisätty 2,0 molia yhtä EMA-molia kohti. Ammoniakkilisäyksen päätyttyä tuote jäähdytettiin alle 50°C:n ja siirrettiin varastoastioihin.

Laboratoriovalmistus (EMÄ:n ominaisviskositeetti 0,06): Lähtöaine EMÄ valmistettiin muuten samalla tavalla kuin esimerkissä 1, paitsi että reaktoriin panostettiin 267 g maleiinihappoanhydridiä, 2 089 ml etyylibentseeniä, 45,8 ml n-butyraldehydiä ja 13,20 g bentsoyyliperoksidia, jotka kaikki lisättiin heti alussa. Etyleenin paine oli 1,38 MPa ja reaktioseoksen lämpötila 70°C 24 tunnin ajan. Lopputuotetta, EMA:a saatiin 279 g (73,3 %:n saanto). Sen ominais-viskositeetti oli 0,060 (1 % DMF 25°C). Viiden litran nelikaulakol-viin pantiin 249 g kiinteää EMA-jauhetta (ominaisviskositeetti 0,060). Siihen lisättiin tipoittain 5,3 g vettä (15 mol-% EMA:n suhteen) sen osittaiseksi hydrolysoimiseksi, sitten sitä sekoitettiin voimakkaasti kuusi tuntia. Ammonointi suoritettiin johtamalla kuivaa ammoniakkikaasua voimakkaasti sekoitettuun EMÄ-jauheeseen 31-32°C:ssa 18 tunnin ajan. Voitiin havaita ammoniakin hidasta tasaista sitoutumista. Lopputuotetta saatiin 320 g (103,3 %:n saanto).

Kaikkien edellä valmistettujen tuotteiden ominaisuudet on esitetty taulukossa V.

68060 Π3

•P

M

Φ tn

•H

O

Ä

X :tO :iO :(0 :td :(0 :rö O

X G G G G G G AS

o o o tn tn tn tn tn tn

vo vo ro vo :(0 :rö :(0 :(0 :<Ö :(Ö G

O O Γ"" O CO »H i—( )—I i—1 i—I rH d) < - ro vo - m Qj

O W O Λ O \ -H -H -H G G G -P

Ή i—I Γ~ O) d) 0) O O O tn Ή cu ro :r0 :t0 :(0 :(Ö :(0 :r0 £ X G G G G G G 3 x ov tn tn tn tn tn tn x; i—I O O in ao :r0 :rö :(0 :(0 :rö d) i—I O ro m CO \ !—I »—t r—I rH rH rH Ή B ‘ tn o in v co Ai O ro (Ti ''T \ -H -H -H G G g

rs rHrH 10(1)0)0000 G

•H

G

0

^ -P

> X :r0 :tö :(0 :tO :rö :rd O

0 (Ti G G G G G G tn

0 o m tn tn tn tn tn tn (O

X o o vo \ :nj :r0 :rd :rö :nj :r0

Ai VO O' 00 CS rH iH rH iH rH rH -H

GU^orom-rrs +j rH o ro ro cr vo \-h-h-hgGG en

G I rH rH mooOOOO O

(0 O 0) E-ι rs ·η :rö Sh

-P 4J

tn o X «0 £

o ro MO

O O H" r-' 00 >, -H

rHorsm^ i i i i i i i :n) h

Q *· l en m A! H

rH O CO iH rH 13 G X) 1 s; o o m l o vo -H <Ti

· r> 1) H

-h rs -P

rH Ό r-. O Cl) (0 •ho a: u -h o ω -PO O — 4J +j tn o) a; o -p -h 3 d) i u -h (ö tn 3 -M Q ^ G to o a: H ·· K ·· -H O >H Ai 3

en 0) U -H O Ό -h >i tn rH

0 3 ·· tn CU -h i tn -h 3 a; h »h >i a g h a: u > o tn (0 a> tn >i·· 3 ra-poo -m •Η0-Ρ0 >H £ JG -P Λ in 3 > G 0 3 (0> -H G tO M cs-P^r, tn -H 3 > GCU rH d)cö(d -Η-p •Hto-Ptn ro i -h >1 g-ha: -o-p «S a 3 I tn Ό >1 Ή >i £ (jj ·Η d) G -H 3-PdP (03 -H tn M tn 3 g > +)

•H rH -P tn I G -P M Ai (OAi-H QM-H

·· 6 >1 -H -H -H 3 -H Ό O -H (0 O G (OM

W0>i0£Dua4M>iXlT3£X10 <#> :r0

3 a: GrHQj (ΟΟΧ3Μ·Η·ΗΜ£ GW

G-d) O n3 >i M3C(0£M(0£ rH S S

c<rH £>eh vwcoi<x;hcux;^ 3 S O S G r-, χ

EhWS<! H rHXX

27 68060

Vuosina 1957-1960 valmistettujen ja krakterisoitujen EMÄ:n puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaattisuolojen näytteitä (ks. taulukko V) säilytettiin tavallisilla kierrekorkeilla suljetuissa lasi-astioissa (ei typpikehässä eikä tiiviisti suljetuissa astioissa) aina vuoden 1977 alkuun asti yleisessä varastossa. Tällöin (1977) ne otettiin esille uudelleen arvioitaviksi (ks. esimerkit 9 ja 10). Ennen sitä ne karakterisoitiin uudelleen; tulokset nähdään taulukossa VI.

On ilmeistä, että vuosina 1959-1960 kokeillut polymeerit (esimerkki 8), jotka silloin eivät sisältäneet imidiä, olivat pitkän varastointiajän kuluessa menettäneet sekä ammoniakkia että vettä ja muuttuneet imidipitoisiksi polymeerituotteiksi. Näillä muuttuneilla tuotteilla suoritettiin äskettäin uudet kokeet (esimerkit 9 ja 10), joiden tulokset olivat odottamattomasta erilaiset kuin aikaisemmat koetulokset.

28 68060 :(0 tfO :(0 :(0 :(0

G G G C C G

ui in in in to in

fM :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 O

VJD C- rp I—I I—I I—( rH (—I lo r~~ r— * σ> -

co cm σ -p -p G G G G - i—I

CO <—I rH QJOOOOOOCM

:(0 :(0 :(0 :(0 :(0 :(0

G G G G G G

CO W V) m W M

ro :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 o L(0 Γ— rH r-H rH rH rH rH CO U") CO - Γ- rH - CO CM CTi-H-HCGCG - σ

COffJrH rH (DCDOOOOrHCM

:(0 :(0 :<0 :(0 :(0 :(0

G C C G C G

CO to CO CO (0 CO

mo :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 cm 00 1—ii—I rH I—I rH f—I CMC'· •'Τ' r-~ <Ti - m cm σι -ri-ri CCGG - o

CO O rH rH QJOJOOOOOCM

H

t> :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 :(0

G C G G G G

O cn cn co cn cn co X cm :<0 :(0 :(0 :(0 :<0 :(0 o X O r'rHrHrHrHrHrHCTliri G CM - Γ" CO- rH I rt σ> -p -p G G G G -σι

G CO Q rH Γ-H QJDOOOO OH

(0 Eh Φ

G

Λ

—' G

·· I cn

(0 CM I

P r~. O -rl cn ® u -H cn G Ο ^ -P cn

G O -PC

G U Ή (0 (0 G "" G (0 Λ

-P ·· -P O G P

•Η Ο G ·Ρ >-i O

> cn α -π I cn cn >i a- g -π * .q QJ G >1·· (0 (0 -P O (0

-p O rH g £ -P X3 I

O X (0> -H G (0 p -P

G ·· G CD. rH (D <0 (0 G

•P -H rH (0 I -H >1 G rH x -H

G G I cn G >i -P >i g g (#>

G O (0 (0G-Hcn p cn g G

-PO-P G-PP^ (0 Λ! -H \ -

•P X oo G -H G O -H (0 o G -Η -H

OcniOl a P >, Λ G £ Λ O GG G G G -P (0 O X P -P -P P g -P -P

OC-PCXP G G (0 g p <0 g g g gCcnDj(p co hh

g G (0 >1 C

(¾ Eh > Eh H

il 29 68060

Esimerkit 8-21, tuotteiden arviointi

Esimerkki 8

Esimerkeissä 7-V-A, B ja C määriteltyjen kolmen eri molekyylipa inoi sen EMA-puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaattijohdannaisen (joissa ei ollut imidifunktiota) kyky ehkäistä kasvannaisia kokeiltiin riippumattomassa koelaboratoriossa vuosina 1959-1960 käyttäen laitoksen the Cancer Chemotherapy National Service (CCNSC) virallisia Sarcoma-180:n siirteisiin perustuvia menetelmiä, jotka siirteet saatiin laitoksesta the National Institutes of Health. Menetelmässä pidettiin myrkyllisyysrajana kahden eläimen kuolemaa kuudesta. Kokeessa laskettiin T/C-suhteet, so. käsiteltyjen eläinten kasvannaisten keskimääräisen painon ja kontrollieläinten kasvannaisten keskimääräisen painon suhde. T/C-arvot laskettiin kolmesta kokeesta, jos esikokeet olivat sallituissa rajoissa. Materiaali oli hyväksyttävää, jos (T/C)^ x (T/C)2 x (T/C) 3 oli loppukokeessa alle 0,08. Kokeita jatkettiin, jos (T/C)^ oli alle 0,54 ja jos (T/C)^ x (T/C)^ oli alle 0,20. Koe-eläiminä oli määriteltyjä sveitsiläisiä hiiriä (CCNSC, määritelmä XIV), lääkeanto tapahtui intraperitoneaalista (ip) (määritelmä III) ja annos määriteltiin määritelmällä XII.

Saadut tulokset nähdään taulukossa VII.

30 68060

G

G <U

:m G

G G :<Ö -H G

(C (Ö 4J r-ι 4->

(0 (0 X tfl -H

«a· +-> -μ ui tri <U

ro o ai m tu >x> .¾ g ή on co x rl m ,y o :tö o -h <43 Q Γ- rH 4-> VO L41 O 4-1 VO l/l O J> -rl o

υ-0ίΟ\·>(0Ο\·'-(0θ\«··«>1 4-1 G

OUXJrHO-nUOCMOO-nvOrHOO.G X X

G

G

<44 G

G -H

:<Ö G -H

G G :cö (1) 4-i G G 4-1 -H 4-> G (0 >1 G :<tj

(O 4-> 4-> W CU H

ro r~a> rn ro φ OO X (U >i

r-iro n X 141141,¾ in o :n) £ ,G

H G 14lr^r04-> 141 rH O 4-1 141 UO rH O t> O

G) - a r^\-f0 r~- \ ^ * G Γ'-Χ'-'Ρι G Π3

ocjrooo-nroiHOO-rirorHOO^ O rH

6 rH

CU

u <u 4->

G G G W

X (tf (0 G -ro G

X G (0 :rd G

t"· 4-> 4-> :<0 p (U

o ro φ φ 4J Cu uoro m ,¾ σι n χ r~ o :tt)

X O Q OVOO>4-> O UO tN rH 4-1 O VO t" rH rH rtj G

X ·· X O \ ·. (0 O \ ·. > (Q O \ *· * >i -H

<C O CJ L41tNO-riL41CNOOT1LnrHOoi: G 4-1 tu tn H -H tu w M 4-1 > ai

(U G

o g e <u X X :nJ >, tn

X 'J1 :k) i—i -H

G O 4-1 OO

*—4 i—i oi ¢1( 4-i

G X X rH O 14} CO i—I

<OIIIO\*>1||||| I I I I I ' rH

E-llIDUlfMOJilllll tilli fO

r-t G

O <u

G <U

tn -x g o

G X

-rl 0> — G · ro I O Π3

(Ö i-H

•H ro S 4-1

-X ~ <9 G II

-X U <U

Sh -H \ G X M

Φ 4-i :rö »O :r0 H O r-

g -P Sh G M'-'CU-HU

•H <U :ro :ifl :rd rd tn \ tn a) :nJ :rd :aj X x: Ai E-< <U4J S ε g •HtO'-

-H (N (N EX

-m O O — Or-rd (Ö >0 .X X U X U rtJG-n A! O 0 \ O \ G -rl O » en X tn tr X eh tn tj> X e-i tn -h -h ui -Χ -H X \ :0 X \ ^ :0 X \ —:θ X 4J \

X> \ <Ö 4-> \ tri 4->\tö 4-1 X 4J-H

G tn Cn 4-i :aJ Cn 4-> χ :<d en 4J X .-td G <U

•H -H g Ή :r0 ε ‘H :<d ε Ή :td tn 4-) Il

G <Ö <U CU (UCNr-IOj OfOr-ΗΛ -H

Λ G H »I H ^ o tn H rv r, O tn H rv rv O -H Sh XJ

UHO O rH O 4-1 O rH U U 4-> OrHUUHJ rH OM

'-go G O \ Ä G O \ X G O \ \ X O G :G

OO G G E-ι O GGEhEhO GGHEhO tn :rd ·· X (0Χ'-'·η(0Χ'-''-'·η(βΧ'-''-··Γΐ o* £

<U G tU o ad -H

4-1 ·· 4-1 ·· ·· ·· | g 4J O

tn <C O rH 04 ro rH j3 U) X

•H s G I >1 tu O

Ό W Eh <U tU (U DShEoX

.g o o o xx x x xx

X

31 68060

Tuloksista nähdään, että tässä sarjassa myrkyllisyysarvojen parantuessa molekyylipainon alentuessa aktiviteetti katosi molekyylikoon lähestyessä inaktiivista monomeeriyksikkökokoa. Mainittuna ajankohtana (1959-1960) ei valmistettu eikä kokeiltu CCNSC-menetel-millä tai muilla menetelmillä samankaltaisia johdannaisia, jotka olisivat sisältäneet osittaisen imidifunktion. Kaikki kolme polymeeriä (A, B ja C) hylättiin CCNSC-kokeiden jälkeen soveltumattomina Carsinoma 755:tä ja Leukemia 1210:aa vastaan.

Esimerkki 9

Esimerkissä 7 taulukossa VI kuvattuja polymeerejä A, B ja C, jotka oli valmistettu kolmesta erilaisen ominaisviskositeetin omaavasta EMArsta ja joiden molekyylipainot siten olivat sangen erilaiset, annettiin BALB/c-hiirille kolmella eri annostusohjelmassa: (a) ennen kasvannaisen kasvannaissolujen istutusta (SV40-muunnetut kas-vannaissolut, joita nimitetään mKSA-TU5-soluiksi) (päivät -9 ja -1), (b) kasvannaissolujen istutuksen jälkeen (päivät 1 ja 9) ja (c) sekä ennen kasvannaissolujen istutusta että sen jälkeen (päivät -9 ja -1 ja 1 ja 9). Jokaista yhdistettä annettiin intraperitoneaalisti kolmena annoksena, 62,5, 125,0 ja 250,0 mg/kg. Kasvannaissoluja is- 4 tutettiin ihonalaisesti (se) yhteen eläinryhmään 1 x 10 solua ja 3 toiseen eläinryhmään 1 x 10 solua. Kasvannaisten kasvua käsitellyissä eläimissä verrattiin kasvannaisten kasvuun käsittelemättömissä kontrollieläimissä. Tulokset on koottu taulukoihin VIII-A, VIII-B ja VIII-D. Taulukosta VIII-A, jossa käytettiin esimerkin 7 taulukon VI-A polymeeriä ja annostusohjelmaa (a), havaitaan, että 48 % (17/36) tartutetuista hiiristä pysyi terveinä ja ilman kasvannaisia 58 vrk:n tarkkailuaikana. Päivänä 61 kasvannaisvapaisiin eläimiin 4 istutettiin jälleen eläviä kasvannaissoluja (mKSA-TUS, 1 x 10 , se), ja niistä pysyi 82 % (14/17) kasvannaisvapaina (so. immuuneina) 37 vrk istutuksen jälkeen.

Annettaessa esimerkin 7 taulukon VI-A polymeeriä annostusoh-jelmalla (b) pysyi 42 % (15/36) hiiristä kasvannaisvapaina 58 vrk:n 4 tarkkailuaikana. Uuden istutuksen jälkeen (päivä 61) 1 x 10 elävällä kasvannaissolulla 80 % (12/15) jäi kasvannaisvapaiksi 37 vrk istutuksen jälkeen.

Käytettäessä annostusohjelmaa (c), jossa eläimet saivat esimerkin 7 taulukon VI-A polymeeriä sekä ennen kasvannaissolujen istu- tusta että sen jälkeen, 28 % eläimistä (10/36) oli resistenttejä päivänä 58 ja kaikki kasvannaisvapaat eläimet olivat immuuneja tois ta kasvannaisistutusta vastaan.

32 6 8 0 6 0 33 68060 tn I •H -H (ti «ti C Λ oo G mo o n lo n ncNCNO un «a· cm on o i o .h rsi (ti (ti > <ti «ti Dl Q.C (ti (ti :(0 « > > G -h 0) :iti G 04

•H

fÖ-p KD VD VO VO KO ΚΩ ^ ^D<s£)^D

C O oo \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ C ClO VO V£> (N rH <N H· on »a1 ^ VO H (N ^ (ti VO (O LO ΙΠ a (ti (0 > > :(Ö Dl D) ti (ti (ti :(ti « M > < (ti

|— r-H CJo ιΗ OO i—I rH i—li—I

I H I + I + I + I + <u H τι (ti (ti (ti fti (ti (ti (ti (0 H Λ τη -n -n -n -ro τη τη τη

H O

^ ^4 til i—I OI r—I CTl CTi 00 OO

H I 1= = += =1+==1 1= = += =1+= = O <1)

Ai +> +>+)+> +>+>+>

Ai -O :(ti :(Ö :(ti «ti «ti «ti O -H >>> >>> r—I CO -H ·Η ·Η Ή ·Η ·Η 3 «ti «ti '.(ti «ti «ti «ti «ti (ti « Ο4Ο4Ο4 Ο4Ο4Ο4

Eh tn Cn O Ai un in un unun un G \ 1 o un v o un o un * o un ^ o un * oun-

Ctji ui m oi m n m n oi 01 1 n 01 01 ui 01 oi n 01 (m

g OI rl 10 OI rl VO (N iH VO CN rH V£> CN rH OO OJrHVO

< <

I I

H M

> > e e o o λ; as 3 3 rH r—l 3 3 (ti (ti (1) 4J +)

-P *H Ή -H -H

tn rH * P rH » p •H 1—t I— QJ rH r» φ Ό O 01 O 1) Λ P · £= = = = = = = =P ·£= = = = = = = = >i -p e >1 +> e >1

m C -H H G -H rH

0 o tn o o tn o

« « W CU « W CU

G

<u

G

H

un iti •'i* on 3) e + +

EhG OU= = = = = = assocj = = = = = = = = = 1 iti ritn h en < >

tn tn χ X

« (ti

Sr* rH = = = = = = = = = rH = = = = = = = = = 68060

M I

•Η ·Η id :id G ftH G m id id I—I O COi—I I—I IN I—I I—I I—I o > (d :td cn a c Π3 ro :<T3 « > > C -H <D :id c a

-H VO VOVOVOVOOVOVO VOVO

cd -P \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ G 3H m 10 m in m tp in m m 10 G G in (0 id > > :id m in c id <d :id « ,x > id £ rH σ rH σ Ή I + I +

CD

·π <d id id id ra ,C I -n -r-ι -n -n I 0 1 >ι σι pH σ h μ, Ή 1= = +== 1+= =

M

7\ -P +J -P -P

tT -P :id ad :<d > Ή > > >

^ cn -H -H -H

g :rd :id :id :id 2 « a a a 3

I—I

2 μ σ 2 O M in m in ^ G \ I o m * o m * o m*>

Gtn in in in m cn in m in in

<C£ INi-HlOCNi-HlOlN iHVO

m

H

>

G

O

,X

3

rH

3 id 3

<D -P -P

-P -H *H I—l

Ifi rH *· V-l *H

•H H r~ φ CD

Ό O a> M

£1 Ρ ·£= = = = = = 5=0 >1 -p g >1 *

0) G -H rH

0 O W O -H

« t< w a w

G

CD

G

•H

in id id D G a TP ro

EnGidou = = = = = = = 5 = 0

1 Id-p HW rH

< > 0

en in +J x X

x id c

£ ,X <D rH 555555= 5 5 rH

35 6 8 0 6 0

to I

rl ·Η

(Ο :(0 β DjtO

β ro (0(0 Ο Οι—ι ο ο ο r—ι ο ο ο > (0 :(0 w a c (0 (0 :(0 « > > β ·Η 0) :(0 β Dj •Η (0-Ρ O (O (O VO (Ο (O (C ΐΰ (Ο (Ο β \ \ \ \ \ \ \ \\\ β C rn να o in o ie (c m vdvdvd (0 (0 > > :(0 ω tO β (0 β :(0 « Μ > (0 c ιΗ σι γη σ> •H I + I + Φ Ω ·η (0 (0 (0 (0 Λ ·ι—ι -ο ·γ-ι -ο I Ο <Τ - = ι—1= = (Τι ι—I = = Η ι—I II + I + Η φ

Η -Ρ +J -Ρ 4J

> 4J :(0 :(0 »0 Η > > > O to ·Η Ή -Η Μ :(0 :(0 :(0 a0 M Ui Qj Dj Dj β

r—I

β (0 to tTi Επ Ο Λ!

β \ I

C tj> m o m m o m mom <C g r-mcNt^mcN r^moj

P

ι

H

> β 0 β

»H

β (0 O) 4-) 4-) -rl -rl to ι—I » P| •H r—t t~~ CL) 'd o ω λ μ·Ι= = = = = = = = >1 4J 6 >ι

φ β -H I—I

O O to 0

Ui * W Dj β φ β

•H

md rr O β +

Eh β ου 1(0 rH (Λ = = = -:= sss < > ui m u « (0 GM rH = = = = = = = = = 36 6 8 0 6 0 in I Ή Ή (O :G g aio G ro (0(0 O O CN I O O CM O I-H'S' > G :G W & G G G :G « > >

G -H

<D :(0 G a -H

G 4-> (X) φ (β (D U) X) VO VO VO

G G io \ \ \ \ \ \ \ \ \ \

G G (O ID VO rf rn VO VO VO in (N

G G

> > :G

g tn g G G :G « Ai >

G

£ i—I Hr—I

rG I + I + — d)

G ·η G G G G

0 -G -m ·η ·η ·η

Ai O

+J >i i <τ σι <r >h GH | = =+ =ϊ|+= = •H (1) — +> 4-> 4-> 4->

+) :G :G :G

Cl H > > >

G H ·Η H

1 :G :G (G :G

X O, CU CU

H

H

H

> G tT

O Ai

O G \ I

Ai Gö-1 m o m m o in in o m

Ai < E; t"- in <n r- m <n tn <m

G H

G Q

G I

En H

>

G

O

Ai

G

H

G

G

d) +>

4-1 -H H

G H ' i-l H HI— d) Ό 0 d) AO M ·£= = = = := = = >i +JS^ G G *H h

O O G O

« X W ϋ

G

04

G

•H

in G ro DG +

E-ι G o U

IG Η (Λ = = = = = = = = = < > CO G x

X G

S Ai H = = = = = = = = =

II

37 68060

Polymeeriä esimerkin 7 taulukosta VI-B kokeiltiin vain hii- 4 rillä, joihin oli istutettu 1 x 10 elävää mKSA-TU5 solua (se) (ks. taulukko VIII-B). Annostusohjelmalla (a) 22 % (4/18) eläimistä pysyi kasvannaisvapaina 51 vrk tarkkailuaikana. Annostusohjelmalla (b) samoin 22 % (4/18) kasvannaissoluja saaneista hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 51 vrk. Ryhmässä (c) kasvannaisvapaina pysyi vain 2/18 (11 %) hiiristä 51 vrk. Päivänä 54 kaikki edellä olevat kas- 4 vannaisvapaat hiiret (19/54) saivat uuden annoksen 1 x 10 eläviä mKSA-TU5 soluja (se), jolloin 10 niistä oli 37 vrk:n kuluttua kas-vannaisvapaata (so. immuunia).

Esimerkin 7 taulukon VI-D polymeeriä kokeiltiin kahdella an-nostasolla kasvannaisia vastaan samoin kuin edellä olevaa polymeeriä 7-VO-A (ks. taulukko VIII D). Koska sen molekyylipaino oli paljon korkeampi kuin esimerkkien 7A tai 7B polymeerien, niin sitä annettiin annoksina (ip) 75, 50 ja 25 mg/kg. Käsittelyllä (a) 11 % (4/36) kasvannaistartutetuista hiiristä pysyi 36 vrk tarkkailun aikana kasvannaisvapaina. Näistä pysyi 75 % (3/4) kasvannaisvapaina 37 vrk toisen kasvannaistartutuksen jälkeen. Käsittelyssä (b) 8 % (3/36) hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 36 vrk ensimmäisen kasvan-naisistutuksen jälkeen ja vain yksi näistä oli immuuni toisen istutuksen jälkeen. Käsittelyssä (c), jossa polymeeriä 7-VI-D annettiin sekä ennen kasvannaisistutusta että sen jälkeen, 14 % (5/36) pysyi kasvannaisvapaina 36 vrk tarkkailun aikana ja näistä viidestä neljä (80 %) oli immuuneja toisessa istutuksessa.

Taulukoissa VIII A, B ja D olevien vastaavien tarkkailua!-kojen jälkeen kasvannaisvapaiden eläinten kokonaislukumäärä koostui kahdesta ryhmästä, (a) niistä, jotka olivat kasvannaisvapaita koko tarkkailun ajan ja (b) niistä joissa kehittyi tarkkailuaikana mitattavissa olevia kasvannaisia, mutta joissa kasvannaiset sitten vähitellen katosivat ennen tarkkailuajän päättymistä.

Kasvannaisten pieneneminen ja häviäminen osoittaa verrattuna koko ajan kasvannaisvapaina pysyviin koe-eläimiin sekä kasvannais-rasituksen vaikutusta että käytetyn polymeerin vaikutusta. Taantuvien kasvannaisten häviäminen sekä kasvannaisvapaiden eläinten lukumäärä on esitetty yhteenvetona taulukossa VIII-E.

38 68060

»O

<#> tn i tn

tn <D

d C

e , c d ΙΟΟιΗΕηΟ ΟΟΟΓ" c

4-1 LO O 00 2 Oi O rH <D

G *H rH S

tO

to c E-i d „ a :t0 a tn o C i—i

0) oo -^rl oj E-t oi o o (N| (N

tl) H N| TT 2 h| d H |rH C

-P tO

jG -n >t to d

to rH

I tO Ή

tO -H 6 tO

•h to 3 x > c +j ϋ w d g cp 4-) f0-~. O ^fl rJ1 tt ml a\ O (N| N to (0 I C >04 >H (N| ro a I to 4-> (0 tn 10 4-> h to to -h tn c

H EH tn -H -H

H tO -H

> G E

— CO

O rH to 4-*

λ; c to > 4J

x to to tn to

d ·η I CU ~ (OS

rH (0 C (0 ro X 3

d 10 > CO Oi DO Ft H] rl O Oi O rH

<00>tn a | rH I rH -ho

En x tn -h <u

0 to to 4J

a λ; c i to >

C -H

1 to d tn -n 4-> •h tn to c

(0 O KO :rd :t0 tO

CC ro o· tn ro ·*τ tno ^ tn c<0 CC oocoocooc d 4->

tO to '—I I—lOrHrHtDrHrHQ) rH

> d Φ Q) O -H to

tn rH XXJ4-1XX+JXX4J to X

<0 o rC Λ Λ λ; 4J

a tn rHH>trHH>lHrH>H ^ O

P -n to

< CQ O -P

III -H

H H H O >1 > > > X 4->

•h O -P

P "O -O » o X -H

tl) r- a O' a r- a jC

Φ a X X to φ E · d · d · d to x S S ^ S S rH Cu rH -He -He -h e to to 0 into tnto into > -h e cu w-p W4-i W4J tntn4->

Ή -H rH

O (0 tO -H

1 ·· G G Φ d c c c x <0 tO tO o

P (0 > > X

4-> < m Q tn tn P tn i i I (0 to -h ooh h h a a w

> a H H H

PdH H H

< H > > > rHCNCO

tl 39 68060

Esimerkki 10

Esimerkin 7-VI-A polymeeriä kokeiltiin uudelleen samoin kuin edellä esimerkissä 10, paitsi käyttämällä 10 hiirtä koeryhmässä ja vain koekäsittelyjä (a) ja (b). Tulokset nähdään taulukossa IX.

Annostusohjelmalla (a), jossa polymeeriä annettiin päivinä 9 ja 1 ennen kasvannaisistutusta, 37 % (22/60) kasvannaistartutetuis-ta hiiristä jäi 61 vrk tarkkailuaikana kasvannaisvapaiksi. 62 päi- 4 vänä 21:lie kasvannaisvapaalle eläimelle annettiin jälleen 1 x 10 mKSA-TU5 kasvannaissolua (se) ja näistä eläimistä oli 30 vrk jälkeen kasvannaisvapaita (immuuneja) 90 % (19/21).

Toisessa annostusohjelmassa (b), jossa polymeeriä annettiin päivinä 1 ja 9 kasvannaissolujen istutuksen jälkeen, 47 % (28/60) hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 61 vrk tarkkailuaikana. 28 kasvannaisvapaalle hiirelle annettiin sitten toinen kasvannaissoluannos, jolloin niistä 30 vrk tarkkailuaikana pysyi immuuneina 64 % (18/28).

40 68060 « I -H ·Η (0 :π3

£ dl id G ID

(0(0 o cn o m «a* m ιπ n a οο m ιη οι > (0 :(0 « α G (0 (0 :(0 X > > G -d <ϋ :(0 G di •Η Ο οοοοοοο οοοοοο (0 +) ι—I γ—I ι—I rd ι—I γ—( id ι—1 γ-Η id id rd id d £ 3 Ή \ \\\\\ \ \ \ \ \ \ \ \ G £ ιο ο oo o id id r-~ ld r^^foNr^Lnid (0 3 id rd > > «WC (0 (0 :(0 « a; > (0 E id CT) id O') 1 t I + I + 01 •r-ι (0 (0 (0 (0 ,£ -r-ι *i ι ·Γ—ι ·γ~> 0

id O'! ι—I CP I—I

rd I 1= = +=: I 1= = += = 0) X +> -d -d +> +) H +> :(0 :(0 :(0 :(0 •H > > > > Ο « ·Η ·Η ·Η ·Η Μ :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 mx α α aa 3 rd 3 (0 M tp

En O ,X in in in in C \ ι o m - o m * ι o m ·* o m « G en in (n (n m n n m on on m on on

rt! E (N rd ID ON id ID (N id Ιώ (N id ID

< <

I I

H H

0) > > +) ·Η *d ·Η ·Η « rd * d id * d •d ,d Γ" (U rd 0)

03 0 <U O <U

m e · e = = = = = d»s= = = = = >i +> e >i +)6¾ 0) G ‘d rd C "d rd

O O « O O « O

x x ω a x w a c a> c •d m (0 D C n

Eh C O O O U

1(0 d « = = = = = = d « = = = = = = < >

co « x X

X (0 EM rd = = = = = = Id = = = = = =

Esimerkki 11 68060

Esimerkin 6a polymeeriä, joka oli valmistettu kiinteästä EMA:sta ilman vesilisäystä ammonoimalla ammoniakkikaasulla, annettiin BALB/c-hiirille käyttäen annostasona ja käsittelyä, jotka on esitetty esimerkissä 10. Kokeet suoritettiin 10 hiiren ryhmillä, ja tulokset 61 vrk tarkkailun jälkeen on koottu taulukkoon X. Käsittelyssä (a), jossa polymeeriä 6a annettiin päivinä 9 ja 1 ennen kasvannaissolujen mKSA-TU5 istutusta, 40 % (24/60) hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 61 vrk.

Käsittelyssä (b), jossa polymeeriä 6a annettiin päivinä 1 ja 9 kasvannaissolujen istutuksen jälkeen 32 % (19/60) hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 61 vrk. 43 kasvannaisvapaasta hiirestä ryhmästä (a) ja ryhmästä (b) jäi uuden kasvannaisistutuksen (1 x 10 solua) jälkeen 36 hiirtä (87 %) immuuneiksi 30 vrk tarkkailuaikana.

____ TT

42 68060

IA I *H Ή (O :(0 G ft ι—I

G vor-H (N iH i—I m ti* i—i in co in r~ m m m iö (0

> <0 aO

to a G

td (0 ao « > >

G -H Φ MO G ft •H

<0 +-* O oooooo o oooooo G G I—I 1—I i—li—I ι—I ι—I ι—I r—I i—I i—I I—I I—I I—I I—I i—| 5 \ \\\\\ \ \ (uttJ σ> οοσσΓ'-νοσ oo in ld <ό r·'- r~ ld > > :nJ in to G fO cO :f0 X M > <0 E r-t σ ιΗ σ ή I + I + Φ •n f0 f0 «0 <0 JG τι τι -r-ι -r-i

O

>i σ I—I σ iH

t I 1= = += = I 1== + = = X Φ

-P gJ gj gj gJ

O +> :<0 ao ao aö X ’G > > > > X ΙΑ *H -Η *H Ή

G ao :<0 ao :rd aO

<-t X ft ft ft ft O f0 E-i in σι

O M

G\ I om om I o in o m GO1 m in in m in in in in μ ιλ oi in

<C E IN I—I VO CN I—I VO m H ID N H ID

Φ gj Ή Ή τΗ ιΗ

10 —I <0 Vg rH 10 G

-H f—I VO φ Η φ φ Ό Ο 0) Ο Φ •C Ρ ·£= = = = = Μ · g = = = = = >ι +» E >ι -Ρ Ε >ι Φ G -H r-l C -Η Η Ο Ο ίο Ο Ο Μ Ο X X W ft X Μ ft C Φ C •Η m (0 DG n· n

En G OU OO

1(0 I—I (Λ = = = = = = η ΙΟ = = = = = = <C >

to w x X

X (0

ErX l—t = = = = = = ,-1 = = = = = = 43

Esimerkki 12 68060

Esimerkin 6b polymeeriä, joka oli valmistettu ammonoimalla EMÄ kaasumaisella ammoniakilla vettä lisäten, annettiin BALB/c-hii-rille käyttäen esimerkin 10 annostasoja ja käsittelyä. Kokeet suoritettiin 10 hiiren ryhmillä, ja tulokset 61 vrk tarkkailun jälkeen on koottu taulukkoon XI. Käsittelyssä (a), jossa polymeeriä 6b annettiin päivinä 9 ja 1 ennen kasvannaissolujen mKSA-TU5 istutusta, 30 % (18/60) hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 61 vrk. Käsittelyssä (b), jossa polymeeriä 6b annettiin päivinä 1 ja 9 kasvannaissolujen istutuksen jälkeen, 17 % (10/60) kasvannaissoluja saaneista hiiristä pysyi kasvannaisvapaina 61 vrk. 28 kasvannaisvapaasta hiirestä ryhmästä (a) ja (b) jäi uuden kasvannaisistutuksen (1 x 10 solua) jälkeen kasvannaisvapaiksi 23 hiirtä (82 %) 30 vrk tarkkailuaikana.

44 68060

W I •H *H

(ti :n3 β ä '—I

β VO O (NiHrOCNCOO VO CN VO "=3< ΓΜ O (O

(0 <ti > (ti uti cn α β (ti (ti :(ti « > > C -h <U :<ti β a H o oooooo o oooooo

(ti -P |—I r—li—Il—Il—II—I I—| I—| i—| f—I I—I I—I I—I I—I

e 3H \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ \ β β VO O ΟΟΟ'ιΓ'ΟΟΓ^Ο ·<3· 00 ΓΤ VO 00 O Γ~~ (ti (ti I-1 I-I I-1 > > :<C tn ui β (ti (ti :(ti X M > (ti S h en i—i en Ή l + i +

<U

ΓΊ (ti (ti (ti (ti X ·γ-ι ·γ*ι -n ·η

O

£0 σν i—I ον t—I

H H I 1= = += = | 1 = =+= =

X CU

X» +> +> 4J 4J

O +* :(ti :(0 :(ti :(ti ^ -H > > > >

X W *H -H -H *H

β :(ti :(Ö :(ti :(ti :(ti H X a (¾ aa β iti

Ei

tn tn O X

β I O LO (N O LD (N I O LO (N O LT) (N

β Cp m cn vo m cn vo m <n vo lo cn vo

< E <N M <N i—I CN rH (MH

Q)

-P *H -H

tn H X) P -H -H

-H M VO 0) H X p 'O O 0) H VO Q) x p · g = = = = = o <u >i +> g >1 P · g = = = = =

<U β -H M +) P

O O tn O β -H rH

x x ω a o tn o x ω a β <u β •H LO (ti U β -3< ro

Ηβου CU

1(0 i—IC/1 = = = = = = r— CO = = = = = = <C >

m tn χ X

x (ti EM H = = = = = = m = = = = = =

Esimerkki 13 45 68060

Esimerkeissä 9-12 kuvattuja kokeita jatkettiin käyttäen toista kasvannaismallia, Fischer-kannan ^344) rottiin 3-metyylikolan-treeni-indusoitua virtsarakkokarsinoomaa. Kun tämä kasvannainen siirretään normaaleihin Fischer-rottiin, niin se kasvaa primaarikohdas-saan ja kehittää itsestään metastaaseja keuhkoihin. Lisäksi primaarisen kasvannaisen kirurgisen poiston jälkeen havaitaan aina uusiutunut kasvannainen.

Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin esimerkin 7-VI-A polymeerin vaikutusta rottiin, joilla oli kasvannainen ja yhdisteen vaikutusta etäpesäkkeiden muodostuksen estämiseen.

Fischer-kannan rottiin, jotka kukin painoivat noin 250 g, siirrettiin (putkipistin) 2 x 2 mm kasvannaispala. 5, 12 ja 18 vrk kasvannaisimplantaation jälkeen rottia käsiteltiin 62 mg/kg poly-meeriannoksella (ip). Kaikkiaan kuutta eläintä käsiteltiin tällä tavoin. Neljä eläintä, joille oli suoritettu kasvannaisen siirto, jäivät käsittelemättömiksi kontrolleiksi. Kaikki kontrollieläimet kuolivat kolmen viikon kuluessa eli keskimäärin 15 vrk kuluttua kasvannaisen implantaatiosta. Kaksi käsitellyistä eläimistä kuoli 37 vrk kuluttua. Jäljelle jääneet neljä eläintä tapettiin 42 vrk kuluttua implantaatiosta. Silmämääräinen tarkastelu osoitti, että niillä oli selvä primaarinen kasvannainen, muttei lainkaan keuhkoissa etäpesäkkeitä.

Esimerkki 14

Toinen koe suoritettiin toistamalla esimerkin 13 koe, mutta antamalla alempi annos polymeeriä ja suorittamalla käsittely harvemmin. Fischer-rotille suoritettiin saman kasvannaistyypin siirto ja 8 vrk siirron jälkeen rottia käsiteltiin esimerkin 7-VI-A polymeerillä annoksilla 65 mg/kg tai 30 mg/kg (ip) (4 rottaa kummassakin ryhmässä). 16 vrk kasvannaissiirron jälkeen alemman annoksen saaneet rotat saivat tehosteannoksen 30 mg/kg. Tarkkailuaika oli kuusi viikkoa. Kuuden viikon kuluttua henkiin jääneiden rottien keuhkot tarkastettiin mahdollisten etäpesäkkeiden havaitsemiseksi. Viisi kasvannaissiirron saanutta rottaa oli käsittelemättöminä kontrolleina. Kaikki kontrollieläimet kuolivat keskimäärin 23 vrk kasvannaissiirron jälkeen. Neljä annoksen 65 mg/kg saanutta eläintä oli hengissä 40 vrk kasvannaissiirron saamisen jälkeen. Ne tapettiin ja 46 6 8 0 6 0 tutkittiin, etäpesäkkeitä ei löytynyt. Rotista, jotka saivat 30 mg/kg ja tehostetta 16 vrk kuluttua kaksi kuoli päivinä 35 ja 36 ja toiset kaksi tapettiin 40 vrk kasvannaissiirron jälkeen. Myöskään nyt ei havaittu etäpesäkkeiden muodostusta. Molemmissa käsitellyissä ryhmissä oli selvästi pidentynyt hengissä pysyminen kontrolliryhmään verrattuna.

Esimerkki 15

Kolmannessa kokeessa arvioitiin esimerkin 7-VI-A kykyä estää Fischer-rottien kasvannaisen uusiutuminen rotilla, joilta primaarinen kasvannainen oli poistettu kirurgisesti. Fischer-rottiin istutettiin putkipistimellä 2x2 mm suuruinen kasvannaispala samoin kuin esimerkeissä 13 ja 14. Kasvannaisen annettiin sitten kasvaa 2-3 cm suuruiseksi läpimitaltaan. Tässä vaiheessa (8 vrk istutuksen jälkeen) kasvannainen poistettiin kirurgisesti ja rottia käsiteltiin samalla yhdellä annoksella polymeeriä. Koeryhmät käsittivät neljä rottaa ja polymeeriannokset olivat 65 mg/kg ja 30 mg/kg injektiona (ip). Henkiinjäämistä ja kasvannaisen uusiutumista tarkkailtiin seitsemän viikon ajan. Ryhmästä, joka sai kasvannaisen poiston aikana 30 mg/kg polymeeriä, kaikki neljä olivat elossa 47 vrk kuluttua eikä niissä näkynyt merkkiä kasvannaisen uusiutumisesta. Ryhmästä, joka sai 65 mg/kg annoksen yhtenä injektiona kasvannaisen poiston aikana, yksi kuoli 16 vrk kasvannaisen poistamisen jälkeen ja kolme pysyi hengissä 47 vrk, eikä niissä näkynyt merkkiä kasvannaisen uusiutumisesta.

Esimerkki 16

Toisessa kokeessa kasvannaisen uusiutumisen estämiseksi käytettiin Fischer-rottia samoin kuin esimerkissä 15, mutta kolmea eri polymeeriä, joiden imidipitoisuudet olivat erilaiset. Imidipi-toisuudet olivat 0, 5 ja 21,7 %. Tässä kokeessa kasvannainen istutettiin putkipistimellä samoin kuin esimerkeissä 13, 14 ja 15. Kasvannaisten poisto suoritettiin 14 vrk istuttamisen jälkeen.

Kontrolliryhmänä käytettiin yhtä neljän rotan ryhmää, joka ei saanut käsittelyä kasvannaisen poiston aikana. Kasvannainen uusiutui 100-%:isesti 21, 33, 40 ja 44 vrk poiston jälkeen eli keskimäärin 34 vrk poiston jälkeen. Tästä kontrolliryhmästä kaksi rottaa kuoli 44 vrk kasvannaisen poiston jälkeen ja toiset kaksi tapettiin samaan aikaan. Kaikilla neljällä todettiin etäpesäkkeitä.

68060

Toinen viiden rotan ryhmä sai kasvannaisen poiston aikana yhden injektion (ip) 30 mg/kg esimerkin 2a polymeeriä (imidi-% = 0). Tästä ryhmästä kahdella rotalla kasvannainen uusiutui 33 vrk leikkauksen jälkeen ja yhdellä 40 vrk leikkauksen jälkeen. 55 vrk leikkauksen jälkeen kolmella rotalla viidestä (60 %) oli kasvannaisen uusiutuminen. Kolmas kuuden rotan ryhmä sai kasvannaisen poiston ajankohtana yhden annoksen (ip) 30 mg/kg esimerkin 3, taulukon IV-1 polymeeriä, joka sisälsi 5 % imidiä. 55 vrk koeaikana ei havaittu yhdessäkään rotassa kasvannaisen uusiutumista. 55 vrk leikkauksen jälkeen kaksi rotista kuoli (ilman kasvannaista), niissä ei havaittu etäpesäkkeitä.

Neljäs kuuden rotan ryhmä sai kasvannaisen poiston ajankohtana yhden annoksen (ip) 30 mg/kg esimerkin 7 taulukon VI-A polymeeriä, joka sisälsi 21,7 % imidiä. Tässä ryhmässä yhdellä eläimellä kasvannainen uusiutui 21 vrk leikkauksen jälkeen ja toisella 43 vrk leikkauksen jälkeen. Kaikki olivat hengissä 55 vrk. Kasvannainen uusiutui siis vain kahdella kuudesta eli 33 %:lla.

Esimerkki 17

Esimerkeissä 13-16 polymeerejä annettiin injektioina intra-peritoneaalisesti. Tässä esimerkissä valaistaan imidiä sisältävän polymeerin käyttöä antamalla sitä oraalisesti kasvannaisen poistamisen yhteydessä kasvannaisten uusiutumisen estoon tai hidastamiseen. Esimerkissä 16 kontrollieläimet eivät saanett lainkaan lääkettä kasvannaisen poiston aikana ja tällöin osoittautui, että kasvannainen uusiutui keskimäärin 34 vrkrssa.

Tässä esimerkissä 10 Fischer-rotan ryhmälle suoritettiin kasvannaisen istutus putkipistimellä samoin kuin esimerkissä 13. Kehittyneet kasvannaiset poistettiin 13 vrk istutuksen jälkeen ja samalla kullekin rotalle annettiin oraalisesti 1 ml steriiliä vettä, joka sisälsi 30 mg/kg esimerkin 7, taulukon VI-A polymeeriä (21,7 % imidiä). Kasvannaisten uusiutumista tarkkailtiin sitten 10 viikon ajan. Yksi rotista kuoli kasvannaista poistettaessa. Jäljelle jääneissä yhdeksässä rotassa havaittiin pieniä kasvannaisia seitsemässä eläimessä 42, 42, 42, 43, 46, 50 ja 59 vrk kuluttua kasvannaisen poistamisesta. Kaksi rottaa oli kasvannaisvapaita 70 vrk.

48

Esimerkki 18 68060 Tässä esimerkissä oli tarkoituksena määrittää esimerkin 7-VI-A polymeerin vaikutus kasvannaissoluihin muuttamalla niiden antigeeni-syyttä ja/tai vaikuttamalla suoraan sytotoksisesti kasvannaissoluihin .

Kasvannaissolut valmistettiin esimerkissä 13 kuvatusta BLCa kasvannaisesta leikkaamalla ihonalaisesti irti kasvannaismassaa.

Solut saatettiin sitten suspensioon käsittelemällä kasvannaisen palasia heikosti tryptisoivasti. Erottuneet solut pestiin kolme kertaa tasapainotetussa suolaliuoksessa (BSS) ja niiden elävä/kuollut-suhde laskettiin. Näin saatiin 90-95-%:inen solupopulaatio.

1 x 105 solua/ml:ssa Eagle'n minimi-välttämätöntä-väliainet-ta Earl'in BSS:ssä + 10 % vasikansikiöseerumia inkuboitiin esimerkin 7-VI-A polymeerin (30 mg/ml) kanssa. Inkubointi suoritettiin 37°C:ssa 90 minuutin ajan, minkä jälkeen solut erotettiin suspensiosta linkoamalla kuusi minuuttia 300 g:ssä. Soluja tutkittiin jälleen todeten, oliko elävien solujen suhteellinen määrä muuttunut ennen inkubointia vallinneesta tasosta. Menettely toistettiin kolme eri kertaa.

Tästä kokeesta otettiin soluja ja injektoitiin urospuolisiin Fischer-rottiin annoksena 1 x 106 solua. Viisi eläintä sai injektiona polymeerikäsiteltyjä soluja ja viisi eläintä sai soluja, joita oli käsitelty edellä kuvatulla tavalla, mutta ilman polymeeriä. Tulokset on koottu taulukkoon XII.

Taulukko XII

49 6 8 0 6 0

Rotta n:o Kontrollit^ Koe-eläimet

Aika (vrk), jona 2-3 cm Aika (vrk), jona 2-3 cm kasvannainen muodostui kasvannainen muodostui 1 11 11 2 11 11 3 13 13 4 11 11 5 13 11 1) 1 x 106 kasvannaissolua, joita ei ole käsitelty polymeerillä ihonalaisena injektiona 2) 1 x 10^ kasvannaissolua, joita on käsitelty inkuboimalla esimerkin 7-VI-A polymeerin kanssa, ihonalaisena injektiona.

Kasvannaisen kehittymiseen kuluneessa ajassa ei näillä eläimillä ollut mitään eroa. Lisäksi molemmissa eläinryhmissä kasvannaisen kasvumalli oli vertailukelpoinen. Näistä kokeista voidaan vetää johtopäätös, että käytetyllä annoksella esimerkin 7 taulukon VI-A polymeerillä (21,7 % imidiä) ei ollut suoranaista sytotoksis-ta vaikutusta BLCa-kasvannaissoluihin. Lisäksi polymeerin inkuboi-minen kasvannaissolujen kanssa ei muuttunut kasvannaissolujen anti-geenisyyttä.

Esimerkki 19

Esimerkin 7-VI-A imidiä sisältävän polymeerin suoraa myrkyllisyyttä kokeiltiin normaaleilla urospuolisilla Fischer-rotilla.

Sekä ip- että iv-injektiot sisälsivät halutun määrän polymeeriä noin 1 ml:ssa fysiologista keittosuolaliuosta. Myrkyllisyyden määrittämiseksi polymeeriä annettiin kummassakin annosryhmässä viidelle eläimelle annoksesta 100 mg/kg lähtien kasvavia määriä, aina 100 mg/kg enemmän, 1 000 mg/kg asti. Polymeeriä annettiin sekä intra-peritoneaalisti että intravenöösisti. Intraperitoneaalissa annossa ei kaikkiaan 50 eläimellä tehdyssä kokeessa yksikään eläimistä kuollut 30 vrk tarkkailuaikana. Sen sijaan annettaessa polymeeriä suonensisäisesti (iv) havaittiin myrkyllisyyttä annoksesta 800 mg/kg lähtien. Viidestä eläimestä yhdellä oli kouristuksia annoksella 800 mg/kg, kahdella viidestä eläimestä annoksella 900 mg/kg ja neljällä viidestä eläimestä annoksella 1 000 mg/kg, ja nämä eläimet 50 680 6 0 kuolivat. Myrkyllisyyttä tai kuolemantapauksia ei 30 vrk tarkka.ilu-aikana esiintynyt eläimillä (35 eläintä), jotka saivat suonensisäisesti 700 mg/kg tai alle.

30 vrk kuluttua 85 henkiinjäänyttä eläintä tapettiin ja niiden aivot, keuhkot, sydän, maksa, munuaiset ja perna tutkittiin patologisesti sekä silmämääräisesti että mikroskoopilla. Missään näistä elimistä ei havaittu lääkeantoon liittyvää epänormaaliutta.

Toisessa tutkimuksessa edellä olevan polymeerin myrkyllisyyttä intraperitoneaalisti annettuna verrattiin sen myrkyllisyyteen oraalisesti annettuna. Esimerkin 7-VI-A polymeeriä annettiin annoksina 100 mg/g, 500 mg/kg ja 1 000 mg/g joko injektiona (ip) tai suun kautta (po) viidelle Fischer-rotalle kussakin annosryhmässä. Rottia tarkkailtiin 14 vrk, jona aikana ei esiintynyt kuolemantapauksia eikä myrkytysoireita. 14 vrk jälkeen kaikki eläimet tapettiin, ja molemmista annostusryhmistä (ip ja po) tutkittiin eläinten aivot, keuhkot, sydän, maksa, munuaiset ja perna sekä silmämääräisesti että mikroskoopilla. Missään näistä kudoksista ei havaittu epänormaaliutta.

Esimerkki 20

Esimerkeissä 3 ja 4 kuvattuja polymeerejä kokeiltiin standardimenetelmällä (Jerne-plakkimenetelmä) ("Textbook of Immunology", J.T. Barret, C.V. Mosby Company, 1978, ja "Immunology", H.N. Eisen, Midecal Department, Harper and Row Publishers Ind., 1974) niiden kyvyn suhteen saada normaaleissa Lewis-rotissa aikaan immuunivaste lisäämällä 19-S (IgM) vasta-aineita tuottavia soluja heterologisten erytrosyyttien (lampaan punaiset verisolut, SRBC) suhteen. Tyypillisessä tapauksessa eläin, tässä tapauksessa Lewis-rotta, immunoi-daan injektoimalla häntäsuoneen 1 ml pestyjen SRBC-solujen 1:5 laimennusta fysiologisessa keittosuolaliuoksessa. Eläimille annetaan samanaikaisesti intraperitoneaalisti injektiona kokeiltavaa polymeeriä 1 ml:ssa fysiologista keittosuolaliuosta. 4 vrk jälkeen immunoi-tujen eläinten pernasoluja siirretään agaroosikudosviljelysystee-miin, joka sisältää SRBC-soluja. Kudosviljelyväliaine edistää vasta-aineita muodostavien solujen vasta-aineen muodostusta. Nämä vasta-aineet diffundoituvat alkuperäisistä soluista ja hyökkäävät vieressä olevien punasolujen kimppuun. Lisätään seerumikomplementtia (normaalia marsun seerumia), joka edistää RBC-solujen lysoitumista, si 6 8060 jotka solut ovat saaneet ympärilleen vasta-ainetta muodostavan kirkkaan alueen eli plakin vasta-ainetta muodostavan solun ympärille. Nämä plakit (PFC) lasketaan ja ilmoitetaan PFC-lukuna per 1 x 10^ pernasolua. Tulokset nähdään taulukossa XIII. Kaikkia taulukossa XIII esitettyjä polymeerejä kokeiltiin annostasolla 30 mg/kg.

68060 •H .—.

CO O

A o 0) -Ό rH

g

•H II

0 h-h OLn^rovDcNootD<TirHnnm

-+-* <—I Or^LOVOOOi—I tN ^ ^ lO fNJ (Ti ID

td i—I

<0 O ρΗΓΗΓΜΓΜΓΊΓΟΓΟΓΟΓΟΓΟΓΗΓΜρΗ

Ή P 3 -P

ε c •H o -P Ai t/l - td

G

u Φ

di OO'S'tDOOOOtOOOTj'CNOO'J'tD

\ toto^rr^cNr^tovDootTitotorsi

Uto 1Οΐη^ι<ί10>(Ο(Τι(Λ(Γι(ΝΜ01

IP O

Gr pH Π3 i-! i—I I—I |—I i—t pH pH i—( pH pH pH

m G

M S X pH

H CP O

X H pH to

O

a: a: g g pH 0)

3 -P

(d G :<d

Eh -H p :td :td

pHttd VOOtOv£)OOt£)OtDOtDOO

<l)g pHpH pH pH pH pH pHpH

1 0

0) A

0 G

X ΓΗ :id

-P

to

•H P-N

toti) mioinunopH^cN^r^pH

ΪΗ Ό

>lG I O LT) i—IkD^D-^fr^cOCN^tO

0^ ·—I pHpHrH(NOnc\JtorOlf> 1 td to •h G l tJ G < •H I \ ε « h H H ' "td *p|

M

tl)

O

•ho -h ε P ·· H ^

O G i—I i—I

<D OO pH ro o> to t" oo σι 6 · P Qj l II I i il +J > >> > > >>

Ή -H C-H H HH H H HH

oto OtDidl II I I II

CP d) A N n h1 n tn I ro l ro I roro

Esimerkki 20A

68060

Esimerkin 7 taulukon VI-A polymeerin vaikutusta IgM-vasta-ainevasteeseen SRBC-antigeenin suhteen (käytettiin jälleen samoin kuin esimerkissä 20 Jerne-plakkikoemenetelmää) kokeiltiin lisäkokeissa (1) antamalla normaaleille Lewis-rotille joko intraperito-neaalisti tai oraalisesti polymeeriä ja (2) Lewis-rotilla korvaamalla kateenkorvan tehtävä antamalla polymeeriä joko intraperitoneaa-listi tai oraalisesti. Tapauksessa (1) noudatettiin esimerkin 20 mukaista menetelmää. Tapauksessa (2) normaali kateenkorvafunktio poistettiin aikuistymektomialla (Tx), joka suoritettiin kirurgisesti 8-12 viikon iässä, ja suurilla koko kehoon kohdistuvilla säteilyannoksilla (TBI), jota seurasi luuytimen solujen repopulaatio (BM). Tymektomia, kokonaissäteilytys ja luuytimen solujen repopulaatio suoritettiin standardimenetelmin (ks. Falk, R.E. et ai., Surgery, October (1978), Falk, R.E. et ai., Abstract, Canadian Society for Clinical Investigation, Jan. 24-27, 1978, Vancouver, ja Falk, R.E. et ai., Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, Jan. 25-28, 1978, Vancouver.

Näistä TBI ja BM-repopulaatio suoritettiin kirurgisen tymek- tomian jälkeisenä päivänä. TBI suoritettiin säteilyttämällä eläi-137 miä Cs-lähteellä (Atomic Energy of Canada). Laitteen säteilyannos oli valmistajan kalibroima ja se kohdistui samanvahvuisena astiaan pantujen eläinten koko kehon pintaan. BM-repopulaatio suoritettiin valmistamalla yksittäisiä luuytimen solujen suspensioita pesemällä rotan pitkät reisi- ja sääriluut tasapainotetulla suolaliuoksella (BSS) 4°C:ssa. Solut pestiin kolme kertaa BSSissä ja preparaatista laskettiin hemosytometrissä elävien solujen lukumäärä sopivan solulaimennuksen valmistamiseksi. Soluja annettiin intra-venöösisti valmisteina, joissa oli yli 90 % eläviä soluja. Kunkin g rotan BM-repopulaatio käsitti 1 x 10 solua.

Eläinten kuolleisuus koko Tx + TBI + BM prosessissa oli alle 10 %. Käsitellyt eläimet saivat toipua kuusi viikkoa ennen IgM-vasta-ainevasteen määrittämistä SRBC:n suhteen.

Toipumisajan jälkeen eläimille annettiin esimerkin 7 taulukon VI-A polymeeriä ja SRBC-soluja samoin kuin esimerkissä 20. Koetulokset nähdään taulukossa XIII-A.

54 68060

•H

(li O Ai O Φ -

Ti H G

•H H CO tO O (N

0 P~ (Ti H tr •H -H I * * I »· * •P H tr tr Ο Ο

Φ rH rH

(0 o

Ή M G -P

1 G •H O -p a; en —

SO

0) o

4-> rH

M X

Φ H IT5 tNJ O «3 eo tr O

> \ 3 *· - - - * v hrl <ί O Ln Γ0 O tr • U O Γ" ro eo t" tr r-~ g en tn h oo oo r~tr •h , (Ö Ai * c tn E p Φ en Φ «Ha Φ a <o a o a o tri <uwtn-p -h a h a a: •p o« o i \ \ i \ \ \ w e \ -p XX XX Ö1 Φ G tp G oo oo g > CE<0 roro roro Φ tn

G rH

•H C

<0 a) id

i -p · H

Φ G g OOOOOO H

P H 3 H H H H H H φ en :ni A tn

Φ H 3 A

> W H O Ό

„ CG

ac e ρ o

tn iti -H

Hl * 4J

Φ C en iti G >i h -H o (0

tl) H (U -H 3 H

•H Φ 4-1 H +3 G G

+J 4-) 4-> H (0 (Ö a -p -p -h h m tn o 0 -h tn o EES tn >.a P tn :Φ P m X m m 4-> Φ

1 A -P X tö >ί P

tnA G —rl « - -H H

•H -H o -rl -H P5 H a « tn -H φ SC HAH H OHO O A φ e ΦΦ Φ φ Φ en o tn tn o A 3

PIS Φ G Φ iti opo as h :it) H

•h ε ;o ε e p> etno :<0 P -P P P >-3 - 4J tn <H O =Φ O O XOX X Φ 3

M E ε E 2 E-i«Eh E-i Φ-HOG

i ή e ii m

tn O Φ S

H << <<·Η4->Α·Η

h II I I Π3 A H-J

H HH ΗΗΡ)φΟ>ι

X G > > 3 > > H g A G

•H 4-) 4-> (0 >1 O G

O P -P ^ O ^ O -P -O * O A -P A H

A Φ Φ t"- A r- A Φ h A r- A G

a φ g aag a a φ il il il

G E G *3 · G G · 3 · 3 E

h>0 ai Sh g h (0 £H gH (3 X s

G H -H G H G -P G -H 3 W E-t « CQ

Φ O h tn id tn id p tn nj tn tti eh a ω w -ρ ω -p w w -p w -p xx

X

55 68060

Esimerkki 21

Yhdeksää erilaisen imidipitoisuuden (0-35 %) omaavaa polymeeriä, joista useat olivat identtisiä esimerkissä 20 taulukossa XIII kuvattujen kanssa, kokeiltiin Fischer-rotilla tarkoituksella tutkia, miten primaarisen BLCa-kasvannaisen uusiutumisen estäminen kasvannaisen poiston jälkeen oli riippuvainen imidi-%:sta. Koemenetelmä oli muuten sama kuin esimerkeissä 15, 16 ja 17 paitsi, että kaikissa annosryhmissä ja kontrolliryhmässä käytettiin 10 rottaa, joille annettiin eri imidipitoisuuden omaavia polymeerejä annoksina 30 mg/kg ja 15 mg/kg (ip) 1 ml:ssa suolaliuosta. Kontrollieläimet saivat 1 ml suolaliuosta ip. Yhdelle 10 eläimen ryhmälle annettiin oraalisesti 30 mg/kg esimerkin t-VI-A polymeeriä (21,7 % imidiä). Kaikki kasvannaiset poistettiin kirurgisesti 11 vrk niiden istutuksen jälkeen, ja eläimille annettiin kasvannaisen poistamisen jälkeisenä päivänä yksi annos koeyhdistettä. Tulokset on koottu taulukkoon XIV. On mielenkiintoista havaita, että 10 kontrollieläimel-la kasvannainen uusiutui keskimäärin 32,3 vrk kuluttua, mikä on hyvin yhtäpitävä esimerkissä 16 saadun kontrollien keskimääräisen (4 rottaa) uusiutumisen 34 vrk kanssa.

56 68060 rt tn x tn

•H

Ή Ai

3 -H

4-1 (tj

3 o i LDr^mcotNinon'sJ'i-icgfovovor^^'^ X

•H i—I

tn

3 -H

3 4J

tn

G CT I τίΰ NM Hl/1 ON ^ rItNi—hO ΓΟ Π -H

0) H

G G

•H rt rt Φ

G CO I ^rCOrHOJOrOOiNfNr-ltNOtOin^CirO G

G O

G +J

> to -H

tn -P G

rt tn t"· i co^rHtNOroofNrHrHiHOLnuocococo Φ A! O O, -3 rt (0 tn g (—! Ή 4-1

r-HOcoon^ftHfNjonocNiOrHrHominnnro G

*H ti* i—I *H

O

n G rt

<U +J

'tn tn un ro ^ orsi ocn o in o ho o co lt><n cn cn ·η

:rt -H G

G (0 E

:rö G

:rt G rt

> gttJ^ronfOOCNJOMOp-IOOOOrHmiHCN^H -H

H 3 > Ai X Ai tn x

3 (Ti -H

o ή a; te

Ai co cn cncn ocn o o o o o o o oo i-h o o h Ai

Ai G rt 3 tu tn

i—I -3 tn -H

3 G <D -P

rt -H G 04 -H oo oo oo oo o oo oo oo oo tn E-ι :rt i—I tl) rH 3 tn

(1) Ai -H

»H

G G rt a) o ή rt

τ3 Ai G

H -H II O OO OO OO OO O OO OO OO OO o •H Ή

iZ > x G

•H

•H

X -P

tn en +j 0 Ai Q) rt G \ l ounotnoLnoinooinomOLDOLn e rt

G O' CO i—I CO,—I COi—I CO i—I CO CO i—I CO rH CO r—i Γ0 i—I G -P

< 6 rt -P

O

:rt P

t#> +j 1 coLnmr-rHrrtNr' -Po •H *·»* ·******► (X) r-t

T3 lOLntOVOrH^TfOO^}· +J

•H rH (N CN CN (N CO tn -H

6 Ή rH

h Ό O

Ä >1 :rt •h -h tn G rH VD tn ai i rH -g d)G O rH <f rfl to r-~oo 06

6 0) :rt G I III II ·· S

>1 i -P -p > >H> >> G >1

r-H-Htne H H > H HH G

otn-HOrti i il i i «tn

OitDAiXtN co rr co ro I co co 60

•H G tn G

O X W rt

· rHCNCO^invOr^OOtXiO

2 rH X

Esimerkki 22 68060 EMA:n (ominaisviskositeetti 0,66) 100-%risen imidin (esimerkki 5-A) kykyä estää kasvannaisten kasvua kokeiltiin riippumattomassa koelaboratoriossa seuraavalla menetelmällä.

Urospuolisten sveitsiläisten hiirien kylkeen istutettiin putkipistimellä (2 mm läpimitta) Solid Sarcoma 180. Esimerkin 5-A polymeeriä annettiin injektiona (ip) 0,5 mltssa suolaliuosta ilmoitetut annokset kuutena peräkkäisenä päivänä alkaen kasvannaisen is-tutuspäivästä. Viiden hiiren ryhmät saivat polymeeriä ilmoitetulla tavalla annoksina 25, 50 ja 100 mg/kg. Korkeammat annokset, 200, 400 ja 800 mg/kg osoittautuivat myrkyllisiksi. Vuorokauden kuluttua viimeisesti injektiosta (ip) eläimet tapettiin, kasvannainen poistettiin ja punnittiin. Kasvannaisen kasvun estyminen laskettiin %:eina käsiteltyjen eläinten kasvannaisten ja kontrollieläinten kasvannaisten painosta. Tulokset nähdään taulukossa XV} niistä ilmenee, ettei EMÄ:n täysimidillä (100 %) ole aktiviteettia.

58 68060

> <D >ι I

w h h m Ο -H h q a:

X Ή H ft :tO

H — —* Ο :(0

# O O I VO I VO | CM I (N III -t-i H

I P I CM H U O ft Ο -P -t- I 52 2 (0 H :i0

PC -n ' +J

WO tn w a; ro ro o g c w

,, OOH

II A! H Q) w w tn m -p e

(Ö <U (0 A! -P

AiÄ · ^ « oo 00 OlOH

O - - - - - - - - -n

CCC^Ln^irir-Ln m m I G

30H[~-CO<MOOOOO O 00 OHIO

-PW(doCT,r^<TiLDLn m σν tn O

O H ft H —' r* +J

-P <0 Q) +J

WC· :(0 CD 3 H % g H X rl O (0 H H H 3

ft > A O :«j X

" -3 " c &1 +J c O) • W 0) T3 g I * H W 3 H30h,cmocmoco m cm ft a; (0

AlftC - -- -- - - - ·Η 3 A!

Wft-Hr—ICNM'CMrHCM (M CM I AC -P O

OOfOcoromcomn m co 3 ^

h ft 3 -P O

ft w 3 H > 3

. -P C C

> -P O H

X H O W H

H H 1—I +J H 4J

O H H O 3 W -P

·* 0 0 c -p c 0 X 3 3 λ; w c ft 2 A! X H (0 (0 H :(0 > -P 3 3 C :(0 :(0 +J C W -p

(0Q) +J 4-( W H (0 -P -P

E-iCtJi WWH .C Αί O O

H Tj -H B Ή S Λ

•W - g g H O »0 H W

PO Η Η :(0 -η C :(0 (0

C :i0 :(0 H aö H H

•(0 H r-i 1—l o — ^ W

g (0 O) CU H H

H ft dp o :r0 · O

A3 OVOCOVOOOOdPOdPVO VO COft(0

tn X ------ - -O - H 4J -H

OH r-r-vor-voavOCTvor-or-· i:nJW w

«(0 CNCMCMCNCMCNVOCM-M'CMHCN COCO X

"03 O

W H 3 _ <0 -P H H > Ä W O :(0 (0

H W P X H C

p 3 h >: o o •h ft LnininLnLnincNinroinom h :ιθ 3 Ό HO J3 p w >1 CC H W o >1

O ft (0 W

„ P W H

•(0 (0 3 (0 W H

H W C '· H

P W -PÖH >1 h 3 νηνηίηιηκΊΐηνηιηιηιηιηιτ) o -P g «a;

H h w 3 Π3 P

CC <0 h 3 in -p >1 :<0 X - w g h 00

w h 3 h C

O H -H H H H H W *P (0 -P H

C H H H H H H -P -P H A -P

C-—- H ,—I >—I ,—I H H H O P O 3 <0H O O O O O O O C O ·(—1 3 otr> p p p p p p > c o c a AA -P -P -P +J -P +> OT (0 g H <c :<0\ c CO CO Co CO c :(0tji vnooooooooooo ---

p g H CM

59 68060

Esimerkki 23

Keksinnön mukaisen edullisen polymeerin mahdollinen aktiviteetti kokeiltiin normaaleilla urospuolisilla Lewis-rotilla määrittämällä peritoneaalisten makrofagien luvun kasvu ja aktiivisuus fa-gosytoitujen polystyreeni-lateksihiukkasten suhteen, jota koetta voidaan käyttää monien immuunisysteemimodulaattorien, kuten Bacillus Calmette-Guerin-systeemin (BCG), pyraanikopolymeerin ym. osoittamiseen.

Kuuden nuoren täyskasvuisen urospuolisen (2-4 kk) Lewis-ro-tan muodostamalle neljälle ryhmälle annettiin koepolymeeria tai suolaliuosta (kontrolli) seuraavasti: ryhmä 1 sai suolaliuosta (1 ml, ip), ryhmä 2 sai esimerkin 7 taulukko VI-A polymeeriä 30 mg/kg 1 ml:ssa suolaliuosta (ip), ryhmä 3 sai esimerkin 7 taulukon VI-A polymeerin 30 mg/kg 1 mlrssa suolaliuosta (po) ja ryhmä 4 sai 0,1 mg BCG:tä 1 ml:ssa suolaliuosta (ip).

Edellä olevan annon jälkeen päivinä 1, 3 ja 5 kaksi eläintä kustakin neljästä ryhmästä tapettiin ja niiden vatsakalvo-ontelon solut otettiin talteen. Se suoritettiin seuraavasti: eläimiin ruiskutettiin (ip) jäähdytettyä RPMI 1640 väliainetta ja varovaisen hieromisen jälkeen koko vatsaonteloneste erotettiin ja kunkin eläimen vatsaonteloneste lingottiin erikseen kierrosnopeudella 1 000 r/min. Saadut solut värjättiin NSE:llä (spesifioimaton esteraasi) ja pestiin kolme kertaa jäähdytetyllä (4°C) väliaineella. Lopuksi kustakin eläimestä saadut solut suspendoitiin erikseen 10 ml:aan väliainetta ja laskettiin, kustakin vatsaontelosta saatiin soluja, jotka koostuivat keskimäärin 80-95-%:isesti makrofageista; niiden määrä riippui käsittelytyypistä ja ajasta (vrk), joka oli kulunut käsittelystä.

Lateksihiukkas-fagosytoosi-aktiviteetti määritettiin vatsaontelosta saaduilla soluilla (kukin eläin erikseen) seuraavasti. Edellä saadut solut (40-50 miljoonaa solua/ml) suspendoitiin 5 ml:n putkessa 50-%:iseen vasikkasikiöseerumiin + RPMI-vällaineeseen. Suspensioon lisättiin 100 lambdaa polystyreenilateksia (10 % kiintoainetta, hiukkasten läpimitta = 1 ,um, Dow Diagnostics, Indiana-

* O

polis, Indiana), ja seosta inkuboitiin 37 C:ssa tunnin ajan. Solut erotettiin linkoamalla, pestiin kolme kertaa RPMI-väliaineella ja lopuksi suspendoitiin 0,5 ml:aan suolaliuosta. Solususpensiosta 60 6 8 0 6 0 valmistettiin mikroskooppipreparaatit, ja niitä tutkittiin mikroskoopilla lateksihiukkasten fagosytoosin määrittämiseksi makrofa-gisoluihin, Soluja, jotka sisälsivät 10 tai useampia lateksihiuk-kasia, pidettiin positiivisina ja niiden kokonaislukumäärä ilmoitettiin %:eina suspensiossa olevien solujen kokonaismäärästä.

Keksoiskokeina suoritettujen kokeiden tulokset nähdään taulukossa XVI.

Taulukossa esitetyistä tuloksista nähdään, ettei keksinnön mukainen edullinen polymeeri lisää peritoneaalisia makrofageja kontrolleihin verrattuna, kun polymeeriä annetaan intraperitoneaa-listi tai oraalisesti, ja lisäksi, ettei tällaisen peritoneaalisen makrofagin lateksi-fagosytoosiaktiviteetti lisäänny yli normaalin makrofagiaktiviteetin. Tästä poiketen muut normaalit immuunisys-teemimodulaattorit, kuten BCG:llä on osoitettu, lisäävät suuresti peritoneaalisten makrofagien lukumäärää, ja näillä makrofageilla on lisäksi kasvanut lateksi-fagosytoosiaktiviteetti. Tämä korkea ak-tivitetti alenee normaaliarvoihin kolmessa vuorokaudessa.

Edellä olevien tulosten osoittaessa, etteivät keksinnön mukaiset polymeerit aktivoi makrofagifunktiota esimerkkien 20 ja 20A tulokset osoittavat kuitenkin, että nämä polymeerit toimivat B-so-lumodulaattoreina normaaleilla eläimillä ja edistävät B-soluvasta-ainevastetta niitä annettaessa joko intraperitoneaalisti tai oraalisesti. Tämä vaikutus havaitaan lisäksi tymus-funktion puuttuessa, mikä osoittaa, että keksinnön mukaiset polymeerit toimivat tymus-funktion korvaajina niiden aktivoidessa B-soluja lisääntyneeseen vasta-ainemuodostukseen.

61 68060 I I I fd I x -H I 3 :G to (0 X 1 ' (O C ·Η H !lfl IS H 3 -H fl

*H £ O £ *G *G CO CO

G CO >i (0 I O O ,G mHOinOlOOIOlOOinrCOlOOMiCOIOirHOlO Oco £ Λί G rt° -ΓΊ rH -G CMNfOCNCMHOlCOCNHCOHHHCNnH H H H H (N (N "O Ή 0 G * CO Hl 4-1 3 m g -g c G ~ -g ac g >i>h cm n) -h oj o :nj h 0) CO CO o >,+J cooto c e ^ •H M (0 (0

AC I I Cl) M—i CO

G (N 3 G CU I CO

OJ H C/l -H -H

£ Q) 4-1 G CO >

•G O G G G 0 A4 G

CO >4 0 > O r·^ tOnHCO^COCCOOin^OOCOCOCDCOlOHHlOrOi-1 H M h G 0 G

0 -r-l rH -GCD iHHCNCN H G G G

G · (I) +1 O -G G CO

G H £ 4J Ärl CftS Γ—1 (G

H O 3 G O X 1 c >

H CO Λ! O Λ —’ O) -H

4J (DG

G G CO

Cl) | | (0 | x 0 G CO

4-1 I G :G CO (O Ai -n CO -H

•H G -G rH :G cdh G >1 to g G -G £ o £ ·Η -Ή 4-J CL) T3

0 co>itoi o o X LnrHr^-r^i^rHi^-r^oOr-Hi-HooooocrincDninr^Lnr^ixicx) rH to G

G Ai G dP-nH-H CNCONCSMCOCTiai H H <N iHCNIN^fO^rOCNrO 0 Ai G

CO 0 G * CO 4J G CO

G -H G G - -h M Ή G

>t m -h Φ 0) :nl H φ co Cu G

rH C1H C-nU >i)J :G G G

CD rH M G CO

G -G

G 0) I I <C G G

H O G G I :G O

H CO X H CO H :G G

> :G G > CO -rl

X Ai G G G I CO rH

CD>0 oooinoM^coc^nLOcocovoinirfrjcofocNiovoMronco r~ -G rH

O G -Γ-l rH -HVO H H CM m rH £ O

Ai 3 3 · 0 G o <0 G

Ai Ai rH G G .G rH H ·- G

G O 3 G O X Ή :c0 G

r-H^cO-VO,*'-' -H GO

G -H G CO Λί

G G --- ^ > 0) CD

EhG (0 nj G <D£C

(D G G G £ ·Η -H

CD CO X X CO X X CO X X >iG G

G O * * O · · O Ή >1)4 •G G Du O G CU O G CU O 03 > -H -rl a -rl -rl CU -H -rl a DU 3 Ή

-H I—I G I—I *—i CU

G cd»··· cd*·»· <d*·- G g λ; h ¢1 t? HCniji .g en tn 0 G 0

G O Ai Ai O A! Ai O Ai Ai -rl -n G

1 3 \ \ 3 \ \ 3 \ \ X 0 co tn tn co en en co en tn x rt 2 rt e e ee e e -h -d to

Γ*1 G rH rH G CO

£00 · £ O O · £ O O · X H G

G ro m CU cirodi m co CU 0 G

X O -HO -HO -G G Ai > p -vk - ^ v - ^ 11 -G Ai 0

rH rH<< *Ηίΐ;< "H<< - HGH

•h —- 1 i tr> '— 1 I tr» —' 1 1 tx> G e o

en H H £ H H £ H H £ G H

G >1 -rl>> ·Η>> -H>> 003

G rH rHIIrHrHIIrHrHIIrHGCOG

O 0 t-Hr'-r-r'rHGr--rHr~r'-''33J->

G G O 00 00 OGg-H

X G G · · G · · G · · -H G

G -H G££*G££-G££ -G>

£ CO G-H-HCJC-HtHOG-H-HC) 3 "G

:<d OcotnuocncouocncnUrHGG!

G X XWWPQXWWmWWWCS OG

0 to to G

G Ή G Ή

H I :G G > G

rH G I G G G 0 G 0 0 I :G >1 O 0

G CUA! «H > >i)4 G

0 G :G :G ·Η G G -G

G G :G -n:G O 0 >

O rH CU G 0 -H

G -H CC <H CO m GGG

•rlG-rHCOC >1 G Ai

GtO:G-HG0 D X G

0 0 rH -G G 0

Dj to W G G X X

62 68060

Keksinnön valaisemiseksi voidaan suorittaa monia lisäkokeita käyttämällä edellä olevissa esimerkeissä käytettyjen materiaalien sijasta muita olennaisesti samanarvoisia materiaaleja.

Edellä olevissa esimerkeissä olefiinimonomeerina oleva ety-leeni voidaan esimerkiksi korvata ekvivalenttisella määrällä pro-pyleeniä tulosten ollessa olennaisesti samankaltaisia.

Polykarboksyylihappoanhydridinä käytetty maleiinihappoan-hydridi voidaan samoin korvata ekvivalenttisella määrällä sitrako-nihappoanhydridiä olennaisesti samankaltaisin tuloksin.

Vielä alemman keskimääräisen molekyylipainon omaavia polymeerejä voidaan valmistaa fraktioimalla liuotin ei-liuotin-systee-millä edellä esimerkissä 1 valmistetusta EMA-polymeerista. Tätä alempimolekyylipainoista polymeeriä voidaan sitten käyttää ekviva-lenttisena määränä esimerkin 1 polymeerin sijasta edellä olevissa esimerkeissä, jolloin tulokset ovat olennaisesti samankaltaisia.

Muita keksinnön mukaisten imidien farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan valmistaa muuttamalla ammoniumsuolajohdannaiset esimerkiksi natrium- tai kaliumsuoloiksi. Esimerkiksi esimerkissä 3, taulukossa IV ajossa 4 valmistettu ammoniumsuolajohdannai-nen voidaan muuttaa puoliamidi-puolivapaakarboksyylijohdannaiseksi johtamalla sen 5-%:inen vesiliuos heikosti emäksisen kationinvaih-tajakolonnin lävitse, esimerkiksi Amberlite IRC-84 -kolonnin (verk-koutettu akryylihappokopolymeeri, Rohm and Haas Company) lävitse. Saadun liuoksen vapaassa karboksyylimuodossa oleva yhdiste voidaan sitten neutraloida joko NaOH:lla tai KOHrlla, ja saatu neutraloitu liuos kylmäkuivata, jolloin saadaan vastaava natrium- tai kalium-suola johdannainen .

Edellä olevan esimerkin 1 alhaismolekyylipainoinen EMA-po-lymeeri voidaan muuttaa myös puolimonometyylisekundaarinenamidi-puolimonometyyliamiinikarboksylaattisuolaksi esimerkin 2 (a) menetelmällä saattamalla EMA:n asetoniliuos reagoimaan metyyliamiinin asetoniliuoksen kanssa ammoniakin asetoniliuoksen sijasta. Tuotetta voidaan sen jälkeen keittää palautusjäähdyttäen ksyleenissä, jolloin saadaan osittain N-metyylisubstituoitu imidi-johdannainen, jolla on sekä imidifunktio että skundaarinen metyyliamidi, ionoitu COO - ja amiinikarboksylaattifunktio.

Näitä menetelmiä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavissa esimerkeissä.

63 68060

Esimerkki 24

Valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla alhaisen mole-kyylipainon omaava propyleenin ja maleiinihappoanhydridin kopoly-meeri. Reaktoriin pantiin 196 g maleiinihappoanhydridiä liuotettuna 1 600 ml:aan etyylibentseeniä, joka sisälsi 7,30 g bentsoyyliper-oksidia. Seoksen lämpötila kohotettiin 80°C:seen, ja paineella 276 kPa lisättiin 42 g propyleenia asteikolla varustetusta propylee-nisylinteristä. Propyleenin paine pidettiin 276 kPa:ssa ja reaktio-seoksen lämpötila 80°C:ssa 19 tuntia. Ajon päätyttyä reaktori jäähdytettiin ja avattiin, ja saatua propyleeni-maleiinianhydridikopo-lymeerilietettä etyylibentseenissä käsiteltiin samoin kuin esimerkissä 1 uuttamalla kolme kertaa ksyleenillä ja kolme kertaa heksaa-nilla, suodattamalla ja kuivaamalla tuote öljypumpputyhjössä 60°C:ssa. Lopputuotetta saatiin 269 g (87,3 %:n saanto), ja sen l,0-%:isella liuoksella DMF:ssä oli 25°C:ssa ominaisviskositeetti 0,0590.

Edellä valmistettu alhaisviskoosinen propyleeni-maleiinihap-poanhydridikopolymeeri (PMA) muutettiin puoliprimaarinenamidi-puo-liammoniumkarboksylaattisuolaksi samoin kuin EMÄ esimerkissä 2a.

26,0 g:sta PMA:ta saatiin 36,3 g (115,5 %:n saanto) kuivaa tuotetta (35°C:ssa lämpökaapissa 20-25 mm Hg tyhjössä kuivattu). Tuotteen IR-spektri osoitti sen sisältävän primaarista amidia, ionoituneita karboksyyliryhmiä ja ammoniumkarboksylaattiryhmiä. Imidifunktiota ei ollut.

Puoliamidi-puoliammoniumkarboksylaattisuola, joka oli valmistettu 0,059 ominaisviskositeetin omaavasta PMA:sta, muutettiin osit-taisimidiksi esimerkissä 3 kuvatulla menetelmällä. 20 g amidi-ammo-niumsuolaa lietettiin 400 ml:aan ksyleeniä, ja lietettä keitettiin palautusjäähdyttäen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Lietettä keitettiin 33 minuuttia, keiton loppulämpötila oli 139°C, ja vettä kerättiin 1,1 ml. Tuotetta saatiin 15,3 g (saanto 79,6 %). IR-analyy-si osoitti 33 minuutin näytteen sisältävän 19,0 % imidiä amidi- ja karboksylaattifunktioiden lisäksi. Imidi-% määritettiin tässä tapauksessa vertaamalla EMA:n standardi-imidi/amidi-absorbanssikäyrään samoin kuin esimerkissä 5. Tuotteen 2-%:isen vesiliuoksen pH oli 5,43 ennen pH:n säätämistä ja tuotteen lyofilisointia. Kun pH säädettiin 9,5:ksi, tuote suodatettiin ja lyofilisoitiin, niin pH oli 5,50, N—% oli 10,26 ja imidipitoisuus 19,0 paino-% IR-spektrillä määritettynä.

64 68060

Edellä valmistettua imidipitoista PMA-johdannaista kokeiltiin BLCa-kasvannaisia vastaan Fischer-rotilla samoin kuin esimerkeissä 13 ja 15 tarkoituksella todeta sen kyky ehkäistä kasvannaisten etä-peräkkeiden muodostuminen ja kasvannaisten uusiutuminen leikkaamisen jälkeen. Kontrolliryhmä sisälsi 10 eläintä, jotka eivät saaneet lääkettä kasvannaisen poiston jälkeen (10 vrk istutuksen jälkeen).

10 koe-eläintä sai yhden annoksen 30 mg/kg (ip) kasvannaisen poistamisen ajankohtana. Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa.

ti 65 6 8 0 6 0

G

CU

CD

co Y

rH i—I

:rd :G t-ι o t~~ co CO G •H O Co Y G -H 0) -H K >

G I

CO -H

CO g I

H G Ή CO :G -P g

Y -P G G

3 -H -H — -P

G CU CO G G

d Y G CU -H —

G Y G G CO G

4-i :G — G CU

G CO G G

-H CU O

'—Idi—I

O :G \ ro G -P O \

tY CU i—I i—I

G

CU G G

G CO G CO

H -H CO CU CO

G g ·· G :G

-P G Y -H Y G

-G -P G P g G P :G

G G CO > G to > >

d -H CO -P to -H

G tn ·· σ> G ·· co :G

4-1 g Y LO -H Y co d

G P tn μ O

G > · G > +> E g G E tn

<U o r- -H o -P -H

rH rH CD Y r- Y O

O \ i tn ro i tn d G O oo CU \ H 1)

YrH^tYroeo^ G

CU

tn

H

rH G

G G G G

-P to to G

jC to to G

G ·· ·· £>

d Y Y tO

G P P G

4-1 > > Y

G G

G tn r- tn r- <u tn >· to d

G ·· cn ·· -H

•H Y m Y n :G

E p p p

G > > co :G

-P E E O :G

G O O -H CO -H G S

H i—I lo o ro Y GG

to \ I CO rH I CO G Y

G o co (U \ o CU G

D iHtHt4roroi4 -H i—i to

Y G

O O >1 CU

G '—1'—I -P

- G

tn -h

•H Y :G

i—I I—I

rH O' 0)

O E

P II

p X O

G CU ro G

O O

« « X

66 68060

Esimerkki 25

Etyleenistä ja sitrakonihappoanhydridistä valmistettiin alhaisen molekyylipainon omaava kopolymeeri esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Reaktoriin pantiin 228,0 g sitrakonihappoanhydridiä male-iinihappoanhydridin sijasta, 1 874 ml etyylibentseeniä ja 15,6 g bentsoyyliperoksidia 161 ml:ssa etyylibentseeniä. Etyleenipaine pidettiin 1 380 kPa:ssa, ja reaktio suoritettiin 70°C:ssa 27,5 tunnin kuluessa. Katalysaattorilisäyksiä (10,4 g bensoyyliperoksidia 108 mlrssa etyylibentseeniä) tehtiin kolmen tunnin ja 20,5 tunnin kuluttua. Etyleeni/sitrakonihappoanhydridikopolymeerituote saatiin reak-tioseoksesta samoin kuin esimerkissä 1. Sitä saatiin 73,5 g (saanto 23,4 %) ja sen ominaisviskositeetti (l,0-%:inen DMF liuos, 25°C) oli 0,042.

Alhaisviskoosinen etyleeni-sitrakonihappoanhydridikopolymee-ri (9,5 g, 0,21 mol) muutettiin puoliamidi-puoliammoniumkarboksy-laattisuolaksi esimerkissä 2a kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 37,0 g (103,0 %:n saanto) tyhjökuivattua tuotetta. IR-analyysi osoitti sen sisältävän amidiryhmiä, ionoituneita karboksyyliryhmiä ja ammoniumkarboksylaattiryhmiä, muttei imidifunktiota. Osittais-imidi valmistettiin samoin kuin esimerkissä 3 keittämällä palautus-jäähdyttäen 20 g saatua amidisuolaa 400 ml:ssa ksyleeniä 30 minuuttia. Tuotetta saatiin 15,7 g (83,6 %:n saanto) ja sen i/A-absor-banssi (IR) oli 1,21, mikä esimerkissä 5 kuvatun EMA:n standardi-käyrän mukaan vastaa 31,0 %:n imidipitoisuutta. N-% oli 9,24 ja 5-%risen vesiliuoksen pH oli 5,31.

Edellä saadulla ammonoidun etyleeni-sitrakonihappoanhydri-dikopolymeerin imidipitoisella tuotteella tehtiin Fischer-rottia käyttäen kokeita BLCa-kasvannaisten uusiutumisen ja etäpesakemuodos-tuksen toteamiseksi kasvannaisen poistamisen jälkeen samoin kuin esimerkeissä 13 ja 15. Tulokset nähdään seuraavassa taulukossa.

67 68060 c ω Q) <ο ,χ

Γ-Η I—I

:t0 :tO -π

ϋ) O LD

W β •Η Ο ζρΛ! β -3 0) -Η κ >

td I

W -3 « ε ι -Η 3 -Η tn :to ρ g X Ρ 3 3

3 -Η ·Η ,-ν +J

Φ φ tn β 3 CU.X 3 Φ ή .—.

(0 λ: 3 β tn β -ι-) :π3 -—- 3 Φ β tn 3 β η ο ο ^ H Dj Η Ο :Φ \ tf 3 -Ρ ο \ « Ο) ΓΗ ο ^ (0 β tn α> to ^ tn β tn β ·· :Φ •h -h tn Ο) Λί β 3 ε ·· β β :Φ Ρ 3 ,Χ -3 > > -β -Ρ (0 Ρ g (0 -Η ι0 3 tn > 3Wtn :t0 a ρ tn -p tn cu tö tn ·· σι 3 · o o

P 3 .X m -3 ,Χ I" -P

3 P tn ρ tn to to ^- > · 3 > · -h tn ε ε 3 ε o to φ Ο Γ~~ -3 QO -H CU Φ .3 H U) λ; I" .X to O \ i tn tt i tn β ρ

3 O 00 φ \ .3 φ φ P

!X 3 -^r x; to ui tn φ -h p to tn •H β -3

3 (0 β O

p tn (0 CU

Λ tn to > to ·· tn tn to CU λ: tn φ p to ρ ·· x tn p > .X 3 to «) ρ .»s id β tn h tn > a β Φ tn tn -3 β β ·· cm ·· o —- to -3 x π X m > ε p ρ tn tn 3 > > · Ο <tJ :t0 -ρ ε ε c Λί ρ

3 OOP σι -3 β :tC

3 3 tn M ro Λί to -3 :r0 tn \ ι tn σι ι tn ή ε 3 o co φ \ σι φ -303 3> Η Η X ^3¾ ι» 3 Λ X X 3 X >ι Ή οχ β β Η σ> ' -3 β tn :ι0 Φ X r3 Ρ -3 \ Φ β ι—t 31 *3 ι—ι g -3 :t0 O tn η Ρ Ο ,Χ φ Ρ X ro >ι

β Φ II

ΟΟ X

X « X X β

Esimerkki 26 68 68060 Tässä esimerkissä kuvataan erittäin alhaisen molekyylipainon omaavan EMA-yhdisteen valmistaminen fraktioivalla liuotin/ei-liuo-tin-uutolla esimerkissä 1 valmistetusta EMA-polymeerista. Kahdeksasta EMA:n valmistuksesta saatiin öljypumpputyhjössä kuivaamalla 80°C:ssa yön yli 1 284 g EMAta. Näiden kahdeksan EMA-tuotteen omi-naisviskositeetit (1 %, DMF, 25°C) vaihtelivat 0,051:stä 0,058:aan (keskimäärin 0,053) ja niiden ekvivalenttipainot olivat ennen liuo-tinfraktiointia 134-142. Jokainen näistä kahdeksasta ajosta (160 g) liuotettiin 500 ml:aan asetonia ja saostettiin liuoksesta (4 litran dekantteri) sekoittamalla voimakkaasti Lightning-sekoittajalla lisäämällä 2,5 1 tolueenia 10 minuutin aikana. Saostunut EMÄ suodatettiin (kaikkien kahdeksan EMÄ:n emäliuossuodokset säästettiin myöhempää liukoisen polymeerin valmistusta varten) ja kiinteä aineet lietettiin kerran kahteen litraan tolueenia ja kaksi kertaa kahteen litraan heksaania, suodatettiin ja kuivattiin yön yli 50°C:ssa öljypumpputyhjössä. Kahdeksasta ajosta saatiin kaikkiaan 1 143 g liuottimeen liukenematonta EMÄ:a, jonka keskimääräinen ominaisviskositeetti oli 0,057 (se vaihteli välillä 0,053 - 0,060).

Primaarisesta emäliuossuodoksesta saatu asetoni-tolueeni-liukoinen yhdistetty polymeerifraktio konsentroitiin paksuksi öljyksi haihduttamalla kaikki liuottimet Rotavap-haihduttimessa kiehuvassa vesihauteessa 25-30 mm Hg tyhjössä. Jäännös liuotettiin 200 ml:aan asetonia ja saostettiin huoneen lämpötilassa 1 litralla tolueenia, jolloin saatiin öljymäinen, pehmeä massa. Päällä oleva neste dekantoitiin, ja sakka liuotettiin 200 ml:aan asetonia ja saostettiin jälleen 1,2 litralla ksyleeniä 0°C:ssa, jolloin saatiin valkea sakka. Se suodatettiin, pestiin kaksi kertaa 400 ml :11a ksyleeniä ja kaksi kertaa 300 ml :11a heksaania ja kuivattiin yön yli 50°C:ssa täydessä öljypumpputyhjössä. Saatiin 59 g tuotetta, jonka ominaisviskositeetti (1 %, DMF, 25°C) oli 0,031 ja laskettu keskimääräinen numeromolekyylipaino 342 ja titraamalla saatu ekvivalent-tipaino 172,0. C-% oli 60,92, 60,61 ja H-% 6,03, 6,12.

5 g edellä saatua EMA-fraktiota (ominaisviskositeetti 0,031, ekvivalenttipaino 172) muutettiin puoliamidi-puolikarboksyyliammo-niumsuolaksi esimerkin 2a menetelmällä, jolloin saatiin 5,4 g uuni-kuivattua (50°C, tyhjöpumppu) tuotetta. 5 g tätä tuotetta muutettiin 69 68060 osittaisimidiksi esimerkissä 3 kuvatulla tavalla keittämällä palautus jäähdyttäen ksyleenissä tunnin ajan. Kuivaa lopputuotetta (50°C, pumpputyhjö) saatiin 3,8 g. Se liuotettiin 70 g:aan vettä (pH 4,87) ja liuoksen pH säädettiin NH^OHrlla arvoon 9,4, liuos suodatettiin 0,2 ^um suotimella ja kylmäkuivattiin. Lyofilisoidun tuotteen 2,0-%:ksella vesiliuoksella oli pH 5,1, kokonais-N-% 12,27 ja imidi-pitoisuus 25,0 paino-%.

Tuotetta kokeiltiin Fischer-344 rotilla esimerkkein 13 ja 15 mukaisesti määrittäen FBCa-kasvannaisten poiston jälkeen henkiinjääminen, kasvannaisten uusiutuminen ja etäpesäkkeiden muodostuminen .

70 6806 0

G

cd

CD

<N X

CN rH :(0 :(0 -i—i WO tj-

W C

-P O

Xy\X

G -H

<D -P

K >

ro I

W -P

W g I

-P G -P

w :(0 -P g AC -P G 3

3 Ή -P ^ +J

(0 <D W G G

cda: g <d ή

ICJC G G WC

-P :(0 G CD

C W G G

•P CD O —'

I—I CD *H

O :(0 \ vd G -P o \

X Φ rH rH

G

<0 10 CD

GW W φ CD W — W X (0

G ·· G ·· I—I W

-H -H X CD X :(0 W

3 g PC P -Π (D

-P G > -H (0 > (0

JG -P (0 gW G -P

(0 G w r-~ G w r-' (D-P

jl, -p W - -P · - W CD

(0 W ·· ro G H ii+J

-P G AC m -p p r~ gw

G P W > -P -H

2 ^ > . G · GO

g g G (N g .p cd

CD O •'tf -P -- Ο -P W

rH rH ID AC rH ,X -H(0

0 \ I W KD I W W -P

G o in CD \ r- φ -p W

X I~\ x m ·φ X (0 -P

G <0

G G

H (0 G

G (0 (0 > (0 -P W W W >

X! W W (0 W

<0 ·. ·· X a}

CD X X AC

ό p p λ: p > > P ~

(0 (0 > CD

G W I" W t" -P

CD W *> W rH

G ·· <Tl ·· (T\ rH

•Η Λί CN X Γ0 w g P P 0 0

3 > > -P G

-P g g W G

G Ο I"- -1-1 Ο ·Η -H (0 •Ρ rH n AC Ο ιο ,Χ ο W \ I W rH I Μ CD ·Ρ

G OrHCU^xrHCl) W

d p (μ « ίο (n « c a: CD >1 o m G rH -p ** as Ui X ex •p e \ rH X (0 tn h X > g o w P - (0 o -P X «n

G CD

0 0 X

X X XX

71 68060

Tuotteen kyky stimuloida immuunivasteen syntymistä lisäämällä IgM-vasta-ainetta tuottavia soluja lampaan punasoluja vastaan (antigeeni) esimerkin 20 mukaisella menetelmällä määritettiin, jolloin saatiin seuraavat tulokset:

Rottien luku- IgM-PFC/lxlO^ Indeksi määrä ryhmässä pernasolua kontrolli = 1,0

Kontrolli 2 634 1,00

KoeX 4 1 173 1,85 x 30 mg/kg ip.

Esimerkki 27

Keksinnön mukaisten imidien natrium- ja kaliumsuolojen valmistus ja käyttö suoritettiin seuraavasti. Ammoniumsuolajohdannainen valmistettiin esimerksissä 1, 2a ja 3-IV-5 mukaisesti; kylmäkuivatulla tuotteella oli seuraava analyysi:

Kokonais-N-% 14,15, 13,99 N-% NH^-ryhmässä 6,16, 6,09 2-%:isen vesiliuoksen pH 6,28

Imidi-% (IR-analyysi) 20,5

Mekv. NH^/g (NH^-elektrodi) 4,31

Edellä olevan, keksinnön mukaisen imidin Na- ja K-suolat valmistettiin tavanomaisella ioninvaihtomenetelmällä käyttäen IRC-120 hartsia (Rohm and Haas) joko Na- tai K-muodossa. Kolonnit valmistettiin täyttämällä 400 ml IRC-120 (H+-muoto) hartsia sopivaan kolonniin ja käsittelemällä hartsia 3,8 litralla 1,0-m NaCl-liuosta (tai K-muotoa valmistettaessa 1,0-m KCl-liuoksella) ja sitten 4 litralla vettä. Edellä olevan, keksinnön mukaisen imidipitoisen polymeerin NH^+-suolan liuos valmistettiin liuottamalla 5,0 g polymeeriä 200 ml:aan vettä. Liuoksen pH säädettiin arvoon 8,0 laimealla NaOH:lla (tai vastaavasti KOH:lla). pH-säädetty liuos johdettiin vastaavasti Na- tai K-kolonnin lävitse nopeudella 15 ml/min, minkä jälkeen johdettiin vettä, kunnes kummassakin tapauksessa oli saatu 500 mi ef-luenttia. Efluenttien pH säädettiin HCl:llä arvoon 6,8 - 7,0 ja ne kylmäkuivattiin. Saaduilla kylmäkuivatuilla suoloilla oli seuraavat ominaisuudet: 72 6 8 0 6 0

Suolamuoto: NH^' Na+ K+

Saanto, gX - 5,47 5,80

Kokonais-N-% 14,07 7,77 7,00

Mekv. NH4+/g 4,31 0,034 0,036 NH4+ muuttunut suolaksi, % - 99,3 99,3

Cl-% - 1,25 1,22

Na- tai K-% - 10,45 17,08 x 5,00 g:sta NH4+-suolaa, sisältää NaCl:ää tai KCl:ää HClrllä suoritetun pH-säädön seurauksena.

Edellä saaduista suoloista monilla suoritettiin biologisia kokeita seuraavasti: (a) Lähtöaineena käytettyä NH4+-suolaa kokeiltiin Fischer 344 -rottien FBCa-kasvannaisiin määrittäen kasvannaisen poiston jälkeen henkiin jääneet, kasvannaisen uusiutuminen ja etäpesäkkeiden muodostumisen esimerkeissä 13 ja 15 kuvatulla menetelmällä. Saatiin seuraavat tulokset: 73 68060

G

φ φ ο\ χ

rH ι—I

:G

:G ·γ~ι Ο <η ω G •Ή Ο tr .X G -Η φ ·Η κ >

f0 I

tn -η ω £ ι G 3 Ή to :G -Ρ g -Ρ 3 3 2 -G ·Η ^ 4-1 G φ in G 2 3® -G ^

«ϋ d c tn G

-t_) :π3 — 2 Φ

G W 2 G

-G φ Ο <—I CX r-( o :G \ m

2 4-> o \ G

« Φ iH rH Φ Φ

,V

/—» g n] h

G tn tn :G

Φ tn ^ tn -m

G "G ·· :ttS

h -h χ φ λ; g g 2 H G G G Φ :tts •P 3 > -h > tn > rC -μ g ε (0 λ: -g

2 2 tn rH 3tno 2 :G

(X ·Η B - 4) ® ‘ 4-> (X

tts tn ·· 2·· tn 20 +1 2 -X Γ~ -G ,Χ t" 4-1 4-1 2 G tn g tn tn

G — > . 2 > · -G -H

ε ε 2 ε ω o

Φ o ui -G - m -g -g £X

r—I M oo 00 ,X G

O \ ι en m ι in CC

2 o ro φ \ to φ G Φ ΪΧ h in « ιη in (<; Gin

> -G

tn g

•G G G

2 G G Λ! G

4-) tn tn G

xl tn tn m > G ·· ·· g tn

α X X > G

G G G M

4-1 > > r-

G G

G tn m tn ro g (X

Φ tn tn -g ή 2 · * r · · tr -g — •G X ·# X *T 4-1 g G G 4-> in

2 > > Φ O :G

4-1 g g 4-) G G

2 o to -G eri -G tn G :G

•G ιΗ to ,v o m X -g g :G

tn \ ι in h ι in o g 2 O O φ \ (N Φ CX -G 3 D r-t ro ;X ro ro IX (ΛΧ G λ; 2

Φ £>1 ι—I

o G

G -ι "G * G

G tr> Φ X G .X 4-i

•G G \ G

r-t X G tr -G

Ή X > ε :g o tn h G - G O φ 4-i x tx ro

G Φ II

0 0 X

X iX X X G

74 6 8 0 6 0 (b) Edellä valmistettuja suoloja kokeiltiin määrittämällä niiden kyky stimuloida immuunivastetta edistämällä IgM-vasta-ainet-ta tuottavia soluja heterologisia erytrosyyttejä vastaan (SRBC, lampaan punaiset verisolut) esimerkissä 20 kuvatulla tavalla. Tulokset olivat seuraavat:

Polymeeri- Rottien lukum. IgM-PFC/lxlO^ Indeksi suolatyyppi ryhmässä pernasolua kontrolli = 1,0

Kontrolli 2 500 1,00

Ammonium (NH^+) 4 1 052 2,10

Kontrolli 4 534 1,00

Natrium (Na+)1 4 970 1,82

Kalium (K+)1 4 1 098 2,06

Kontrolli 2 538 1,00

Natrium (Na+)X 2 1 373 2,55

Kalium (K+)1 2 996 1,85

Natrium (Na+)xx 3 1 523 2,83

Kalium (K+)xx 3 1 058 1,97

Kontrolli 6 541 1,00

Natrium (Na+)1 5 1 254 2,32

Kalium (K+)1 5 1 044 1,93

Natrium (Na+)XX 6 1 607 2,97

Kalium (K+)XX 6 1 003 1,85 30 mg/kg ip. xx 30 mg/kg po.

Esimerkki 28

Alhaismolekyvlipainoinen EMÄ esimerkistä 1-E (ominaisvisko-siteetti = 0,063) muutettiin puolimonometyylisekundaarinenamidi-puolimonometyyliamiinikarboksylaattisuolaksi seuraavalla menetelmällä. 43,9 g (0,312 mol) EMA:a liuotettiin 440 ml:aan reagenssi-laatua olevaa asetonia, ja liuos jäähdytettiin kuivajää-asetonihau-teessa -78°C:seen. Tähän liuokseen lisättiin 71 ml (54 g, 1,74 mol) nesteytettyä metyyliamiinia ja vielä 100 ml asetonia, jotta tuotteen saostuessa muodostunutta lietettä voitaisiin tehokkaasti sekoittaa. Metyyliamidi-amiinisuolaliete sai lämmetä huoneen lämpötilaan (kaksi tuntia) ja sitä sekoitettiin yön yli, se suodatettiin 75 6 8 0 6 0 ja ylimääräinen amiini pestiin pois liettämällä tuote kolme kertaa asetoniin (3 x 500 ml). Tuote kuivattiin 35°C:ssa yön yli 20-25 mm Hg tyhjössä, jolloin saatiin 78,3 g (123,9 %:n saanto) EMÄ:n puoli-metyylisekundaarinenamidi-puolimetyyliamiinisuolaa. Saatu metyyli-amidi-amiinisuola (20,0 g) lietettiin ksyleeniin (400 ml) ja keitettiin siinä palautusjäähdyttäen ja sekoittaen viisi minuuttia samalla johtaen seokseen metyyliamiinikaasua ja poistaen vettä 0,75 ml. Liukenematon tuote suodatettiin, lietettiin kerran 400 ml:aan ksy-leeniä ja kolme kertaa 400 ml:aan heksaania, tuote suodatettiin ja kuivattiin 40°C:ssa 20-25 mm Hg tyhjössä, jolloin saatiin 16,4 g (85,2 %:n saanto) osittais-N-substituoitua imidi-johdannaista. IR-spektri osoitti imidifunktion kohdassa 1700 cm ^ ja sekundaarisen metyyliamidifunktion kohdassa 1645 cm sekä ionoidun C00 - ja amiinikarboksylaattifunktiot. Imidipitoisuudeksi saatiin 17,0 % standardi I/A-absorbanssikäyrästä (substituoimaton imidi/primaari-nen amidi) esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. N-% oli 11,41 ja 2-%:isen vesiliuoksen pH oli 8,70.

Edellä saatua N-metyyli-imidipitoista tuotetta kokeiltiin Fischer 344 -urosrotilla FBCa-kasvannaisten suhteen määrittämällä kasvannaisen poiston jälkeen henkiin jääneet, kasvannaisen uusiutuminen ja etäpesäkkeiden muodostus esimerkeissä 13 ja 15 kuvatuilla menetelmillä. Saatiin seuraavat tulokset: 76 68060

G

G) 0) ,α rH i—!

:3 -n A

WO Γ~ G

WC >

•H O

tP A O

G -H rH

α) ή

K > G

"H

Ή «0 I 4->

W Ή 4J

w g I a) •H 3 -r| 4-) ω :(0 4-) g w

A 4-) G 3 -H

3 -H -H ^ 4-) 0

GO) WC 3 CU

CL.A 3 Φ -H —

G A 3 G W G G

4-) WJ 3 1) Q)

GW 3 G G

•H O) O — -H

<—I iii I—I 3

0 :<0 \ m G

G 4-) O \ G

K (U H O 3 >

W

r— 3 3

G ω A

ω 3-^ w G W c •H -rH W a) A :3 g e ·· e g g A) 3 A -G > :3 Λ 4-) 3 (H £ 3 >

G 3 W > 3 W r~ -H

CU Ή W 4-) W » :3

3 W ·· O 3 >· (N CU

4-) 3 A m -H A r- O

3 G W G 4-) 3 ^ > · 3 > 3

G g 3 6 -G

0) o -H —· γ~~ -G o ή ή o a r- a a, O \ I w m I w 3 θοοθ)\οθφ c

A rH A CO Ό A <D

w

•H

G 3

3 3 3 G

4-) W W G

rG W W 3 3 ·· ·« £>

CU A AW

G G G 3

-P > > A

3 3 C

G 0) (-- (Dm r-- 0) <1) W ·> W ft 0)

C · (N ·· r~- -G A

G A m A m ^ rH

G G G :3 3 > > * W -n «0

G g O G

3 O O -H o -H G G :3 •H rH in A Ο ·*τ A GO) :3 W v\IWrH|W 3 W £ 3 O co Φ \ in φ A3

D rH rH A m <n A -H o A

W rH 3

A 3 rH

o O >, 4J

G rH I—I W G

- -H QJ

tP G 4-)

•G A G G

H \ C -G

<H (y> G :G

p 6 > H

g w a) 4-) X 0 3

G 0) m A II

0 0

« A X C

77 68060 EMA-raaka-aineen valmistus puolisuuressa mittakaavassa EMA-raaka-aineen valmistus suuremmassa mittakaavassa ja keksinnön mukaisten johdannaisten valmistus siitä suoritettiin seuraa-vien esimerkkien mukaisesti.

Esimerkki 29 EKA:n valmistus

Etyleeni-maleiinihappoanhydridkopolymeeria (EMÄ) valmistettiin 570 litran ruostumattomasta teräksestä valmistetussa autoklaavissa, johon liittyi initiaattorilisäystä varten 45 litran panostus-pommi ja lasivuoruttu sekoittimella varustettu reaktori, joka voitiin sulkea 11a huuhtomista varten ja jossa reaktantit sekoitettiin? autoklaavi oli varastettu turpiinisekoittimella, 75 mm:n poh-javenttiilillä ja vaipalla joko kuumentamista tai jäähdytystä varten. Kaikki kolme astiaa huuhdottiin kolme kertaa typellä ennen reaktanttien panostamista. Lasivuorattuun reaktanttisekoittimeen pantiin 343 kg etyylibentseeniä ja 30 kg maleiinihappoanhydridiä (MA). Seosta kuumennettiin 50°C:ssa, kunnes saatiin liuos. Tähän MA:n etyylibentseeniliuokseen lisättiin 2 340 g bentsoyyliperoksi-dia liuotettuna erillisessä astiassa 21 kg:aan etyylibentseeniä.

Edellä oleva reaktanttien etyylibentseeniliuos lisättiin sitten 570 litran autoklaaviin, jonka lämpötila vaipan avulla pidettiin 40°C:ssa ja johon johdettiin jonkin verran etyleeniä. Sekoitin säädettiin pyörimään nopeudella 125 r/min. Reaktanttien lisäämisen jälkeen reaktanttiastia huuhdottiin 2,7 kg :11a etyylibentseeniä, ja tulojohto suljettiin. Panostuksen jälkeen autoklaavin venttiili suljettiin ja autoklaavi saatettiin 414 kPa:n etyleenipaineen alaiseksi viideksi minuutiksi. Sulkimien paineet säädettiin kestämään 172-345 kPa yli reaktorin paineen. Panoksen lämpötila säädettiin 45 minuutiksi 75°C:seen säätämällä vaipan lämpötila 95°C:seen. Sitten reaktori saatettiin 1 380 kPa:n etyleenipaineeseen. Ajankohtaa reaktorin sisällön saavuttaessa 75°C:n lämpötilan pidettiin ajankohtana 0.

Katalysaattorilisäyspommiin vietiin 1 560 g bentsoyyliperok-sidia liuotettuna 28 kg:aan etyylibentseeniä. Edellä olevan reak-tioseoksen reagoitua 75°C:ssa ja 1 380 kPa:n etyleenipaineessa kolme tuntia siihen lisättiin toinen annos initiaattoria ja katalysaat- 78 6 6 0 6 0 torilisäyspommi huuhdottiin 1,8 kg:11a etyylibentseeniä. Toisen bentsoyyliperoksidilisäyksen jälkeen reaktoria pidettiin 75°C:ssa 1 380 kPa:n etyleenipaineessa vielä 14 tuntia eli kaikkiaan 17 tuntia. 17 tunnin jälkeen reaktioseos jäähdytettiin 25°C:seen, etylee-nipaine päästettiin pois ja reaktori huuhdottiin kolme kertaa typel-lä.

EMA:n etyylibentseeniliete laskettiin ulos pohjaventtiilin kautta keraamiselle Knutsche-tyhjösuotimelle, joka oli varustettu puuvillakangassuodattimella. Suodatin peitettiin muovipeitteellä ja huuhdottiin typellä. Suodatinkakku lietettiin uudelleen 136 kg:aan ksyleeniä, sekoitettiin siinä 15 minuuttia ja suodatettiin. Sama toistettiin ksyleenin kanssa kolme kertaa ja sitten heksaanin (102 kg) kanssa kolme kertaa. Viimeinen märkä heksaanikakku levitettiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuille tarjottimille ja kuivattiin 50°C:ssa Devine-tyhjätarjotinkuivurissa 48-72 tuntia eli kunnes ksyleenin hajua ei enää tuntunut. Saatiin 35,4 kg (82,8 %:n saanto) kuivaa tuotetta. Kaikkiaan suoritettiin neljä eri suuruista valmistuserää, joista edellä kuvattu oli valmistuserä 3.

Erä n:o Lämpötila °C Saanto, kg Qminaisviskositeetti (1 % DMF, 25°C) 1 70 11,3 0,063 2 75 22,7 0,053 3 75 35,4 0,051 4 75 11,3 0,052

Esimerkki 30

Ammonoidun EMÄ:n osittaisimidin valmistus EMArn (esimerkin 29 tuote) ammonointi ja imidointi suoritettiin 380 litran lasilla vuoratussa Pfaudler-reaktorissa, joka oli varustettu poisvedettävällä siipisekoittimella ja estesysteemillä sekä ruostumattomasta teräksestä valmistetulla tislauskierukalla ja jäähdyttimellä, joiden avulla saatiin vaihtoehtoisesti konden-saatti kokonaan poistettua tai mikä tahansa tislefraktio palautettua reaktoriin. Systeemi oli varustettu kahdella toisistaan riippu-pumattomalla syöttölinjalla, joista toinen oli ammoniakkia varten ja toinen nestettä varten ja molemmat sijaitsivat siten, että ne liittyivät reaktoriin sekoitetun reaktioseoksen pinnan alapuolella. Kumpikin johto oli varustettu hylsysuodattimella ja rotametrilla 79 68060 virtausnopeuksien mittaamiseksi ja säätämiseksi. Reaktorin vaipan avulla voitiin sekä kuumentaa käyttäen painehöyryä että jäähdyttää. Nesteiden sisäänjohtoputki liittyi 95 litran lasilla vuorattuun Pfaudler-reaktoriin, jossa EMA-raaka-aine liuotettiin asetoniin ennen liuoksen lisäämistä 380 litran ammonointireaktoriin. 380 litran reaktorista lopputuote laskettiin ulos pohjassa olevan venttiilin kautta peitettyyn ruostumattomasta teräksestä valmistettuun Knutsche-tyyppiseen tyhjösuotimeen.

Tyypillinen ammonointi ja osittaisimidisointi kuvataan seu-raavassa.

380 litran reaktoriin panostettiin 132,5 litraa (102 kg) suodatettua asetonia ja 95 litran liuosastiaan pantiin 81,4 litraa asetonia ja 21,3 kg EMA-kopolymeeria (valmistettu esimerkin 29 ajossa 4) ja niitä sekoitettiin 20-30°C:ssa, kunnes EMÄ oli täysin liuennut. Samanaikaisesti 380 litran reaktoriin johdettiin asetonin pinnan alle ammoniakkia nopeudella 0,159 kg/min viiden minuutin ajan. Sitten edellä valmistettu EMA-asetoniliuos lisättiin paineella johdossa olevan suotimen lävitse 40 minuutin ajan lineaarisen virtausnopeuden ollessa 2,0 kg/min sekoitettuun asetoni-NH^-liuok-seen 380 litran reaktoriin nestepinnan alapuolelle. 380 litran reaktoriin johdettiin koko EMA:n lisäyksen ajan ammoniakkia nopeudella 0,16 kg/min. Tänä aikana reaktioseoksen lämpötila sai kohota 44-55°C: seen, eikä seosta jäähdytetty ulkoisesti. EMA-lisäyksen päätyttyä ammoniakkia johdettiin edelleen 15 minuuttia nopeudella 0,16 kg/min. Saostunut ammonoitu-Ema-liete jäähdytettiin sitten 25°C:seen ja laskettiin tyhjösuotimelle kiinteän ammonoidun tuotteen talteenottamiseksi.

Suodatettu ammonoitu tuote, puoliamidi-puoliammoniumkarbok-sylaattisuola lietettiin peräkkäin (20 min) 3 x 178 litraan asetonia, jolloin jokaisen liettämisen välillä suodatettiin, ja sitten 2 x 178 litraan heksaania, ja tuote suodatettiin, jolloin saatiin heksaanipitoinen suodatuskakku. Osa kakusta kuivattiin analyysiä varten. IR-analyysi osoitti, ettei tuote sisältänyt anhydridiä, vaan että se sisälsi vain amidia ja ammoniumkarboksylaattisuolaryh-miä. Sen 2,0-%:isen vesiliuoksen pH oli 5,88. Suoritettiin viisi tällaista ajoa käyttäen erilaisia EMÄ:n määriä, kuten seuraavassa taulukossa nähdään. Edellä kuvattu koski ajoa 5.

80 680 60 *3* If) ι—I I—I ΓΠ vo in ld oo σι <A° r- v *r ^ 1 (N cn ro m no

2 Ή I—I I—I I—I <—I

:(0

CO

CO

0) Ό ·ί h co h to <D no cn r- oo > » ·> » - *

LD VO VO LO LD

CAP

CM

•H K

CO Ch

rH

>1 I—I fTj (0 t—h CO :n3 :nJ :(0 :<0 :/0

!0 3 C C C C C

w di ui w m in G I :(0 :(0 :(0 :(0 :(0

d) “f" I—i (—I I—I I—I I—I

0) rr

-P ffi C C C C C

P 2 O O O O O

0 P

-P :(0 :(0 :(0 :(0 :(0

G C G C C

G (0 CO CO CO CO

(0 -H :(0 :(0 :(0 :(0 :(0 *0 (—I I—I 1—I rH (—1

•Η -H

P B G G G G G

W < O O O O O

•H

Ό :(0 :(0 :(0 -’(0 :(0

H G G G G C

p to to to to to Ό :(0 :(0 :(0 :<0 :(0

I—I I—I rH r—I I—I

si C ‘Η *H -Η -Η Ή

< <D<U<D<D<U

G

1 P Η -X

Λ (0 Cn

•h x χ σ\ (N

G X ^ ^ ^ <0 G * KocNOPi

(0 0):(0 2<nldo>S

to to p X -H :(0 GJ O :(0 π -P g >1

>1 I +J

-P :(0 +J

-P :(0 tJ> <1) 0 £ JX vf o m Ο) ιη +j

P 1 r ' r V ^ ,H

>i < - m h in m h p :(0 Su :(0 i—t (—I rvj :<0 «WP :(0 £

1 O -H

G ·· <1)

•H C

O I

GO h n n <i m 0 to « 1 “ z

< -p X

81 68060

Edellä valmistetut heksaanipitoiset ammonoidut EMA-kakut käytettiin suoraan imidointivaiheessa, jota kuvataan seuraavassa koskien ajon 5 imidointia.

Heksaanipitoinen ajon 5 suodatuskakku vietiin 380 litran reaktoriin, joka sisälsi 144 litraa tclueenia (124,7 kg) ja 72 litraa (62,6 kg) ksyleeniä. Heksaani-tolueeni-ksyleeniliuottimessa oleva ammonoitu EMA-liete kuumennettiin kiehuvaksi samalla johtaen seokseen vedetöntä ammoniakkia 0,02 kg/min. Seos saavutti palau-tustislauslämpötilan 82°C:ssa ja sen sisältämä vesi poistu kaikki atseotrooppisesti, sitten tislautui heksaani, kunnes reaktioseok-sen lämpötila oli 115°c. Reaktiolämpötila pidettiin tämän jälkeen 115-116°C:ssa tarpeen tullen lisäämällä tolueeni/ksyleeniseosta 2:1 (tilavuus/tilavuus), jolloin imidoinnissa syntynyt vesi poistui. Keittämistä palautusjäähdyttäen jatkettiin 7,5 tuntia veden poistuessa tällöin atseotrooppisesti, ja seokseen johdettiin koko ajan ammoniakkia nopeudella 0,02 kg/min, kunnes haluttu imidinmuo-dostus oli saavutettu. Imidinmuodostusta seurattiin IR-analyysin avulla (ks. seuraavaa taulukkoa).

Kun haluttu imidimäärä oli muodostunut, reaktioseos jäähdytettiin ja suodatettiin edellä kuvatulla tavalla ja erotettua imi-dipitoista tuotetta käsiteltiin samoin kuin edellä liettämällä 3 x 155 litraan (20 min) tolueenia ja sitten 2 x 119 litraan (20 min) heksaania. Lopullinen heksaanipitoinen suodatinkakku kuivattiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuilla tarjottimilla tyhjössä (öljypumppu) 50°C:ssa 72 tuntia tai kunnes tyhjöuunin paine oli 50°C:ssa alle 3 torr.

Kaikkiaan suoritettiin neljä ajoa, jotka vastasivat ammonoi-dun EMA-tuotteen ajoja 1, 2, 4 ja 5. Näitä ajoja koskevat tiedot on koottu seuraavaan taulukkoon.

68060 Q 2 to tn tn + N Γ-H CN ι—I «θ' EC ι—I CN Ο <Τ\ S -*-- ui m ιη ί1

dP

2 •

dP dP

I I

<2 O

S ι +J

ω tn « n cn ® C

•H CN CO ι—I CN (0 3 (0 «· « *. · (0 PC ro ro ro ro tn

•HO »H »—I rH ι—I

O M C

CO -P

O X -P

g O) ε -p

B I -H

* o

c c o I

(U0)3 vo H

G tn-h K ro n* ro cn -H

•H Ή rl 0j · ^ ·> O ·· -h uo m ld m nj P op tn c tn •h ι a> tu tn

a cn > tn -H

•H G

Ό Ή •H dP 3 ε ι ω •h -h —. uo ld o m Ό DS *·**·»· · G -H H O rH ι—ι o o

-P ε ~ CN (N CN (N G

-PH -H

(ti G

> a H ** cc — λ; -p u •H (0 ^ ^ ^ p CC vo h oo σν o G tn » - *> ·> +j D Γ' Γ' C3V Ν' rö X vo r> oo oo ro +)171

P X

tu O (N O O u +J Ν' Ν' O VO o O - o G N· VO Γ~ H to

En pH CN —'

G

>1 I G

+J :rt5 -p +J :t0 tri n o σν ro <0 <U έ .X v ' >

-P I K) 1^ Lf) rl -H

>1 <0 - H CN G

:tt3 S3 »O X

X W H -H

c c

O D

•ro H CN N LO

<C X

tl 83 68060

Edellä saatujen uunikuIvattujen tuotteiden vesiliuosten pH:t. säädettiin 9,5:een airauoniurahydroksidilla, liuokset steriilisuoda-tettiin 0,2 ^,um suotimella seerumipulloihin ja lyofilisoitiin lopulliseen käyttömuotoon. Näiden neljän ajon lopulliset analyysit esitetään seuraavassa. Tulokset poikkeavat edellä esitetyistä johtuen karboksyyliryhmien uudelleenammonoitumisesta, jotka karboksyy-liryhmät uunikuivatuksessa menettivät ammoniumryhmiä.

Ajo Imidi-% (IR) 2-%risen vesi- N-% N-% NH^+:ssa

liuoksen pH

1 18,0 5,96 13,78 5,95 2 20,8 6,00 13,96 5,74 4 18,5 6,69 14,54 6,23 5 20,0 6,46 14,20 6,13

Esimerkki 31

Imidiä sisältävän ammonoidun EMA:n laboratoriosynteesi AEMA-heksaanipitoisesta kakusta suoraan ksyleenissä ilman kuivatusta

Laboratoriomittakaavassa suoritettiin kokeita lisäämällä asetoniin liuotettuna EMA:a eri pituisina ajanjaksoina asetoniin, johon johdettiin ammoniakkikaasua erilaisin nopeuksin, jolloin lämpötila sai kohota huoneen lämpötilasta (23-25°C) 50-53°C:seen. Saostunut ammonoitu EMÄ suodatettiin ja liete pestiin heksaanilla ja suodatettiin. Heksaanipitoinen ammonoidun EMÄ:n suodatinkakku lietettiin sitten ksyleeniin ja lietettä kuumennettiin veden poistamiseksi kahdessa vaiheessa: (1) NH^:n ja asetonin reaktiossa syn-tynyttä vettä poistettiin atseotrooppisesti tislaamalla 75-102uC:ssa, (2) ammonoidun EMA:n osittaisimidoinnissa syntynyttä vettä poistettiin heksaanin poistamisen jälkeen 122-132°C:ssa. Osittaisimidi saatiin suodattamalla liete ja pesemällä se ksyleenillä ja heksaanilla. Ajoja suoritettiin 12 ja niiden tulokset nähdään jäljempänä olevassa ensimmäisessä taulukossa. Seuraava kuvaus koskee taulukossa olevaa ajoa n:o 10.

Esimerkin 29 ajon 1 EMA:a (80 g, 2,0 mol) liuotettiin 1,1 litraan asetonia ja liuos suodatettiin paperisuotimella. Tämä EMÄ:n asetoniliuos lisättiin 45 minuutin aikana sekoittaen 2,4 litraan asetonia viiden litran pullossa, joka oli varustettu palautusjääh-dyttimellä atseotrooppista tislausta vasten, lisäyspullolla ja si- 84 68060 säänjohtoputkella ammoniakin sisäänjohtamista varten. EMA-asetoni-liuoksen ja ammoniakin tuloputket olivat viiden litran pullon nestepinnan alapuolella. Ammoniakkia johdettiin reaktioseokseen koko 45 minuuttia kestävän EMA-lisäyksen ajan ja vielä 10 minuuttia sen jälkeen nopeudella 0,081 mol/min, kaikkieen 4,44 mol. EMA-lisäys aloitettiin huoneen lämpötilassa (23°C), ja reaktioseoksen lämpötila sai kohota koko 45 minuutin ajan, sillä reaktiosesta ei jäähdytetty. Ammonoidun EMA-lietteen lopullinen lämpötila oli 53,5°C. Am-monoitu tuote suodatettiin, lietettiin 2x2 litraan (30 min) asetonia ja sitten 2x2 litraan (30 min) heksaania ja suodatettiin. Heksaanipitoinen kakku lietettiin kuivaamatta 2,7 litraan ksyleeniä veden poistamiseksi siitä ja sen osittaisimidisoimiseksi. Ammonoi-dun EMA:n heksaani-ksyleenilietettä kuumennettiin palautusjäähdyttäen veden poistamiseksi siitä atseotrooppisesti kahdessa vaiheessa. Koko prosessin ajan lietteeseen johdettiin jatkuvasti ammoniakki-kaasua nopeudella 0,030 mol/min. Veden poistuminen alkoi 88°C:ssa ja lämpötila kohosi 60 minuutin kuluessa 101°C:seen, jolloin vettä oli poistunut 9,1 ml. Kuumennusta jatkettiin, jolloin heksaani poistui, ja imidinmuodostuksessa syntynyttä vettä alkoi poistua 125°C:ssa. Imidoinnissa syntynyttä vettä poistettiin atseotrooppisesti 60 minuutin ajan 125-132°C:ssa, jolloin saatiin 6,9 ml vettä. Imidoinnin päätyttyä liete jäähdytettiin 100°C:seen, suodatettiin, pestiin liettämällä 30 minuutin ajan 2 litrassa ksyleeniä ja suorittamalla sama toimenpide vielä kaksi kertaa 2 litrassa heksaania (30 min) ja sitten tuote suodatettiin. Suodatettu tuote kuivattiin 15 tuntia 50°C:ssa öljypumpputyhjössä (3 mm Hg). Tuotetta saatiin 314 g (94,5 %:n saanto). 12 ajon tulokset nähdään seuraavassa taulukossa. Käyttövalmiiseen muotoon uunikuivattu tuote saatettiin liuottamalla se veteen (2-5 %), säätämällä pH NH4OH:lla arvoon 9,5, suodattamalla 0,2 ^utn suotimella ja lyofilisoimalla seerumipullois-sa. Seuraavassa esitetyssä toisessa taulukossa on saatujen uunikui-vattujen ja lyofilisoitujen tuotteiden ominaisuudet.

85 68060 C r^r-inr^CTi^romtNintoo G (0 ^ G g cö c*° ro-rotNrorH^^ixjvoTTrr^r 4J 44 "—' α>σ\σ\σϊθ<τισ\ζ2>σ\(?\<τι<τ< +J «0 Q) G > 4-1

(0 -H O (Nt^LOrHinnmc^tTi^iricN

(ί |3 3 tJl pH O O pH Ο i—li—li—I)—li—I pH pH

U) X 4-> mmmmrnmmmmmcnm I—I ^0(Ν[^ιΗίΓ)ι-ΗΟ00Γ^<Τι00Γ~

X E

OX VOCOt^r^rpr^l^VOVOVOVOVO

-P X

c0 .TO C

*H -P Ή 0 to g LnmLnLnr^LnoroLnocoun d, -h (omwoOhr'O^'O^i/iio 1 13 (0 ο -π λ:

(Ng -H

K -h c

X

X

pH yin-irvDC^rH^r^ni-Hvo'^

rH

O g ^νοιηοα^οΗΟοοοοσισ'ιΓ-- π3

·· (N CN (N) (N rH I—Ιι—I

c £S

«H

o ω

-P

tn G 1 (

•H *H

0 ε c di οοιηιηιηιηιηοοοοο o 1 (0 mNNHMcor'WWW'CW -n O -X Ή rH rH (0

P4 -H

K < σι

(N

:(ö G

I U -H

O :(0 λ;

λ; :(0 P

g tn inmon'Tj'Tf^f'i' φ

Ctno^ra^Lnoco^D^r^r^r^T^r g CO -h >) HiOvDijoinLnLn^^^T'^'^^^ co :(0 rH G 0) to 0 0

•H 2 ΛΙ rH

pH O U

ε u o CG 0 σι •H (O-HO'S’tOCTvtNLnr^^HrHpHf-HrH O O ΓΟ

X G g t£5 tD to CO Γ^Ι^Γ'-αΟΟΟΟΟΟΟΟΟ ·> (N rH

(0 Φ \ OOOOOOOOOOOO N H I

•H di i—I ICN

G 00OOOOOOOOOOOO 3 O (N

0 52 ε -H 00 pH

g 4-1 -P -P

<i 4-i (0 (0 (0 G O > > Ή ·Η 4-1 ·Η ·ρ4 (OgooooomomLntninLn >,ρΗρΗ

G oocrcoor^OOinmintnin to O O

o (0 pH i-4 λ: XX 4-1 44 O *p4 (0 (0 (0

^ (0 CO i—li—I

CO -H -H -H 4J 44 1 O :0 :0 X -t-ι dl di >i - (0 g ε

:(0 G TO TO

CO X (0 rH -H

•h-h οοοοιηιηιηιηιηιηιηιη co

i—I (0 CO -H -H

I -H ,Μ X

<C G G XXX

2* 0) 'pI Ή -pH -H

m co ε (0 ta ta X w «

O O X

•Γ-l·· rHiNrO-^Ln^l^-OOCTiOrHCN XX

< G pH pH pH XXX

Esimerkin 31 tuotteiden ominaisuudet 86 68060

Ajo Uunikuivattu tuote Luofilisoitu tuote

2-%:isen vesi- Imidiä, paino-% 2-%risen vesi- Imidiä, paino-% liuoksen pH liuoksen pH

1 5,28 21,5 6,20 17,9 2 4,89 23,2 6,12 21,6 3 4,92 25,2 6,09 22,2 4 4,98 23,2 6,23 19,9 5 5,01 22,8 6,16 21,5 6 5,10 23,5 6,22 20,8 7 5,02 23,0 6,25 19,5 8 5,12 24,0 6,14 19,3 9 5,12 23,5 6,18 19,0 10 5,07 22,5 6,06 18,8 11 4,99 22,2 6,18 19,0 12 4,96 23,2 6,10 19,5 x IR-analyysillä.

Kaikkien edellä olevien valmistuserien (noin 4 000 g) seoksella oli seuraava analyysi:

Uunikuivattu tuote: 2-%:isen vesiliuoksen pH 5,02

Imidiä: 23,5 paino-%

Lyofilisoitu tuote: 2-%:isen vesiliuoksen pH 6,00

Imidiä: 19,5 paino-%.

Kahden 2 000 g:n erän pH säädettiin NH4OH:lla arvoon 9,5, liuokset steriilisuodatettiin ja lyofilisoitiin seerumipulloissa, 0,5 g/pullo. Näin saatiin kaikkiaan 8 000 pullollista tuotetta eläimillä tai ihmisillä suoritettaviin kokeisiin.

Näin pullotetun tuotteen analyysi oli seuraava: 2-%:isen vesiliuoksen pH 6,27

Imidi/amidi-absorbanssi, IR-analyysi 0,888

Paino-% imidiä 19,3

Kokonais-N-% 14,49 N-% NH4+-ryhmässä 6,27 87 6 8 0 6 0

Esimerkki 32 Tässä esimerkissä käytettiin esimerkissä 20 kuvattua menetelmää, jonka avulla arvioitiin normaalien Lewis-rottien kyky stimuloida immuunivastetta lisäämällä IgM-vasta-aineita tuottavien solujen muodostusta heterosyklisiä erytrosyyttejä vastaan (lampaan punaiset verisolut, SRBC). Esimerkistä 20 poiketen tässä esimerkissä keksinnön mukaista imidipitoista yhdistettä annettiin häntälaski-moon suonensisäisenä ruiskeena 1 mlrssa fysiologista keittosuola-liuosta, joka sisälsi esitetyn määrän yhdistettä. Kaikki muut yksityiskohdat olivat samat kuin esimerkissä 20. Kahdessa kokeessa saatiin seuraavat tulokset.

83 68060

un +J

I I G

> O O

H -H X -.

I 4-1 ’—" I—! ΓΟ 3 Ο σϊ ID m i—I Γ'· i—i no to π3·Η|| o uo^cniocOi—ilocti :3 p—I (0 —

p 3 λ; ·η γη (NtNonmcNtNmiH

to E ®H

-Η -Η Ό H -V 4J G 0

G Cfl -H G

(D

e

•H ID

to o

0 I—I

X <0 X

-H r-t 3 <N tOlN’itNOOOTl'iM

G \ i—l CN OOOOOOOOOO-d-CN

(DUO m -^(nudoocn·—ιαοο

0) Cn CO

^ pL( 3 I—I I !l ll (l—I I—1| ll—I

-H S G

Ο (Τ' Φ CG H O4

< P

1 I c

H O O

> I 4-> — I—I Ο ιΗΓΜΙΟΟ'^τΤΟΊΓ'·' t— 03 o mOi—li—iocnooo 3 -H || - --''****

:3 .-1 10 I—l CNCNCNCNCNCNCNrH

-P 3 X -H

CO g <U iH

•Η -Η Ό I—I

•X P C O

G W -H G

<1) H id :3 :3 to O to to O I 10 to X ft :3 :3 H rH 3 X g g G \rH cn ooooLnoo-a'r'-mi-i ,5 ,3 (DUO id cyimiHr'-^Lnr'CN >ί>ί

CJCntO LT) CNi—I CN I—li—ICNi—to GG

p ^ te .G G I—I rH I—li—li—li—li—li—I :3 :3

Ή S G P -P

O Cn <D G G

(¾ H Oj -H -H

:3 :3

--—· rH I—I

- *H Q)(D

> Ή

•H I—I U~> I—I Ή *rH

^ O -- κι in

OGCNlDCO^r-Jr-IOO -Η X

to cn P m H -G 3 ο λ; c > λ: c \ o c cn λ: x

< £ — XX

89 6 8 0 6 0

Esimerkki 33

Keksinnön mukaista edullista etyleenin ja maleiinihappo-anhydridin kopolymeeria, jonka molekyylipaino oli noin 850, ja josta oli valmistettu puoliamidi-puoliammoniumryhmiä sisältävä johdannainen ja siitä noin 20 paino-% imidiryhmiä sisältävä johdannainen (olennaisesti kuviossa 1 esitetty kopolymeeri), kokeiltiin ihmisillä. Useita kuukausia kestäneessä 72 potilaan vaiheen I kliinisessä tutkimuksessa, joilla potilailla oli ruuansulatus-elinsyöpä (mahalaukun, haiman, paksusuolen ja peräsuolen syöpä) ei havaittu olennaista myrkyllisyyttä lääkettä annettaessa intra-peritoneaalisesti, oraalisesti tai intravenöösisti. Taudin etenemisessä lääkeannon jälkeen ei havaittu nopeutumista.

Claims (9)

90 68060

1. Menetelmä immunosäätövaikutusta omaavan kopolymeeri-johdannaisen valmistamiseksi kopolymeerista, joka koostuu olefii-nimonomeerista, jossa on noin 2-4 hiiliatomia, ja *,,/* -tyydyttämättömästä dikarboksyylihappoanhydridistä, jossa on 4 - noin 6 hiiliatomia, tunnettu siitä, että mainitun kopolymeerin puoliamidi-puoliammoniumsuolajohdannainen, jolla kopolymeerilla on molekyylipaino noin 300-1500, saatetaan reagoimaan ammoniakin kanssa orgaanisessa liuottimessa palautusjäähdytyslämpötilassa sellaisen kopolymeerijohdannaisen valmistamiseksi, joka sisältää sekä (a) puoliamidi-puoliammoniumsuolaryhmiä että (b) imidiryh-miä, joiden osuus mainituista johdannaisryhmistä on noin 5-40 paino-%, ja mahdollisesti puoliammoniumsuolaryhmä muutetaan muuksi farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaryhmäksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että orgaaninen liuotin on ksyleeni tai tolueeni.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että olefiinimonomeeri on etyleeni.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että polykarboksyylihappoanhydridi on maleiinihappo-anhydridi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että olefiinimonomeeri on etyleeni ja polykarboksyylihappoanhydridi on maleiinihappoanhydridi.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kopolymeerin keskimääräinen molekyylipaino on noin 850.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että puoliamidi-puolikarboksylaattisuolaryhmä on puoliamidi-puo1iammoniumsuolaryhmä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että imidiryhmän osuus johdannaisryhmistä on noin 10-25 paino-%.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että lämpötila on noin 50-200°C, edullisesti noin 60-150°C ja edullisimmin noin 100-150°C.