CN110484584A - 一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，以牡蛎肉为原料，制备牡蛎浆液；依次经过胃蛋白酶酶解、胰酶酶解、乙醇沉淀、减压浓缩及干燥(冷冻干燥或喷雾干燥)，获得具有延缓骨质流失活性的多肽。本发明采用胃蛋白酶和胰酶对牡蛎浆液二次酶解，再使用乙醇除去糖类与蛋白，较好的减少活性多肽再降解，利于保留活性多肽的完整性，防止体内胃肠道酶导致的活性改变或降低；所得多肽对成骨细胞增殖率最高达到168％。通过体内实验证实，本发明开发了牡蛎组织的二次酶解工艺，逐步提高延缓骨质流失活性多肽的纯度，得到了一种具有延缓骨质流失活性的牡蛎多肽产品。所述延缓骨质流失活性多肽可用于预防骨质疏松等相关食品或药品的开发。

Description

一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及水产品加工技术领域，更具体地说，涉及一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法及其应用。
背景技术
骨质疏松症是全世界关注的主要公共卫生问题。骨质疏松性骨折是最常见的致残原因之一，也是全球医疗费用的主要来源。据估计，目前全世界有2亿多人患有这种疾病，每年导致890多万例骨折。目前骨质疏松症治疗药物批准可以分为两类。第一类抵抗骨质再吸收药剂是最常用的治疗骨质疏松症药物，其中包括含氮磷酸盐，雷洛昔芬，激素替代疗法，降钙素。这些药物是通过抑制破骨细胞骨吸收，这些疗法能够改善骨质疏松症患者的生活质量，但是不能恢复大多数骨质疏松症患者的骨骼完整性。第二类是骨合成类药物，一般用于严重的骨质疏松症患者，也很难用于对前期骨质减少的预防，或着缓解骨质疏松的进程。因骨质疏松发病早期基本没有什么不良反应，因而不易被发现，不能及时的进行治疗，但是一旦发病将会很难治愈。外科手术以及目前常见的的预防和治疗骨质疏松的药物，长期服用这类药物会引起便秘等一系列不适反应症状，不仅医疗成本高，而且会有一定的毒副作用，并且很难达到彻底治愈的目的。2018年的中国医学会骨质疏松与骨矿盐疾病学分会发布的中国骨质疏松症患者的调查报告表明，骨质疏松的预防意义要大于治疗收益。因此，如何转变骨质疏松的治疗思路为可预防的手段是提高国民骨骼健康的新途径。
多肽对许多疾病作为潜在类似药物使用正在快速增长。多肽是一类化合物体内目标结合具有更强的特异性，使得其生物活性更高效和更好的适用性，且其无关的副作用也更有限。与蛋白质相比，肽类的小分子尺寸跟小，完善的多肽化学合成方法提供了更多和更经济的产量。此外肽的较短长度表明他们的使用不仅在系统性注射也为医学临床方便药片口服诱导骨生长刺激。牡蛎是一种营养丰富的水产品。其每百克鲜贝肉含蛋白质7克，糖3.9克，灰分1.4克，脂肪2.5克，其蛋白质含量很高。牡蛎蛋白的营养价值高且具有良好的抗氧化活性，抗凝血及抗肿瘤活性。值得一提的是，牡蛎的营养价值高还由于它所含的蛋白质有人体需要的缬氨酸、亮氨酸等8种必需氨基酸。越来越多的水产蛋白的水解产物被发现具有各种的生物活性。
常用的酶解方法得到的多肽在体内发挥生物功效存在一些缺点，因为人异源消化酶的多肽被食用后可能会被胃肠道中蛋白酶的二次或者多次水解，很难保证原始多肽的生物活性。很多多肽在体外活性测试得到的效果在体内会有所降低。而经过胃肠道同源蛋白酶水解的多肽可以较好的减少其再水解的可能性，有利于保留原始的完整性，防止体内胃肠道酶导致的活性改变或降低。
发明内容
本发明的目的是克服现有异源酶水解的多肽体内活性降低技术的缺点，以牡蛎(Crassostrea gigas)为原料，提供一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，并开发了具有延缓骨质流失活性的多肽产品。
为了达到上述目的，本发明提供一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉，按料液重量比1:3～1:5加水，0～4℃匀浆，匀浆转速4000～5000rpm，每次匀浆时间为1～2min，间歇时间为30～40s，总共匀浆3～5次，得牡蛎浆液；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：将步骤S1所述牡蛎浆液的pH调节到2.0～4.0，加入胃蛋白酶，在温度30～37℃搅拌水解1～2小时，得酶解液A；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，每克蛋白质添加胃蛋白酶4500～5000U；所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：将步骤S2所述酶解液A的pH调节到6.5～8.2，加入胰酶，在温度30～37℃搅拌水解1～3小时，得酶解液B；将所述酶解液B离心取上清液A；其中，所述胰酶的添加量以上述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，每克蛋白质添加胰酶4500～5000U；所述酶解液A中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其2～4倍体积的无水乙醇，在4～7℃的环境下静置24～48h，离心取上清液B；
S5、旋转蒸发：取步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转蒸发温度为30℃～45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/10～1/15，得浓缩液；将所述浓缩液干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性的多肽，放-20℃备用；所述干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。
优选方式下，使用HCl对步骤S2所述牡蛎浆液的pH进行调节。
优选方式下，步骤S2所述搅拌的转速为45～60rpm。
优选方式下，步骤S3所述搅拌的转速为45～60rpm。
优选方式下，使用HCl或NaOH溶液对步骤S3所述酶解液A的pH进行调节。
优选方式下，步骤S3所述离心的参数为：10000～12000g、8～10min。
优选方式下，步骤S4所述离心的参数为：10000～12000g、8～10min。
优选方式下，步骤S5所述旋转蒸发的转速为50～80rpm。
优选方式下，步骤S5所述冷冻干燥参数为：冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥24～48小时；在第二段时间开始抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
优选方式下，步骤S5所述喷雾干燥为高温喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
优选方式下，步骤S5所述喷雾干燥为低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
优选方式下，所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃条件下进行匀浆，匀浆转数为5000rpm，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400ml；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液400ml；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算，为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：使用4mol/L的NaOH将步骤S2所述酶解液A的pH调节到8.0，加入胰酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解3小时，得酶解液B；将所述酶解液B在10000g进行离心，离心时间为10min，得到上清液A；其中，所述胰酶的添加量以所述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，所述酶解液A中的蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胰酶5000U，共添加150000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃的环境下静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S5、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为80rpm，水浴温度为45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性的多肽，放-20℃备用；其中，所述冷冻干燥参数为：采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥为高温喷雾干燥或低温喷雾干燥，高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
本发明的另一个目的是，提供所述延缓骨质流失活性多肽的应用，用于预防骨质疏松症；用于制备预防或/和治疗骨质疏松的药物或食品。
一种预防或/和治疗骨质疏松的药物或食品，在制备时加入所述延缓骨质流失活性多肽。
本发明的有益效果：
(1)牡蛎是一种来源广泛的，常见的水产品，以牡蛎为原料取材容易，安全无副作用，可显著降低生产成本，满足大规模生产的需要。
(2)将生物酶解与高效的纯化的方法结合，达到了高效筛选小分子多肽药物的目的，操作简单，生产条件温和；通过细胞实验进行活性测定，其产品安全性高。
(3)利用双酶二次酶解消化牡蛎肉组织开发了具有明显延缓骨质流失活性的多肽，对成骨细胞增殖效果最高达到168％，通过动物实验进一步证实了它的良好效果，提示具有对骨质疏松症较强的预防作用。通过上述的全部组合技术或某一种技术，对多肽的种类、性质、活性进行多元化分离纯化筛选，提高了生物活性肽的筛选生物活性肽的效率，获得了一种稳定，可操作，高效率的生物活性肽鉴定筛选方法。
(4)采用胃蛋白酶和胰酶对牡蛎浆液进行二次酶解，再使用乙醇除去酶解液中糖类与大蛋白。该方法可以较好的减少所得活性多肽被再降解的可能性，有利于保留活性多肽的完整性，防止体内胃肠道酶导致的活性改变或降低。
所述具有成骨活性的多肽能够用于延缓骨质流失相关功能性食品的有益的食品添加成分。
附图说明
图1为本发明一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法的流程图；
图2为本发明制备的具有延缓骨质流失活性的多肽促进成骨细胞24h增殖结果；
图3为本发明制备的具有延缓骨质流失活性的多肽促进成骨细胞48h增殖结果；
图4为施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BMD的影响；
图5为施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BV的影响；
图6为施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠TV的影响；
图7为施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BV/TV的影响。
具体实施方式
以下是对发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
多肽产品的制备工艺大多数为选择一种或者多种酶进行酶解消化，得到的多肽溶液进行活性鉴定，确定良好活性的溶液制成产品，本发明也是首先对牡蛎组织进行匀浆酶解，离心得到的水解的多肽溶液液，确定良好的成骨活性酶解工艺。
本发明过程中用乙醇沉淀法进一步去除组分的多糖，提高多肽产品中的有效组分，由于分子量小的多肽的成骨活性优于分子量大的蛋白和多肽，所以本发明在用乙醇沉淀法去除大蛋白和多糖。综合上述技术分析背景，由于食品蛋白酶解工艺的复杂多样性，本发明从牡蛎二次酶解工艺入手，逐步提高延缓骨质流失活性多肽的纯度，获得了一种稳定，可操作，高效率的生物活性肽制备与纯化方法。
本发明提供一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)牡蛎浆液的制备
首先将牡蛎去壳后，按料液质量比1:3～1:5加水。采用冰浴的方式进行匀浆，匀浆转数为4000～5000rpm,匀浆时间为1～5min，间歇时间为30～40s，总共匀浆3～5次。将上述匀浆液并干燥，将干燥的粉末放-20℃冰箱保存备用。
(2)牡蛎浆液的一次酶解
将上述匀浆液冻干粉，按料液质量比1:3～1:5加水复溶，将溶液的pH调节到2.0～4.0，再加入胃蛋白酶4500～5000U/g蛋白，在温度30～37℃下消化水解1～2小时。将得到的消化液10000～12000g进行离心，离心时间为8～10min，离心后取上清干燥，将干燥的粉末放-20℃备用。
(3)牡蛎浆液的二次酶解
将上述一次酶解液pH调节到6.5～8.2，再加入胰酶4500～5000U/g蛋白，在温度30～37℃下消化水解1～4小时。将得到的酶解液10000～12000g进行离心，离心时间为8～10min，离心后取上清干燥，将干燥的粉末放-20℃备用。
(4)乙醇沉淀
将一次酶解或二次酶解得到的酶解液，按照2～4倍消化液体积的无水乙醇，在4～7℃的环境下静置24～48h。然后于10000～12000g进行离心，离心时间为8～10min，离心后取上清。
(5)减压浓缩
乙醇沉淀后离心得到的上清进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为50～80rpm，水浴温度为30℃～45℃，得到的浓缩液为原液的1/10～1/15。将得到的溶液进行干燥，将干燥的粉末放-20℃备用。
(6)干燥，真空冷冻干燥或者喷雾干燥
①冷冻干燥方法
上述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3-5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1-3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1-2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1-2小时，第五段：5℃～15℃干燥1-2小时，第六段：15℃～20℃干燥1-2小时，第七段：20℃～25℃干燥1-2小时。在第二段开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa。真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
②喷雾干燥的方法
高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
(7)成骨细胞增殖活性的测定方法
用MTT法测定MC3T3-E1前成骨细胞的增殖情况，将密度为2000～10000个每孔的MC3T3-E1细胞接种在96孔板中，细胞培养基为含有10～20％FBS的α-MEM培养基中，在5％CO2的环境中于35～40℃培养12～36小时；之后，更换新鲜的10～20％FBS的α-MEM培养基，并用PBS缓冲液洗涤；然后在含有5μg/ml-1000μg/ml浓度样品的10～20％FBS的α-MEM培养基中于35～40℃下培养细胞24～72小时，接着用四甲基偶氮唑蓝MTT溶液(浓度为4～10mg/mL，用10mM PBS溶解)处理3～5小时；之后，用100～200μL二甲基亚砜(DMSO)代替培养基，100rpm摇动20～30分钟。使用酶标仪Microplate Reader(Eon，BioTek，USA)在440～590nm处测其吸光度值。计算每个孔中MC3T3-E1细胞的活力作为活细胞的百分比。
下述各例中使用的胃蛋白酶厂家为Sigma公司、商品号10108057001；胰酶厂家Sigma公司、商品号P7545-25G。
实施例1
一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃条件下进行匀浆，匀浆转数为5000rpm，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400g；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液400ml；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算，为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：使用4mol/L的NaOH将步骤S2所述酶解液A的pH调节到8.0，加入胰酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解1小时，得酶解液B；将所述酶解液B在10000g进行离心，离心时间为10min，得到上清液A；其中，所述胰酶的添加量以所述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，所述酶解液A中的蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胰酶5000U，共添加150000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃的环境下静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S5、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为80rpm，水浴温度为45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性的多肽，放-20℃备用；
所述冷冻干燥为：采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa，真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
所述喷雾干燥为高温喷雾干燥或低温喷雾干燥，所述高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；所述低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
实施例2
一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃条件下进行匀浆，匀浆转数为5000rpm，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400g；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液400ml；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算，为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：使用4mol/L的NaOH将步骤S2所述酶解液A的pH调节到8.0，加入胰酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液B；将所述酶解液B在10000g进行离心，离心时间为10min，得到上清液A；其中，所述胰酶的添加量以所述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，所述酶解液A中的蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胰酶5000U，共添加150000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃的环境下静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S5、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为80rpm，水浴温度为45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有促骨生成活性的多肽，放-20℃备用；
其中，所述冷冻干燥参数为：采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
所述喷雾干燥为高温喷雾干燥或低温喷雾干燥，所述高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；所述低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
实施例3
一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃条件下进行匀浆，匀浆转数为5000rpm，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400ml；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液400ml；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算，为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：使用4mol/L的NaOH将步骤S2所述酶解液A的pH调节到8.0，加入胰酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解3小时，得酶解液B；将所述酶解液B在10000g进行离心，离心时间为10min，得到上清液A；其中，所述胰酶的添加量以所述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，所述酶解液A中的蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胰酶5000U，共添加150000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃的环境下静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S5、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为80rpm，水浴温度为45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有成骨活性的多肽，放-20℃备用；
其中，所述冷冻干燥参数为：采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥为高温喷雾干燥或低温喷雾干燥，所述高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；所述低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
对比例1
一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃条件下进行匀浆，匀浆转数为5000rpm，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400g；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌水解2小时，得酶解液400ml；将所述酶解液400g进行离心，得到上清液A；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》进行测定和计算，为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃的环境下静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S4、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B进行旋转蒸发除去乙醇，旋转转速为80rpm，水浴温度为45℃，旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性多肽，放-20℃备用；
其中，所述冷冻干燥参数为：采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间开始进行抽真空，所述第二段至第七段保持真空状态，真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
所述喷雾干燥为高温喷雾干燥或低温喷雾干燥，高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
分别取实施例1、实施例2、实施例3、对比例1制备的具有延缓骨质流失活性的多肽(以下简称活性多肽)，按下述方法测定成骨活性：
成骨细胞增殖活性的测定方法
用MTT法测定MC3T3-E1前成骨细胞的增殖情况，将密度为10000个每孔的MC3T3-E1细胞接种在96孔板中，细胞培养基为含有体积分数为10％FBS的α-MEM培养基，在5％CO2的环境中于37℃分别培养24小时；之后，更换新鲜的10％FBS的α-MEM培养基，并用PBS缓冲液洗涤；然后在分别含有5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml浓度的活性多肽10％FBS的α-MEM培养基中，于37℃下培养分别细胞24和48小时，接着用四甲基偶氮唑蓝MTT溶液(浓度为5mg/mL，用10mM PBS溶解)静置处理4小时；之后，用150μL二甲基亚砜(DMSO)代替培养基，100rpm摇动30分钟。使用酶标仪Microplate Reader(Eon，BioTek，USA)在590nm处测其吸光度值。计算每个孔中MC3T3-E1细胞的活力作为活细胞的百分比。计算公式为：存活细胞％＝(OD延缓骨质流失活性多肽组/OD 10％FBS的α-MEM培养基组)×100％。
骨质疏松小鼠的预防作用
选择小鼠C57品系雌性小鼠，对小鼠卵巢手术摘除的为骨质疏松模型组(OVX)，对小鼠卵巢周围脂肪进行摘除的为假手术组(Sham)，对小鼠卵巢手术摘除并使用实施例3中延缓骨质流失活性多肽灌胃处理的为预防组(OVX-OP)。手术后的所有小鼠修养2周后再进行干预，OVX-OP组延缓骨质流失活性肽灌胃的剂量为每天300mg/kg体重，OVX组和SHAM组使用相同体积的水进行灌胃。总共灌胃3个月后，对小鼠胫骨骨小梁进行Micro-CT骨密度扫描。扫描后采用CT-Analyser软件对各组小鼠的骨密度BMD，骨体积BV，骨组织体积TV，骨体积与骨组织体积比BV/TV等参数进行分析。
结果如图2～图3所示，图2为延缓骨质流失活性多肽(下述简称为活性多肽)促进成骨细胞24h增殖结果，其中在培养基中添加实施例1制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的活性多肽相比，培养24h时对成骨细胞增值了118％；在培养基中添加实施例2制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的活性多肽相比，培养24h时对成骨细胞增值了146％；在培养基中添加实施例3制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的牡蛎水解物相比，培养24h时对成骨细胞增值了156％。图3为活性多肽促进成骨细胞48h增殖结果，其中在培养基中添加实施例1制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的活性多肽相比，培养48h时对成骨细胞增值了117％；在培养基中添加实施例2制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的牡蛎水多肽相比，培养48h时对成骨细胞增值了164％；在培养基中添加实施例3制备的活性多肽500μg/ml，与添加0μg/ml的活性多肽相比，培养48h时对成骨细胞增值了168％。
结果如图4～图7所示，图4为实施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BMD的影响，OVX-OP组的BMD恢复到Sham组的水平，平均为0.11mg/cc，显著高于OVX组的0.014mg/cc；图5为实施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BV的影响，OVX-OP组的BV恢复到Sham的水平，平均为0.28mm3，显著高于OVX组的0.14mm3；图6为实施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠TV的影响，OVX组与OVX-OP的TV与Sham相比没有差别；图5为实施例3中延缓骨质流失活性多肽对骨质疏松小鼠BV/TV的影响，OVX-OP组的BV/TV恢复到SHAM组的水平，平均为10.42％，显著高于OVX组的5.89％。以上结果表使用本发明的制备方法得到的延缓骨质流失活性多肽有对小鼠骨质疏松症有预防的效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉，按料液重量比1:3～1:5加水，0～4℃、4000～5000rpm匀浆，每次匀浆时间为1～2min，间歇时间为30～40s，总共匀浆3～5次，得牡蛎浆液；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：将步骤S1所述牡蛎浆液的pH调节到2.0～4.0，加入胃蛋白酶，在温度30～37℃搅拌1～2小时，得酶解液A；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，每克蛋白质添加胃蛋白酶4500～5000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：将步骤S2所述酶解液A的pH调节到6.5～8.2，加入胰酶，在温度30～37℃搅拌1～3小时，得酶解液B；将所述酶解液B离心，取上清液A；其中，所述胰酶的添加量以上述酶解液A中蛋白质的总含量为基准，每克蛋白质添加胰酶4500～5000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其2～4倍体积的无水乙醇，在4～7℃静置24～48h，离心取上清液B；
S5、旋转蒸发：取步骤S4所述上清液B，置于30℃～45℃进行旋转蒸发至所述上清液B体积的1/10～1/15，得浓缩液；将所述浓缩液干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性的多肽；其中，所述干燥为喷雾干燥或冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S2所述搅拌的转速为45～60rpm。
3.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S3所述离心的参数为：10000～12000g、8～10min。
4.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S4所述离心的参数为：10000～12000g、8～10min。
5.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S5所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃冷冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥24～48小时；在第二段抽真空，所述第二段至第七段真空度18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
6.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S5所述喷雾干燥为常压高温喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
7.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤S5所述喷雾干燥为低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
8.根据权利要求1所述具有延缓骨质流失活性多肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、牡蛎浆液的制备：取牡蛎肉100g，加水300g，0℃、5000rpm均浆，每次匀浆时间为1min，间歇时间为30s，总共匀浆5次，得牡蛎浆液400g；
S2、牡蛎浆液的一次酶解：取步骤S1所述牡蛎浆液400ml；使用4mol/L的HCl将所述牡蛎浆液的pH调节到2.0，加入胃蛋白酶，在温度37℃、55rpm搅拌2小时，得酶解液400ml；其中，所述胃蛋白酶的添加量以所述牡蛎浆液中蛋白质的总含量为基准，所述牡蛎浆液中蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胃蛋白酶5000U，共添加胃蛋白酶150000U；
S3、牡蛎浆液的二次酶解：使用4mol/L的NaOH将步骤S2所述酶解液A的pH调节到8.0，加入胰酶，在温度37℃、55rpm搅拌3小时，得酶解液B；将所述酶解液B在10000g离心10min，得到上清液A；所述酶解液A中的蛋白质总含量为30g，每克蛋白质添加胰酶5000U，共添加150000U；
S4、乙醇沉淀：取步骤S3所述上清液A，加入其3倍体积的无水乙醇，在4℃静置24h，10000g离心10min取上清液B；
S5、旋转蒸发：取在步骤S4所述上清液B在45℃、80rpm旋转蒸发至所述上清液B体积的1/15，得浓缩液；将所述浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥，所得干燥的粉末为具有延缓骨质流失活性的多肽；
其中，所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃冷冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：15℃干燥1小时，第六段：20℃干燥1小时，第七段：25℃干燥48小时；在第二段时间进行抽真空，所述第二段至第七段真空度为18～22Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
所述喷雾干燥为低温喷雾干燥或高温喷雾干燥，所述高温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为35％，进风温度为170℃，进料速度为20L/h，物料温度控制在80℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽；所述低温喷雾干燥：溶液中的固形物含量为30％，真空度达为-0.01～-0.06MPa，进风温度为120℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在40℃，得到具有延缓骨质流失活性的多肽。
9.一种权利要求1-8任一方法制备的延缓骨质流失活性多肽的应用，其特征在于，用于制备预防或/和治疗骨质疏松的药物或食品。
10.一种预防或/和治疗骨质疏松的药物或食品，其特征在于，在制备时加入延缓骨质流失活性多肽。
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