HU184229B - Process for producing poymere compounds of immunregulating activity - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a daganatterápiában immunszabályozóként használható polimer vegyületek előállítására.

Bár a daganatos megbetegedések gyógyítása széles körű kutatások tárgya, rendkívül kevés hatásosan használható vegyületet találtak.

Az egyik lehetőség szerint kísérletek történtek a test immunrendszerének befolyásolására. Általános felismert jelenség például, hogy a csecsemőmirigynek nagy szerepe van az immunrendszer kialakulásában és működésében. Az alapvetően hormonális úton szabályozott különböző mechanizmusokban a csecsemőmirigy T-limfociták által létrejövő immunműködés felett végez szabályozást. Többféle, természetben előforduló és kémiai szintézissel előállított pepiidet vizsgáltak, váltakozó eredményekkel, az immunrendszer stimulálására és/vagy gátlására.

Az immunrendszerre aktívan ható más vegyületek között szerepel például a Bacillus mikroorganizmusból izolált vegyület, a Calmette-Guerin (BCG) anyaga, a Corynebacterium parvum-ból izolált anyag, a glukán, a levamisole és a tilorone. A fenti vegyületek közül egyesek növelik az antitestek képződését, mások növelik vagy csökkentik a sejt-immunitást.

Különböző, biológiailag aktív szintetikus polielektrolitokat javasolnak daganatellenes szerként. így Regelsom és Holland úgy találták, hogy egerekben a poli-etilénszulfonát nátriumsója széles spektrumú daganatellenes aktivitással rendelkezik [Natúré (London), 181, 46, 1958]. A nátrium-poli-etilén-szulfonáthoz hasonló antineoplazmikus aktivitással rendelkező nagy molekulasúlyú karbonsav polimereket fedeztek fel később, például poli-akrilsavat, poli-metakrilsavat és etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert [Regelsom és munkatársai, Natúré (London), 186, 778-780, 1960; Regelsom, „Water-Soluble Polymers” a „Polymer Science and Technology” 2. kötet; Bikales szerkesztése; 161-177. oldal, Plenum Press, New York, 1973]. Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer típusú polimerek antineoplazmikus aktivitását a 664 326 számú kanadai szabadalmi leírásban ismertetik, ami megfelel a 758 023 számú, 1958. október 28-án elfogadott egyesült államokbeli leírásnak. Ezeknek a polimereknek az előnyös molekulasúlya 500 és 1,5 millió között lehet. Az etilén-maleinsavanhidrid félamid- és félammónium-sójának egyik ilyen leírt polimere 20 000 és 30 000 közötti átlagos molekulasúlyú, és az utólagos vizsgálatok szerint rágcsálókban és kutyákban krónikusan toxikus [Wihich és munkatársai, Fed. Proceedings 19. kötet, 1960]. A 2000—3000 molekulasúlyú polimer Mihich és munkatársai szerint kutyákban szintén toxikus (Fed. Proceedings 20. kötet, 1961). Ezek a toxicitási adatok a polimerek klinikai vizsgálata ellen szólnak.

Ezt követően a National Cancer Institute által végzett tumorellenes hatásvizsgálat szerint a divinil-éter és a maleinsav-anhidrid 1:2 arányú kopolimerje tumorellenes hatást mutatott [Breslow, Pure and Appl. Chem., 46, 103—113, 1976]. Ezt a kopolimert pirán-kopolimerként vagy DIVEMA-ként is ismerik, és egy jól ismert mintáját NSC 46 015 jellel jelölik. A fenti pirán-kopolimerek daganatellenes szerként való használatát a 3 224 943 és 3 794 622 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban is ismertetik, ahol a szerzők az előnyös molekulasúlyt 5000 és 30 000 között adják meg. A pirán-kopolimerek daganatellenes hatása több közlemény szerint az immunrendszer működésének fokozásával, vagy a reti2 kuló-endoteliálís rendszeren át jelentkező immunválasznak tulajdonítható, amelynek eredményeképpen növekszik a makrofágok működése [Breslow, Pure and Appl. Chem., 46, 103-113, 1976; Mohr és munkatársai, Prog. Cancer Rés. Ther., 7, 415—426, 1978; Schultz és munkatársai, mint fent 7, 459-467, 1978; továbbá Dean és munkatársai, Cancer Treatment Reports, 62, 1978. szeptember] .

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimerekhez hasonló polimerek különböző nagy molekulasúlyú változatainak előzetesen közölt krónikus toxicitása ellenére a jelen szerzők kutatásokat folytattak immunszabályozó aktivitással rendelkező hasonló típusú polimerek előállítására. Új kutatásokat és módszereket vezettünk be, amelyek lehetővé tették citotoxicitással nem rendelkező immunszabályozó hatású vegyületek előállítását. A kísérletek eredményeképpen vegyületeket találtunk, amelyek közvetlen citotoxikus hatással nem rendelkeznek, és ennek ellenére meglepő módon és váratlanul rendkívül hatásosaknak bizonyultak metastazisos daganatokkal szemben, és gátolták a daganat újra jelentkezését annak kivágását vagy eltávolítását követően. így ezeket a vegyületeket különösen előnyösen használhatjuk a daganatterápia során mint immunrendszert szabályozó vegyületeket. A vegyületeket felhasználhatjuk a tumor újbóli megjelenésének, vagy a metastázis kifejlődésének gátlására oly módon, hogy a daganat műtéti úton, X-sugárzással vagy citotoxikus terápiával való kivágása vagy kezelése után adagoljuk.

A találmány tárgya eljárás az előzőekben ismertetett etilén-maleinsav-anhidrid kopolimerhez hasonló típusú új vegyületek szintézisére, amelyek hatásosak a daganatok metastázisa és a daganatok újrakeletkezése ellen emlősökben, annak ellenére, hogy erős primer daganatellenes hatással nem rendelkeznek. Olefin monomerekből és aj3-telítetlen polikarbonsav-anhidridek 4-6 szénatomos molekuláiból képződött kopolimerek, amelyek átlagos molekulasúlya 300 és 1500 közé esik és félamid, továbbá félammónium-só funkciós csoportot, illetve imidcsoportokat tartalmazó egységekből állnak, mely utóbbiak a fenti funkciós csoportokat tartalmazó egységekre számítva 5 % és 40 % közötti mennyiségben vannak jelen. Ilyen olefin monomerek például az etilén, a propilén és az izobutilén; a polikarbonsav-anhidridek közül megemlítjük a maleínsav-anhidridet, a citrakonsav-anhidridet és az akonitsav anhidridet. Előnyös monomer összetevő az etilén és a maleinsav-anhidrid.

Szemléltető jelleggel és a találmány oltalmi körét nem szűkítve bemutatjuk az előnyös, etilénből és maleinsavanhidridbó'l álló kopolimert, amely különböző származtatott funkciós csoportokat tartalmaz:

a. az I általános képletű félamid- és félammónium-só,

b. a II általános képletű imid-származék, ahol X hidrogénatom, vagy 1—4 szénatomos alkilcsoport, előnyösen hidrogénatom;

Y hidrogénatom, ammóniumion vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható fémkation, előnyösen ammóniumion; és

Z hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport, ammóniumion, vagy gyógyszerészeti szempontból elfogadható fémkation, előnyösen azonban hidrogénatom.

A bemutatott a. és b. molekulaegységek vagy csoportok a gyakorlatilag lineáris szénatomokból álló molekulában vannak elosztva. Az egységek 5 % és 40 % közötti

184 229 része imidcsoport, a többi alapvetően félamid és félkarbonsav egység.

Ezeket az egységeket a molekulaláncban és/vagy a polimerben véletlenszerűen helyezhetjük el. Nyilvánvaló, hogy jelen lehet kis mennyiségű (valószínűleg 10%-nál kevesebb) monoammónium-karboxil-csoport, vagy más, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sócsoport és/vagy dikarbonsavcsoport, amely abból adódhat, hogy a vegyületek előállításakor az anhidrid részlegesen vagy egyáltalán nem reagál.

Az előző csoportok közül az a. félamid, félkarbonsav-sócsoport előnyösen félamid, félammóniumsó és a b. imidcsoport előnyösen nem szubsztituált imid.

Szintén szemléltető jelleggel, a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül bemutatjuk az etilénből és maleinsav-anhidridből álló kopolimer előnyös alakját:

a. a III képletű félamid, félammónium-só és

b. a IV képletű nem szubsztituált imid-csoport.

Ahogy azt az előzőekben ismertettük, a megfelelő

a. és b. egységek vagy csoportok a lényegében lineáris, folyamatos szénláncból álló molekulában vannak elosztva. Az egységek 5% és 40% közötti mennyisége előnyösen nem szubsztituált imidcsoport, a többi gyakorlatilag előnyös félamid, félammónium-só egység. Ezeket az egységeket a láncon vagy a polimeren belül véletlenszerűen helyezhetjük el. Nyilvánvaló, hogy kevés (valószínűleg 10%-nál kevesebb) monoammónium-karboxil-csoport vagy dikarboxilcsoport lehet jelen, mivel a vegyületek előállításakor az anhidrid részben vagy egyáltalán nem reagált molekulái is jelen vannak.

A találmány szerinti polimer immunszabályozó szerek előnyösen vízben oldódnak. A találmány szerinti eljárást a mellékelt ábrákkal tovább szemléltetjük.

Az 1. ábrán bemutatjuk a találmány szerinti jellemző polimer infravörös abszorpciós spektrumát, amely polimer 20% imidcsoportot tartalmaz. A vegyületet a 3. példa szerint állítjuk elő; lásd még a 4. táblázat 5. kísérletét.

A 2. ábrán összehasonlítás céljából megadjuk az imidcsoportot nem tartalmazó megfelelő polimer infravörös abszorpciós spektrumát. A vegyület előállítására vonatkozóan lásd a 2a. példát.

A 3. mellékelt ábrán összehasonlítás céljából megadjuk a 100 % imidcsoportot tartalmazó megfelelő poUmer infravörös abszorpciós spektrumát. A vegyületet az 5. példában megadottak szerint állítottuk elő.

Bár a 664 326 számú kanadai szabadalmi leírásban a szerzők olyan etilén-maleinsav-anhidrid típusú kopolimereket írnak le, amelyek félamid, félammónium-sószármazékok, továbbá ismertetik az ilyen típusú kopolimerek részlegesen imidált származékainak vagy imidjeinek antineoplazmikus aktivitását, a találmány szerinti különleges polimerek, amelyek az a. félamid, félkarbonsav-só- és ab. az előzőekben ismertetett mennyiségű imidcsoportot tartalmazzák, és viszonylag alacsony átlagos molekulasúlyúak (300-1500) új vegyületek. Ezeknek az új polimereknek váratlan és használható immunszabályozó tulajdonságaik vannak, amelyek nem jelentkeznek a megfelelő, kizárólag a. vagy b. funkciós csoportokkal rendelkező megfelelő poUmereknél, vagy azoknál, amelyek molekulasúlya lényegesen nagyobb. Az összehasonlítás lehetősége miatt megadjuk, hogy például ezen polimerek megfelelő monomer fragmensei, például a szukcinimid és a szukcinamidsav (ammóniával kezelt borostyánkősav-anhidrid) előzőleg ismert vegyületek, és semmiféle kimutatható daganatellenes hatással nem rendelkeznek [Regelsom és munkatársai, Natúré (London), 186. 78—780, 1960]. A találmány szerinti immunszabályozó szerek előállítására használt funkciós csoportokat nem tartalmazó alacsony molekulasúlyú kopolimereket ismert módszerekkel állítjuk elő, lásd például a 2 857 365, 2 913 437, 2 938 016 és 2 980 653 számú egyesült államokbeU szabadalmi leírásokat. Általában úgy járunk el, hogy az olefint, például az etilént polikarbonsav-anhidriddel, például maleinsav-anhidriddel reagáltatjuk 40 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten szabad csoportokat befolyásoló katalizátor jelenlétében egy folyékony halmazállapotú oldószerben, amely a reagensek számára oldószer és a keletkező interpolimer számára nem. Különösen előnyösen használhatunk ismert peroxid típusú és azo-típusú szabad csoportokra ható polimerizációs katalizátort, előnyösen például benzoil-peroxidot. Nem reakcióképes oldószerként például benzolt, halogénezett benzolokat és halogénezett paraffmeket használunk a polimerizációs reakció elvégzésekor. Azonban, ahogy azt a 2 913 437 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik, a kopolimer termék molekulasúlyának csökkentésére előnyösen használhatunk alkilezett aromás szénhidrogéneket, amelyekben legalább egy α-hidrogénatom van, például etil-benzolt, izopropil-benzolt, diizopropil-benzolt, toluolt vagy xílolt.

Különösen előnyös oldószer az utóbbi célra az etilbenzol. A kopolimer előnyösen ekvimoláris mennyiségben tartalmazza az olefin-csoportokat és anhidrid-csoportokat, amit úgy érünk el, hogy a reagáló monomereket ekvimoláris mennyiségben adagoljuk. A kopolimer terméket szilárd halmazállapotban kapjuk meg, szűréssel könnyen eltávolíthatjuk, vagy centrifugálással vagy más hasonló elkülönítési eljárással.

Nyilvánvaló, hogy a szabad csoportokat iniciálé vegyületek jelenléte mind a polimerizációs reakció beindításakor, mind pedig a befejeződésekor, vagy az alkilezett aromás szénhidrogénből álló folyékony halmazállapotú reakcióeleggyel való telomerizációkor arra vezethet, hogy a polimer szerkezetbe különböző szerves csoportok épülnek be. A teljes polimer készítményre számítva ezeknek a csoportoknak a százalékos aránya nő a polimer molekulasúlyának csökkenésével. Például, ha szabad csoport iniciálóként benzoil-peroxidot és reakcióelegyként etil-benzolt használunk, úgy a polimer szerkezetbe beépül ezek megfelelő aromás csoportja. Ezek a csoportok nagyobb százalékban vannak jelen a polimer teljes szerkezetének összmennyiségére számolva olyan polimerben, amelynek molekulasúlya 300, mint abban a polimerben, amelynek molekulsúlya 1500.

Nyilvánvaló továbbá, hogy ezen alacsony molekulasúlyú kopomolimerek előállításakor a kopolimerbe bizonyos mennyiségű keresztkötéseket kialakító vegyületet kell adagolnunk a termék vízben való oldhatatlanná alakítására. Ilyen keresztkötéseket kialakító szerek például a vinil- és allil-észterek, különösen az akrilátok és krotonoátok, ahogy azt a 3 165 486 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásból tudjuk. A kopolimereket a derivatizáció után is oldhatatlanná tehetjük különböző módon, például a 3 554 985 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint diamin keresztkötésekkel, továbbá például különböző vivőanyagok kapcsolásával, például bentonittal, latex részecskékkel vagy eritrocitákkal.

-3184 229

Ismeretes, hogy az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimerek amid-származékait előállíthatjuk oly módon, hogy a kopolimert szobahőmérsékleten vagy magasabb hőmérsékleten ammóniagázzal reagáltatjuk (lásd például a 664 326 számú kanadai szabadalmi leírást és a 2 883 287 és a 3 157 595 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Ismeretes az is, hogy ha a reakciót magasabb hőmérsékleten végezzük, úgy több imid-csoport keletkezik, míg az imid-csoportok kialakulásának gátlására nem reakcióképes szerves folyékony halmazállapotú oldószert, például benzolt használunk, és ugyanezért szabályozzuk a hőmérsékletet. Az amid-képzés ismert módszere szerint a polimert folyékony halmazállapotú ammóniával reagáltatjuk —33 °C hőmérsékleten.

A fenti eljárások általánosan használhatók az imidcsoportokat tartalmazó származékok előállításakor köztes vegyületként használható félamid, félammónium-sók képzésekor, az ammónia tökéletesen diffundál az etilénmaleinsav-anhidrid kopolimer részecskék belső részeibe is, ahogy az a 2. példában megadottakból következik. A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy az etilén-maleinsav-anhidrid típusú kopolimert acetonban oldjuk, majd az oldott polimert acetonban folyékony ammóniával reagáltatjuk. Az előállítani szándékolt félamid, félammónium-só termék kiválik az oldatból, és ezt követően szűréssel, centrifugálással vagy más ismert módszerrel a 2. példa a., b. és c. pontja szerint könnyen elkülöníthetjük. A mellékelt 2. ábrán bemutatjuk a 2a. példában megadottak szerint előállított félamid, félammónium-só termék infravörös abszorpciós spektrumát, a termék 0% imidet tartalmaz.

Az előnyös, imidcsoportokat tartalmazó származék előállítására ezután a köztes félamid, félammónium-sót tovább reagáltatjuk ammóniával, amikor az mind az a. félamid, félammónium-só csoportokat, mind pedig a b. imidcsoportokat tartalmazni fogja oly módon, hogy az imidcsoportok a származtatott csoportok 5 % és 40% közötti mennyiségét képviselik. Adott esetben a félammónium-sócsoportokat más, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sócsoportokká alakíthatjuk át. A reakciót előnyös oldószerrel készült reakcióelegy ben, például toluolban vagy xilolban végezzük, a reakcióelegy forráspontjának megfelelő hőmérsékleten, mindaddig, míg a szükséges mennyiségű imidcsoport kialakul. Ezt az eljárást a későbbiekben a 3. és a 4. példában ismertetjük. A reakcióelegy forráspontja 50 °C és 200 °C, előnyösen 60 °C és 150 °C, legelőnyösebben 100 °C és 150 °C között változhat.

A mellékelt ábrák közül az 1. ábrán bemutatjuk a

3. példa 4. táblázatának 5. kísérlete szerint előállított, mind a. félamid, félammónium-só funkciós csoportokat, mind pedig b. imidcsoportokat, ez utóbbit 20%-ban tartalmazó polimer infravörös abszorpciós spektrumát. A példa szerinti polimer átlagos molekulasúlya 850 és a 20% imidtartalom az előnyös 10% és 25% közé esik.

Az összehasonlítás érdekében előállítjuk az 5. példában a 100% imidcsoportot tartalmazó etilén-maleinsavanhidrid kopolimert. A mellékelt 3. ábrán megadjuk ezen termék infravörös abszorpciós spektrumát.

Az 1. példában részletesen ismertetjük az 1-3. ábrák infravörös abszorpciós spektrumainak analízisét.

A találmány szerinti polimerek rákterápiában felhasználható immunszabályozó hatását jellemző polimer termékekkel az alábbi vizsgálatokkal bizonyítjuk.

Az első kísérletsor folyamán a polimereket vírus által indukált nem metastázisos egérdaganaton vizsgáljuk. Modellként SG40-vírus által indukált fibroszarkomát választunk (m KSA), amely BALB/C egér eredetű. Ezt az m KSA-TU5 daganatot Kit és munkatársai írják le [Int. J. Cancer, 4, 384-392, 1969], és nem gyengül a BALB/C egérben. A kísérletek során a megfigyelt daganatregresszió összefüggőt az immunstimulálással és a daganat súlyának csökkenésévi, jól egyezve Dean és munkatársai [Int. J. Cancer, 16. 465-475,1975] adataival, akik kimutatták, hogy az m KSA daganattal antigének jelennek meg, továbbá, hogy a kis daganatokat hordozó állatokban jó korreláció figyelhető meg a sejttől függő immunitással. Az egereket különböző mennyiségű vizsgált vegyülettel kezeltük az életképes tumorsejtekkel való fertőzés előtt vagy után, vagy előtt is és után is (TDioo és TD_S0). Ezután összehasonlítottuk a tumorok növekedését a nem kezelt kontroll állatok tumorjainak növekedésével. Ezen kísérletek során a 850 molekulasúlyú találmány szerinti polimerek jóval nagyobb daganatregressziót váltottak ki, mint a 2000— 3000 és a 20 000-50 000 közötti molekulasúlyú polimerek.

Egy másik kísérlet során a találmány szerinti polimereket kémiailag indukált metastázisos patkánydaganaton vizsgáltuk. Modellként a 3-metil-kolantrénnel indukált hólyagdaganatot (BLCA) használtuk Fisher 344 patkányokban [lásd Prehn és munkatársai, J. Nat. Can. Inst., 18. 769, 1957; és Fáik és munkatársai, Surgery, 1978. október]. A daganatsejteket sejtkultúrában tartjuk fent 5 év óta. Szubkután beültetést követően egy héten belül metastázisos állapotba kerül a tüdő. A szubkután tumorbeültetést követően a szokásos túlélési idő három hét vagy kevesebb.

A metastázisos patkánydaganat modellel végzett kísérlet egyik részében a vizsgált polimert a tumor beültetését követően hetenként három héten át szakaszosan adagoltuk. Ezeknek a kezelt állatoknak több mint háromszor hosszabb volt a túlélési idejük, mint a nem kezelt kontroll állatoké és a hat hetes megfigyelési időszakban metastázis nem volt megfigyelhető.

A fenti kísérlet egy másik részében a vizsgált polimert a daganat beültetését követő 7-10. napon a tumor kivágásakor adagoltuk. A kezelt állatokat megfigyeltük, hogy a daganat újra jelentkezik-e és az eredményeket a nem kezelt kontroll állatokkal összehasonlítottuk. A kontroll állatokban a tumor újramegjelenése a tumor kivágását követően hat héten belül, átlagosan 32 napon belül 100%-osan újra megjelent, míg a találmány szerinti előnyös polimer testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségével kezelt állatokban az első hat héten tumor nem jelent meg, a 10. hét után a tumor csak az állatok 13 %-ában jelentkezett újra.

Egy további kísérletsorozat során a találmány szerinti jellemző polimereket közönséges Lewis törzsbe tartozó patkányokon vizsgáltuk, és kimutattuk, hogy stimulálják az immunválaszt, amit a megnövekedett antitest-termelés bizonyított.

A közönséges Lewis patkányokkal végzett másik kísérlet során kimutattuk a találmány szerinti polimerek B-sejt-aktiválását, anélkül, hogy T-sejtek megjelentek volna, ami azt jelenti, hogy a polimerek a csecsemőmirigy funkcióját pótolják. A T-sejtek csecsemőmirigymeghatározott limfociták, ugyanakkor a B-sejtek olyan

-4184 229 limfociták, amelyek az ekvivalens szervben vagy a csontvelőben keletkeznek.

Szintén Lewis törzsbe tartozó patkányokon vizsgáltuk a peritoneális makrofágok számának növekedését és a makrofágok latex fagocitozisának aktivitását. A kísérletek szerint a találmány szerinti polimerek B-sejtaktivitásának immunszabályozó hatásra való változása nem a makrofágok aktivitásának hatására jön létre. A találmány szerinti polimerek ezek szerint másképp hatnak, mint a rokon pirán-kopolimerek, amelyek a retikuló-andoteliális rendszeren át hatnak a makrofágok funkciójának növelésére.

A fenti és más vizsgálatok részletes leírását és a megfelelő eredményeket a 8-23. példákban adjuk meg.

A találmány szerinti vegyületet általában hatásos immunszabályozó mennyiségben adagoljuk a tumor kemoterápia, daganatsugárzásos terápia és/vagy daganatműtét során. Mint ahogy a daganatterápia során használt ilyen segédanyagok is, a találmány szerinti vegyületek a terápiával azonos időben, vagy a terápia megkezdése előtt, vagy azt követően megfelelő időben adagolhatok. Általában úgy járunk el, hogy a terápia elkezdése előtt két nappal és a terápia befejezését követően egy hónapon át adagolunk. Vizsgálataink szerint egy előnyös vízben oldódó polimer 30—60 napon belül ürül ki a szervezetből, így az adagolás minden hatodik hétben válik szükségessé.

A találmány szerinti polimereket parenterálisan vagy orálisan adagolhatjuk, például testsúlykilogrammra számítva 1 mg és 100 mg közötti mennyiségben. Adagolhatunk intravénásán és intraperitoneálisan, előnyösen vizes, mint például steril vizes vagy fiziológiás sóoldatban. Orálisan a polimereket tablettaként, porként, kapszulákban, elixírként és hasonló dózis alakban adagoljuk ismert szilárd vagy folyékony halmazállapotú hígítókkal, vivőanyagokkal, szuszpendáló szerekkel és adjuvánsokkal együtt, például kukoricakeményítővel, laktózzal, talkummal, sztearinsawal, magnézium-sztearáttal, zselatinnal, akáciával, növényi gumival, alkohollal, vízzel, dimetil-szulfoxiddal, növényi olajokkal és hasonlókkal együtt. Az orális dózisalak előnyösen szilárd halmazállapotú, amelyet megfelelő folyékony elegyben oldunk az adagolás idején. A szilárd halmazállapot biztosítja az a. félamid, félkarbonsavas-só és a b. imidcsoportok kettős csoportjainak stabilitását. Megfelelő immunszabályozó hatás elérésére alkalmas polimert tartalmazó más dózisalakokat a továbbiakban ismertetett példákban adunk meg. A polimert előnyösen fiziológiás sóoldatban adagoljuk.

A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. A példák kizárólag szemléltető jellegűek, a találmány oltalmi körét nem érintik. A példákban használt kitermelési százalékok az elméleti kitermelési százalékra vannak számítva.

1. példa

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer előállítása

A nyers etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert fűthető 4,5 1 térfogatú belső vízhűtéssel, mágneses keverővei (percenként 1000-1200 fordulat), etilén bevezetővel és egy katalizátor-adagolóval ellátott saválló acélból készült, fűthető és hűthető reaktorban állítjuk elő. A reakcióedény fenekén lévő szeleppel mintákat vehetünk vagy kiereszthetjük a végterméket. A reaktorban 1625 g (1875 ml) etil-benzolt, 190 g (1,94 mól) maleinsavanhidridet és 14,1 g (0,058 mól) benzoil-peroxidot oldunk 80 g (92 ml) etil-benzolban. A katalizátort további 20,0 ml etil-benzollal mossuk be a reaktorba. A reaktort bezáijuk és szobahőmérsékletű etilénnel kihajtjuk a levegőt. Ezután 70 °C hőmérsékletre emeljük a reakciótér hőmérsékletét, és etilénnel a polimerizáció során állandó 11,5 atm nyomást biztosítunk. 3 órán át 70 °C hőmérsékleten és 11,5 atm nyomáson folytatjuk a polimerizációt, majd 9,4 g (0,039 mól) benzoil-peroxidot adagolunk 60 g (70 ml) etil-benzolban. Az adagolócsövet 20 ml etil-benzollal mossuk át. 70 °C hőmérsékleten és 11,5 atm nyomáson etilén-bevezetéssel tartva 14 órán át keveqük, amiután a polimerizáció teljessé válik. A reakció lezajlását követően lehűtjük a reaktort, kiszellőztetjük, a reaktorban etil-benzolban szuszpendált etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer marad vissza, amelynek kis része a ke verőn, a hűtőkígyókon és a reaktor falán van. Ezt a szuszpenziót szűrjük, egyesítjük a reaktorra tapadt anyaggal, és a szűrletben lévő maleinsavanhidridet fenolftalein-átcsapásig végzett nátrium-hidroxidos titrálással meghatározzuk.

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer terméket úgy dolgozzuk fel, hogy szűrés után három alkalommal, egyenként egy órán át két liter xilollal extraháljuk szobahőmérsékleten, az extrakciót 3X2 1 hexánnal, esetenként egy órán át megismételjük, majd szűréssel elkülönítjük a terméket. A szűrést az összes extrakciós lépés közben elvégezzük. A végső etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert csökkentett nyomású térben egy éjszakán át 55 C és 60 °C közötti hőmérsékleten szárítjuk. Az így kapott száraz etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert Waring-malomban porrá őröljük (5 perc) homogenizálás céljából. Az 1. táblázatban megadjuk 7 egymást követő etilén-maleinsav-anhidrid polimerizáció eredményét.

A fenti F termék molekulasúlyának paramétereit meghatároztuk. A terméket 24 órán át 100 °C hőmérsékleten olajpumpával kialakított csökkentett nyomású térben szárítjuk. A paramétereket vízmentes dimetilformamidban méljük. Az F termék numerikus átlagos molekulasúlya (M_n) 852, a meghatározást dimetil-formamidban végeztük 120 °C hőmérsékleten gőznyomás ozmometriával Knauer WP ozmométerben. A súly szerinti molekulasúly (M_w) 5730, amely mérést szintén dimetil-formamidban végeztük kis szögű lézersugár segítségével Chromatix KMX-6 műszerben. A belső viszkozitás dimetil-formamidban 25 °C hőmérsékleten kapilláris viszkoziméterben (Cannon Ubblehode hígításos viszkoziméterben) (75-ös nagyság) 0,0607 dl/g. A mérés során négy különböző koncentrációt extrapoláltunk O koncentrációra.

Nagyobb specifikus viszkozitású (0,11, 1%, dimetilformamid, 25 C-on) etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer M_n, M_w értékeit és belső viszkozitását hasonló módon meghatároztuk. Ebben az esetben a belső viszkozitást 0,1227 dl/g-nak, az M_n értéket 2264-nek és az M_w-értéket 12970-nek találtuk.

Különböző specifikus viszkozitású etilén-maleinsavanhidrid termékek fenti értékeit használva kiszámítottuk a K és a konstansokat abban a standard egyenletben, amely a viszkozitás (rj) és a molekulasúly között az összefüggést, (η) = ΚΜ^α. Az összefüggés a következő:

184 229

1. táblázat

Kísérlet száma	Maleinsav- anhidrid átalakulás, %	Maleinsavanhidrid termék g (kitermelési %)	Hidrogén, % (1)	Szén, % (2)	Specifikus viszkozitás 1% DMF-ban 25 °C-on	Ekvivalens súly (3)
A	91,5	185 (68,8)	4,98	57,34	0,064	138,5
B	98,6	227 (83,6)	5,03	58,11	0,068	139,9
C	98,3	223 (82,1)	5,10	58,15	0,063	140,0
D	98,3	219 (81.1)	5,04	58,24	0,066	139,1
E	97,9	223 (81,7)	5,10	57,89	0,063	140,6
F	97,9	225 (81,9)	5,12	58,14	0,061	141,5
G	98,6	224 (82,4)	5,11	58,05	0,064	140,1

(1) Két mérés átlaga.

(2) Az ASTM D-2515-74 eljárás szerint Ostwald viszkoziméterrel.

(3) A grammokban megadott súly egy mólegység anhidridet tartalmaz, amit vizes oldatban ismert nátrium-hidroxidos potenciometrikus pH-titrálással határozunk meg.

(η)^^{ΠΪΟΓηΐ3ΐηί£ΐ}=4,71Χ10-⁴ (p) dhnetil-formamid _{= 3 5} χ 1θ}-₅

Μη’⁷² és M&⁸⁶

Hullámszám „ / ^port

A találmány szerinti és igénypontban szereplő kopolimerek kapcsán az „átlagos molekulasúly” kifejezést használjuk a numerikus átlagos molekulasúlyra.

Az alábbiakban ismertetjük a funkcionális csoportok meghatározását.

A példákban ismertetett polimer származékok különböző funkcionális csoportjait mind minőségileg, mind mennyiségileg infravörös abszorpciós spektrumanalízissel határozzuk meg Beckman IR-12 spektrofotométerrel. A minták előkészítését, az abszorpciós frekvenciák felvételét és az egész eljárást az imidcsoportoknak az amidcsoportokhoz való arányának meghatározására a „The Infra-red Spectra of Complex Molecules” munka szerint végezzük [Bellamy, John Wiley and Sons, 1960, vagy a következő munka szerint: Practical Infra-red Spectroscopy, Cross, Butterworth, 1964], a minták elkészítésekor minden esetben két mg polimerből és 250 mg vízmentes kálium-bromidból készült tablettát használunk, a tabletták 70 mg vegyes polimert tartalmaznak. A hullámhosszak helyzetét hullámszámban adjuk meg reciprok centiméterben (cm^-1).

A termék összetételének minőségi meghatározását, azaz bizonyos csoportok jelenlétét vagy hiányát az alábbi frekvencia sablon szerint határoztuk meg:

4. Polimer primer amid:	1670 major	C=O
amid I sáv	1620 minor	NH-deformáló dás és C-N nyújtás
5. Karboxilát ion	1560 1570	aszimmetrikus
(COO~)		nyúlás
6. Metiléncsoport	1470-1450	C-H
(-CHJ		deformálás
7. Ammónium (NH4 +) só-	1405-1400	szimmetrikus
ja a karbonsavnak (az erősség függ a kation természetétől)		feszítés
8. Nagymennyiségű imid-	1370-1450
csoportot (50%-nál	minor
többet) tartalmazó	1180-1200	C-N
polimerek dublettel:	major

a 3. esetben megadottakon kívül

1. Öttagú anhidrid-gyűrű dublett:

2. Nem disszociált alifás sav (COOH)

3. Polimer imidcsoport,

5-tagú gyűrű dublett:

Hullámszám (cm1)	Csoport
1870-1830	C = O
minor
1870-1760
major 725-1700	C=O
1715 major 1770 minor	c=o

Az ammónium-karboxilát-csoporton kívül imid- és amidcsoportokat tartalmazó polimerek esetében az utóbbiak minőségi meghatározására a major imidsáv (1715 cm^-1) és a major primer amidsáv (1670 cm^-1) elnyelési intenzitását határozzuk meg. Az imidcsoportok mennyiségének meghatározására a fentiek szerint meghatározott imid/amid mért arányát összehasonlítjuk egy sor olyan infravörös jellel, amit különböző imidcsoportokat és imidcsoportot és amidcsoportot tartalmazó vegyületekből felállított standard görbéből kapunk meg.

A standard görbe felvételéhez szükséges vegyületeket úgy kapjuk, hogy növekvő mennyiségű tiszta (körülbelül 100%-os), az 5. példában megadottak szerint előállított imidet, imidcsoportot, vagy nem izolált karboxilcsoportot nem tartalmazó polimert keverünk csak amid⁶⁰ csoportot és ionizált karboxilcsoportot tartalmazó és a 2. példában megadottak szerint előállított polimerrel.

Az imidcsoport /amidcsoport arány megállapításakor biztosnak kell lennünk abban, hogy az 1715 cm^-1 hullámhosszon nem ionizált karboxilcsoport nincs jelen, ezért először vízben oldjuk a mintát, az oldat pH-ját

184 229 ammónium-hidroxiddal 10,0-re állítjuk be, és fagyasztva szárítjuk, amikor a nem ionizált karboxilcsoportok ammónium-karboxiláttá alakulnak. Ez az eljárás növeli a karboxilátnak megfelelő 1560 és 1400 cm^-1 sávok intenzitását, de biztosak lehetünk abban, hogy az 1715 cm^-1 hullámhosszon jelentkező sáv valóban imideredetű.

A következőkben ismertetett példák szerint előállított termékek jellemzésekor a fentiek szerinti mérés alapján állítjuk, hogy bizonyos funkcionális csoportok jelen vannak vagy hiányoznak, és hogy az imidcsoportot tartalmazó polimer imidcsoport-tartalma mennyi.

2. példa

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer félamidfélammónium-karbonsavas sójának előállítása

Az etilén-maleinsav-anhidrid polimerek ammónizálására ismert előző módszerek (lásd a 3 157 595 számú egyesült államokbeli és a 664 325 számú kanadai szabadalmi leírásokat) háromfélék:

1. A vízmentes etilén-maleinsav-anhidrid port erőteljesen keveijük, és szobahőmérsékleten vízmentes körülmények között ammóniagázt vezetünk rá.

2. Az etilén-maleinsav-anhidrid port benzolban vagy hexánban szuszpendáljuk, majd keverés közben ammóniát vezetünk a szuszpenzióba.

3. Folyékony fölös mennyiségű ammóniába szilárd halmazállapotú etilén-maleinsav-anhidrid port adunk keverés közben, amikor megkapjuk az etilén-maleinsavanhidrid kopolimer félamid-félammónium-karboxilát-sóját, amelyet azonban a találmány szerinti eljárás során nem használhatunk fel. A használhatatlanság oka az, hogy még a finoman porított etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer darabkák belső részébe sem jut be megfelelő idő alatt az ammónia. Hosszabb reakcióidőt használva a termék még mindig tartalmaz nem reagált anhidridet, körülbelül 5 súly százaléknyi mennyiséget, amit az infravörös abszorpciós spektrum 1780 és 1850 cm^-1 frekvenciáin jelentkező anhidridre jellemző sáv bizonyít.

Anhidridet nem tartalmazó termék rövid reakcióidő alatti és durva hőmérsékletszabályozási körülmények között való előállítására a találmány előnyös kivitelezési változata szerint az alábbiak szerint járunk el:

a) az 1. példa F. pontja szerint előállított 80 g etilénmaleinsav-anhidrid polimert 800 ml acetonban oldjuk, az oldatot 20 perc alatt keverés közben 100 ml, 3 1 acetonban lévő folyékony ammóniához öntjük -70 °C hőmérsékleten (a -70 °C hőmérsékletet szárazjég és aceton elegy ében állítjuk elő). A 20 perces adagolási idő után körülbelül 4 óra alatt szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni a reakcióelegyet, ez alatt az idő alatt a kivált termék színe sárgáról fehérre változik. Szűréssel elkülönítjük a terméket, és egymás után kétszer 11 acetonban szuszpendáljuk, majd aceton és hexán 1 :1 arányú elegyének 1,5 1-ben, szintén két alkalommal. A szuszpenziókat 30 percen át keveijük. A végterméket szűréssel elkülönítjük, és egy éjszkán át 45 °C hőmérsékleten és 20—25 Hgmm nyomású térben szárítjuk. 900 ml vízben oldjuk a száraz terméket, az oldatot 0,45 mikron pórusnagyságú szűrőn szűrjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 100%-os kitermeléssel 98,7 g félamid-félammónium-karboxilát-sót kapunk.

b) Az a) eljárást .ismételjük meg az alábbiak szerint: az 1. példa F. pontjában megadottak szerint előállított etilén-maleinsav-anhidrid polimert acetonban oldjuk, azonban az acetonhoz vizet is adunk. A 60 g súlyú etilén-maleinsav-anhidrid polimert 500 ml aceton és 2,32 g víz elegyében oldjuk, az oldatot 2 órán át visszacsepegő hűtő alatt forraljuk. Az etilén-maleinsav-anhidridet tartalmazó acetonos oldatot lehűtés után, keverés közben 10 perc alatt 2 liter, 3 mól folyékony ammóniát tartalmazó acetonhoz öntjük -60 °C hőmérsékleten. Ahogy az előbb eljártunk, a szuszpenziót szobahőmérsékletre hagyjuk melegíteni, majd kétszer 1,5 liter térfogatú acetonban szuszpendáljuk, és egyszer 1 liter hexánban. Ezután szűrjük a terméket, és 40 °C hőmérsékleten 20—25 Hgmm nyomású térben szárítjuk egy éjszakán át. A száraz termék súlya 84 g (kitermelés 100%).

c) Az alábbi eljáráshoz az 1. példa G. pontjában megadottak szerint előállított etilén-maleinsav-anhidrid-polimert használjuk. 100 g (0,714 mól) etilén-maleinsav-anhidrid polimert 700 ml, 3,85 g vizet tartalmazó acetonban melegítjük visszacsepegő hűtő alatt, 2 órán át. Lehűtjük az acetonos oldatot, és 10 perc alatt 3,3 liter, 60 ml folyékony ammóniát tartalmazó acetonhoz öntjük keverés közben -50 °C hőmérsékleten. Egy órán át —50 °C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd két óra alatt szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. Szűréssel elkülönítjük a terméket, és kétszer 2 liter acetonban szuszpendáljuk (30 percig), majd két alkalommal 2 liter hexánban (30 perc esetenként). Szűréssel elkülönítjük a terméket, és egy éjszakán át 50 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomású térben szárítjuk. A kapott száraz félamid-félammónium-karboxilát-só súlya 115,6 g (kitermelés 93%).

A fenti három termék analitikai adatait a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat

Előállítás abc

Nitrogén, % (két meghatározás átlaga) 13,40 14,18 14,19

Az infravörös spektrum szerint jelenlévő csoportok

Anhidrid Nem disszociált karboxil-	nincs	nincs	nincs
csoport	nincs	nincs	nincs
Imidcsoport	nincs	nincs	nincs
Primer amidcsoport	major	major	major
Ionizált karboxilcsoport	major	major	major
Metiíéncsoport	igen	igen	igen
-C00NH4	major	major	major

major = a dublett intenzívebb sávja látható

3. példa

A részleges imid-származék előállítása xilolban.

A 2. példa a) pontjában megadottak szerint előállított félamid-félammónium-karboxilát-só 10 g-ját 250 ml xilolban szuszpendáljuk, olyan egy liter térfogatú edényben, amely keverővei, hőmérővel, vízcsapdával és az ammónia bevezetésére szolgáló bevezetőcsővel van el7

-7184 229 látva. 12 órán át visszacsepegő hűtő alatt melegítjük a szuszpenziót, mialatt a gázbevezetőcsövön ammóniát vezetünk a reakcióelegybe. Meghatározott idők elteltével alikvót mintákat veszünk a reakcióelegyből (lásd 3. táblázat) az imidcsoportok kialakulásának meghatározására. 5 A kivett kis térfogatú mintákat három egymást követő szuszpendálással dolgozzuk fel 100 ml hexánban. Ezután szűrjük, és 50 °C hőmérsékleten 20-25 Hgmm nyomású térben szárítjuk. A terméket 2 %-os vizes oldatának pHját meghatározzuk, majd ammónium-hidroxiddal 10,0-re 10 állítjuk be és fagyasztva szárítjuk. Mindegyik mintából infravörös abszorpciós spektrumot veszünk fel az imid/ amid arány, azaz az imidtartalom százalékos meghatározására. Az eredményeket a 3. táblázaton adjuk meg.

3. táblázat

A xilolban való forralás ideje a minta kivételekor	pH-l(a)	PH-2(b)	Imid/ amidül arány	Imid® súly%
15 perc	6,26	7,20	0,723	13,8
30 perc	6,00	5,86	0,858	18,5
45 perc	5,91	5,76	0,999	23,3
1 óra	5,78	5,53	1,113	27,4
1,5 óra	5,43	5,43	1,398	36,8
2 óra	5,27	5,76	1,501	40,2
3 óra	4,94	5,72	1,821	50,0
4 óra	4,78	5,38	—	—
6 óra	4,73	5,76	—	—
7,5 óra	4,73	5,60	-	—
12 óra	-	-	-	-

(a) a pH-beállítás előtti pH-ja a 2 %-os vizes oldatnak; 35 (b) a 2 %-os vizes oldat pH-ja, amelynek pH-ját 10-re állítottuk be, és fagyasztva szárítottuk;

(c) az infravörös abszorpciós intenzitás 1715 cm’¹ és 1670 cm^-1 hullámsávon mért aránya;

(d) standard görbéből kapott eredmények az imid/amid 40 arányból számítva.

Kilenc további kísérletet végeztünk, amelyben a 2. példa b. pontjában megadottak szerint előállított félamid-félammónium-karboxilát-sót használtunk. Mindegyik kísérlet során a 4. táblázatban megadott ideig xilolban visszacsepegő hűtő alatt forraltuk a reakcióelegyet, és a mintákat feldolgoztuk. A szárított termékeket, amelyeket hexános mosás után kaptunk, egyenként 150 ml vízben oldjuk, az oldatok pH-ját ammóniumhidroxiddal 10,O-ra állítjuk be, 0,2 mikron pórusnagyságú szűrőn szűrjük az oldatot, és in vivő állatkísérletekhez steril szérum-edényekben közvetlenül fagyasztva szárítjuk. A 4. táblázatban megadjuk a kitermelést és a különböző minták analitikai adatait.

4. példa

A részleges imid-származék előállítása toluolban.

A 3. példában megadottakat ismételjük meg a részleges imid-félamid-félammóniurii-karb oxil-etilén-maleinsav-anhidrid polimer előállítására, azzal a különbséggel, hogy az imidképzés arányát változtatjuk oly módon, hogy a toluol forráspontjának (110 °C) megfelelő hőmérsékleten dolgozunk, a xilol helyett toluolt használva.

Az etilén -maleinsav-anhidrid kiindulási anyagot az 1. példa F. pontjában megadottak szerint állítjuk elő, a félamid-félammónium-só előállítását pedig a 2. példa a. pontjában megadottak szerint végezzük víz adagolása nélkül. Ez a termék az infravörös abszorpciós spektrum szerint primer amidot, ionizált karboxilcsoportot és ammónium-karboxilátot tartalmaz, ugyanakkor anhidridvagy imidcsoportot nem. 28 g ilyen amid-ammónium-sót egy liter toluolban szuszpendálunk, a szuszpenziót visszacsepegő hűtő alatt forraljuk. A második órában, a 3,5. órában és az 5. órában három alikvót mintát veszünk. A terméket szűréssel elkülönítjük, 150 ml toluolban háromszor szuszpendáljuk, ezután petrol-éterben háromszor szuszpendáljuk, majd elkülönítjük, csökkentett nyomású térben (25 Hgmm) 17 órán át szobahőmérsékleten szárítjuk. A száraz terméket ezután 100 ml vízben

4. táblázat

Kísérlet száma	A xilolos forralás ideje	Kitermelés g kitermelési %	pH-l(a)	pH-2®	Nitrogén^ %	Imid/amid arány®	Imid<e) %
1.	2 perc	4,45 (90,1)	5,03	7,08	14,27	0,489	5,3
2.	4 perc	3,92 (92,6)	4,85	6,93	14,28	0,559	7,9
3.	10 perc	7,87 (80,5)	4,43	7,12	14,48	0,661	11,5
4.	20 perc	6,28 (81,1)	4,52	6,74	13,82	0,798	16,5
5.	30 perc	6,15 (80,1)	3,99	6,39	13,67	0,911	20,4
6.	45 perc	6,30 (82,7)	4,60	6,69	13,71	1,020	24,1
7.	1 óra	6,30 (83,4)	4,70	6,22	13,80	1,139	28,2
8.	1,5 óra	6,15 (82,6)	4,37	6,00	13,07	1,333	34,7
9.	3,0 óra	5,90 (81,9)	4,33	5,81	12,52	1,828	50,1

(1) Az 1. kísérlet során 5,0 g félamid-félammónium-karboxilát-sót használtunk, a 2. kísérlet során 4,3 g-ot, a 3. kísérletben 10,0 g-ot, végül az utolsó esetben 8,0 g-ot.

(a) A pH-beállrtás előtti 2 %-os vizes oldat pH-ja.

(b) A 10,0 pH-ra beállított és fagyasztva szárított termék 2%-os vizes oldatának pH-ja.

(c) A pH-beállítás után fagyasztva szárított termékből határozzuk meg.

(d) Lásd a 3. táblázat c. pontjában megadottakat.

(e) Lásd a 3. táblázat d. pontjában megadottakat. Ebben az esetben fagyasztva szárított terméket használtunk. 8

184 229 oldjuk, az oldat pH-ját ammónium-hídroxiddal 9,0-re állítjuk be, majd 0,20 mikron pórusnagyságú szűrőn szűrjük, és in vivő állatkísérletekhez steril szérum-edényekben fagyasztva szárítjuk. A következő eredményeket kapjuk: 5

Toluolos forralási idő (óra)

Termék, Nitrogén, Imid/amid³ g % arány

Imid^b %

2	6,15	13,78	0,531	6,5
3,5	7,73	13,41	0,600	9,5
5	9,24	13,82	0,647	11,0

táblázat (c) pontját. Fagyasztva szárított (a) Lásd a 3 termék.

(b) Lásd a 3. táblázat (d) pontját. Fagyasztva szárított termék.

5. példa

Az etilén-maleínsav-anhidrid teljes imid-származékának előállítása

Az etilén-maleinsav-anhidrid specifikus viszkozitása: 0,061.

A 2. példa a. pontjában megadottak szerint előállított termék 20 g-ját 250 ml xilolban szuszpendáíjuk, a szuszpenzión 18,5 órán át folyamatos áramban ammóniát vezetünk, a reakció során keletkező vizet Dean—Starkcsapdával távolítjuk el. A csapdában 2,7 ml víz gyűlik össze. Szűrjük a terméket, három alkalommal hexánban szuszpendáíjuk, majd ezt követően egy éjszakán át 35 szobahőmérsékleten és 25 Hgmm nyomású térben szárítjuk. A száraz végtermék súlya 13,5 g (kitermelés 84,3 %). 3 g terméket 150 ml vízben oldunk, az oldatot egy éjszakán át keveijük, majd szüljük, vízzel mossuk és fagyasztva szárítjuk. A termék nitrogéntartalma 9,53% 40 és az infravörös abszorpciós spektrumban az 1190, 1360, 1715 és 1770 cm^-1 hullámhosszakon, az imidcsoportokra jellemzően elnyelési maximumokat találunk.

A spektrumban amid-, anhidrid- vagy ionizált karboxilcsoport, vagy ammónium-karboxilát jelenlétére utaló el- 45 nyelési maximumok nem látszanak.

A fenti teljes imid-terméket használtuk különböző adalékanyagokkal együtt az imidcsoportokat nem tartalmazó és a 2. példa a. pontjában előállított félamid-félammónium-karboxilát-sóval együtt az előzőekben meg- 50 adottak szerinti standard imid/amid infravörös görbe felvételekor. Az alábbiak szerint járunk el: az adott mennyiségeket analitikai mérlegen méljük, és saválló acélból készült Wiglebug keverőben összekeveijük. Az infravörös abszorpciós spektrumot a fenti keverékekből 55 és kálium-bromidból készült tabletákkal határozzuk meg, a tabletták 2 mg polimer keveréket és 250 mg kálium-bromidot tartalmaznak. A tabletta 70 mg polimert tartalmaz tablettánként. A teljes standard görbét az alábbiak szerint kevert készítményekből határoztuk 60 meg:

Az 5. példában megadottak szerint előállított teljes imid súlya, mg	Az imidet nem tartalmazó 2a. példa szerint előállított termék súlya, mg	Imid/amid elnyelési arány
3	97	0,427
6	94	0,509
10	90	0,621
20	80	0,843
30	70	1,161
40	60	1,519
50	50	1,871
60	40	2,099
70	30	2,564
80	20	3,008

A. példa

A 0,66 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidrid teljes imidjének előállítása

Az 5. példában használt vegyületnél nagyobb molekulasúlyú etilén-maleinsav-anhidrid teljes imidjének előállítására 0,66 specifikus viszkozitású (1%, dimetilformamid, 25 °C), 20 000—30 000 molekulasúlyú etilénmaleinsav-anhidridből indulunk ki. Ebben az esetben az ammóníázott etilén-maleinsav-anhidridet a 6. példa a. pontjában megadottak szerint állítjuk elő, nevezetesen oly módon, hogy az etilén-maleinsav-anhidrid poron át vízmentes ammóniagázt vezetünk át keverés közben 70 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten. A kapott félamidfélammónium-karboxil-etilén-maleinsav-anhidrid-sót (specifikus viszkozitás: 0,66) a félamid imiddé alakítására, azaz a víz kiűzésére magasabb hőmérsékleten melegítjük.

Úgy járunk el, hogy 525 g 0,66 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidrid-félamid-félammónium-karboxil-sót 14 liter térfogatú edényben erőteljesen keverünk. A reakcióedényben vízlevezető van. A keverés közben ammóniagázt vezetünk át a són. 122 °C-ra emeljük a hőmérsékletet, amikor a víz kezd összegyűlni a vízcsapdában. Egy óra múlva 152 °C-ra emeljük a hőmérsékletet, amikor 24 ml víz távozik. 5 órán át folytatjuk (összesen 6 órán át) a keverés közbeni melegítést, és az ammónia bevezetést, amikor összesen 54 ml vizet távolítunk el. lehűtjük a reakcióedényt, a terméket fehér színű por alakú anyagként kapjuk meg. A termék nitrogéntartalma 11,11%, az elméleti nitrogéntartalom 11,20%.

Ezt a nagy molekulasúlyú 100% imidtartalmú etilénmaleinsav-anhidridet független vizsgáló laboratóriumban 1958-ban daganatnövekedés gátlására vizsgálták, és aktivitást nem tapasztaltak (lásd a 22. példát).

6. példa

Az etilén-maleinsav-anhidrid félamid-félammóniumkarboxil-sójának előállítása az irodalomban ismert módszerekkel vízzel és anélkül

-9184 229

a. Négynyakú 500 ml-es edényt teflon keverővei, hőmérővel, gázbevezetővel és gázkivezető szeleppel látunk el. Az ammóniagáz bevezetésére szolgáló vezetéket gázórával szereljük fel a bevezetett gáz kvalitatív meghatározására. Az edénybe 25 g, az 1D. példában megadottak szerint előállított etilén-maleinsav-anhidrídet adagolunk, és percenként ötszázat forduló keverővei keverjük a port. Az ammónia bevezetését olyan sebességgel végezzük, hogy a reakcióedényben 70 C hőmérséklet alakuljon ki anélkül hogy melegítenénk azt, perc múlva a por alakú termék hőmérséklete eléri a 70 °C-t, ekkor az ammóniagáz bevezetését annyira csökkentjük, hogy ez a hőmérséklet maradjon meg. 1,5 órán át 70 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióhőt, majd lezárjuk az ammóniagáz bevezetésére szolgáló szelepet, és lehűtjük a reakcióterméket nitrogéngázzal. 98,8 %-os kitermeléssel 30,8 g száraz, ammóniázott etilén-maleinsav-anhidridet kapunk félamid-félammónium-karboxilátként. A termék nitrogéntartalma 11,01, 14,18; a termékből készült 2 %-os vizes oldat pH-ja 6,07.

Az infravörös abszorpciós spektrum az alábbi elnyelési maximumokat mutatja:

nem reagált anhidrid: 1780 és 1850 cm¹ (kevesebb, mint 5 % becsülve), primer amidcsoport: 1670 és 1620 cm ¹ (major), karboxilátion: 1565 cm ¹ (major),

NH^-karboxilát: 1405 cm^-1 (major), imid: nincs.

b. Az 1D. példában megadottak szerint előállított etilén-maleinsav-anhidrid újabb ammónizációját végezzük el az a. eljárásváltozat szerint, azzal a különbséggel, hogy az etilén-maleinsav-anhidridet az alábbiak szerint először vízzel kezeljük, amivel fokozzuk az ammónia és az anhidrid komponens reakcióját. Úgy járunk el, hogy 25 g etilén-maleinsav-anhidridet percenként ötszázat forduló keverővei keverünk 40 C hőmérsékleten 6 órán át 0,53 g (17 mól%) víz jelenlétében, amit az első 20 percben cseppenként adagolunk 1,0 ml-es injekcióstüvel. 6 óra múlva szobahőmérsékletre hűtjük a por alakú terméket, és az ammóniázást a fenti a. pont szerint eljárva végezzük, miközben úgy alakítjuk a reakciót, hogy a reakcióelegy a 70 °C hőmérsékletet 10 perc alatt érje el. A teljes ammóniázás ideje 70 °C hőmérsékleten 1 óra, amiután nitrogénnel lehűtjük a terméket. 100,8 %-os kitermeléssel 31,4 g terméket kapunk, amelynek nitrogéntartalma 14,02, 13,94%; a termékből készült 2 %-os vizes oldat pH-ja 6,45. Az előállított vegyületből felvett infravörös abszorpciós spektrumban az alábbi elnyelési sávok láthatók:

nem reagált anhidrid: van jelen, de sokkal kevesebb, mint a fenti a. pont szerint előállított termékben; primer amidcsoport: major, ahogy az a. pont szerinti termékben;

karboxilion: NH^-karboxiláttal;

NH4-karboxilát: több, mint az a. pont szerinti termékben;

imidcsoport: nincs jelen.

7. példa

Előzőleg előállított termékek (gyakorlatilag a 6. példa szerint kapott anyagok) jellemzése

1956 júliusa és 1960 februárja között több félamid10 félammónium-karboxilát-só-származékot állítottunk elő különböző viszkozitású (különböző molekulasúly) etilén-maleinsav-anhidrid polimerekből. A viszkozitás mérléke specifikus viszkozitásban 1,0%-os dimetil-formamiddal készült oldatban 25 °C hőmérsékleten a következő értékű volt: 1,19, 0,60, 0,11-0,060. A becsült molekulasúly (Mn) a fenti értékeknek megfelelően a következő: 50 000-60 000; 20 000-30 000; 2000-3000 és 1000. Az első három terméket, azaz a 0,11, 0,60 vagy 1,19 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidridet nagy kísérleti üzemi készülékben ammóniáztuk, amiután 300—400 kg-nyi terméket kaptunk. A kis viszkozitású (0,060) etilén-maleinsav-anhidridet kisebb laboratóriumi készülékben ammóniáztuk, a kísérletek során 200-300 g etilén-maleinsav-anhidridet használtunk. A termékek jellemzése előtt ismertetjük az előállítás folyamatát.

A kísérleti üzemi eljárás az 1,19, 0,60 és 1,011 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidridből kiindulva.

Az ammóniázásra használt tartály saválló acélból készült Stokes forgatható szárító (Modell 59AB), amit hűtőköpennyel vettünk körül, és szárazgőz és vízmentes ammónia bevezetésére tettünk alkalmassá. A tartályba helyezett keverő percenként 5,7-et fordul, a tartály megdönthető a végtermék eltávolítására.

A tartály teljes térfogata 110 m³, a munkatér 75 m³ és a hűthető vagy fűthető tér 180 m³. Jellemző kísérlet során lezárjuk az ammónia bevezetésére szolgáló szelepet és 250—300 kg megfelelő viszkozitású etilén-maleinsavanhidridet adagolunk a keverő folyamatos működése közben. 55 °C hőmérsékletre melegítjük a polimert, majd prehidrolizáljuk oly módon, hogy 1 mól etilénmaleinsav-anhidridre számítva 0,15-0,20 mól vizet vezetünk be szárazgőz adagolásával. 0,5 kg etilén-maleinsav-anhidridre számítva 3 óra alatt 0,035 kg gőzt használunk. Ez alatt az idő alatt a reakciókeverék hőmérsékletét hűtővizet használva a köpenyben 55 °C és 75 °C között tartjuk. Ezután a részlegesen hidrolizált etilén-maleinsav-anhidrid felületére vízmentes ammóniagázt vezetünk, olyan ütemben, hogy a hőmérséklet 60 °C és 70 °C között maradjon (körülbelül 2,5 kg óránként). A reakciót addig folytatjuk, míg mólnyi mennyiségű etilénmaleinsav-anhidridre számítva 2,0 mól ammóniát adtunk. Az összes ammónia beadagolását követően 50 °C hőmérsékletre hűtjük a terméket, és tárolótartályokba töltjük.

A 0,06 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidriddel végzett laboratóriumi eljárás:

A kiindulási etilén-maleinsav-anhidridet az 1. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a reaktorba 267 g maleinsav-anhidridet, 2089 ml etil-benzolt, 45,8 ml n-butil-aldehidet és 13,20 g benzoilperoxidot adunk, a reakció kezdetén. Az etilénnel kialakított nyomást 24 órán át 70 °C hőmérsékleten 12 atmoszférán tartjuk. A reakció végén 73,3 %-os kitermeléssel 279 g 0,060 specifikus viszkozitású (1%, dimetilformamidban, 25 °C hőmérsékleten) etilén-maleinsavanhidridet kapunk. 5 liter térfogatú négynyakú lombikba 249 g 0,060 specifikus viszkozitású etilén-maleinsav-anhidrid szilárd halmazállapotú port adunk, a port 6 órán át 45 °C és 55 °C közötti hőmérsékleten keverjük, miközben részleges hidrolízisre cseppenként 5,3 g vizet (az etilén-maleinsav-anhidridre számítva 15 mól %) adagolunk. Száraz vízmentes ammóniával kezdjük az ammóniázást oly módon, hogy az erőteljesen kevert szilárd halmazállapotú etilén-maleinsav-anhidrid porba vezetjük

-101

184 229 az ammóniát, és a reakció hőmérsékletét 18 órán át 31 °C és 32°C között tartjuk. Ez alatt az idő alatt lassú, de állandó ammóniafelvétel figyelhető meg. A végtermék súlya 320 g (103,3 %-os kitermelés).

A fenti összes termék jellemzését az 5. táblázatban 5 adjuk meg.

Az 1957. és 1960. között előállított és abban az időben jellemzett etilén-maleinsav-anhidrid félamid-félammónium-karboxilát mintákat abban az időben jellemeztük (lásd 5. táblázat), majd 1977 elejéig általános célokat 10 szolgáló raktárban üvegedényben tároltuk, amelyet közönséges csavaros fedővel zártunk le (nem nitrogén alatt, sem más módon leforrasztva). 1977-ben további kísérletekre elővettük a mintákat (lásd 9. és 10. példákat). Az anyagok újrahasználta előtt újra jellemeztük őket, a jellemzés eredményeit a 6. táblázatban adjuk meg.

Az 1959—1960-ban jellemzett minták (lásd 8. példa), amelyek akkor imidcsoportot nem tartalmaztak, ammóniát és vizet vesztettek, így a hosszú időn át tartó tárolás során imidet tartalmazó polimerré alakultak át. Ezeket az átalakult termékeket a 9. és 10. példákban mostanában újra vizsgáltuk, és az előző eredményekhez képest váratlanul különböző eredményeket kaptunk.

5. táblázat

Meghatározás	D	c	B	A
Etilén-maleinsav-anhidrid (1)
specifikus viszkozitása	1,19	0,60	0,11	0,060
Molekulasúly 50-	-60 000*	20-30 000*	2300**	1060**
Ammóniázott termék:
CRDkód:	S-24	334	333	337
az előállítás éve:	1957	1957	1956	1960
nitrogén %	15,83	16,86	14,80	13,83
Infravörös abszorpciós spektrum
A kísérlet dátuma:	—	1959. V. 22.	1959. VI. 8.	1960. VII. 5.
Anhidrid	—	nincs	nincs	nincs
Karbonsav (karboxilcsoport)	-	nincs	nincs	nincs
Imidcsoport	-	nincs	nincs	nincs
Primer amidcsoport	-	jelen van	jelen van	jelen van
Karboxilátion (COO~)	-	jelen van	jelen van	jelen van
Ammónium-karboxilát	—	jelen van	jelen van	jelen van

(1) 1%, dimetil-formamid, 25 °C hőmérsékleten.

* Becsült M_n a viszkozitásból számítva — M_n görbe összefüggése.

** 1960 decemberében határoztuk meg ebulliometrikus módszerrel, acetonban való forráspont emelkedéssel.

6. táblázat

Meghatározás	D	C	B	A
Ammóniázott termék:
Identifikációs kód	S-24	334	333	337
Az 5. táblázatnak megfelelő
jel	D	C	B	A
Nitrogén-tartalom, %-ban	14,02	12,46	12,53	12,62
Infravörös jellemzés
A kísérlet dátuma:	1977	1978	1977	1977
Anhidrid	nincs	nincs	nincs	nincs
Karbonsav (karboxilcsoport)	nincs	nincs	nincs	nincs
Imidcsoport	jelen van	jelen van	jelen van	jelen van
Primer amidcsoport	jelen van	jelen van	jelen van	jelen van
Karboxilátion (COO“)	jelen van	jelen van	jelen van	jelen van
Ammónium-karboxilát	jelen van	jelen van	jelen van	jelen van
Imid/amid elnyelési
hányados	0,890	0,922	1,180	0,950
Imidcsoport, %	19,5	20,7	29,5	21,7

-111

184 229

A továbbiakban ismertetjük a találmány szerinti vegyületek tulajdonságait.

8. példa

1959. és 1960. között három különböző molekulasúlyú etilén-maleinsav-félamid-félammónium-karboxilátszármazékot (imid-csoportot nem tartalmaznak, lásd 7-V-A, B és C példa) használtunk egymástól függetlenül szolid Sarcoma-180-ra történő hivatalos vizsgálatnál, amit a Cancer Chemotherapy National Service Center (CONSC) határozott meg, és amit a National Institutes of Health bocsátott rendelkezésre. Az eljárás toxikus limitként hat közül két állat halálát engedi meg. A TjC arányt számítottuk, ami a kezelt állatok (T) átlagos daganatsúlyát, illetve a kontroll állatok (C) átlagos daganatsúlyát reprezentálja. A T/C értékeket egy sorozat kísérletből számítottuk, abban az esetben, ha az előkísérletek megfelelő eredményt adtak. A vizsgált anyag akkor elfogadható, ha a három kísérlet során a (T/C)! X X (T/C)₂ X (T/C)₃ kevesebb, mint 0,08 az utolsó kísérlet után. A kísérleteket folytattuk abban az esetben, ha a (T/C)i kisebb volt, mint 0,54 és ha a (T/C)i X(T/C)₂ kisebb volt, mint 0,20. A kísérletek során használt állatok Swiss egerek (CCNSC, XIV vonal). A vizsgált vegyületet intraperitoneálisan adagoljuk (III specifikáció), a dózist a XII specifikáció szerint határoztuk meg.

A fenti kísérletek eredményeit a 7. táblázatban adjuk meg.

Úgy találtuk, hogy a molekulasúly csökkenésével csökken ugyan a toxicitás, azonban az aktivitás elvész, ahogy a molekula nagysága az inaktív monomer csoport nagysága felé közelít. Hasonló származékokat, amelyek 5 részleges imid-funkciós csoportokat tartalmaznak, nem állítottunk elő és nem vizsgáltunk a CCNSC-eljárással, vagy bármely más vizsgálattal 1959. és 1960. között. Az összes (3) polimert (A, B és C, lásd előbb) elvetettük, amikor CCNSC-eljárással vizsgáltuk őket a carcinoma '⁷55 és a Leukémia 1210 sejtekkel.

¹⁵ 9. példa

A 7. példa 6. táblázatában ismertetett A, B és D, három különböző specifikus viszkozitású etilén-malein20 sav-anhidrid kiindulási vegyületből készített, és így három különböző molekulasúlyú polimer vegyületet BALB/c egereknek adagoltunk három dózisterv szerint: (a) SV 40 (mKSA-TU5) tumorsejtekkel való fertőzés előtt (a 9. és 1. napon), vagy (b) a tumorral való fertőzés 25 után (1. nap és 9. nap), vagy (c) mind a tumorral való fertőzés előtt (9. nap és 1. nap) és után (1. nap és 9. nap). A vizsgált vegyületet intraperitoneálisan (IP) adagoljuk három dózisban, 62,5, 125,0 és 250,0 mg/kg mennyiségben. A tumorsejteket szubkután (SC) inoku30 láljuk, nevezetesen az állatok egyik csoportjának 1X10⁴

7. táblázat

Meghatárczás	D	c	B	C
Vegyület (5. táblázat,
7. példa)		A++	B	C
Etilén -maleinsav-anhidrid
specifikus viszkozitása	-	0,060	0,11	0,60
A termék száma	U-l 104*	CRD337~	CRD333	CRD334
1. kísérlet:
dózis mg/kg-ban	500	500	575	60
elpusztult/teljes	2/6	2/6	0,7	1/7
(T/C)!	0,89	0,45	0,337	0,180
megjegyzés	elvetettük	folytattuk	folytattuk	folytattuk
2. kísérlet:
dózis mg/kg-ban	—	500	375	60
elpusztult/teljes	-	2/6	1/7	2/6
(T/C)2	-	0,29	0,139	0,51
(T/C)i X(T/C)2	-	0,13	0,053	0,093
megjegyzés	-	folytattuk	folytattuk	folytattuk
3. kísérlet:
dózis mg/kg-ban	—	500	375	60
elpusztult/teljes	-	1/6	1/6	1/6
(T/C)3	-	0,77	0,15	0,50
(T/C), X (T/C)2 X (T/C)3	-	0,10	0,008	0,046
megjegyzés	—	folytattuk	elfogadva	elfogadva

⁺ Az U-l 104 a szukcinaminsav ammóniumsója, az A, B és C polimerek monomer funkcionális csoportja.

Kétszer vizsgáltuk. A második vizsgálat során 500 mg/kg dózissal az elpusztult/teljes arány: 1/6 és a (T/C)i: 1,39.

-121

184 229 sejtet, az állatok másik csoportjának 1X10³ sejtet. Ezután összehasonlítjuk a tumorsejtek növekedését a kezelt és a nem kezelt kontroll egerekben. A kísérletek adatait a 8A., 8B. és 8D. táblázatokban adjuk meg. A 8A. táblázat szerint a 7. példában ismertetett 6A. táblázat szerinti 5 polimer az (a) dózisterv szerint adagolva olyan hatást vált ki, hogy a tumorral fertőzött egerek 48 %-a (36-17) egészséges marad, és tumormentes az 58 napos megfigyelési periódusban. A 61. napon a tumormentes egereket életképes tumorsejtekkel (mKSA-TU5, szubkután 10 1X10⁴ sejt) újra fertőzzük, amikor 82%-uk, 17—14 ismét tumormentes marad (azaz immunis) a fertőzést követő 37 napon át.

A 7. példa során ismertetett 6A. táblázat szerinti vegyületet a (b) dózisadagolás szerint a tumorfertőzést 15 követően adagoltuk, amikor az 58 napon át tartó megfigyelés során az állatok 42 %-a (36-15) rezisztens maradt a daganatra. Az újrafertőzés után (a 61. napon) az 1X10⁴ életképes tumorsejtet kapott állatok 80 %-a (15-12) daganatmentes maradt a 37. napig. 20

A 7. példában ismertetett 6. táblázat A vegyületet a (c) dózisadagolási terv szerint a daganatfertőzés előtt és után adagoltuk, amikor az 58 napos megfigyelési szakasz során az állatok 28 %-a (36—10) rezisztens maradt a daganatra, ugyanakkor a második tumorfertőzés során ezek 25 a tumormentes állatok mind immunisnak bizonyultak.

A 7. példában megadottak szerint előállított és a 6. táblázatban bemutatott B polimert csak 1X10⁴ élő mKSA-TU5 szubkután adagolt sejtekkel fertőzött egereken vizsgáltuk (lásd 6B. táblázat). Ha az (a) dózisterv szerint adagoltuk a vegyületet, úgy az állatok 22 %-a (18-4) maradt daganatmentes az 51 napig tartó megfigyelés alatt. A (b) terv szerint adagolt polimerrel az 51 napig tartó megfigyelés alatt hasonlóképpen a fertőzött egerek 22 %-a maradt tumormentes (18—4). A (c) csoportban 51 nap alatt 18 állatból csak 2 (11%) maradt tumormentes. Az 54. napon az összes fenti tumormentes egeret (54—10) 1X10⁴ életképes mKSA-TU5 sejttel fertőztük szubkután, és 37 nap múlva 10 marad tumormentes (azaz immunis).

A 7. példában megadottak szerint előállított és a 6. táblázatban bemutatott D polimert a 7. példa 6. táblázatának A vegyületéhez hasonlóan vizsgáltuk oly módon, hogy kétféle mennyiségű tumorsejttel fertőztük (lásd 8D. táblázat). Ez a vegyület sokkad nagyobb molekulasúlyú, mint a 7. példa A vagy a 7. példa B vegyülete, így ezt a vegyületet intraperitoneálisan adagoltuk testsúlykilogrammra számítva 75, 50 és 25 mg-mos mennyiségben. Az (a) dózisterv szerinti adagoláskor a tumorral fertőzött egerek 11 %-a (36-4) maradt tumormentes a 36 napos megfigyelési időszak alatt. Ezek 75 %-a (4-3) maradt tumormentes a második tumorsejt fertőzést

8A. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelés módja	A tumor növekedése a kezelt állatokban, 58. nap	Tumor- mentes, 58. nap
1X104	SC kontroll			6/6	0
1X104	7. példa 6. táblázat-A polimer	250	Nap -9 és -1	6/6	0
1X104	polimer	125	Nap —9 és -1	4/6	2
1X104	polimer	62,5	Nap -9 és -1	2/6	4
1X104	polimer	250	Nap +1 és +9	1/6	5
1X104	polimer	125	Nap+1 és +9	2/6	4
1X104	polimer	62,5	Nap +1 és +9	4/6	2
1X104 1X104	polimer polimer	125	Nap -9 és -1 Nap +1 és +9 Nap +1 és +9	3/6 4/6	3 2
1X104	polimer	62,5	Nap +1 és +9	4/6	2
1X103	SC kontroll	—	__	6/6	0
1X103	7. példa 6. táblázat-A polimer	250	Nap —9 és —1	1/6	5
1X103	polimer	125	Nap —9 és —1	2/6	4
1X103	polimer	62,5	Nap -9 és -1	4/6	2
1X103	polimer	2.50	Nap+9 és +1	3/6	3
1X103	polimer	125	Nap +9 és +1	6/6	0
1X103	polimer	62,5	Nap +9 és +1	5/6	1
1X103	polimer	250	Nap -9 és -1	6/6	0
1X103	polimer	125	Nap +9 és +1	5/6	1
1X103	polimer	62,5	Nap +9 és 4-1	4(6	2

-131

184 229

8Β. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelés módja	A tumor növekedése a kezelt állatokban, 51.nap	Tumor- mentes, 51. nap
1X1O4	SC kontroll		_	5/6	1
1X1O4	7. példa 6. táblázat-B
	polimer	250	Nap -9 és -1	6/6	0
1X1O4	polimer	125	Nap -9 és -1	3/6	3
1X1O4	polimer	62,5	Nap -9 és -1	5/6	1
1X1O4	polimer	250	Nap +1 és +9	5/6	1
1X1O4	polimer	125	Nap +1 és +9	4/6	2
1X1O4	polimer	62,5	Nap +1 és +9	5/6	1
1X104	polimer	250	Nap —9 és —1 Nap +1 és +9	5/6	1
1X104	polimer	125	Nap —9 és —1 Nap +1 és +9	5/6	1
1X104	polimer	62,5	Nap -9 és -1 Nap +1 és +9	6/6	0
1X103	Nem vizsgáltuk

8D. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelés módja	A tumor növekedése a kezelt állatokban, 36. nap	Tumormentes, 36. nap
1X1O+4	SC kontroll		—	6/6	0
1X10+4	7. példa 6. táblázat-D polimer	75	Nap —9 és —1	6/6	0
1X10+4	polimer	50	Nap -9 és -1	5/6	1
1X10+4	polimer	25	Nap -9 és -1	6/6	0
1X1O+4	polimer	75	Nap +1 és +9	6/6	0
1X1O+4	polimer	50	Nap +1 és +9	6/6	0
1X10+4	polimer	25	Nap +1 és +9	5/6	1
1X10+4	polimer	75	Nap —9 és —1	6/6	0
1X1O+4	polimer	50	Nap +1 és +9	6/6	0
1X1O+4	polimer	25	Nap +1 és +9	6/6	0
1X10+3 1X1O+3	SC kontroll 7. példa 6. táblázat-D polimer	75	Nap —9 és -1	6/6	5
1X1O+3	polimer	50	Nap -9 és -1	4/6	2
1X10+3	polimer	25	Nap -9 és -1	5/6	1
1X1O+3	polimer	75	Nap +9 és +1	6/6	0
1X1O+3	polimer	50	Nap +9 és +1	6/6	0
IX10+3	polimer	25	Nap +9 és +1	4/6	2
1X1O+3	polimer	75	Nap -9 és -1	6/6	0
1X1O+3	polimer	50	Nap +9 és +1	5/6	1
1X10+3	polimer	25	Nap -9 és -1	2/6	4

-141

184 229 követő 37 nap alatt. A (b) módon kezelt állatok 8 %-a (36—3) maradt tumormentes 36 nap alatt a primer tumorfertőzés után, és csak egy ezek közül volt immunis a második tumorfertőzéskor. A (c) dózisterv szerint 'rezeit állatok (ahol a 7. példában ismertetett 6. táblázat- 5 bán megadott D polimert a tumorfertőzés előtt és után is adagoltuk, az állatok 14 %-a (36-5) maradt tumormentes 36 nap alatt, továbbá az 5 állat közül 4 (80%) immunis volt a másodlagos tumorfertőzéssel szemben.

A 8A., B. és D. táblázatokban ismertetett tumor- 10 mentes állatok két csoportra oszthatók: 1. azok az állatok, amelyek a megfigyelési időszak alatt tumormentesek maradtak, és 2. azok az állatok, amelyek mérhető daganattal rendelkeztek a megfigyelési idő alatt, és amely fokozatosan csökkent és eltűnt a megfigyelési időszak 15 vége előtt.

A regresszált tumorok megjelenése és a tumormentesség állapota függ a fertőző tumorsejtek mennyiségétől és a használt polimertől. A regresszálódott tumorok és a tumormentes állatok számát a 8E. táblázatban ismer- 20 tétjük.

10. példa 25

A 7. példában ismertetett 6. táblázat A polimeijét az előző 9. példában megadottak szerint újra vizsgáljuk, azzal a különbséggel, hogy vizsgálati csoportként 10 30 egeret használunk, és csak az (a) és (b) kezelési módszert alkalmazzuk. Az adatokat a 9. táblázatban foglaljuk össze.

Az (a) dózisterv szerint a polimert a tumorfertőzés előtti 9. és 1. napon adjuk, ekkor a tumorral fertőzött 35 egerek 37 %-a (60-22) maradt tumormentes a 61 napos megfigyelési periódus alatt. A 62. napon a tumormentes állatok közül 21-et 1X10⁴ mKSA-TU5 tumorsejttel fertőzünk szubkután, majd megfigyeljük, hogy 30 további nap múlva az állatok 90 %-a (21-19) tumormentes 40 (immunis).

A (b) dózisterv szerint a polimert a tumorfertőzés utáni 1. és 9. napon adagoljuk, ekkor az egerek 47 %-a (60-28) maradt tumormentes a 61 napos megfigyelési periódus alatt. A 61. napon a 28 tumormentes állatot újra fertőzzük a daganattal, ekkor az állatok 64 %-a (28-18 állat) immunis marad a 30 napos megfigyelési szakasz alatt.

11. példa

A 6a. példában szilárd fázisban, adagolt víz nélkül, gáz alakú ammóniával reagáltattuk az etilén-maleinsav-anhidridet. Ezt a polimer készítményt adagoljuk BALB/c egereknek oly módon, ahogy azt a 10. példában megadtuk. Egy-egy vizsgált csoport 10 egérből áll. A 61 napos megfigyelési szakasz során kapott adatokat a 10. táblázatban foglaljuk össze. Az (a) kezelési terv során a 6a. példa szerinti polimerrel az mKSA-TU5 tumorsejtekkel való fertőzés előtt a 9. és az 1. napon kezeljük az állatokat, amikor azok 40 %-a (60—24) tumormentes marad.

A (b) kezelési terv szerint a 6a. példa szerinti polimert a tumorinokulálást követő 1. és 9. napon adagoljuk, amikor a daganatsejtekkel fertőzött egerek 32 %-a (60-19) tumormentes marad a 61 napos megfigyelési periódus alatt. A két csoportból származó és a 61 nap alatt tumormentesnek bizonyult 43 egeret 1X10⁴ tumorsejttel másodszor is fertőzzük, amikor 36 állat, azaz az állatok 87 %-a tumormentes marad 30 nap alatt. Az eredményeket a 10. táblázatban foglaljuk össze.

12. példa

A 6b. példában az etilén-maleinsav-anhidridet adagolt víz jelenlétében szilárd fázisú ammóniázásnak vetettük alá. Az így kapott polimert BALB/c egereknek adagoltuk a 10. példában ismertetett kezelési tervszerint. Egy vizsgált csoport 10 egérből áll. A 61 napig tartó megfigyelés adatait all. táblázatban foglaljuk össze. Az (a) dózisterv szerint a 6b. példa szerinti polimert az mKSA-TU5

8E. táblázat

Adatok a megfelelő táblázatból	Polimer	Tumorsejt dózis	Tumormentes (1)	Regresszált tumorok (2)	Teljes	% Regresszált
8A. 7. példa	6. táblázat-A	1X103	8	10	18	56
		1X104	0	24	24	100
		Teljes	8	34	42	81
8B. 7. példa	6. táblázat-B	1X103	NT1 2 (3)	NT	NT	NT
		1X104	1	9	10	90
			—	—	—	—
		Teljes	1	9	10	90
8D. 7. példa	6. táblázat-D	1X103	10	0	10	0
		1X104	0	2	2	100
		Teljes	10	2	12	17

(1) Tumormentes a megfigyelési szakasz alatt — nem regresszált.

(2) Kifejlődött tumorok, amelyek nullára csökkennek a megfigyelési szakasz végére.

(3) Nincs vizsgálva.

-15184 229

9. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelési terv	A tumor növekedése az állatokban, 61 nap alatt	Tumormentes állatok 61 nap alatt
1X104	SC kontroll	_	__	10/10	0
1X104	7. példa 6. táblázat-A polimer	250	Nap —9 és —1	8/10	2
1X104	polimer	125	Nap -9 és -1	10/10	0
1X104	polimer	62,5	Nap -9 és -1	7/10	3
1X104	polimer	250	Nap +1 és +9	6/10	4
1X104	polimer	125	Nap +1 és +9	6/10	4
1X104	polimer	62,5	Nap +1 és +9	7/10	3
1X103	SC kontroll	—		5/10	5
1X103	6. példa 7. táblázat-A polimer	250	Nap -9 és -1	7/10	3
1X103	polimer	125	Nap -9 és -1	4/10	6
1X103	polimer	62,5	Nap —9 és —1	2/10	8
1X103	polimer	250	Nap +9 és +1	7/10	3
1X103	polimer	125	Nap +9 és +1	5/10	5
1X103	polimer	62,5	Nap +9 és +1	1/10	9

10. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelési terv	A tumor növekedése az állatokban, 61 nap alatt	Tumormentes állatok 61 nap alatt
1X104	SC kontroll			9/10	1
1X104	6a. példa szerinti polimer	250	Nap 9 és 1	8/10	2
1X104	polimer	125	Nap -9 és -1	9/10	1
1X104	polimer	62	Nap -9 és -1	9/10	1
1X104	polimer	250	Nap +1 és +9	7/10	3
1X104	polimer	125	Nap +1 és +9	6/10	4
1X104	polimer	62	Nap +1 és +9	9/10	1
1X103	SC kontroll	—	—	8/10	2
1X1O3	6a. példa szerinti polimer	250	Nap —9 és —1	2/10	8
1X1O3	polimer	125	Nap -9 és -1	5/10	5
1X103	polimer	62	Nap —9 és —1	3/10	7
1X103	polimer	250	Nap +9 és +1	7/10	3
1X1O3	polimer	125	Nap +9 és +1	7/10	3
1X103	polimer	62	Nap +9 és +1	5/10	5

tumorsejtekkel való fertőzés előtti 9. és 1. napon adagoljuk, amikor az állatok 30 %-a (60 állatból 18) marad tumormentes a 61 napos megfigyelési szakasz alatt.

A (b) kezelési terv szerint a 6b. példa szerinti polimert a tumorfertőzést követő 1. és 9. napon adagoljuk, amikor a daganatsejtekkel fertőzött egerek 17 %-a (60 16 állatból 10) marad tumormentes 60 nap alatt. A fenti két csoportból származó 61 nap alatt tumörmentesen maradt 28 egeret 1X10⁴ daganatsejttel másodszor fertőzzük, amikor 23 állat, azaz 82%-uk marad tumormentes 30 nap alatt.

Az eredményeket all. táblázatban adjuk meg.

-16184 229

11. táblázat

mKSA-TU5 tumor	Vizsgált vegyület	Dózis, mg/kg	Kezelési terv	A tumor növekedése az állatokban, 61 nap alatt	Tumormentes állatok 61 nap alatt
1X10*	SC kontroll	_		10/10	0
1X104	6b. példa szerinti polimer	250	Nap -9 és -1	8/10	2
1X104	polimer	125	Nap —9 és —1	9/10	1
1X104	polimer	62	Nap -9 és -1	7/10	3
1X104	polimer	250	Nap +1 és +9	8/10	2
1X104	polimer	125	Nap +1 és +9	7/10	3
1X104	polimer	62	Nap +1 és +9	10/10	0
1X103	SC kontroll	—	—	4/10	6
1X103	6b. példa szerinti polimer	250	Nap —9 és —1	8/10	2
1X103	polimer	125	Nap -9 és -1	4/10	6
1X103	polimer	62	Nap -9 és -1	6/10	4
1X103	polimer	250	Nap +1 és +9	8/10	2
1X103	polimer	125	Nap +1 és +9	10/10	0
1X103	polimer	62	Nap +1 és +9	7/10	3

13. példa

A 9 12. példában megadottakat másik rosszindulatú daganat modellrendszeren is vizsgáljuk. A tumort Fischer (F344) törzsű patkányokon váltjuk ki 3-metil-kolantrénnel, a tumor húgyhólyag karcinoma. Amikor ezt a tumort normális Fischer patkányokba transzplantáljuk, úgy az a primer helyen fejlődik ki, és spontán metastázis következik be a tüdőben. A ráksejtek minden esetben megjelennek a primer tumor műtéti eltávolítását követően. 40

Az első vizsgálatokat a 7-VI-A példa szerinti polimer hatásvizsgálatára végeztük, vizsgáltuk a tumorhordozó patkányok túlélését és a metastázis gátlását a találmány szerinti vegyülettel.

Körülbelül 250 g súlyú Fischer patkányokba szubku- 45 tán 2X2 mm méretű tumort ültetünk. A tumor bejuttatását követő 5., 12. és 18. napon a tumorral rendelkező patkányokat testsúlykilogrammra számítva 62 mg polimerrel kezeljük a peritoneális üregbe adott injekcióval. llyen módon hat állatot kezelünk. A beültetett tumorral 50 bíró állatok közül négyet nem kezelünk, ezek a kontrollok. A tumor bejuttatását követően három héten belül, vagy átlagosan 15 nap múlva a kontroll állatok elpusztultak. Két kezelt állat a 37. napon pusztult el. A négy megmaradt kezelt állatot a tumor bejuttatását követő 55 42. napon leöltük. A vizsgálatok szerint ezekben az állatokban primer tumor kialakult, azonban metastázisos tüdőelváltozás nem volt tapasztalható.

14. példa

A 13. példában megadott vizsgálatot ismételjük meg alacsonyabb dózisú és ritkábban adagolt polimerrel.

A Fischer törzsbeli patkányoknak hasonló tumort ülte- 65 tünk be, és a beültetést követő 8. napon a tumort hordozó patkányoknak a 7-VI-A példa szerinti polimert adjuk testsúlykilogrammra számítva 65 mg vagy 30 mg dózisban intraperitoneális injekcióval (csoportonként négy patkányt használunk). A beültetést követő 16. napon az alacsonyabb dózist kapott csoportba tartozó állatoknak testsúlykilogrammra számítva 30 mg újabb vegyületet adunk. Hat hét múlva vizsgáljuk a túlélést. Ebben az időben a túlélőket megvizsgáljuk a tüdő metastázisos elváltozása szempontjából is. A beültetett tumorral rendelkező öt állat nem kapott kezelést, ezek a kontrollok. A tumor beültetését követő 23. napon ez az öt állat elpusztult. A testsúlykilogrammonként 65 mg polimert kapott négy állat a 40. napon él, ekkor leöljük őket. Metastázisos elváltozást nem tapasztalunk. A 16. napon testsúlykilogrammra számítva 30 mg dózist kapott állatok közül kettő a 35. és a 36. napon elpusztult, a megmaradó két állatot a 40. napon leöljük. A vizsgálatok szerint ezekben metastázisos elváltozást nem tapasztalunk. A kontroll állatokkal szembeni meghosszabbodott élettartam mindkét kezelt csoportban egyértelmű.

15. példa

A 7-VI-A példa szerinti polimer hatását a tumor Fischer törzsbeli patkányokban való újramegjelenésére vizsgáljuk. A primer tumort műtéti úton eltávolítjuk az állatokból. A 13. és a 14. példa szerint eljárva a Fischer törzsbeli patkányokba 7X2 mm méretű tumort ültetünk be. Ezután hagyjuk nőni a rosszindulatú daganatot mindaddig, míg két-három cm méretű lesz. Ekkor (a beültetést követő 8. napon) műtéti úton eltávolítjuk a daganatot, és a patkányokat egy alkalommal, testsúlykilogrammra számítva 65 mg vagy 30 mg polimerrel 17

-17184 229 kezeljük intraperitoneális injekcióval. Két csoportot kezelünk, a csoportokba négy állatot osztunk. A túlélést és a tumor újramegjelenését 7 hét múlva vizsgáljuk. A testsúlykilogrammra számítva 30 mg polimert kapott állatok a 47. napon élnek, és a tumor megjelenése egyáltalán nem figyelhető meg. A műtétkor testsúlykilogrammra számítva 65 mg hatóanyagot kapott állatok közül az egyik a 16. napon, a tumor újramegjelenése után elpusztult, ugyanakkor a másik három a 47. napon él, és a tumor újramegjelenése nem tapasztalható rajtuk.

16. példa

A 15. példában megadottakat ismételjük meg a Fischer patkányokkal a rosszindulatú daganat újramegjelenésének gátlására, azzal a különbséggel, hogy különböző imid-tartalmú polimereket használunk. A három polimerben az imid-tartalom nulla, öt és 21,7 %. A tumor beültetését a 13., 14. és 15. példában megadottak szerint végezzük. A tumor műtéti eltávolítását a beültetést követő 14. napon végezzük.

Kontrollként négy állatot használunk, ezek a rosszindulatú daganat eltávolításakor nem kapnak hatóanyagot. A tumor újramegjelenése a 21., 33., 40. és 44. napon (a műtétet követően), átlagosan a 34. napon 100 %-os. Ebben a kontrollcsoportban két állat a 44. napon pusztult el, a másik kettő él, és ezeket leöljük. Mindkettőben metastázisos állapotot figyeltünk meg.

állatot tartalmazó csoportnak intraperitoneálisan, testsúlykilogrammra számítva 30 mg, a 2a. példa szerinti polimert (imid-tartalom nulla) adagolunk a tumor műtéti eltávolítása idején. Ebben a csoportban két patkány esetén a műtétet követő 33. napon megfigyeltük a tumor újramegjelenését, a harmadikban a 40. napon. Az 55. nap után az öt patkány közül háromban (60%) megjelent a tumor. Hat állatnak intraperitoneálisan, testsúlykilogrammra számolva 30 mg, a harmadik példa 4. táblázatának 1. vegyületét adagoljuk, ez a vegyület 5% imidcsoportot tartalmaz. Az 55. napon ezek közül az állatok közül kettő elpusztult, azonban tumor nem volt bennük, és metastázist sem figyeltünk meg.

A negyedik csoportba tartozó hat patkánynak intraperitoneálisan, testsúlykilogrammra számítva 30 mg 7. példa 6. táblázat szerinti A polimert adunk, ez a polimer 21,7 % imidet tartalmaz. A csoportba tartozó állatok közül egyben a 21. napon megjelent a tumor, a másikban a 43. napon. 55 nap múltán az összes állat él. A hat állatból kettőben jelent meg a tumor, és ez 33 %-os átlag.

17. példa

A 13-16. példákban ismertetett állatkísérletek során a polimert injekcióval adagoltuk a peritoneális üregbe. A jelen példában olyan kísérletet ismertetünk, amelynek során imid-tartalmú készítményt adagolunk, orálisan, a tumor műtéti eltávolításával egyidejűleg, a rosszindulatú daganat gátlására, vagy megjelenésének megakadályozására. A 16. példában ismertettük, hogy a kontroll állatok, amelyek a rosszindulatú daganat eltávolításakor nem kapnak hatóanyagot, átlagosan a 34. napon tumort hordoznak.

Ebben a példában tíz Fischer patkányban a 13. példában megadottak szerint tumorfertőzést okozunk. A ki18 fejlődött rosszindulatú daganatokat műtéti úton a beültetést követő 13. napon eltávolítjuk, és ugyanakkor testsúlykilogrammra számítva 30 mg 7. példa 6. táblázat A szerinti polimert (21,7% imid-tartalom) adagolunk 1 ml steril vízben, orálisan. 10 héten át vizsgáljuk a tumor megjelenését. Egy patkány a tumor műtéti eltávolítása közben elpusztult. A megmaradó kilenc patkány közül hétben a tumor műtéti eltávolítását követő 42., 42., 42., 43., 46., 50., illetve 59. napon kisméretű tumorfejlődés tapasztalható. Két patkányban a 70. napon sem jelent meg rosszindulatú elváltozás.

18. példa

A példa során vizsgáljuk, hogy a 7. példa VI-A szerinti polimerrel kezelt tumorsejtek antigén tulajdonságai változnak-e, vagy közvetlen citotoxikus hatásuk kimutatható-e a tumorsejtekkel szemben.

A 13. példában megadott BLCa tumorból tumorsejteket készítünk oly módon, hogy kivágunk egy szubkután tumormasszát. A sejtekből szuszpenziót készítünk oly módon, hogy felszabadítjuk a daganatból a sejteket, és ezután a daganatból származó darabkákat enyhe tripszines kezelésnek vetjük alá. Az elkülönített sejteket háromszor pufferolt sóoldattal (BSS) mossuk, és az élő/nem élő sejtek arányának megállapítására vizsgáljuk a szuszpenziót. A tisztítás ezen fázisában 90-95 %-os sejtpopulációt kapunk.

Earl BSS oldattal készült Eagls minimál táptalajhoz 10% marhaszérumot adunk, majd milliliterenként 1X10⁵ sejtet tartalmazó tumorsejt szuszpenziót készítünk. A szuszpenziót a 7. példa VI-A szerinti polimerrel inkubáljuk, a polimer koncentrációja 30 mg/1. Az inkubációt 37 °C hőmérsékleten 90 percen át végezzük, az inkubációt követően 300 g mellett 6 percen át centrifugálunk. A sejteket élőképesség szempontjából vizsgáljuk, az élőképesség az előinkubációs értékhez képest nem változik. A fenti eljárást három alkalommal megismételjük.

A fenti kísérletből származó sejteket hím Fischer patkányoknak adjuk szubkután 1X10⁶ sejtkoncentrációban. Öt állatnak polimerrel kezelt sejteket adunk, további öt állatnak olyan daganatsejteket, amelyeket a fenti módon, de polimer nélkül kezeltünk. Az eredményeket a 12. táblázatban adjuk meg.

12. táblázat

Patkány száma	Kontrollok1 2—3 cm méretű tumor kifejlődésének napja	Kezelt állatok2 2—3 cm méretű tumor kifejlődésének napja
1	11	11
2	11	11
3	13	13
4	11	11
5	13	11

¹ 1X1O⁶.A tumorsejteket polimer nélkül inkubáltuk, szubkután adagoltuk.

² 1X10⁶. A tumorsejteket a 7. példa VI-A szerinti polimerrel inkubáltuk és szubkután adagoltuk.

-18184 229

Az állatok között időbeli különbséget nem tapasztaltunk a tumor kifejlődése szempontjából. Ezenfelül a rosszindulatú daganat növekedési tulajdonságai a két csoport állataiban hasonló. A kísérletek következtetése az, hogy a 7. példa szerinti VI-A polimer (amely 21,7% imid-tartalmú) a használt dózisban nem rendelkezik közvetlen citotoxikus hatással a BLCa tumorsejtekre. Ezenfelül a polimer előinkubációja a tumorsejtekkel nem okozza a tumorsejtek antigén tulajdonságának változását.

19. példa

Hím Fisher patkányokkal meghatározzuk a 7. példa VI-A szerinti imid-tartalmú polimer direkt toxicitását. Az intraperitoneálisan és intravénásán adagolt polimert a megfelelő mennyiségű polimert tartalmazó 1 ml fiziológiás sóoldatban adagoljuk. Az egyes csoportoknak a polimert 100 mg/testsúlykilogrammtól kezdődően 100 mg/testsúlykilogrammal növelve 1000 mg/testsúlykilogrammig adagoljuk egyenként öt-öt állatnak. A polimert mind intraperitoneálisan, mind pedig intravénásán adagoljuk. Az intraperitoneálisan adagolt polimer a 30 napos megfigyelési idő alatt az összes vizsgált 50 patkányon nem okozott toxicitási tüneteket vagy halált. Toxicitási tüneteket figyeltünk meg azonban akkor, ha a polimert intravénásán adagoltuk testsúlykilogrammonként 800 mg-os vagy ennél nagyobb dózisban. A 800 mg/kg polimert kapott 5 állat közül egy, a 900 mg/kg polimert kapott öt állat közül kettő és az 1000 mg/kg polimert kapott öt állat közül négy az intravénás adagolást követően görcsöket kapott és elpusztult. A 700 mg/kg intravénás dózist kapott állat közül egyik sem mutatott toxicitási tüneteket a 30 napos megfigyelési periódus során (35 állat).

A 30 napos megfigyelési szakaszt követően a 85 túlélő patkányt leöltük, és megvizsgáltuk agyukat, tüdejüket, szívüket, májukat, veséjüket és lépüket mikroszkóp segítségével. Gyógyszernek tulajdonítható elváltozásokat egyik szerv szövetében sem találtunk.

Másik vizsgálatunk során megvizsgáltuk a fenti, intraperitoneálisan és orálisan adagolt polimer toxicitását. A 7. példa VI-A szerinti polimert injekcióval intiaperitoneálisan vagy pasztillában orálisan adagoltuk öt-öt Fisher patkánynak 100 mg/kg, 500 mg/kg és 1000 mg/kg dózisban. 14 napon át figyeltük az állatokat, amely idő alatt az állatok nem pusztultak el, és toxikus tünetek kifelődése nem következett be. A 14. nap után leöltük az állatokat, majd mind az intraperitoneálisan, mind pedig az orálisan kezelt állatok agyát, tüdejét, szívét, máját, veséjét és lépét patológiai vizsgálatnak vetettük alá. Egyik szerv szövetében sem találtunk kóros elváltozásokat.

20. példa

A találmány szerinti polimerek közül a 3. és a 4. példában előállított vegyületeket vizsgáljuk közönséges Lewis patkányokkal abból a szempontból, hogy képesek-e stimuálni a 19-S (IgM) antitesteket termelő sejteket, azaz az immunválaszt a heterogén eritiocitákkal (birka vörös vérsejt) szemben. A vizsgálatokat a standard Jerne plakk-méréssel végeztük [lásd Textbook of Immunology, Barrett, Mosby Company, 1978; továbbá Immunology, Eisen, Medical Department, Harper és Row Publishers Inc., 1974]. Jellemző vizsgálat szerint úgy járunk el, hogy egy állatot, esetünkben egy Lewis patkányt immunizálunk 1 ml 1:5 hígítású mosott és fizológiás sóoldatban lévő birka vörösvérsejttel a farki vénán át. Ugyanabban az időben intraperitoneális injekcióval adagoljuk a polimert 1 ml fiziológiás sóoldattal. Négy nap múlva az immunizált állatok lépsejtjeit agaróz szövettenyészetre rétegezzük a birka vörösvérsejtekkel együtt. A szövettenyészet táptalaj lehetővé teszi az antitesteket szintetizáló sejtek növekedését és az antitest kiválasztását. Az antitestek kidiffundálnak a sejtből, és hozzákötődnek a szomszédságukban lévő eritrocitákhoz. A vörösvérsejtek lizisének elősegítésére szérumot (tengerimalac szérumot) adagolunk a vörösvérsejtekhez, amikor az antitesttel kapcsolatban lévő sejtekből kitisztult területek vagy plakkok jönnek létre az antitestképző sejtek körül. Ezeket a plakkokat megszámoljuk és 1X10⁶ lépsejtre számítva kifejezzük. Az eredményeket a 13. táblázatban adjuk meg. A 13. táblázat összes adata 30 mg/kg mennyiségű polimerre vonatkozik.

Példa szerinti polimer	spektrumból összes	IgM plakkszám/ 1X106 lépsejt	Stimulációs index/kont- roll=l,00
számolt imid/amid arány	állat átlaga
Kontroll	—	16	568	1,00
2a	0	10	1564	2,75
3-IV-l	5,3	6	1446	2,54
4	6,5	6	1478	2,60
3-IV-3	11,5	10	1620	2,86
3-IV-4	16,5	10	1770	3,12
-	16,0	6	1866	3,28
3-TV-6	24,1	10	1968	3,46
-	24,4	6	1984	3,49
3-IV-7	28,2	10	1992	3,51
-	32,6	6	1268	2,23
3-IV-8	34,7	10	1664	2,93
3-IV-9	50,1	10	926	1,63

20A. példa

Az alábbi kísérletek során a 7. példa VI-A szerinti polimer hatását vizsgáljuk a birka vörösvérsejt antigénnel szembeni IgM antitest képzésre a fentiekben ismertetett Jerne plakk-módszerrel (lásd 20. példa). A kísérleteket Lewis patkányokkal végezzük, amikor a polimert intraperitoneálisan vagy orálisan adagoljuk. Kísérleteket végzünk Lewis patkányokkal oly módon is, hogy a csecsemőmirigy funkcióját mintegy helyettesíteni kívánjuk intraperitoneálisan vagy orálisan adagolt polimerrel. Az első esetben a 20. példa szerinti módon járunk el. A második esetben a csecsemőmirigyet felnőtt állatból műtéti úton eltávolítjuk (Tx), a műtétet 8-12 hetes korban végezzük, majd magas dózissal teljes testet érintő besugárzást, ezt követően pedig csontvelősejt átültetést végzünk. A csecsemőmirigy eltávolítását, a teljes testet érintő besugárzást és a csontvelővel való műveletet ismert módszerekkel végezzük (lásd Fáik és 19

-19184 229 munkatársai, Surgery, október, 1978; Fáik és munkatársai, Abstract, Canadian Society fór Clinical Investigation, január, 24-27, 1978, Vancouver, és Fáik és munkatársai, Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, január 25—28., 1978, Vancouver).

A fentiek szerint a teljes testet érintő besugárzást és a csontvelő átültetést a csecsemőmirigy műtéti eltávolítását követő napon végezzük. A teljes testet érintő besugárzást cézium¹³⁷ izotópforrással végezzük (Atomié Energy of Canada). A besugárzás dózisát a 1 készüléken a működtető állítja be, és a besugárzás egyenletes a tartályba helyezett állat egész testfelületén.

A csonvelő átültetésre a csontvelő sejtek különálló sejteket tartalmazó szuszpenzióját állítjuk elő oly módon, hogy kiegyenlített sóoldattal 4 °C hőmérsékleten mos- 1 suk a patkány femurjának és tibiájának hosszú csontjait. Háromszor kiegyenlített sóoldattal mossuk a sejteket és hemocitométerben meghatározzuk az élő sejtek számát és a megfelelő sejthígítást. A sejteket intravénásán adagoljuk olyan készítményből, amely 90%- 2 nál több életképes sejtet tartalmaz. A csontvelő átültetést mindegyik patkányra számítva 1X10⁸ sejttel végezzük,

A teljes beavatkozás során, amely érinti a csecsemőmirigy eltávolítását, a teljes testre vonatkozó besugárzást 2 és a csontvelő átültetést, az állatok elhalálozási aránya 10%-nál kevesebb volt. A kezelt állatokat hat héten át gyógyulni hagyjuk, majd elvégezzük a birka vörösvérsejtekkel szembeni IgM antitest képződési vizsgálatot.

A gyógyulási időszak után a 20. példában megadottak e szerint eljárva adagoljuk a 7. példa VI-A szerinti vegyületet és a birka vörösvérsejteket. Az egész kísérlet eredményeit a 13 A. táblázatban adjuk meg.

21. példa

Fisher patkányokban vizsgáljuk a találmány szerinti kilenc polimert, amelyek különböző imid-tartalmúak 5 és amelyek azonosak a 20. példa 13. táblázatában megadottakkal abból a szempontból, hogy a százalékos imidtartalom hogyan befolyásolja a primer BLCa tumor újramegjelenését a rosszindulatú daganat műtéti eltávolítását követően. A kísérleti eljárás a 15., 16. és 17. példá0 bán megadott eljárással azonos, azzal a különbséggel, hogy ebben az esetben minden dózis esetén 10 patkányt használtunk, kontrollként szintén 10 patkányt állítottunk be, és dózisként testsúlykilogrammra számítva 30 mg-ot és 15 mg-ot választottunk, a hatóanyagot pedig 5 1 ml sóoldatban intraperitoneálisan adagoltuk. A kontroll állatok intraperitoneálisan 1 ml sóoldatot kapnak. 10 állatból álló csoportnak 21,7% imidet tartalmazó 7. példa VI-A szerinti polimert adagolunk, testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségben orálisan. A tumor beültetését követően műtéti úton eltávolítjuk a kifejlődött rosszindulatú daganatot, all. napon, és egy adagban adagoljuk a hatóanyagot a daganat eltávolítását követő napon. Az eredményeket a 14. táblázatban adjuk meg. Érdekes, hogy a kontroll állatban átlagosan 32,3 napon jelenik meg újra a tumor, ami jól egyezik a 16. példában vizsgált négy patkánynál tapasztalt átlagértékkel, a 34 nappal.

22. példa

Vizsgáljuk az 5A. példa szerinti 100% imid-tartalmú etilén-maleinsav-anhidrid (specifikus viszkozitás 0,66)

13A. táblázat

Lewis patkányok IgM antitest képződése

Polimer	Az állatok kezelése	Az állatok száma	Dózis mg/kg adagolás módja	Válasz IgM plakk/1X106 lépsejt	Stimulációs index Kontroll: 1,00
Kontroll	Nem kezelt kontrollok	10	-	174,2	-
7. példa— 6. táblázat - A	Normál	10	30* **/IP	836,0	4,78
7. példa—6. táblázat -A	Normál	10	30*/orális	865,6	4,96
Kontroll	Tx, 950R,	10	—	73,6	—

BM-kontrollok

7. példa-6. táblázat —A	Tx, 950R, BM	10	30*/IP	740,4	10,10
7.példa-6. táblázat—A	Tx, 950R, BM	10	30*/orális	474,0	6,42

*15 mg/testsúlykilogramm dózissal ugyanezeket az eredményeket kaptuk.

**Tx: csecsemőmirigy műtét

R: a teljes testet érintő besugárzás mértéke BM: csontvelő átültetés.

-201

184 229

14. táblázat

Szám	Polimer forrás példa	% imid	Dózis* mg/kg x =	Azoknak az állatoknak a száma, amelyekben a tumor újra megjelent a műtéti eltávolítást követő x. napon
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1.	kontroll	—	—	0	1	2	3	5	10	—	—	__	—
2.	2a	0	30	0	0	2	3	3	3	3	4	4	5
			15	0	0	2	3	5	5	5	6	6	7
3.	3-IV-l	5,3	30	0	0	0	0	0	1	1	1	2	3
			15	0	0	2	2	2	2	2	2	2	3
4.	4	6,5	30	0	0	0	0	0	0	0	0	1	2
			15	0	0	0	1	2	3	3	3	5	5
5.	3-IV-4	16,5	30	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
			15	0	0	0	1	2	2	2	2	2	3
6.*	7-VI-A	21,7	30	0	0	0	0	0	0	1	2	4	4
7.	3-IV-6	24,1	30	0	0	0	0	1	1	1	1	1	1
			15	0	0	0	0	0	1	1	2	2	2
8.	—	24,4	30	0	0	0	0	0	0	0	0	1	3
			15	0	0	0	1	3	5	5	6	6	6
9.	3-IV-7	28,2	30	0	0	1	3	5	5	5	5	6	6
			15	0	0	0	1	2	3	3	4	6	7
10.	3-IV-8	34,7	30	0	0	0	2	2	3	3	3	3	4
			15	0	0	1	1	2	3	3	3	3	4

*A 6. példa esetén a hatóanyagot orálisan adagoljuk, minden más esetben intraperitoneá lisan. Dózisonként 10 patkányt vizsgálunk.

15. táblázat

Hatóanyag dózisa mg/kg(1>	Egér a kiinduláskor	Egér a végén	Eredeti testsúly (g)	Végső testsúly (g)	Átlagos kivágott tumorsúly (mg)	Gátlás kezelt/kont- roll%
25	5	5	27,0	31,4	1074,4	—9
kontroll	5	5	27,6	32,2	985,4	-
50	5	5	26,8	34,0	724,4	+26
kontroll	5	5	27,6	32,2	985,4	-
100	5	5	26,8	31,0	587,6	-16
kontroll	5	5	29,0	32,3	505,8	-
200	5	2		60% elpusztult	NC®
kontroll	5	5	29,0	32,3	505,8	-
400	5	3		40% elpusztult	nc1 (2)
kontroll	5	5	27„6	32,2	985,4	-
800	5	0		100% elpusztult	—
kontroll	5	5	27,6	-	-	-

(1) Svájci hím egér, S-180 tumor szubkután fertőzéssel, a hatóanyagot intraperitoneálisan 0,5 ml sóoldatban adagoljuk a tumor beültetését követően hat egymást követő napon át. Az állatokat az utolsó hatóanyag adagolást követő napon öljük le.

(2) Akut toxicítás miatt nem számoljuk.

-21184 229 hatását független laboratóriumban, a rosszindulatú daganat gátlására. Az alábbiak szerint járunk el.

Hím svájci egerek oldalába 2 mm átmérőjű eszközzel szolid szarkóma 180-at ültetünk. Az 5A. példa szerinti polimert intraperitoneális injekcióval adagoljuk a táblázatban megadott koncentrációban, 0,5 ml sóoldatban, hat egymást követő napon át. Az adagolást a tumor beültetését követő napon kezdjük. Öt egérből álló csoportoknak testsúlykilogrammra számítva 25, 50 és 100 mg hatóanyagot adunk. A magasabb, a testsúlykilogrammra számítva 200, 400 és 800 mg-os dózisok toxikusnak bizonyultak. Az utolsó intraperitoneális hatóanyag injekciót követő napon leöljük az állatokat, és eltávolítjuk a tumort, majd megmérjük súlyát. A tumorgátlást úgy számítjuk, hogy a kezelt állatok tumorsúlyát elosztjuk a kontroll állatok tumorsúlyával, és az eredményt százalékban fejezzük ki. Az eredményeket a 15. táblázatban adjuk meg, a táblázatból kiderül, hogy a 100% imidtartalmú etilén-maleinsav-anhidrid nem aktív.

23. példa

A találmány szerinti egyik előnyös polimerrel közönséges hím Lewis patkányokon vizsgálatokat végzünk annak megállapítására, hogy a hatóanyag hogyan befolyásolja a peritoneális makrofágok számát, és vizsgáljuk a polimer aktivitását a polisztirol latex részecskék fagocitálására, amely hatás jellemző több immunrendszert befolyásoló anyagra, mint például a Bacillus Calmette Guerin készítményre (BCG), a pirán kopolimerre és más hasonló vegyületre.

2-4 hónapos normál hím Lewis patkányokat hatosával négy csoportra osztjuk, és hatóanyagot, illetve a kontroll esetén sóoldatot adagolunk. Az első csoport intraperitoneálisan 1 ml sóoldatot kap. A második csoport a 7. példában ismertetett 6. táblázat A polimerjét kapja intraperitoneálisan, sóoldatban (1 ml), testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségben. A harmadik csoport a 7. példában ismertetett 6. táblázat A szerinti polimert kapja 1 ml sóoldatban, orálisan, testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségben. Végül a negyedik csoport intraperitoneálisan adagolt 1 ml sóoldatban 0,1 mg BCG-tkap.

A fenti adagolást követő 1., 3. és 5. napon a fenti négy csoportba tartozó állat közül kettő-kettő állatot leölünk, és megvizsgáljuk a peritoneális űrben lévő sejteket. A sejteket az alábbiak szerint gyűjtjük össze. Intraperitoneálisan 100 ml RPMI 1640 elegyet injektálunk, és a teljes peritoneális folyadék enyhe masszázsa után elvezetjük, a folyadékot és a sejteket minden egyes állat peritoneális üregéből külön-külön 1000 fordulatszámú centrifúgán összegyűjtjük. A sejteket NSE (nem specifikus eszteráz) festékkel festjük, és háromszor mossuk 4 °C hőmérsékletű fenti eleggyel. Végül 10 ml fenti elegyben szuszpendáljuk az egyes állatokból nyert sejteket, és megszámláljuk azokat. A sejtek átlagosan 80-95% makrofágból állnak, attól függően, hogy milyen kezelést kaptak, és hány nap telt el a kezelést követően.

A latex részecskék fagocitásának mértékét a peritoneális űrben lévő sejtek által az alábbiak szerint határozzuk meg. A fentiek szerint előállított sejtszuszpenziót úgy hígítjuk, hogy az 1 ml 50%-os boíjúszérum és RPMI oldat elegyében 40—50 millió sejtet tartalmazzon. A szusz22 penziót 5 ml-es csőbe töltjük. Ehhez lOOlambda polisztirol latexet (10% szilárd halmazállapotú anyag, a részecskék átmérője 1 μ, Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana), és a keveréket egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután elkülönítjük a sejteket, három alkalommal RPMI eleggyel mossuk, végül 0,5 ml sóoldatban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióból mikroszkópi kenetet készítünk, és megvizsgáljuk a makrofágok által fagocitált latex részecskék számát. Azokat a sejteket pozitívaknak nyilvánítjuk, amelyek 10 vagy több latex részecskét fagocitáltak, ezeknek a pozitív sejteknek a teljes számát a szuszpenzióban lévő összes sejt százalékában fejezzük ki.

A fenti kísérletek két kísérletből származó adatait a 16. táblázatban ismertetjük.

A 16. táblázatban közölt adatok szerint a találmány szerinti előnyös polimer nem növeli intraperitoneálisan vagy orálisan adagolva a peritoneális makrofágok számát a kontrolihoz képest, továbbá ezeknek a peritoneális makrofágoknak a latex fagocitáló aktivitása nem emelkedik a közönséges makrofág aktivitás fölé. Ezzel szemben más immunrendszert moduláló szerek, mint például a BCG, nagyban növeli a peritoneális makrofágok számát, és ezek a makrofágok megnövekedett latex fagocitáló aktivitással rendelkeznek. Ez a magas aktivitás három nap múlva és ezt követően a normális értékre csökken.

A fenti eredményekkel ellentétben, amely eredmények szerint a találmány szerinti polimerek nem aktiválják a makrofág funkcióját, a 20. és 20A. példákban közölt eredmények szerint ezek a polimerek mindazonáltal B-sejt modulátorok az állatokban, és stimulálják a B-sejt antitest választ, intraperitoneálisan vagy orálisan adagolva. Ezenkívül megfigyeltük, hogy ez a hatás még akkor is jelentkezik, ha a csecsemőmirigy nem funkcionál, ami azt jelenti, hogy a találmány szerinti polimerek helyettesítik a csecsemőmirigy funkcióját a B-sejtek aktivitásával, azaz az antitest termelés növelése következik be.

A továbbiakban példákkal szemléltetjük, hogy az előző példákban ismertetett különleges vegyületek a találmány szerinti termékek előállításakor más gyakorlatilag ekvivalens anyagokkal helyettesíthetők.

így például az előző példákban ismertetett propilént ekvivalens mennyiségű etilénnel helyettesíthetjük, ezzel az olefinnel gyakorlatilag hasonló eredményeket kapunk.

Az előző példákban ismertetett eljárás során használt maleinsav-anhidrid például ekvivalens mennyiségű citrakonsav-anhidriddel helyettesíthető, ezzel a polikarbonsav-anhidriddel hasonló eredményeket kapunk.

Az 1. példában megadott etilén-maíeinsav-anhidrid polimer oldószer—nem oldószer frakcionálásával még alacsonyabb átlagos molekulasúlyú termék állítható elő. Ezt az alacsonyabb molekulasúlyú polimert ezután az 1. példa szerint polimer ekvivalens mennyiségével helyettesítve hasonló eredményeket érünk el.

A találmány szerinti imidek más gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit is előállíthatjuk oly módon, hogy az ammónium-só-származékokat például nátrium- vagy kálium-sóvá alakítjuk. így például a 3. példa 4. táblázatának 4. kísérlete során előállított amraónium-sót fél-amiddá, fél-szabad karboxil-származékká alakíthatjuk oly módon, hogy az ammónium-sót 5%-os vizes oldatban gyengén bázikus kationcserélő oszlopon, például Amberlite IRC-84 gyantából készült oszlopon

-221

184 229

16. táblázat

A 23. példában ismertetettek szerint végzett kezelést követő peritoneális makrofág szám és aktivitás

1. kísérlet 2. kísérlet

A gyógyszeradagolást követő nap, amikor az állatokat leöljük	Kezelés	A sejtek száma az egyes peritoneális űrben (X106)	Latex felvétel a tíznél több latex részecskét tartalmazó sejtek %-a	A sejtek száma az egyes peritoneális űrökben (X106)	Latex felvétel a tíznél több latex részecskét tartalmazó sejtek %-a
1	kontroll (1,0 ml	10	25	3	29
	sóoldat)	18	31	3	21
	7—6-A polimer,	5	27	11	30
	30 mg/kg, IP*	9	27	13	25
	7—6-A polimer,	7	27	4	20
	30 mg/kg, orális	6	31	6	15
	BCG, 0,1 mg, IP	27	97	26	90
		33	97	28	84
3	kontroll (1,0 ml	5	8	5	20
	sóoldat)	6	11	4	15
	7—6-A polimer	3	11	8	30
	30 mg/kg, IP*	6	8	8	15
	7—6-A polimer,	5	20	8	11
	30 mg/kg, orális	5	8	6	10
	BCG, 0,1 mg, IP	4	9	6	25
		8	13	15	32
	kontroll (0,1 ml)	3	26	1	16
	sóoldat	2	23	1	7
	7-6-A polimer,	5	45	5	12
	30 mg/kg, IP*	6	37	3	10
	7—6-A polimer,	2	45	1	15
	30 mg/kg, orális	13	37	1	11
	BCG, 0,1 mg, IP*	3	26	2	20
		6	38	7	25

*A limfocita típusú sejteket a lépből, csecsemőmirigyből, a csontvelőből extraháljuk a

7. példában ismertetett 6. táblázat A szerinti polimerrel kezelt állatból és egyik esetben sem tudtunk kimutatni latex fagocitáló aktivitást, amely nagyobb lett volna, mint a hasonlóképpen nyert kontroll sejteké.

(akrilsavas, keresztkötéseket tartalmazó kopolimer, Rohm és Haas Company) vezetjük át. A kapott oldatban lévő szabad karboxilos alakot nátrium-hidroxiddal vagy kálium-hidroxiddal semlegesítjük, a semleges oldatot fagyasztva szárítjuk, amiután megkapjuk a megfelelő nátrium-, illetve kálium-sót. 55

Az 1. példában megadott alacsony molekulasúlyú etilén-maleinsav-anhidrid polimert átalakíthatjuk félmono-etil-szekunder amid, fél-mono-metil-amin-karboxilát sójává oly módon, hogy a 2a. példa szerint eljárva az etilén-maleinsav-anhidridet oldjuk, az oldatot acetonnal θθ elegyítjük, és ezt az elegyet acetonos ammónia helyett acetonos metil-aminnal reagáltatjuk. A terméket xilolban, visszacsepegtető hűtő alatt forraljuk, amiután megkapjuk a részlegesen N-metil-szubsztituált imid-származékot, amely mind imidcsoportokkal, mind szekunder θ5 metil-amid-csoporttal, ionizált karboxil-csoporttal és amin-karboxilát-csoportokkal rendelkezik.

A fentiek szemléltetésére az alábbi példákat adjuk meg.

24. példa

Az 1. példában megadottakhoz hasonlóan eljárva propilénből és maleinsav-anhidridből álló alacsony molekulasúlyú kopolimert állítunk elő.

A reaktorba 196 g, 1600 ml etil-benzolban oldott maleinsav-anhidridet helyezünk, az etil-benzol 7,30 g benzoil-peroxidot tartalmaz. 80 °C-ra növeljük az oldat hőmérsékletét, propilén adagolásával (42 g) 3,2 atmoszférára növeljük a nyomást. 19 órán át 80 °C hőmérsékleten és 3,2 atmoszférán végezzük a reakciót. A reakció 23

-231

184 229 lezajlása után lehűtjük a reakcióedényt, kiszellőztetjük, és az etil-benzolban lévő propilén-maleinsav-anhidrid kopolimert az 1. példában megadottak szerint eljárva, háromszor xilollal extrahálva, az extrahálást hexánnal háromszor megismételve, szűréssel, majd 60 C hőmérsékleten csökkentett nyomású térben való szárítással feldolgozzuk. A végtermék súlya 269 g (87,3%-os kitermelés). 1,0%-os dimetil-formamidos oldatának 25 °C-on 0,0590 a specifikus viszkozitása.

A fentiek szerint előállított kis viszkozitású propilénmaleinsav-anhidrid kopolimert fél-primer-amid-fél-ammónium-karboxilát-sójává alakítjuk a 2a. példában az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimerre vonatkozóan megadottak szerint eljárva. 26,0 g propilén-maleinsav-anhidrid kopolimerből 115,5%-os kitermeléssel 36,3 g sót j kapunk. A terméket 35 °C hőmérsékleten 20—25 Hgmm nyomású térben szárítottuk. Az előállított termék infravörös elnyelési spektruma szerint primer amidcsoport, ionizált karboxilcsoport és ammónium-karboxilát-csoport van jelen. Imidcsoport nem mutatható ki. 2

A 0,059 specifikus viszkozitású propilén-maleinsavanhidridből előállított félamid-félammónium-karboxilátsót a 3. példában megadottak szerint eljárva részleges imiddé alakítjuk. Úgy járunk el, hogy 20 g amid-ammónium-sót 400 ml xilolban szuszpendálunk, majd a szusz- 2 penziót visszacsepegő hűtő alatt melegítjük a 3. példában megadottak szerint eljárva. 33 percen át folytatjuk a visszacsepegő hűtő melegítést, a véghőmérséklet 139 °C. Ekkor 1,1 ml víz gyűlik össze. A terméket a megadottak szerint nyeljük ki, amiután 79,6%-os kitermeléssel ; 15,3 g anyagot kapunk. A 33 perces minta infravörös analízise szerint 19,0% imidet tartalmaz az amidcsoportokon és az ammónium-karboxilát-csoportokon kívül.

Az imidtartalmat ebben az esetben az 5. példában, az etilén-maleinsav-anhidrid vizsgálata szerint a standard ; imid/amid abszorpciós arány alapján határoztuk meg.

A termék 2%-os vizes oldatának pH-ja 5,43. Az oldat pH-ját 9,5-re állítjuk be, szűrjük, és fagyasztva szárítjuk. A pH ekkor 5,50. A termék százalékos nitrogéntartalma 10,26, imidtartalma 19,0% (az infravörös i spektrum szerint).

A fentiek szerint előállított propilén-maleinsav-anhidrid imid-tartalmú származékát Fisher hím patkányokon vizsgáltuk BLCa tumorral szemben, annak megállapítására, hogy hogyan befolyásolja a metastázist és a 13. és 15. példák szerinti műtétet követő tumor újramegjelenést. A kontroll csoportban tíz állat van, ezek a tumor beültetését követő 10. napon végzett műtétkor 5 nem kapnak hatóanyagot. Tíz állatnak a tumor kivágásának napján intraperitoneálisan egy adagban testsúlykilogrammra számítva 30 mg hatóanyagot adunk. A kísérlet eredményeit a 17. táblázatban adjuk meg.

25. példa

Az 1. példában megadottak szerint eljárva alacsony molekulasúlyú etilénből és citrakonsav-anhidridből álló kopolimert állítunk elő. A reaktorba 228,0 g citrakon5 sav-anhidridet adagolunk a maleinsav-anhidrid helyett, továbbá 1874 ml etil-benzolt és 161 ml etil-benzolban 15,6 g benzoil-peroxidot. Etilénnel 16 atmoszféra nyomást biztosítunk, és a reakciót 70 °C hőmérsékleten végezzük 27,5 órán át. A harmadik órában és a 20,5. 0 órában 108 ml etil-benzolban további 10,4 g benzoil-peroxid katalizátort adagolunk. Az etilén-citrakonsav-anhidrid kopolimert az 1. példában megadottak szerint különítjük el, amikor 23,4%-os kitermeléssel 73,5 g terméket kapunk. A kopolimer 1,0%-os dimetil-formamidos 5 oldatban 25 °C hőmérsékleten 0,042 specifikus viszkozitású.

Az alacsony viszkozitású etilén-citrakonsav-anhidrid kopolimer 29,5 g-ját (0,21 mól) félamid-félammóniumkarboxilát sójává alakítjuk a 2a. példában megadottak :0 szerint. Ily módon 103,0%-os kitermeléssel 37,0 g csökkentett nyomású térben szárított terméket kapunk. Az infravörös abszorpciós spektrum analízise szerint a termékben amidcsoport, ionizált karboxilcsoport és ammónium-karboxilát-csoport van jelen, imid nincs. 15 A 3. példában megadottak szerint eljárva részleges imidet állítunk elő az amid-ammónium-karboxilát származékból. Úgy járunk el, hogy 20 g fenti amid-sót 400 ml xilolban visszacsepegő hűtő alatt forralunk 30 percen át. A termék súlya 15,7 g (kitermelés 83,6%) és az I/A 10 abszorpciós (infravörös) arány 1,21, amely az 5. példában ismertetett etilén-maleinsav-anhidrid standard görbe szerint 31,0% imidnek felel meg. A termék százalékos nitrogéntartalma 9,24%, a termék 5%-os vizes oldatának pH-ja 5,31.

17. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők száma a 16. héten
Kontrollok	10	10/10 18—50 nap Átlag: 32,7 nap	10/10 (újra megjelenik) 48—67 nap Állag: 59 nap	10/10 (újra megjelenik)	0
Vizsgálat*	10	3/10 30-38 nap Átlag: 34,7 nap	3/3 (újra megjelenik) 61—70 nap Átlag: 66 nap	1/3 (újra megjelenik)	7

* 30 mg/testsúlykilogramm, egy adag, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításakor.

n: az állatok száma.

-24184 229

Az ammóniázott etilén-citrakonsav-anhidrid kopolimer imidet tartalmazó származékát hím Fisher patkányokon BLCa tumoron vizsgáljuk túlélésre, a tumor újramegjelenésére és anti-metastázisos tulajdonságra a 13. és 15. példában megadottak szerint. A kísérletek 5 eredményeit a 18. táblázatban foglaljuk össze.

26. példa

A példában ismertetjük az igen alacsony molekulasúlyú etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer előállítását oldószer—nem oldószer frakcionálással. Az eljárás során az 1. példában megadott etilén-maleinsav-anhidridet használjuk. Nyolc különböző etilén-maleinsav-anhidrid készítményből 1284 g keveréket készítünk ( a keverék súlya 80 C hőmérsékleten, egy éjszakán át csökkentett nyomású térben való szárítás utáni súlyt képvisel). Ennek a nyolc etilén-maleinsav-anhidrid terméknek a specifikus viszkozitása (1%-os dimetil-formamidos ol- 20 dat, 25 °C hőmérséklet) 0,051 és 0,058 között változik (átlag 0,053) és ekvivalencia súlyuk 134 és 142 között változik az oldószerrel való frakcionálás előtt. A nyolc különböző terméket (160 g) 500 ml acetonban oldjuk, és 2,5 1 toluolban kicsapjuk, 10 perc alatt, Lightning 25 keverővei való erőteljes keverés közben. A kicsapott etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert szűrjük, a szűrleteket a későbbiekben az oldódó polimer előállítására még felhasználjuk. A szűrési maradékot 2 1 toluolban szuszpendáljuk, majd két alkalommal 2 liter hexánban, 30 végül szűrjük, és 50 °C hőmérsékleten, egy éjszakán át csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ily módon a nyolc különböző kísérletből származó anyagból 1143 g terméket kapunk, amely oldószerben nem oldódó etilénmaleinsav-anhidrid kopolimer és átlagos specifikus visz- 35 kozitása 0,057 (a nyolc oldószerrel kicsapott különböző kísérleti anyag specifikus viszkozitása 0,053 és 0,060 között változott).

Az aceton és toluol elegyében oldódó polimert az egyesített primer anyalúgból úgy különítjük el, hogy az 40 anyalúgot töményítjük olajos desztillációs maradékig (Rotavap, forró vízfürdő, 25-30 Hgmm nyomás).

A desztillációs maradékot 200 ml acetonban oldjuk, és liter toluolból szobahőmérsékleten kicsapjuk. Ily módon olajos szilárd terméket kapunk. A felülúszót dekantáljuk, és a csapadékot 200 ml acetonban újra feloldjuk, majd ezt követően 1,2 liter 0 °C hőmérsékletű xilolból kicsapjuk, amiután fehér színű, szilárd halmazállapotú anyagot kapunk. A terméket szűréssel elkülönítjük, két alkalommal 400 ml xilollal, majd ezt követően két alkalommal 300 ml hexánnal mossuk, 50 °C hőmérsékleten egy éjszakán át csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ily módon 59 g, 1%-os dimetil-formamidos oldatban és 25 °C hőmérsékleten 0,031 specifikus viszkozitású terméket kapunk, amely 342 molekulasúlyú anyagnak és a titrálás szerint 172,0 ekvivalencia súlyú terméknek felel meg. Az így kapott termék százalékos széntartalma 60,92, 60,61; százalékos hidrogéntartalma pedig 6,03, 6,12.

g fenti, 0,031 specifikus viszkozitású és 172 ekvivalencia súlyú etilén-maleinsav-anhidrid frakciót félamid-félkarboxil-ammónium sójává alakítunk a 2a. példában megadottak szerint, amiután 50 °C hőmérsékleten csökkentett nyomású térben való szárítást követően 5,4 g terméket kapunk. 5 g ilyen félamid-félkarboxil-ammóniumsót a 3. példában megadottak szerint részleges imiddé alakítunk oly módon, hogy xilolban egy órán át visszacsepegő hűtő alatt forraljuk. A száraz végtermék (50 °C-on, csökkentett nyomású térben való szárítást követően) súlya 3,8 g. Ezt 70 g 4,87 pH-jú vízben oldjuk, az oldat pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,4-re állítjuk be, 0,2 mikron lyukméretű szűrön szüljük az oldatot, majd ezt követően fagyasztva szárítjuk. A végső liofilizált termék 2,0 %-os vizes oldatának pH-ja 5,1. A teljes nitrogéntartalom 12,27% és az imid-tartalom 25,0%.

A fentiek szerint előállított terméket Fisher 344 patkányban FBCa tumoron vizsgáljuk, annak megállapítására, hogy milyen hatása van a túlélésre, a tumor újramegjelenésére és a tumor műtéti eltávolítását követő anti-metastázisra. A vizsgálatokat a 13. és a 15. példa szerint végeztük.

Megvizsgáltuk a fenti terméket az immunválasz stimulálására is, oly módon, hogy megállapítottuk a birka vörösvérsejtekkel (antigén) szembeni IgM antitest képzés stimulálását a 20. példában megadottak szerint. A kísérlet eredményeit a 20. táblázatban adjuk meg.

18. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők száma a 16. héten
Kontrollok	10	10/10 18—50 nap Átlag: 32,7 nap	10/10 (újra megjelenik) 48—67 nap Átlag: 59 nap	10/10 (újra megjelenik)	0
Vizsgálat* **	9 * *	4/9 19-39 nap Átlag: 30 nap	4/4 (újra megjelenik) 61—78 nap Átlag: 70,5 nap	0/4 (újra megjelenik)	5

* 30 mg/testsúlykilogramm, egy dózis, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításának napján. A tumort a tumor beültetését követő 10. napon távolítjuk el.

** Egy állat elpusztult a tumor műtéti eltávolításakor.

n: Az állatok száma.

-251

184 229

19. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők száma a 22. héten
Kontrollok	10	10/10 21—37 nap Átlag: 29,7 nap	10/10 (újra megjelenés) 45-64 nap Átlag: 53,7 nap	10/10 (újra megjelenés)	0
Vizsgálat*	10**	6/10 21—60 nap Átlag: 39,7 nap	6/6 (újra megjelenik) 47-102 nap Átlag: 71,7 nap	1/6 (újra megjelenik)	4

* A tumor műtéti eltávolítása a tumor beültetését követő 11. napon történt.

** 30 mg/testsúlykilogramm, egy dózis, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításának napján.

20. táblázat

Vizsgálat	Az állatok száma a csoportban	IgM plakk/1X106 lépsejt	Index kontroll: 1,0
Kontrollok	2	634	1,00
Vizsgálat*	4	1173	1,85

*30 mg/testsúlykilogramm, intraperitoneálisan adagolva.

27. példa

A találmány szerinti imidek nátrium- és kálium-sóinak előállítását és felhasználását szemléltetjük az alábbiakban. Az ammónium-sót az 1., 2a. és 3-4—5. példákban megadottak szerint állítjuk elő, a vegyület (fagyasztva szárított) a következő analitikai adatokkal rendelkezik:

teljes nitrogéntartalom, %: 14,15, 13,99; nitrogéntartalom (NH₄) %: 6,16, 6,09;

pH, 2 %-os vizes oldat: 6,28;

imidtartalom (infravörös spektrum), súly%: 20,05; Meq. NH₄/g;

ammónium-elektróddal: 4,31.

A fenti imid-származék megfelelő nátrium-káliumsóját közönséges, a Rohm és Hass cégtől vásárolt ioncserélő IRC-120 gyantával állítjuk elő, tetszés szerint nátrium-sót vagy kálium-sót kapunk. Az oszlop előállí35 tására 400 ml tf'-alakú IRC-120 gyantát megfelelő oszlopba töltünk, és előállítjuk a Na⁺-alakú gyantát oly módon, hogy 3,8 1 1,0 mólos nátrium-kloridot (vagy a kálium-só előállításakor 1,0 mólos kálium-klorid oldatot), majd ezt követően 4 1 vizet vezetünk át rajta. Elő4θ állítjuk az imidet tartalmazó polimer ammónium-sójának oldatát oly módon, hogy 5,0 g polimert 200 ml vízben oldunk. Ennek az oldatnak a pH-ját híg nátrium21. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők száma a 19. héten
Kontrollok*	10	10/10 30—66 nap Átlag: 47,5 nap	10/10 (újra megjelenik) 53-85 nap Átlag: 74,1 nap	10/10 (újra megjelenik)	0
Vizsgálat*, **	10	3/10 32—59 nap Átlag: 49,3 nap	3/3 (újra megjelenik) 56-86 nap Átlag: 75,0 nap	1/3 (újra megjelenik)	7

* A tumor műtéti eltávolítása a tumor beültetését követő 7. napon történt.

**30 mg/testsúlykilogramm, egy dózis, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításának napján, n: az állatok száma.

-261

184 229 hidroxid (vagy a kálium-só előállítása esetén káliumhidroxid) oldattal 8,0-ra állítjuk be. A pH-beállított oldatot átvezetjük a nátrium* (vagy kálium⁺)-alakú oszlopon, az átvezetés sebessége 15 ml/perc. Ezután 500 ml vízzel mossuk az oszlopot. Az effluensek pH ját hidrogén-kloriddal 6,8-7,0-re állítjuk be és fagyasztva szárítjuk. A végső fagyasztva szárított sók az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek:

só-alak:	nh4	Na*	K*
kitermelés, g*	-	5,47	5,80
teljes nitrogéntartalom, %	14,07	7,77	7,00
Meg. NHÍ/g	4,31	0,034	0,036
sóvá alakított NHj, %	—	99,3	99,3
klór, %	—	1,25	1,22
Na vagy K, %	-	10,45	17,08

5,00 g ammónium-sóból, amely nátrium-kloridot vagy kálium-kloridot a hidrogén-kloriddal való pH-beállítás miatt tartalmaz.

A fenti sók közül néhányat az alábbi két biológiai vizsgálatnak vetettük alá:

a. Az ammónium-kiindulási sót Fisher 344 patkányokon kifejlesztett FBCa tumoron vizsgáljuk, megfigyeljük, hogyan hat a hatóanyag a túlélésre, a tumor műtéti eltávolítását követően a tumor újra megjelenésére és a metastázisra. A kísérleteket a 13. és a 15. példában megadottak szerint végezzük.

b. A fenti sókat megvizsgáljuk az immunválasz stimulálásának képessége szempontjából, oly módon, hogy meghatározzuk a heterogén eritrociták (birka vörös vérsejtek) által kiváltott IgM antitest képződés növekedését. A kísérleteket a 20. példában megadottak szerint végezzük.

22. táblázat

Polimer típus	A patkányok száma a csoportban	IgM plakk/ 1X106 lépsejt	Index kontroll: 1,0
Kontrol]	2	500	1,00
Ammónium (NHj)	4	1052	2,10
Kontroll	4	534	1,00
Nátrium (Na*)*	4	970	1,82
Kálium (K*)*	4	1098	2,06
Kontroll	2	538	1,00
Nátrium (Na*)*	2	1373	2,55
Kálium (K*)*	2	996	1,85
Nátrium (Na*)**	3	1523	2,83
Kálium (K*)**	3	1058	1,97
Kontroll	6	541	1,00
Nátrium (Na*)*	5	1254	2,32
Kálium (K*)*	5	1044	1,93
Nátrium (Na*)**	6	1607	2,97
Kálium (K*)**	6	1003	1,85

*30 mg/testsúlykilogramm, intraperitoneálisan adagolva.

**30 mg/kg, orálisan (szájon át) adagolva.

28. példa

Az 1E. példában megadottak szerint előállított 0,063 specifikus viszkozitású alacsony molekulasúlyú etilénmaleinsav-anhidrid kopolimert félmono-metil-szekunderamid-félmono-etil-amin-karboxilát sójává alakítjuk az alábbiak szerint. 440 ml acetonban 43,9 g (0,312 mól) etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert oldunk, az oldatot szárazjég és aceton elegyében -78 °C-ra hűtjük. Az oldathoz 71 ml (54 g, 1,74 mól) kondenzált metil-amint és 100 ml acetont adunk, miközben a kivált terméket erőteljesen keverjük. Ezután a metil-amid-amin-sóból álló terméket szobahőmérsékletre hűtjük (két óra alatt), majd egy éjszakán át keverjük, amiután szüljük, és 3X500 ml acetonnal mossuk a fölös amin eltávolítására. Ezután egy éjszakán át 20—25 Hgmm nyomású térben és 35 °C hőmérsékleten szárítjuk, amiután 123,9 %-os kitermeléssel 78,3 g félmetil-szekunder-amid-félmetilamin-sót kapunk.

20,0 g metil-amid-amint 400 ml xilolban szuszpendálunk, és keverés közben 5 percen át visszacsepegő hűtő alatt forraljuk. A forralás közben a vizet eltávolítjuk, és metil-amint vezetünk át a szuszpenzión. 0,75 ml víz távozik. Szűréssel elkülönítjük az oldhatatlan terméket, 400 ml xilollal, majd ezt követően 3 X400 ml hexánnal mossuk, szüljük, és 40 °C hőmérsékleten 20-25 Hgmm nyomáson szárítjuk. Ily módon 85,2 %-os kitermeléssel

16,4 g részleges N-metil-szubsztituált imid-származékot kapunk. A termék infravörös abszorpciós spektruma szerint a termék imidcsoportot (1700 cm^-1), szekunder metil-amíd-csoportot (1645 cm^-1), ionizált karboxilés amin-karboxilát-csoportot tartalmaz. A termék imidtartalmát meghatároztuk, ez a standard I/A abszorpciós görbe szerint 17,0% (lásd 5. példa). A termék százalékos nitrogéntartalma 11,41, 2 %-os vizes oldatának pH-ja 8,70.

A fenti N-metil-imid-tartalmú terméket Fisher 344 hím patkányokon kiváltott FBCa tumoron vizsgáljuk a túlélésre, a tumor műtéti eltávolítását követően pedig a tumor újramegjelenésére és a metastázisra. A kísérleteket a 13. és a 15. példában megadottak szerint végezzük.

Az etilén-maleinsav-anhidrid nyers termék kísérleti üzemi előállítását az alábbiakban ismertetjük..

Az alábbi két példában ismertetjük az etilén-maleinsav-anhidrid nyers termék és a származtatott termékek előállítását.

29. példa

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimer előállítása

Az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert 625 liter térfogatú saválló acélból készült, 55 liter térfogatú sarzsirozó bombával felszerelt autoklávban végezzük. Az autoklávban lévő reakcióelegy keverhető oly módon, hogy nitrogéngáz bevezetésével mozgatjuk a reagenseket, és turbina keverőt működtetünk. A készülék alsó részén körülbelül 7 cm-es szelep van a reakcióelegy elvezetésére, ezen felül hűthető és melegítő köpennyel van ellátva. A reagensek adagolása előtt a készüléket nitrogéngázzal öblítjük. Az üvegfalú reagenskeverőbe 260 kg etil-benzolt és 32 kg maleinsav-anhidridet helyezünk. 50 °C-on addig melegítjük az elegyet, míg teljes oldatot kapunk. Az etil-benzol maleinsav-anhidrid oldathoz 27

-27184 229

23. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők száma a 16. héten
Kontrollok*	10	10/10 18-50 nap Átlag: 32,7 nap	10/10 (újra megjelenik 48—67 nap Átlag: 59 nap	10/10 (újra megjelenik)	0
Vizsgálat**	10	3/10 35—40 nap Átlag: 37,3 nap	3/3 (újra megjelenik) 68—77 nap Átlag: 72,7 nap	0/3 (újra megjelenik)	7

* 30 mg/testsúlykilogramm, egy dózis, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításának napján.

** A tumor eltávolítását a tumor beültetését követő 10. napon végeztük.

n: az állatok száma.

2340 g, 22 kg etil-benzolban különálló tartályban oldott benzoil-peroxidot adunk.

Ezután a reagensek etil-benzolos oldatát 625 1 térfogatú autoklávba öntjük, a hőmérsékletet 40 °C-on tartjuk, és enyhe etilén áramot biztosítunk. A keverő percenként 125-öt fordul. Az adagolást követően a reagensek tartályát 2,4 kg etil-benzollal öblítjük, és ezt is hozzáadjuk az autoklávban lévő reakcióelegyhez. Lezárjuk az autoklávot, és etilénnel 4,8 atmoszféra nyomást biztosítunk, amit 5 percen át tartunk. A gáz bevezetésére szolgáló nyomást a reaktorban lévő nyomáshoz képest 2-4 atmoszférával magasabb értékre állítjuk. A fűtőköpeny hőmérsékletét 95 °C-ra állítjuk be, ami a reak- 35 cióelegy 75 °C-os hőmérsékletét biztosítja. Ezt a hőmérsékletet 45 percen át tartjuk, amiután a reaktorban uralkodó nyomást 16 atmoszférára növeljük. A nulla időt attól a perctől számítjuk, amikor a reaktorban lévő reakcióelegy hőmérséklete eléri a 75 °C-ot. 40 kg etil-benzolban 1560 g benzoil-peroxidot oldunk, az oldást és a sarzsirozást az 53 1 térfogatú katalizátoradagoló bombában végezzük. A reakció 75 °C hőmérsékleten és 16 atmoszféra nyomáson folyik, ennek harmadik órájának végén hozzáadjuk az autoklávban 45 lévő reakcióelegyhez a második katalizátort, az adagoló bombát 2 1 etil-benzollal öblítjük. A benzoil-peroxid második adagjának adagolását követően 14 órán át, összesen 17 órán át 75 °C hőmérsékleten 16 atmoszféra etilén-nyomáson tartjuk a reakcióelegyet. A 17 órás 50 teljes reakcióidő letelte után 25 °C-ra hűtjük a reakcióelegyet, az etilénnel biztosított nyomást megszüntetjük, és a reaktort háromszor nitrogénnel öblítjük.

A reaktorban lévő etil-benzolos etilén-maleinsavanhidrid szuszpenziót az alsó elvezető szelepen át 55 Knutsche-vákuumszűrőre vezetjük, a szűrőn gyapjúszövetből készült anyag van. A szűrőt műanyag záróedénnyel és nitrogéngázzal zárjuk. A szűrési maradékként kapott nedves masszát 150 1 xilolban szuszpendáljuk, 15 percen át keveijük a szuszpenziót, majd újra 60 szűrjük. Ezt a xilolos mosást háromszor ismételjük, majd az előbbieket háromszor 110 1 hexánnal megismételjük. A végső hexános szűrési maradékot saválló acélból készült tálcákra szórjuk, és 50 °C hőmérsékleten csökkentett nyomású térben Devine vákuumszárítóban 65 28

48-72 órán át szárítjuk, míg a termék xilolszaga nem érezhető. A végtermék súlya 38 kg (kitermelés 82,8%). A 24. táblázatban ismertetjük négy különböző kísérlet eredményeit. A fentiek során a 24. táblázat szerinti harmadik kísérletet ismertettük.

24. táblázat

Kísérlet száma	Hőmérséklet, °C	Kitermelés kg	Specifikus viszkozitás 1 %, dimetilformamid, 25 °C
1	70	12	0,063
2	75	24	0,053
3	75	38	0,051
4	75	12	0,052

30. példa át. ammóníázott etilén-maleinsav-anhidrid részleges imidjének előállítása

A 29. példában megadottak szerint előállított etilénmaleinsav-anhidrid ammóniázását és imidálását 450 1 térfogatú, keverővei és bevezető és kivizető szelepekkel ellátott üvegfalú Pfaudler-reaktorban végezzük, amelyben saválló acélból készült desztillációs hurok és kondenzáló edény van, amely lehetővé teszi a kondenzálódó folyadék eltávolítását, és bármelyik desztillációs frakció visszavezetését a reaktorba. A reaktorba két egymástól független bevezető csonk nyúlik, az egyik az ammónia, a másik folyadék számára, mindkettő a kevert reakcióelegy felszíne alá nyúlik. A két bevezető cső szűrővel és rotaméterrel van felszerelve, ez utóbbi a bemenő gáz, illetve folyadék térfogatának meghatározására. A reaktor köpenye lehetővé teszi a reakcióelegy gőzzel való fűtését vagy hűtését. A folyadék számára létesített bevezető csonk egy 115 1 térfogatú üveg Pfaudler-edénybe nyúlik, amelyben a 450 1-es ammóniázó reaktorhoz való adagolás előtt acetonban oldjuk az etilén-maleinsav-anhidrid nyersanyagot. A 450 1 térfogatú reaktorban lévő vég-281

184 229

25. táblázat

Ammóniá- zás Kísérlet száma	Etilén- maleinsav- anhidrid, kg	Hexán- nedves termék, kg	A száraz termék analízise
Anhidrid	Amid	NHÍ-só	pH 2%, vizes	Nitrogén, %
1	6	NR*	nincs	igen	igen	9,34	12,64
2	7,7	23	nincs	igen	igen	6,27	12,55
3	17,5	57,5	nincs	igen	igen	6,48	13,51
4	17,5	100	nincs	igen	igen	5,77	13,81
5	23,5	NR	nincs	igen	igen	5,88	13,93

NR* — Nem határoztuk meg.

terméket egy alsó szeleppel vezetjük saválló acélból készült Knutsche-típusú vákuumszűrőre.

Az ammóniázás és részleges imidálás folyamatát az 20 alábbiakban ismertetjük.

A 450 1 térfogatú reaktorba 158 1 (103 kg) szűrt acetont vezetünk, míg a 112 1-es tartályba 97 1 (63 kg) szűrt acetont adagolunk, nitrogénatmoszféra alatt.

A 97 1, az oldószertartályban lévő acetonhoz 21,5 kg, 25 a 29. példa 4. kísérlete szerint előállított etilén-maleinsavanhidridet adunk, és 20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten addig keveijük, míg oldatot kapunk. Ugyanakkor a 450 1-es reaktorban lévő acetonhoz vízmentes ammóniát adunk öt percen át 0,158 kg/perc sebességgel. Ez- 30 után a bevezető csonkon át hozzáadjuk az etilén-maleinsav-anhidrid acetonos oldatát (nyomás alatt), mégpedig 40 perc alatt (2,1 kg/perc), az oldat bevezetése az acetonos-ammóniás oldathoz keverés közben történik, és az oldatot a folyadékfelszín alá irányítjuk. A 4501-es reak- 35 torban 0,15 kg/perc sebességgel ammóniát vezetünk az etilén-maleinsav-anhidrid adagolása alatt. Eközben a reakcióelegy hőmérsékletét külső hűtés alkalmazása nélkül 44 °C és 55 °C közötti hőmérsékletre hagyjuk emelkedni. Az etilén-maleinsav-anhidrid adagolásának 40 befejezését követően 15 percen át 0,16 kg/perc sebességgel folytatjuk az ammónia bevezetését. Ezután 25 C-ra hűtjük a kicsapott ammóniázott etilén-maleinsav-anhidrid szuszpenziót, és a szilárd halmazállapotú termék eltávolítására vákuumszűrőre vezetjük. 45

A szűrt, ammóniázott terméket, a félamid-félammónium-karboxilát-sót tovább kezeljük oly módon, hogy három alkalommal, 20 percen át 210 1 acetonban szuszpendáljuk, majd minden szuszpenzió készítés után szűrjük. Végül 2X2101 hexánban szuszpendáljuk, majd szű- 50 rés után megkapjuk a termék hexános masszáját. A termék alikvótját analitikai mérésekre szárítjuk. Az infravörös abszorpciós spektrumanalízis szerint a termékben nincs anhidrid, jelen van viszont az amid- és az ammónium-karboxilát-csoport. A termék vizes oldatá- 55 nak 2,0 %-os koncentrációban 5,88 a pH-ja.

Összesen öt ammóniázási kísérletet végeztünk különböző mennyiségű etilén-maleinsav-anhidriddel. Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg. A fenti leírás a 25. táblázat 5. kísérletére vonatkozik.

A fenti ammóniázott etilén-maleinsav-anhidrid hexános masszát használjuk az alábbi imidálás során. Az imidálást a 25. táblázat 5. kísérletében kapott termékkel végeztük.

Az 5. kísérletből származó hexános szűrési maradékot olyan 450 1-es reaktorba töltjük, amely 171 1 (125 kg) toluolt és 85,5 1 (63 kg) xilolt tartalmaz. A hexán-toluolxilol oldószerelegyben lévő ammóniázott etilén-maleinsav-anhidrid szuszpenziót forralásig melegítjük, miközben 0,02 kg/perc sebességgel vízmentes ammóniát vezetünk át a reakcióelegyen. A refluxálás 82 °C hőmérsékleten kezdődik, az összes jelenlévő vizet azeotrop desztillációval eltávolítjuk, végül eltávozik a hexán, mindaddig, míg a reakcióelegy hőmérséklete a 115 °C-t eléri. Ezután toluol és xilol 2:1 arányú elegyének adagolásával 115 °C és 116 C közötti hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, mialatt az imidálási reakció során keletkező vizet eltávolítjuk. 7,5 órán át folytatjuk a viz azeotrop eltávolítását, és az ammónia 0,02 kg/perc sebességű bevezetését. Ezalatt az idő alatt az infravörös abszorpciós spektrum szerint bekövetkezik az imidképződés (lásd a 26. táblázatot).

Az imidkeletkezés befejeződésekor lehűtjük a reakcióelegyet, a fentiek szerint szüljük, és az elkülönült imidtartalmú terméket az előbbiekben megadottak szerint 3X155 kg toluollal mossuk (20 perc), majd 20 percen át 2X120 kg hexánnal. A végső hexános szűrési maradékot saválló acél tálcákban 50 °C hőmérsékleten 72 órán át csökkentett nyomású térben szárítjuk, vagy addig folytatjuk a szárítást, míg a csökkentett nyomású térben 50 °C hőmérsékleten 3 Hgmm nyomás uralkodik. Összesen négy imidálási kísérletet folytattunk, a kísérleteket a 25. táblázat 1., 2., 4. és 5. kísérletében nyert anyagokkal végeztük. Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg.

-291

184 229

26. táblázat

A mmóniázott etilén-maleinsav-anhidrid-imid előállítása

Kísérlet	Etilén- maleinsav- anhidrid, kg	Termék kg*	Imid, % Infravörös spektrum	2 %-os vizes oldat pH-ja	Teljes N,%	NH4- nitrogén, %
1	12	4,40 (67,6)	20,5	5,3	13,26	5,11
2	15,4	6,42 (77,1)	21,5	5,4	13,33	5,22
4	35	17,00 (89,8)	21,0	5,3	13,12	5,01
5	47	21,60 (84,9)	20,5	5,26	13,26	4,94

* 50 °C hőmérsékleten addig szárítottuk a terméket, míg 3 Hgmm nyomás nem uralkodott a csökkentett nyomású térben. A zárójelek között a százalékos kitermelést adjuk meg.

A fentiek szerint előállított és magasabb hőmérsékleten szárított termék vizes oldatainak pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,5-re állítjuk be, majd 0,2 mikron méretű szűrőn steril ampullákba szűrjük, és végső felhasználásra fagyasztva szárítjuk. Az alábbiakban a 27. táblázatban megadjuk a fenti négy kísérlet termékeinek analitikai adatait. Az eredmények az előzőekben megadottaktól különböznek, mivel a karboxilcsoportok a szárítás közben elvesztett ammóniát újra felvették.

27. táblázat

Kísérlet száma	%-os imidtartalom (infravörös spektrum)	2 %-os vizes oldat pH-ja	Nitrogén, %	Ammónia- nitrogén, %
1	18,0	5,96	13,78	5,95
2	20,8	6,00	13,96	5,74
4	18,5	6,69	14,54	6,23
5	20,0	6,46	14,20	6,13

31. példa

Az alábbiakban bemutatjuk az imidcsoportokat tartalmazó ammóniázott etilén-maleinsav-anhidrid előállítását laboratóriumi szinten olyan ammóniázott hexános etilén-maleinsav-anhidrid termékből közvetlenül kiindulva, amelyet xilolban forralunk és nem szárítunk,

Laboratóriumi készítményeket állítunk elő, amelynek a során az etilén-maleinsav-anhidridet acetonban oldjuk, majd az oldatot különböző időközökben különböző mennyiségű gáz alakú ammóniával kezelt acetonhoz adagoljuk, miközben a reakcióelegy hőmérséklete szobahőmérsékletről (23-25 °C) 50-53 °C-ra emelkedik. Szűrjük a kivált ammóniázott etilén-maleinsav-anhidridet, a szűrési maradékot acetonnal mossuk, majd a mosást hexánnal megismételjük, és szűrjük a szuszpenziót. Az ammóniázott etilén-maleinsav-anhidrid hexános szűrési maradékát xilolban. szuszpendáljuk, és a teljes szuszpenziót a víz eltávolítására két lépésben desztilláljuk: 1. 75 °C és 102 °C hőmérséklet között azeotrop desztillációval eltávolítjuk a vizet, amely az ammónia és az aceton reakciójából keletkezik; 2. a hexán eltávolítása után 122-132 °C hőmérsékleten az ammóniázott etilén30 maleinsav-anhidrid részlegesen imidálódik, amelynek során víz lép ki.

A végső részleges imidet szűréssel elkülönítjük, majd xilollal és ezt követően hexánnal mossuk. 12 ilyen kísérletet végeztünk, ezeknek az eredményeit a 28. táblázat25 bán foglaljuk össze. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a táblázat 10. kísérletének kivitelezését.

A 29. példában megadott 1. kísérlet szerint előállított 280 g súlyú (2,0 mól) etilén-maleinsav-anhidridet 1,1 1 acetonban oldjuk, és szűrőpapíron szűrjük az oldatot.

5 liter térfogatú, azeotrop desztillációra alkalmas kondenzáló edénnyel, adagoló edénnyel és az ammónia bevezetésére használható bevezetőcsonkkal ellátott reakcióedényben 2,4 liter acetont keverünk, majd keverés közben 45 perc alatt hozzátöltjük a fenti etilén-maleinsav35 anhidrid acetonos oldatot. Az ammónia bevezetésére szolgáló cső és az etilén-maleinsav-anhidrid acetonos oldatának bevezetésére szolgáló csonk az 5 literes edényben lévő folyadék folyadékszintje alatt van. Az etilénmaleinsav-anhidrid adagolása közben (45 perc) és további

10 percen át ammóniát vezetünk a reakcióelegybe percenként 0,081 mólos sebességgel, összesen 4,44 mól ammóniát használunk. Az etilén-maleinsav-anhidrid adagolását szobahőmérsékleten (23 °C) kezdjük, és a reakcióelegy hőmérsékletét hűtés nélkül a teljes 45 percen át emelkedni hagyjuk. Az ammóniázott etilén-maleinsavanhidrid szuszpenzió végső hőmérséklete 53,5 C. Szűrjük az ammóniázott terméket, 2X2 1 acetonban (egyenként 30 percen át) szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót egyenként, szintén 30 percen át 2X2 l hexánban mossuk, végül szűqük. A hexános szűrési maradékot szárítás nélkül 2,7 1 xilolban szuszpendáljuk a víz eltávolítására és részleges imidálására. Az etilén-maleinsav-anhidrid ammóniázott termékének hexános-xilolos szuszpenzióját a víz azeotrop eltávolítására forraljuk. A víz két lépésben távozik. Az egész reakció folyamán percenként 0,030 mól ammóniát vezetünk át a szuszpenzión. A víz 88 C hőmérsékleten kezd távozni, ez körülbelül 60 percen át folytatódik. Ekkor a hőmérséklet 101 °C-ra emelkedik, amiután 9,4 ml víz távozik. A hexán eltávolításával pár60 huzamosan folytatjuk a melegítést mindaddig, míg az imidkeletkezés miatt víz távozik. Ezt 125 °C-on érjük el. Az imidálási reakció során keletkező vizet 60 percen át 125 °C és 132 °C közötti hőmérsékleten desztillálva azeotrop desztillációval eltávolítjuk, amikor 6,9 ml vizet kapunk. Az imidálási reakció után 100 °C-ra hűt-301

184 229 jük a szuszpenziót, szüljük, 30 percen át 2 1 xilollal, majd ezt követően egyenként 30 percen át 2X21 hexánnal mossuk, végül szüljük. 15 órán át 50 °C hőmérsékleten, 3 Hgmm nyomáson szárítjuk a szűrési maradékot. A szárított termék súlya 314 g; kitermelés 94,5%. 5 A 12 kísérlet eredményeit a 28. táblázatban mutatjuk be.

Felhasználásra a szárított terméket vízben oldjuk (2-5 %-os oldatot készítünk). A vizes oldat pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,5-re állítjuk be, 0,2 mikron pórusnagyságú szűrőn szüljük, és ampullákban fagyasztva ¹θ szárítjuk. A szárított és fagyasztva szárított végtermék tulajdonságait a 29. táblázaton adjuk meg.

A fenti összes kísérleti anyag keverékének (körülbelül 4000 g) analitikai adatai akövetkezóTí: szárított termék: 2%-os vizes oldatának pH-ja: 5,02; súlyszázalék imid: 23,5; fagyasztva szárított termék: 2 %-os vizes oldatának pH-ja: 6,00; súlyszázalék imid: 19,5.

Kétszer 2000 g termék pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,5-re állítjuk be, sterilre szüljük az oldatot, és szérumampullákban úgy szárítjuk fagyasztva, hogy azok emberi vagy állati használatra alkalmas formában ampullánként 0,5 g-ot tartalmazzanak, összesen 8000 g-ot.

Ennek az ampullázásra használt anyagnak az analitikai adatai a következők:

28. táblázat

A 31. példa szerinti kísérletek kísérleti körülményei

Kísérlet száma	Etilén- maleinsav- anhidrid adagolás ideje (perc)*	Ammónia adagolás	összes mól	Vízeltávolítás	Vízeltávolítás az imidből***	Szárított termék, g (%, kitermelés)
Teljes idő, perc	Mennyiség mól/perc	első eset*1 idő (perc)	k - ml	Idő (perc)	ml
1	30	100	0,060	6,0	90	24,4	85	6,6	312 (93,7)
2	40	100	0,064	6,4	120	26,5	95	8,2	309 (93,1)
3	40	90	0,066	5,95	125	25,4	95	7,7	305 (92,3)
4	40	80	0,069	5,5	115	22,6	85	7,1	311 (93,7)
5	45	70	0,072	5,05	85	14,9	77	7,5	305 (91,9)
6	45	65	0,075	4,83	85	12,1	75	7,1	313 (94,4)
7	45	60	0,077	4,60	75	10,4	60	7,0	313 (94,3)
8	45	55	0,081	4,44	60	8,7	63	6,8	319 (96,3)
9	45	55	0,081	4,44	60	8,3	65	6,7	319 (96,2)
10	45	55	0,081	4,44	60	9,1	60	6,9	314 (94,5)
11	45	55	0,081	4,44	60	9,6	58	6,8	315 (94,6)
12	45	55	0,081	4,44	60	7,6	55	6,7	312 (94,0)

*Az összes kísérlet során a 29. példa szerinti 1. kísérletben előállított etilén-maleinsav-anhidrid 2,0 mólnyi mennyiségét használtuk.

** A hőmérséklet minden esetben 80 °C és 102 °C közötti.

*** A hőmérséklet minden esetben 122 °C és 133 °C közötti.

29. táblázat

A 31. példában megadottak szerint előállított termékek tulajdonságai

Kísérlet száma	Szárított termék	Fagyasztva szárított termék
2 %-os vizes oldatának pH-ja	súly % imid*	2 %-os vizes oldatának pH-ja	súly % imid*
1	5,28	21,5	6,20	17,9
2	4,89	23,2	6,12	21,6
3	4,92	25,2	6,09	22,2
4	4,98	23,2	6,23	19,9
5	5,01	22,8	6,16	21,5
6	5,10	23,5	6,22	20,8
7	5,02	23,0	6,25	19,5
8	5,12	24,0	6,14	19,3
9	5,12	23,5	6,18	19,0
10	5,07	22,5	6,06	18,8
11	4,99	22,2	6,18	19,0
12	4,96	23,2	6,10	19,5

infravörös abszorpciós spektrum-analízis szerint.

-311

184 229

2%-os vizes oldat pH-ja: 6,27;

az infravörös abszorpciós spektrum szerinti imid/amid arány: 0,888;

imidtartalom, súlyszázalék: 19,3;

teljes nitrogéntartalom, %: 14,49;

ammónia-nitrogéntartalom, %: 6,27.

A fentiek szerint előállított nagy mennyiségű terméket Fisher344 hím patkányokban vizsgáljuk FBCa tumoron, annak megállapítására, hogy hogyan befolyásolja a túlélést, a tumor újramegjelenését és a metastázisos folyamatokat a tumor műtéti eltávolítását követően. A vizsgálatok során a 13. és a 15. példákban megadottak szerint járunk el. A kísérletek adatait a 30. táblázaton adjuk meg.

32. példa

A 20. példában megadottak szerint járunk el a közönséges Lewis patkányok vizsgálatakor. Megállapítjuk a találmány szerinti termék hatását az immunválasz stimulálására, amit a heterogén eritrociták (birka vörösvérsejtek) által kiváltott IgM antitest képzés növekedése határoz meg, azzal a különbséggel, hogy ebben a kísérletben a találmány szerinti imidtartalmú készítményt intravénásán adagoljuk 1 ml fiziológiás sóoldatban a farki vénán át. A kísérlet adatait a 31. táblázatban adjuk meg.

33. példa

A találmány szerinti előnyös vegyület olyan kopolimer, amely etilénből és maleinsav-anhidridből áll, molekulasúlya 850 és félamid, félammóniumcsoportokat tartalmaz, és ezenkívül imidcsoportokat, amely utóbbiak az összes fenti csoport 20%-át képviselik (gyakorlatilag azonos az 1. ábrán jelzett vegyülettel), A vegyület vizsgálatát emberen végezzük el. Az I fázisú klinikai vizsgálat során több hónapon át emésztőrendszeri rákkal (köztük gyomorrákkal, hasnyálmirigyrákkal, bélrákkal és rektális rákkal) rendelkező 72 betegnél nem tapasztaltunk a gyógyszer adagolását követően jelentős toxicitási tünete két, sem intraperitoneális, orális és/vagy intravénás ada30. táblázat

	n	Újramegjelenés	Elpusztul	Metastázis a halálkor	Túlélők aló. héten (112. napon)
Kontrollok*	10	10/10 18—77 nap Átlag: 45,4 nap	10/10 (újra megjelenik) 51—95 nap Átlag: 76,8 nap	10/10 (újra megjelenik)	0
Vizsgálat*,**	10	0/10	0,10	0	10

* A tumor műtéti eltávolítását a tumor beültetését követő 7. napon végeztük.

** 30 mg/testsúlykilogramm, egy adagban, intraperitoneálisan adagolva a tumor műtéti eltávolításának napján, n: az állatok száma.

31. táblázat

Intravénás dózis, mg/kg

A 7. példa 6. táblázatának A 3. példa 4. táblázatának

A polimeqe 5. polimeije

IgM	Stimulációs	IgM	Stimulációs
plakk/1X106	index	plakk/1X106	index
lépsejt	Kontroll: 1	lépsejt	Kontroll: 1

0 (kontroll)	562*	1,00	522**	1,00
32	1298	2,31	1406	2,69
16	1138	2,02	1282	2,46
8	1215	2,16	1684	3,23
4	1178	2,10	1882	3,61
2	1144	2,04	1238	2,37
1	1257	2,24	1100	2,11
0,5	1173	2,09	1844	3,53
0,1	1021	1,87	1022	1,96
*Csoportonként öt állat. **Csoportonként két állat.

-321

184 229 goláskor, ezen felül a betegség előrehaladása megállt a gyógyszerrel való kezelés alatt.

34. példa 5

Ha a 24. példában ismertetett eljárás során a propilén helyett ekvivalens mennyiségű izobutilént használunk, gyakorlatilag hasonló eredményt kapunk.

35. példa

Ha a 25. példában megadott eljárás során a citrakonsav-anhidrid helyett ekvivalens mennyiségű dimetil-ma-15 leinsav-anhidridet használunk, úgy gyakorlatilag hasonló eredményeket kapunk.

36. példa 20

Ha a 26. példában megadott eljárás során használt átlagosan 342 molekulasúlyú etilén-maleinsav-anhidrid helyett 300 számított átlagos molekulasúlyú etilénmaleinsav-anhidridet használunk, úgy gyakorlatilag 25 hasonló eredményeket kapunk.

37. példa

Ha a 26. példában megadott eljárás során használt 342 számított átlagos molekulasúlyú etilén-maleinsavanhidrid helyett 1500 számított átlagos molekulasúlyú etilén-maleinsav-anhidridet használunk, úgy gyakorlatilag hasonló eredményeket kapunk. 35

A témában jártas szakember előtt nyilvánvaló, hogy a találmány ismeretében további példák adhatók meg, anélkül, hogy a találmány szellemétől, oltalmi körétől eltávolodnánk. Érthetően ezek a példák is a találmány oltalmi köréhez tartoznak. 40

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás immunregulációs szempontból aktív, 2—4 szénatomos olefin monomerből és 4-6 szénatomos aj3-telítetlen polikarbonsav-anhidridből álló 300—1500 mólsúlyú kopolimer-származék előállítására, mely

   a) félamid, félammónium-só-csoportokat tartalmazó és 50

   b) imidcsoportokat tartalmazó egységekből áll, az amidcsoportokat tartalmazó egységek a félamid, félammónium-só funkciós csoportokat tartalmazó egységek

   5-40 súly% mennyiségét alkotják, és adott esetben a félammónium-só-csoportok legalább egy része attól eltérő gyógyszerészeti szempontból elfogadható sócsoporttal helyettesített, azzal jellemezve, hogy egy 300-1500 molekulasúlyú, 2-4 szénatomos olefin monomer és 4-6 szénatomos α,β-telítetlen polikarbonsavanhidrid által alkotott kopolimert, mely félamid, félammónium-só-csoportokat tartalmazó egységekből, valamint adott esetben ezekre számítva legfeljebb 5 súly% imid-csoportokat tartalmazó egységekből áll, ammóniával reagáltatunk, majd adott esetben a félammónium-sócsoportokat más, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sócsoportokká alakítjuk át.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót szerves oldószerrel készült reakcióelegyben a reakcióelegy forráspontjának megfelelő hőmérsékleten végezzük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként xilolt vagy toluolt használunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan kopolimert alkalmazunk, melynek olefin monomerje etilén.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan kopolimert alkalmazunk, melynek polikarbonsav-anhidrid monomerje maleinsav-anhidrid.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan kopolimert alkalmazunk, melynek olefin monomerje etilén és polikarbonsav-anhidrid monomerje maleinsav-anhidrid.
7. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 850 átlagos molekulasúlyú kopolimert használunk.
8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 50 °C és 200 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 60 °C és 150 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
10. 10. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a reakciót 100 °C és 150 °C közötti hőmérsékleten végezzük.
11. 11. Eljárás immunregulációs hatású szer előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított kopolimert fiziológiás sóoldatban oldjuk.