NO158807B

NO158807B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av et immunoregulerende derivat av en copolymer.

Info

Publication number: NO158807B
Application number: NO80800137A
Authority: NO
Inventors: Joseph E Fields; Samuel S Asculai; John H Johnson
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1979-01-22
Filing date: 1980-01-21
Publication date: 1988-07-25
Also published as: US4255537A; PL221495A1; NL8000334A; OA06425A; NO800137L; HU184229B; FI68060C; CH644874A5; ZM480A1; CA1140852A; DE3002047A1; ES8102153A1; EG14805A; BE881264A; JPS55100322A; GB2040951B; FI68060B; IT1193367B; NO158807C; ES487819A0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et immunoregulerende derivat av en copolymer av en olefinmono-

mer og et a,3-umettet polycarboxylsyreanhydrid, som er anvend-bart ved den immunoregulerende styring av tumorterapi.

Selv om tumorterapi har vært gjenstand for stadig økende undersøkelser, er meget få effektive forbindelser for slik bruk hittil blitt funnet.

Ifølge en problemstilling har det vært gjort forsøk

på å manipulere med kroppens immunsystem. Eksempelvis er det generelt anerkjent at thymuskjertelen er av stor betydning ved utvikling og aldring av immunologisk kompetanse. Ved forskjellige mekanismer som antas å være prinsippielt hormonelle, utviser thymuskjertelen kontroll over den T-lymfocytformidle-

de immunfunksjon. Et utall av naturlige forekommende og syn-tetisk fremstilte peptider har således blitt testet som stimuleringsmidler og/eller undertrykkende midler for dette immunsystem med varierende resultater.

Andre midler som er funnet å ha immunhjelpende aktivitet innbefatter for eksempel Bacillus Calmette-Guerin (BOG), Corynebacterium parvum, glucan, levamisole og tiloron. Enkelte av disse forbindelser øker produksjonen av antistoffer mens andre enten øker eller inhiberer celleformidlet immunitet.

Forskjellige biologisk aktive syntetiske polyelek-trolytter har også være foreslått som anvendbare antitumormidler. Således fant Regelson og Holland et vidt spektrum av antitumoraktivitet i mus for natriumsaltet av polyethylen-sulfonat. Nature (London) 181, 46 (1958). Et utall carboxyl-syrepolymerer med hovedsakelig høy molekylvekt, for eksempel polyacrylsyre, polymetacrylsyre og ethylenmaleinsyreanhyrid-copolymer (EMA) ble deretter funnet å ha antineoplastisk aktivitet lik den av natriumpolyethylensulfonat. Regelson et al., Nature (London) 186, 778 - 780 (1960), Regelson, "Water-Soluble Polymers", i "Polymer Science and Technology", Vol. 2 (ed. N.K. Bikales), s. 161 - 177, Planum Press, New York, 1973. Den antineoplastiske aktivitet av EMA-type-polymerer er også beskrevet i canadisk patent 664 326, svarende til US patentsøknad 758 023 innlevert 28. oktober 1958.

En anvendbar molekylvekt for disse polymerer er angitt å være mellom 500 og 1,5 million. En av disse polymerer, halv-amidet, halvammoniumsaltet av EMA med en midlere molekylvekt på 20 000 - 30 000 ble senere angitt å være kronisk toksiske i gnagere og hunder. Mihich et al., Fed. Proceedings, Vol. 19, Nr. 1, Pt. 1, Mars 1960. Kronisk toksisitet ble også senere beskrevet for polymerer med molekylvekt 2000 - 3000 i hunder, Mihich et al. Fed. Proceedings, Vol. 20, nr. 1, Pt. 1, mars 1961. Disse observasjoner av toksisitet talte imot klinisk testing av polymerene.

Senere ble den beslektede 1:2 divinylether-malein-syreanhydridcopolymer funnet å utvise antitumoraktivitet ved tester utført av National Cancer Institute. Breslow, Pure & Appl. Chem. 46, 103 - 113 (1976). Denne copolymer er også kjent som pyran-copolymer eller DIVEMA, og en velkjent prøve er blitt betegnet NSC 46015. Bruk av disse pyrancopolymerer som antitumormidler er også beskrevet i US patentskrifter 3 224 943 og 3 794 622 hvori den anvendbare molekylvekt er beskrevet å variere fra 5000 - 30 000. Antitumoraktiviteten av pyrancopolymer er blitt tilskrevet en immunpotensiering eller en effekt på immunresponsen gjennom det reticuloendo-theliale system (RES) ved høyning av makrofagfunksjonen,

som angitt i flere publikasjoner, for eksempel Breslow, Pure & Appl. Chem. 46, 103 - 113 (1976), Mohr et al., Prog. Cancer Res. Ther. 7, 415 - 426 (1978), Schultz et al., id. 7, 459 - 467 (1978), og Dean et al., Cancer Treatment Reports 62, september 1978.

Til tross for at den kjente teknikk har rapportert kronisk toksisitet for forskjellige høymolekylære EMA-type-polymerer, er forskningsarbeider blitt utført av oppfinnerne for ytterligere å vurdere polymerer av denne generelle type med hensyn til immunoregulerende aktivitet. Nye problem-stillinger og nye metoder for vurdering ble innført, hvilket muliggjorde erkjennelse av immunoregulerende aktivitet uten medfølgende cytotoksisitet. Som et resultat av dette ble visse av disse nylig vurderte forbindelser funnet å ikke ha noen direkte cyt<p>toksisk aktivitet, men ble overraskende og uventet funnet å være meget effektive overfor tumor-metastase og tumor-tilbakevending etter bortskjæring eller fjerning av

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et immunoregulerende derivat av en copolymer av en olefinmonomer og et a,P-umettet polycarboxylsyreanhydrid, som er anvend-bart ved den immunoregulerende styring av tumorterapi.

Ifølge en problemstilling har det vært gjort forsøk på å manipulere med kroppens immunsystem. Eksempelvis er det generelt anerkjent at thymuskjertelen er av stor betydning ved utvikling og aldring av immunologisk kompetanse. Ved forskjellige mekanismer som antas å være prinsippielt hormonelle, utviser thymuskjertelen kontroll over den T-lymfocytformidle-de immunfunksjon. Et utall av naturlige forekommende og syn-tetisk fremstilte peptider har således blitt testet som stimuleringsmidler og/eller undertrykkende midler for dette immunsystem med varierende resultater.

Forskjellige biologisk aktive syntetiske polyelek-trolytter har også være foreslått som anvendbare antitumormidler. Således fant Regelson og Holland et vidt spektrum av antitumoraktivitet i mus for natriumsaltet av polyethylen-sulfonat. Nature (London) 181, 46 (1958). Et utall carboxyl-syrepolymerer med hovedsakelig høy molekylvekt, for eksempel polyacrylsyre, polymetacrylsyre og ethylenmaleinsyreanhyrid-copolymer (EMA) ble deretter funnet å ha antineoplastisk aktivitet lik den av natriumpolyethylensulfonat. Regelson et al., Nature (London) 186, 778 - 780 (1960), Regelson, "Water-Soluble Polymers", i "Polymer Science and Technology", Vol. 2 (ed. N.K. Bikales), s. 161 - 177, Planum Press, New York, 1973. Den antineoplastiske aktivitet av EMA-type-polymerer er også beskrevet i canadisk patent 664 326, svarende til US patentsøknad 758 023 innlevert 28. oktober 1958. En anvendbar molekylvekt for disse polymerer er angitt å være mellom 500 og 1,5 million. En av disse polymerer, halv-amidet, halvammoniumsaltet av EMA med en midlere molekylvekt på 20 000 - 30 000 ble senere angitt å være kronisk toksiske i gnagere og hunder. Mihich et al., Fed. Proceedings, Vol. 19, Nr. 1, Pt. 1, Mars 1960. Kronisk toksisitet ble også senere beskrevet for polymerer med molekylvekt 2000 - 3000 i hunder, Mihich et al. Fed. Proceedings, Vol. 20, nr. 1, Pt. 1, mars 1961. Disse observasjoner av toksisitet talte imot klinisk testing av polymerene.

som angitt i flere publikasjoner, for eksempel Breslow, Pure & Appl. Chem. 46, 103 - 113 (1976), Mohr et al., Prog. Cancer Res. Ther. 7, 415 - 426 (1978), Schultz et al., id. 7, 459 - 467 (1978), og.Dean et al., Cancer Treatment Reports 62, september 1978.

Til tross for at den kjente teknikk har rapportert kronisk toksisitet for forskjellige høymolekylære EMA-type-polymerer, er forskningsarbeider blitt utført av oppfinnerne for ytterligere å vurdere polymerer av denne generelle type med hensyn til immunoregulerende aktivitet. Nye problem-stillinger og nye metoder for vurdering ble innført, hvilket muliggjorde erkjennelse av immunoregulerende aktivitet uten medfølgende cytotoksisitet. Som et resultat av dette ble visse av disse nylig vurderte forbindelser funnet å ikke ha noen direkte cytotoksisk aktivitet, men ble overraskende og uventet funnet å være meget effektive overfor tumor-metastase og tumor-tilbakevending etter bortskjæring eller fjerning av hovedtumor. Således er disse forbindelser indikert som særlig anvendbare ved styring av tumorterapi ved en immunologisk mekanisme. De er anvendbare for å forhindre tumor tilbakevending eller utvikling av metastaser ved administrering etter bortskjæring eller fjerning av hovedtumor, røntgen eller cytotoksisk kjemoterapi.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles en ny gruppe av forbindelser av den ovenfor angitte EMA-type, hvilke har vist seg effektive mot tumor-metastaser og tumor-tilbakevending i pattedyr selv om disse mangler sterk primær antitumoraktivitet. Oppfinnelsen vedrører således en analogifremgangsmåte for fremstilling av et immunoregulerende derivat av copolymer av olefinmonomer med fra 2 til 4 carbonatomer og a,|3-umettet polycarboxylsyreanhydrid med fra 4 til 6 carbonatomer. Ana-logif remgangsmå ten er kjennetegnet ved at et halvamid, halv-ammoniumsaltderivat av angitte copolymer, hvori copolymeren har en molekylvekt på fra 300 til 1500, omsettes med ammoniakk for ytterligere å derivatisere copolymeren til å inneholde både (a) halvamid, halv-ammoniumsaltgrupper og (b) imidgrupper, hvori imidgruppene omfatter fra 5 til 4 0 vekt% av de derivatiserte grupper, og eventuelt at halv-ammoniumsaltgruppene omdannes til andre farmasøytisk akseptable saltgrupper. Illustrerende eksempler på slike olefinmonomerer er ethylen, propylen og isobutylen, og illustrative eksempler på slike polycarboxylsyreanhydrider er maleinsyreanhydrid, citraconsyreanhydrid og aconitinsyreanhydrid. Av disse monomere komponenter er ethylen og maleinsyreanhydrid foretrukket.

For illustrasjonsformål kan den passende derivatiserte, foretrukne copolymer av ethylen og maleinsyreanhydrid betegnes ved at den har følgende strukturelle enheter eller grupper:

(a) halvamid, halvcarboxylatsalt -

hvori X = H eller C1_4 alkyl, og fortrinnsvis H, Y = H, ammonium eller et farmasøytisk akseptabelt metallkation, og fortrinnsvis ammonium, og z = H, C1-4 alkyl, ammonium eller et farmasøytisk akseptabelt metallkation, og fortrinnsvis H.

De respektive (a)- og (b)-enheter eller -grupper er fordelt langs et hovedsakelig rettkjedet, uavbrutt carbonatommolekyl. Fra 5% til 40% av disse enheter skal være imid, idet resten er prinsipalt halvamid, halvcarboxylatsalten-heter.

Disse enheter kan være anbragt vilkårlig innen kjeden og/eller vilkårlig innen polymeren. Det skal forstås at en liten del (antatt å være mindre enn 10 %) av monoammoniumcarboxyl-eller annen farmasøytisk akseptabel saltgruppe og/eller dicarboxylgruppe også kan være tilstede som kan opp-stå fra partielt omsatt eller uomsatt anhydrid under fremstillingen av disse forbindelser.

Blant de foregående derivatiserte grupper er (a) halv-amid, halvcarboxylatsaltgruppen fortrinnsvis halvamid, halv-ammoniumsalt, og (b) imidgruppen er fortrinnsvis usubstituert imid.

Den foretrukne, derivatiserte copolymer av ethylen og maleinsyreanhydrid kan betegnes ved at den har følgende strukturelle enheter eller grupper:

(a) halv-amid, halv-ammoniumsalt -

og (b) usubstituert imid -

Som tidligere angitt er de respektive (a)- og (b)-enheter eller -grupper fordelt langs et hovedsakelig rettkjedet, uavbrutt carbonatommolekyl. Fra 5 til 40% av disse enheter er usubstituert imid, idet resten prinsipalt er de foretrukne halv-imid, halv-ammoniumsaltenheter. Disse enheter kan være anbragt vilkårlig innen kjeden eller vilkårlig innen polymeren. Det skal forstås at en liten del (antatt å være mindre enn 10%) av monoammoniumcarboxyl- eller dicarboxyl-gruppen kan foreligge som avledet fra partielt omsatt eller uomsatt anhydrid under fremstillingen av disse forbindelser.

De polymere immunoregulerende derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen er også fortrinnsvis vannløselige.

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved de med-følgende tegninger, hvori: fig. 1 viser de karakteristiske områder i det infra-røde absorpsjonsspektrum for en representativ polymer fremstilt ifølge oppfinnelsen som er derivatisert slik at den inneholder 20% imid. Se eksempel 3, tabell IV, forsøk 5, i det etterfølgende.

Fig. 2 viser for sammenlignings skyld det karakteristiske område av det infrarøde absorpsjonsspektrum for en tilsvarende polymer som inneholder 0% imid. Se eksempel 2(a)

i det etterfølgende.

Fig. 3 viser for sammenlignings skyld det karakteristiske område av det infrarøde absorpsjonsspektrum for en tilsvarende polymer som er derivatisert slik at den inneholder 100% imid. Se eksempel 5 i det etterfølgende.

Selv om kanadisk patentskrift 664 326 beskriver bruk av halv-amid, halv-ammoniumsalter av EMA-type copolymerer, eller bruk av imider eller partielt imidiserte derivater av EMA-type copolymerer for å gi antineoplastisk aktivitet, menes det at de spesifikke polymerer fremstilt ifølge oppfinnelsen som har kombinasjonen av både (a) halv-amid, halv-carboxylatsaltgruppe og (b) imidgruppe i de her definerte forhold, og som har en relativt lav midlere molekylvekt på fra 300 til 1500, er nye forbindelser. Disse nye polymerer har overraskende anvendbare immunoregulerende egenskaper som ikke utvises av de tilsvarende polymerer som bare har (a)- eller (b)-gruppen, og som har betydelig høyére molekylvekt. Også

de tilsvarende monomere fragmenter av disse polymerer, nemlig succinimid og succinaminsyre (ammoniert ravsyreanhydrid) er tidligere ikke beskrevet å utvise noen signifikant tumor-inhiberende effektivitet, Regelson et al., Nature (London) 186, 778 - 789 (1960).

De uderivatiserte lav-molekylære copolymerer som ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille de ønskede immunoregulerende derivater, kan fremstilles etter velkjente metoder slik som beskrevet i for eksempel US patentskrifter 2 857 365, 2 913 437, 2 938 016 og 2 980 653. Typisk omsettes olefinet, for eksempel ethylen, med polycarboxylsyreanhydridet, for eksempel maleinsyreanhydrid, ved temperaturer varierende fra 40° C til 100° C i nærvær av en friradikal-

katalysator og i et væskeløsningsmiddél som er et løsnings-middel for reaktantene og et ikke-løsningsmiddel for den dan-nede interpolymer. Konvensjonelle friradikal-' polymerisasjonskatalysatorer av peroxydtypen og azo-typen er særlig egnet for dette formål, og benzoylperoxyd foretrekkes. Inerte løsningsmidler slik som benzen, halobenzener og halo-paraffiner er anvendbare løsningsmidler for polymerisasjonsreaksjonen. Imidlertid er et alkylert aromatisk hydrocarbon med minst ett ct-hydrogen, slik som for eksempel ethylbenzen, isopropylbenzen, diisopropylbenzen, toluen eller xylen, et foretrukket væskemedium for polymerisasjonsreaksjonen for det formål å redusere molekylvekten til copolymerproduktet som beskrevet i US patentskrift 2 913 437.

Ethylbenzen er spesielt foretrukket som væskemedium for det sistnevnte formål. Copolymeren inneholder fortrinnsvis hovedsakelig ekvimolære mengder av olefinres.ten og anhydridresten slik som det vil bli erholdt ved anvendelse av ekvimolære mengder av reaktantmonomerene. Det resulteren-og (b) usubstituert imid -

i det etterfølgende.

Fig. 3 viser for sammenlignings skyld det karakteristiske område av det infrarøde absorpsjonsspektrum for en tilsvarende polymer som er derivatisert slik at den inneholder . 100% imid. Se eksempel 5 i det etterfølgende.

De uderivatiserte lav-molekylære copolymerer som ifølge oppfinnelsen anvendes for å fremstille de ønskede immunoregulerende derivater, kan fremstilles etter velkjente metoder slik som beskrevet i for eksempel US patentskrifter 2 .857 365, 2 913 437, 2 938 016 og 2 980 653. Typisk omsettes olefinet, for eksempel ethylen, med polycarboxylsyreanhydridet, for eksempel maleinsyreanhydrid, ved temperaturer varierende fra 40° C til 100° C i nærvær av en friradlkal-

katalysator og i et væskeløsningsmiddel som er et løsnings-middel for reaktantene og et ikke-løsningsmiddel for den dan-nede interpolymer. Konvensjonelle friradikal-' polymerisasjonskatalysatorer av peroxydtypen og azo-typen er særlig egnet for dette formål, og benzoylperoxyd foretrekkes. Inerte løsningsmidler slik som benzen, halobenzener og halo-paraffiner er anvendbare løsningsmidler for polymerisasjonsreaksjonen. Imidlertid er et alkylert aromatisk hydrocarbon med minst ett a-hydrogen, slik som for eksempel ethylbenzen, isopropylbenzen, diisopropylbenzen, toluen eller xylen, et foretrukket væskemedium for polymerisasjonsreaksjonen for det formål å redusere molekylvekten til copolymerproduktet som beskrevet i US patentskrift 2 913 437.

Ethylbenzen er spesielt foretrukket som væskemedium for det sistnevnte formål. Copolymeren inneholder fortrinnsvis hovedsakelig ekvimolære mengder av olef inres.ten . og anhydridresten slik som det vil bli erholdt ved anvendelse av ekvimolære mengder av reaktantmonomerene. Det resulterende copolymerprodukt erholdes i fast form og gjenvinnes lett ved filtrering, sentrifugering og lignende separasjonsprosedyrer.

Det skal forstås at friradikalinitiatoren, både gjennom initiering av polymerisasjonsreaksjonen og etter-følgende terminering eller telomerisering med det alkylerte aromatiske hydrocarbonvæskemedium, vil bevirke innføring av forskjellige organiske grupper i den polymere struktur. Prosenten av disse grupper i det totale polymere materiale vil øke ettersom molekylvekten på polymeren avtar. Bruk av for eksempel benzoylperoxyd som friradikalinitiator. og ethylbenzen som væskereaksjonsmedium vil bevirke innføring av deres respektive aromatiske grupper i polymerstrukturen. Disse grupper vil utgjøre en større prosent av den totale struktur i polymerer med en molekylvekt på ca. 30 0 enn polymerer som har en molekylvekt på ca. 1500.

Det skal envidere bemerkes at ved fremstilling av disse lavmolekylære copolymerer kan en viss mengde av tverr-bindingsmiddel innarbeides i copolymeren og dermed gjøre produktet løselig i vann. Eksempler på slike tverrbindingsmid-ler er vinyl-og allylestere, spesielt de acrylater og croto-nater som er beskrevet i US patentskrift 3 165 486. Copoly-merene kan også gjøres uløselige etter derivatiseringen, ved forskjellige midler slik som f.eks. tverrbinding med diamin som beskrevet i US patentskrift 3 554 985, eller ved binding til bærere slik som bentonitt, latexpartikler eller erythrocyter.

Det er kjent at amidderivatene av EMA-copolymerer kan fremstilles ved omsetning av copolymeren med ammoniakkgass ved omgivende eller forhøyede temperaturer som beskrevet 1 canadisk patentskrift1664 326 og i US patentskrifter 2 883 287 og 3 157 595. Det er også kjent at omsetning ved høyere temperaturer er tilbøyelig til å aktivere imiddannelse, mens reaksjonen i inerte organiske væskeløsningsmedia slik som benzen, kan anvendes for å regulere reaksjonstemperaturen og retardere imiddannelsen. En annen kjent metode for amid-dannelse omfatter omsetning av polymeren i flytende ammoniakk ved -33° C.

Selv om de ovenfor angitte prosedyrer generelt er anvendbare for fremstilling av halv-amid, halv-ammoniumsaltet som et mellomtrinn for fremstilling av de imid-holdige derivater, lider de av en tid-diffusjonseffekt av ammoniakk inn i den indre kjerne av EMA-partiklene som beskrevet i eksempel 2. En foretrukket metode omfatter først å oppløse EMA-copolymeren i aceton, etterfulgt av omsetning av den oppløs-te polymer med flytende ammoniakk i aceton. Det ønskede halv-amid, halv-ammoniumsaltprodukt utfelles fra løsningen og kan deretter lett gjenvinnes ved filtrering, sentrifugering og lignende separasjonsprosedyrer som illustrert i eksempel 2, del a, b og c. Fig. 2 i de medfølgende tegninger viser det infrarøde spektrum av halv-amid, halv-ammonium-saltproduktet ifølge eksempel 2(a), som inneholder 0 % imid.

Fremstilling av det ønskede imidholdige derivat kan deretter utføres ved å omsette halv-amid, halv-ammonium-saltmellomproduktet med ammoniakk for ytterligere å derivatisere copolymeren slik at den inneholder både (a) halv-amid, halv-ammonium-saltgrupper og (b) imidgrupper hvori imidgruppene omfatter fra 5 til 40 vekt% av de derivatiserte grupper, og eventuelt at halv-ammoniumsaltgruppen omdannes til andre farmasøytisk akseptable saltgrupper. Reaksjonen utføres i egnede organiske løsningsmiddelmedia slik som f.eks. toluen eller xylen, ved tilbakeløpstemperaturer inntil den ønskede prosent av imidderivat er dannet som illustrert i eksempel 3 og 4. Tilbakeløpstemperaturer kan variere fra 50° C til ca. 200° C, fortrinnsvis fra 60 til 150° C og helst fra 100 til 150° C.

Fig. 1 i de medfølgende tegninger viser det infra-røde spektrum for et representativt eksempel (Eksempel 3, Tabell IV, forsøk 5) av den ønskede polymer som er derivatisert til å inneholde både (a) halv-amidet, halv-ammoniumsaltgruppen og (b) imidgruppén.. og hvori.imidet omfatter 20 % av derivatiseringen. Polymeren ifølge dette eksempel har en midlere molekylvekt på ca. 850 og mengden på 20 % imid ligger innen det foretrukne område på fra 10 til 25 % imid.

For sammenlignings skyld ble også et fullstendig 100 % imidderivat av EMA-copolymeren fremstilt som illustrert i eksempel 5. Fig. 3 i tegningene viser det infrarøde spektrum for denne polymer.

En detaljert beskrivelse av den infrarøde analyse for identifisering av de forskjellige funksjonelle gruppe-ringer som illustrert i fig. 1 - 3, er angitt i det etter-følgende eksempel 1.

For å demonstrere effektiviteten av polymerer fremstilt ifølge oppfinnelsen ved immunoregulerende styring av tumor-terapi, ble representative eksempler på polymerene underkastet forskjellige tester som følger: I en serie av tester ble polymerene testet i en virusfremkalt, ikke-metastatisk musetumormodell. Den anvendte modell var SV4 0-virus-indusert fibrosarkom (m KSA) av syngenetisk BALB/c-mus-opprinnelse. Denne musetumor, mKSA-TU5, var utviklet av Kit et al. Int. J. Canser 4,

384 - 392 (1969) og er ikke kjent å vende tilbake i syngenetisk BALB/c-mus. I denne serie av tester var de observerte tumorregresjoner tilknyttet immunostimulering og reduksjon av tumorbelastning i overensstemmelse med Dean et al., Int.

J. Canser, 16, 465 - 475 (1975) som har vist at mKSA hadde tumor-assosierte antigener og at i dyr med små tumorer er det en god korrelasjon med celleformidlet immunitet. Musene ble behandlet med tre forskjellige doser av testforbindelsen enten før eller etter eller både før og etter utfordring med levedyktige tumorceller ved en TD^qQ og TD5q« Veksten av tumor ble deretter vurdert i de behandlede dyr mot normale ikke-behandlede kontrollmus. I denne serie av tester utviste polymerer ifølge oppfinnelsen med en midlere molekylvekt på ca. 850 en betydelig større tumorregresjonsaktivitet enn de tilsvarende polymerer med en molekylvekt på 2000 - 3000

og molekylvekt på 20 000 - 50 000.

I en annen serie av tester ble representative polymerer fremstilt ifølge oppfinnelsen testet i en kjemisk indusert, metastasedannende rottetumormodell. Den anvende modell var en 3-methylcholanthren-indusert blæretumor (BLCA) i Fischer 344 rotter. (Prehn, R.T. et al., J. Nat. Can. Inst. 18,

769 (1057) og Falk, R. et al., Surgery, Oktober 1978).

Tumorcellene var blitt overført i cellekultur over 5 år, og etter subkutan (SC) implantasjon, var disse kjent for å metastasere til lungene innen 1 uke etter implantasjonen. Den vanlige overlevelsestid etter subcutan tumor-implantasjon er 3 uker eller mindre.

I en del av disse tester i den metastaserende rotte-tumormodell ble testpolymeren administrert periodevis med ca. 1 ukes intervaller i 3 uker etter tumor-implantasjon. Disse behandlede dyr hadde en overlevelsesgrad større enn tre ganger den for de ubehandlede kontrolldyr og ingen meta-stasevekst ble observert under 6 ukers observasjon.

I en annen del av disse tester ved den metastaserende rotte-tumormodell, ble testpolymeren administrert som et supplement til tumorbortføring 7-10 dager etter tumorinnpodning. De behandlede dyr ble observert for tumor-tilbakevendelse etter utskjæring mot ubehandlede kontrolldyr. I kontrolldyrene var tumor-tilbakevendelse 100 %

innen 6 uker, etter bortskjæring med en midlere tid på 32 dager, mens i dyrene behandlet med de foretrukne polymerer ved 30 mg/kg var det ingen tilbakevendelse under de første 6 uker, og etter 10 uker var tumor-tilbakevendelse synlig bare i 13 % av dyrene.

I en annen serie av tester ble representative polymerer fremstilt ifølge oppfinnelsen testet i normale Lewis-rotter og ble funnet å stimulere immunresponsene som fastslått ved en økning i antistoffproduksjon.

Andre tester i normale Lewis-rotter viste B-celle-aktivering av representative polymerer fremstilt ifølge oppfinnelsen uten nærvær av T-celler, som således indikerer bruk av disse polymerer som en thymus-funksjonserstatning. T-celler er thymus-avledede lymfocytter mens B-celler er lymfocytter som differensierer i slimhinne-ekvivalenten eller benmarg.

Ytterligere testing i normale Lewis-rotter for økning i peritoneale makrofager og aktivitet av latex-fago-cytose av makrofagene har indikert at den immunoregulerende effekt av disse polymerer på B-celleaktivitet ikke produse-res ved stimulering av makrofagaktiviteten. Polymerene fremstilt ifølge oppfinnelsen synes således å virke forskjellige fra de beslektede pyrancopolymerer ifølge teknikkens stand som virker gjennom RES ved å øke makrofagfunksjonen.

En detaljert beskrivelse av de ovenfor angitte og andre slike tester og de tilsvarende resultater er angitt i eksempel 8-23.

Generelt kan polymerene fremstilt ifølge oppfinnelsen administreres til en vert i en effektiv immunoregulerende mengde som et supplement til tumor-kjemoterapi, tumor-bestrål-ingsterapi og/eller tumor-bortskjæring. Som sådanne kan disse ved styring av tumor-terapi administreres samtidig med slik terapi, eller innen en egnet tid før eller etter slik terapi. Generelt vil dette være innen en 2-dagers periode umiddelbart før og én-måneders-periodeflumiddelbart etter slik terapi. Undersøkelser viser at utskillelse av en foretrukket vannløse-lig polymer fremstilt ifølge oppfinnelsen finner sted i løpet av 30 - 60 dager, og det tas således i betraktning at administrering av vedlikeholdsdoser av polymeren kan foretas hver sjette uke.

Polymerene kan administreres parenteralt såvel som oralt i mengder varierende for eksempel fra 1 til 100 mg pr. kg kroppsvekt. De kan administreres både intravenøstog intraperitonealt, fortrinnsvis i vandig løsning slik som sterilt vann eller fysiologisk saltvann.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere. I alle eksempler er utbyttet angitt som prosent utbytte av teoretisk basert på gjenvunnet produkt.

Eksiempel 1

Fremstilling av. EMA

Det ønskede ethylen/maleinsyreanhydrid (EMA) copolymer-råmateriale ble fremstilt i en oppvarmet rustfri stålreaktor på 3,78 liter utstyrt med indre vannkjølings-spiral, magnetdrevet omrører som virker optimalt ved 1000 - 1200 omdr. pr. min., ethyleninnløp og et innløp gjennom hvilket ytterligere katalysator kan tilsettes i løsning pres-set inn av ethylen. Prøver kunne tas ut og sluttproduktet tømmes ut gjennom en bunnåpning. Hjelpeutstyr for oppvarming og avkjølingskontroll var tilveiebragt. I et typisk forsøk besto tilførselen til reaktoren av 1625 g (1975 ml) ethylbenzen, 190 g (1,94 mol) maleinsyreanhydrid og 14,1 g (0,058 mol) benzoylperoxyd løst i 80 g (92 ml) ethylbenzen. Katalysatorkaret ble vasket i reaktoren med ytterligere 20,0 ml ethylbenzen. Reaktoren ble lukket og trykket ventilert to ganger med ethylen ved romtemperatur for å fortrenge luft 1 systemet. Deretter ble temperaturen bragt til og holdt ved 70° C med et ethylentilføringstrykk på 14 kg/cm<2> under poly-merisas jonen. Etter 3 timers polymerisasjon ved 70° C og 14 kg/cm ethylentrykk ble ytterligere 9,4 g (0,039 mol) benzoylperoxyd i 60 g (70 ml) ethylbenzen tilført gjennom katalysatortilførselsrør etterfulgt av vasking av dette inn-løp med 2 0 ml ethylbenzen. Omrøring under oppvarming ved 70° C og 14 kg/cm<2> ethylentilførsel ble fortsatt i ytterligere 14 timer for å fullføre polymerisasjonen. Etter endt forsøk ble reaktoren kjølt og ventilert, og innholdet besto av en ethylbenzenoppslemming av produktet ethylen/maleinsyreanhydrid (EMA) copolymer og en liten mengde av produkt EMA avsatt på omrører, kjølespiral og reaktoroverflaten. Denne oppslemming ble filtrert etter at den var kombinert med avsatte materiale som ble fjernet ved skraping, og omdannelsen av maleinsyreanhydrid ble bestemt på filtratet ved NaOH-titrering til et fenolfthalinendepunkt.

Den totale EDA produktopparbeidelse besto av filtrering, oppslemmingekstraksjon tre ganger (1 time hver) med 2 liter xylen ved romtemperatur etterfulgt av tre ekstrak-sjoner (1 time hver) med 2 liter hexan og til slutt filtrering. Filtrering ble utført mellom alle ekstraksjonstrinn. Det sluttelige EMA-produkt ble vakuumtørket over natten med fullstendig oljepumpevakuum ved 55 - 60° C. Det således tørkede EMA produkt ble pulverisert i en Waring-blander i 5 minutter for å redusere den mindre mengde av avsatt materiale til pulverkonsistens. Tabell I angir resultatene erholdt ved syv slike fortløpende EMA-polymerisasjoner.

Molekylvektparametere ble bestemt på EMA-produktet under anvendelse av fremstilling F som et typisk produkt. Materialet ble vakuumtørket i 24 timer ved 100° C under anvendelse av oljepumpevakuum. Parametre ble bestemt i tørr dimethylformamid (DMF). For fremstilling F ble antallsmidlere molekylvekt (Mn) bestemt som 852 under anvendelse av damptrykk-osmometri i DMF ved 120° C under anvendelse av et Knauer VP osmometer. Vektsmidlere molekylvekt (Mw) ble bestemt til 5730 under anvendelse av lavvinkel-laserlys-spredning, igjen i DMF, under anvendelse av et Chromatix KMX-6 instrument. Grenseviskositet i DMF ved 25° C ble målt ved kapillarviskometri under anvendelse av et Cannon Ubblehode fortynningsviskometer (størrelse 75) ved ekstrapolering av fire forskjellige konsentrasjoner til null-konsentrasjon. Grenseviskositeten for fremstilling F ble funnet å være 0,0607 dl/g.

Lignende bestemmelser av M , Mw og grenseviskositet ble foretatt på lignende måte under anvendelse av et EMA-preparat med høyere spesifikk viskositet (0,11, 1 %, DMF, 25° C). I dette tilfelle ble grenseviskositeten funnet å være 0,1227 dl/g, Mn var 2264 og Mw var 12 970.

Ved anvendelse av de ovenfor angitte verdier for to EMA-produkter med varierende spesifikk viskositet kunne K-og a-konstantene bestemmes i standardligningen, og forholdet mellom grenseviskositet ([ri]) til molekylvekt [ri] = KM<a> ble bestemt. De funne forhold var:

[n]^ = 4,71 x IO"<4> Mn °'72

og

r -iDMF ..-i -, n-5 „. 0,86

[ri]25o = 3,51 x 10 J 1^ u,OD

Uttrykket "midlere molekylvekt" som anvendt her

i forbindelse med de beskrevne copolymerer er definert til å være antallsmidlere molekylvekt.

Identifisering av funksjonelle grupper

Identifiseringen av de forskjellige funksjonelle grupper for alle de polymere derivateksempler, både kvalita-tivt og kvantitativt, ble utført ved infrarød analyse under anvendelse av et Beckman IR-12 spektrofotometer. Prøvefrem-stilling, absorpsjonsfrekvenstildelinger og prosedyrer for å bestemme forholdet mellom imidgrupper og amidgrupper ble foretatt som beskrevet i enten "The Infra-red Spectra of Complex Molecules", Bellamy, John Wiley and Sons, 1980, eller "Practical Infra-red SpectroscopyV, Cross, Butterworth, 1964. Prøvefremstilling - i alle tilfeller - ble utført med pressede skiver av 2 mg polymer pr. 250 mg tørt KBr-materiale med 70 mg blandet polymer/KBr pr. skive. Absorpsjonsbånd-stillinger er uttrykt i enheter av bølgetall som er uttrykt i reciproke centimeter (cm "*") , vanligvis kalt båndfrekvenser. ;For kvalitativ karakterisering ("fingerprinting") av produktsammensetning og nærvær eller fravær av visse grupper ble følgende båndfrekvenstildelinger anvendt: ;For kvantitativ bestemmelse av imid/amid-innholdet ;i en polymer inneholdende begge grupper, i tillegg til ammo-niumcarboxylatfunksjonen, ble forholdet mellom absorpsjons-intensiteten av det store imidbånd ved 1715 cm og det store primære amidbånd ved 1670 cm bestemt. Imidinnholdet ble bestemt ved å sammenligne det målte forhold mellom imid/amid og en standardkurve for prosent imid mot imid/amid absorp-sjonsforhold fremstilt fra en serie av infrarød-kurver erholdt ved å blande økende mengder av rent (ca. 100 %) imid (beskrevet i eksempel 5) med polymere inneholdende ikke noe imid eller uionisert COOH, men med bare amid-og ioniserte carboxyl(beskrevet i eksempel 2)grupper. ;For denne sistnevnte test på imid/amidforhold ble det tatt forsiktighetsregler for å sikre at uionisert carboxyl ikke var til stede ved 1715 cm ved først å oppløse prøven i vann, justere pH til 10,0 med ammoniumhydroxyd og frysetørke for å omdanne ethvert uionisert COOH til ammoniumcarboxylatet. Slike prosedyrer øker intensiteten av carboxylatbånd ved ;1560 og 1400 cm men sikrer at det gjenværende bånd ved 1715 cm virkelig er av imid-opprinnelse. ;I alle de etterfølgende eksempler hvor det refere-res til nærvær eller fravær av funksjonelle grupper og imidinnholdet i mid-inneholdende polymerer, er dette gjort på basis av nærvær eller fravær av de ovenfor angitte funksjonelle båndtildelinger og den ovenfor angitte metode for kvantitativ bestemmelse av imid/amid-bånd intensitetsforhold. ;Eksempel 2 ;Fremstilling av halvamid-halvammonium ;COO~ salt av EMA ( AEMA) ;Tidligere kjente metoder for ammoniering av EMA-polymerer (beskrevet i US patentskrift 3 157 595 og canadisk patent 664 326) ved én av tre metoder: (1) tørr ammoniering med ammoniakkgass ved vanlige temperaturer ved dynking av ammoniakk på kraftig omrørt tørt EMA-pulver, (2) dykking av ammoniakk i en omrørt oppslemming av EMA-pulver i benzen eller hexan, elle (3) ved direkte tilsetning av fast EMA-pulver til et omrørt overskudd av flytende ammoniakk for å ;gi halv-amid-halv-ammonium-carboxylatsaltet av EMA, hvilket er blitt funnet å være mangelfullt for foreliggende bruk. ;Denne mangelfullhet tilskrives en betydelig tids-diffusjonseffekt av ammoniakk inn i den indre kjerne av jevnt fint malt EMA-partikler. Selv med forlenget reaksjonstid inneholder alltid de således fremstilte amid-ammoniumsaltprodukter rest-mengder av uomsatt anhydrid, som når opp til 5 vekt%, som fastslått ved nærvær av anhydrid absorpsjonsbånd ved 1780 og 1850 cm ^ frekvenser. ;Den følgende foretrukne metode ble utviklet for å unngå lange reaksjonstider og dårlig temperaturregulering, under dannelse av produkter som ikke inneholdt noen anhydrid-funksjon. (a) 80 g EMA-polymer fra eksempel 1-F ble løst i 800 ml aceton (AR-kvalitet) og denne løsning ble tilsatt i løpet av en 20-minutters periode til en omrørt løsning av 100 ml flytende ammoniakk i 3 liter aceton ved -70° C (tørris-acetonbad). Etter 20 minutters tilsetningsperiode fikk den totale blanding gradvis oppvarmes til romtemperatur (4 timer) under hvilket tidsrom det utfelte produkt forandret farve fra en opprinnelig gul til en hvit farve. Produktet ble filtrert og deretter oppslemmet to ganger med 2 liter aceton etterfulgt av to oppslemminger med 1,5 liter 50/50 aceton/hexan. Alle oppslemmingstrinn foregikk i løpet av 3 0 minutter hver. Sluttproduktet ble filtrert og tørket over natten ved 45° C ved 20 - 25 mm Hg vakuum. Det tørkede produkt ble løst i 900 ml vann, filtrert gjennom et 0,45 um filter og fryse-tørket under dannelse av 98,7 g (100 % utbytte) av halv-amid-halv-ammonium carboxylatsalt. (b) Prosedyre (a) ble gjentatt under anvendelse av EMA-polymer fra eksempel 1-F men med vann tilsatt til den opprinnelige EMA-løsning i aceton. 60 g EMA ble løst i 500 ml aceton pluss 2,32 g vann, og løsningen ble kokt under til-bakeløpskjøling i 2 timer. Den avkjølte acetonløsning av EMA ble tilsatt under omrøring i løpet av 10 minutter til ;2 liter aceton inneholdende 3 mol flytende ammoniakk ved ;-60° C. Som før fikk reaksjonsoppslemmingen oppvarmes til romtemperatur og ble opparbeidet som ovenfor beskrevet med to oppslemminger i 1,5 liter aceton og én oppslemming med 1 liter hexan, ble filtrert og vakuumtørket ved 40° C, 20 - 25 mm Hg over natten. Det gjenvunne tørkede produkt besto av ;84 g hvilket er større enn 100 % utbytte. ;(c) Ved en tredje fremstilling ble det anvendt EMA-polymer fra eksempel 1-G. 100 g (0,714 mol) EMA ble kokt under tilbakeløpskjøling i 2 timer i 700 ml aceton inneholdende 3,85 g vann. Den avkjølte acetonløsning ble tilsatt i løpet av 10 minutter til en omrørt løsning av 3,3 liter aceton inneholdende 60 ml flytende ammoniakk ved -50° C. Etter 1 time ved -50° C fikk reaksjonsoppslemmingen oppvarmes til romtemperatur (2 timer). Det filtrerte produkt ble oppslemmet to ganger i 2 liter aceton (30 minutter hver) og to ganger i 2 liter hexan (30 minutter hver), ble filtrert og tør-ket over natten ved 50° C ved fullt oljepumpevakuum. Det ;gjenvundne tørre halv-amid-halv-ammonium carboxylatsalt veide 115,6 g, dvs. 93 % utbytte. ;Analyse av de ovenfor beskrevne tre fremstillinger er angitt i tabell II. ;Eksempel 3 ;Fremstilling av partielle imidderivater i xylen ;En 10 g's prøve av halvamid-halvammoniumcarboxylat-saltet ifølge eksempel 2a ble oppslemmet i 250 ml xylen i en 1 liters kolbe utstyrt med omrører, termometer, vannopptag-ningsfelle og et gassinnløpsrør for ammoniakk. Oppslemmingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i 12 timer mens en jevn strøm av ammoniakk gjennom gassinnløpsrøret ble opprettholdt. Prøver på produktoppslemmingen ble fjernet ved forskjellige tidspunkter (se tabell III) for å bestemme omdannelsen til imid i forhold til tiden. Hver liten prøve ble opparbeidet ved tre fortløpende oppslemminger i 100 ml hexan, filtrert og tørket ved 50° C, 20 - 25 mm Hg vakuum. pH på de 2 %-ige vandige løsninger ble målt både før og etter ytterligere opp-løsning i vann, pH-justering til 10,0 (NH^OH) og frysetørring. Infrarød spektrum ble tatt på alle prøver for å fastslå imid/ amid-forhold og således prosent imidinnhold. Resultatene er oppført i tabell III. ;;Et ytterligere sett av ni individuelle forsøk ble kjørt hvori halvamid-halvammonium carboxylatsalt ifølge eksempel 2-b ble anvendt. Hvert individuelt forsøk ble kokt under tilbakeløpskjøling i xylenoppslemming i den i tabell IV angitte tid og opparbeidet. De tørre produkter fra hexan-vaskingene ble individuelt oppløst i 15 0 ml vann, pH-justert til 10,0 med NH^OH, filtrert gjennom et 0,20 'Vim filter og direkte frysetørket i sterile serumflasker for in vivo dyreundersøkelse. Utbyttene og 'analysen av de forskjellige forsøk er beskrevet i tabell IV. vaskingene ble individuelt oppløst i 150 ml vann, pH-justert til 10,0 med NH^OH, filtrert gjennom et 0,20 um filter og direkte frysetørket i sterile serumflasker for in vivo dyreundersøkelse. Utbyttene og analysen av de forskjellige forsøk er beskrevet i tabell IV. ;Eksempel 4 ;Fremstilling av partielle imid- derlvater i toluen ;Partielle imider av halvamid-halvammoniumcarboxylat-salt av EMA-polymerer ble fremstilt hovedsakelig som beskrevet i eksempel 3 med unntak av at imiddannelsesgraden ble variert ved at man arbeidet ved toluentilbakeløp (110 C) i toluen-oppslemming i stedet for xylen som beskrevet i eksempel 3. ;Det anvendte EMA var fra eksempel 1-F og prosedyren for fremstilling av halvamid-halvammoniumsaltet var det samme som beskrevet i eksempel 2a uten tilsatt vann. Dette produkt viste stort IR-absorpsjonsbånd for primær amid, ionisert carboxyl og ammoniumcarboxylat uten spor av anhydrid eller imid. ;28 g av dette amid-ammoniumsalt ble oppslemmet i 1 liter toluen og oppvarmet til tilbakeløpskjøling. Tre prøver ble fjernet etter 2 timer, 3,5 timer og 5 timers tilbakeløps-kjøling (slutten av forsøk). Produktene ble isolert ved filtrering, 3 oppslemminger i 150 ml toluen og 3 oppslemminger i petroleumether og vakuumtørket, 25 mm Hg i 17 timer ved romtemperatur. De tørre produkter ble deretter løst i 100 ml vann, justert til pH 9,0 med NH^OH, filtrert gjennom et 0,20 mikrons filter og direkte frysetørket i sterile serumflasker for in vivo dyrebestemmelse. Resultatene er som følger: ;Eksempel 5 ;Fremstilling av full^ imid av EMA ;EMA spesifikk viskositet = 0, 061 ;Det fulle imid av EMA ble fremstilt ved kokning under tilbakeløpskjøling av 20 g av produktet fra eksempel 2a i 250 ml xylenoppslemming i 18,5 timer under konstant strøm av ammoniakk og ved å fjerne vann fra reaksjonen i en Dean Stark felle. Totalt 2,7 ml vann ble fjernet i fellen. Produktet ble filtrert, oppslemmet med hexan tre ganger og tør-ket over natten, 25 mm Hg i vakuum ved romtemperatur. Det tørre produkt veide 13,5 g, 84,3 % utbytte. ,3 g av produktet ble omrørt i 150 ml vann over natten, filtrert, vasket med vann og frysetørket. Produktet hadde et nitrogeninnhold på 9,53 % og en IR-avsøkning viste absorpsjonsbånd bare ved 1190, 1360, 1715 og 1770 cm 1 bølgenummer, typisk for imidgrupper. Ikke noe amid, anhydrid, ionisert carboxyl eller ammoniumcarboxylat absorpsjonsbånd var tydelig. ;Det ovenfor angitte fulle imidprodukt ble anvendt i forskjellige blandinger med halvamid-halvammonium-carboxylatsaltet inneholdende ikke noe imid fra eksempel 2a for å etab-lere en imid/amid-infrarød standard-kurve som tidligere beskrevet etter eksempel 1 som følger: De angitte mengder, veid analytisk, ble blandet i en rustfri stålblander under anvendelse av en Wigglebug blander. Infrarød avsøkninger ble foretatt på pressede skiver av de ovenfor angitte blandinger med tørr KBr under anvendelse av 2 mg polymerblanding til 250 mg KBr. Pelleten besto av 70 mg polymer/KBr blanding pr. skive. Den totale referansekurve ble konstruert fra følgende blandede sammensetninger: ;Eksempel 5- A ;Fremstilling av fullstendig imid av EMA ;EMA spesifikk viskositet = 0, 66' ;Det fullstendige imid av EMA med høyere molekylvekt enn det som ble anvendt i eksempel 5 ble fremstilt under anvendelse av EMA med spesifikk viskositet =0,66 (1 %, DMF, 25° C) svarende til en molekylvekt på 20-30 000. I dette tilfelle ble den ammonierte EMA fremstilt som beskrevet i eksempel 6 (a) ved spyling av tørr ammoniakkgass gjennom et omrørt pulver for EMA ved en temperatur under 70° C. Det resulterende halvamid-halvammonium-carboxylatsalt av EMA-pulver (spesifikk viskositet = 0,66) ble ytterligere oppvarmet til forhøyet temperatur for å omdanne halvamidet til imid ved å drive av vann. ;525 g av det EMA-avledede halvamid-halvammonium carboxylatsalt med spesifikk viskositet lik 0,66 ble kraftig omrørt i en 11,34 liters kjele utstyrt med en vannopptagnings-felle og under en kontinuerlig strøm av ammoniakkgass. Temperaturen ble hevet til 122° C hvor vann begynte å oppsamles i vannfellen. Etter 1 time nådde temperaturen 152° C og 24 ml vann var blitt fjernet. Oppvarming under omrøring og under ammoniakkstrøm ble fortsatt i 5 timer (totale 6 timer) og totalt 54 ml vann ble erholdt. Etter avkjøling var produktet et hvitt melaktig pulver. N% var 11,11 mot teoretisk lik 11,20. ;Dette høymolekylære EMA 100 % imid ble testet med hensyn til tumor vekst-inhibering ved et uavhengig testlaboratorium i 1958 og utviste ingen aktivitet (se eksempel 22). ;Eksempel 6 ;Fremstilling av halvamid-halvammonium COO- salt av EMA ved tidligere kjente metoder med eller uten vann ;(a) En 500 ml<1>s 4-halset kolbe ble utstyrt med teflonrører, termometer, gassinnløpsspyler og gassutløpsbob-ler. Ammoniakkgassen ble ført gjennom et strømningsmeter for å følge graden av strømning bare på kvalitativ basis. Til kolben ble tilsatt 25 g EMA fra eksempel ID og pulveret ble omrørt med en hastighet på 500 omdr. pr. minutt. Ammoniakk-innløpsstrømmen ble holdt ved en hastighet for å oppnå 70° C fra romtemperatur uten bruk av varmemantel. I løpet av 9 minutter hadde pulvertemperaturen nådd 70° C og ammoniakk-strømningen ble nedsatt for å opprettholde denne temperatur. En temperatur på 70° C ble opprettholdt i 1 time og 30 minutter, ved hvilket tidspunkt ammoniakkgassen ble avstengt og reaksjonsblandingen ble avkjølt under nitrogen. Utbyttet av ;tørt ammoniert EMA som halvamid-halvammonium-carboxylat var 30,8 g, 98,8 % utbytte. Nitrogenprosenten var 14,01, 14,18 og en 2 %-ig vandig løsning hadde en pH på 6,07. IR-avsøk-ninger indikerte absorpsjonsbånd for: ;(b) En annen ammoniering av EMA fra eksempel ID ble foretatt som i (a) med det unntak at EMA ble først behandlet med vann som beskrevet i det etterfølgende for å høyne reaksjonen med ammoniakk og nedsette anhydridkomponenten i produktet. 25 g EMA ble omrørt med 500 omdr./min ved 40° C (varmemantel) i 6 timer i nærvær av 0,53 g (17 mol%) vann som ble tilsatt dråpevis i løpet av de første 20 minutter fra en 1,0 ml sprøyte. Etter 6 timer ble pulveret avkjølt til romtemperatur og ammonieringen ble utført som beskrevet i (a), idet temperaturen fikk nå 70° C i løpet av 10 minutter. Den totale ammonieringstid ved 70° C var 1 time, og produktet ble avkjølt under nitrogen. Utbyttet var 31,4 g, 100,8 % utbytte, prosent nitrogen var 14,02, 13,94, og en 2 %-ig vandig løsning hadde en pH på 6,45. IR avsøkninger indikerte følgende absorpsjonsbånd: ;Eksempel 7 ;Karakterisering av produkter tidligere fremstilt hovedsakelig som beskrevet i eksempel 6 ;I løpet av tidsrommet fra juli 1956 til og med februar 1960 ble halvamid-halvammonium carboxylatsaltderiva-ter ved flere viskositetskvaliteter (forskjellige molekylvekter) av EMA fremstilt og vurdert. Viskositetskvalitetene, uttrykt i spesifikk viskositet ved 1,0 vekt% i DMF ved 25° C varierte fra 1,19, 0,60, 0,11 til 0,060. De tilsvarende ;beregnede molekylvektverdier (MR) var 50 000 - 60 000, ;20 000 - 30 000, 2000 - 3000 og 1000. De første tre, dvs. anvendelse av EMA på 0,11, 0,60 eller 1,19 ble ammoniert i et stort forsøksanlegg under dannelse av produktmengder på 272 - 363 kg. Den lavviskøse (0,060) EMA ble ammoniert i et mindre laboratorieanlegg under anvendelse av 200 - 300 g EMA. Prosedyrene er beskrevet i det etterfølgende, etterfulgt av produktkarakterisering erholdt på den tid. ;Forsøksanleggsprosedyre (for 1,19, 0,60 og 0,11 spesifikk viskositet, EMA): "Ammonierings"-karet som ble anvendt var en mantelforsynt rustfri stål Stokes rotasjonstørker, modell 59AB utstyrt med anordninger for å innføre tørr damp og vannfri ammoniakk over overflaten av innholdet, en omrører som virket ved 5,7 omdr./min og en rotasjonsventil for for-segling av bunnen og uttapping av sluttproduktet. "Fullt" volum av enheten var 1133 liter, "arbeids"-volumet var 765 liter og det mantelforsynte område var 5,85 m 2. I typisk for-søk ble ammonieringsanordningen lukket i bunnen og 2 27 - ;272 kg av EMA med egnet viskositet ble innført under omrøring. EMA ble oppvarmet til 55° C hvoretter den ble for-hydrolysert til en grad på 0,15 - 0,2 0 mol vann pr. mol EMA ved tilsetning av tørr damp i en hastighet på 0,007 kg damp pr. kg EMA over en 3 timers periode over overflaten av innholdet. Under denne periode ble temperaturen opprettholdt mellom 55 og 75° C ved anvendelse av kjølevann i mantelen. Vannfri gassformig ammoniakk ble deretter tilført reaktoren (over overflaten av den delvis hydrolyserte EMA) i en hastighet slik at temperaturen ble opprettholdt mellom 60 og 70° C (ca. 2,2 7 - 3,63 kg pr. time) inntil 2,0 mol ammoniakk pr. mol EMA var blitt tilsatt. Etter at all ammoniakk var blitt tilsatt ble produktet avkjølt til under 50° C og helt over i lagerbeholde-re. i ;Laboratorieprosedyre for EMA med spesifikk viskositet 0,06: Utgangs-EMA ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 1 med det unntak at reaktortilførselen besto av 267 g maleinsyreanhydrid, 2089 ml ethylbenzen, 45,8 ml n-butyraldehyd og 13,20 g benzoylperoxyd tilsatt alt i begynnelsen. Ethylentrykket ble holdt i 24 timer ved 14 kg/cm<2> ved 70° C. Utbyttet av omarbeidet EMA-produkt var 279, 73,3 % utbytte, og den spesifikke viskositet var 0,060 ved 1 % i DMF ved 25° C. Til en 5-liters 4-halset kolbe ble innført 249 g av fast pulverformet EMA med spesifikk viskositet 0,060 og denne ble kraftig omrørt i 6 timer ved 45 - 55°C etter dråpevis tilsetning av 5,3 g vann (15 mol% basert på EMA) for å bevirke partiell hydrolyse. Ammonieringen ble startet ved anvendelse av tørr vannfri ammoniakkgass spylt i den kraftig omrørte faste EMA-pulver' og temperaturen ble holdt ved 31 - 32° C i 18 timer. Under denne periode fant det sted et langsomt men jevnt opptak av ammoniakk. Sluttproduktet veide 320 g, 103,3 % utbytte. ;Produktkarakterisering for alle de ovenfor beskrevne produkter er angitt i etterfølgende tabell V. ;Prøver av halvamid-halvammonium carboxylatsaltene av EMA fremstilt i 1957 - 1960 og karakterisert ved det tidspunkt som angitt i tabell V ble lagret i glasskrukker med vanlige skrulokk (ikke under nitrogen eller forseglet på noen måte) inntil tidlig 1977 i et vanlig lager. Ved dette tidspunkt (1977) ble de fjernet for fortsatt bestemmelse (se eksempel 9 og 10). Før anvendelser ble materialene karakterisert på nytt med de resultater som er vist i tabell ;VI. ;Det er klart at polymerproduktene testet 1959 - 1960 (eksempel 8) som ikke inneholdt noe imid ved den tid, hadde tapt både ammoniakk og vann og var derved omdannet til imid-holdige polymerprodukter under den lange lagringsperio-den. Disse omdannede produkter som nylig testet i eksempel 8 og 9 ga uventet forskjellige resultater sammenlignet med de tidligere resultater. ;Produktvurderinqseksempler 8 - 21- ;Eksempel 8 ;Tre molekylvektversjoner av EMA halvamid-halv-^ ammonium-carboxylatderivater (inneholdende ikke noen imidgruppe) som identifisert i eksempel 7-V-A, B og C ble vurdert ved et uavhengig testlaboratorium i løpet av 1959 og 1960 under anvendelse av offisielle prosedyrer for faste Sarcoma-180 transplantater som spesifisert ved Cancer Chemo-therapy National Service Center (CCNSC) og erholdt fra National Institutes of Health. Prosedyren tillot to dødsfall av 6 dyr som en toksisk grense. T/C-prøveforhold ble beregnet som forholdet mellom midlere tumorvekt i behandlede dyr og midlere tumorvekt av kontrolldyr. T/C-verdiene ble beregnet for en serie av tre forsøk hvis foregående forsøk oppfylte grensene. Materialet var akseptabelt hvis (T/C)-^ x (T/C)2 x (T/C)3 er mindre enn 0,08 etter sluttforsøket. For-søk ble fortsatt hvis (T/C)-^ var mindre enn 0,54, og hvis (T/C..)-^ x (T/C) 2 var mindre enn 0,20. De anvendte dyr var Swiss-mus (CCNSC, spesifikasjon XIV), administreringsmåten var IP (spesifikasjon III) og dosebestemmelse foretatt ved spesifikasjon XII. ;De erholdte data er oppført i tabell VII. ;Det ble konkludert med at selv om toksisiteten ble forbedret ettersom molekylvekten ble mindre, gikk aktiviteten tapt ettersom størrelsen avtok mot den inaktive monomere del for denne serie av derivater. Ingen lignende derivater inneholdende den partielle imidfunksjon ble fremstilt eller vurdert ved CCNSC-prosedyrer, og heller ikke andre prosedyrer ved dette tidsrom (1959 - 1960). Alle tre polymerer (A, B og C) ble avvist når de ble vurdert ved CCNSC-prosedyrer overfor Carcinoma 755 og Leukemia 1210. ;Eksempel 9 ;De polymere materialene (A, B, C) som beskrevet i eksempel 7, tabell VI, fremstilt fra tre forskjellige EMA-råmaterialer med forskjellig spesifikk viskositet og således tre vidt varierende molekylvekter, ble administrert til BALB/c-mus under anvendelse av tre doseringsplaner, (a) før vdaj -9 og -1) eller (b) etter (dag 1 og 9) tumor-inokula-sjon mod SV40 overførte (betegnet som mKSA-TU5) tumorceller, eller (c) både før (dag -9 og -1) og etter (dag 1 og 9) tumorutfordring. Forbindelsen ble administrert intraperito-nalt (IP) ved tre doser av 62,5, 125,0 og 250,0 mg/kg. Tumor:celler ble inokulert ved 1 x 10 4 celler subcutant (SC) ;i en gruppe av dyr og ved 1 x 10 3 subcutant i en annen gruppe av dyrene. Veksten av tumor i de behandlede mus mot normale ikke-behandlede kontrollmus ble deretter vurdert. Dataene er oppført i tabell VIII-, VIII-B og VIII-D. Fra tabell VIII-A ved anvendelse av polymere fra eksempel 7-Tabell VI-A og under anvendelse av doseringsplan (a), forble 48 % (17/36) av tumorutfordrede mus friske og fri for tumor gjennom den 8 dagers lange observasjonsperiode. På dag 61 ble dyr som er fri for tumor på nytt utfordret med levedyktige tumorceller (mKSA-TU5 ved 1 x IO<4> SC) og 82 % (14/17) forble tumorfri (dvs. immune) ved den 37. dag etter utfordring. ;Ved anvendelse av doseringsplan (b) hvor polymer 7 Tabell VI-A ble gitt etter tumorutfordring, forble 42 % ;(15/36) resistente overfor tumor etter 58 dagers observasjon. Etter utfordring på nytt (dag 61) med 1 x IO<4> levedyktige tumorceller forble 80 % (12/15) tumorfri 3 7 dager etter utfordringen. ;Dyr tilhørende doseringsplan (c) hvori polymer 7 - Tabell VI-A ble administrert både før og etter tumorutfordring var 28 % resistente (10/36) ved dag 58 og alle disse tumor-fri dyr var immune overfor den sekundære tumor-utf ordring. ;;Polymer fra eksempel 7, Tabell VI-B, ble testet bare i mus inokulert med 1 x 10 4 levedyktige mKSA-TU5-celler (SC) (Se tabell VIII-B). Ved anvendelse av doseringsplan (a) forble 22 % (4/18) av musene tumorfri gjennom 51 dagers observasjon. Med plan (b) forble 22 % (4/18) av de tumorutfordrede mus likeledes fri for tumor etter 51 dager. I gruppe (c) forble bare 2/18 (11 %) tumorfri i 51 dager. På dag 54 ble alle de tumorfri mus (10/5<*>4) på nytt utfordret med 1 x 10 4 levedyktige mKSA-TU5-celler SC, og etter 37 dager forble alle 10 tumorfri (dvs. immune) overfor tumorreutfor-dring.

Polymer fra eksempel 7, Tabell VI-D,ble testet ved to tumorutfordringskonsentrasjoner som med polymer 7-VI-A ovenfor (se tabell VIII-D). Da denne har meget høyere molekylvekt enn polyme re fra eksempel 7A eller 7B, var dosen for polymeren 7D (IP) 75, 50 og 25 mg/kg.som angitt. Med behandlingsplan (a) forble 11 % (4/36) av de tumorutfordrede mus tumorfri etter 36 dagers observasjon. Av disse forble 75 %

(3/4) tumorfri etter 3 7 dagers sekundær tumorutfordring. I plan (b) forble 8 % (3/36) tumorfri etter 36 dagers primær tumorutfordring og bare én av disse var immune overfor sekundær tumorutfordring. I plan (c) hvor polymer 7-VI-D ble gitt både før og etter tumor, forble 14 % (5/36) tumorfri i 36 dager og 4 av disse 5 (80 %) var immune overfor sekundær tumorutfordring.

Det totale antall tumorfrie dyr i tabell VIII A, B og D ved slutten av de respektive observasjonsperioder kunne deles i to grupper, (a) de som var tumorfri gjennom observasjonsperioden, og (b) de som utviklet målbare tumorer under observasjonsperioden og som deretter gikk tilbake og forsvant før slutten av observasjonsperioden.

En analyse av tilbakegående tumorer mot de som forble tumorfri uten regresjon indikerte både en avhengighet av tumorbelastning og av den anvendte polymer. Analyseresulta-tet for tilbakegående tumorer fra det totale antall av tumor-fri dyr er vist i tabell VIII-E.

Eksempel 10

Polymermaterialet fra eksempel 7-VI-A ble testet på nytt som beskrevet i eksempel 9 med det unntak at 10 mus ble anvendt pr. testgruppe og bare behandlingsplanene (a) og (b) ble anvendt. Dataene er oppført i tabell IX.

Under anvendelse av doseringsplan (a) hvor polymeren ble gitt på dag 9 og dag 1 før tumorutfordring, forble 3 7 %

(22/60) av de tumorutforedede mus tumorfri gjennom en 61 dagers observasjonsperiode. På dag 62 ble 21 av de tumorfri dyr utfordret på nytt med 1 x IO<4> mKSA-TU5-tumorceller (SC) og etter ytterligere 30 dager var 90 % (19/21) av musene tumorfri (immune).

I den andre doseringsplan (b) hvor polymeren ble gitt på dag 1 og 9 etter tumorutfordring forble 47 % (28/60) av musene tumorfri gjennom den 61 dags lange observasjonsperiode. Av de 28 tumorfri mus (ved 61 dager), forble 64 %

(18/28) immune i 30 ytterligere dager etter sekundær utfordring med tumor.

Eksempel 11

Polymermaterialet fra eksempel 6a, fast EMA ammoniert med gass uten tilsatt vann, ble administrert til BALB/c-mus under anvendelse av de dosekonsentrasjoner og behandlingsplaner som beskrevet i eksempel 10 med 10 mus pr. testgruppe. De erholdte data etter en 61 dagers observasjonsperiode er oppført i tabell 10. Ved anvendelse(av behandlingsplan (a) hvor polymer 6a ble gitt på dag 9 og dag 1 før tumorutfordring med mKSA-TU5-tumorceller forble 40 % (24/60) av musene tumorfri etter 61 dager.

Ved anvendelse av behandlingsplan (b) hvor polymeren 6a ble gitt på dag 1 og dag 9 etter tumorinokulasjon forble 32 % (19/60) av de tumorutfordrede mus tumorfri etter 61 dager. Av totalt 43 tumorfri mus fra gruppe (a) pluss (b) etter 61 dager forble 36 eller 87 % immune overfor sekundær levedyktig tumorutfordring (1 x 10 4 celler) i en periode på 30 dager.

Eksempel 12

Polymermaterialet ifølge eksempel 6b, fast EMA ammoniert med gass og tilsatt vann, ble administrert til BALB/c-mus under anvendelse av de dosekonsentrasjoner og behandlingsplaner som er beskrevet i eksempel 10 med 10 mus pr. testgruppe. De erholdte data etter 61 dagers observasjon er oppført i tabell XI. Med behandlingsplan (a) hvor polymer 6b ble gitt på dag 9 og dag 1 før tumorutfordring med mKSA-TU5-tumorceller forble 30 % (18/60) av musene tumor-fri etter 61 dager. Med behandlingsplan (b) hvor polymeren 6b ble gitt på dag 1 og dag 9 etter tumorinokulasjon forble 17 % (10/60) av de tumorutforedede mus tumorfri etter 61 dager. Av de totale 28 tumorfri mus fra gruppe (a) pluss (b) etter 61 dager, forble 23 eller 82 % tumorfri i ytterligere 30 dager etter en sekundær utfordring av 1 x IO<4> tumorceller.

Eksempel 13

Den vurdering som er bdskrevet i eksempel 9-12 ble utvidet til et andre tumormodellsystem som var et trans-plantabelt 3-methyl-cholanthren-indusert blære- karsinom. på Fischer ^344) rotter. Når denne tumor transplanteres i normale Fischer-rotter, vokser den ved det primære sted og sprer seg spontant i lungene. Envidere observeres alltid tilbakevendende cancer etter kirurgisk fjerning av primær-turnoren.

Den første undersøkelse var beregnet på å fastslå effekten av polymer fra eksempel 7-VI-A når det gjelder overlevelse av rotter som har tumor og forbindelsens evne til å forhindre dannelse av metastaser.

Fischer-rotter som veier ca. 250 g hver, ble subcutant implantert med en 2 x 2 mm seksjon av tumor. 5, 12 og 18 dager etter tumorimplantasjonen ble de tumorbærende rotter behandlet med polymer i en dose på 62 mg/kg ved injeksjon inn i det peritoneale hulrom. Totalt 6 dyr ble behandlet på denne måte. 4 dyr med implantert tumor ble ikke behandlet og tjente som kontrolldyr. Alle kontrolldyrene døde innen 3 uker eller gjennomsnittlig 15 dager etter tumorimplantasjonen. 2 av de behandlede dyr døde etter 37 dager. De 4 gjenværende dyr ble avlivet ved dag 42 etter implantasjonen. Groveksaminasjon viste at de hadde betydelig primær tumorvekst men ingen metastaser i lungene.

Eksempel 14

En annen undersøkelse ble utført for å gjenta eksempel 13 og fastslår effekten av en lavere dose og redusert hyppighet ved behandlingen. Fischer-rotter mottok samme type tumorimplantat og 8 dager etter implantasjonen ble de tumorbærende rotter behandlet med polymer fra eksempel 7-VI-A med 65 mg/kg eller 30 mg/kg ved en I.P. injeksjon (4 rotter i hver gruppe). 16 dager etter implantasjonen fikk gruppen som mottok den laveste dose en"booster" på 30 mg/kg. Overlevelse ble observert over en 6 ukers periode. Etter 6 uker ble de overlevende dyr undersøkt med hensyn til nærvær av metastatisk sykdom i lungene. 5 dyr med implantert tumor forble ubehandlet som kontrolldyr. Alle kontrolldyrene døde av sykdom og hadde gjennomsnittlig 23 dagers overlevelse etter tumorimplantasjonen. Gruppen på 4 dyr med en enkelt dose på 65 mg/kg legemiddel var i live i 40 dager og ble deretter avlivet. Undersøkelse fastslo ingen metastaser. Av gruppen som mottok en 30 mg/kg"booster" på dag 16 døde to dag 35 og 36 og de gjenværende to ble avlivet på dag 40. Igjen fastslo undersøkelse ingen tegn på metastaser. Forlenget overlevelse i forhold til kontrolldyrene i begge de behandlede grupper var selvsagt fastslått.

Eksempel 15

En tredje undersøkelse ble utført for å vurdere evnen til polymeren fra eksempel 7-VI-A til å forhindre tumor-tilbakedannelse i Fischer-rotter hvis primærtumor var blitt kirurgisk fjernet. Fischer-rotter mottok en trochar-implantasjon av en 2 x 2 mm seksjon av tumor som beskrevet i eksempel 13 og 14. Tumoren fikk deretter vokse til en diameter på 2-3 cm. Ved denne tilstand (8 dager etter implantasjonen) ble tumoren fjernet kirurgisk og samtidig ble rotten behandlet med en enkel dose av polymer ved 65 mg/kg eller 30 mg/kg ved en I.P. injeksjon i to grupper, hver inneholdende fire rotter. Overlevelse-og tumor-tilbakedannelse ble observert i en 7 ukers periode. Av gruppen som mottok 30 mg/kg polymer ved tumor reseksjon, var alle fire i live etter 4 7 dager uten noe tegn på tumor-tilbakedanrielse. Av gruppen som mottok 65 mg/kg som en enkel dose ved reseksjonstiden, døde én på dag 16 etter tumor-tilbakedannelse, mens de andre tre var i live ved dag 47 uten noen tegn på tumor-tilbakedannelse.

Eksempel 16

En andre undersøkelse over forhindring av tumor-tilbakedannelse ble foretatt på Fischer-rotter lik den som er beskrevet i eksempel 15 med det unntak at tre polymerer med forskjellig imidinnhold ble anvendt. Imidkonsentrasjonene var null, 5 og 21,7 %.' I denne undersøkelse ble trochar-implantasjon av tumor foretatt som beskrevet i eksempel 13, 14 og 15. Bortskjæring av alle tumorer ble foretatt 14 dager etter implantasjonen.

En gruppe av fire rotter ble anvendt som kontrolldyr og mottok ingen beahndling ved bortskjæringstidspunktet. Tumor-tilbakedannelse var 100 % på dag 21, 33, 40 og 44 etter bortskjæring, med en midlere tilbakedannelsestid på 34 dager. Av denne kontrollgruppe døde to rotter på dag 4 4 og to var i live og ble avlivet ved dette tidspunkt. Alle fire ble funnet å ha tegn på metastaser.

En andre gruppe på fem rotter mottok en enkelt I.P. dose på 30 mg/kg av polymeren fra eksempel 2a (null % imid) ved tidspunktet for tumorreseksjon. Av denne gruppe ble det igjen dannet tumor i to rotter på dag 33 etter reseksjon og i en tredje på dag 40. Etter 55 dager hadde 3 av 5 rotter (60 %) tumor-tilbakedannelse. En tredje gruppe på 6 rotter mottok én enkel I.P. dose på 30 mg/kg av polymeren fra eksempel 3, tabell IV-1, inneholdende 5 % imidgrupper, ved tidspunket for tumor-reseksjon. Ikke noe tumor tilbakedannelse ble observert i noen dyr i løpet av 55 dager. På dag 55 døde to av disse rotter (uten tumor) og ved undersøkelse ble det ikke funnet noen tegn på metastaser.

En fjerde gruppe på 6 rotter mottok en enkelt I.P. dose på 30 mg/kg av polymeren fra eksempel 7, tabell VI-A, inneholdende 21,7 % imid, ved tidspunktet for tumorreseksjon. I denne gruppe hadde ett dyr tumor-tilbakedannelse ved dag 21 og en annen på dag 43. Alle var i live etter 55 dager. Således ble det bare konstatert tilbakedannelse i to av seks tilfeller, dvs. et gjennomsnitt på 33 %.

Eksempel 17

Dyreforsøk som beskrevet i eksempel 13 til og med 16 gjorde bruk av polymere dosert ved injeksjon i det peri-tonale hulrom. Dette eksempel illustrerer anvendelsen av et imid-holdig materiale som administreres oralt ved tumor-reseksjon for å forhindre eller retardere tumor-tilbakedannelse. I eksempel 16 ble det observert at kontrolldyr som ikke mottok noe legemiddel ved tumorreseksjonen utviste en midlere' tid for tumor-tilbakedannelse på 34 dager.

I dette eksempel mottok en gruppe på 10 Fischer-rotter trochar-implantasjon av tumor som beskrevet i eksempel 13. De utviklede tumorer ble fjernet kirurgisk på dag 13 etter implantasjon og samtidig ble hver rotte oralt inkubert med 1 ml sterilt vann inneholdende. 30 mg/kg av den imid-holdige polymer ifølge eksempel 7, tabell VI-A (21,7 % imid). Tumor-tilbakedannelse ble deretter observert over en 10 ukers periode. Én rotte døde ved fjerning av tumoren. Av de gjenværende 9 rotter ble liten tumor-tilbakedannelse observert i 7 dyr ved dag 42, 42, 42, 43, 46, 50 og 59 etter tumor-bortskjæring. To rotter var fri for tumor-tilbakedannelse etter

70 dager.

Eksempel 18

Formålet med dette forsøk er å bestemme hvorvidt en eksponering av tumorceller overfor polymer fra eksempel 7-VI-A påvirker deres antigenisitet og/eller hadde en direkte cytotoksisk effekt på tumorcellene.

Tumorceller ble fremstilt fra den BLCa-tumor som er beskrevet i eksempel 13 ved å skjære ut en subcutan tumormasse. Cellene ble deretter bragt i suspensjon ved å rive cellene ut av tumoren med ytterligere forsiktig trypsinering av tumor-stykkene. De separerte celler ble vasket tre ganger i en balansert saltløsning (BSS) og tellet for å bestemme forholdet mellom levende og døde celler. En 90-95 % cellepopula-sjon ble erholdt ved dette punkt.

Tumorceller i en konsentrasjon på 1 x 10 5 celler pr. ml i "Eagles minimal essential media" i "Earl's BSS" pluss 10 % kalvefosterserum ble inkubert med 30 mg/ml av polymer fra eksempel 7-VI-A. Inkuberingen ble utført ved 37° C i 90 minutter hvoretter cellene ble bragt ut av suspensjonen ved sentrifugering ved 300 x gi 6 minutter. Cellene ble igjen undersøkt med hensyn til levedyktighet som ikke var blitt forandret fra tilstanden før inkuberingen. Prosedyren ble gjentatt på tre separate tilfeller.

Celler fra dette forsøk ble injisert subcutant i Fischer-hanrotter i en dose på 1 x 10^ celler. Fem dyr ble injisert med polymerbehandlede celler og sammenlignet med fem dyr som mottok tumorceller behandlet som ovenfor angitt men uten tilsatt polymer. Resultatene er oppført i tabell

XII.

Det var ikke noen forskjell mellom disse dyr ved tumorfremkallingen. Envidere var vekstmønsteret for tumoren etter dette sammenlignbart mellom de to grupper. Konklusjo-nen fra disse forsøk er at ved den anvendte dose vil polymeren fra eksempel 7-Tabell VI-A (21,7% imid) ikke ha noen direkte cytotoksisk effekt på BLCa tumorceller. I tillegg bevirket preinkubering av polymeren med tumorcellen ingen forandring av antigenisiteten av tumorcellene.

Eksempel 19

Den direkte toksisitet av den imid-holdige polymer fra eksempel 7-VI-A ble bestemt på normale Fischer-hanrotter. Både I.P. og I.V. injeksjon av polymer besto av tilnærmet

1 ml fysiologisk saltvann inneholdende den egnede mengde av polymeren. For å bestemme toksisitet, ble polymer gitt i doser på 100 mg/kg med økende intervaller på 100 mg/kg opp til 1000 mg/kg til fem dyr i hver doseringsgruppe. Polymer ble administrert både intraperitonealt og intravenøst. Ingen toksisitet eller dødsfall ble observert med dyr under anvendelse av den intraperitoneale administreringsmåte opp til 30 dagers observasjonstid på totalt 50 rotter. Toksisitet ble imidlertid observert, når polymeren ble gitt i doser på 800 mg/kg (I.V.) og over. Én av fem dyr ved 800 mg/kg, to av fem dyr ved 900 mg/kg og fire av fem dyr ved 1000 mg/kg syntes å utvikle kramper ved intravenøs administrering av polymeren og døde. Ingen toksisitet eller dødsfall ble observert i dyr som mottok I.V.-doser på 7 00 mg/kg eller mindre over den 3 0 dagers observasjonsperiode (35 dyr).

Etter den 30 dagers lange observasjonsperiode ble de 85 overlevende rotter avlivet og hjerne, lunge, hjerte, lever, nyre og milt fra hver rotte ble underkastet groveksaminasjon og mikroskopisk patologi. Ingen legemiddel tilknyttede unormaliteter ble observert i noen av disse organvev.

I en annen undersøkelse ble toksisiteten av den ovenfor angitte polymer administrert I.P., sammenlignet med denne administrerte oralt. Polymeren fra eksempel 7-VI-A ble administrert ved doser på 100 mg/kg, 500 mg/kg og 1000 mg/kg enten ved injeksjon (I.P.) eller via sonde (P.O.) til hver av fem Fischer-rotter pr. doseringsgruppe. Rottene ble observert i 14 dager og ikke noe dødsfall eller toksiske utslag oppsto. Etter 14 dager ble alle dyrene avlivet, både fra I.P. og

P.O. legemiddeladministrering, og hjerne, lunge, hjerte, lever, nyre og milt fra hvert dyr ble underkastet grov- og mikroskopisk patologi. Igjen ble det ikke funnet noen unormaliteter i noe av organvevet.

Eksempel 20

Polymere ifølge oppfinnelsen som beskrevet i eksempel 3 og 4 ble vurdert i normale Lewis-rotter for deres evne til å stimulere immunresponser uttrykt ved økende 19-S (IgM) antistoff-produserende celler til heterologe erythrocyter (røde blodceller fra sauer, SRBC) ved standard Jerne plakk-prøvningsmetode. Se: "Textbook of Immunology", J.T. Barrettå CV. Mosby Company, 1978 og "Immunology", H.N. Eisen, Medical Department, Harper and Row Publishers Inc., 1974. I en typisk test immuniseres et dyr, i dette tilfelle Lewis-rotter, med 1 ml av en 1:5 fortynning av vasket SRBC i fysiologisk saltvann via halevev. Samtidig gies dyrene I.P. injeksjoner av den angitte polymer i 1 ml fysiologisk saltvann. Etter 4 dager anbringes miltceller fra de immuniserte dyr i et agarose vevdyrkningssystem med SRBC. Vevkulturmediet under-støtter veksten og utskillelse av antistoff av de antistoff-syntetiserende celler. Disse antistoffer diffunderer fra de opprinnelige celler og festes til nabo-erythrocytene. Serum-komplement (normalt marsvin-serum) tilsettes som aktiverer lysen av de RBC-er som er ;blitt dekket med antistoff, slik at det dannes et klart område eller plakk rundt den antistoff-dannende celle. Slike plakker (PFC) telles og uttrykkes som antall PFC pr. 1 x 10^ miltceller. Resultatene er oppført i tabell XIII. Alle polymermaterialene i tabell XIII ble testet ved 30 mg/kg.

Eksempel 2O- A

I et ytterligere sett av forsøk ble effektene av polymer fra eksempel 7, Tabell VI-A, på IgM-antistoff-respons overfor SRBC-antigen (igjen under anvendelse av Jerne plakk-metoden som beskrevet i eksempel 20 vurdert (1) i normale Lewis-rotter med polymer gitt enten I.P. eller oralt, og

(2) i Lewis-rotter som en erstatning for thymusfunksjon, igjen med polymer gitt enten I.P. eller oralt. I tilfelle

Cl) gikk man frem som beskrevet i eksempel 20. I tilfelle

(2) ble den normale thymusfunksjon fjernet ved thymectomi-(Tx) på voksne dyr, hvilket ble utført kirurgisk i en alder på 8 - 12 uker og høye doser av total kroppsbestråling (TBI) etterfulgt av benmargcelle-repopulasjon (BM). Thymectomi, total kroppsbestråling og benmargcelle-repopulasjon ble alle foretatt etter standardprosedyrer beskrevet av Falk, R.E.

et al, Surgery, Oktober 1978, av Falk, R.E. et al., Abstract, Canadian Society for Clinical Investigation, Jan. 24-27, 1978, Vancouver and av Falk, R.E. et al., Abstract, Royal College of Physicians and Surgeons, Jan. 25-28, 1978, Vancouver.

I disse prosedyrer ble TBI og BM repopulasjon foretatt dagen etter kirurgisk thymectomi. For TBI ble dyrene bestrålet under anvendelse av en 137cesiumkilde (Atomic Energy of Canada). Dosen av bestråling i denne maskin kali-breres av tilførselsanordningen og påføres på en rimelig måte over hele kroppsoverflaten av dyrene plasert i beholderen. For BM repopulasjon, ble enkelcelle suspensjoner av benmarg-celler fremstilt ved vasking av de lange ben i låret og skinn-ben hos rotten med en balansert saltløsning (BSS) ved 4° C. Cellene ble vasket tre ganger i BSS og tellet i et hemocyto-meter for å bestemme levedyktigheten og den hensiktsmessige cellefortynning. Celler ble administrert I.V. under anvendelse av preparater med en levedyktighet større enn 90 %.

Til hver rotte BM repopulasjon ble det innbefattet 1 x 10g celler.

Mortalitetsgraden av dyr for den totale Tx + TBI + BM prosedyre var mindre enn 10 %. Disse dyr fikk deretter komme seg i en periode på 5 uker før forsøk med IgM antistoff-respons overfor SRBC.

Etter oppbygningsperioden ble polymeren fra eksempel It Tabell VI-A,og SRBC administrert som i eksempel 20. Resultatene fra det totale forsøk er vist i Tabell XIII-A.

Eksempel 21

Ni polymerer med varierende imidinnhold (0 til 35%) og identisk med mange av de som er beskrevet i eksempel 20, Tabell XIII, ble vurdert i Fischer-rotter for sammenlignbar yteevne som en funksjon av prosent imid ved å forhindre tilbakedannelse av primær BLCa-tumor etter tumorfjerning. Det ble anvendt samme forsøksprosedyre som beskrevet i eksempel 15, 16 og 17 med det unntak at i dette tilfelle ble det anvendt 10 rotter for alle doseringsgrupper og kontroll-grupper og de varierende imidmaterialer ble dosert både ved 30 mg/kg og 15 mg/kg ved I.P.-injeksjon i 1 ml fysiologisk saltvann. Kontrolldyrene mottok bare 1 ml saltvann I.P.

En 10 dyrs gruppe ble gitt 30 mg/kg oralt av polymer fra eksempel 7-VI-A (21,7 % imid) som angitt. Alle tumorer ble fjernet kirurgisk 11 dager etter trochar implantasjon og legemidler ble administrert i enkle doser som ovenfor angitt på dag 1 etter tumor-fjerning. Resultatene er oppført i Tabell XIV. Av interesse er at de gjennomsnittlige dager for tumor-tilbakedannelse for 10 kontroller var 32,3 som stemmer godt overens med gjennomsnittet for kontrolldyr på 34 dager (4 rotter) som beskrevet i eksempel 16.

Eksempel 22

EMA med 100 % imid (spesifikk viskositet = 0,66) fra Eksempel 5-A ble vurdert med hensyn til tumorvekstinhi-bering ved et uavhengig test-laboratorium under anvendelse av følgende prosedyre.

Fast Sarcoma 180 ble implantert ved trocar (2 mm diameter) inn i siden på swiss hanmus. Polymeren fra eksempel 5-A! ble administrert ved I.P. injeksjon ved den angitte dose i 0,5 ml fysiologisk saltvann på seks fortløpende dager, startende med dag 1 etter tumor-implantasjon. Grupper på 5 mus mottok 25, 50 og 100 mg/kg dose som beskrevet. Høyere doser; 200, 400 og 800 mg/kg viste seg å være toksisk som indikert. Dagen etter den siste I.P. injeksjon ble dyrene avlivet og tumor fjernet ved disseksjon og veiet. Tumor— inhibering ble beregnet som prosent av tumorvekt for behandlet dyr dividert med tumorvekt for kontrolldyr. Resultatene er vist i Tabell XV som indikerer at EMA med 100 % imid ikke utviser noen aktivitet.

Eksempel 23

En foretrukket polymer fremstilt ifølge'oppfinnelsen ble vurdert i normale Lewis-hannrotter for mulig aktivitet når det gjelder å øke antallet av peritoneale makrofager, og deres aktivitet når det gjelder å fagocytere polystyren latexpartikler som er blitt demonstrert for et utall immunsystem-modulatorer slik som Bacillus Calmette-Guerin (BCG), pyran-copolymer og andre slike midler.

Fire grupper på seks unge fullvoksne (2-4 måneder gamle) normale Lewis-hannrotter ble administrert legemiddel eller fysiologisk saltvann (kontrolldyr) som følger. Gruppe-

1 mottok en ml fysiologisk saltvann gitt I.P.} gruppe -2

mottok polymeren ifølge eksempel 7, Tabell VI-A, ved 30 mg/kg i 1 ml fysiologisk saltvann gitt I.P.; gruppe- 3 mottok polymeren ifølge eksempel 7, Tabell VI-A,ved 3 0 mg/kg i 1 ml fysiologisk saltvann gitt oralt, og gruppe -4 mottok 0,1 mg BCG i 1 ml fysiologisk saltvann gitt I.P.

På dagene 1, 3 og 5 etter administreringen ble to

av hver av de fire grupper avlivet og bukhuleceller ble oppsamlet. Oppsamlingen innbefattet følgende prosedyre. 10 0 ml avkjølt RPMI 1640 media ble injisert I.P. og etter forsiktig massasje ble den totale bukhulevæske drenert og cellene fra hver enkel bukhule ble separert ved sentrifugering ved 1000

omr. pr. min. Disse celler ble "farget med NSE ^fargestoff (ikke-spesifikk esterase) og vasket tre ganger med avkjølt (4° C) medium. Til slutt ble cellene fra hvert enkelt hulrom suspendert i 10

ml medium og tellet ved å fastslå midlere antall av celler bestående av 80 - 95 % macrofager erholdt fra hver bukhule som en funksjon av den ovenfor angitte behandlingsgruppetype og tid (dager) etter behandling.

Latex-partikkel-fagocytoseaktivitet av hvert sett

av bukhuleceller ble bestemt som følger. En suspensjon av de ovenfor angitte celler ble fremstilt i en konsentrasjon på 40 - 50 millioner celler pr. ml 50 % kalvefosterserum pluss RPMI medium i et 5 ml's rør. Til suspensjonen ble tilsatt 100 lamda polystyren-latex (10 % faststoff, partikkel-diameter lik én micron),

og blandingen ble inkubert i 1 time ved 37° C.

Celle ble deretter sentrifugert, vasket tre ganger med RPMI medium og til slutt resuspendert i 0,5 ml fysiologisk saltvann. Objektglass med cellesuspensjoner ble fremstilt og undersøkt mikroskopisk for å bestemme graden av latexpartikkel-fagocytose i makrofagcellen. De celler som inneholdt 10 eller flere latexpartikler ble betraktet som positive og det totale antall av slike celler (de inneholdende 10 eller flere latexpartikler) uttrykt som prosent av det totale antall celler i suspensjonen.

Dataene fra disse forsøk er vist i Tabell XVI for duplikatforsøk.

Dataene i Tabell XVI viser at den foretrukne polymer fremstilt ifølge oppfinnelsen ikke øker antall peritoneale makrofager i forhold til kontrollverdier når den administreres enten I.P. eller oralt, og videre vil latex-fagocytoseaktivi-teten av slike peritoneale makrofager ikke økes i forhold til normal makrofagaktivitet. I motsetning til dette vil andre immune systemmodulatorer, som vist ved data for BCG, sterkt øke antallet av peritoneale makrofager, og slik makrofag har sterkt øket latex-fagocytoseaktivitet. Denne høye aktivitet avtar til normale verdier etter 3 dager.

I motsetning til de ovenfor angitte resultater som indikerer at polymerene fremstilt ifølge oppfinnelsen ikke aktiverer makrofagfunksjonen, viser resultatene i eksempel 20 og 20A at disse polymerer ikke desto mindre virker som B-cellemodulatorer i normale dyr og stimulerer B-celle-antistoff-respons når de gis enten I.P. eller oralt. Videre observeres denne effekt selv i fravær av thymusfunksjonen, hvilket indikerer at polymerene fremstilt ifølge oppfinnelsen virker som thymusfunksjonerstatning ved aktivering av B-celler for øket antistoffproduksjon.

Forskjellige andre eksempler som ytterligere vil illustrere oppfinnelsen kan utføres ved å anvende andre hovedsakelig ekvivalente materialer i stedet for de spesifikke materialer som er beskrevet i de foregående eksempler.

Således kan propylen erstattes med en ekvivalent mengde av ethylen i de foregående eksempler som illustrativt for de definerte olefinmonomerer med hovedsakelig lignende resultater.

Også citraconsyreanhydrid kan anvendes i stedet for en ekvivalent mengde av maleinsyreanhydrid i de foregående eksempler som illustrativt eksempel på de definerte polycarboxylsyreanhydrider, med hovedsakelig lignende resultater.

Polymerer med enda lavere molekylvekt kan fremstilles ved løsningsmiddel-ikkeløsningsmiddelfraksjonering av EMA-polymeren fremstilt i eksempel 1. Denne lavmolekylære polymer kan deretter anvendes i stedet for en ekvivalent mengde av polymeren ifølge eksempel 1 i det foregående eksempel med hovedsakelig lignende resultater.

Andre farmasøytiske akseptable salter av imider fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å omdanne ammonium-saltderivatene til salter slik som for eksempel natrium og kalium. Eksempelvis kan ammoniumsaltderivatet ifølge eksempel 3, Tabell IV, forsøk 4, omdannes til halvamid, halvfritt carboxylderivat ved å føre en 5 %-ig vandig løsning av ammoniumsaltet gjennom en svak basekationbytterkolonne, for eksempel Amberlite (r) IRC-84 (tverrbundet acrylcopolymer).

Den resulterende løsning i den fri carboxylform kan deretter nøytraliseres enten med NaOH eller KOH, og den nøytraliserte løsning kan frysetørkes under dannelse av det tilsvarende natrium-og kaliumsaltderivat.

Den lavmolekylære EMA-polymer ifølge eksempel 1 kan også omdannes til halv-monomethyl sekundæramid, halv-mono-methylamin carboxylatsalt ved prosedyren ifølge eksempel 2 (a) ved å omsette løsningen av EMA og aceton med en løsning av methylamin i aceton i stedet for ammoniakk i aceton. Produktet kan deretter kokes under tilbakeløpskjøling i xylen under dannelse av et partielt N-methyl-substituert imidderivat som har en imidgruppe såvel som tilstedeværelse av sekundært methylamid-, ionisert COO"^- og amincarboxylat-grupper.

Detaljerte illustrative prosedyrer for utførelse av de ytterligere eksempler med tilsluttede resultater er som følger:

Eksempel 24

En lavmolekylær copolymer av propylen' og maleinsyreanhydrid ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 1. Til reaktoren ble tilført 196 g maleinsyreanhydrid oppløst i 1600 ml ethylbenzen inneholdende 7,30 g benzoylperoxyd. Temperaturen ble bragt til 80° C og trykket justert til 2,8 kg/cm 2 ved tilsetning av 42 g propylen fra en tilmontert propylensylinder. Deretter ble propylentrykket opprettholdt ved 2,8 kg/cm i et tidsrom på 19 timer ved en reaksjonstemperatur på 80° C. Ved slutten av forsøket ble reaktoren avkjølt og ventilert og oppslemmingen av propylen/ maleinsyreanhydrid-copolymer i ethylbenzen ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 1 ved tre xylen-oppslemmingsekstraksjoner etterfulgt av tre hexan-oppslemmingsekstraksjoner, filtrering og tørking med fullt oljepumpevakuum ved 60° C. Sluttproduktet besto av 269 g, 87,3 % utbytte, og en 1,0 % løsning i DMF ved 25° C hadde en spesifikk viskositet på 0,0590.

Det lavviskøse propylen/maleinsyreanhydrid-copolymer (PILA) -produkt. fremstilt som ovenfor beskrevet, ble omdannet til halvprimært amid-halvammonium carboxylatsalt ved den eksakte prosedyre som er beskrevet (for EMA) i eksempel 2a. Fra 26,0 g PMA ble det erholdt 36,3 g, 115,5 % utbytte, av ovntørket (35° C, 2 0 - 25 mm Hg vakuum) produkt. Den funksjonelle sammensetning ved infrarød analyse av produktet indikerte bare nærvær av primært amid, ionisert carboxyl og ammoniumcarboxylatgrupper. Ikke noen gruppe var til-

stede.

Halvamid-halvammonium carboxylatsalt fremstilt fra PMA med en spesifikk viskositet på 0,059 ble omdannet til et partielt imidholdig materiale ved den prosedyre som er beskrevet i eksempel 3. En 20 grams prøve av amid-ammoniumsaltet ble oppslemmet i 400 ml xylen, og oppslemmingen ble kokt under tilbakeløpskjøling som beskrevet i eksempel 3. Oppslemmingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i 33 minutter med en sluttemperatur på 13 9° C idet det ble oppsamlet 1,1 ml vann, og produktet ble opparbeidet som beskrevet under dannelse av 15,3 g (79,6 % utbytte) sluttprodukt. Infrarød analyse av produktet viste at 33 minutters prøven inneholdt 19,0 % imid, i tillegg til amid-og ammoniumcarboxylat— grupper. Prosent imid ble bestemt i dette tilfelle ved referanse til standard imid/amid-absorpsjonsforhold-sammen-setningskurven for EMA som beskrevet i eksempel 5. pH på en 2 %-ig vandig løsning var 5,43 før justering og lyofilisering. Etter justering til pH 9,5, filtrering og lyofilisering var pH 5,50, % nitrogen var 10,26 og imidinnholdet var 19,0 vekt% som bestemt ved infrarød analyse.

Det ovenfor angitte imidholdige derivat av PMA ble undersøkt i Fischer-hannrotter under anvendelse av BLCa-tumor med hensyn til anti-metastaseegenskaper og ikke-tilbakedannelse av tumor etter reseksjon som beskrevet i eksempel 13 og 15. Det var 10 dyr i kontrollprøven som ikke mottok noe legemiddel etter tumorfjerning (10 dager etter implantasjon) og 10 dyr som mottok en enkel 3 0 mg/kg dose I.P. ved tidspunktet for tumorbortskjæring. Resultatene er oppført i den etterfølgende tabell:

Eksempel 25

En lav-molekylær copolymer av ethylen og citraconsyreanhydrid ble fremstilt på lignende måte som beskrevet i eksempel 1. I dette tilfelle var mengdene av reaktormate-rialene 228,0 g citraconsyreanhydrid i stedet for maleinsyreanhydrid, 1874 ml ethylbenzen og 15,6 g benzoylperoxyd i 161 ml ethylbenzen. Ethylentrykket ble opprettholdt ved 14 kg/cm<2 >og reaksjonen ble utført ved 70° C i totalt 2 7 1/2 time. Ytterligere katalysatortilsetning ble foretatt ved 3 timer og 20 1/2 time bestående av 10,4 g benzoylperoxyd i 108 ml ethylbenzen hver gang. Ethylen/citraconsyreanhydrid-copolymerproduktet, opparbeidet som beskrevet i eksempel 1, besto av 7 3,5 g, 23,4 % utbytte. Den spesifikke viskositet (1,0 % DMF, 25° C) av copolymeren var 0,042.

29,5 g (0,21 mol) av den lavviskøse ethylen/citraconsyreanhydrid-copolymer ble omdannet til halvamid-halvammo-niumcarboxylatsalt ved den prosedyre som er beskrevet i eksempel 2a under dannelse av 37,0 g, 103,0 % utbytte, vakuum-tørket produkt. Infrarød analyse indikerte nærvær av amid, ionisert carboxyl og ammoniumcarboxylatfunksjoner men ikke noen imidgrupper. Et partielt imid av amid-ammonium-carboxylatderivatet ble fremstilt under anvendelse av prosedyren ifølge eksempel 3 ved kokning under tilbakeløpskjøling av en xylen (400 ml)-oppslemming av 20 g av det ovenfor angitte amidsalt i 30 minutter. Produktutbyttet var 15,7 g, 83,6 % utbytte, og I/A-absorpsjonsforholdet (infrarød) var 1,21, hvilket svarer til 31,0 % imid sammenlignet med stan-dardkurven for EMA som beskrevet i eksempel 5. Prosent nitrogen var 9,24 % og en 5%-ig løsning i vann hadde en pH

på 5,31.

Det ovenfor angitte imid-holdige produkt av ammoniert ethylen/citraconsyreanhydrid-copolymer ble vurdert i Fischer-hannrotter under anvendelse av BLCa-tumor med hensyn til overlevelse, ikke-tilbakedannelse og anti-metastaseegenskaper etter tumorfjerning som beskrevet i eksempel 13 og 15. Resultatene er oppført i den etterfølgende tabell:

Eksempel 2 6

Dette eksempel beskriver fremstillingen av en meget lavmolekylær EMA- blanding utvunnet ved løsningsmiddel-ikkeløsningsmiddel-fraksjonering av EMA-polymerer beskrevet i eksempel 1. Fra åtte separate EMA-fremstillinger ble det oppsamlet 1284 g EMA etter tørking over natten ved 80° C ved fullt oljepumpevakuum. Disse åtte EMA-produkter varierte i spesifikk viskositet (1 %, DMF, 25° C) fra 0,051 til 0,058 (gjennomsnittlig 0,53) og deres ekvivalentvekter varierte fra 134 til 142 før løsningsmiddelfraksjoneringen. Hver av åtte forsøk (160 g) ble oppløst i 500 ml aceton og utfelt i 2,5 liter toluen under en 10-minutters periode i et 4-liters begerglass som var kraftig omrørt med en Lightning-omrører Det utfelte EMA ble filtrert (man tok vare på alle åtte primærmoderlutfiltratene for opparbeidelse av løselig polymer, se nedenfor) og det faste materiale ble oppslemmet én gang i 2 liter toluen og to ganger i 2 liter hexan, filtrert og tørket over natten ved 50° C ved fullt oljepumpevakuum. Fra de åtte individuelle forsøk ble det erholdt totalt

1143 g av løsningsmiddelløselig EMA som hadde en gjennomsnittlig spesifikk viskositet på 0,057 (de åtte løsnings-middelutfelte individuelle forsøk varierte fra 0,053 -

0,060 i spesifikk viskositet).

Den aceton-toluenløselige polymerfraksjon i de kombinerte primærmoderlutfiltrater ble konsentrert til en tung olje ved fordampning av alle løsningsmidlene i en "Rotavap" på et kokende vannbad ved 25 - 30 mm Hg vakuum. Residuet ble løst i 200 ml aceton og utfelt i 1 liter toluen ved romtemperatur under dannelse av et oljeaktig grøtaktig fast materiale. Den overliggende væske ble dekantert fra og bunnfallet ble oppløst på nytt i 200 ml aceton og utfelt på nytt i 1,2 liter xylen ved 0° C under dannelse av et fast hvitt bunnfall. Dette produkt ble filtrert, vasket to ganger med 400 ml xylen og to ganger med 300 ml hexan og tørket over natten ved 50° C ved fullt oljepumpevakuum. Det ble erholdt 59 g produkt som hadde en spesifikk viskositet (1 %, DMF,

25° C) på 0,031, en beregnet .antallsmidlere molekylvekt på 342 og en ekvivalentvekt ved titrering på 172,0. Prosent carbon var 60,92, (60,61) og prosent hydrogen var 6,03 (6,12). 5 g av den ovenfor angitte EMA-fraksjon med spesifikk viskositet på 0,031 og ekvivalentvekt på 172 ble omdannet til halvamid-halvcarboxylammoniumsalt ved den prosedyre som er beskrevet i eksempel 2a, under dannelse av 5,4 g ovnstørket (50° C, pumpevakuum) produkt. 5 g av dette halvamid-halvcarboxylammoniumsalt ble omdannet til partielt imid ved den prosedyre som er beskrevet i eksempel 3 ved kokning under tilbakeløpskjøling i xylen i 1 time. Sluttproduktet (5 0° C, pumpevakuum) besto av 3,8 g. Dette ble løst i 70 g vann (pH = 4,87) og justert til en pH på 9,4 med NH^OH, filtrert gjennom et 0,2 um filter og frysetørket. Det lyofiliserte sluttprodukt hadde en pH på 5,1 (2,0 % vandig), et totalt nitrogeninnhold på 12,27 og et imidinnhold på 25,0 vekt%.

Produktet ble vurdert i Fischer 344 rotter under anvendelse av FBCa-tumor når det gjelder overlevelse, ikke-tilbakedannelse og anti-metastaser etter tumorfjerning som beskrevet i eksempel 13 og 15.

Produktet ble også vurdert med hensyn til dets evne til å stimulere immunresponser uttrykt i økende IgM-antistoffproduserende celler overfor røde blodcelle- (antigen) stimulering som beskrevet i eksempel 20 med følgende resultater:

Eksempel 2 7

Fremstillingen og anvendelsen av natrium-og kaliumsalter av imider fremstilt ifølge oppfinnelsen ble vist som følger. Ammoniumsaltderivatet ble fremstilt ved metoder beskrevet i eksmpel 1, 2a og 3-IV-5 og viste følgende analyse på frysetørket produkt:

De tilsvarende natrium- og kaliumsalter av det ovenfor angitte imid fremstilt ifølge oppfinnelsen ble fremstilt ved konvensjonell ionebytterteknikk under anvendelse av Rohm og Haas "IRC-12 0" i enten natriumformen eller kaliumformen. Disse kolonner ble fremstilt ved å fylle 400 ml "IRC-120" (H<+>form) i en egnet kolonne og utvikle Na<+->harpiksen ved behandling med 3,8 liter 1,0 molar NaCl (eller 1,0 molar KC1 i tilfelle kalium) etterfulgt av 4 liter vann. Løsninger av det ovenfor angitte NH^"1"- salt av den imidholdige polymer ble fremstilt under anvendelse av 5,0 g polymer løst i 200 ml vann. Disse løsninger ble deretter justert til en pH av 8,0 med fortynnet NaOH (eller KOH når det gjelder kalium). Disse pH-justerte løsninger ble ført gjennom de respektive Na-eller K-kolonner med en strømningshastighet på 15 ml/min etterfulgt av vann inntil 500 ml av avløpet var oppsamlet i hvert tilfelle. Avløpene ble justert til 6,8 - 7,0 med HC1 og fryse-tørket. De frysetørkede sluttsalter hadde følgende egenskaper:

De ovenfor angitte salter ble underkastet to bio-logiske vurderinger som beskrevet i det etterfølgende: (a) NH4+-modersaltet ble vurdert i Fischer 344 rotter under anvendelse av FBCa-tumor med hensyn til overlevelse, ikke-tilbakedannelse og anti-metastaser.- etter tumorfjerning som beskrevet i eksempel 13 og 15 med de følgende resultater: (b) De ovenfor angitte salter ble vurdert med hensyn til deres evne til å stimulere immunresponser uttrykt i økende IgM-antistoffproduserende celler overfor heterologe erythrocyter (SRBC, røde blodceller fra sauer) som beskrevet i eksempel 20 med følgende resultater:

Eksempel 28

Lavmolekylær EMA fra eksempel 1-E (spesifikk viskositet = 0,063) ble omdannet til halv-monomethyl-sekundært-amin/halv-monomethyl-amincarboxylatsalt ved følgende prosedyre. En løsning av 43,9 g (0,312 mol) EMA i 440 ml reagens-aceton ble avkjølt til -78° C i tørris-aceton. Til denne opp-løsning ble tilsatt 71 ml (54 g, 1,74 mol) kondensert methylamin og 100 ml ytterligere aceton for å tillate effektiv om-røring av den utfelte produktoppslemming. Etter at oppslemmingen av methyl-amid-aminsalt var blitt oppvarmet til romtemperatur (2 timer) ble den omrørt over natten, filtrert og vasket fri for overskudd av amin med tre oppslemminger av aceton (500 ml hver) og tørket over natten ved 20 - 25 mm Hg vakuum ved 35° C under dannelse av 78,3 g (123,9 % utbytte) av halvmethyl-sekundært-amid/halvmethyl-aminsalt av EMA. Dette methylamid-aminsalt (20,0 g) ble oppslemmet i 400 ml xylen og kokt under tilbakeløpskjøling under omrøring i 5 minutter under vannopptak og med en strøm av methylamin som rislet gjennom oppslemmingen, hvorved 0,75 ml vann ble fjernet. Det uløselige produkt ble filtrert, oppslemmet én gang med 400 ml xylen etterfulgt av tre ganger med 4 00 ml hexan, filtrert og tørket ved 40° C ved 20 - 25 mm Hg vakuum under dannelse av 16,4 g (85,2 % utbytte) av det partielt N-methyl-substituert-imidderivat. Infrarød analyse av produktet indikerte imidgrupper ved 1700 cm såvel som nærvær av sekundært methylamid ved 1645 cm<->"'", ionisert COO og amincarboxylat-grupper. Imidkonsentrasjonen ble bestemt å være 17,0 % som avlest fra standard I/A absorpsjonskurve for usubstituert-imid/primær-amid-blandinger som beskrevet i eksempel 5.

% nitrogen var 11,41 og en 2 %-ig vandig løsning hadde en pH på 8,70.

Det ovenfor erholdte N-methyl-imid-holdige produkt ble vurdert i Fischer 344 hannrotter under anvendelse av FBCa-tumor med hensyn til overlevelse, ikke-tilbakedannelse og anti-metastaseegenskaper etter tumorfjerning som beskrevet i eksempel 13 og 15 med de følgende resultater:

Fremstilling av EMA- råmateriale i forsøksanlegg

EMA-råmateriale og det derivatiserte produkt ble fremstilt i større skala som beskrevet i de to etterfølgende eksempler.

Eksempel 2 9

Fremstilling av EMA

Det ønskede råmateriale, ethylen/maleinsyreanhydrid (EMA) copolymer ble fremstilt i en 568 liters rustfri stål-autoklav utstyrt med en 45,4 liters tilføringsbombe for initiatortilsetning, en glassf6ret omrørt reaktor hensikts-messig forseglet for N-^-spyling hvori reaktantene blandes,

en turbinrører, en tre-tommers bunntapningsventil og mantelforsynt for enten oppvarming eller avkjøling. Alle tre kar ble spylt tre ganger med N2 før tilsetning av reaktanter.

Inn i den glassf6rede reaktantblander ble innført 243,1 kg ethylbenzen og 29,9 kg maleinsyreanhydrid (MA). Blandingen ble oppvarmet til 50° C inntil fullstendig oppløsning ble erholdt. Til denne løsning av MA i ethylbenzen ble tilsatt en løsning av 2340 g benzoylperoxyd i 20,9 kg ethylbenzen fremstilt i et separat kar.

Den ovenfor angitte ethylbenzenløsning av reaktanter ble deretter tilsatt til den 568 liters store rustfrie autoklav, manteloppvarmet til 40° C under opprettholdelse av en svak ethylenspyling. Omrøreren ble innstilt på 125 omdr. pr. minutt. Etter tilsetning ble reaktantkaret skyllet over i autoklaven med 2,27 kg ethylbenzen, frakoblet og innløps-røret ble stengt. Etter fylling ble autoklavventilen lukket og autoklaven ble komprimert til 4,2 kg/cm 2 med ethylen og holdt der i 5 minutter. Pakningstrykkene ble justert til 1,7 - 3,5 kg/cm over reaktortrykket. Satstemperaturen ble bragt til 75° C ved å innstille mantelen på 95° C over en periode på 45 minutter, hvoretter reaktoren ble komprimert med ethylen til 14 kg/cm 2. Null tid ble nedtegnet når reak-torinnholdet nådde 75° C.

En løsning av 1560 g benzoylperoxyd i 28,2 kg ethylbenzen ble fremstilt og fyllt i en 45,4 liter stor katalysatortilsetningsbombe. Etter 3 timers reaksjon av den ovenfor angitte sats ved 75° C og 14 kg/cm^ ethylentrykk ble den andre tilsetning av initiator foretatt til autoklaven og tilsetningsbomben ble skyllet med 1,8 kg ethylbenzen. Etter den andre tilsetning av benzoylperoxyd ble reaktoren holdt ved 75° C og 14 kg/cm<2> ethylentrykk i ytterligere 14 timer, totalt 17 timer. Etter totalt 17 timer ble reaktantene av-kjølt til 25° C, ethylentrykket utventilert og reaktoren spylt tre ganger med nitrogen.

EMA-reaktoroppslemmingen i ethylbenzen ble tappet gjennom bunnuttapningsventilen på et steingods "Knutsene" vakuumfilter utstyrt med en bomullsfilterduk. Filteret ble dekket med en plastduk og nitrogenspylt. Den filtrerte våte kake ble oppslemmet på nytt i 13 6 kg xylen, omrørt i 15 minutter og filtrert på nytt. Denne reoppslemningsprosess med xylen ble gjentatt tre ganger etterfulgt av tre reoppslem-mings-filtertrinn under anvendelse av 102,66 kg hexan. Den ferdige våte kake av EMA ble spredd på rustfrise ståltrau og vakuumtørket ved 50° C i en "Devine" vakuumtrautørker i 48 - 72 timer inntil ikke noe xylenlukt var til stede. Det ferdige tørkede produkt veide 35,4 kg, 82,8 % utbytte. Totalt ble en serie på 4 forsøk med varierende størrelse foretatt som følger. De ovenfor angitte forsøk beskriver forsøk nr.

3 i den etterfølgende tabell:

Eksempel 30

Fremstilling av partielt imid av ammoniert EMA

Ammoniering og imidisering av EMA (produkt fra eksempel 29) ble utført i en 378 liters glassf6ret "Pfaudler" reaktor utstyrt med en bladomrører og skjermsystem og en rustfri ståldestillasjonssløyfe og kondenser som ga valg mellom total fjerning av kondensat eller tilbakeløp av enhver fraksjon av destillatet til reaktoren. Systemet var utstyrt med to uavhengige tilføringsledninger, én for ammoniakk, den andre for væske, begge tilpasset til å løpe ut under overflaten av den omrørte reaksjonsblanding. Hvert rør var utstyrt med et innsatsfilter og et rotometer for å overvåke og kon-trollere strømningshastighetene. Reaktormantelen ga både komprimert dampoppvarming eller avkjøling etter behov. Inn-løpsledningen for væsker var tilkoblet til en 94,6 liters glassf6ret "Pfaudler" reaktor hvori EMA.-råmaterialet ble opp-løst i aceton før tilsetning til den 378 liters store ammo-nieringsreaktor. Sluttprodukter fra den 3 78 liters store reaktor ble gjenvunnet ved uttapping gjennom en bunnventil over i et dekket rustfritt Knutszch stålvakuumfilter.

En typisk ammoniering og partiell imidiserings-sekvens er beskrevet som følger: Den 378 liters store reaktor ble fylt med 132,4 liter (102,66 kg) filtrert aceton og det 94,6 liters store løsningskar ble fylt med 81,4 liter (62,6 kg) filtrert aceton, begge under nitrogenatmosfære. Til de 81,4 liter aceton i løsningskaret ble tilsatt 21,32 kg EMA-copolymer (fremstilt som beskrevet i eksempel 29, forsøk 4) og omrøringen ble fortsatt i 20 - 30° C inntil fullstendig oppløsning var oppnådd. Samtidig ble vannfri ammoniakk tilsatt under overflaten av acetonet i den 378 liter store reaktor i en hastighet på 0,16 kg/minutt i 5 minutter. Deretter ble EMA-acetonløsningen tilsatt under trykk gjennom filteret ved en lineær strømningshastighet over en periode på 4 0 minutter (2,08 kg/min) inn i den omrørte aceton-NH^-løsning i den 378 liter store reaktor under væskeoverflaten. Ammoniakk-strømmen inn i den 378 liter store reaktor ble holdt ved 0,16 kg/min. under EMA-tilsetningstiden. Under dette tidsrom fikk reaksjonsblandingstemperaturen stige til 44 - 55° C ved at ingen utvendig kjøling ble tilført. Ammoniakkstrøm-ningshastigheten på 0,16 kg/min. ble fortsatt i 15 minutter etter EMA-tilsetningen. Oppslemmingen av utfelt ammoniert EMA ble deretter kjølt til 25° C og tappet til vakuumfilteret for gjenvinning av det faste ammonierte produkt.

Det filtrerte ammonierte produkt, halvamid-halv-ammoniumcarboxylatsaltet, ble ytterligere omsatt ved sukses-sive reoppslemminger (20 minutter) tre ganger i 177,6 liter porsjoner av aceton med filtrering mellom hver reoppslemmingstrinn, og tilslutt to ganger i 177,9 liters porsjoner av hexan etterfulgt av filtrering under dannelse av en hexan-våtkake av produkt. En prøve av denne våtkake ble tørket for analyse og viste ikke noe anhydrid ved IR-analyse, bare amid-og ammoniumcarboxylatsaltgrupper. Dens vandige løsnings-pH var 5,88 ved 2,0 % konsentrasjon.

Totalt ble fem slike ammonieringer foretatt under anvendelse av forskjellige mengder av EMA som indikert i det etterfølgeride. Den ovenfor angitte beskrivelse angår forsøk 5 i den etterfølgende tabell:

De ovenfor angitte hexan-våtkaker av ammoniert EMA ble anvendt direkte i imidiseringssekvensen av derivatise-ringsprosessen som følger, som beskriver imidiseringen av ammonieringsforsøk 5.

Hexan-våtfilterkaken fra forsøk 5 ble tilsatt til den 378 liters store reaktor som inneholdt 143,8 liter (124,74 kg) toluen og 71,9 liter (62,6 kg) xylen. Denne oppslemming av ammoniert EMA i blandet hexan-toluen-xylenløs-ningsmiddel ble oppvarmet ved kokning med kontinuerlig spyling med vandig ammoniakk ved 0,02 kg/min. Tilbakeløpskokning startet ved 82° C og alt vann som var tilstede ble fjernet azeotropisk etterfulgt av fjerning av hexan inntil reaksjons-blandingens temperatur nådde 115° C. Reaksjonstemperaturen ble deretter holdt ved 115 - 116° C som trengtes ved porsjons-vise tilsetninger av en toluen/xylenblanding i et forhold på 2:1 under fjerning av vann dannet ved imidisering ved denne temperatur. Kokning under tilbakeløpskjøling ble fortsatt i 7 1/2 time med azeotrop fjerning av vann og med kontinuerlig ammoniakkspyling ved 0,02 kg/min. inntil den ønskede omdannelse til imid var oppnådd som bestemt ved infrarød analyse (se etterfølgende tabell).

Når den ønskede omdannelse til imid var nådd ble reaksjonsoppslemmingsblandingen avkjølt, filtrert som ovenfor beskrevet og det fraskilte imidholdige produkt ble behandlet som ovenfor beskrevet med tre reoppslemmingstrinn under anvendelse av toluen (154,8 kg, 20 minutter) etterfulgt av to re-oppslemmings tr inn under anvendelse av hexan (119,3 kg, 20 minutter). Den filtrerte hexan-våtkake ble tørket i rustfri ståltrau i vakuum (oljepumpe) ved 50° C i 72 timer eller inntil vakuumovntrykket var under 3 torr ved 50° C.

Totalt ble fire forsøk utført svarende til forsøk

1, 2, 4, 5 i den ovenfor beskrevne EMA-ammonieringssekvens. Data for disse forsøk er oppført i det etterfølgende:

Vandige løsninger av de ovenfor ovntørkede produkter ble justert til pH 9,5 med ammoniumhydroxyd, filtrert sterilt gjennom et 0,2 um filter i serumampuller og lyofilisert for endelig bruk. Sluttanalyse for disse fire forsøk var som følger. Resultatene avviker fra de ovenfor angitte på grunn av reammoniering av carboxylgrupper som mistet ammoniakk under ovntørking.

Eksempel 31

Laboratoriesyntese av imid-holdig ammoniert EMA under anvendelse av AEMA- hexan- våtkake direkte i tilbakeløpskokende xylen uten tørking

Laboratorieskalafremstillinger ble foretatt hvori EMA, løst i aceton, ble tilsatt over forskjellige tidsrom til en løsning av aceton til hvilken gassformig ammoniakk var tilsatt ved forskjellige strømningshastigheter, idet temperaturen fikk stige fra romtemperatur (23 - 25° C) til 50 - 53° C. Det utfelte ammonierte EMA ble filtrert og oppslemmingsvasket med aceton etterfulgt av oppslemmingsvasking med hexan og filtrering. Hexan-våtkaken av ammoniert EMA ble deretter reoppslemmet i xylen og den totale oppslemming ble oppvarmet for å fjerne'vann i to trinn, (1) azeotropisk fjerning av vann innen temperaturområdet på 75 - 102° C, fra omsetning med NH^ og aceton etterfulgt av (2) vann dannet under partiell imidisering av ammoniert EMA ved forhøyet temperatur (122 - 132° C) etter hexanfjerning. Det partielle imid ble erholdt ved filtrering etterfulgt av oppslemmingsvasking med xylen og hexan. Tolv slike forsøk ble foretatt som oppført i den første etterfølgende tabell. Den ovenfor angitte beskrivelse henviser til forsøk nr. 10 i tabellen.

EMA fra eksempel 29, forsøk 1 (280 g - 2,0 mol) ble løst i 1,1 liter aceton og filtrert gjennom filterpapir. Denne EMA-acetonløsning ble tilsatt over en periode på 45 minutter til 2,4 liter aceton i en omrørt 5-liters kolbe utstyrt med azeotropfjernende tilbakeløpskondenser, tilset-ningskolbe og en innløpsspyler for ammoniakk. Innløpene for ammoniakkspyleren og EMA-acetonløsningen var under væske-nivået i 5-liters kolben. Under den 45 minutters lange EMA-tilsetningsperiode og 10 minutter deretter ble ammoniakk spylt inn i reaksjonsoppslemmingen ved en hastighet på 0,081 mol/ minutt for en total tilsetning på 4,44 mol ammoniakk. EMA-tilsetning ble startet ved romtemperatur (23° C) og reak-sjons temperaturen fikk stige uten noen kjøling under hele 45-minutters-perioden. Sluttemperaturen på den ammonierte EMA-oppslemming i aceton var 53,5° C. Det ammonierte produkt ble filtrert, reoppslemmet to ganger i 2 liter aceton (30 min. hver) etterfulgt av to ganger i 2 liter hexan (30 min. hver) og filtrert. Hexan-våtkaken ble deretter reoppslemmet uten tørking i 2,7 liter xylen for vannfjerning og partiell imidisering. Denne hexan-xylenoppslemming av ammoniert EMA ble oppvarmet til tilbakeløpskjøling for å fjerne vann ved azeotrop destillasjon i to trinn. Under hele denne prosedyre ble ammoniakkgass kontinuerlig spylt gjennom oppslemmingen i en hastighet på 0,030 mol/min. Den opprinnelige vannfjerning startet ved 88° C og i løpet av en periode på 60 min. steg temperaturen til 101° C, og 9,1 ml vann ble erholdt. Opp-varmingen ble fortsatt med hexanfjerning inntil vann fra imiddannelsen først ble oppnådd ved 125° C. Vannet fra imidiseringen ble azeotropisk fjernet over en 60 minutters periode mellom 125° C og 132° C, hvorved 6,9 ml vann ble erholdt. Etter imidisering ble oppslemmingen avkjølt til 100°C, filtrert, vasket ved reoppslemming i 30 min. i 2 liter xylen, etterfulgt av to reoppslemmingsvaskinger (30 min. hver) i 2 liter hexan og filtrert. Det filtrerte produkt ble tørket i 15 timer ved 50° C under oljepumpevakuum ved 3 mm Hg. Utbyttet av ovntørket produkt var 314 g, 94,5 % utbytte. Oppsumme-ring for 12 slike forsøk er vist i den første etterfølgende tabell. For endelig bruk ble det ovntørkede produkt oppløst i vann (2 - 5 %) og pH ble justert til 9,5 med NH^OH, filtrert gjennom et 0,2 um . filter og lyofilisert i serumflasker. Egenskapene til det ovntørkede og lyofiliserte produkt er gitt i den andre tabell. Egenskaper for produkter fra Eksempel 31

Den totale blanding av alle de ovenfor angitte satser (ca. 4000 g) viste følgende analyse:

To satser på 2000 g hver ble pH-justert til 9,5 med NH^OH, filtrert sterilt og lyofilisert i serumflasker inneholdende 0,5 g pr. flaske for sluttbruk i enten human-eller dyretester under dannelse av totalt 8000 slike ampuller.

Analysen for dette materiale var:

Eksempel 32

Dette eksempel gjør bruk av den prosedyre som er beskrevet i eksempel 20 for å vurdere normale Lewis-rotter med hensyn til deres evne til å stimulere immunresponser u-trykt i økende IgM-antistoff-produserende celler overfor heterologe erythrocyter (røde blodceller fra sauer, SRBC) unntatt at i dette tilfelle ble imidmaterialet fremstilt ifølge oppfinnelsen administrert intravenøst via halevene som 1 ml fysiologisk saltvann inneholdende den indikerte doserings-mengde. Alle andre detaljer var de samme som beskrevet i Eksempel 20. Etterfølgende data ble erholdt i to forsøk.

Eksempel 3 3

Et foretrukket eksempel omfat-tende en copolymer av ethylen og maleinsyreanhydrid med en molekylvekt på 850 og derivatisert til å inneholde halvamid-halvammoniumsaltgrupper og imidgrupper hvori imidgruppene omfatter ca. 20 vekt% av de angitte grupper (hovedsakelig lik det eksempel som er illustrert i fig. l),er blitt testet i mennesker. Under en periode på flere måneder i en Fase 1-klinisk undersøkelse av opp til 72 pasienter med gastro-intestinal cancer innbefattet pasienter med mage-j pancreas-, tykktarm-og rectal-cancer' f ble det ikke observert noen signifikant toksisitet forbundet med legemidlet ved intraperito-neal, oral eller intravenøs administrering og ikke noe akse-lerert mønster for sykdomsforløp etter legemiddelbehandling oppsto.

Eksempel 34

Når isobutylen ble erstattet med en ekvivalent mengde av propylenet ifølge eksempel 24, ble hovedsakelig lignende resultater erholdt.

Eksempel 35

Når dimethylmaleinsyreanhydrid ble anvendt i stedet for en ekvivalent mengde av citraconsyreanhydrid som beskrevet i eksempel 25 ble hovedsakelig lignende resultater erholdt.

Eksempel 36

Når EMA med en beregnet antallsmidlere molekylvekt på 300 ble anvendt i stedet for EMA med en beregnet antallsmidlere molekylvekt på 342 som beskrevet i eksempel 26, ble hovedsakelig lignende resultater erholdt.

Eksempé. l 3 7

Når EMA med et beregnet antallsmidlere molekylvekt på 15 00 ble anvendt i stedet for EMA med en beregnet antallsmidlere molekylvekt på 342 som beskrevet i eksempel 26, ble hovedsakelig lignende resultater erholdt.

Andre eksempler kan fremstilles hvilket er innly-sende for fagmannen uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. Det skal forstås at alle slike eksempler er innbefattet innen kravenes ramme.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av, et immunoregulerende derivat av copolymer av olefinmonomer med fra 2 til 4 carbonatomer og a,3-umettet polycarboxylsyreanhydrid med fra 4 til 6 carbonatomer, karakterisert ved at et halvamid, halv-ammoniumsaltderivat av angitte copolymer, hvori copolymeren har en molekylvekt på fra 300 til 1500, omsettes med ammoniakk for ytterligere å derivatisere copolymeren til å inneholde både (a) halvamid, halv-ammoniumsaltgrupper og (b) imidgrupper, hvori imidgruppene omfatter fra 5 til 40 vekt% av de derivatiserte grupper, og eventuelt at halv-ammoniumsaltgruppene omdannes til andre farmasøytisk akseptable saltgrupper.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at olefinmonomeren er ethylen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polycarboxylsyreanhydridet er maleinsyreanhydrid.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at olefinmonomeren er ethylen og polycarboxylsyreanhydridet er maleinsyreanhydrid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at copolymeren har en midlere molekylvekt på 850.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at halv-amid, halvcarboxylatsaltgruppen er en halv-amid, halv-ammoniumsalt-gruppe.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at imidgruppen omfatter fra 10 til 25% av de derivatiserte grupper.