CN116178702A - 一种叶酸靶向的新材料、叶酸靶向tgx221脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，涉及抗肿瘤药物的制备，特别是指一种叶酸靶向的新材料、叶酸靶向TGX221脂质体及其制备方法和应用。通过化学合成的方法将FA与CHEMS接枝到H2N‑PEG‑NH2上合成一种新型的叶酸靶向材料，再通过优化脂质体处方，制备一种具有叶酸介导靶向的TGX221脂质体。体内外实验的结果表明，叶酸介导靶向TGX221脂质体可以更特异性的抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡和周期阻滞，较游离TGX221和非靶向TGX221脂质体具有更好的抗前列腺癌作用，也进一步揭示其优异的肿瘤靶向作用。

Description

一种叶酸靶向的新材料、叶酸靶向TGX221脂质体及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及抗肿瘤药物的制备，特别是指一种叶酸靶向的新材料、叶酸靶向TGX221脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
前列腺癌（prostate cancer, PCa）是最常见的男性恶性肿瘤之一，是发达国家男性癌症死亡的第二大主要原因。据统计，2013年全美有24万例新诊断的前列腺癌患者，且大约有3万人死于前列腺癌。根据前列腺癌的临床分期和危险程度，其治疗手段包括：主动监测、外科根治性切除、放射治疗、化学药物治疗、内分泌治疗及疫苗的应用。化疗，是除手术和放射治疗外，仍是治疗肿瘤疾病的主要治疗方法。但目前抗癌药物存在以下难以克服的缺点：首先是此类药物水溶性差，不能有效地通过体液环境运输至肿瘤靶组织；其次，即使部分能溶于水的抗癌药物，也普遍存在血液半衰期过短、无主动靶向性、对正常细胞毒副作用大等问题。这些缺点严重的限制了化疗药物在临床中的应用。因此，如何识别和预防这些治疗过程中药物引发毒副作用成为提高药物的疗效和患者的生活质量的关键。
脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术，它是将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。因其脂质双分子层结构与细胞结构类似，可透过血管内皮细胞到达靶向病灶部位。同时，它可改变被包封药物的体内分布，使其更多的在病灶部位堆积释放，减少在其他正常组织的释放，在提高药物的治疗指数的同时，降低对非病灶组织的毒副作用，达到靶向给药的目的。在制备脂质体药物的基础上，采用聚乙二醇（PEG）对脂质体表面进行一定的物理修饰，可以制备隐形的脂质体纳米粒，能够避免脂质体被单核吞噬细胞系统巨噬细胞所识别和吞噬，明显延长脂质体药物在体内的作用时间，而且在一定程度上，提高了治疗效果。
目前治疗PCa的一种有吸引力的方法是用特定配体对脂质体进行表面修饰，使其与肿瘤细胞表面的过度表达受体，例如叶酸（FA）受体。研究发现，叶酸受体过度表达于许多实体肿瘤细胞表面，包括前列腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、子宫内膜癌及结直肠癌等，但其在正常组织细胞表面几乎不表达。细胞表面的叶酸受体可通过配体-受体的特异性识别结合作用与叶酸或叶酸偶联的物质识别并与之结合。将 FA 靶向材料与药物载体偶联后，制备叶酸靶向脂质体，并通过肿瘤细胞表面 FR 介导的特异性内吞作用来实现抗癌药物的主动靶向输送功能。
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是一个调节多种信号通路的细胞内信号分子家族。哺乳动物细胞中有三类PI3K亚型（I、II和III），其中I类PI3Ks p110a和p110b广泛表达，敲除小鼠中这两个基因中的任何一个都会导致胚胎致死。最近，我们发现p110b在前列腺癌组织和细胞系中的表达水平明显高于p110a，p110b在雄激素刺激的细胞增殖、AR介导的基因表达和裸鼠AR阳性前列腺癌细胞异种移植物的异种肿瘤生长中至关重要。与周围的非恶性前列腺组织相比，恶性前列腺组织中p110b的表达显著升高，以上表明以p110b为靶点是前列腺癌治疗的潜在方法。TGX221是一种合成的小分子抑制剂，与其他类型的IA PI3Ks相比，它对p110b具有极好的亚型特异性。而且它已成功用于动物模型，以抑制体内p110b活性。然而，TGX221的水溶性很差，需要有机溶剂，如二甲基亚砜和丙二醇，用于静脉注射，这些溶剂具有显著的心脏毒性，并可能导致昏迷、心律失常和心跳骤停。因此，非常需要这种化合物的癌症细胞靶向和水溶性配方，以供我们使用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种叶酸靶向的新材料、叶酸靶向TGX221脂质体及其制备方法和应用，用于递送PI3K抑制剂（TGX221）的pH敏感的脂质体给药系统。
本发明的技术方案是这样实现的：
首先我们合成叶酸靶向材料---叶酸-聚乙二醇-胆固醇的半琥珀酸盐FA-PEG-CHEMS，作为靶向材料，利用其能与肿瘤微环境中的叶酸受体特异性结合，进而将药物特异性递送至癌细胞和在癌细胞内实现靶向药物释放。其结构式如下：
Figure SMS_1
FA-PEG-CHEMS合成路线如下：
第一步先将 FA 与 H2N-PEG-NH2连接合成 FA-PEG-amine；第二步再将胆固醇和NHS 连接生成 CHEMS-NHS；最后将 FA-PEG-amine 和 CHEMS-NHS 进行偶联，最终生成 FA-PEG-CHEMS 目标产物，技术路线如下：
Figure SMS_2
具体步骤为：
（1）FA-PEG-bis-amine 的合成：精密称取 12-35 mg 的FA溶于1 mL DMSO 中，再依次加入 7-21 mg DCC、4-12 mg NHS 和 16-45 mg TEA，在室温条件下，通入氮气，避光搅拌1 h 后，再加入76-220mg H2N-PEG-NH2，避光搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物，7000 ×g 离心10 min 后取上清1 mL；在上清中加入3 mL 50 mM Na2CO3，10000 ×g再次离心 10 min，吸取上清4 mL；将上步所得产物过 Sephadex G25 柱进行纯化，去除未反应的 FA 和 H2N-PEG-NH2等小分子量的副产物。纯化后的产物于-20℃冻存4h后，再冷冻干燥24 h – 48 h。
（2）CHEMS-NHS 的合成：将1-3.2 g CHEMS、0.4-1.5 g NHS 共溶于20 mL THF 中；取1.25-4 g DCC 溶于10 mL THF 中，加入第一步反应液中，在室温条件下，搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物过滤弃残渣，将滤液倒至梨形玻璃瓶中，放置于旋转蒸发仪上，于35℃旋转蒸发除尽 THF 约30 min – 40 min；残余物加异丙醇和THF（1:2 v/v）溶解后再重结晶；将重结晶的产物进行过滤，再置于真空干燥箱中真空干燥 24 h。
（3）FA-PEG-CHEMS 的合成：取120-150 mg FA-PEG-bis-amine（40 µM）与25-32 mgCHEMS-NHS（50 µM）共溶于50 mL CHCl3，室温避光反应过夜（约24 h）；待反应结束后，于37℃减压旋转蒸发除尽 CHCl3，约30 min – 40 min；上述残余物再加50 mM NaCO310 mL室温水化30 min，再于4000 ×g 离心10 min后取上清，去除杂质；将上清装入14 KDa透析袋于超纯水中透析72 h 除去小分子量的副产物（每24 h更换一次超纯水）；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理（约48 h）。
叶酸靶向材料将用于后续叶酸靶向TGX221脂质体的制备方法，步骤如下：
1）含 TGX221非叶酸靶向脂质体（Lip-TGX221）的合成：
采用薄分散法制备 Lip-TGX221，按正交设计方法所筛选出的结果以质量比63-80:13-16:4-5来称取处方量的 HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE，按8-24:1-2药脂比的量称取 TGX221，全部溶于一定量的氯仿中，37 ℃减压旋转蒸发去除有机溶剂直至梨形瓶内壁上形成一层脂质薄膜。在室温下，置于真空干燥箱中过夜以除去残余的有机溶剂。然后，加3 mL pH 6.8 的PBS于65 ℃水化脂质膜30 min。水化后的脂质体于65 ℃水浴中，在通氮气的条件下，用高压挤出器过0.22 µm 滤膜进行整粒，共过膜5次。最后经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，除去大颗粒及未包封的游离TGX221，即得乳白色半透明脂质体混悬液。
2）含 TGX221叶酸靶向脂质体（FA-Lip-TGX221）的合成：
采用薄分散法制备 FA-Lip-TGX221，按正交设计方法所筛选出的结果以质量比63-80:13-16:4-5来称取处方量的 HSPC 、 Cholesterol 、 mPEG2000-DSPE 、 FA-PEG-CHEMS，并按8-24:1-2药脂比的量称取TGX221，全部溶于一定量的氯仿中，37 ℃减压旋转蒸发除去有机溶剂直至梨形瓶内壁上形成一层脂质薄膜。在室温下，置于真空干燥箱中过夜以去除残余的有机溶剂。然后，加 3 mL pH 6.8 的PBS于65 ℃水化脂质膜30 min。水化后的脂质体于65 ℃水浴中，在通氮气的条件下，用高压挤出器过0.22 µm 滤膜进行整粒，共过膜5次。最后经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，除去大颗粒及未包封的游离TGX221，即得乳白色半透明脂质体混悬液。
上述的叶酸靶向TGX221脂质体（FA-Lip-TGX221）在制备抑制人前列腺癌细胞增殖、促进人前列腺癌细胞凋亡的药物中的应用。
FA-Lip-TGX221具有叶酸靶向功能，提高了其在前列腺癌癌细胞PC-3荷瘤小鼠中的治疗效果，显着促进了癌细胞的死亡并增强了对肿瘤生长的抑制，同时降低了生物毒性。
本发明具有以下有益效果：
1、本专利通过化学合成的方法将FA与CHEMS接枝到H2N-PEG-NH2上合成一种新型的叶酸靶向材料，再通过优化脂质体处方，制备一种具有叶酸介导靶向的TGX221脂质体。体内外实验的结果表明，叶酸介导靶向TGX221脂质体可以更特异性的抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡和周期阻滞，较游离TGX221和非靶向TGX221脂质体具有更好的抗前列腺癌作用，也进一步揭示其优异的肿瘤靶向作用。
2、本申请制备的TGX221脂质体的稳定性良好，在10% FBS的PBS中，脂质体的粒径电位在96h的孵育中均无显著变化，呈现出pH响应的可持续性的药物释放。本申请的FA靶向脂质体可以有效的被叶酸受体高表达的前列腺癌细胞所摄取，并且其摄取可以被游离的叶酸所阻断，FA靶向脂质体的摄取是通过叶酸受体介导的内吞作用而完成。FA-Lip-TGX221可使DNA合成前期受阻，导致肿瘤细胞DNA合成受阻，进而抑制肿瘤细胞合成，还可以促进PC-3细胞的凋亡，抑制肿瘤的增长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为FA-PEG-CHEMS的化学结构式。
图2为FA-PEG-CHEMS的合成路线。
图3为脂质体的表征。（A）FA-PEG-CHEMS的FT-IR光谱。（B）、（C）和（E）分别是Blank-Lip、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221的粒径分布图和透射电镜图。（D）Zeta电位统计。（F）UV光谱。（G）FA-Lip-TGX221在4℃中的稳定性。（H）FA-Lip-TGX221在10% FBS中的稳定性。（I）TGX221、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221在pH 7.4的缓冲液中的累积药物释放曲线。（J）FA-Lip-TGX221在不同 pH 值 (pH = 5.5, 6.8, 7.4)的缓冲液中的累计释放曲线。（平均值±标准差，n=3）
图4为脂质体的体外细胞摄取。（A）PC-3细胞与游离Calcein、Lip-Calcein和FA-Lip-Calcein共孵育6h后的荧光显微镜。[比例尺= 50 μm]（B）流式细胞术定量测定PC-3细胞摄取Calcein。（C）PC-3细胞的平均荧光强度。（平均值±标准差，n=3，*p<0.05或****p<0.0001）
图5为TGX221脂质体的体外抗癌性能。（A）、（B）和（C）是用游离TGX221、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221处理PC-3细胞后24h、48h和72h的细胞存活率。（D）对给药处理后的PC-3细胞进行24小时活/死细胞染色的图像。[比例尺 = 100 μm]（E）EdU法检测各组PC-3细胞的DNA增殖活性并定量分析各组的增殖率。 [比例尺 = 100 μm]（F）使用流式细胞术测量每组细胞的凋亡率并计算凋亡细胞的百分比 (%)。[比例尺 = 100 μm]（G）通过TUNEL法测定凋亡水平并对其进行定量分析。 [比例尺 = 100 μm]（H）通过TUNEL法测定凋亡水平并定量分析。 [比例尺 = 100 μm] （I）JC-1法检测的线粒体膜电位荧光图像。 [比例尺 = 50 μm]（平均值±标准差，n=3，**p<0.01、***p<0.001或****p<0.0001）
图6为体内生物分布。（A）以0.5 mg/kg的DiR剂量通过尾静脉（n=3）给药游离DiR、Lip-DiR或FA-Lip-DiR后不同时间点的全身图像。（B）注射后48h采集的主要组织图像。（C）不同时间点肿瘤区域荧光强度的定量分析。（D）主要器官和肿瘤组织荧光强度的定量分析。（平均值±标准差，n=3，*p<0.05或****p<0.0001）
图7为TGX221脂质体的体内抗肿瘤效果。每2天通过尾静脉以100 mg/kg的TGX221剂量注射游离TGX221、Lip-TGX221、FA-Lip-TGX221和相同体积的生理盐水。（A）各种治疗后的肿瘤切除图片。（B）各组小鼠的肿瘤生长情况。（C）各种治疗后切除肿瘤的重量。（D）不同处理后小鼠体重的变化。（平均值±标准差，n=7，*p<0.05，**p<0.01或****p<0.0001）
具体实施方式
本申请应用试验主要试剂、药品及样品如下：
叶酸（folic acid，FA）（阿拉丁化学制品有限公司）；
聚乙二醇二胺 (MW, 3350, H2N-PEG-NH2) （Sigma-AldrichChemical Co. 美国）；dicyclohexylcar-bodiimide (DCC) （J&K Chemical, Ltd. 中国）；
N-hydroxysuccinimide (NHS) （J&K Chemical, Ltd. 中国）；
cholesteryl hemisuccinate (CHEMS) （Sigma-Aldrich Chemical Co. 美国）；Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) （AvantiPolar Lipids Inc.）；
胆固醇(Cholesterol) （Acros organics 公司）；
聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）（Lipoid 公司，德国）；
钙黄绿素（Calcein）（阿拉丁化学制品有限公司）；
三乙醇胺（TEA）、四氢呋喃（THF）、二甲基亚砜（DMSO）、Na2CO3、异丙醇、氯仿（CHCl3）、氢氧化钠（NaOH）（阿拉丁化学制品有限公司）；
青霉素、链霉素、胰蛋白酶（碧云天生物科技有限公司）；
F12K 培养基（吉诺生物医药技术有限公司）；
胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）；
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT)（Sigma-Aldrich. 美国）；Cell-Light EdU Apollo 567 体外成像试剂盒（RiboBio，广州，中国）;
原位细胞死亡检测试剂盒（Beyotime biotechnology，上海，中国）；
YF®488-Annexin V和PI凋亡检测试剂盒(美国光大®公司，中国苏州)。
主要仪器设备：
冷冻干燥机（Free Zone 6L，北京四环科学仪器厂有限公司）；
激光粒度及zeta电位分析仪（NanoZS90，英国马尔文公司）；
紫外可见荧光分度计（UV-2600，日本岛津公司）；
红外分光光度计（iS50 FT- IR，美国热电公司）；
超净工作台（SW-CJ-2FT，苏州净化设备有限公司）；
倒置荧光显微镜（CKX31，奥林巴斯科技有限公司）；
流式细胞仪（CytoFLEX S，美国贝克曼公司）；
小动物活体成像系统(IVIS Lumina XRMS Series III，美国PerkinElm)。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的FA-PEG-CHEMS的制备方法，其合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
1、FA-PEG-bis-amine 的合成：精密称取26.5 mg 的FA溶于1 mL DMSO 中，再依次加入 15.5 mg DCC、8.63 mg NHS 和 34.8 mg TEA，在室温条件下，通入氮气，避光搅拌1 h后，再加入167.5 mg H2N-PEG-NH2，避光搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物，7000 ×g 离心10 min 后取上清1 mL；在上清中加入3 mL 50 mM Na2CO3，10000 ×g 再次离心 10 min，吸取上清4 mL；将上步所得产物过 Sephadex G25 柱进行纯化，去除未反应的 FA 和 H2N-PEG-NH2等小分子量的副产物。纯化后的产物于-20℃冻存4h后，再冷冻干燥36 h。
2、CHEMS-NHS 的合成：将1 gCHEMS、0.475 g NHS 共溶于20 mL THF 中；取1.25 gDCC 溶于10 mL THF 中，加入第一步反应液中，在室温条件下，搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物过滤弃残渣，将滤液倒至梨形玻璃瓶中，放置于旋转蒸发仪上，于35℃旋转蒸发除尽 THF 约30 min – 40 min；残余物加异丙醇和THF（1:2 v/v）溶解后再重结晶；将重结晶的产物进行过滤，再置于真空干燥箱中真空干燥 24 h。
3、FA-PEG-CHEMS 的合成：取137mg FA-PEG-bis-amine（40 µM）与29.2 mg CHEMS-NHS（50 µM）共溶于50 mL CHCl3，室温避光反应过夜（约24 h）；待反应结束后，于37℃减压旋转蒸发除尽 CHCl3，约30 min – 40 min；上述残余物再加50 mM NaCO310 mL室温水化30min，再于4000 ×g 离心10 min后取上清，去除杂质；将上清装入14 KDa透析袋于超纯水中透析72 h 除去小分子量的副产物（每24 h更换一次超纯水）；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理（约48 h）。
FA-PEG-CHEMS结合物的结构表征，使用傅里叶变换红外 (FT-IR) 光谱在 BrukerIFS-55（瑞士）上记录，如图3A所示，在FA-PEG-CHEMS中的FT-IR光谱中可以观察到在3309cm-1处的吸收峰为酰胺键的N-H伸缩振动吸收；2887cm-1处为CHEMS的甲基亚甲基的对称伸缩特征吸收峰，1343cm-1处为CH3吸收峰；在 1647cm-1 处为酰胺键的 C=O 伸缩振动吸收峰； 1467cm-1处为 FA 中苯环的特征吸收峰；1112cm-1处的吸收峰为 H2N-PEG-NH2的 C-O-C 的伸缩振动吸收峰。以上结果表明了合成的产物确实是 FA-PEG-CHEMS。
实施例2
本实施例的FA-PEG-CHEMS的制备方法，其合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
1、FA-PEG-bis-amine 的合成：精密称取 12mg 的FA溶于1 mL DMSO 中，再依次加入 7 mg DCC、4 mg NHS 和 16 mg TEA，在室温条件下，通入氮气，避光搅拌1 h 后，再加入76 mg H2N-PEG-NH2，避光搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物，7000 ×g 离心10 min 后取上清1 mL；在上清中加入3 mL 50 mM Na2CO3，10000 ×g 再次离心 10 min，吸取上清4 mL；将上步所得产物过 Sephadex G25 柱进行纯化，去除未反应的 FA 和 H2N-PEG-NH2等小分子量的副产物。纯化后的产物于-20℃冻存4h后，再冷冻干燥24 h 。
2、CHEMS-NHS 的合成：将2 gCHEMS、1.4 g NHS 共溶于20 mL THF 中；取3 g DCC溶于10 mL THF 中，加入第一步反应液中，在室温条件下，搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物过滤弃残渣，将滤液倒至梨形玻璃瓶中，放置于旋转蒸发仪上，于35℃旋转蒸发除尽 THF 约30 min min；残余物加异丙醇和THF（1:2 v/v）溶解后再重结晶；将重结晶的产物进行过滤，再置于真空干燥箱中真空干燥 24 h。
3、FA-PEG-CHEMS 的合成：取120mg FA-PEG-bis-amine（40 µM）与25 mg CHEMS-NHS（50 µM）共溶于50 mL CHCl3，室温避光反应过夜（约24 h）；待反应结束后，于37℃减压旋转蒸发除尽 CHCl3，约30 min；上述残余物再加50 mM NaCO310 mL室温水化30 min，再于4000 ×g 离心10 min后取上清，去除杂质；将上清装入14 KDa透析袋于超纯水中透析72 h除去小分子量的副产物（每24 h更换一次超纯水）；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理（约48 h）。
实施例3
本实施例的FA-PEG-CHEMS的制备方法，其合成路线如图1所示，具体合成步骤如下：
1、FA-PEG-bis-amine 的合成：精密称取 35 mg 的FA溶于1 mL DMSO 中，再依次加入 21 mg DCC、12 mg NHS 和 45 mg TEA，在室温条件下，通入氮气，避光搅拌1 h 后，再加入220 mg H2N-PEG-NH2，避光搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物，7000 ×g离心10 min 后取上清1 mL；在上清中加入3 mL 50 mM Na2CO3，10000 ×g 再次离心 10min，吸取上清4 mL；将上步所得产物过 Sephadex G25 柱进行纯化，去除未反应的 FA 和H2N-PEG-NH2等小分子量的副产物。纯化后的产物于-20℃冻存4h后，再冷冻干燥48 h。
2、CHEMS-NHS 的合成：将1 gCHEMS、0.475 g NHS 共溶于20 mL THF 中；取1.25 gDCC 溶于10 mL THF 中，加入第一步反应液中，在室温条件下，搅拌反应过夜；待反应结束后，取反应过夜的产物过滤弃残渣，将滤液倒至梨形玻璃瓶中，放置于旋转蒸发仪上，于35℃旋转蒸发除尽 THF 约30 min – 40 min；残余物加异丙醇和THF（1:2 v/v）溶解后再重结晶；将重结晶的产物进行过滤，再置于真空干燥箱中真空干燥 24 h。
3、FA-PEG-CHEMS 的合成：取137mg FA-PEG-bis-amine（40 µM）与29.2 mg CHEMS-NHS（50 µM）共溶于50 mL CHCl3，室温避光反应过夜（约24 h）；待反应结束后，于37℃减压旋转蒸发除尽 CHCl3，约40 min；上述残余物再加50 mM NaCO310 mL室温水化30 min，再于4000 ×g 离心10 min后取上清，去除杂质；将上清装入14 KDa透析袋于超纯水中透析72 h除去小分子量的副产物（每24 h更换一次超纯水）；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理（约48 h）。
实施例4
利用实施例1制备的叶酸靶向材料制备叶酸靶向TGX221脂质体的方法，先通过正交实验对TGX221脂质体制备工艺的筛选与确定：
L9(34)正交设计的因素水平表
Figure SMS_3
L9(34)正交实验方案及结果分析
根据以上结果，我们可直观的看出最优制备处方为 A2B2C1，即HSPC：Cholesterol为 5:1；TGX221: HSPC的药脂比为 1:10；mPEG2000-DSPE占整个处方比例的5%时，包封率是最高的。同时，我们得到的脂质体粒径小、粒径分布较均匀、形态规则，能够满足脂质体制备的要求。
Figure SMS_4
其中A：HSPC：Cholesterol；B：TGX221：HSPC；C：mPEG2000-DSPE浓度；D：空白列（用来计算因子间的相互效应）；K：因素实验结果之和（例：K1代表各列1的总和）；k：因素实验结果之和的均值。
基于上述结果，叶酸靶向材料将用于后续叶酸靶向TGX221脂质体的制备方法，步骤如下：
步骤如下：
1）含 TGX221非叶酸靶向脂质体（Lip-TGX221）的合成：
采用薄分散法制备 Lip-TGX221，按正交设计方法所筛选出的结果质量比65：13：5来称取处方量的 HSPC 6.5g、Cholesterol 1.3g、mPEG2000-DSPE 0.5g，再按 1:10 药脂比的量称取 TGX221，全部溶于一定量的氯仿中，37 ℃减压旋转蒸发去除有机溶剂直至梨形瓶内壁上形成一层脂质薄膜。在室温下，置于真空干燥箱中过夜以除去残余的有机溶剂。然后，加3 mL pH 6.8 的 PBS于 65 ℃水化脂质膜 30 min。水化后的脂质体于 65 ℃水浴中，在通氮气的条件下，用高压挤出器过 0.22 µm 滤膜进行整粒，共过膜 5 次。最后经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，除去大颗粒及未包封的游离TGX221，即得乳白色半透明脂质体混悬液。
2）含 TGX221叶酸靶向脂质体（FA-Lip-TGX221）的合成：
采用薄分散法制备FA-Lip-TGX221，按正交设计方法所筛选出的结果以质量比65:13:4.5:0.5 来称取处方量的HSPC 6.5g、 Cholesterol 1.3g、 mPEG2000-DSPE 0.45g、FA-PEG-CHEMS 0.05g，并按 1:10 药脂比的量称取TGX221，全部溶于一定量的氯仿中， 37℃减压旋转蒸发除去有机溶剂直至梨形瓶内壁上形成一层脂质薄膜。在室温下，置于真空干燥箱中过夜以去除残余的有机溶剂。然后，加 3 mL pH 6.8 的 PBS 于 65 ℃水化脂质膜 30 min。水化后的脂质体于 65 ℃水浴中，在通氮气的条件下，用高压挤出器过0.22µm滤膜进行整粒，共过膜 5 次。最后经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，除去大颗粒及未包封的游离TGX221，即得乳白色半透明脂质体混悬液。
关于制得的脂质体稳定性评价：
为了探索脂质体在储存条件和体内循环环境下保持稳定性的能力，将脂质体在水和含有 10% FBS 的 PBS 中于 37 ℃下孵育。以预定的时间间隔，记录脂质体的尺寸。对脂质体的粒径电位及形态进行测定，根据粒径分布结果，Blank Lip、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221的粒径分别约为108.4nm、131.4nm和179.1 nm（图3B、C和E），多分散指数较低（PDI<0.200），表明脂质体中的纳米颗粒分布较均匀。通过对脂质体的形态进行观察，验证了上述说法，可以看出脂质体呈球形囊泡、无粘连且大小较为均一。Zeta电位结果显示 BlankLip、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221分别约为-7.31mV、-8.89m和-17.21 mV 的负表面电荷（图3D），这表面负电荷可能是由于磷酸基引起的。为了验证TGX221是否成功包被进脂质体里，将其进行了紫外全波长扫描，280nm是TGX221的特征吸收峰，且空白脂质体在此处无吸收峰，由此可以从紫外吸收光谱看出TGX221成功载入Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221中（图3F）。TGX221脂质体的包封率及载药量具体可见表1。
Figure SMS_5
制剂的载体系统若不稳定，会使药物析出，呈现沉淀等特征，此情形会对制剂的治疗结果产生变化。因此有必要对TGX221脂质体的储存稳定性进行考察。Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221的尺寸和电位的稳定性分别从4℃和10% FBS的PBS中进行考察，如图3G所示，在4℃的PBS中，脂质体的粒径和电位在14天内均无明显变化，如图3H所示，在10% FBS的PBS中，脂质体的粒径电位在96h的孵育中均无显著变化，这表明TGX221脂质体的稳定性良好。
脂质体的pH酸响应药物释放实验：
使用透析法来研究不同pH值（PH7.4、6.8、5.5）缓冲液下的药物释放行为。将1mL的TGX221溶液、Lip-TGX221溶液及FA-Lip-TGX221溶液（浓度均为1mg/mL）装于透析袋中（MW：1000Da），然后将透析袋置于5mL缓冲液（pH7.4/6.8/5.5，0.5% w/v SDS）的离心管中。再将离心管置于37℃的孵化摇床上，转速为120rpm/min。在预定好的1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h时间点定时定量取样，每次取出3mL的释放介质同时并补充同体积的新鲜释放介质。并通过紫外可见分光光度计在280nm处检测TGX221的累计释放量。为了验证TGX221脂质体的体外缓释作用，我们用透析的方法将TGX221、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221在pH7.4的缓冲液中进行释放，如图3I所示，TGX221在48h时几乎释放完全，而Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221在48h时的释放量才将近达到30.0%，之后释放度趋近平缓，脂质体中TGX221的释放速度明显减慢，这可能是由于TGX221表面存在脂质膜，所以脂质体具有缓释的作用。
从文献中可以得知，人体正常组织环境是偏中性的，而肿瘤的微环境是高酸性的，且FA-Lip-TGX221具有酸响应，因此我们设定了不同pH值（7.4、6.5 和 5.5）的缓冲液来评估FA-Lip-TGX221中TGX221的释放行为。这些缓冲液用于模拟不同生物环境中的 pH 值，分别包括血浆（pH 7.4），肿瘤微环境 (pH 6.0-6.8) 和溶酶体 (pH 5.5)。如图3J所示，在pH7.4 的缓冲液中，FA-Lip-TGX221 在96小时内的 TGX221 释放百分比约为 32.0%，表明FA-Lip-TGX221 在中性介质中保留了大部分的负载药物。在pH 6.8的缓冲溶液中，FA-Lip-TGX221的药物最终释放百分比约为34.0%，和在pH 7.4的条件下相差无几。但是，在孵育96h后，TGX221在酸性条件 (pH 5.5) 下的释放量约为40.0%，明显高于缓冲液（pH7.4和pH6.8）。这表明我们的靶向脂质体呈现出pH响应的可持续性的药物释放。
实施效果例1
先进行细胞培养，PC-3人源性前列腺癌细胞购于中国细胞科学库（中国上海）。PC-3培养在10%FBS（胎牛血清）、100µg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的F12K中，细胞在37℃、95%空气及5% CO2的细胞培养箱中生长。
一、 细胞摄取测定
用荧光显微镜和流式细胞仪对细胞摄取进行定性和定量的研究。利用脂质体装载钙黄绿素（Calcein）来标记脂质体，叶酸靶向钙黄绿素脂质体与非靶向钙黄绿素脂质体制备方案如下：
1. 含Calcein非叶酸靶向脂质体（Lip-Calcein）的合成：
（1）将41.9 mg HSPC、15.5 mg cholesterol 和12.6 mg mPEG-DSPE2000共溶于5mL CHCl3中，于37 ℃减压旋转蒸发30 min – 40 min 除尽有机溶剂；
（2）取50 mM Calcein (约5 mg) 161 µL 溶于1.84 mL PBS，于65℃水化上述脂质膜 30 min；
（3）于65 ℃水浴上通氮气过高压挤出器进行整粒，依次过200 nm滤膜 5 次，100nm 滤膜3次；
（3）经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，分离游离Calcein和包裹Calcein的非靶向脂质体（Lip-Calcein）。
2. 含Calcein叶酸靶向脂质体（FA-Lip-Calcein）的合成：
（1） 将41.9 mg HSPC、15.5 mg cholesterol、12.6 mg mPEG2000-DSPE和5 mgFA-PEG-CHEMS 共溶于5 mL CHCl3中，于37 ℃减压旋转蒸发30 min – 40 min 去除有机溶剂；
（2）取50 mM Calcein (约 5 mg) 161 µL 溶于1.84 mL PBS，于65 ℃水化上述脂质膜 30 min；
（3）于65 ℃水浴上通氮气过高压挤出器进行整粒，依次过200 nm 滤膜 5 次，100nm 滤膜 3 次；
（4）经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，分离游离的Calcein和包裹Calcein的靶向脂质体（FA-Lip-Calcein）
在荧光显微镜中，将处于对数生长期的PC-3细胞以每孔1 × 104个细胞的密度接种到 24 孔板中。待细胞贴壁后，将培养基换成浓度为的游离的Calcein、非靶向组（15 µMLip-Calcein）、靶向组（15 µM FA-Lip-Calcein）以及阻断组（15 µM FA-Lip-Calcein，并加入 1 mM FA 以封闭 FR 使其充分与 FA 结合），孵育6h，细胞用PBS洗2遍，然后用4%的多聚甲醛固定，再用DAPI染色15min，使用荧光显微镜获取荧光图像。
在流式细胞术实验中，与上述荧光显微镜细胞实验处理步骤一致，之后，将细胞用PBS洗涤3次并重悬于500μL PBS中，通过流式细胞仪(Cyto FLEX，Beckman)检测细胞摄取效率。
我们利用钙黄绿素（Calcein）具有绿色荧光的特性，将其作为荧光标记物包裹至脂质体内来考查叶酸受体过度表达的PC-3 细胞摄取非靶向和叶酸靶向脂质体的差异性，从而验证所制备的 FA-PEG-CHEMS 的叶酸受体靶向摄取性能。如图4A所示，游离的Calcein是一种小分子，可以被动扩散穿过细胞膜并进入细胞，所以钙黄绿素组显示出强烈的绿色荧光。靶向脂质体组（FA-Lip-Calcein）的绿色荧光远高于非靶向组（Lip-Calcein）和阻断组（FA+FA-Lip-Calcein），其摄取明显好于其他组。通过流式细胞仪定量检测显示（图4B-C），叶酸受体靶向钙黄绿素脂质体（FA-Lip-Calcein）的细胞摄取高于非靶向脂质体(Lip-Calcein)约2倍，而当加入游离的叶酸时，细胞摄取大幅度减少。因此，细胞摄取实验结果说明，FA靶向脂质体可以有效的被叶酸受体高表达的前列腺癌细胞所摄取，并且其摄取可以被游离的叶酸所阻断，证明FA靶向脂质体的摄取是通过叶酸受体介导的内吞作用而完成。
二、体外细胞毒性试验
为了研究TGX221脂质体对体外癌细胞活性的抑制作用，我们采用MTT法对人前列腺癌细胞系PC-3细胞进行评价。对游离TGX221、Lip-TGX221及FA-Lip-TGX221对PC-3细胞的细胞活力研究。利用MTT法对其进行检测。
将处于对数生长期的PC-3细胞接种到96孔板中，待细胞贴壁后，将原培养基取出，再加入100μL不同浓度的药物溶液。每个浓度设3个复孔，设对照组。继续培养24、48和72 h后，倒出上清液，加入20 μL浓度为0.5 mg/mL的MTT溶液。继续培养4 h后，弃上清，加入100μL DMSO。在酶标仪（Multiscan，Thermo，USA）上测量每组在 490 nm 处的吸光度。计算处理细胞的存活率百分比并与未处理的对照细胞进行比较。细胞活力 (%) = 药物处理细胞的OD/培养基处理细胞的 OD × 100%。
如图5A-C所示，将TGX221、Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221和细胞进行孵育，细胞增殖抑制率呈明显的浓度-时间依赖性。游离 TGX221 组有很明显的细胞增殖抑制效应，其细胞生存率最低，作用72h 的 IC50 值为4.95µg/mL，但我们的研究重点是比较Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221对PC-3细胞增殖抑制作用的差异性。如图5C所示，UA 脂质体作用 72 h 的非靶向Lip-TGX221组的 IC50 值为19.06µg/mL，而叶酸受体靶向FA-Lip-TGX221组的 IC50值为9.6µg/mL，可见叶酸靶向脂质体的细胞增殖抑制效果约为非靶向脂质体的2倍，受体靶向作用效果较好，具有较明显的细胞杀伤作用。
三、Calcein-AM和PI细胞染色实验
为了在体外更直观的观察到药物对细胞的抑制作用，接下来用钙黄绿素-AM（绿色荧光）和碘化丙啶 PI（蓝色荧光）对活细胞和死细胞进行共染色来进行活/死检测，通过Calcein-AM和PI染色来评估脂质体处理细胞的活力成像。将PC-3细胞以1 × 104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，细胞贴壁后，然后与PBS、游离TGX221、Lip-TGX221及FA-Lip-TGX221（药物浓度均为15μg/mL）孵育24h。再将细胞与Calcein-AM染色30min, 用PI染色2-5min。最后在荧光显微镜下对细胞进行成像。
如图5D所示，可以清楚地观察到，游离TGX221组处理过的细胞红色荧光最多，其次是叶酸受体靶向 FA-Lip-TGX221 组的红色荧光范围优于非靶向Lip-TGX221组。结果与MTT 测量的结果一致。
四、细胞增殖试验
使用 Cell-Light EdU Apollo 567 体外成像试剂盒按照制造商的说明进行 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (EdU) 掺入测定。 PC-3细胞以2 × 104个细胞/孔种入 96 孔板。不同治疗组（药物浓度均为15μg/mL）处理24h后，用10μM EdU孵育2h，然后培养24 h。然后，将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 30 min，然后在室温下用 0.5% Triton X-100 溶液处理 15min。接着，每孔加入200μL Apollo溶液，避光孵育30 min。使用荧光显微镜（Olympus BX43CKX31）获取荧光图像。细胞增殖率（%）=（EdU阳性细胞数）/（细胞总数）×100%。
结果图5E表明，在经FA-Lip-TGX221的处理下，PC-3细胞在 24 小时的增殖率仅为3.4%，与Lip-TGX221组相比，靶向组更好的抑制了细胞增殖。随后对其进行细胞周期分析。结果如图5G所示，用FA-Lip-TGX221处理PC-3细胞，细胞周期主要阻滞在G1期，即DNA合成前期，导致肿瘤细胞DNA合成受阻，进而抑制肿瘤细胞合成。
五、TUNEL检测
使用原位细胞死亡检测试剂盒进行TdT介导的DutP-生物素缺口末端标记(TUNEL)分析。将PC-3细胞以2×104个细胞/孔的密度接入96孔板，药物处理（药物浓度均为15μg/mL）24 h。用PBS洗涤后，细胞在4%多聚甲醛中固定30 min，然后用1% Triton X-100溶液在室温下处理10 min。然后每孔加入200μL TUNEL溶液，37℃避光孵育60 min，荧光染料染色。4', 6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 用于在室温下暗处染色细胞核 5 min。使用荧光显微镜（Olympus BX43 CKX31）获取荧光图像。使用 Image J 软件对 TUNEL 阳性细胞进行计数。
如图5F所示，左下、右下和右上象限代表有活力的、早期凋亡和晚期凋亡/坏死区分，结果表明Control组、TGX221组、Lip-TGX221组和FA-Lip-TGX221组的凋亡率分别为1.84%、8.64%、12.53%和18.4%，FA-Lip-TGX221组和Lip-TGX221组相比，其早期和晚期凋亡细胞均增加。如图5H所示，TUNEL检测结果证实FA-Lip-TGX221组细胞凋亡指数较Lip-TGX221组明显升高。对其定量分析，结果显示叶酸靶向组PC-3细胞的凋亡率为13.21%，明显高于非叶酸靶向组（2.53%）。流式细胞术检测细胞凋亡情况，采用Annexin V/ PI双染色法。
六、体外细胞凋亡和细胞周期测定
在6孔板中培养总共3×105个PC-3细胞并孵育24小时。然后更换新鲜培养基，分别用PBS、游离TGX221、Lip-TGX221及FA-Lip-TGX221（药物浓度均为15μg/mL）处理细胞24h。通过使用 YF®488-Annexin V 和 PI 细胞凋亡检测试剂盒或细胞周期试剂盒染色来检测凋亡细胞和细胞周期，并使用FlowJo软件进行分析。
通过 JC-1 染色检测线粒体膜电位 (Δψm)，当线粒体功能障碍时，线粒体膜电位(Δψm) 可通过线粒体中JC-1 聚集体转化为 JC-1 单体导致细胞凋亡。如图5I 所示，与FA-Lip-TGX221一起孵育的PC-3细胞具有来自 JC-1 单体染色的较亮绿色荧光。再次证明导致线粒体功能障碍的FA-Lip-TGX221更能促进PC-3细胞的凋亡。
实施效果例2
为证明在体内HA-ADT能够抑制人前列腺癌细胞的生长，进行了裸鼠成瘤实验，相关过程介绍如下。
雄性BALB/c裸鼠(5周)购自北京维达河实验动物科技有限公司（证书编号：中国科学技术出版社(京)2016-0006，北京）。动物实验由河南大学医学院实验动物医学伦理与福利委员会(HUSOM-2017-195)根据国家科学技术委员会制定的《实验动物条例》进行。
将PC-3细胞（2×107/mL）皮下接种于裸鼠右侧腋下，每只裸鼠接种200μL，待肿瘤体积长至100mm3时进行药物治疗，待肿瘤体积长至150mm3时进行体内荧光成像。
（1）体内荧光成像
制备Lip-DiR和FA-Lip-DiR，与上述制备Lip-TGX221和FA-Lip-TGX221步骤相同。
对于体内荧光成像，首先通过尾静脉注射（DiR浓度为 5 μg/kg）给BALB/c荷瘤小鼠注射DiR、Lip-DiR和FA-Lip-DiR。在不同的注射后时间（1、3、6、12、24、48h）获得荧光图像。随后，将心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肿瘤在注射48h后分离并拍照。
为了探究叶酸靶向脂质体在小鼠体内的肿瘤靶向性能，我们制备DiR脂质体在前列腺癌移植瘤模型小鼠体内进行了实验，在分别给药 1 h、3h、6h、12h、24h、48h 后，我们采用动物活体成像系统观察小鼠体内DiR的荧光强度。如图6A-B所示，经FA-Lip-DiR处理过的小鼠，与其他组相比，其肿瘤区域荧光最强。48 h 后，处死小鼠，并取出主要脏器和肿瘤进行离体成像，结果如图6C-D所示，与活体成像的结果相似，FA-Lip-DiR组的DiR的荧光信号主要分布在肿瘤和肝脏的位置，其中肝脏的摄取较多可能是因为肝脏是人体的主要代谢器官，药物进入体内后可能会首先转运至肝脏。这些结果表明FA-Lip-DiR能够在肿瘤区域特异性积累，这是由于叶酸对过表达叶酸受体的癌细胞具有较强的靶向性。
（2）体内抗肿瘤功效
当肿瘤体积约为100 mm3时，将移植瘤小鼠随机分为4组(每组7只)，给药剂量如下：生理盐水组、TGX221组、Lip-TGX221组及FA-Lip-TGX221组（浓度均为100mg/kg），每2天进行1次尾静脉注射给药，连续给药治疗14天。在治疗期间，每隔1天给小鼠称重并测量肿瘤体积。肿瘤体积计算公式如下：肿瘤体积=长×宽2×0.5。
为了评估TGX221脂质体的化疗效果，通过尾静脉向PC-3皮下移植瘤小鼠注射不同药物：（1）生理盐水、（2）TGX221、（3）Lip-TGX221和（4）FA-Lip-TGX221。如图7C所示，尽管各组的肿瘤增长体积均呈上升趋势，但注射 TGX221和Lip-TGX221的小鼠的肿瘤大小明显高于 FA-Lip-TGX221组，这表明了经FA修饰后的脂质体具有更好的肿瘤靶向作用，进而治疗效果更佳，治疗23天后的肿瘤光学照片（图7A）和肿瘤重量（图7B）也证明了FA-Lip-TGX221治疗的小鼠具有最小的肿瘤重量和最佳的治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种叶酸靶向的新材料，其结构式如下：
Figure QLYQS_1
。
2.权利要求1所述的叶酸靶向的新材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）FA-PEG-bis-amine 的合成：将FA溶于DMSO中，再依次加入DCC、NHS和TEA，室温条件下，通入氮气，避光搅拌后，再加入H2N-PEG-NH2，反应结束后，离心取上清，向上清中加入Na2CO3溶液，再离心取上清经纯化后得FA-PEG-bis-amine；
（2）CHEMS-NHS 的合成：将CHEMS、NHS共溶于THF中，然后加入到DCC的THF溶液中，室温条件下搅拌过夜，反应结束后过滤并收集滤液，经旋转蒸发、溶解、再结晶所得产物真空干燥后即为CHEMS-NHS；
（3）FA-PEG-CHEMS 的合成：将步骤（1）的FA-PEG-bis-amine与步骤（2）的CHEMS-NHS共溶于CHCl3中，室温避光反应至完全，经旋转蒸发后再加入NaCO3 室温水化，离心取上清，透析后所得产物经冷冻干燥得FA-PEG-CHEMS即靶向载药脂质体。
3.根据权利要求2所述的叶酸靶向的新材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中FA、DCC、NHS、TEA和H2N-PEG-NH2的质量比为12-35:7-21:4-12:16-45:76-220；Na2CO3溶液的浓度为50mM。
4. 根据权利要求3所述的叶酸靶向的新材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中CHEMS、NHS和DCC的质量比为1-3.2: 0.4-1.5: 1.25-4；溶解采用的溶剂为体积比1:2的异丙醇和THF。
5. 根据权利要求4所述的叶酸靶向的新材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中FA-PEG-bis-amine和CHEMS-NHS的质量比为120-150:25-32；FA-PEG-bis-amine在CHCl3溶液中的浓度为40 µM，CHEMS-NHS在CHCl3溶液中的浓度为50 µM。
6.利用权利要求1的叶酸靶向的新材料制备叶酸靶向TGX221脂质体的方法，其特征在于，步骤如下：
1）Lip-TGX221的合成：按比例称取脂质原料HSPC、Cholesterol和mPEG2000-DSPE，然后将脂质原料HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE和TGX221溶于氯仿中，37℃减压旋蒸除溶剂后得一层脂质薄膜，经真空干燥后再加入PBS水化脂质薄膜，65℃水浴加热后在通氮气的条件下，过0.22 µm 滤膜进行整粒，经过整粒后的脂质体过 CL4B 凝胶柱进行纯化，得乳白色半透明脂质体混悬液即Lip-TGX221；
2）FA-Lip-TGX221的合成：按比例称取脂质原料HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE和FA-PEG-CHEMS，将脂质原料HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE、FA-PEG-CHEMS和TGX221共溶于氯仿中，37℃减压旋蒸至形成一层脂质薄膜，重复步骤1）中对脂质薄膜的处理步骤，最终得到乳白色半透明脂质体混悬液，即为FA-Lip-TGX221。
7.根据权利要求6所述的利用叶酸靶向的新材料制备叶酸靶向TGX221脂质体的方法，其特征在于：所述步骤1）中HSPC、Cholesterol和mPEG2000-DSPE的质量比为63-80:13-16:4-5，脂质原料HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE的总质量与TGX221的质量比为8-24:1-2。
8.根据权利要求6所述的利用叶酸靶向的新材料制备叶酸靶向TGX221脂质体的方法，其特征在于：所述步骤2）中HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE和FA-PEG-CHEMS的质量比为63-80:9-11:4-5:4-5；脂质原料HSPC、Cholesterol、mPEG2000-DSPE和FA-PEG-CHEMS的总质量与TGX221的质量比为8-24:1-2。
9.利用权利要求6-8任一项所述的方法制备的叶酸靶向TGX221脂质体。
10.权利要求9所述的叶酸靶向TGX221脂质体在制备抑制人前列腺癌细胞增殖、促进人前列腺癌细胞凋亡的药物中的应用。
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