SE449490B - Sampolymerer av olefiner och omettade polykarboxylsyraanhydrider, sett att framstella dem samt deras anvendning som immunreglerande medel - Google Patents

Description

449 490 Breslow, Pure dc Appl. Chem, 46, 103-13 (1976). Denna sampolymer är även känd som pyransampolymer eller DIVEMA, och ett välkänt prov har betecknats NSC 46015. Användningen av dessa pyransampolymerer som antitumörmedei beskrivs även i amerikanska patentskrifterna 3.224.943 och 3.794.622, där den användbara molekylvikten beskrivs ligga mellan 5.000-30.000. Antitumöraktiviteten hos pyransampolymeren har tillskrivits en immunopotentiering eller en effekt på immunsvaret genom det retikuloendoteliala systemet (RES) genom att öka makrofagfunktionen, vilket beskrivs i ett antal publikationer däribland exempelvis Breslow, Pure dr Appl. Chem, 146, 103-13 (1976), Mohr et al., Prog. Cancer Res.

Ther. 7, 1115126 (1978), Schultz et al., id. 7, 459-67 (1978) och Dean et a ., Cancer Treatment Reports 62, September 1978. I i Trots de tidigare rapporterna om kronisk toxicitet hos olika polymerer av EMA-typ med högre molekylvikt utfördes ytterligare forskning av föreliggande uppfinnare för att ytterligare utvärdera polymerer av denna allmänna typ med avseende på lmmunreglerande aktivitet. Nya angreppssätt och nya utvärderings- metoder infördes, vilka medgav igenkännande av immunreglerande aktivitet utan tillhörande cytotoxicitet. Som följd härav visade sig vissa av dessa mera nyligen utvärderade föreningar inte ha någon direkt cytotoxisk aktivitet, samtidigt som de överraskande och oväntat befanns vara mycket effektiva mot tumörmetastaser och tumöràterfall efter bortskärning eller avlägsnande av en huvudtumör. Sålunda är dessa föreningar indicerade som speciellt användbara vid kontroll av tumör- terapi genom en immunologisk mekanism. De är användbara för att förhindra tumörâterfall eller utveckling av metastaser genom administrering efter bortskär- ning eller avlägsnande av en huvudtumör genom kirurgi, röntgen eller cytotoxisk kemoterapi. i l enlighet med föreliggande uppfinning har en ny grupp av föreningar av den ovannämnda allmäna EMA-typen syntetiserats, vilka är effektiva mot tumörmetastaser och tumöràterfall hos däggdjur, även om de saknar kraftig primär antitumöraktivitet. Dessa föreningar är sampolymerer av olefinmonomerer med från 2 till ca 4 kolatomer och oß-omättade polykarboxylsyraanhydrider med från 4 till ca 6 kolatomer, vilka sampolymerer har en medelmolekylvikt från ca 300 till ca 1.500 och är derivatiserade så att de innehåller såväl en halv-arnid, halv-karboxylatsaltfunktion som en imidfunktion, varvid imidfunktionen omfattar från ca 596 till ca 4096 av den derivatiserade funktionen. Illustrativa exempel på sådana olefinmonomerer är eten, propen och isobuten, och illustrativa exempel på sådana polykarboxylsyraanhydrider är maleinsyraanhydrid, citrakonsyraanhydrid och akonitsyraanhydrid. Av dessa monomera komponenter är eten och malein- 1:' 449 490 syraanhydrid föredragna. l illustrerande men inte begränsande syfte kan den föredragna sam- polymeren av eten och maleinsyraanhydrid, som är derivatiserad på lämpligt sätt, representeras som omfattande följande strukturella enheter eller grupper: (a) halv-amid, halv-karboxylatsalt m -æx-xz-cn -cH-çH.J H1 0=C C=O L NX? O”Y* och (b) imid ' * i där X = H eller ChQ-alkyl, företrädesvis H, Y = H, ammonium eller en farmaceutiskt godtagbar metallkatjon, företrädes- vis ammoniu m, och Z = H, C1_¿¿-alkyl, ammonium eller en farmaceutiskt godtagbar metallkatjon, företrädesvis H.

De respektive (a)- och (b)-enheterna eller -grupperna är fördelade längs en huvudsakligen linjär, kontinuerlig kolatommolekyl. Från ca 596 till ca 4096 av dessa enheter skall vara imidgrupper, med återstoden huvudsakligen bestående av halv-amid, halv-karboxylatsaltenheter. Dessa enheter kan vara placerade slump- mässigt inom kedjan och/eller slumpmässigt inom polymeren. Man inser att en liten andel (som tros vara mindre än 10%) monoammonlumkarboxyl- eller andra farmaceutiskt godtagbara saltgrupper och/eller dikarboxylgrupper också kan förekomma, härrörande från delvis reagerad eller oreagerad anhydrid under '20 framställningen av dessa föreningar.

Av de föregående derivatiserade grupperna är (a) halvamid, halvkarbox- ylatsaltgruppen företrädesvis ett halvamid, halvammoniumsalt, och (b) ímid- gruppen är företrädesvis osubstituerad ímid. 449 490 Åter i illustrerande och inte begränsande syfte kan den föredragna sampolymeren av eten och maleinsyraanhydrid såsom lämpligt derivatiserad representeras som uppvisande följande strukturella enheter eller grupper: (a) halvamid, halvammoniumsalt - cHQ- ca;- cH -çu - I O=C C=O NH? OÜQHR . och (b) osubstituerad imid *Cl-lz-Cl-ií-CH-CH - o=c c=o \ / N H Såsom tidigare är respektive (a)- och (b)-enheter eller grupper fördelade längs en väsentligen linjär, kontinuerlig kolatommolekyl. Från ca 596 till ca 14096 av dessa enheter är företrädesvis osubstituerad imid, varvid återstoden huvudsakligen är de föredragna halvamid, halvammoniumsaitenheterna. Dessa enheter kan placeras slumpmässigt inom kedjan eller slumpmässigt inom poly- meren. Man inser att en liten andel (som tros vara mindre än 1096) monoammoniumkarboxyl- eller dikarboxylgrupp kan förekomma härrörande från delvis reagerad eller oreagerad anhydrid under framställningen av dessa före- ningar.

De polymera immunreglerande medlen enligt uppfinningen är också företrädesvis vattenlösliga.

Uppfinningen illustreras ytterligare genom de bifogade ritningarna, i vilka Fig. l visar "fingeravtrycksområdet" av det infraröda absorptionsspektrat för en representativ polymer enligt uppfinningen, som är derivatiserad för 'att innehålla 2096 imid; se Exempel 3, Tabell IV, körning 5 nedan, Fig. 2 i jämförande syfte visar "fingeravtrycksomràdet" för det infraröda absorptionsspektrat för en motsvarande polymer, som innehåller 096 imid; se ' 449 490 Exempel 2 (a) nedan, och Fig. 3 i jämförande syfte visar "fingeravtrycksomrâdet" av det infraröda absorptionsspektrat för en motsvarande polymer, som är derivatiserad för att innehålla 10096 imid; se Exempel 5 nedan. Även om den' kanadensiska patentskriften 664.326 beskriver användning av halvamid, halvammoniumsalterna av sampolymerer av EMA-typ eller använd- ning av imider eller partiellt imiderade derivat av sampolymerer av EMA-typ för antineoplastisk aktivitet tror vi att de speciella polymererna enligt uppfinningen, som har kombinationen av såväl (a) halvamid, halvkarboxylatsaltfunktion som (b) imidfunktioni de häri angivna proportionerna och som har relativt låg medelmole- kylvikt från ca 300 till ca 1.500, är nya. Dessa nya polymerer har oväntande, användbara immunreglerande egenskaper, som inte finns hos motsvarande poly- merer med endast (a)- eller (b)-funktionen eller som har betydligt högre molekylvikt. Som jämförelse kan också nämnas att motsvarande monomera fragment av dessa polymerer, nämligen succinimid och succínamidsyra (ammonie- rad bärnstenssyraanhydrid) tidigare har beskrivits såsom icke uppvisande någon nämnvärd tumörhämmande aktivitet; Regelson et al., Nature (London) 186, 778-80 (1960).

De oderivatiserade sampolymerer med låg molekylvikt, som används för att framställa de önskade immunreglerande medlen enligt uppfinningen, kan framställas genom välkända metoder, som exempelvis beskrivs i amerikanska patentskrifterna 2.857.365, 2.913.437, 2.938.016, och 2.980.653. Typiskt sett får olefinen, exempelvis eten, reagera med polykarboxylsyraanhydriden, exempelvis maleinsyraanhydrid, vid temperaturer från ca 40°C till ca lO0°C i närvaro av en fri-radikalfrämjande katalysator och ett vätskeformigt lösningsmedel, som är ett lösningsmedel för reaktanterna och inte något lösningsmedel för den bildande interpolymeren. Konventionella fri-radikalfrämjande polymerisationskatalysatorer av peroxidtyp och azotyp är utomordentligt lämpliga för detta ändamål, och exempelvis bensoylperoxid är en föredragen katalysator. lnerta lösningsmedel såsom bensen, halobensener och haioparaffiner är användbara lösningsmedel för polymerisationsreaktionen. Ett alkylerat aromatiskt kolväte med minst ett a-väte, t.ex. etylbensen, isopropylbensen, diisopropylbensen, toluenoch _xylen, är dock ett föredraget vätskeformmedium för polymerisationsreaktionen i syfte att reducera molekylvikten hos sampolymerprodukten, såsom beskrivs i amerikanska patent- skriften 2.913.437. Etylbensen är speciellt föredraget som vätskeformigt medium för sistnämnda syfte. Sampolymeren innehåller företrädesvis väsentligen ekvimo- lära mängder av olefinresten och anhydridresten, såsom uppnås vid användning av ungefär ekvimolära mängder av reaktantmonomererna. Den bildade sampolymer- rf: 449 490 produkten erhålls i fast form och kan lätt återvinnas genom filtrering, centrífuge- ring och liknande separationsmetoder.

Man inser att fri-radikalinitiatorn kommer att medföra införande av olika organiska komponenter i polymerstrukturen, detta såväl genom initiering av polymerisationsreaktionen och den efterföljande termineringen eller telomerise- ringen med det vätskeformiga mediet av alkylerat aromatiskt kolväte. Procent- andelen av dessa komponenter i den totala polymerkompositionen ökar alltefter- som polymerens molekylvikt minskar. Exempelvis kommer användning av bensoyl- peroxid som fri-radikalinitiator och etylbensen som vätskeformigt reaktions- medium att leda till införande av deras respektive aromatiska komponenter i den polymera strukturen. Dessa komponenter kommer att utgöra en större procent- andel av den totala strukturen i polymerer med en molekylvikt av ca 300 än i polymerer med en molekylvikt av ca l.500.

Vid framställningen av dessa lågmolekylära sampolymerer kan en viss mängd tvärbindningsmedel införlivas i sampolymeren för att därigenom göra produkten olöslig i vatten. Exempel på sådana tvärbildningsmedel är vinyl- och allylestrar, speciellt de akrylater och krotonater som beskrivs i amerikanska patentskriften 3.165.486. Sampolymererna kan ocksâ olösliggöras efter derivatise- ring med hjälp av olika medel som t.ex. tvärbindníng med diamin, såsom beskrivs i amerikanska patentskriften 3.554.985, eller genom att fästas vid bärare såsom bentonit, latexpartiklar eller erytrocyter.

Det är känt att amidderivat av sampolymerer av EMA-typ kan framställas genom att sampolymeren får reagera med ammoniakgas vid normala eller förhöjda temperaturer, såsom beskrivs i kanadensiska patentskriften 664.326 och amerikanska patentskrifterna 2.883.287 och 3.157.595. Det är även känt att reaktion vid högre temperaturer tenderar att främja imidbildning, medan reaktion i inerta organiska vätskeformiga lösningsmedelsmedium såsom bensen kan an- vändas för att kontrollera reaktionstemperaturen och fördröja imidbildningen. En annan känd metod för imidbildning omfattar reaktion av polymeren i flytande ammoniak vid -33°C. Även om ovan nämnda metoder vanligtvis är användbara för framställ- ning av halvamid, halvammoniumsaltet som ett mellansteg för framställning av de imidhaltiga derivaten är de bristfälliga beträffande tids-diffusionseffekt av ammoniak in i den inre kärnan av EMA-partiklarna för syftena enligt denna uppfinning, såsom beskrivs i Exempel 2 nedan. En föredragen metod för syftena enligt föreliggande uppfinning innebär att man först upplöser sampolymeren av EMA-typ i aceton, följt av reaktion av den upplösta polymeren med flytande ammoniak i acetonen. Den önskade halvamid, halvammoniumsaltprodukten faller å! 449 490 ut ur lösningen och kan sedan lätt återvinnas genom filtrering, centrifugering och liknande separationsmetoder, såsom illustreras ytterligare i Exempel 2, delarna a, b och c, nedan. Fig. 2 i de bifogade ritningarna visar IR-spektrum för halvamid, halvammoniumsaltprodukten enligt Exempel 2 (a) som innehåller 096 imid.

Framställningen av de önskade imidhaltiga derivaten kan sedan ske genom att det intermediära halvamid, halvammoniumsaltet får reagera med ammoniak för att ytterligare derivatisera sampolymeren, så att den innehåller både (a) halvamid, halvammoniumsaltgrupper och (b) imidgrupper, varvid dessa imidgrupper innehåller från ca 5 till ca #0 vikt-96 av nämnda derivatiserade grupper, och eventuellt överför nämnda halvammoniumsaltgrupp till andra farmaceutiskt godtagbara saltgrupper. Reaktionen utförs i ett lämpligt organiskt lösningsmedium som t.ex. toluen eller xylen vid återflödestemperaturer tills den önskade procentandelen av imidderivat bildas, såsom illustreras vidare i Exemplen 3 och 4 nedan. Återflödestemperaturerna kan variera från ca 50°C till ca zoo°c, förctfädccvis från ca so°c nu ca 1so°c, och särskm föredraget från 1oo°c nu 1so°c. - Fig. I i de bifogade ritningarna visar lR-spektrat för ett representativt exempel (Exempel 3, Tabell IV, körning 5) av den önskade polymeren, som är derivatiserad för att innehålla såväl (a) halvamid, halvammoniumsaltfunktionen som (b) imidfunktionen, och i vilken imiden omfattar 2096 av nämnda derivatise- ring. Polymeren enligt detta exempel har en medelmolekylvikt på ca 850 och de 2096 imid ligger inom det föredragna området av ca 1096 till ca 2596 imid.

I jämförande syfte framställdes också ett 100% imidderivat av EMA- sampolymeren, såsom illustreras i Exempel 5 nedan. Fig. 3 i ritningarna visar IR- spektrum för denna polymer.

En detaljerad beskrivning av IR-analysen för identifiering av de olika ovan nämnda funktionella grupperna, enligt illustrationen i Fig. l till 3, anges nedan, efter Exempel l.

För att demonstrera effektiviteten hos polymererna enligt uppfinningen vid immunreglerande kontroll av tumörterapi fick representativa exempel på polymererna undergå olika tester enligt följande: I en serie tester undersöktes polymererna i en virusinducerad, icke- metastatisk mustumörmodell. Den använda modellen var SVIJO-virus-inducerat fibrosarkom (mKSA) med ursprung från syngen BALB/c-mus. Denna mustumör, mKSA-TUS, har sitt ursprung från Kit et al. Int. J. Cancer 4, 384-392 (1969) och är inte känd att regressera hos syngena BALB/c-möss. I denna undersöknings- 449 490 serie relaterades de observerade tumörregressionerna till immunostimulering, och reduktionen av tumörbelastning i enlighet med Dean et al. Int. J. Cancer, 16, 465-475 (1975), som visade att mKSA hade tumörassocierade antigener och att det i små djur med tumörer förelåg god korrelation med cellförmedlad immunitet. Mössen behandlades med tre olika doser av testföreningen, antingen före eller efter eller såväl före som efter efter aktivering med livskraftiga tumörceller vid TD 1 00 och TD 59. Tillväxten av tumörerna utvärderades sedan för de behandlade djuren relativt normala, obehandlade kontrollmöss. I denna undersökningsserie visade polymerer enligt uppfinningen med en medelmolekyl- vikt på ca -850 väsentligt större tumörregressionsaktivitet än motsvarande polymerer med molekylvíkter på 2000-3000 och 20 000-50 000.

I en annan undersökningsserie testades representativa polymerer enligt föreliggande uppfinning vid en kemiskt inducerad râttumörmodell med metastas- er. Den använda modellen var en B-metylkolantren-inducerad blâstumör (BLCA) pà Fischer BIM-råttor; Prehn R.'l'. et al, J. Nat. Can. Inst. 18, 769 (1957) och Falk, R. et al, Surgery, October (1978). Tumörcellerna hade förvarats i cellkultur under fem år och var kända att efter subkutan (SC) implantation ge lungmeta- staser inom en vecka efter implantationen. Den vanliga överlevnadstiden efter subkutan tumörimplantation är tre veckor eller mindre.

Vid en del av dessa undersökningar med den metastaserande râttumör- modellen administrerades testpolymeren periodiskt med ca en veckas intervall i tre veckor efter tumörimplantationen. De behandlade djuren hade mer än tre gånger större överlevnadsgrad än för de obehandlade kontrolldjuren, och ingen metastatisk tillväxt noterades under de sex observationsveckorna.

Vid en annan del av dessa undersökningar på den metastaserande ràttumörmodellen adminístrerades polymeren som ett komplement till tumörav- lägsnande 7 till 10 dagar efter tumörympningen. De behandlade djuren observera- des med avseende på tumöråterfall efter avlägsnandet och jämfördes med obehandlade kontrolldjur. l-los kontrolldjuren var tumöråterfallen 10096 inom sex veckor efter resektionen med en medeltid på 32 dagar, medan för djur behandlade med föredragna polymerer enligt uppfinningen med 30 mg/kg inga återfall observerades under de första sex veckorna och tumörâterfall efter 10 veckor endast observerades hos 1396 av djuren. ' Vid ännu en undersökningsserie testades representativa polymerer enligt uppfinningen på normala Lewis-råttor och befanns stimulera immunsvaren, påvisat genom en ökning av antikroppsproduktionen. I Ytterligare andra tester på normala Lewis-råttor visade B-cell- vs 'ab 449 490 aktivering genom representativa polymerer enligt uppfinningen, utan närvaro av T-celler, vilket sålunda indicerar användning av dessa polymerer som tymusfunk- tíonersättning. T-celler är tymushärledda lymfocyter, medan B-celler är lymfo- cyter som differentíerar i bursalekvivalenten eller benmärgen.

Ytterligare testning på normala Lewis-råttor beträffande ökning i peritoneala makrofager och aktivitet av latex phagocytosis hos makrofagerna har visat att den immunreglerande effekten hos dessa polymerer på B-cell aktivitet inte åstadkommas genom stimulering av makrofagaktiviteten. Polymererna enligt uppfinningen synes sålunda verka på annorlunda sätt än de tidigare kända gbesläktade pyransampolymererna, vilka verkar genom RES genom ökning av makrofagfunktionen.

En detaljerad beskrivning av ovannämnda och andra sådana tester och motsvarande resultat anges i Exemplen 8 till 23 nedan.

Vanligtvis kan polymererna enligt uppfinningen administreras till en värd i en effektiv immunreglerande mängd som ett hjälpmedel till tumörkemo- terapi, tumörbestrâlningsterapi och/eller tumörexcision. Som sådana adjuvantia vid tumörterapi kan de administreras vid ungefär samma tidpunkt som sådan terapi eller inom lämplig tid före eller efter sådan terapi. I allmänhet innebär detta' 'inom en tvådagars period omedelbart före och en enmånadsperiod omedelbart efter sådan terapi. Studier indikerar att tömning av en föredragen vattenlöslig polymer enligt uppfinningen sker på ca 30 till 60 dagar, och man förväntar sålunda att administrering av boosterdoser -av polymeren kan ges ungefär var sjätte vecka.

Polymererna kan administreras parenteralt liksom oralt i mängder från exempelvis ca l till ca 100 mg per kg kroppsvikt. De kan administreras såväl intravenöst som intraperitonealt, företrädesvis i vattenlösning såsom sterilt vatten eller koksaltlösning. Oralt kan de administreras i form av tabletter, pulver, kapslar, elixir och liknande doseringsformer i blandning med sedvanliga fasta och flytande spädningsmedel, bärare, suspenderingsmedei och adjuvantia som t.ex. majsstärkelse, laktos, talk, stearinsyra, magnesiumstearat, gelatin mdfl- Och ibhannesbrödbàagumnfi, alkohol, vanan, aimefyisulfoxid (bMso), vegetabi- liska oljor och liknande material. Den orala doseringsformen rekonstitueras företrädesvis fast i en lämplig vätskeblandning vid administreringstillfället för att bibehålla stabiliteten hos de dubbla grupperingarna av (a) halvamid, halvkarboxylatsalt och (b) imid. Andra lämpliga doseringar av polymererna för att ge önskad immunreglerande effekt kan bestämmas med hänvisning till de speciella exempel som anges nedan. En föredragen doseringsform för administre- 449 490 ring av polymeren är i fysiologisk koksaltlösning. Även om de efterföljande detaljerande exemplen illustrerar uppfinning- en ytterligare är det givet att uppfinningen inte är begränsad till dessa speciella exempel. 1 alla exemplen avser det procentuella utbytet procentandelen utvunnen produkt i förhållande till teoretiskt utbyte.

Exemæl 1 Framställning av EMA Detjinskade râmaterialet, eten/maleinsyraanhydrid (EMA)-sampolymer- i en, framställdes i en upphettad reaktor av rostfritt stål om 3,75 liter, försedd med inre vattenkylningsslinga, magnetomrörare med optimal drift vid 1000-1200 r.p.m., eteninlopp och ett inlopp genom vilket ytterligare katalysator kunde införas i lösningen genom etentrycket. Prov kunde uttas eller slutinnehållet töm- mas genom en bottenöppning. Hjälputrustning för uppvärmnings- och kylnings- kontroll var anordnade. Vid en typisk körning bestod satsen till reaktorn av l625g (1875 ml) etylbensen, l90g (l,94 mol) maleinsyraanhydrid och 11+,1g (0,058 mol) bensoylperoxid löst i SOg (92 ml) etylbensen. Katalysatorkärlet tvättades in i reaktorn med ytterligare 20,0 ml etylbensen. Reaktorn tillslöts och tryckventilerades 2 gånger med eten vid rumstemperatur för att undantränga luft i systemet. Därefter bringades temperaturen till och hölls vid 70°C med ett etentillförseltryck på 1380 kPa (200 p.s.i.) så länge polymeriseringen varade.

Efter tre timmars polymerisering vid 70°C och 1380 kPa etentryck gjordes en tillsats av 9,4g (0,039 mol) bensoylperoxid i 60g (70 ml) etylbensen genom katalysatortillförselledningen följt av tvättning av detta inlopp med 20 ml etylbensen. Man fortsatte därefter att röra under uppvärmning vid 7060 och 1380 kPa etentillförsel i ytterligare 14 timmar för att fullständiga polymerise- ringen. Vid slutet av körningen kyldes reaktorn och luftades, och innehållet bestod av ett etylbensenslam av eten/maleinsyraanhydrid (EMÅJ-sampolymer- produkt och en liten mängd EMA-produkt som stelnat på omröraren, kylslingorna och reaktorytorna. Detta slam filtrerades, efter sammanslagning med det stelnade materialet, som avlägsnades genom skrapning, och omvandlingen av maleinsyraanhydrid bestämdes på filtratet genom NaOH-titrering till fenol- ftalein-slutpunkt.

Den totala EMA-produktupparbetningen bestod av filtrering, slam- extraktion tre gånger (1 timme vardera) med 2 liter xylen vid rumstemperatur följt av tre extraktioner (1 timme vardera) med 2 liter hexan och slutfiltrering.

Filtrering användes mellan samtliga extraktionssteg. Den slutliga EMA-produkten 'U 449 490 Il vakuumtorkades över natten med fullt oljepumpvakuum vid 55-60°C. Den sålunda torkade EMA-produkten pulveriserades i en "Waring"-blandare i 5 minuter för att reducera den mindre andelen glasformigt material till pulverkonslstens. l tabell l sammanfattas de erhållna resultaten vid sju sådana, efter varandra följande EMA-polymeríserlngar. 449 490 12 .IÛMZ UHNUCMHw ÜUE wCwCmmZ. -.._0023 >m wcfiofiuïïa xmtvuëofiucuwoa Eocuw wEmäwn vflšzcm uoncfioE co owcwnmßucš EEw M å; Rv ..@.0E.00._2>.0_0>:...o .300030000 .R-0~0~-n 2.00... EE 0000:00 0 ...%=v_800>=: 5 ...mwšcëwäun nå. >m Éfiuuuë GV .: 000.0 00.00 2.0 .QxNS äN 0.00 u 0.:: 30.0 0100 2.0 8:3 0- 0.00 h. 0.0.: 000.0 00.00 010 rån: SN 0.8 m 102 000.0 00.00 00.0 2:8 SN 0.00 n 0.0.: 000.0 0100 010 3.3. 0- 0.00 o 0.02 000.0 3.00 00.0 3.03 EN 0.00 m 0.00. 000.0 00.00 ä... 3.000 02 0:0 < u 0~ E.. 30.300 .ä .m a. š E? . "än 02 8 æ 8 æ 050530 0==0=0>E0 .E -E2«>_>._m 000.093., Ez .šš -.._0020 -032300 00.50! ._3030 èåu 055202 _ :unmh 449 490 13 Molekylviktsparametrar bestämdes på EMA-produkten med användning av preparat F ovan som typisk produkt. Materialet vakuumtorkades i 21+ timmar vid l00°C med användning av oljepumpvakuum. Parametrarna bestämdes i torr dimetylformamid (DMF). För preparat F bestämdes talmedelmolekylvikten (Mn) till 852 med användning av ångtrycksosmometri i DMF vid 120°C med användning av en "Knauer VFW-osmometer. Viktmedelmolekylvikten (MW) bestämdes till 5730 med användning av laserljusspridning vid liten vinkel, åter i DMF, med användning av ett "Chromatix KMX-6"-instrument. Gränsviskositeten i DMF vid °C mättes med kapillärviskosimetri med användning av en "Cannon Ubblehode" utspädningsviskosimeter (storlek 75) genom extrapolation av fyra olika -koncen- trationer till nollkoncentration. Gränsviskositeten för preparat F befanns vara 0,0607 dl/g.

Liknande bestämningar av Mn, MW och gränsviskositet gjordes på identiskt sätt med användning av ett EMA-preparat med högre specifik viskositet (0,ll, 196, DMF, 25°C). I detta fall befanns gränsviskositeten vara 0,l227 dl/g, Mn var 2.264 och MW var 12.970.

Med användning av de ovan angivna värderna för tvâ EMA-produkter med varierande specifik viskositet bestämdes K- och cat-konstanterna i standard- ekvationen, som relaterar gränsviskositeten (ÛQ l) till molekylvikt, [WL ]=KMu.

De funna sambanden var: , D ' _ mig: = »hu x 10 l* Mn 0.72 och [filšïf - 3,51 x 1o'5_r1w°'85 Uttrycket "medelmolekylvikt" som det här använts med avseende på de angivna sampolymererna enligt uppfinningen är definierat att betyda talmedel- molekylvikt.

Identifiering av funktionella grupper ldentifieringen av de olika funktionella grupperna för samtliga av polymerderivatexemplen, både kvalitativa och kvantitativa, åtföljdes av infraröd analys med användning av en Beckman IR-l2 spektrofotometer. Provberedning, absorbansfrekvenstilldelningar och förfaranden för bestämning av förhållandet mellan imid- och amidgrupper följde de förfaranden som anges iantingen "The Infra-red Spectra of Complex Mo1ecules", Bellamy, John Wiley and Sons, 1960, eller "Practical Infrared Spectroscopy", Cross, Butterworth, l96li. För provberedning använde man i samtliga fall pressade skivor av 2 mg polymer per 449 490 14 250 mg torr KBr-komposition med 70 mg blandad polymer/KBr per skiva.

Positionerna för absorberande band anges i vågtalsenheter, som uttrycks i reciproka centimeter (cm'1), vanligtvis kallade bandfrekvenser.

För att ta kvalitativa "fingeravtryck" på produktkompositionen som närvaro eller frånvaro av vissa grupper godtas och användes följande bandfre- kvenstilldelningar: vsgtai (mfl) Funktion 1. Anhydrid med 5-ledig ring Dublétt: 1870-1830 mindre C=0 sträckning 1800-1750 större 2. Odissocierad alifatisk syra (COOl-Û: 1725-1700 C=0 sträckning 3. Polymer imid, S-ledig ring Dublett: 1715 större C=0 sträckning 1770 mindre 4. Polymer primär amid: amid-1-band 1670 större C=0 sträckning - ' 1620 mindre NH deformation och C-N sträckning . Karboxylatjon C05 1560-1570 assymetrisk sträckning 6. Metylen -CHZ- 1l+70-1#50 C-H deformation 7. Ammonium (NH +)-salt av karboxylat 1405-1400 symmetrisk (intensiteten beror på sträckning katjonslaget) 8. Polymerer med hög koncen- tration av imidgrupper (över 6096) innehåller även en dublett: förutom de som visas i 3 ovan. 1180-1200 större C-N sträckning 1370-1350 mindre För kvantitativ bestämning av imid/amidhalten i en polymer innehållan- de bägge grupperna, bestämdes, förutom ammoniumkarboxylatfunktion, ett absorbansintensitetsförhållande mellan huvudimidbandet vid 1715 cm-l och huvud-primäramidbandet vid 1670 cm'1. lmidhalten bestämdes genom att man jämförde det uppmätta imid/amid-förhàllandet (ovan) med en standardkurva för procent imid mot imid/amid-absorbansförhållande, som framställts från en serie IR-kurvor erhållna genom blandning av ökande mängder ren (ca 10096) imid X7. r., 'ii n 449 490 (beskriven i Exempel 5) med polymer som inte innehöll något imid eller ojoniserat COOH utan med enbart amid och joniserad karboxyl (beskriven i Exempel 2) funktioner.

För detta senare test av imid/amid-förhållandet var man noga med att säkerställa att ojoniserad karboxyl inte var närvarande vid 1715 cm'1 genom att man först löste provet i vatten, justerade pH-värdet till 10,0 med ammonium- hydroxid och frystorkade för att omvandla allt ojoniserat COOH till ammonium- karboxylat. Sådana procedurer ökar intensiteten för karboxylatbanden vid 1560 och 1400 cm'1 men säkerställer att det återstående bandet vid 1715 cm'1 verkligen härrör från imid.

I alla de följande exemplen sker hänvisning till närvaro eller frånvaro av funktionella grupper och till imidhalten i imidhaltiga polymerer på basis av närvaro eller frånvaro av de ovan angivna funktionella bandtilldelningarna och den ovan angivna metoden för bestämning av kvantitativa imid/amid-bandinten- sifefsföfhåiianden. ' Exempel 2 Framställning av halvamid-halvammonium- COO'salt av EMA (AEMA) Tidigare metoder för ammoniering av EMA-polymerer (angivna i US- PS 3.157.595 och CA-PS 6§4.326) genom endera av tre metoder: (l) torr ammoniering med ammoniakgas vid vanliga temperaturer genom att strila ammoniak i kraftigt omrört torrt EMA-pulver, (2) strila ammoniak i ett omrört slam av EMA-pulver i bensen eller hexan, eller (3) genom direkt tillsats av fast EMA-pulver till ett omrört överskott av flytande ammoniak, så att man får halvamid-halvammonium-karboxylatsaltet av EMA, har befunnits vara bristfälli- ga för föreliggande användning. Denna bristfällighet hänför sig till en avsevärd tidsdiffusionseffekt av ammoniak in i den inre kärnan hos t.o.m. fint malda EMA-partiklar. Även med förlängd reaktionstid innehåller de på så. sätt framställda amid-ammoniumsaltprodukterna alltid restmängder av oreagerad anhydrid, som närmar sig 5 viktprocent, vilket visas genom närvaron av anhydridabsorbansband vid frekvenserna 1780 och 1850 cm'1. _ Följande föredragna metod utvecklades för att eliminera långa reak- tionsperioder och dålig temperaturkontroll med bildning av produkter som inte innehöll någon anhydridfunktion. (a) EMA-polymer från Exempel l-F (80 g) löstes i 800 ml aceton (AR- kvalitet) och denna lösning sattes under en 20 minuters period till en omrörd 449 490 16 lösning av 100 ml flytande ammoniak i 3 liter aceton vid -70°C (torris-aceton- bad). Efter tillsatsperioden på 20 minuter fick hela blandningen långsamt värmas till rumstemperatur (4 timmar), varvid den utfällda produkten ändrade färg från initialt gul till vit. Produkten filtrerades och uppslammades successivt två. gånger med 2 liter aceton följt av tvâ uppslamningar med 1,5 liter aceton/hexan (50/50).

Samtliga uppslamningssteg tog vardera 30 minuter. Slutprodukten filtrerades och torkades över natten vid 45°C vid 20-25 mm Hg vakuum. Den torkade produkten löstes i 900 ml vatten, filtrerades genom ett filter på 0,45 mikrometer och frystorkades, vilket gav 98,7 g, 10096 utbyte, halvamid-halvammonium-karboxyi- salt. ., (b) Förfarande (a) ovan upprepades som följer med användning av EMA- polymer från Exempel l-F men med vatten tillsatt till den ursprungliga EMA- lösningen i aceton. EMA (60 g) löstes i 500 ml aceton plus 2,32g vatten, och lösningen återloppskokades i två timmar. Den kylda acetonlösningen av EMA sattes under omrörning och inom loppet av en 10 minuters period till 2 liter aceton, som innehöll 3 mol flytande ammoniak vid -60°C. Som tidigare fick reaktionsuppslamningen värmas till rumstemperatur och upparbetades som ovan med tvâ uppslamningar i 1,5 liter aceton och en uppslamning med l liter hexan, fíltrerades och vakuumtorkades vid #0°C, 20-25 mm Hg över natten. Den utvunna torkade produkten bestod av 84 g, vilket var mer än 10096 utbyte. (c) En tredje beredning använde EMA-polymer från Exempel l-G. 100 g (0,7lß moi) EMA âterloppskokades i två timmar i 700 ml aceton, som innehöll 3,85 g vatten. Den kylda acetonlösningen sattes under en 10 minuters period till en omrörd lösning av 3,3 liter aceton, som innehöll 60 ml flytande ammoniak vid -50°C. Efter l timme vid -50°C fick reaktionsuppslamningen värmas till rumstemperatur (2 timmar). Den filtrerade produkten uppslammades tvâ gånger i 2 liter aceton (30 minuter vardera) och två gånger i 2 liter hexan (30 minuter vardera), filtrerades och torkades över natten vid 50°C vid fullt oljepump- vakuum. Det utvunna torkade halvamid-halvammoniumkarboxylsaltet var 115,6 g, 9396 utbyte.

Analyser av de ovan angivna tre preparaten är sammanställda i Tabell ll. 'fu 449 490 17 Tabell II Preparat _a_ Q 9 Kväve: 96 (medeltal av 2) 13,40 14,18 14,19 Funktionell sammansättning genom IR Anhydrid ingen ingen ingen Odissocierad COOH ingen ingen ingen Imid ingen ingen ingen Primär amid större större större Joniserad COÖ- större större större Metylen -CHZ- ja ja ja -COO'NH J' större större större Exemæl 3 Framställning av partiella imid- derivat i xylen Ett 10 g prov av halvamid-halvammonium-karboxylsaltet i Exempel 2a uppslammades i 250 ml xylen i en l liters kolv försedd med omrörare, termometer, vattenelimineringsfälla och en gasinloppsspridare för ammoniak.

Uppslamningen återloppskokades i 12 timmar, varvid man upprätthöll ett jämnt flöde av ammoniak genom gasinloppspridaren. Alikvota prov på produktslammet avlägsnades vid olika tider (se tabell III) för analys av omvandligen till imid mot tiden. Varje litet prov upparbetades genom tre på varandra följande uppslamning- ar i 100 ml hexan, filtrerades och torkades vid 50°C, 20-25 mm l-lg vakuum. pH- värdet för 2 96-iga vattenlösningar mättes både före och efter ytterligare lösning i vatten, pil-justering till 10,0 (NHaOH) och frystorkning. IR utfördes på samtliga prov för att fastställa imid/amid-förhållandena och således den procentuella imidhalten. Resultaten är uppställda i Tabell III. 449 490 18 Tabell III Xylenåterloppskoktid (a) (b) __ (c) _ vid uttagning av prov pH-l pH-Z I/A-forh. lmld (d) vikt-96 min. 6,26 7,20 0,723 13,8) min. 6,00 5,86 0,858 18,5 45 min. 5,91 5,76 0,999 23,3 1 tim. 5,78 5,53 1,113 27,1: 1,5' um. 5,43 5,43 1,39: 36,: 2 tim. 5,27 5,76 1,501 40,2 3 tim. 4,94 5,72 1,821 50,0 4 rim. 4,78 5,38 ___ ___ e rim. 4,73 5,76 ___ -__ 7,5 flm. 4,73 5,60 _-_ ___ 12 tim. --- --- --- --- .(a) pH för 2 9ó-ig vattenlösning före pil-justering. (b) pH för 2 96-ig vattenlösning, justerad till pH 10, och frystorkad. (c) IR-bandabsorbansintensitetsförhållande vid vâgtal 1715 cm'I/ 1670 cm-l (d) Erhållet från standardkurva för sammansättning mot I/A-förhållande.

En ytterligare omgång på nio enskilda experiment kördes, varvid halvamid-halvammonium-karboxylsaltet i Exempel 2-b användes. Varje enskild körning àterloppskokades i xylen-uppslamning under den angivna tiden (Tabell IV) och upparbetades totalt.

De torra produkterna från hexantvättning löstes var för sig i 150 ml vatten, pH-justerades till 10,0 med NHaOH, filtrerades genom ett 0,20 mikro- meter filter och frystorkades direkt i sterila serumflaskor för djurutvärdering in vivo. Utbyten och analys för de olika körningarna beskrivs i Tabell IV. (h 449 490 19 .csuoa Bšäään - E :Mann ä Seän mn 3 .Én-Vona vmvtounænw ._ E :onmh nov .wocnow om A3 .Esvoä vmxnovnëü uflonnzwfïa ma .bäznm fiuv .vmšeunen 18 S: :n :w .ëeøuå .w=n=wne2ä> nwæ n å m.. .e .mcïowwå..rm »bmw wEEnw-cøfig wfi* N .än Ia Amy .w än »Énsâ 552 .n 0.8 wvenšæ n .w ns wveflâ n .<2m< w än uuansen n weeæx n: inn nnn: nn.n_ :än nn; nnš: oñn .ev än n nán nnn: 3.2 86 nn; 3.3. 26 .en n; n nán m2: 8.2 nns EJ sin: ons. .en n n Én one: 2.2 S6 S; nnnä oná .se n* n inn :nå 5.2 nns nn.n 2.9: nïn .ee On n nå än... nnfi ia nn; 2.:: nná .ee nn e n.: Sná nïï nïn nä; nnšc nn.n .ee 2 n än nnnë nnf nns nn; Såå nn.n .ee n n n.n nnïø _ nn:: än än :så nä.. .se n _ .w ...veånfnn m. . nuesä .ä w øšuën .e êzee šèn. nuvänfix :min Gain êewwwmww. ueuwmwww mensen >~ :onmh 449 490 Exemæl 4 Framställning av partiella imid- derivat i toluen Partiella imider av halvamid-halvammonium-karboxylsalt av EMA- polymer framställdes i huvudsak som i Exempel 3 med undantag av att imidbild- ningshastígheten varierades genom att man arbetade vid toluenáterflöde (ll0°C) itoluenuppslamning i stället för xylen som i Exempel 3.

Den EMA som användes var från Exempel l-F, och det förfarande som användes för framställning av halvamid-halvammoniumsaltet var detsamma som Exempel 2a utan tillsatt vatten. Denna produkt uppvisade större IR-absórptions- band för primär amid, joniserad karboxyl och ammoniumkarboxylat utan nâgra spâr av anhydrid eller imid. 28 g av detta amidammoniumsalt uppslammades i en liter toluen och upphettades till âterflöde. Tre alikvoter avlägsnades vid 2 l timmars, 3,5 timmars och 5 timmars âterloppskokning (slutet på körningen).

Produkterna isolerades genom filtrering, tre uppslamningar i 150 ml toluen och tre uppslamningar i petroleumeter, och vakuumtorkades, 25 mm Hg, i 17 timmar vid rumstemperatur. De torra produkterna löstes sedan i 100 ml vatten, justerades till pH 9,0 med NHQOH, filtrerades genom ett 0,20 mikrometer filter och frystorkades direkt i sterila serumflaskor för in vivo-utvärdering pâ djur.

Man erhöll följande resultat: Toluenåterlopps- Produkt Kväve l/A(a)" Imidm koktid, tim. g 96 förhållande 96 2 6,15 13,7: 0,531 6,5 3,5 7,73 13,41 0,600 9,5 5 9,24 13,82 0,647 11,0 (a) Se fotnot (c) Tabell Ill - frystorkad produkt (b) Se fotnot (d) Tabell Ill - frystorkad produkt Exempel 5 Framställning av helimid av EMA EMA Sp. visk. = 0,061 EMA-helimiden framställdes genom återloppskokning av 20g av pro- dukten från Exempel 2a i 250 ml xylenuppslamning i 18,5 timmar vid konstant ammoniumflöde och genom avlägsnande av reaktionsvatten i en Dean Stark-fälla.

Totalt 2,7 ml vatten avlägsnades i fällan. Produkten filtrerades, uppslammades 449 490 21 med hexan tre gånger och torkades över natten vid 25 mm Hg vakuum vid rumstemperatur. Den torra produkten vägde 13,5 g, 84,396 utbyte. Bg av produkten omrördes i 150 ml vatten över natten, filtrerades, tvättades med vatten och frystorkades. Produkten hade en kvävehalt på 9,53%, och en IR- avsökning visade absorptíonsband endast vid vågtalen 1190, 1360, 1715 och 1770 cm'l, som är typiska för imidfunktion. Inga amid-, anhydrid-, joniserad karboxyl- eller' ammoniumkarboxylatabsorptionsband kunde påvisas.

Den ovan angivna helimidprodukten användes i olika blandningar med icke-imiden, som innehöll halvamid-halvammoniumkarboxylatsalt från Exempel 2a, för att upprätta en IR-jämförelsekurva för ímid/amid-sammansättning'såsom tidigare beskrivits genom att följa Exempel 1 som följer: De angivna mängderna, vägda pâ analysvåg, blandades i rostfria stâlblandare med användning av en "Wigglebug Mixer". IR-avsökningar gjordes på pressade skivor av blandningarna ovan med torr KBr med användning av 2 mg polymerblandning pâ 250 mg KBr.

Tabletten bestod av 70 mg polymer/KBr-blandning per skiva. Totaljämförelse- kurvan konstruerades från följande blandade kompositioner: Vikt fullständig imid Vikt för noll 96 Imid/Amid- från Exempel 5 imid från Exempel 2a absorbans- mg mg förhållande 97 0,#27 94 ' 0,509 90 0,621 _ 80 0,803 70 1,161 ao eo 1,519 50 50 1,871 60 40 2,099 70 30 2,564 80 20 3,008 449 490 22 Exempel 5-A Framställning av helimid av EMA EMA sp. visk. = 0,66 Helimiden av EMA med högre molekylvikt än den som användes i Exempel 5 framställdes med användning av EMA med specifik viskositet = 0,66 (196, DMF, 25°C) motsvarande en molekylvikt på 20-30.000. I detta fall framställdes den ammonierade EMA som i Exempel 6(a) genom att man strilade torr ammoniakgas genom ett omrört EMA-pulver vid en temperatur under 70°C.

Det resulterande pulverformiga halvamid-halvammoniumkarboxylsaltet av EMA (sp. visk. = 0,66) upphettades ytterligare vid förhöjd temperatur för att omvandla halvamiden till imid genom avdrivning av vatten. ' t 525 g av det från EMA med sp. visk. 0,66 härledda halvamid- halvammoniumkarboxylsaltet skakades kraftigt i ett ll liters kokkärl, försett med en vattenavledning, och under kontinuerligt ammoniakgasflöde. Temperatu- ren höjdes till l22°C, varvid vatten började avskiljas ivattenavledningen. Efter 1 timme nådde temperaturen upp till l52°C, och 21+ ml vatten hade avlägsnats.

Man fortsatte värma med omrörning under ammoniakflöde i 5 timmar (totalt 6 timmar), varvid man erhöll totalt 54 ml vatten. Efter kylning var produkten ett vitt mjöligt pulver. Kvävehalten var ll,ll% mot teoretiskt 11,20.

Denna 100 96-iga imid av EMA med högre molekylvikt testades med avseende på tumörtillväxthämning vid ett oberoende testlaboratorium 1958 och uppvisade ingen aktivitet (se Exempel nr 22).

Exempel 6 Framställning av halvamid-halvammonium COO-salt av EMA genom tidigare kända metoder med och utan vatten (a) En 500 ml lß-halskolv utrustades med Teflor®-omrörare, termo- meter, gasinloppsspridare och gasutloppsbubblare. Ammoniakinloppsgasen kördes genom en flödesmätare för att följa flödeshastigheten endast pâ kvalitativ basis.

Kolven satsades med 25 g EMA från Exempel 1-D, och pulvret omrördes vid en hastighet av 500 rpm. lnloppsflödet av ammoniak hölls vid en sådan hastighet att man uppnådde 70°C med början från rumstemperatur utan användning av värmemantel. Efter 9 minuter hade pulvertemperaturen nått upp till 70°C, och ammoniakflödet sänktes för att upprätthålla denna temperatur. En temperatur på 70°C upprätthölls i 1 timme och 30 minuter, varefter ammoniaken avstängdes och reaktionsblandningen kyldes under kväve. Utbytet av torr ammonierad EMA som halvamid-halvammoniumkarboxylat var 30,8 g, 98,896 utbyte. Kväveprocen- ten var 14,01, 14,18, och pH-värdet för en 2 96-ig vattenlösning var 6,07. IR- l0 449 490 23 avsökningar indikerade absorptionsband för: Oreagerad anhydrid vid 1780 och 1850 (uppskattat till mindre än 5%) Primär amid vid 1670 och 1620 (större) Karboxylatjon vid 1565 (större) NHJ-karboxyiaf vid mos (större) Imider inga (b) En andra ammoniering av EMA från Exempel 1-D utfördes som vid (a) ovan, med undantag av att EMA först behandlades med vatten såsom beskrivs nedan för att öka reaktionen med ammoniak och minska anhydridkomponenten i produkten. 25 g EMA omrördes vid 500 rpm. vid 40°C (värmemantel)i 6 timmar i närvaro av 0,53g (17 mol-96) vatten, som tillsattes droppvis under de första minuterna från en 1,0 ml spruta. Efter 6 minuter kyides pulvret till rumstemperatur, och ammoniering utfördes som i (a) ovan, varvid temperaturen fick nå upp till 70°C på 10 minuter. Den totala ammonieringstiden vid 70°C var 1 timme, och produkten kyides under kväve. Utbytet var 31,4 g, l00,896 utbyte, kväveprocenten var 14,02, 13,94, och pH-värdet för 2 96-ig vattenlösning var 6,45. IR-avsökningar indikerade följande absorptionsband: Oreagerad anhydrid - närvarande men mycket mindre än i (a) Primär amid Större som i (a) Karboxyljon NHf-karboxylat med NH f-karboxylat ökat jämfört med (a) Imid - frånvarande Exempel 7 Karakterisering av produkter som tidigare framställts huvudsakligen som i Exempel 6 Under perioden juli 1956 till februari 1960 tillverkades och utvärderades halvamid-halvammoniumkarboxyiatsaltderivat med flera viskositetsgrader (olika molekylvikter) av EMA. De använda viskositetsgraderna, uttryckt i specifik viskositet vid 1,0 vikt-96 i DMF vid 25°C, varierade från 1,19, 0,60, 0,ll till 0,060. Motsvarande beräknade molekylviktsvärden (Mn) var 50-60.000, 20-30.000, 2-3.000 och 1.000. De första tre, dvs. som använde EMA med specifik viskositet 0,11, 0,60 eller 1,19, ammonierades i en stor pilotanläggningsutrustning som gav produktmängder på 270-360 kg. EMA med den lägre viskositeten (0,060) ammo- nierades i en mindre laboratorieutrustning med användning av 200-300 g EMA. 449 490 24 Förfarandena beskrivs nedan, följt av produktkarakterisering erhållen vid denna tidpunkt.

Sammanställning av pilotanlâggningsförfarande (för EMA med sp. visk. l,l9, 0,60 och O,ll): Det "ammonierings"-kärl som användes var en mantlad "Stakes" roterande tork i rostfritt stål, modell 59AB, utrustad med lämpliga organ för att införa torr ånga och vattenfri ammoniak ovanför ytan av innehållet, en omrörare som arbetade vid 5,7 rpm. och en vridventil för tätning av botten och uttömníng av slutprodukten. Enhetens "fulla" volym var l,l m3, "arbets"- volymen var 0,76 m3 och den mantlade arean var 5,9 m2. Vid en typisk körning tillslöts ammoniatorn vid botten och 225-270 kg EMA med lämplig viskositet fylldes på r-ned omröraren igång. EMAzn upphettades till 55°C, varefter den förhydrolyserades i en omfattning av 0,l5-0,20 mol vatten per mol EMA genom tillsats “ovanför ytan" av torr ånga med en hastighet av 0,0032 kg ånga per kilo EMA under en 3-timmars period. Under denna period hölls temperaturen mellan 55 och 70°C med användning av kylvatten i manteln. Vattenfri gasformig ammoniak släpptes sedan in i reaktorn (ovanför ytan av partiellt hydrolyserad EMA) vid en sådan hastighet att temperaturen hölls mellan 60 och 70°C (ca 2,3- 3,6 kg per timme) tills 2,0 mol ammoniak per mol EMA tillsatts. Sedan all ammoniak tillsatts, kyldes produkten till under 50°C och tappadesi i förrådsbehål- lare..

Laboratorieförfarande för EMA med sp. visk. 0,06: utgångsprodukten EMA framställdes pâ liknande sätt som det som beskrivs i Exempel l, med undantag av att reaktorsatsen bestod av 267g maleinsyraanhydrid, 2089 ml etylbensen, 45,8 ml n-butyraldehyd och l3,20 g bensoylperoxid, allt tillsatt från början. .Etylentrycket hölls i 24 timmar vid 1380 kPa vid 70°C. Utbytet av upparbetad EMA-slutprodukt var 279 g, 73,3 96 utbyte, och den specifika viskositeten var 0,060 vid 196 i DMF vid 25°C. En S-liters lt-halskolv satsades med 249 g fast pulver av EMA med sp. visk. 0,060 och detta omrördes kraftigt i 6 timmar vid #5-55°C efter initial droppvis tillsats av 5,3g vatten (15 mol-96 baserat på EMA) för att åstadkomma partiell hydrolys. Ammonieringen startades . med användning av torr vattenfri ammoniakgas, som sprutades in i det kraftigt omrörda fasta EMA-pulvret, och temperaturen hölls vid 3l-32°C i 18 timmar.

Under denna period observerades en långsam men jämn upptagning av ammoniak.

Slutprodukten vägde 320 g, l03,396 utbyte.

Produktkarakteriseringen av samtliga av de ovan angivna produkterna beskrivs i Tabell V nedan. 449 490 .cofluum ~ wcfihonwuxcsaxox .covo«vc:.:.oEo=_:nv umE owÉ .önEmuwu ficmuwwm xx .ucmnEmwïävficä | fiåmoxwï :mä :E vmcxmhom x .v03 ...Msn *_ 3 ovcmäfiwz ovcmhïhmz wvcmhmïwz øwcmhm>cmhm vvcmbïcwhm oucflzïcwhm noš oéw nwaæ omg mmm xxowofi ewa ovcmhïkmz øvcwcgumz oucmhmïwz uwcmhšcwhm uvcm~m>cm~m uvcmhgcwum monwonmw 2%: RS än xx°°n~ :d uvcmhmïmz 1 .. u vucmhmåmz .. | u wwcmhmïwz | u | wwšüm>cwhm | 1 f owšüm>åhm .. | | øvcmäšäum | | | NNAQQH - - - wwâq mwfi _.

Nnmq ßwmfi ann *Nnm xooodnaom xcoodwaow _ 3.0 2: U Q umïxonumxEšcoëE< PNOUV coflmïxofirzmv.

BEm .ñEïm ES: EOOOV mkñflæxonkmv. ÉPE=< ëšmummc~nümv~ u cïuflhwflxmhmx«m~ .K o>w>¥ En vzwuwEmhm "vovTDdO äxsvoha vmhmwcoEE/x "wnw._Eo3v=>_Ö_m_o2 A: .xvä .å .Sam .šïå fiwcvöšacøv~ _> :ónmh 449 490 za Prov på halvamid-halvammoniumkarboxylatsalter av EMA framställda 1957-1960 och karakteriserade vid den tiden såsom beskrivs i Tabell V förvarades i glasburkar med vanliga skruvlock, (varken under kväve eller tätade på något sätt) till i början av 1977 i en lagerlokal för vanliga ändamål. Vid denna tid (1977) togs de bort för fortsatt utvärdering (se Exempel 9 och 10). Före återanvändning karakteriserades materialen på nytt med de resultat som visas i Tabell Vl.

Det är uppenbart, att de polymerprodukter som testades 1959-1960 (Exempel 8), som inte innehöll någon imíd vid den tidpunkten, hade förlorat både ammoniak och vatten och därigenom omvandlats till imidhaltiga polymer- produkter under den långa förvaringsperioden. Dessa omvandlade produkter gav, när de senare testades i Exemplen 9 och 10, oväntat skilda resultat jämfört med de tidigare resultaten. 571 449 490 27 mä 026 oucmumïwz ovcmpm>hmz wucmhm>bmz ovcmhghwz oucfimšñæm øucmhmšñhm ßmmfl 3.2 mmm »ämm ow ~ J mucflmÉmZ mwcmhmåwz mwcmhmåwz øwcmpm>hwz wvcwhïcwhm ovcmäšcm É RS nfiwfl mmm fioN Nwmå ovcmäåwz ovcmhmåmz ovcmäïmz uušwzšumz mvcflmšhwhm øvcmäšcmpm mßmfl 2.2 än QS omwâ oucmhflíwz ovcmhmïmz uucmumimz uvcmhghmz øvcmumšähm wucmhmšähm NNE 3.3 aN|w æ .EE »Esa=ßwwcß.omnfl.vmem=ze~ wmšxontwxëšcoëëf» PNOUV coïmïxonhm! EEm »wëtm 2.5 AIOOUV mšwšxonïm! ÉPE=< Eaumvmwcficuævm 1 ciømwmåxmhwxuw: 8 6>m>x > :Så :z :zwrflšoz üošwcwhøwwwu~cuvfl Ézwoä. vmhzcoEE< _> :onmk 4 4 9 4 9 0 28 Produktutvärderingsexempel 8-21 Exempel 8 Tre molekylviktsversioner av EMA-halvamid-halvammoniumkarboxylat- derivat (som inte innehöll någon imidfunktion), identifierade i Exempel 7-V-A, B och C utvärderades vid ett oberoende testlaboratorium under 1959 och 1960 med användning av officiella förfaranden för transplantationer av fast Sarcoma-180 som specificeras av Cancer Chemotherapy National Service Center (CCNSC) och erhållna från National lnstitutes of Health. Förfarandet tillät tvâ döda på sex djur som toxisk gräns. TIG-förhållanden vid försöket beräknades som förhållandet mellan medéltumörvikten hos behandlade djur och medeltumörvikten-hos kon- trolldjur. T/C-värdena beräknades för en serie om tre experiment, om det föregående experimentet motsvarade tillâtliga gränser. Materialet var godtag- bart, om (T/C)1 x (T/C)2 x (T/C)3 var mindre än 0,08 efter det sista försöket.

Försök utfördes om (T/C)1 var mindre än 0,54 och om (T/C)1 x (T/C)2 var mindre än 0,20. De djur som användes var specificerade schweiziska möss (CCNSC, specifikation XIV), administreríngsvägen var Lp. (specifikation III) och dos- bestämningen skedde enligt specifikation Xll.

De sammanställda resultaten visas i Tabell VII. 449 490 29 än; n JOD; :oo wš n fiøuoëmvæv .wåmë som vuE d xwwšw v? ...mflwmfæw 333 mhvcm »om ...omcmw m3 vflmmh xx .O :uo m .< mchPöEšom >m :v32 fiåocoflxcå mhwEocoE :vv .mšwwcwßwchmn >m fmxzmwëšcoëëm ..m> 2373 x mtuoU 256 owö m2 om fiwwfioæ näs Ra å. 3 tweno... 02... É 3 ânnæo 36 u flEo »cos Ds É Én twwf.°.._ Ros mn io Nä Mn n fiwwtøm. mnmö .Qo mmm ânnmu . :a m mïmvtmm u 1 | 36 - - Ra - - - m: - - - QR - - - I tmßäm - - - S... - - - ä... - - - å - - - än - - - åäö". Sååå 26 23 Én å CR än šàmomo xfl: T: S06 - - - xx< x. mcwcxhwëcf. m2: .. NGE _. .GE moš :æswšw wåwE wow wcficxhmëcf.

NOE x :UB NUE Sfloåmvmw wåwE men wcmcvtmëcf.

.GE :Eøtmßu måmE wow "m xwwñm "N xæwhmm å xwP-mm voxwxzvohm wofimoxm? šfiuwmw 422m K ïmëwxm .> :unmb mcmcohæm => Zmnøh 449 490 Man drog slutsatsen, att samtidigt som toxiciteten förbättrades allteftersom molekylvlkten blev mindre, så förlorades aktivitet allteftersom storleken minskade mot den inaktiva monomerresten för denna serie av derivat.

Inga liknande derivat som innehöll den partiella ímidfunktionen framställdes eller utvärderades genom CCNSC-förfaranden eller något som helst annat förfarande vid den ovan angivna tidsperioden (1959-1960). Alla tre polymererna (A, B och C ovan) förkastades vid utvärdering med CCNSC-förfaranden mot Carcinoma 755 och Leukemia 1210.

Exempel 9 Polymerkompositionerna (A, B, D) som beskrivs i Exempel 7, Tabell VI, framställda av tre olika EMA-råmaterial med olika specifik viskositet och således med tre vitt skilda molekylvikter, administrerades till BALB/c-möss med användning av tre dosscheman, (a) före (dag -9 och -1) eller (b) efter (dag I och 9) tumörinokulering med SWO-transformerade (betecknade mKSA-TU5) tumörcel- ler, eller (c) både före (dag -9 och -I) och efter (dag 1 och 9) tumörprovokatio- nen. Föreningen administrerades intraperitonealt (IP) i tre doser om 62,5, 125,0 resp. 250,0 mg/kg. Tumörceller inokulerades med 1 x 104 celler subkutant (SC) i en grupp av djur och med 1 x 103 subkutant i en annan grupp av djur. Tillväxten av tumörer i de behandlade mössen i förhållande till normala, ej behandlade kontróllrnöss bestämdes därefter. Värdena är sammanställda i Tabell VIII-A, VIII- B och VIII-D. Av Tabell VIII-A framgår att, vid användning av polymer från Exempel 7-Tabell VI-A och med användning av dosschema (a), 4896 (17/36) tumörprovocerade möss förblev friska och tumörfria t.o.m. den 58:e dagen av observationsperioden. Dag 61 provocerades tumörfria djur pä nytt med livskraf- riga tumörceller (mKsA-rus vid 1 x lo” SC) och 82% (Udmiörblev tumörfria (dvs. immuna) 37 dagar efter provokation.

Med användning av dosschema (b), där polymer 7-Tabell Vl-A gavs efter tumörprovokation, förblev #296 (15/36) resistenta mot tumörer efter 58 dagars observation. Efter reprovokation (dag 61) med 1 x 104 livskraftiga tumörceller förblev 8096 (12/15) tumörfria 37 dagar efter reprovokationen.

Djur i dosschema (c), där polymer 7-Tabell VI-A administrerades både före och efter tumörprovokation, var 2896 resistenta (10/36) t.o.m. dag 58, och alla dessa tumörfria djur var immuna mot den sekundära tumörprovokationen. 449 490 31 Ä __ = __ -n __. w\fi ._ n N ~ ._ , ._ _.

O w\w ~+ :OO m+ OWN .. .. _. _.- .8 m- mmm w w\fi ._ QNW .. n .. ..

O m\w _. hwfi ._ _. _.

M _+ C00 a... wflfi .. = ..

N w\»~ _. QNW ._ _ ._ _. é W\N ... fiNfi ._ ._ _. w w: _... 500 m: wmQ cwN <|~> -Énmhxß flwmrcuxm :må .oEšom Um _. o w\w ...i ||| :óuucox M+O~ x .- N WE. ._ QNW .. .. _. & = = = : M W\fi ß+ :OO _.+ OhN .. _. .. _.- fio m- må % __ = = = ë wxN ._ WN... _. _. ..

H WE. m+ SUO ~+ Mmfi OfiN _. .. .. .a w\N .. n_Nm . _. _. _.

N mä. ._ hN~ _. .. .. _. ...ä T .to m- må RN <..> ..._35 .Ršæfi ...nä .uëšoa Om _. o m3 un.. l... Zoåcox a+O~ X q ä m... m ä m... w . m3 .3c2m.uw.. . mëunuw måwE wcÉušH .mEš ÅQEDF uxmåäuumånh nmmcfivcmcwm moD owmmh |hDH| <-=~> :ußmh 449 490 32 :ES .E m2 x _ O w\w , : W.Nw = : : w w\fi ._ hNfl : : : m+ :uo T w w\h .HI :UD m| WNQ OWN : _. : .__ w\h : M .Nw = = : N Ü = É Z _. _. w W\W m... :UD .~+ WMQ DNN : : _. ï. Ü Z Û-N@ = _. 2 M w\m : n N _. = ._ = Q .å T 6.. m- wå RN må :Bflï Éssm. om _. åh uuEšom _ wF E» In :obcox #3 x q .R www m R www w w? atv .ötzxazuøh M mëuzum måwE wcmcïmu .fišz Jfiësh uxwšzwšësh -mwczucmnum 30 .àmwh |nD._.« m|~=> Zuma... 449 490 33 Q m\w .. M N ._ _. _.

C 2 _. __ .- o wÉ m.. zoo _+ Q _. ._ ._ _.- .to m- än .à 2 __ __ 2 O W\w : OH .. _. ._ _. »å ü ä.. ï må 2 _. _. __ O w\w : . HN : _. ._ .__ w\h : Om. _. _. _. o m3 T ._00 m- wmo . . 2 n-_> :Bfiš :äëwxm O :må .öëšom Om ._ o wš »i ...... :Pacox .12 x ~ å å. w ä ä.. w ara hficvfizuw. m mëøcum wåwE wcmcväu .ñE-ß 1.682. .xwåššcšw ...wmcšvcwnum men Lä... -nDHLQmzE 01:; :vnmh 449 490 34 Q W\N : W N : : : .~ w\fi ._ Oh : _. : m+ :oo T o mä .T :ä m- må Q _. _. ._ N w\# : H N = = : Ö W __ __ = = o wë _+ :uo m+ mmQ É __ _. ._ fl m\w : WN ._ _. : N wïe ._ Oh : = ._ o m3 T :oo m| mmQ nu Q|~> :onfl-.ë EaEmxm Om ._ :fw .öëšom o WE i- I.. :obcox m+2 x _ å wav w å än w m3 ...mvzvwnwuwh w mëucuw wšwE wcmcflæw .fiEš ...ñEsh uxwàzfæwëzh :wwšqvcmzøm woO Lmuh -nähixmxë ïtou 0-:; :mfimh 449 490 as Polymer från Exempel 7-Tabell Vl-B testades endast på möss inokulera- de med lxlflq livskraftiga mKSA-TU5-celler (SC) (se Tabell VIII-B). Vid användning av dosschema (a) förblev 2296 (11/18) av mössen tumörfria under 5l observationsdagar. Med schema (b) förblev 2296 (4/ 18) av de tumörprovocerade mössen likaså fria från tumörer efter 51 dagar. I grupp (c) förblev endast 2/18 (1196) tumörfria i 51 dagar. Dag 54 provocerades alla de ovan angivna tumör-fria mössen (10/54) på nytt med lxlOlß livskraftiga mKSA-TUS-celler SC, och efter 37 dagar var fortfarande alla 10 tumörfria (dvs. immuna) vid förnyad tumörprovoka- tion.

Polymer från Exempel 7-Tabell Vl-D testades på tvâ tumörprovoka- tionsnivåer som med polymer 7-VI-A ovan (se Tabell VIII-D). Eftersom -den hade mycket högre molekylvikt än polymererna från Exempel 7A eller 7B, gavs dosen för polymer 7D (IP) vid 75, 50 och 25 mg/kg såsom angivits. Med behandlings- schema (a) var 11% (14/36) tumörprovocerade möss fortfarande tumörfria efter 36 observationsdagar. Av dessa förblev 7596 (3/4) tumörfria efter 37 dagar vid sekundär tumörreprovokation. Vid schema (b) förblev 896 (3/36) tumörfria efter 36 dagars tumörprovokation, och endast en av dessa var immun vid sekundär tumörreprovokation. Vid schema (c) gavs polymer 7-Vl-D både före och efter tumör, varvid 1496 (5/36) förblev tumörfria i 36 dagar, och 4 av dessa 5 (8096) var immuna mot sekundär tumörreprovokation.

Det totala antalet tumör-fria djur i Tabell Vill-A, B och D vid slutet av respektive observationsperioder härrörde från två källor, (a) sådana som var tumörfria under hela observationsperioden, och (b) sådana som utvecklade mätbara tumörer under observationsperioden, vilka sedan tillbakabildades och försvann före slutet av observationsperioden.

'En analys av tillbakabildade tumörer gentemot sådana som förblev tumörfria helt igenom utan regression indikerade både ett beroende av tumörbelastning och av den använda polymeren. En analyssammanfattning av tillbakabildade tumörer från totala antalet tumörfria djur visas i Tabell VIII-E. 449 490 36 “r 6332 m. ä .cwuovömwcomflïhmmno >m fiäšm E> o E» ovflömwußwo.. Eow .öpæEsw øumšuwšvb GV .owmömmøhmuh .ä ._ cuuoïoawcompghwmno Em: .även mïfimëzh AC 2 2 N 3 220... m3. M. m al t. u: nå :RE c ofl o . o.. noflâ nu ÉaEøxm 01:; om 3 m _ :Eek ä. .OA w ._. *Så må ._33 H2 .m2 FZ AQFZ mo _ å am ÉmEoxm mu=~> ä Na än w 252. än. ä. .mm .wa *Ei fr; :REP wn 3 3 w mot: á Emëwxm <|E> oufiumwokwø.. 8 ämfiä. Åwvöàëa» 3 :uvZ 3.0: mcficäflonmon LuEšom . .E zman... wwmäwwvhwvm flàöës... BEE. :mh c2äm> m|~=> :mnmh 449 490 37 Exemgel 10 Polymerkompositionen från Exempel 7-VI-A testades på nytt som i Exempel 9 ovan, med undantag av att 10 möss användes per testgrupp och att endast behandlíngsschemana (a) och (b) användes. Värdena är sammanställda i Tabell IX.

Med användning av dcsschema (a), där polymer gavs dag 9 och dag 1 före tumörprovokation, förblev 3796 (22/60) av de tumörprovocerade mössen tumörfria över en 61 dagars observationsperiod. Dag 62 återprovocerades 21 av de tumörfria djuren med l x 10k mKSA-TU5-tumörceller (SC), och efter ytterligare 30 dagar var 90% (19/21) av mössen tum örfria (immuna).

Vidvdet andra dosschemat (b), där polymer gavs dag 1 och 9 efter tumörprovokation, förblev 4796 (28/60) av mössen tumörfria över observations- perioden på 61 dagar. Av de 28 tumörfria mössen (vid 61 dagar) förblev 6496 (18/28) immuna i ytterligare 30 dagar efter sekundär reprovokation med tumör. 449 490 38 i m O._.\.~ ._ W.NW ._ __ ._ H OQW ._ WN_. __ ._ _.

M O-ák 0+ :OO .~+ MMQ OHN ._ : __ w 0 .QN __ W.NW __ ._ __ w 0 :a ._ m. N ._ : : _. m aim _.. :uo m: man. onN <|~>|ß EmEwxm Om _. åh .öëšoa n o in -i -I =9_É9_ m2 x _ n qqm __ QNW __ ._ : ä O.~\W _. åNfi __ __ _. __ 23 m.. 6.. _.. wå RN ._ _. ._ m. O ~.\N __ M~Nw __ _. _. 0 O~\O_. ._ m. N ~ _. ._ _.

N oïw _... :uo m- wmfi onw <1~>|~ ÉaEuxm Om _. :mä .öEšom Q QS: --- --- äšce. #2 x _ S »å w G mä w mr; ._3:o_&uu._ _ mEvcum måmE wcwcušw .öEå åæës... «xw>=$._æc_:._. åwcsucmzwm won .àwuh -nDHLxmZE 449 490 39 Exemgel ll Polymerkompositlonen från Exempel 6a, gasammonierad EMA i fast fas utan tillsatt vatten, administrerades till BALB/c-möss med användning av dosnivåerna och behandllngsschemana i Exempel 10 med 10 möss per testgrupp.

Värden erhållna efter 61 dagars observation är sammanfattade i Tabell X. Med användning av behandlíngsschema (a), där polymer 6a gavs dag 9 och dag l före tumörprovokaticm med mKSA-ïUi-tumörceller, var 4096 (24/60) av mössen fortfarande tumörfría efter 61 dagar.

Med användning av behandlingsschema (b), där polymer 6a gavs dag 1 och dag 9 efter tumörinokulation, var 3296 (19/60) av de tumörprovocerade mössen fortfarande tumörfria efter 61 dagar. Av de totalt 43 tumörfria mössen från grupp (a) plus (b) efter 61 dagar, förblev 36 eller 8796 immuna vid sekundär reprovokatíon med livskraftig tumör (1xl04 celler) under en period på 30 dagar. 449 490 40 n.

W O _.\h _. Nm _. : = M O _.\ß = www _. _. :_ m Ek ü ._00 ï ma. CR _. ._ _. m O _.\M ._ Nw = _. : w O _.\fi = MNM _. ._ _. w SR T 60 m- ma. RN m. .wfišwä å.. .wšâa um _.

N aim å- i- :obcox m3 x ä ._ Oflxm ._ NW ._ _. _. ä Û = ä __ Z = n Sk ü 60 ï än RN _. _. ._ _. O~.\m ._ NW _. _. = fl O._.\m _. wNw .. _. : N S... _- 60 m- mä 08 3 .Ršwxm ä.. 35.22. om ._ _ ER 4- å- =2ë9_ .E v. .

S må w S ma. @ Eb .wÉmEMumL m mEuzuw måwE wcwcvåw .öëå ...ñëah wxmåflwuæEsh -wmcflucmcum woO | Éuh |nD._.| X :aaah 449 490 41 Exemæl 12 Polymerkomposítionen från Exempel 6b, gasammonierad EMA i fast fas med tillsatt vatten, administrerades till BALB/c-möss med användning av dosnívåerna och behandlingsschemana i Exempel 10 med 10 möss per testgrupp.

Värden erhållna efter 61 dagars observation är sammanfattade i Tabell XI. Med behandllngsschema (a), där polymer 6b gavs dag 9 och dag l före tumör- provokation med mKSA-TU5-tumörceller, var 3096 (l 8/60) av mössen fortfarande tumörfria efter 61 dagar. Med behandlingsschema (b), där polymer 6b gavs dag l och dag 9 efter tumörínokulation, var 1796 (10/60) av de tumörprovocerade mössen fortfarande tumörfria efter 61 dagar. Av de tctalt 28 tumörfria mössen från grupp (å) plus (b) efter 61 dagar, förblev 23 eller 8296 tumörfria i' 30 dagar efter en sekundär reprovokation på 1 x 104 med tumörceller. 193 449 490 42 M O.~\N _. NW : = : o = __ = = N O.~\m m+ C00 ~+ wmb DHN : : _. .c O~\m : NW = ._ = w 0:a _. fiNfl : = : N cïm T. 200 mn wav ohN nw ÜQEUXN :mha ...mëšøa Om : w cza ...l .ln äoäcox m2 x __ O Q ~\O~. _. Nw ._ : : M O_.\ß ._ fiNfl : : : N O-šw m... :OO ~+ MNU QfiN : _. : M O~\N ._ Nm ._ _. _.

H ER _ ._ m2 ._ ._ ._ N oqw T :UG m: www cfiN nw ÉQEUXN Cwum .öfišom Um _. c cis ...i 1:a :obcox eo.. x q G ma. w S ma. w m3 .ötzåfiuøh _ mëønum måwE mcmcvëw 5GB :ÉÉDH uXW>=ZLm Fšh uwmcfivcmcum H woD 1 :UH nn DP| MX :øamh 1.5 449 490 43 Exempel 13 Utvärderingen som beskrivs i Exempel 9 till 12 utsträcktes till ett andra tumörmodellsystem, som var ett transplanterbart 3-metyl-kolantren-inducerat urínblåskarcinom hos FischerÜf-'Bmpstam-råtta. När denna tumör transplanteras i normala Fischer-råttor, växer den på primärstället och metastaserar spontant till lungan. Vidare observeras alltid återkommande cancer efter kirurgiskt avlägsnan- de av den primära tumören.

Den första studien var utformad att bestämma effekten av polymer från Exempel 7-Vl-A på överlevnaden hos tumör-bärande råttor och föreningens förmåga att förhindra bildning av metastaser.

Fiseher-stamråtton ungefär 250 g vardera, implanterades subkutant (trokar) med ett 2 x 2 mm tumörsnitt. Fem, tolv och arton dagar efter tumör- implantationen behandlades tumörbärande råttor med polymer i en dos av 62 mg/kg genom injektion i peritonealhâlan. Totalt behandlades sex djur på sådant sätt. Fyra djur med implanterad tumör lämnades obehandlade och användes som kontroller. Samtliga kontrolldjur dog av sjukdom inom tre veckor eller ett medeltal på l5 dagar efter tumörimplantation. Två av de behandlade djuren dog efter 37 dagar. De fyra kvarvarande djuren avlivades dag 42 efter implantation. Totalundersökning avslöjade att de hade påfallande primär tumör- tillväxt men inte någon metastatisk lungsjukdom.

Exempel 14 En andra undersökning utfördes för att upprepa Exempel 13 och bestämma effekten av en lägre dos och reducerad behandlingsfrekvens. Fischer- stamråttor fick samma typ av tumörimplantat, och åtta dagar efter implantation behandlades tumörbärande råttor med polymer från Exempel 7-Vl-A genom en i.p. injektion (4 råttor i varje grupp) på 65 mg/kg eller 30 mg/kg. 16 dagar efter implantation fick den lägre dosgruppen en booster på 30 mg/kg. överlevnaden observerades under en 6 veckors period. Efter 6 veckor undersöktes de överlevande djuren med avseende på närvaro av metastatisk sjukdom i sina lungor. Fem djur med implanterad tumör var obehandlade som kontroller.

Samtliga kontrolldjur dog av sjukdom och överlevde i medeltal 23 dagar efter tumörimplantation. Gruppen om fyra djur med en enda dos om 65 mg/kg läkemedel var levande i 40 dagar och avlivades. Undersökning avslöjade inga metastaser. Av gruppen som fått en booster på 30 mg/kg efter 16 dagar dog två dag 35 och 36, och de återstående tvâ avlivades dag 1:0. Åter avslöjade undersökning inte något tecken på metastaser. Förlängd överlevnad jämfört med kontrolldjur i båda de behandlade grupperna var givetvis självklar. 449 490. 44 Exemæl l5 Ett tredje studium utformades för att bestämma förmågan hos polymer från Exempel 7-VI-A att förhindra tumörrekurrens hos Fischer-råttor, vars primära tumör avlägsnats kirurgiskt. Fischer-stamråttor fick en trokarimplanta- tion av ett 2 x 2 mm tumör-snitt som i Exempel 13, lll. Tumören fick sedan växa till en storlek på 2-3 cm diameter. Vid detta stadium (8 dagar efter ímplantatíon) avlägsnades tumören kirurgiskt, och samtidigt behandlades råttan med en enda dos polymer på 65 mg/kg eller 30 mg/kg genom en i.p. injektion i två grupper om fyra råttor vardera. överlevnad och tumörrekurrens observerades under en sju veckors period. l gruppen som fick 30 mg/kg polymer vid tumörresektion var fyra levande efter 47 dagar utan något tecken på tumörrekurrens. I gruppensom fick 65 mg/kg som enda dos vid resektionstillfället dog en dag 13 efter tumörrekur- rens, medan de övriga tre var levande dag #7 utan något tecken på tumörrekur- FETIS- Exemæl 16 Ett andra studium av förhindrande av tumörrekurrens utfördes på Fischer-råttor liknande det i Exempel l5, med undantag av att tre polymerer med olika imidhalter användes. Imidnivåerna var 0, 5och 21,796. Vid dettqJ studium utfördes trokarimplantatíon av tumör såsom beskrivs i Exempel 13, lll och 15. Excision av samtliga tumörer utfördes 14 dagar efter implantationen. - En grupp om fyra råttor användes som kontroller och fick ingen behandling vid excisionstillfället. Tumörrekurrensen var 10096 dag 21, 33, 40 och 41+ efter excision med en medelrekurrenstid på 30 dagar. l denna kontrollgrupp avled två råttor dag 144, och två var levande och avlivades vid den tidpunkten.

Alla fyra befanns ha tecken på metastaser.

En andra grupp om fem råttor fick en enda i.p. dos på 30 mg/kg av polymeren från Exempel 2a (noll procent imid) vid tidpunkten för tumörresektion.

I denna grupp återkom tumör hos två råttor dag 33 efter resektion och i en tredje dag 40. Efter 55 dagar hade tre av fem råttor (6096) tumörrekurrens. En tredje grupp om sex råttor fick en enda i.p. dos på 30 mg/kg av polymeren från Exempel 3, Tabell Vl-1, som innehöll 5% imidfunktion, vid tidpunkten för tumörresektion.

Ingen tumörrekurrens observerades hos något djur under 55 dagar. Dag 55 avled två av dessa råttor (utan tumör), och vid undersökning fann man inget tecken på metastaser.

En fjärde grupp om sex råttor fick en enda i.p. dos på 30 mg/kg av polymeren från Exempel 7, Tabell VI-A, som innehöll 21,796 imid, vid .tumör- resektionstillfället. l denna grupp hade ett djur tumörrekurrens dag 21 och ett t! 449 490 us andra dag 43. Alla var levande efter 55 dagar. Således rekurrerade endast två av sex, dvs. ett medeltal på 3396.

Exemæl l7 Djurförsöken som beskrivs i Exempel l3 till l6 utnyttjade polymerer doserade genom injektion i peritonealhålan. Detta Exempel illustrerar använd- barheten av en imidhaltig komposition vid oral administrering vid tumörresek- tionstidpunkten för att förhindra eller fördröja tumörrekurrens. l Exempel 16 noterades att kontrolldjur, som inte fick något läkemedel vid tumörresektionstill- fället, visade en genomsnittlig tidpunkt för tumörrekurrens på 34 dagar. l detta exempel fick en grupp om 10 Fischer-råttor trokarimplantation av tumör som i Exempel 13. De utvecklade tumörerna avlägsnades kirurgiskt dag 13 efter implantationen, och samtidigt intuberades varje råtta oralt med en ml sterilt vatten innehållande E30 mg/kg av den imidhaltiga polymeren från Exempel 7, Tabell Vl-A (2l,796 imid). Tumörrekurrens observerades sedan under en lO veckors period. En rätta dog vid tidpunkten för kirurgiskt avlägsnande av tumör.

Av de återstående nio råttorna observerades små tumörrekurrenser hos sju djur dag 42, 42, 42, 43, 46, 50 och 59 efter tumörexcision. Två råttor var fria från tumörrekurrens efter 70 dagar. _ Exempel 18 Syftet med detta försök var att fastställa om exponering av tumörceller för polymer från Exempel 7-VI-A förändrade deras antigenicitet och/eller hade någon direkt cytotoxisk effekt på tumörcellerna.

Tumörceller preparerades från den BLCa-tumör som beskrivs i Exempel 13 genom att man skar bort en subkutan tumörmassa. Cellerna överfördes sedan i suspension genom att man kardade cellerna ut ur tumören med ytterligare försiktig trypsinisering av tumördelarna. De separerade cellerna tvättades tre gånger i balanserad saltlösning (BSS) och räknades för bestämning av förhållandet levande/döda. En 90-95 96-ig cellpopulation erhölls vid detta tillfälle.

Tumörceller i en koncentration om lx 105 celler per ml, i "Eagles minimal essential media in Earl's BSS", plus 10% fetalt kalvserum inkuberades med ao mg/ml polymer fran Exempel r-vi-A. rnkuberzng utfördes vid 37°c i 90 minuter, varefter cellerna avlägsnades från suspensionen genom centrifugering vid 300 g i sex minuter. Cellerna undersöktes på nytt med avseende på livsduglighet, vilken inte hade förändrats från pre-inkubationsnivån. Förfarandet upprepades vid tre skilda tillfällen.

Celler från detta försök injicerades subkutant i Fischer-hanråttor i en dos på 1x106 celler. Fem djur injicerades med polymerbehandlade celler och jämfördes med fem djur, som fick tumörceller behandlade som ovan men utan .'59- ,_... 449 490 46 tillsatt polymer. Resultaten är sammanfattade i Tabell XII.

Tabell XII Kontroller (I) Dagar för att utveckla Försöksdjur Dagar för att utveckla Råtta nn 2-3 cm tumör 2-3 cm tumör 1 ll 1l 2 ll 11 3 _ 13 13 4 11 11 13 11 (l) l x 106 Tumörceller som inte inkuberats med polymer, inokulerade s.c. (2) 1 x 106 Tumörceller som förinkuberats med polymer från Exempel -VI-A, inokulerade s.c.

Det förelåg ingen skillnad mellan dessa djur i tiden för tumörutveckling.

Vidare var tillväxtmönstret för tumören efter detta jämförbar mellan de båda grupperna. Slutsatsen av dessa försök är att vid den använda dosen, så hade polymer från Exempel 7-Tabell Vl-A (2l,796 imid) inte någon direkt cytotoxisk effekt på BLCa-tumörceller. Dessutom förändrade inte förinkubation av polymer med tumörcellen antigeniciteten hos tumörcellerna.

Exempel 19 Den direkta toxiciteten för imidhaltig polymer från Exempel 7-VI-A bestämdes på normala Fischer-hanrâttor. Både i.p. och i.v. injektion av polymeren bestod av ungefär l ml fysiologisk saltlösning, som innehöll lämplig mängd polymer. För att bestämma toxiciteten gavs polymeren i doser om 100 mg/kg med ökande tillskott om 100 mg/kg upp till 1000 mg/kg till fem djur i varje dosgrupp. Poljmeren administrerades både intraperitonealt och intravenöst.

Ingen toxicitet eller djurdöd observerades med djur vid användning av den intraperitoneala vägen upp till 30 dagars observation på totalt 50 råttor.

Toxicitet observerades emellertid när polymer gavs i doser om 800 mg/kg (i.v. väg) och däröver. Ett av fem djur vid 800 mg/kg, tvâ av fem djur vid 900 mg/kg och fyra av fem djur vid 1000 mg/kg visade sig få konvulsioner vid intravenös administrering av polymer och avled. Ingen toxicitet eller död noterades hos djur, som gavs intravenösa doser om 700 mg/kg eller mindre under den 30 dagar långa 449 490 #7 observationsperioden (35 djur).

Efter observationsperioden på 30 dagar avlivades de 85 överlevande råttorna, och hjärnan, lungan, hjärtat, levern, njuren och mjälten från varje råtta underkastades total och mikroskopisk patologi. Återigen observerades inga abnormiteter i nâgra av organvävnaderna.

Vid ett annat studium jämfördes toxiciteten för den ovan angivna polymeren vid i.p. administrering med toxiciteten vid oral administrering.

Polymeren från Exempel 7-VI-A administrerades i doser om 100 mg/kg, 500 mg/kg och 1000 mg/kg, antingen genom injektion (i.p.) eller genom sond (p.o.) till var och _en av fem Fischer-råttor per dosgrupp. Råttorna observerades i 11+ dagar och inga döda eller någon toxisk manifestation uppträdde. Efter 14 dagar avlivades samtliga djur, både från läkemedelsadministreringen i.p. och p.o., och hjärna, lunga, hjärta, lever, njure och mjälte från varje djur underkastades total och mikroskopisk patologi. inte heller här observerades några abnormiteter i någon av organvävnaderna.

Exempel 20 Polymerer enligt uppfinningen beskrivna i Exempel 3 och 4 utvärderades på normala Lewis-råttor med avseende på deras förmåga att stimulera immunsvaret i form av ökning av l9-S(lgM)-afltikr0pprOÖUCGRHGB Celler mOI heterologa erytrocyter (röda blodkroppar från får, SRBC) genom standardmeto- den med Jerne-plaque. Se: "Textbook of Immunology", J.T. Barrett, C.V. Mosby Company, 1978, och "Immunolflgyfi .N. Eisen, Medical Department, Harper and Row Publishers Inc., 1974. Vid ett typiskt test immuniseras ett djur, i detta fall Lewis-råttor med lml av en 1:5 utspädning av tvättat SRBC i fysiologisk saltlösning via svansvenen. Vid samma tidpunkt ges djuren i.p. injektioner av den angivna polymeren i l ml fysiologisk saltlösning. Efter 4 dagar pläteras mjält- celler från de immuniserade djuren i ett agarosvävnadskultursystem med SRBC.

Vävnadskulturmediet främjar tillväxten och antikroppavsöndringen av de anti- kropp-syntetiserande cellerna. Dessa antikroppar diffunderar från upphovscellen och fäster sig vid angränsande erytrocyter. Serumkomplement (normalt marsvins- serum) tillsätts, vilket främjar iysis av de röda blodkropparna som blivit överdragna med antikropp, varvid en klar yta, eller plaque, bildas kring den antikroppbildande cellen. Sådana plaquer (PFC) räknas och uttrycks som antalet PFC per lx 106 mjältceller. Resultaten är sammanfattade i Tabell Xlll. Alla polymerkompositioner i Tabell XIII testades vid 30 mg/kg. 449 490 48 __: S: Ra äæ Ra QR 3.» »Na Ea åæ 8.~ .ÄN Sa S.. 8: u :Eäox XÜUCMW CT-Ufl-»E Pâ 2 1% 32 2 Sa “så w Ém âfl 8 www äfl w iä 32 2 .å 82 m. ...E S2 S QS 82 9 ä: ä: m. 3 mi: w “w 32 2 c än 2 -l .švuflmfie Bzæäs »Eæâzßw m2 x fl 296 -uweflumëfi BÉ :så :Så m. än så HEUUOunw m|>~|n w|>Tn ~|>Tn wnå-n æ|>~um nušun *_ 721m mN Éobcoxv :umš LC ïmEuxm :WG åwxösrom EX :mnmh 449 490 #9 Exempgl 20-A I ytterligare en omgång försök bestämdes effekterna av polymer från Exempel 7-Tabell VI-A på igM-antikroppssvar på SRBC-antigen (åter med användning av Jerne-plaque-analysmetoden som i Exempel 20) (1) på normala Lewis-råttor med polymer, som gavs antingen i.p. eller oralt, och (2) på Lewis- råttor som ersättning för tymusfunktion, även här med polymer som gavs antingen i.p. eller oralt. I fall (1) följde förfarandet det i Exempel 20. I fall (2) avlägsnades normal tymusfunktion genom vuxen tymektomi (Tx), som utfördes kirurgiskt vid en ålder av 8 till 12 veckor och höga doser av helkroppsbestrålning (TEI) följt av benmärgscellrepopulation (BM). Tymektomi, helkroppsbestrålning och benmärgscellrepopulation utfördes samtliga genom standardförfaranden beskrivna av Falk, R.E. et al, Surgery, oktober (1978), av Falk, R.E. et al, Abstract, Canadian Society for Clinical Investigation, Jan. 24-27, 1978, Vancouver och av Falk, R.E. et al, Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, Jan, 25-28, 1978, Vancouver.

Vid dessa förfaranden utfördes helkroppsbestrålning och benmärgscell- repopulation dagen efter kirurgisk tymektomi. För helkroppsbestrålningen bestrå- 13 7cesium-käl1a (Atomic Energy of Canada).

Stråldosen i denna apparat är kalibrerad av leverantören och anbringas på likformigt sätt över hela kroppsytan hos djur placerade i behållaren. För BM- repopulation bereddes enkelcellsuspensioner av benmärgsceller genom tvättning lades djuren med användning av en av de långa benen i femur och tibia hos råttan med en balanserad saltlösning (B55) vid 4°C. Cellerna tvättades tre gånger i BSS och räknades i en hemocytometer för att bestämma livsduglighet och lämplig cellutspädning.

Cellerna administrerades intravenöst med användning av beredningar med större. än 9096 livsduglighet. För varje råtta innebar BM-repopulation 1 x 108 celler.

Djurens mortalitetsgrad för hela Tx + TBI + BM-proceduren var mindre än 1096. Dessa djur fick sedan återhämta sig under en period på 6 veckor före körning av IgM-antlkroppssvaret på SRBC. .

Efter återhämtningsperioden administrerades polymeren från Exempel 7-Tabell VI-A och SRBC som i Exempel 20. Resultaten för totalförsöket visas i Tabell XIII-A. :n 449 490 50 ff. .whwëcun vfloafiwwcoxum u En .wšcäbhunwaaohxïc vad n M Aëfixucšh u å.

RX .wåwë 2 _58 åmfv 2353.. vucmcšq x Éfifipfl n I 26 ïš .Eåxâ 3 sa .šâ ä. 2 sæfi Éßzxæw q n I 3.8 ...ewß ...åxå 2 sa šâ ä. N _ så. _ uUZO-.HCOM Xx I wfi -- 2 .å Ja? .å .ams <-_> :Bfi å; »www 3.338 2 Esöz A Ésafi <4> äed. ä; 33 .Éæam 3 _2502 -N Éeøä .ö=o..«cox www.. ~$2 .l o.. àcmcono m-.NEÉZ cwwå oo: u :obcox .mšøuåw-ë ww> hä. wczucmsunhswn huëšom xøvcmwwcfihwflsëfim woflxiümm wåmE Éuhr. x/x 23 mOQ .zšflmvøë .öfiflïflšma mo: hm>mamohxflcmuëm~ <|=~X Zønmh 449 490 51 Exempel 21 Nio polymerer med varierande imidhalt (0 till 3596) och identiska med många av de som beskrivs i Exempel 20, Tabell XIII, utvärderades på Fischer- råttor med avseende på deras jämförbara uppträdande som funktion av imidprocent vid förhíndrande av rekurrens av primär BLCa-tumör efter tumör- resektion. Försöksförfarandet följer det som beskrivits i Exempel 15, 16 och 17, med undantag av att man i detta fall använde 10 råttor för samtliga dosgrupper och kontroller och att de olika imidkompositionerna doserades både med mg/kg och 15 mg/kg genom i.p. injektion i 1 ml saltlösning. Kontrollema fick enbart l ml saltlösning i.p. En grupp om 10 djur fick 30 mg/kg oralt av polymer från Exempel 7-Vl-A (2l,796 imid) såsom angivits. Alla tumörer avlägsnades kirurgiskt 'elva dagar efter trokarimplantation, och läkemedelssubstanserna administrerades i enkeldoser såsom ovan dag l efter tumörexcisionen. Resulta- ten är sammanfattade i Tabell XIV. Av intresse är att det genomsnittliga antalet dagar för tumörrekurrens för de 10 kontrollerna var 32,3 som väl tål att jämföras med kontrollmedelvärdet på 31+ dagar(l+ råttor) i Exempel 16. 449 490 52 .non .öm .oofimo oo Eo .ownEPow n=< AE movcm n=m .Jonna cøåw w .E oonoëwxm 8 o n n. n n n o o o o no __ n n n n n n o o o on Eon . n.>o-n .oo n o o. n n n o o o o no o o n n n n n o o o on nan .n.>o.n .n o o o n n n o o o o no n o o o o o o o o o on osn i .n n n n o o o o o o o no o o o o o o o o o o on osn o.>o-n .n o o n o o o o o o o on n.on <-o>.n .mo n n n n n n o o o o no o o o o o o o o o o on n.oo o.>o.n .n n n n n n n o o o o no n o o o o o o o o o on n.o oo .o n n n n n n n n o o no n n o o o o o o o o on n.n o->o-n .n n o o n n n n n o o no n o o n n n n n o o on o nn .n 1 -- i I oo n n n o o i- I- ooâooovo .o oo n n n o n o n n oux nån... ooš oäeono ...z .coonxwoooomåsn .ovän xnoD ucvuoom moomx .ooxuwof X .ovuwv mcm-Esxuuuwßozu UUE .op-U ~mwc< launtz-Om >HX :onmh 449 490 53 Exemæl 22 Den l0096-iga imiden av EMA (sp. visk. = 0,66) från Exempel S-A studerades med avseende på tumörtillväxtinhibering vid ett oberoende testlabo- ratorium med användning av följande förfarande.

Fast Sarcoma 180 implanterades med trokar (2 mm diameter) i sidan pâ schweiziska hanmöss. Polymeren från Exempel S-A administrerades genom i.p. injektion i den angivna dosen i 0,5 ml saltlösning sex på varandra följande dagar med början dag l efter tumörimplantationen. Grupper om 5 möss fick 25, 50 och 100 mg/kg dos såsom beskrivits. Högre doser, 200, #00 och 800 mg/kg, visade sig vara toxiska såsom indikeras. Dagen efter den sista i.p. läkemedelsinjektionen avlivades djuren, och tumören avlägsnades genom dissektion och' vägdes.

Tumörinhiberingen beräknades som procent för behandlade djurs tumörvikter dividerat med kontrolldjurens tumörvikter. Resultaten visas i Tabell XV, som anger att ingen aktivitet uppvisades av EMA-hel(l0096)imiden. -v 449 490 54 .uuäumxon fišm >m vc-Ew nu vmcxmnun .nm GV . .cocøflxuøhwmwuuëøxmn mwnfi.. :av .öfiø cwwmv wuum>=>m :ønP-n .cøcoflmncflaënnæE-ä »väv wcmcnwšmw -E nå n :É .äwmv uvcmnww mnvnwng wa w :uåw nom .uå 23.95 Eocom owTm .nnæëcmc mxmfinmøšcum GV I t _ I Én . n n . äšce.

I .Rån 53% ä nä... n n Sn I ïnnn n.nn Én n n :oëöx 302 .nån 55% ä æš n n 03 I nån n.nn ...nn n n :oëax Éoz .nån :Ein ä .än n n Sn I nån n.nn ...nn n n :EEE 2- nån .En nan n n . 2: I finnn n.nn Én n n :oëan nn+ nsnn .än nan n n on i .flnnn n.nn Én n n =8E8_ n- _35: Én Én n n nn w.. wE w m 5G ïfiw wåwE hg-Ouucøviumuu ÖES» UMGUÉUXO wxçvšmu uvmšüwwfi mmæÉ mmwå :v mo? lmmcfiuvnmccfi .nmw øšåvbøå nøfløccxwwü nflmvwrcvxwd >X :ónmh 449 490 ss Exempel 23 En föredragen polymer enligt uppfinningen utvärderades på normala Lewis-hanråttor med avseende på möjlig aktivitet vid ökning av antalet peritoneala makrofager och deras verkan att fagocytera polystyrenlatexpartiklar, vilket har demonstrerats för ett antal immunsystemmodulatorer, som Bacillus Calmette-Guerin (BCG), pyransampolymer, och andra sådana medel.

Fyra grupper om sex unga vuxna (2-4 månader gamla) normala Lewis- hanråttor administrerades läkemedel eller saltlösning (kontroller) enligt följande.

Grupp-l fick l ml saltlösning given i.p., grupp-Z fick polymeren från Exempel 7- Tabell VI-A vid 30 mg/kg i 1 ml saltlösning given i.p., grupp-B fick polymeren från Exempel 7-Tabell Vl-A vid 30 mg/kg i lml saltlösning given oràlt, och grupp-ll fick O,l mg BCG i 1 ml saltlösning given i.p.

Dag l, 3 och 5 efter den ovannämnda administreringen avlivades två i var och en av de fyra ovannämnda grupperna, och peritonealhålcellerna insamlades. lnsamligen inbegrep följande procedur. l00 ml kylt RPMI l6li0- medium injicerades i.p., och efter försiktig massage avtappades hela peritoneal- vätskan och cellerna från varje enskild peritonealhâla separerades genom rotation vid 1000 varv per minut. Dessa celler fläckades med NSE (non-specifikt esteras)-färg och tvättades tre gånger med kylt (4°C) medium. Slutligen suspenderades cellerna från varje enskild håla i 10 ml medium och räknades, så att man fick det genomsnittliga antalet celler bestående av 80-9596 makrofager erhållna från varje peritonealhåla som funktion av den ovan angivna behandlings- grupptypen och tiden (dagar) efter behandling.

Latexpartikelfagocytosaktiviteten hos varje omgång peritonealhålecel- ler bestämdes på följande sätt: en suspension av de ovannämnda cellerna bereddes i en koncentration av 140-50 miljoner celler per ml 50 96-igt fetalt kalvserum plus RPMl-medium i ett 5 ml provrör. Till suspensionen sattes 100 lamda polystyrenlatex (1096 fast substans, partikeldiameter = en mikrometer, Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana, USA), och blandningen inkuberades i en timme vid 37°C. Cellerna centrifugerades sedan ned, tvättades tre gånger med RPMl-medium och omsuspenderades slutligen i 0,5 ml saltlösning. Slides av cell- suspensionerna iordningställdes och undersöktes mikroskopiskt för att bestämma 'omfattningen av latexpartikelfagocytos in i makrofagcellen. De celler, som innehöll 10 eller fler latexpartiklar ansågs positiva, och det totala antalet av sådana celler (sådana som innehöll 10 eller fler latexpartiklar) uttrycktes som procent av totala antalet celler i suspensionen.

Värdena från dessa försök visas i Tabell XVI för dublettförsök. 449 490 ss Värdena i Tabell XVI visar slutgiltigt att den föredragna polymeren enligt uppfinningen inte ökar peritonealmakrofag jämfört med kontrollvärdena vid administreringen antingen i.p. eller oralt, och vidare att latexfagocytosakti- viteten hos sådan peritonealmakrofag inte ökas jämfört med normal makrofag- aktivitet. Däremot ökar andra immunsystemmodulatorer, såsom visas genom värden på BCG, i hög grad antalet peritonealmakrofager, och sådana makrofager har 'i hög grad ökad latexfagocytosaktivítet. Denna höga aktivitet minskar till normala värden efter tre dagar och däröver. I motsats till de ovan angivna resultaten, som visar att polymererna enligt föreliggande uppfinning inte aktiverar makrofagfunktionen, så visar resultaten i Exempel 20 och 20a att dessa polymerer icke desto mindre verkar som B-cell-modulatorer på normala djur och stimulerar B-cellantikroppsvaret, när de ges antingen i.p. eller oralt. Vidare noteras denna effekt även i frånvaro av tymusfunktion, vilket indikerar att polymererna enligt uppfinningen verkar som tymusfunktionersättning vid aktive- ring av B-celler för ökad antikroppsproduktion. 449 490 57 Nm HN 3 I n.. om 2 om www om 2 oN nN on ~N mN wmvšwmaxowfl 2 .zšm uøE .ašuu 8 mâcmwwmmnxøfiwq 2 2 w w w ___ d.. .we 3. .uuw w w w w 8 w ._ :Bo .wšws ww .<._>A ä w w w w 2 w x .É .wåws ww .<._>A ä _. I w W N W AMCWEmQ-Ämw qe of: ZOuwCOM M wN R R wN R R .nä .wE .a .won w ä w w .à ß x :So .wšws ww éšé wm 2 R w 2 ä w u å. .wvšs ww .<-.>..\. ä w ä w_ w 3 2 .wsâwšww _E ...c :S201 w Awoñc wm_v=f.maxo«m_ 2 Awoüe wcåwcmcøm ïvwëøwafi .wøëm .ES vøE ...wzuu 8 .llflflnmlwfiflww wcÉ>=>m .än man MUZÜU -dw C< MSM Cwflflmfl SXOwGA .öm ww=mu _2.c< N xænumm - xwmkoà nN .waåoxm M wåšwon Eowmw wcåwcmzon E> wutåwxm- :uo Éwmmwowxmëzwøcoflflwom ~>X :mama 449 490 58 S .mchofiflåohflcox :nå 25min .ö=oo owcmšš ...oh :m ubñum Ém>cEwc ..m> Eow mof^uowmwx3m_ :owwc mwwmhäoc :mw ÉwE wzuo .øïšš .xm :mä .öEšom voE flflvcmnun Eow ...f-w mzm wo: whwEcwn :oo .ädscvfiëš .ÉEÖ EufimmE :mh wuuflucmbxo .äšøumæfiæuowcšq x nu m wm w 8 N å n »E .ms å .cum _ ~ ~ R m ~ 2 q 2 N ._ :ms æäwe R .<._>¿ ä 2 n Nm w 2 ß 2 n x d.. .wåws 3 _<._>A ä m q MN N w- _. wN n AmcÉmæä-mw 1.: oåv :obcoz n .=N_š...._mmxu«m_ 2 Amoïo hmvmfimmxvflm. 3 Awoñc wczncmzøm _øuoëwxw_ hä? .Ešm uuE .önou 8 .ösm uwE ho=wu _* wcmc>=>m .ñw wmO wCwF-MNHNNDXUHNJ wCwflwflu-.Nflflxflvflnu ha :UU ~NWC< ._0200 fimuâ N xmwumm fl xmflwm mw EmEvxm M wåbfiun.. Eoäm wcšucmzun E., 3228.? zoo _m«wm«oä_m_.:_mu=ot.öm Éïoë _>X :Bg 449 490 59 Olika andra exempel som illustrerar uppfinningen ytterligare kan utföras genom att man ersätter de specifika material som uppräknats i de föregående exemplen med andra väsentligen ekvivalenta material.

Således kan propen insättas istället för en ekvivalent mängd eten i de föregående exemplen som belysande för de definierade olefinmonomererna med i huvudsak liknande resultat.

På samma sätt kan även citrakonsyraanhydrid insättas istället för en ekvivalent mängd maleinsyraanhydrid i de föregående exemplen som belysande för de definierade polykarboxylsyraanhydriderna med i huvudsak liknande resultat.

Polymerer med ännu lägre molekylvikt kan framställas genom. lösnings- medel/icke-lösningsmedel-fraktíonering av den EMA-polymer som framställts i Exempel l ovan. Denna polymer med lägre molekylvikt kan sedan insättas istället för en ekvivalent mängd av polymeren i Exempel l i de föregående exemplen med i huvudsak liknande resultat.

Andra farmaceutiskt godtagbara salter av imider enligt uppfinningen kan framställas genom omvandling av ammoniumsaltderivaten till salter som t.ex. natrium- och kaliumsalter. Exempelvis kan ammoniumsaltderivatet i Exempel 3, Tabell IV, körning 4, ovan, omvandlas till halvamid-, halvfrikarboxyl- derivatet genom passage av en 5 96-ig vattenlösning av ammoniumsaltet genom en svagt basisk katjonbytarkolonn, t.ex. "Amberlite IRC-Siv' (tvärbunden akryl- sampolymer, Rohm and Haas Company). Den erhållna lösningen i fri karboxyl- form kan sedan neutraliseras med antingen NaOH resp. KOH, och den neutraliserade lösningen frystorkas, så att man får motsvarande natrium- och kaliumsaltderivat. _ Den ovannämnda EMA-polymeren i Exempel l med låg molekylvikt kan även omvandlas till halv-monometyl-sekundär- amid-, halvmonometylaminkar- boxylatsaltet med förfarandet i Exempel 2(a) genom att man låter lösningen av EMA och aceton reagera med lösning av metylamin i aceton istället för ammoniak i aceton. Produkten kan sedan återloppskokas i xylen, så att man får ett partiellt N-metylsubstituerat imidderivat, som har såväl en imidfunktion som närvaro av sekundär metylamid-, joniserad C00' och aminkarboxylatfunktioner.

Detaljerade belysande förfaranden för att utföra de föregående ytterli- gare exemplen med åtföljande resultat följer nedan: Exemæl 24 En sampolymer med låg molekylvikt av propen och maleinsyraanhydrid framställdes på liknande sätt som beskrivs i Exempel l. Reaktorn satsades med l9ö g .maleinsyraanhydrid löst i 1600 ml etylbensen innehållande 7,30 g líensoyl- 449 490 60 peroxid. Temperaturen bringades till 80°C, och trycket justerades till 280 kPa (40 psi) genom tillsats av #2 g propen från en propencylinder monterad på en våg.

Därefter hölls propentrycket vid 280 kPa under en period på 19 timmar vid 80°C reaktionstemperatur. Vid slutet av körningen kyldes bomben och luftades, och uppslamningen av propen/maleinsyraanhydrid-sampolymer i etylbensen upparbe- tades såsom beskrivs i Exempel l genom tre xylenuppslamningsextraktioner följt av tre hexanuppslamningsextraktioner, filtrering och torkning med fullt olje- pumpvakuum vid GOOC. Slutprodukten bestod av 269 g, 87,396 utbyte, och en 1,0 æ-ig lösning i DMF vid 2s°c hade en specifik viskositet pa o,o59o.

Den ovan framställda lågviskositets-propen/maleinsyraanhydridsampo- lymer (PMAl-produkten omvandlades till halvprimäramid-halvammoniumkar- boxylatsaltet genom exakt det förfarande som beskrivs (för EMA) i Exempel 2a.

Av 26,0 g PMA fick man 36,3 g, 115,5 96 utbyte, ugnstorkad (350 C, 20-25 mm Hg vakuum) produkt. Den funktionella sammansättningen genom IR av produkten angav endast närvaro av primär amid-, joniserad karboxyl- och ammoniumkar- boxylatgrupper. Ingen imidfunktion var närvarande.

Det halvamid-halvammoniumkarboxylatsalt som framställts av PMA med specifik viskositet 0,059 omvandlades till en komposition innehållande partiell imid genom det förfarande som beskrivs i Exempel 3. Ett prov på 20 g av amid-ammoniumsaltet uppslammades i 400 ml xylen, och uppslamningen åter- loppskokades som i Exempel 3. Den âterloppskokades i 33 minuter med sluttemperatur vid l39°C, varvid l,l ml vatten uppsamlades, och produkten upparbetades såsom beskrivits, varvid man erhöll 15,3 g, 79,6 96 utbyte, av slutprodukten. IR-analys av produkten visade, att 33-minuters provet innehöll 19,096 imid, förutom amid- och ammoniumkarboxylatfunktioner. imid-procenten bestämdes i detta fall genom hänvisning till standardkurvan för imidlamid- absorbansförhâllande-sammansättning för EMA såsom beskrivs i Exempel 5. pH- värdet för en 2 96-ig vattenlösning var 5,43 före justering och lyofilisering. Efter justering till pH 9,5, filtrering och lyofilisering var pH-värdet 5,50, procenten kväve var 10,26 och imidhalten var l9,0 vikt-96, bestämt genom IR.

Det ovannämnda imidhaltiga PMA-derivatet utvärderades pâ Fischer- hanråttor med användning av BLCa-tumör med avseende pâ antimetastasegen- skaper och tumör-non-rekurrens efter resektion såsom beskrivits i Exempel 13 och 15. Det var 10 djur i kontrollgruppen, som inte fick något läkemedel efter tumörexcision (10 dagar efter implantation) och 10 djur som fick en enda dos i.p. om 30 mg/kg vid tidpunkten för tumörexcisionen. Resultaten är sammanställda i den följande tabellen: 354 449 490 61 c ._0193 3 E> UUCG>UTHU>O Auumhuäsxwhv m2 AUÜNmOu-:JXUÖ .w www v? 53332: >ø mcmcfimwëO E... .comfluxøhmEau bmw :wwnv .m3 .movqwxcu .wåmE om .Ewan wm .Iuwøå .mwå 2-3 Aowmhøhhsxwra Qm .äwmv mn .åwvuå .mwmv Så fioumhutsxuhv 2 ä: www >w wcusfißEo .äwmu Nån .Zmuøå .mmå wfiâ °_\m .mwå än .zæös .mmå 8-2 °~\°~ wcwtaxw.. >m mcwnfifiEO .än ÉÉm u: X 2 x nä.

Ow .~0=.O.3COV~ cl 449 490 62 Exempel 25 En sampolymer med låg molekylvikt av eten och citrakonsyraanhydrid framställdes på liknande sätt som beskrivs i Exempel 1. I detta fall bestod reaktormaterialsatsen av 228,0 g citrakonsyraanhydrid istället för maleinsyra- anhydrid, 1874 ml etylbensen och l5,6g bensoylperoxid 1 161 ml etylbensen.

Etentrycket hölls vid 1380 kPa, och reaktionen utfördes vid 70°C under totalt 271/2 timme. Ytterligare katalysatortillsatser gjordes efter tre timmar och efter 201/2 timme, som vardera bestod av 10,4g bensoylperoxid i 108 ml etylbensen. Eten/citrakonsyraanhydrid-sampolymerprodukten bestod, efter upp- arbetning s_om i Exempel 1, av 73,5 g, 23,496 utbyte. Den specifika viskositeten 0,096 1 DMF, 2s°c) av sampoiymeren var 0,042.

Làgviskositets eten/citrakonsyraanhydrid-sampolymeren om 29,5 g, 0,21 mo! omvandlades till halvamid-halvammoníumkarboxylatsaltet genom det i Exempel 2a beskrivna förfarandet, varvid 37,0 g, lO3,096 utbyte, vakuumtorkad produkt utvanns. IR-analys indikerade närvaro av amid-, joniserad karboxyl- och ammoniumkarboxylatfunktioner men inte någon imidfunktion. En partiell imid av amid-ammoniumkarboxylatderivatet framställdes med användning av förfarandet i Exempel 3 genom âterloppskokning av en xylen (400 ml)-uppslamning av 20 g av det .ovannämnda amidsaltet i 30 minuter. Produktutbytet var 15,7 g, 83,696 utbyte, och l/A-absorbans (Im-förhållandet var 1,21, vilket motsvarar 31,096 imid vid jämförelse med standardkurvan för EMA som beskrivs i Exempel 5.

Kvävehalten var 9,24%, och en 596-ig lösning i vatten hade ett pH-värde på 5,31.

Den ovannämnda imidhaltiga produkten av ammonierad eten/citrakon- syraanhydrid-sampolymer utvärderades på Fischer-hanráttor med användning av BLCa-tumör med avseende på överlevnad, non-rekurrens och antimetastas- egenskaper efter tumörresektion såsom beskrivs i Exempel 13 och 15. Resultaten är sammanställda i den följande tabellen: 449 490 63 c ..oxow> 2 w? wwcm>ø~ho>ß ïwmähhaxub io fimwmhwhsxub 2 Éfl wæwÉ> wowmfimuøë >m wcmcwfimficnv æwå HE .2252 æwå fiå fiflvmuuuuflxvb .aïq .äwmw mn .Zmwoä äweu 3-2 Aowmhmfizxub 2 ä! www >m mcÉZmNEO ...àw Éwcf. n c .cofiwmuxmumE-ä w? www :m xx .flOfiuflvflflfißsmum-.CDH »Uwwü Hmwflfi Ofl COMÄUXUÖEDF .cowfluxuwmëš .mm :uwmw .AE .mowïxcv .wåmE om x .äwww om .šwwwå såå âå mš ...æmw än :_2002 .mwmw 3-2 012 wcuwwzxwh >m wcwcflnwuëO “så 2 .mšobcox CI 449 490 64 Exempel 26 Detta exempel beskriver framställning av en EMA-komposition med mycket låg moiekylvikt erhållen genom lösningsmedel/icke-1ösningsmedelfraktio- nering av EMA-polymerer beskrivna i Exempel 1. Av åtta separata EMA- beredningar uppsamlades 1284 g EMA efter torkning över natten vid 80°C vid fullt oljepumpvakuum. Dessa åtta EMA-produkter varierade i specifik viskositet (196, DMF, 25°c) från 0,051 fm0,05s(medeiia10,os3),°ch deras ekvivaientvik- ter varierade från 134 till 142 före lösningsmedelfraktionering. Var och en av de åtta körningarna (160 g) löstes i 500 ml aceton och utfälldes i 2,5 liter toluen under en tiominuters period i en 4 liters bägare under kraftig omrörning med en "Lightningfi-omrörare. Utfällt EMA filtrerades (varvid man sparade 'alla åtta ursprungliga moderlutfiltrat för upparbetning av löslig polymer nedan), och de fasta substanserna uppslammades en gäng i 2 liter toluen och tvâ gånger i 2 liter hexan, filtrerades och torkades över natten vid 50°C vid fullt oljepumpvakuum.

Ur de åtta enskilda körningarna fick man totalt 1143 g av det lösningsmedelsolös- liga EMA, som hade en genomsnittlig specifik viskositet på 0,057 (de åtta lösningsmedelsutfällda enskilda körningarna varierade från 0,053-0,060 i specifik viskositet).

Den aceton/toluenlösliga polymerfraktionen i de sammanslagna ur- sprungliga moderlutsfiltraten ovan koncentrerades till en tjock olja genom avdunstning av alla lösningsmedel i en "Rotavap" på ett kokande vattenbad vid -30 mm Hg vakuum. Återstoden löstes i 200 ml aceton och fälldes i 1 liter toluen vid rumstemperatur, vilket gav en oljig mosig fast substans. Överstoden dekanterades, och fällningen återupplöstes i 200 ml aceton och omfälldes i 1,2 liter xylen vid 0°C till enifast vit fällning. Denna produkt filtrerades, tvättades tvâ gånger med 400 ml xylen och två gånger med 300 ml hexan och torkades över natten vid 50°C vid fullt oljepumpvakuum. Man fick 59 g produkt, som hade en specifik viskositet (196, DMF, 25°C) på 0,031, en beräknad talmedelmolekylvikt på 342 och en ekvivalentvikt genom titrering pà 172,0.

Kolprocenten var 60,92, 60,61 och väteprocenten var 6,03, 6,12. g av den ovannämnda EMA-fraktionen med specifik viskositet 0,031 och ekvivalentvikt 172 omvandlades till halvamid-halvkarboxylammoniumsaltet genom förfarandet i Exempel 2a, varvid man fick 5,4 g ugnstorkad (50°C, pumpvakuum) produkt. Fem gram av detta halvamid-halvkarboxylammoniumsalt omvandlades till partiell imid genom förfarandet i Exempel 3 genom återlopps- kokning i xylen i 1 timme. Den torra slutprodukten (50°C, pumpvakuum) bestod av 3,8 gram. Denna löstes i 70 g vatten (pH 4,87) och justerades till ett pH-värde på 9,4 med NHQLOH, titrerades genom ett filter på 0,2 mikrometer och frystorkades. Den slutliga lyofiliserade produkten hade ett pH i 2,0 96-ig 449 490 65 vattenlösning på 5,1, en total kvävehalt på 12,27 och en imidhalt på 25,0 viktprocent.

Produkten utvärderades på Fischer BIM-råttor med användning av FBCa- tumör med avseende på överlevnad, non-rekurrens och antimetastas efter tumörresektíon som beskrivs i Exempel 13 och 15. 449 490 66 o ._oxuw> NN v? uušïmqhøfi Aovmpuuhsxuhv wš Auvmhøuhsxo.. o fl \o~ www E» .öwmuwmvøE >m mâšfificö n» .cofimuxwšêsw .öm :ømmn .Af .moflwxcu wåwE om xx .cofim«:m_nE~._æE:« .öäu I www :ofiuxohæësh x äwë En .zæöz .mwë STS Avvwuøkuaxogv wÉ .ömmw .ämm .šuvuë .mwä 3-2 Auumhufizxvb sig En >m mcwätåEO .män nä _2252 .æäw 8-3. °~\w .æwå ÄN .2252 .män REN 013 wCU-:Dxwu 2.... mšcflfiüëO 3 3 :I xx .x »wok K uUZOuNCOX 449 490 67 Produkten utvärderades även med avseende på dess förmåga att stimulera immunsvar i form av ökning av lgM-antikroppsproducerande celler vid stimule- ring med röda blodkroppar från får (antigen) såsom beskrivs i Exempel 20 med följande resultat: IgM-PFC/ Antal råttor ”m6 ...w Index LEQPEL celler m” L<°_HE°_H:I_Q Kontroller 2 634 1,00 Test* 4 1173 1,25 '° 30 mg/kg, i.p.

Exempel 27 Framställningen och användbarheten av natrium- och kaliumsalter av imider enligt uppfinningen demonstrerades på följande sätt. Ammoniumsalt- derivatet framställdes med metoderna som beskrivs i Exempel l, 2a och 3-IV-5 och hade följande analysresultat för den frystorkade produkten: Total-96 kväve - 10,15, 13,99 96 kväve 1 NHQ* - 6,16, 6,09 pH - 296-ig vattenlösning - 6,28 Vikt-96 imid genom IR - 20,5 - Mekv. NHJ/g med NH 3- elektrod - 4,31 Motsvarande natrium- och kaliumsalter av den ovan angivna imiden enligt uppfinningen framställdes med sedvanliga jonbytartekniker med använd- ning av "lRC-IZO" (Rohm och Haas) i antingen natrium- eller kaliumform. Dessa kolonner framställdes genom laddning av 400 ml "iRC-i20" (Híh-form) i en lämplig kolonn och generering av Naïhartset genom behandling med 3,8 liter 1,0 molar NaCl (eller 1,0 molar KCl vid kalium) följt av i: liter vatten. Lösningar av det ovannämnda NHJ-saltet av den imidhaltiga polymeren framställdes med användning av 5,0 g polymer löst i 200 ml vatten. Dessa lösningar justerades sedan till ett pH-värde av 8,0 med utspädd NaOH (eller KOH vid kalium). Dessa pH-justerade lösningar fick passera genom Na- resp. K-kolonner vid en flödeshastighet på 15 ml/min. följt av vatten, tills 500 ml effiuent uppsamlats i vardera fallet. Dessa effluenter justerades till 6,8 - 7,0 med HC! och frystorkades. De slutliga frystorkade salterna hade följande egenskaper: 449 490 Saltform: NHJ Utbyte, g: -- Total kväve-96 14,07 mekv. NHf/g 4,31 NHJ omvandla: nu salt, 96 -- Klor, 96 --- Na eller K, 96 -- 68 Na* ,47 7,77 o,o3a 99,3 ,45 K+ ,30 7,00 0,036 99,3 1,22 17,08 “ från 5,00 g Nflaïsaif, innehåller Nacl eller Kci från pia-justering mefmcl.

De olika ovan angivna salterna :fick undergâ två biologiska utvärderingar såsom beskrivs nedan: (a) NHlf-modersaltet utvärderades på Fischer BIM-råttor med användning av FBCa-tumör med avseende på överlevnad, non-rekurrens och anti-metastas efter tumörresektion såsom beskrivs i Exempel 13 och 15 med följande resultat: 449 490 69 o ._ov_uø> 2 u? wucguïøñ Aovmxwhhaxue m2 AUUNuUQuDXUÖ O~\O._ www D? .ömmvmmuwE >m wcficfimwEO ...än -mucm n c :Bfluxoöëaw ...ww :wwmw .AE .movüxco .wåwE om xx äwë of .2252 :šå 3.3 éwumhuuhsxohv Qm .mmww 3: .zæäz .mwå 27% .wvmhïhsxøhv o ~ ä: BU ä wcšflflwëø Læwmv n? .zæäz .män “man °_\~ äwmu QS .zëwz away 3-3 °x\@_ mcuhäxuh >m mcÉfimwëO .cofimflcflmëmhæëš .öüv ß www comfluxvxwEah o~ 3 :I R xx .x 32.

R LUZOuHP-OV- 449 490 70 (b) De ovan angivna salterna utvärderades med avseende på sin förmåga att stimulera immunsvar i form av ökning av IgM-antikroppsproducerande celler mot heterologa erytrocyter (röda fârblodkroppar, SRBC) såsom beskrivs i Exempel 20 med följande resultat: Polymerkälla -salttyp- Kontroll Ammoníummflf) Kontroll - Natrium ( Na* ) x xanumuöf* Kontroll Natrium (Na Kalium (K*)* Natrium (Na+) g: Kalium (KÜW +)X Kontroll Natrium (Na Kalium (K+)* Natrium(Na+)u Kalium (K*)** +)X mg/kg, givet i.p. x* 30 mg/kg, givet oralt Antal råttor i gruppen J? J? axmuiuiax wmwmw 1gM-PFC/ lxl06 Index mjältceller kontroll = 1,0 500 1,00 1052 2,10 534 1,00 970 1,82 1098 2,06 538 1,00 1373 2,55 996 1,85 1523 2,83 1058 1,97 #l 1,00 1254 2,32 104# 1,93 1607 2,97 1003 1,85 449 490 71 Exemæl 28 EMA med låg molekylvikt från Exempel IE (specifik viskositet = 0,063) omvandlades till halvmonometyl-sekundär-amid-halvmonometylaminkarboxylat- salt genom följande förfarande. En lösning av 43,9 g (0,3l2 mol) EMA i 440 ml acetonreagens kyldes till -78°C i torris/aceton. Till denna lösning sattes 7l ml (54 g, l,74 mol) kondenserad metylamid och 100 ml ytterligare aceton för att medge effektiv omrörning av det utfällda produktslammet. Sedan uppslamningen av metylamidaminsalt hade uppvärmts till rumstemperatur (2 timmar) omrördes den över natten, filtrerades och tvättades fri från överskott av amin med tre uppslamningar av aceton (500 ml vardera) och torkades över natten vid 20- mm Hg' vakuum vid 3s°c, varvid man fick 78,3 g, 123996 uibvce, av halvmetyl-sekundär-amid-halvmetylaminsaltet av EMA. Detta metylamidamin- salt (20,0 g) uppslammades i 400 ml xylen och återloppskokades under omrörning i minuter under vatteneliminering och med en ström av metylamin strilande genom uppslamningen, varigenom 0,75 ml vatten avlägsnades. Den olösliga produkten filtrerades, uppslammades en gång med 400 ml xylen följt av tre gånger med 400 ml hexan, filtrerades och torkades vid 40°C vid 20-25 mm Hg vakuum, varvid man fick 16,4 g, 85,296 utbyte, av det partiellt N-metylsubstitue- radeimidderivatet. lR-analys av produkten indikerade imidfunktion vid 1700 cm"l liksom närvaro av sekundär metylamid vid 1645 cm-l, joniserad C00' och aminkarboxylatfunktioner. lmfdnivân bestämdes till 17,096 vid avläsning från I/A- absorbansstandardkurva för osubstituerade imid-primäramid-kompositioner såsom beskrivs i Exempel 5. Kvävehalten var ll,4l%, och en 2 96-ig vattenlösning hade ett pl-l-värde på 8,70.

Den ovannämnda N-metylimidhaltiga produkten utvärderades på Fischer 344-hanrâttor med användning av FBCa-tumör med avseende på överlev- nad, non-rekurrens och antimetastasegenskaper efter tumörexcision såsom beskrivs i Exempel 13 och 15 med följande resultat: 449 490 72 o LOXUU> Wfi U~> UUCN>U~LO>Û Amwmhuhhaxohv m3 awfiflufluuflxfluv O~\O~. uæu E> .öwmwwmfiwE >..m_ mECÉmNEO ...Ev 135m u c .:oSm«cm_QET_æEE. .öfio .öwmu 3 comfluxøkæEsh .cofixowwhhæëav bmw :uwmv :m4 .moflvxcm .wåwE om äwä 52 sšö: Ewa. .Ráw Awbmuvtflxwb Mxfi .mwmu mn .Zmvmë .mwmv Så.

Auvmhubsxus 2 šq nav >m mcmcfimuEO umwmw m§m .åøvoë .mwmv 3.2 SR .mwmw .än .såå .mån 8-2 2:: wcøtsxo.. >m wcwcfiuwëO 2 2 CI X Ru mvh .mšobcox 449 490 73 Framställning av EMA-råmaterial i pilotanläggning Beredningar i större skala av EMA-råmaterial och den derivatiserade produkten enligt uppfinningen framställdes i enlighet med följande två exempel.

Exemæl 29 Framställning av EMA Det önskade råmaterialet eten/maleinsyraanhydrid (EMM-sampolymer framställdes i en autoklav på 570 liter av rostfritt stål försedd med en 45 l påfyllningsbomb för initiatortillsats, en glasklädd omrörd reaktor lämpligt tätad för Nz-genomblâsning, i vilken reaktanterna blandades, en turbinomrörare, en 7_,5 cm bottenutloppsventil, och mantlad för antingen uppvärmning eller kylning.

Alla tre kärlen genomblâstes tre gånger med NZ före all satsning med reaktanter.

I den glasbeklädda reaktantblandaren satsades 243 kg etylbensen och 30 kg maleinsyraanhydrid (MA). Blandningen upphettades till 50°C tills fullständig lösning erhölls. Till denna lösning av MA i etylbensen sattes en lösning av 2340 gram bensoylperoxid i 21,0 kg etylbensen, som framställts i ett separat kärl.

Den ovannämnda etylbensenlösningen av reaktanter tillfördes sedan till den rostfria stålautoklaven på 570 liter, manteltempererad vid ÅLOOC, varvid man upprätthöll en lätt etylengenomblåsning. Omröraren inställdes på 125 varv per minut. Efter tillsatsen sköljdes reaktantkärlet ned i autoklaven med 2,3 kg etylbensen, togs loss och inloppsledningen tillproppades. Efter satsningen tillslöts autoklavens genomströmningsöppningar, och autoklaven trycksattes till 415 kPa med eten och hölls så i 5 minuter. Tätningstrycken justerades till 170-350 kPa över reaktortrycket. Satstemperaturen bringades till 75°C genom inställning av manteln på 95°C under en period på 45 minuter, varefter reaktorn trycksattes med eten till 1380 kPa. Nolltid registrerades när reaktorinnehâllet nått 75°C.

En lösning av 1560 gram bensoylperoxid i 28,2 kg etylbensen framställ- des och satsades i katalysatortillsatsbomber på 45 liter. Efter tre timmars reaktion av den ovan angivna satsen vid 75° C och 1380 kPa etentryck gjordes den andra initiatortillsatsen till autoklaven, och tillsatsbomben sköljdes med 1,8 kg etylbensen. Efter den andra tillsatsen av bensoylperoxid hölls reaktorn vid 75°C och 1380 kPa eten under ytterligare 114 timmar - totalt 17 timmar. Efter totalt 17 timmar kyldes reaktanterna till 25°C, etentrycket avlägsnades och reaktorn genomblåstes tre gånger med kväve.

EMA-uppslamningen i etylbensen i reaktorn utmatades genom bottenut- loppsventilen på ett Knutsche-vakuumfilter av stengods försett med en bomulls- filterduk av segeldukstyp. Filtret täcktes med en plastfilt och kväveatmosfär.

Den filtrerade våta kakan uppslammades på nytt i 136 kg xylen, och omrördes i 449 490 74 minuter och omfiltrerades. Denna återslamningsprocess med xylen upprepades tre gånger följt av tre återslamnings-filtersteg med användning av 102 kg hexan.

Den slutligen erhållna hexanvåta EMA-kakan spreds ut på rostfria ståltråg och vakuumtorkades vid 50°C i en "Devine" vakuumtrågtork i 48-72 timmar, tills ingen xylenlukt var närvarande. Den slutliga torkade produkten vägde 35,4 kg, 82,896 utbyte. Totalt gjordes en serie på lf körningar med olika storlekar som följer. Det som angivits ovan beskriver körning nr 3 nedan: Körning nr. Temgeratur Utbyte Spec. visk. o C kg l96-DMF-25 C. 1 ' _ ' 70 11,3 0,063 2 75 22,7 0,053 3 75 35,1; 0,051 4 75 11,3 0,052 Exempel 30 Framställning av partiell imid av ammonierad EMA Ammoniering och imidering av EMA (produkt från Exempel 29) utfördes i en _3801 Pfaudler-reaktor försedd med en återgående bladomrörare och ett baffelsystem och en destillationsslinga av rostfritt stål samt en kylare som gjorde det möjligt att välja mellan total elíminering av kondensat eller återföring av någon fraktion av destillatet till reaktorn. Systemet var försett med tvâ oberoende tlllförselledningar, en för ammoniak och den andra för vätska, båda utformade att utmynna nedanför ytan av den omrörda reaktionsblandnlngen.

Varje ledning var utrustad med en filterpatron i ledningen och en rotameter för' att övervaka och reglera strömningshastigheterna. Reaktormanteln ombesörjde både övertrycksångvärme eller kylning alltefter behov. Inloppsledníngen för vätskor var fäst vid en 95 l glasklädd Pfaudler, i vilken EMA-råmaterialet löstes i aceton före tillsatsen till 380 1 ammonieringsreaktorn. Slutprodukter från 3801- reaktorn utvanns genom utmatning genom en bottenventil på ett vakuumfilter av Knutszch-typ av rostfritt stål.

En typisk ammonierings- och partiell imideringssekvens beskrivs i det följande. ' Reaktorn på 3801 satsades med 1321 (102 kg) filtrerad aceton, och lösningskärlet på 95 l satsades med 81,l+l (62,6 kg) filtrerad aceton, båda under kväveatmosfär. Till de 81,41 aceton i lösningskärlet sattes 21 kg EMA- sampolymer (framställd som i Exempel 29, körning 4), och omrörningen fortsattes vid 20-30°C, tills man uppnådde fullständig lösning. Samtidigt tillfördes vattenfri 449 490 75 ammoniak under ytan av acetonen i 380 l-reaktorn med en hastighet av 0,16 kg/minut i 5 minuter. Därefter tillfördes den ovannämnda EMA-acetonlös- ningen under tryck genom ledningsfiltret med linjär strömningshastighet under en 40 minuters period (2,1 kg/min.), varvid den utströmmade i den omrörda aceton- NH3-lösningen i 380 l-reaktorn nedanför vätskeytan. Ammoniakflödet in i 3801- reaktorn hölls vid en hastighet på 0,16 kg/min. under hela EMA-tillsatstiden.

Under denna tid fick reaktorblandningens temperatur stiga till 44-55°C genom att man inte lade på någon yttre kylning. Ammoniakflödet vid 0,16 kg/min. fick fortsätta i 15 minuter efter EMA-tillsatsen. Uppslamningen av utfälld ammonie- ' rad EMA kyldes sedan till 25° C och utmatades till vakuumfiltret för utvinning av den fasta ammonierade produkten. _ _ Den filtrerade ammonierade produkten, halvamid-halvammoniumkar- boxylatsaltet, behandlades ytterligare genom successiv återuppslamning (20 minuter) i acetonportioner om l78l med filtrering mellan varje återuppslam- ningssteg och slutligen tvâ gånger i hexanportioner om l78l följt av filtrering, vilket gav en hexanvåt produktkaka. En alikvot av denna våta kaka torkades för analys och visade ingen anhydrid vid IR-analys, endast amid- och ammoniumkar- boxylatsaltgrupper. Dess vattenlösnings-pl-l var 5,8 vid 2,096 koncentration.

Totalt kördes fem sådana ammonieringar med användning av olika mängder EMA såsom anges nedan. Den ovan angivna beskrivningen hänför sig till körning 5 nedan: 449 490 76 nmfi.. 3.2 ~n.n~ nfimq :ÉÉ v>w>x R. äfi ha šø ke äs .wm_cwfim> wvæa m... uucmäïhwz øwcmbïhmz vucmäšhmz øucmhmïwz owcfimïmz H-Nm *. -+ :z vvcmäïwz wvcmhfišhwz mvCmhmÉmZ . øvEEmZmZ oucflmïwz EE< øvcmhm>cwum øvcmhšcflm vušfimšñhm ou:w._m>cw._m owcmum>cmhm vcvísx Ésvohm .Eofl >m mšmc< az m8 Nä må xmz 'Iwm mxmx åÉmxwI .šflmß w -az x nå mf mf É in <2m vcm>c< -flNflfiä-lfi .E wcficå! wcÉw~coEE< 449 490 77 De ovannämnda hexanvâta kakorna av ammonierad EMA användes direkt i imideringssekvensen vid derivatiseringsförfarandet enligt det följande, som beskriver imidering av ammonieringskörning 5 ovan.

Den hexanvâta filterkakan från körning 5 ovan satsades i 300 l-reaktorn, som innehöll 1441 (125 kg) toluen och 721 (62,6 kg) xylen. Detta slam av ammonierad EMA i blandat hexan/toluen/xylen-lösningsmedel upphettades till kokning med fortsatt besprutning med vattenfri ammoniak vid 0,012 kg/min. Återflöde började vid 82°C, och allt vatten som var närvarande avlägsnades azeotropiskt följt av eliminering av hexan, tills reaktionsblandningens temperatur nätt ll5°C. Reaktionstemperaturen hölls därefter vid ll5-ll6°C som erfordra- des genom a_tt man tillsatte tillskott av en toluen/xylen-blandning i volymförhål- landet 2:1' under eliminering av vatten som bildades genom imidering denna temperatur. Återloppskokningen fortsattes i 7 1/2 timme med azeotropisk eliminering av vatten och med fortsatt ammoniakinsprutning vid 0,012 kg/min. flöde, tills den önskade omvandlingen till imid uppnâddes, vilket bestämdes genom IR-analys (se följande tabell).

När den önskade omvandlingen till imid uppnåtts, kyldes reaktionsslam- blandningen, filtrerades såsom beskrivits ovan och den separerade imidhaltiga produkten behandlades som innan genom tre âteruppslamningssteg med använd- ning _av toluen (155 kg, 20 min.) slutligen följt av två återuppslamningssteg med användning av hexan (119 kg, 20 min.). Den slutliga filtrerade hexanvâta kakan torkades i rostfria stâltrâg i vakuum (oljepump) vid 50°C i 72 timmar eller tills vakuumugnstrycket var under 3 torr vid 50°C.

Totalt utfördes fyra körningar motsvarande körningarna l, 2, 4 och 5 av den ammonierade EMA-sekvensen ovan. Tillämpliga värden för dessa körningar är sammanställda nedan: 449 490 78 &m.@ ~°.« -.« -.« ä + .*z wa v>w>¥ w~fn_ w~.« n.°~ ~_.n_ «.« °._~ nn _ m ~ *_ _ w n , S.. ww . Ü n _ n n .ow ämfiö .ucox *N w: Eocuw wß .IQ 9 o>m>x wcÉwE En: åvt~m> vmflåm .moucøhma E05 offiw: Évuohm .how m .Uoon v? å? ...öäcwD x ^m.#wv °w.- ^@.«@V Qo.- ^_.-v ~@.w ^@.~@v °«.@ X x flxs nuxäbOuß <2m vmLoÉoEEw EfimcEEM vmvtouwcub n._~ m.n~ °.N @.« wx .fäuw (Em wcm>c< -1Niflñ CFCO 449 490 79 Vattenlösningar av de ovan angivna ugnstorkade produkterna justerades till pH 9,5 med ammoniumhydroxid, sterilfiltrerades genom ett 0,2 mikrometers filter i serumflaskor och lyofiliserades för slutlig användning. Slutlig analys för dessa fyra körningar var som följer. Resultaten skiljer sig från de ovan angivna på grund av reammoniering av karboxylgrupper som förlorat ammoniak under ugnstorkningen. 96 imid 2%-ig vatten- 96 96 kväve Körning med IR lösning pH Kväve i Nl-lf 1 18,0 5,96 13,78 , 5,95 2 20,8 6,00 13,96 5,714 4 ' 18,5 6,69 14,54 6,23 20,0 6,#6 14,20 6,13 Exempel 31 Laboratoriesyntes av imid innehållande ammonierad EMA med användning av AEMA-hexanvåt kaka direkt i xylenåterflöde utan torkning. i Beredningar i larboratorieskala gjordes där EMA, löst i aceton, tillsattes under olika tidsperioder till en lösning av aceton, till vilken gasformig ammoniak tillfördes vid olika flödeshastigheter, varvid temperaturen tilläts stiga från rumstemperatur(23-25°C) till 50-53°C. Utfâlld ammonierad EMA filtrerades och uppslamningstvättades med aceton följt av uppslamningstvättning med hexan och filtrering. Den hexanvåta kakan av ammonierad EMA uppslammades sedan åter i xylen, och hela uppslamningen upphettades för eliminering av vatten i två steg, (l) azeotropisk eliminering av vatten i temperaturområdet 75-102°C härrörande från reaktion mellan NHB och aceton följt av (2) vatten som bildats genom partiell imidering av ammonierad EMA vid förhöjd temperatur (122-132°C) efter hexaneliminering. Den slutliga partiella imiden erhölls genom filtrering följt av uppslamningstvättning med xylen och hexan. Tolv sådana körningar gjordes, vilka sammanfattas i den första tabellen nedan. Den följande beskrivningen sammanfattar körning nr 10 i tabellen.

EMA från Exempel 29, körning 1, (280 g - 2,0 mol) löstes i l,l liter aceton och filtrerades genom filtrerpapper. Denna EMA-aceton-lösning tillsattes under en period på 45 minuter till 2,4 liter aceton i en omrörd 5-liters kolv försedd med en äterloppskylare för azeotropeliminering, tillsatskolv och inlopps- spridare för ammoniak. Inloppen för ammoniakspridaren och EMA-acetonlös- ningen befann sig under vätskenivån i S-literskolven. Under den #5 minuter långa EMA-tilisatsperioden och i 10 minuter därefter sprutades ammoniak in i den reagerande uppslamningen med en hastighet av 0,081 mol/minut till en 449 490 80 totalmängd på 4,44 mol ammoniak. EMA-tillsatsen påbörjades vid rumstempera- tur (23°C), och reaktionstemperaturen fick stiga utan någon kylning under hela 45 minuters perioden. Sluttemperaturen hos uppslamningen av ammonierad EMA i aceton var 53,500 Den ammonierade produkten filtrerades, återuppslammades två gånger i 2 liter aceton (30 minuter vardera) följt av två gånger i 2 liter hexan (30 minuter vardera) och filtrerades. Den hexanvåta kakan återuppslammades sedan utan torkning i 2,7 liter xylen för elimineríng av vatten och partiell imidering. Denna hexan/xylen-uppslamning av ammonierad EMA upphettades till återflöde för elíminering av vatten genom azeotropdestillation i två steg. Under hela denna procedur sprutades ammoniakgas kontinuerligt genom uppslamningen med en hastighet på 0,030 mol/min. Den första vattenelimíneringen började vid 88°C, och under en period på 60 minuter steg temperaturen till l0l°C, och 9,1 ml vatten erhölls. Upphettningen fortsattes under hexaneliminering, tills vatten härrörande från imidbildning först erhölls vid l25°C. Vattnet från imideringen avlägsnades azeotropiskt under 60 minuter mellan 125 och l32°Ci varvid 6,9 ml vatten erhölls. Efter imidering kyldes uppslamningen till l00°C, filtrerades, tvättades genom återuppslamning i 30 minuter i 2 liter xylen följt av två återuppslamningstvättningar (30 minuter vardera) i 2 liter hexan och finreredes. Den filtrerade predukten ferkeeee 1 15 timmer vid so°c under oljepumpvakuum vid 3 mm Hg. Utbytet av ugnstorkad produkt var 314 g, 9l+,596 utbyte. Summan av 12 sådana körningar visas i den första tabellen nedan. För slutlig användning löstes den ugnstorkade produkten i vatten (2-596), och pH- värdet iusterades till 9,5 med NHQOH, filtrerades genom ett 0,2 mikrometers filter och lyofiliserades i serumflaskor. Egenskaperna hos de slutliga ugnstorkade och lyofiliserade produkterna anges i den andratabellen nedan. 449 490 81 ^°.«mv ~_m ^w.@mv «_n ^«.&mv *dm ^~.@mv ßfln .m.w@. mfln ^fl.««v ~_n .#.@mv m_n ^m.~@V nan .~.nmv -n ^m.N«. nom ^_.nmv won ^~.n@V Nqm Aøfixnu: .w w 9:32. vmvïoäc D ~.w w.w m.@ ~.w w.w °.~ _.~ n.~ ..~ h.~ ~.w @.w »mm nn w.~ ww w.m ow _.m nw n.w nw ~.» Qw @.°_ mh ~.- xx m.@_ fiw w.- ha °.n~ mm n\w~ @ nn @.@~ flmmflßmw .flm .U ommfl .._uo Nmfi :m-BE .öšflwöaëou m=< xxx .UoNÉ :uo ow cmzmë xmkauænomëu» m=< xx J wficumx .mw ïmEvxm :mä cm .ëwcwcumx m=< x flRK En: :WG wcÉmEE=u|ONI xx~ ...c mcïocmcšunOwI om @@.@ _w°.° nu na - ou @@.@ ~m°_° nn nê - Om @@.@ ~w°.° nn n* Qfl ow @«.@ _w°.° nn «@ m ow #&.ä _~°.° nn wa w hk °w.@ -°.° Qw na R wa nw.« n~=.° ww må w wa «°.« -°.° ø~ ha n «H~ n.« mw°.° cm Q* @ “Nä nm.« ww°.° em ca M 8_ «¿ ëoå 62 øë N om °.@ °wo.° °Q_ om _ .sE.2» Es ¿E _ :SPF Håwswm: wšßß -$8=:-<2u I. mumw-:wxmwcoflgecfx É Éafioxm M Lv2vwc$wpmwc~:._mx måfifimami 1D 449 490 Egenskaper hos produkter från Exempel 31 Ugnstorl-:ad Qrodukt 82 Lxofiliserad grodukt Körning 296-01 varna-rig., pH viki-æ imid* 296-1g varfenisg., pH v1m-96 imia* 1 5,22 21,5 6,20 17,9 2 4,89 23,2 6,12 21,6 3 4,92 25,2 6,09 22,2 4 4,96 23,2 6,23 19,9 5,01 22,2 6,16 21,5 6 5,10 23,5 6,22 20,8 7 5,02 23,0 6,25 19,5 s 5,12 24,0 6,14 19,3 9 5,12 23,5 6,18 19,0 5,07 22,5 6,06 1s,s 11 4,99 22,2 6,18 19,0 12 4,96 23,2 6,10 19,5 X Genom IR-analys.

Totalblandningen av alla de ovan angivna satserna (ca 4000 g) hade följande analys: Ugnstorkad: Lyofiliserad: 296-ig vattenlsg. pH: 5,02 Vikt-96 imid: 296-ig vattenlsg. pH: 6,00 Vikt-96 imid: 23,5 19,5 Två satser om 2000 g vardera pH-justerades till 9,5 med NH4OH, sterilfiltrerades och lyofiliserades i serumflaskor innehållande 0,5 g per flaska för slutlig användning vid antingen human- eller djurförsök, så att man fick totalt 8000 sådana ampuller.

Analysen för detta stora buteljerade material var: pH, 2 96-ig vattenlösning Imid/amid-absorbansförhållande genom IR Vikt-96 imid Totalt kväve, 96 96 Kväve som NHJ 6,27 0,888' 19,3 14,49 6,27 449 490 83 Exempel 32 Detta exempel utnyttjar det i Exempel 20 beskrivna förfarandet för utvärdering på normala Lewis-råttor med avseende på deras förmåga att stimulera immunsvar i form av ökning av lgM-antikropproducerande celler mot heterologa erytrocyter (röda fárblodkroppar, SRBC), med undantag av att imidkompositionen enligt uppfinningen i detta fall admínistrerades genom intravenös dos via svansvenen som l ml fysiologisk saltlösning innehållande den angivna dosmängden. Alla andra detaljer var desamma som i Exempel 20.

Följande värden erhölls vid två experiment. vi n... 81! 449 490 .um-Cm .än va? N “Rahm .öm .Év n NK X å: NNE ä: ä: 10 RK _32 Sä _ S: n...

:Q S: âä àü _ Rä âfi .så å: N Gå Nä: 2.~ ä: ._ 3.» am. 2.~ 22 w wïN QS NQN ä: 2 S.N 83 ää ää å 8 J ...än 8. _ »Sn ^ =Pa=°v= o q u :Brax _ u :oëax wšwe 8.. xuvcm o 12 \U mm xoucw o ÉQUHÉ mwcwšwhfizfi ...hwcqgflnëflm _ . w 23 ømwcïuïëïm w _23 nušon ÉaEvxm :mh .öEšom <|_>|m TgaEoxm :mh .öEšom ann..- .- --«=~» j-_. 449 490 85 Exempel 33 Ett föredraget exempel enligt uppfinningen innefattande en sampolymer mellan eten och maleinsyraanhydrid, som har en molekylvikt på ca 850 och är derivatiserad så att den innehåller halvamid-halvammoniumsaltgrupper och imidgrupper, varvid imidgrupperna omfattar ca 20 vikt-96 av dessa grupper (i huvudsak liknande det exempel som belyses med Figur I) har testats på människor. Under en period på flera månader vid ett kliniskt studium Fas I av upp till 72 patienter med gastrointestinal cancer (innefattande mag-, bukspottkörtek, kolon- och rektalcancerpatienter) stötte man inte på någon betydande toxicítet med läkemedlet vid någon av de intraperitoneala, orala eller intravenösa vägar det administrerades och inget accelererat mönster av sjukdomsprogression efter läkemedelsbehandlingen har inträffat.

Exempel 34 När isobutylen insätts istället för en ekvivalent mängd propen i Exempel 24, erhålls i huvudsak liknande resultat.

Exempel 35 När dimetylmaleinsyraanhydrid insätts istället för en ekvivalent mängd citrakonsyraanhydridi Exempel 25 erhålls i huvudsak liknande resultat.

Exemæl 36 När EMA med en beräknad talmedelmolekylvikt på 300 insätts istället för EMA med en beräknad talmedelmolekylvikt på 342 i Exempel 26, erhålls i huvudsak liknande resultat.

Exempel 37 När EMA med en beräknad talmedelmolekylvikt på 1500 insätts istället för EMA med en beräknad talmedelmolekylvikt på 342 i Exempel 26, erhålls i huvudsak liknande resultat.

Ytterligare andra exempel kan utföras, vilket lätt inses av fackmannen på området efter att ha läst föreliggande beskrivning, utan att man avviker från uppfinningens grundtanke och omfattning. Givetvis innefattas alla sådana ytterligare exempel inom ramen för de efterföljande patentkraven.

Claims (11)

1. 0 15 20 25 30 449 490 86 PATENTKRAV 1, Sampolymerer av olefinmonomerer med från 2 till ca l: kolatomer och qgß-omättade polykarboxylsyraanhydrider med från li till ca 6 kolatomer, k ä n n e t e c k n a d e av att de har en medelmolekylvikt från ca 300 till ca 1500, och är derivatiserade så att de innehåller både halvamid-, halvkarboxylat- saltgrupper och imidgrupper, varvid imidgrupperna utgör från ca 5 till ca 4096 av de derivatiserade grupperna.

2. , Sampolymerer enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d e av att olefinmonomeren är eten.

3. 'Sampolymerer enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a d e av att polykarboxylsyraanhydriden är maleinsyraanhydrid.

4. Sampolymerer enligt patentkravet 1, 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a d e av att medelmolekylvikten är ca 850.

5. Sampolymerer enligt patentkravet 1, 2, 3 eller 4, k ä n n e t e c k n a d e av att halvamid-, halvkarboxylatsaltgruppen är halv- amid-, halvammoniumsaltgruppen.

6. Sampolymerer enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a d e av att imidgruppen utgör från ca 10 till ca 2596 av de derivatiserade grupperna.

7. Läkemedelskomposition med immunreglerande verkan, k'ä n n e t e c k n a d av att den innehåller Sampolymerer enligt något av patentkraven 1-6 och en farmaceutiskt godtagbar bärare,

8. Läkemedelskomposition enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k n a d av att bäraren är fysiologisk saltlösning, i vilken sam- polymererna är lösta,

9. Sampolymerer enligt något av patentkraven l-6 för användning som immunreglerande medel.

10. Sampolymerer enligt något av patentkraven 1-6 för användning vid tumörterapi.

ll. Sätt att framställa immunreglerande derivat av Sampolymerer av oleíinmonomerer med från 2 till ca L; kolatomer och uß-omättad polykarboxyl- OQ ml 10 15 20 25 449 490 87 syraanhydrider med från 4 till ca 6 kolatomer, k ä n n e t e c k n a t av att man låter ett halvamid-, halvammoniumsaltderivat av sampolymeren, i vilket sampolymeren har en molekylvikt från ca 300 till ca 1500, reagera med ammoniak för ytterligare derivatisering av sampolymeren, så att den innehåller både (a) halvamid-, halvammoniumsaltgrupper och (b) imidgrupper, varvid imidgrupperna utgör från ca 5 till ca #0 viktprocent av de derivatiserade grupperna, och eventuellt omvandlar halv-arnmoniumsaltgruppen till andra farmaceutiskt godtagbara saltgrupper. 12- Sätt enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k n a t av att reaktionen utförs i organiskt lösningsmedelsmedium vid återflödestemperatur. 13- Sätt enligt patentkravet 12» k ä n n e t e c k n a t av att det organiska lösningsmedelsmediet är xylen och/eller toluen. lll. Sätt enligt patentkravet 11,12 eller 13, k ä n n e t e c k n a t av att olefinmonomeren är eten. 15- Sätt enligt patentkravet 11, 12, 13 eller 14, k ä n n e 1: e c k n a t av att polykarboxylsyraanhydriden är maleinsyraanhydrid. 16. Sätt enligt något av patentkraven 11-15, k ä n n e t e c k n a t av att medelmolekylvikten är ca 850. 17- Sätt enligt något av patentkraven 11-16, k ä n n e t e c k n a t av att imidgruppen utgör från ca 10 till ca 2596 av de derivatiserade grupperna. 13- Sätt enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k n a t av att temperaturen är från ca 50° till ca 200°C, företrädesvis fran ca eo° :in ca 1so°c, och gäfskii: från ca 1oo° m1 ca 1so°c.