WO2021133190A1 - Способ получения модифицированного гиалуронана - Google Patents

Способ получения модифицированного гиалуронана Download PDF

Info

Publication number
WO2021133190A1
WO2021133190A1 PCT/RU2019/001019 RU2019001019W WO2021133190A1 WO 2021133190 A1 WO2021133190 A1 WO 2021133190A1 RU 2019001019 W RU2019001019 W RU 2019001019W WO 2021133190 A1 WO2021133190 A1 WO 2021133190A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biopolymer
sodium hyaluronate
rpm
crosslinking
reaction
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/001019
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Петрович ГУДОВ
Алмаз Серикович БЕКБАЕВ
Ирина Викторовна РОМАНОВА
Original Assignee
Акционерное общество "Медтехнопроект"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное общество "Медтехнопроект" filed Critical Акционерное общество "Медтехнопроект"
Publication of WO2021133190A1 publication Critical patent/WO2021133190A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates

Definitions

  • the present invention relates to the field of production of medical devices, biotechnology and medicine, including endoprosthetics, and in particular to a method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate and its use in various fields of medicine.
  • Biopolymers based on polysaccharides and their modified derivatives, in particular, based on hyaluronic acid (hereinafter referred to as HA), are used in various fields of biotechnology, medicine, general and aesthetic, in particular surgical practice and endoprosthetics, they have such important properties as biodegradability in living tissues over time, and the rate of the biodegradation process depends on the HA derivative or a complex composition that includes it.
  • These biopolymers must meet such important criteria as biocompatibility, non-immunogenicity, bioinertness and hypoallergenicity. It is known from the prior art that as such a biopolymer, a polysaccharide is widespread — sodium hyaluronate, an anionic glycosaminoglycan.
  • Glycosaminoglycans are linear polysaccharides formed from repeats of disaccharides consisting of amino sugars - hexosamines and uronic acid residues (D-glucuronic or L-iduronic).
  • Hyaluronic acid (HA) [D-glucuronic acid (1-b-3), M-acetyl-E-glucosamine (1-b-4)] h
  • Fig. 1 which is characterized by the absence of sulfate groups, is a biopolymer a wide range and is widely used in various fields of medicine.
  • This macromolecule is most often referred to as hyaluronan, because of the many different forms that the HA molecule can take under physiological conditions (a form of its own acid, and a salt such as sodium hyaluronate) [1].
  • HA present in all vertebrates, is the main component of the extracellular matrix: in the vitreous humor of the human eye (0.1 mg / ml) and in the synovial joint fluid (3-4 mg / ml).
  • HA In vertebrates, HA performs a wide range of functions: in the skin, it maintains tissue hydration [8]; in the cartilage, it nourishes chondrocytes, regulates water exchange and the content of ions, maintains the physical properties of the tissue and regulates the interaction of cartilage cells with the intercellular substrate. Biological effects associated with the interaction of the GK-receptor cause changes in the rate of cell proliferation, migration, and angiogenesis [9, 10]. In addition, an overproduction of HA is observed in diseases associated with inflammation, fibrosis, and cancer. Recently, direct evidence indicates the involvement of HA in cancer metastasis [11, 12]. The molar mass of natural hyaluronan ranges from a few hundred Daltons to 8 million Daltons, but the average value ranges from 1 million to 2 million Daltons.
  • Hyaluronan having good solubility in water, is energetically stable [13] and can exist in various conformational states (elongated chains, relaxed helices, rod-like structures, etc.).
  • the great ability of HA to retain water is due to its hydrophilic chemical nature.
  • This structure (Fig. 2) is supported by intramolecular hydrogen bonds, which give the macromolecule a certain rigidity and promote the formation of hydrophobic regions on its surface, which makes possible the cross-linking of neighboring HA molecules, as well as its interaction with cell membranes and lipid components.
  • Long polymer molecules of hyaluronic acid form fibrils, networks, stacks [14].
  • the viscoelastic nature refers to the rheological behavior of aqueous HA solutions, which exhibit the elasticity of the gel in combination with the viscosity of the liquid.
  • HA is mainly used in the treatment of osteoarthritis, in cosmetics, in ophthalmology, in aesthetic medicine, in surgery and wound healing, as well as in local drug delivery and tissue engineering [16, 18].
  • HA is used in its natural form, namely in a linear form.
  • modifications to the main body are required.
  • Crosslinks initiated in a linear form are divided into physical (formed as a result of electrostatic interaction or hydrogen bonds) and chemical (covalent bonds).
  • the number of covalent crosslinks affects the properties of the obtained hydrogels, such as the degree of swelling, mechanical strength and elasticity, permeability, characteristics associated with the migration of dosage forms and small molecules through them [19].
  • the beneficial effect quickly disappears in a certain period of time.
  • the modified form of HA is less susceptible to chemical and enzymatic hydrolysis, shows long-term stability in vivo, thus prolonging the beneficial effect of its use [16]. Modification processes, especially crosslinking, significantly improve the specific mechanical properties of the material [16].
  • Polypropylene glycol is a non-toxic, clear and colorless odorless liquid that is widely used in the food, pharmaceutical and cosmetic industries as a direct and indirect additive.
  • the liquid has low vapor pressure and low viscosity.
  • Commercial polypropylene glycol is usually obtained from water and propylene oxide obtained from organic and inorganic sources.
  • Polypropylene glycol has been designated GRAS (Generally Recognized as Safe) by the US Food and Drug Administration because it is easily metabolized in the human body as carbohydrates.
  • GRAS Generally Recognized as Safe
  • the inert chemical serves as a solvent and stabilizer as it does not react or alter the ingredients in the final product.
  • the objective of the present invention is to develop a new effective method for producing a biopolymer based on a modified spatially crosslinked copolymer of sodium hyaluronate, which promotes a complete replacement of the endoprosthetic biological fluid while maintaining basic natural properties, including structural and transport functions.
  • the technical result of the present invention is the development of a new effective method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate, which promotes the most complete replacement of endoprosthetic biological fluid while maintaining basic natural properties, including structural and transport functions.
  • the specified method of obtaining a biopolymer is highly scalable, allows you to obtain a hypoallergenic biopolymer with a high degree of purity and a low level of endotoxin content, that is, characterized by low toxicity.
  • this method makes it possible to regulate the creation of cross-linking in order to obtain a biopolymer with a spatial structure, capable of retaining and / or releasing proteins, that is, to carry out a depositing transport function.
  • the biopolymer obtained by the claimed method can be widely used in medicine, including surgery and endoprosthetics, orthopedics, traumatology, ophthalmology, and aesthetic medicine.
  • the specified technical result is achieved by implementing a method for producing a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate, including the following stages:
  • each crosslinking agent has a molecular weight ranging from 500 to 8000 Da.
  • the molar ratio of sodium hyaluronate and crosslinking agents is 1: 200 to 1: 600. In more specific options embodiments of the invention, the molar ratio of sodium hyaluronate and crosslinking agents is 1: 400.
  • the reaction mixture is stirred at a temperature of 4-25 ° C and for 10-12 hours.
  • the resulting reaction mixture after the stage of stopping and binding of epoxy groups, is neutralized to a pH of 7.0 ⁇ 0.5, dialyzed in a flow system with a physiological phosphate buffer, where the pH takes on a value of 7.3 ⁇ 0.2.
  • the molecular weight of sodium hyaluronate is from 1x10 6 Da to 2 ⁇ 10 6 Da.
  • the covalent crosslinking step is carried out in a temperature range of 0 ° C to 10 ° C.
  • the covalent crosslinking step is carried out for 18-22 hours.
  • the crosslinking agents can be administered simultaneously, sequentially or over a period of time, in particular over a period of 3-5 hours.
  • the molar mass of the resulting biopolymer does not exceed 5000 kDa.
  • the present invention also includes a biopolymer based on a modified sodium hyaluronate copolymer intended for use as a synovial fluid endoprosthesis and obtained by the method of the invention.
  • the molar mass of the biopolymer does not exceed 5000 kDa.
  • the biopolymer has a degree of crosslinking of 10 ⁇ 3%.
  • Figure 1 Structural formula of the monomeric unit of the hyaluronan molecule.
  • Figure 2 Structural formula of a tetramer of a hyaluronic acid molecule in an aqueous environment in solution.
  • FIG. 6 MTT analysis of cytotoxicity of the sample "Giruanana plus” (HA) and a sample of biopolymer (X1) obtained by the method according to the invention.
  • the Y-axis indicates a dimensionless value: the cytotoxicity index (CI), expressed in quotient from the division of the number of cells in the experiment by the number of cells in the control.
  • Figure 7. Morphology of cells of peritoneal exudate (M1 and M2 correspond to the population of macrophages, Ly - to lymphocytes):
  • Figure 8 Deposition of HA (A) and X1 (B) in adipose cells 7 days after subcutaneous administration. HA and X1 are labeled with rhodamine B (red), the nuclei are colored blue. Scale 37 microns.
  • Figure 9 Capture by macrophages of the peritoneal cavity of the sample HA (A) or X1 (B) 7 days after the intravenous injection of fillers. Macrophages are stained with antibodies with CD11b (green), fillers are stained with rhodamine B (red), nuclei are colored blue. Scale 5-6 microns.
  • FIG. 10 Biodistribution of sample HA (A-B) and X1 (D-3) 10 days after i.p. injection of 200 ⁇ l of sample with rhodamine B (red).
  • A D adipose tissue, scale 17 microns; B, E - kidneys, scale 17 ⁇ m (inset, scale 120 ⁇ m); B, G - liver, scale 30 microns, 3 - liver, scale 111 microns; D - liver, intact mouse.
  • Cell nuclei are colored blue.
  • FIG. 11 Biodegradation of a sample of HA (A) and X1 (B) by human skin cells (HaCaT line) on day 9 of spheroid cultivation. Scale 22 microns. Spheroids were obtained on an anti-adhesive substrate.
  • FIG. 12 Biodegradation of HA (A, C) and X1 (B, D) in A / Sn mice 20 days after intraperitoneal injection (A, B) or in the area of the fat pad N ° 3 of the mouse. Scale 45 microns. Nuclei are stained with Hoechst (blue), cell membranes - with phalloidin (green).
  • Figure 13 The presence of a fluorescent signal in the region of rhodamine (FL2) in splenocytes of A / Sn mice 20 days after intraperitoneal injection (A, B) or in the area of the Ne3 fat pad (C, D).
  • FL2 rhodamine
  • cleavage or depolymerization refers to structural changes in a biopolymer (hyaluronate) due to the influence of environmental, chemical or thermal factors that entail a decrease in the average molecular weight of the biopolymer, including during autoclaving, leading to a change in rheological properties ...
  • degradation refers to a change in physicochemical properties that occurs as a result of the action of temperatures, acids, or alkalis, as well as the action of enzymes in vitro, in particular, huluronidase. Degradation of biopolysaccharides occurs mainly through the cleavage of glycosidic bonds by acid catalytic hydrolysis.
  • biodegradation refers to a change in physicochemical properties that occurs over a certain time, as a result of exposure to factors of the immune system and the enzymatic activity of the interstitial and intercellular environment, where the implant was placed in vivo.
  • molecular weight (average molecular weight) is the statistical average of the relative molecular weights of the macromolecules that make up the biopolymer.
  • oligomer in this document refers to a molecule in the form of a chain of a small number of identical constituent units.
  • the term "monomer” in this document refers to a molecule (disaccharide), an elementary structural unit of which a biopolymer is composed as a result of its lining up in a chain with multiple repetitions.
  • hyaluronan refers to a non-sulfated glycosaminoglycan, which is a linear, unbranched polymer built from a repeating disaccharide moiety of hyaluronic acid, consisting of 0-glucuronide - - (1,3) - (M-acetyl) -glucosamine and connected by a b (1-4) glycosidic bond.
  • Polypropylene glycol diglycidyl ether is an affordable and easy-to-use, safe cross-linking agent, the general formula is CsH502-0CH (CHs) CH2) p-C 3 H 5 O (Fig. 4), where polypropylene glycol molecules are monomers for HA chain spacing, with molar masses from 500 to 800 0000 Yes.
  • the method of obtaining a biopolymer based on a modified copolymer of sodium hyaluronate according to the invention consists in creating cross-linking covalent ether bonds between the residues of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine, which are part of sodium hyaluronate, as a result of the introduction of two or more cross-linking bifunctional agents -
  • the main raw material for the process is hyaluronic acid, its sodium salt can be obtained, in particular, by the method of biotechnological synthesis based on bacterial strains (Streptococcus, Bacillus subtilis).
  • the resulting reaction mixture is neutralized to a pH of about 7, the remaining free epoxy groups are deactivated with glycine (Fig. 5), then the resulting biopolymer is subjected to flow dialysis, homogenized, and after filling in glass vials or pre-filled syringes, sterilized with steam.
  • the use of the stage of deactivation of epoxy groups with glycine allows obtaining a safe product characterized by low toxicity. This removes glycine residues during the dialysis step.
  • the starting material for the implementation of the method according to the invention is a pharmacopoeially pure sodium hyaluronate with a molecular weight in the range from 1x10 6 Da to 2x10 6 Da. Then hyaluronan is dissolved in a sodium hydroxide solution, which is a prerequisite for the reaction with PPHDE and a decrease in the final viscosity of the solution, which in turn improves the rheological properties of the solution and makes it possible for its uniform mixing and homogenization.
  • Cross-linking agents PPGDE separately, or a mixture in a certain proportion is added to the sodium hyaluronate solution, the reaction is carried out in the temperature range from 0 ° C to 10 ° C.
  • the reaction at each stage (including the stage of HA dissolution, the stage of cross-linking (creation of cross-links), the stage of stopping the reaction, neutralization and dialysis) lasts no more than 24 hours.
  • the main feature of the invention is the ability to accurately control (in particular, by the method of one-dimensional ( 1 H, 13 C) and two-dimensional ( 1 H- 1 H COZY, 1 H- 13 C HSQC) NMR spectroscopy, as well as by means of Raman spectra) the reaction conditions polymerization, which will make it possible to obtain hyaluronan derivatives with unique properties, the spatial structure of the molecular network that affects the protein interaction, namely, with the ability to control the exchange and release of proteins.
  • the method according to the invention allows you to accurately change the rheological properties of the obtained biopolymer to ensure the performance of natural functions of the prosthetic biological fluid, in particular, as an endoprosthesis of synovial fluid, while maintaining the properties of unhindered penetration into the spongy intercellular structure of the cartilage to deliver nutrient components to chondrocytes.
  • the method according to the present invention produces a biopolymer with a defined pore size that allows transport of proteins.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a biopolymer, which is characterized not only by the necessary rheological properties, but also by transport functions similar to those for biological fluids, in particular synovial fluid.
  • the rate of interaction of hyaluronic acid and epoxy groups of cross-linking agents is not a linear characteristic.
  • the required percentage of crosslinking, in particular 10 ⁇ 3%, according to the method according to the invention was monitored by means of NMR methods, such as: 1 H-NMR, 13 C-NMR, 1 H- 1 H COZY, 1 H- 13 C HSQC, 1 H- 13 ⁇ ⁇ .
  • NMR methods such as: 1 H-NMR, 13 C-NMR, 1 H- 1 H COZY, 1 H- 13 C HSQC, 1 H- 13 ⁇ ⁇ .
  • the main advantage of this method is the ability to obtain biopolymers similar in rheological properties to human biological fluid, while controlling the average molecular weight of the obtained polymer crosslinked chains.
  • double crosslinking is the ability to obtain biopolymers similar in rheological properties to human biological fluid, while controlling the average molecular weight of the obtained polymer crosslinked chains.
  • the biopolymer based on modified sodium hyaluronate according to the invention is biocompatible, non-immunogenic, more resistant to enzymatic degradation than unmodified hyaluronan, which allows it to be used in various fields of general medicine, in particular:
  • the biopolymer according to the invention can also be used in the surgical treatment of ophthalmic diseases, eye injuries, corneal injuries as a viscoprotector, protector of endothelial cells during operations;
  • a biopolymer obtained by the method according to the invention can help to moisturize skin and thus restore elasticity, thereby reducing the depth of wrinkles.
  • this biopolymer can stimulate epidermal cells to proliferate and divide, as well as help protect human skin from ultraviolet radiation.
  • the reaction was stopped by adding 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddHfeO (sterile ultrapure water) and left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na2HPC> 4 / NaH2P04, 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by the addition of 0.4 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddHbO, and the mixture was left stirring for 12 h at + 4 ° C (30 rpm).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM agHPO ⁇ MangPC, 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 30 mg / ml.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 10 hours at + 4 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 15 mg / ml.
  • the obtained biopolymer was stirred by means of an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 10 hours at + 4 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 PC> 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7, 2 + 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 10 hours at + 4 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na2HP04 / NaH 2 P0, 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddhbO, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 / NaH 2 P0 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by the addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml of ddhbO, and the mixture was left stirring for 10 h at + 4 ° C (30 rpm).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed, changing 4 times physiological phosphate buffer (PBS, 1 L, 2 mM IAGNRS LMaHPO ⁇ 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 10 hours at + 10 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 20 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 5 ° C.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 10 hours at +4 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 15 mg / ml.
  • the reaction was stopped by addition of 0.2 g of glycine, previously dissolved in 1 ml ddH 2 0 and allowed to stir for 12 hours at + 4 ° C (30 rev / min).
  • the resulting biopolymer was neutralized with a 1 M hydrochloric acid solution to pH 7.0, then transferred to a dialysis bag (Viking, 12 kDa).
  • the biopolymer was dialyzed by changing the physiological phosphate buffer 4 times (PBS, 1 L, 2 mM Na 2 HP0 / NaH 2 P0 4 , 145.5 mM NaCl, pH 7.2 ⁇ 0.2).
  • the resulting product was brought with the required amount of buffer to a concentration of 30 mg / ml.
  • the resulting biopolymer was stirred with an overhead stirrer for another 2 h at 30 rpm for its complete homogenization at a temperature of + 4 ° C.
  • the present invention proposes the introduction of an additional stage, including the treatment of the reaction mass of the crosslinked biopolymer with a glycine solution, this stage allows you to stop the polymerization reaction in a short time and additionally solve the problem of free epoxy groups that cause the toxicity of the resulting biopolymer, since as a result of isomerization, oxirane groups are isomerized to form aldehyde, which determines the toxicity of the biopolymer.
  • glycine as a nucleophilic agent, attaches and blocks the epoxy group.
  • the resulting crosslinked biopolymer does not have a toxic effect.
  • Toxicity tests were carried out in comparison with the analogue of the synovial fluid endoprosthesis containing only HA solution without cross-linking, "Giruan plus". Also, the test result was a description of the effect of the drug on the mouse immune system and the provision of data with indicators of changes in marker cells, inflammatory reactions, the deposition effect of the drug and the assumption of ways of excretion.
  • HA "Giruan plus"
  • a preparation containing HA without chemical modification at a concentration of 10 mg / ml, phosphate-physiological buffer, as well as the preparation of the endoprosthesis of synovial fluid ESL-HA-PPEGDE-1 (X1 ) is a preparation prepared according to the method according to the invention, which is a solution of 10 mg / ml cross-linked biopolymer (obtained according to example 2 of this document), phosphate-physiological buffer.
  • In vivo toxicity In vivo toxicity was assessed in A / Sn mice. Fillers were injected into mice intraperitoneally with a 30G needle in volumes of 50, 100, 150, and 200 ⁇ l per mouse. Mice were removed from the experiment after 7, 8 and 10 days. Peritoneal exudate and spleen were collected. The number and subpopulation composition of cells in the exudate and spleen were assessed. An intact mouse was used for comparison. The research results showed that the number of cells and subpopulation composition in the abdominal cavity is within normal limits (Fig. 7, Table 1).
  • mice were removed from the experiment after 20 days, and adipose tissue was taken from the injection site (abdominal cavity and in the area of subcutaneous injection). Analysis of adipose tissue was performed using histology. The results of the studies showed that after 20 days in the abdominal cavity and in the area of subcutaneous injection, the samples are partially hydrolyzed, but reliably detected (Fig. 12).
  • the organs were homogenized in saline, an equal volume of 70% ethanol was added, rhodamine B was extracted for 12 hours, centrifuged at 15 thousand rpm for 20 minutes, the clarified supernatants were transferred to plates and the fluorescence was measured on a reader at a wavelength of 525 nm. Data on mean fluorescence intensity (MFI) minus control for intact mice are shown. Data are not normalized to organ weights.
  • Hydrolysis in tissues is associated with the capture of debris by macrophages, its hydrolysis and its partial transport to the spleen (Fig. 13) and to the liver. There were no differences in the hydrolysis and transport of the samples.
  • Balazs E.A. and Gibbs DA The rheological properties and biological function of hyaluronic acid // Chem Mol Biol Intercell Matrix. -1970. - Vol. 3. - P. 1241-1245. 2. Balazs EA, Leshchiner E., Larsen NE and Band P. Applications of hyaluronan and its derivates / Gebelein CG (ed) Biotechnological polymers. Technomic, Lancaster. -1993. -P. 41-65.
  • the hyaluronate receptor is referentially expressed on proliferating epithelial cells // J. Cell. Biol. -1989. - Vol. 108 .-- P. 1557-1565.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области производства медицинских изделий, биотехнологии и медицины, в том числе эндопротезирования, а именно к методу получения биополимера на основе гиалуроната натрия и применению его в различных областях медицины. Предложенный способ позволяет получать биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, способствующего наиболее полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции, а также характеризующегося низкой токсичностью. Биополимер, полученный заявленным способом, может найти широкое применение в медицине, в том числе хирургии и эндопротезировании, ортопедии, травматологии, офтальмологии, эстетической медицине.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИАЛУРОНАНА
Область техники
Настоящее изобретение относится к области производства медицинских изделий, биотехнологии и медицины, в том числе эндопротезирования, а именно к способу получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия и применению его в различных областях медицины.
Уровень техники
Биополимеры на основе полисахаридов и их модифицированных производных, в частности, на основе гиалуроновой кислоты (далее ГК) находят применение в различных областях биотехнологии, медицины, общей и эстетической, в частности хирургической практике и эндопротезировании, они обладают такими важными свойствами, как биодеградируемость в живых тканях с течением времени, а скорость процесса биодеградации зависит от производного ГК или сложной композиции, его включающей. Указанные биополимеры должны отвечать таким важным критериям, как биосовместимость, неиммуногенность, биоинертность и гипоаллергенность. Из уровня техники известно, что в качестве такого биополимера широко распространен полисахарид - гиалуронат натрия, анионный гликозаминогликан.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой линейные полисахариды, образующиеся из повторений дисахаридов, состоящих из аминосахаров - гексозаминов и остатков уроновых кислот (D-глюкуроновой или L-идуроновой). Гиалуроновая кислота (ГК) ([D-глюкуроновая кислота (1-b-3), М-ацетил-Э-глюкозамин (1-b-4)]h) (фиг. 1), которая отличается отсутствием сульфатных групп, является биополимером широкого спектра и широко применяется в различных областях медицины. Эта макромолекула чаще всего упоминается как гиалуронан, из-за многих различные форм, которые молекула ГК может принимать в физиологических условиях (форма собственной кислоты, и соли, например гиалуронат натрия) [1].
Этот биополимер широко распространен в природе, будучи идентифицированным в мягких тканях позвоночных (например, суставы, синовиальная жидкость, кожа, стекловидное тело глаза, пуповина) [2], у водорослей [3], у моллюсков [4], и также в культивируемых эукариотических клеточных линиях и некоторых прокариот, где выполняет функцию защитной капсулы, окружающей клетку [5]. ГК, присутствующая у всех позвоночных, является основным компонентом внеклеточного матрикса: в стекловидном теле глаза человека (0,1 мг/мл) и в синовиальной суставной жидкости (3-4 мг/мл).
У позвоночных ГК выполняет широкий спектр функций: в коже она поддерживает гидратацию тканей [8]; в хряще она питает хондроциты, регулирует обмен воды и содержание ионов, поддерживает физические свойства ткани и регулирует взаимодействие клеток хряща с межклеточным субстратом. Биологические эффекты, связанные с взаимодействием ГК-рецептора, вызывают изменения скорости в пролиферация клеток, их миграции и ангиогенез [9, 10]. Кроме того, перепроизводство ГК наблюдается при заболеваниях, связанных с воспалением, фиброзом и раком. В последнее время прямые доказательства свидетельствуют об участии ГК при метастазировании рака [11, 12]. Молярная масса природного гиалуронана варьируется от нескольких сотен Дальтон до 8 млн Дальтон, но среднее значение колеблется в интервале от 1 млн до 2 млн Дальтон.
Гиалуронан, обладая хорошей растворимостью в воде, энергетически стабилен [13] и может существовать в разнообразных конформационных состояниях (вытянутые цепи, расслабленные спирали, стержневидные структуры и др.). Большая способность ГК удерживать воду связана с его гидрофильной химической природой. Такую структуру (Фиг. 2) поддерживают внутримолекулярные водородные связи, которые придают макромолекуле определенную жесткость и способствуют образованию на её поверхности гидрофобных участков, что делает возможным поперечное связывание соседних молекул ГК, а также его взаимодействие с клеточными мембранами и липидными компонентами. Длинные полимерные молекулы гиалуроновой кислоты, формируют фибриллы, сети, стопки [14]. Вязкоупругая природа относится к реологическому поведению водных растворов ГК, которые проявляют эластичность геля в сочетании с вязкостью жидкости.
Даже при небольших концентрациях гиалуронана происходит внутримолекулярное взаимодействие, возникает упорядоченная и относительно стабильная трёхмерная структура в виде пластинок и трубочек, хотя молекулы полисахарида в растворе продолжают находиться в движении [17].
Из-за вышеупомянутых выделенных свойств, разработка и коммерциализация продуктов на основе ГК находятся в непрерывном движении. ГК в основном используется в лечение остеоартроза, в косметике, в офтальмологии, в эстетической медицине, в хирургия и заживление ран, также при местной доставке лекарственных средств и тканевой инженерии [16, 18].
В некоторых из вышеупомянутых областей применения ГК используется в естественном виде, а именно в линейной форме. Однако для многих целей необходимы модификации ГК. Инициируемые в линейной форме поперечные сшивки разделяют на физические (образованные в результате электростатического взаимодействия или водородных связей) и химические (ковалентные связи). Количество ковалентных сшивок оказывает влияние на свойства полученных гидрогелей, такие как степень набухания, механическая прочность и эластичность, проницаемость, характеристики, связанные с миграцией сквозь них лекарственных форм и малых молекул [19].
Применение линейных форм ГК в условиях in vivo приводит к скорой потере молекулярной массы, изменению вязкоупругих свойств и структуры в виду нестабильности из-за действия ферментов гиалуронидаз, свободных радикалов и температуры. Для решения вышеупомянутых проблем, можно реализовать подход, основанный на создании поперечных связей внутри и межмолекулярных связей в молекуле полимера ГК. Это обстоятельство уменьшает скорость биодеградации, подразумевает увеличение времени его местонахождения в тканях и его планирование в зависимости от типа модификации. Данные производные могут быть получены с помощью различных реагентов, например, карбодиимидов [US7879818, US20070224277], производных дивинилсульфона [US4582865, US4605601, US4636524, ЕР0939086], замещенных оксиранов [US4716224, US4772419, US4716154], 1,4- бутандиолдиглицидилового эфира (БДДЭ) [WO2013021249, US4716224], многоатомных спиртов [US4957744], органических альдегидов [US4713448, US5128326, US4582865], бискарбодиимидов [US5356883], полимеров карбоновых кислот [ЕР0718312], карбонат- замещенного пиридина [ЕР 2408823], олиго- или полипептида [ЕР2094736], производных азиридина [US20050222081]
Таким образом, если линейная форма ГК используется для подкожных инъекций, то полезный эффект быстро проходит в определенный период времени. Модифицированная форма ГК, напротив, менее восприимчива к химическому и ферментативному гидролизу, показывает длительную устойчивость в естественных условиях, таким образом пролонгирует полезный эффект от применения [16]. Процессы модификации, особенно сшивки, значительно улучшают специфические механические свойства материала [16].
Однако стоит упомянуть, что в результате использования сшивающих агентов различной природы, существует необходимость их своевременной дезактивации, поскольку в результате деградации полимера они могут высвобождаться с сохранением токсичных свойств.
Полипропиленгликоль (ППГ) является нетоксичной, прозрачной и бесцветной жидкостью без запаха, которая широко используется в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в качестве прямой и непрямой добавки. Жидкость имеет низкое давление пара и вязкость. Коммерческий полипропиленгликоль обычно получают из воды и пропиленоксида, полученных из органических и неорганических источников. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США присвоило полипропиленгликолю статус GRAS (общепризнанный как безопасный), поскольку он легко метаболизируется в организме человека в виде углеводов. В пищевой и фармацевтической индустрии ППГ используются уже более 50 лет. Инертное химическое вещество служит растворителем и стабилизатором, так как оно не реагирует и не изменяет ингредиенты конечного продукта. Таким образом, разработка новых подходом к созданию биополимеров (гелей) на основе модифицированной ГК является актуальной и важной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного пространственно- сшитого сополимера гиалуроната натрия, способствующего полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, способствующего наиболее полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции. Указанный способ получения биополимера хорошо масштабируем, позволяет получать гипоаллергенный биополимер с высокой степенью чистоты и низким уровнем содержания эндотоксинов, то есть характеризующегося низкой токсичностью. Кроме того, указанный способ позволяет осуществлять регулировку создания поперечной сшивки с тем, чтобы получить биополимер с пространственной структурой, способный удерживать и/или высвобождать белки, то есть осуществлять депонирующую транспортную функцию. Биополимер, полученный заявленным способом, может найти широкое применение в медицине, в том числе хирургии и эндопротезировании, ортопедии, травматологии, офтальмологии, эстетической медицине.
Указанный технический результат достигается за счет осуществления способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, включающий следующие стадии:
- создание поперечных ковалентных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, посредством введения двух и более сшивающих агентов различных молекулярных масс, в различном соотношении в основной среде, каждый из которых представляет собой (полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир;
- остановка стадии создания поперечных ковалентных связей и связывание свободных эпоксидных групп посредством добавления глицина.
В частных вариантах воплощения изобретения каждый сшивающий агент характеризуются молекулярную массу, имеющую значение в диапазоне от 500 до 8000 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:200 - 1:600. В более конкретных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1 :400.
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии добавления глицина реакционную смесь перемешивают при температуре 4-25°С и в течение 10-12 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения полученную реакционную смесь после стадии остановки и связывания эпоксидных групп нейтрализуют до значения pH 7,0±0,5, подвергают диализу в проточной системе с физиологическим фосфатным буфером, где pH принимает значение 7,3±0,2.
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроната натрия составляет от 1x106 Да до 2^106 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 10°С.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в течение 18-22 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения сшивающие агенты могут вводится одновременно, последовательно или через промежуток времени, в частности, промежуток времени составляет 3-5 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса получаемого биополимера не превышает 5000 кДа.
Настоящее изобретения также включает биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, предназначенный для использования в качестве эндопротеза синовиальной жидкости и полученный способом по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса биополимера не превышает 5000 кДа. В частных вариантах воплощения изобретения биополимер имеет степень сшивки 10±3 %.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Краткое описание чертежей.
Фигура 1. Структурная формула мономерного звена молекулы гиалуронана.
Фигура 2. Структурная формула тетрамера молекулы гиалуроновой кислоты в водном окружении в растворе.
Фигура 3. Химическая схема модификации гиалуронана посредством ППГДЭ для двух молекулярных масс.
Фигура 4. Общая структурная формула сшивающего агента ППГДЭ.
Фигура 5. Взаимодействие свободной эпоксидной группы с глицином.
Фигура 6. Анализ цитотоксичности методом МТТ образца «Гируанана плюс» (НА) и образца биополимера (Х1), полученного способом по изобретению. По оси Y указана безразмерная величина: индекс цитотоксичности (ЦИ), выражающегося в частном от деления количества клеток в опыте на количество клеток в контроле. Фигура 7. Морфология клеток перитонеального экссудата (М1 и М2 соответствует популяция макрофагов, Ly - лимфоцитам):
(A) в контроле;
(Б) после в/б введения образца «Гируанана плюс» (НА);
(B) после в/б введения образца биополимера (Х1), полученного способом по изобретению.
Фигура 8. Депонирование НА (А) и Х1 (Б) в жировых клетках через 7 дней после подкожного введения. НА и Х1 мечены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 37 мкм.
Фигура 9. Захват макрофагами перитонеальной полости образца НА (А) или Х1 (Б) через 7 дней после в/б введения филлеров. Макрофаги окрашены антителами с CD11b (зеленый), филлеры окрашены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 5-6 мкм.
Фигура 10. Биораспределение образца НА (A-В) и Х1 (Д-3) через 10 дней после в/б введения 200 мкл образца с родамином В (красный). А, Д жировая ткань, шкала 17 мкм; Б, Е - почки, шкала 17 мкм (на врезке шкала 120 мкм); В, Ж- печень, шкала 30 мкм, 3 - печень, шкала 111 мкм; Г - печень, интактная мышь. Синим окрашены ядра клеток.
Фигура 11. Биодеградация образца НА (А) и Х1 (Б) клетками кожи человека (линия НаСаТ) на 9 день культивирования сфероидов. Шкала 22 мкм. Сфероиды получены на антиадгезивной подложке.
Фигура 12. Биодеградация НА (А, В) и Х1 (Б, Г) в мышах линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки N°3 мыши. Шкала 45 мкм. Ядра окрашены Хехст (синий), мембраны клеток - фаллоидином (зеленый).
Фигура 13. Наличие флуоресцентного сигнала в области родамина (FL2) в спленоцитах мышей линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки Ne3 (В, Г).
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
В описании данного изобретения термин «расщепление или деполимеризация» относится к структурным изменениям биополимера (гиалуроната) из-за воздействия экологических, химических или термических факторов, которые влекут за собой уменьшение средней молекулярной массы биополимера, в том числе при автоклавировании, приводящем к изменению реологических свойств. В описании данного изобретения термин «деградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в результате действия температур, кислот, или щелочей, а также действию ферментов in vitro, в частности, гиулуронидазой. Деградация биополисахаридов, происходит в основном посредством расщепления гликозидных связей кислотно-каталитическим гидролизом.
В описании данного изобретения термин «биодеградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в течение определенного времени, в результате воздействия факторов иммунной системы и ферментативной активности межтканевой и межклеточной среды, куда был помещен имплантат in vivo.
Термин «молекулярная масса (средний молекулярный вес)» - это средняя статистическая величина относительных молекулярных масс макромолекул, составляющих биополимер.
Термин «олигомер» в данном документе относится к молекуле в виде цепочки из небольшого количества одинаковых составных звеньев.
Термин «мономер» в данном документе относится к молекуле (дисахарид), элементарной структурной единице из которой состоит биополимер в результате ее выстраивания в цепочку с многократным повторением.
В описании данного изобретения термины «гиалуронан» относится к несульфатированному гликозаминогликану, который представляет собой линейный, неразветвленный полимер, построенный из повторяющегося дисахаридного фрагмента гиалуроновой кислоты, состоящей из 0-глюкуронида- -(1,3)-(М-ацетил)-глюкозамина и соединенной b (1-4) гликозидной связью.
(Полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир - доступный и удобный в использовании, безопасный сшивающий агент, общая формула - СзН502-0СН(СНз)СН2)п- С3Н5О (фиг. 4), где мономерами для дистанцирования цепей ГК являются молекулы полипропиленгликоля, с молярными массами от 500 до 800 0000 Да.
Осуществление изобретения
Способ получении биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия согласно изобретению заключается в создании поперечных ковалентных простых эфирных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N- ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, в результате введения двух и более сшивающих бифункциональных агентов -
(полипропиленгликоль)диглицидиловых эфиров (ППГДЭ) с различными молярными массами и в разных пропорциях в основной среде (фиг. 3). Основным сырьем для процесса служит гиалуроновая кислота, ее натриевая соль может быть получена, в частности, методом биотехнологического синтеза на основе бактериальных штаммов ( Streptococcus , Bacillus subtilis). После процесса химической сополимеризации полученную реакционную смесь нейтрализуют до показателя pH около 7, оставшиеся свободные эпоксидные группы дезактивируют глицином (фиг. 5), затем полученный биополимер подвергают проточному диализу, гомогенизируют и после розлива по стеклянным флаконам или шприцам предварительного заполнения, стерилизуют паром. Использование стадии дезактивация эпоксидных групп глицином позволяет получить безопасный продукт, характеризующийся низкой токсичностью. При этом в ходе стадии диализа остатки глицина удаляются.
Исходным сырьем для осуществления способа по изобретению служит фармакопейно чистый гиалуронат натрия с молекулярной массой в диапазоне от 1x106 Да до 2x106 Да. Затем гиалуронан растворяют в растворе гидроксида натрия, что является необходимым условием для реакции с ППГДЭ и уменьшения конечной вязкости раствора, что в свою очередь улучшает реологические свойства раствора и делает возможным его равномерное перемешивание и гомогенизацию.
Сшивающие агенты ППГДЭ по отдельности, или смесь в определенной пропорции добавляют к раствору гиалуроната натрия, реакцию ведут в интервале температур от 0°С до 10°С. Реакция на каждой стадии (в том числе на стадии растворения ГК, стадии сшивки (создания поперечных связей), стадии остановки реакции, нейтрализации и диализа) длится не более 24 ч.
Основной особенностью изобретения является возможность точно контролировать (в частности, посредством метода одномерной (1Н, 13С) и двумерной (1Н-1Н COSY, 1Н-13С HSQC) спектроскопии ЯМР, а также посредством спектров комбинационного светорассеяния) условия реакции полимеризации, что позволит получать производные гиалуронана, обладающими уникальными свойствами, пространственной структурой молекулярной сети, влияющей на белковое взаимодействие, а именно с возможностью контролировать обмен и высвобождение белков. Способ по изобретению позволяет точно изменять реологические свойства полученного биополимера для обеспечения выполнения природных функций, протезируемой биологической жидкости, в частности, как эндопротез синовиальной жидкости с сохранением свойств беспрепятственного проникновения в губчатую межклеточную структуру хряща для доставки питательных компонентов хондроцитам. Другими словами, способ согласно настоящему изобретению позволяет получить биополимер с определенным размером пор, которые обеспечивают транспорт белков. Таким образом, способ по изобретению позволяет получить биополимер, который характеризуется не только необходимыми реологическими свойствами, но и транспортными функциями аналогичными для биологических жидкостей, в частности синовиальной жидкости.
Скорость взаимодействия гиалуроновой кислоты и эпоксидных групп сшивающих агентов не является линейной характеристикой. Необходимый процент сшивки, в частности 10±3 %, согласно способу по изобретению контролировался посредством методов ЯМР, таких как: 1Н-ЯМР, 13С-ЯМР, 1Н-1Н COSY, 1Н-13С HSQC, 1Н-13С НМВС. Таким образом, способ по изобретению позволяет промышленно получать биополимер с воспроизводимыми физико-химическим характеристиками, с возможностью контроля структуру и количества свободных эпоксидных групп.
Основным преимуществом данного способа (двойной сшивки) является возможность получать близкие по реологическим свойствам к биологической жидкости человека биополимеры, при этом контролируя среднюю молекулярную массу полученных полимерных сшитых цепей. Например, при замене синовиальной жидкости на биополимер, полученный способом по изобретению, не происходит изменение локомоции сустава, куда был помещен эндопротез синовиальной жидкости, и нет препятствий для проникновения в межклеточное пространство, а именно в поры хрящевой ткани. В связи с чем нет прерывания питания хрящевой ткани при данного рода терапии.
Биополимер на основе модифицированного гиалуроната натрия по изобретению является биосовместимым, неиммуногенным, более устойчивым к ферментативному расщеплению, чем немодифицированный гиалуронан, что позволяет использовать его в различных областях общей медицины, в частности:
1) в ревматологии, ортопедии и травматологии в качестве средства для внутрисуставного введения пролонгированного действия при терапии остеоартрозов дегенеративно-дистрофического и постравматического генеза различной локализации (не только крупных суставов, а именно коленного и тазобедренного, но более мелких, таких как плечевой и локтевой суставы). При внутрисуставных инъекциях сшитых и линейных форм ГК обнаружено, что гиалуронан оказывает терапевтическое воздействие при остеоартрите. Несколько исследований были проведены для изучения эффектов, показывающих, что ГК способна подавлять дегенерация хряща, обеспечивать защиту мягких тканей поверхностей суставов, нормализует реологические свойства синовиальной жидкости и приводит к снижению болевого восприятия [20, 21, 18].
2) в офтальмологии в качестве активного ингредиента для увлажнения глаз, также биополимер по изобретению может быть использован при хирургическом лечении офтальмологических заболеваний, травм глаза, повреждений роговицы в качестве вископротектора, протектора клеток эндотелия при операциях;
3) в качестве депонирующего агента для инъекционной имплантации в пораженную ткань, или орган с последующим высвобождением биологически активных веществ и лекарственных средств: как малых молекул, так и терапевтических биополимеров, в частности, пептидной природы;
4) в эстетической медицине в качестве кожных наполнителей по безоперационному увеличению мягких тканей, в том числе для сглаживания морщин и увеличения объема мягких тканей, такие как губы и грудь.
5) в косметике в качестве увлажняющего компонента. Использование биополимера, полученного способом по изобретению, может способствовать увлажнению кожи и таким образом восстанавливать эластичность, уменьшая тем самым глубину морщин. Кроме того, указанный биополимер может стимулировать эпидермальные клетки к пролиферации и делению, а также способствовать защите коже человека от ультрафиолетового излучения.
6) применение при местной доставке лекарств.
Реализацию способа получения сополимера с межмолекулярной и внутримолекулярной сшитой структурой можно продемонстрировать на следующих примерах.
Пример 1. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,3 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHfeO (стерильная ультрачистая вода) и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HPC>4/NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 2. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 2 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
Реакцию остановили добавлением 0,4 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHbO и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ агНРО^МаНгРС , 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С. Пример 3. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 2,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP04/NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный Биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 4. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP04/NaH2PC>4, 145,5 мМ NaCI, pH 7, 2+0, 2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 5. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 0,2 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP04/NaH2P0 , 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 6. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1 ,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddhbO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP0 /NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 7. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1 ,00 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1 ,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,40 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1 ,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddhbO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ ИагНРС ЛМаНгРО^ 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 8. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +10°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP04/NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +5°С.
Пример 9. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 4 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 4,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 2,5 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4 °С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP04/NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С. Пример 10. В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,95 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (М=1500 Да, р = 1,10 г/см3) и 4,5 мл ППГДЭ (М=640 Да, р = 1,06 г/см3). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddH20 и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4° С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до pH 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ Na2HP0 /NaH2P04, 145,5 мМ NaCI, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Исследования токсичности биополимера по изобретению
Одной из основных проблем с использованием диглициловых эфиров в создании поперечных связей в ГК является наличие оксирановых групп, оставшихся после технологического цикла приготовления биополимера. В настоящем изобретении предлагается введение дополнительной стадии, включающей в себя обработку реакционной массы сшитого биополимера раствором глицина, данный этап позволяет остановить реакцию полимеризации в короткие сроки и дополнительно решить вопрос свободных эпоксидных групп, обуславливающих токсичность получаемого биополимера, поскольку в результате изомеризации оксирановые группы изомеризуются с образованием альдегида, что и определяет токсичность биополимера. В результате глицин, как нуклеофильный агент, присоединяется и блокирует эпоксидную группу. Используя данную технологию полученный сшитый биополимер не обладает токсическим действием.
Были проведены испытания на токсичность в сравнении с аналогом эндопротеза синовиальной жидкости, содержащим только раствор ГК без сшивки, «Гируан плюс». Также результатом испытаний стало описание влияния препарата на иммунную систему мыши и предоставление данных с показателями изменения маркерных клеток, воспалительных реакциях, депонирующего эффекта препарата и предположение путей выведения.
В данном эксперименте исследовали токсичность и биораспределение имплантата «Гируан плюс» (НА) - препарат, содержащий ГК без химической модификации в концентрации 10 мг/мл, фосфатно-физиологический буфер, а также препарата эндопротеза синовиальной жидкости ESL-HA-PPEGDE-1 (Х1) - препарат, приготовленный согласно способу по изобретению, представляющий собой раствор 10 мг/мл сшитого биополимера (получен согласно примеру 2 настоящего документа), фосфатно- физиологический буфер.
Вязкостные свойства. Оба препарата вязкие, прозрачные, полностью растворимы в воде, в виде равномерных капель проходят через иглу 30Gx1/2".
Токсичность in vitro. Для оценки токсичности препараты разводили в 8 раз и оценивали методом МТТ на линии клеток карциномы поджелудочной железы ТЗМ4. Результаты эксперимента показали, что оба препарата низкотоксичны (фиг.6).
Токсичность in vivo. Токсичность in vivo оценивали на мышах линии A/Sn. Филлеры вводили мышам внутрибрюшинно иглой 30G в объемах 50, 100, 150 и 200 мкп на мышь. Мышей выводили из эксперимента через 7, 8 и 10 дней. Забирали перитонеальный экссудат и селезенки. Оценивали количество и субпопуляционный состав клеток в экссудате и селезенках. Для сравнения использовали интактную мышь. Результаты исследований показали, что количество клеток и субпопуляционный состав в брюшной полости находится в пределах нормы (фиг.7, Таблица 1).
Таблица 1. Субпопуляционный состав перитонеального экссудата на 7 сутки после в/б введения препарата «Гируан плюс» (НА) или препарата по изобретению (Х1).
Figure imgf000016_0001
Анализ количества и субпопуляционного состава селезенки показал незначительные изменения, также находящиеся в пределах нормы (Таблица 2). Наблюдается снижение отношения CD4/CD8, однако это также в пределах нормы. Различий между образцами НА и Х1 не выявили.
Таблица 2. Субпопуляционный состав селезенки на 7 сутки после внутрибрюшинного введения препарата «Гируан плюс» (НА) или препарата по изобретению (Х1).
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000017_0001
Биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).
В ходе проведения данного эксперимента изучали биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости_при подкожном и внутрибрюшинном введении геля с включением флуоресцентной метки родамина В. Мышам вводили филлеры подкожно (п/к) в объеме 50 мкл под лапу N°3 или внутрибрюшинно (в/б) в объеме 200 мкл. Мышей выводили из эксперимента через 8 и 10 дней. В месте инъекции (п/к или в/б) свободный гель не обнаруживался. Забирали печень, селезенку, почки, мышцы и жировую ткань. Результаты проведенных экспериментов показали, что основным депо являются жировые клетки (фиг.8). При в/б введении часть геля уносится макрофагами в региональные лимфоузлы (фиг. 9) и селезенку, откуда гель попадает в печень и почки (фиг.10). Остатки выводятся через мочу (почки) и кал (печень) (Таблица 3). Различий по биораспределению между образцами НА и Х1 не выявили.
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости изучали в 3D культуре in vitro на клетках линии кератиноцитов человека НаСаТ. Результат проведенных исследований показал, что образцы захватываются клетками и сохраняются в них не менее 10 дней без значительного гидролиза (фиг. 11).
Биодеградация эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ) in vivo :
Часть мышей выводили из эксперимента через 20 дней, забирали жировую ткань из места инъекций (брюшной полости и в области подкожного введения). Анализ жировой ткани осуществляли с помощью гистологии. Результаты проведенных исследований показали, что через 20 дней в брюшной полости и в области подкожного введения образцов частично гидролизуются, но достоверно детектируются (фиг. 12).
Таблица 3. Анализ биораспределения препарата «Гируан плюс» (НА) и препарата по изобретению (Х1) на 7-10 день после введения подкожно под лапу N°3 (sc) или внутрибрюшинно (ip).
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
‘Органы гомогенизировали в физрастворе, добавляли равный объем 70% этилового спирта, экстрагировали родамин В в течение 12 часов, центрифугировали при 15 тыс об/мин 20 мин, осветленные надосадки переносили в планшеты и измеряли флуоресценцию на ридере при длине волны 525 нм. Приведены данные по средней интенсивности флюоресценции (MFI) за вычетом контроля для интактной мыши. Данные не нормированы на вес органов.
Гидролиз в тканях ассоциирован с захватом дебриса макрофагами, его гидролизом и частичным транспортом его в селезенку (фиг. 13) и в печень. Различий по гидролизу и транспорту образцов не было.
Таким образом, проведенные исследования показали, что препараты «Гируан плюс» (НА) и препарат по изобретению ESL-HA-PPEGDE-1 (Х1) не отличаются по токсичности, биораспределению и биоразложению, путям выведения полупродуктов и продуктов биораспада. Как следствие можно сделать вывод о том, что способ согласно данному изобретению позволяет получить такой же низкотоксичный биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, как и сам гиалуронат.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
1. Balazs Е.А. and Gibbs D.A. The rheological properties and biological function of hyaluronic acid // Chem Mol Biol Intercell Matrix. -1970. - Vol. 3. - P. 1241-1245. 2. Balazs E.A., Leshchiner E., Larsen N.E. and Band P. Applications of hyaluronan and its derivates / Gebelein CG (ed) Biotechnological polymers. Technomic, Lancaster. -1993. -P. 41-65.
3. De Angelis P.L. Hyaluronan synthases: fascinating giycosyltransferases from vertebrates, bacterial pathogens, and algal viruses // Cell. Mol. Life. Sci. -1999. - Vol. 56. - P. 670-682.
4. Volpi N. and Maccari F. Purification and characterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis // Biochimie. -2003. - Vol. 85. - P. 619-625.
5. O'Regan M., Martini I., Crescenzi F., De Luca C., Lansing M. Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis // Int. J. Biol. Macromol. -1994. - Vol. 16 - No. 6. - P. 283-286.
6. Toole B.P. Hyaluronan in morphogenesis // J. Intern. Med. -1997. - Vol. 242 - No. 1. - P. 35-40.
7. Marcellin E., Chen W., Nielsen L.K. Microbial hyaluronic caid biosynthesis in Microbial production of biopolymers and polymers precursors application and perspectives // Caisters academic press. -2009. - Vol. 7. - P. 163-179.
8. Bettelheim F.A. and Popdimirova N. Hyaluronic acid — synergetic glycosaminoglycan // Curr. Eye. Res. -1992. - Vol. 11. - P. 411-419.
9. Goldberg R.L. and Toole B.P. Hyaluronate inhibition of cell proliferation // Arthritis Rheum. -1987. - Vol. 30. - P. 769-778.
10. Alho A.M. and Underhill C.B. The hyaluronate receptor is referentially expressed on proliferating epithelial cells // J. Cell. Biol. -1989. - Vol. 108. - P. 1557-1565.
11. Stern R. Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology // Pathol. Biol. -2005. - Vol. 53 - No. 7. - P. 372-382.
12. Heldin P. Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumour formation // Braz. J. Med. Biol. Res. -2003. - Vol. 36 - No. 8. - P. 967-973.
13. Scott J.E. Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. The biology of hyaluronan // Ciba Found. Symp - 1989 - Vol. 143.- P. 6-15.
14. Хабаров B.H., Бойков П.Я., Селянин M.A. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине - М., Практическая медицина, 2012.- 224 с.
15. Lapcik L, Lapcik L. Hyaluronan: preparation, structure, properties and applications // Chem. Rev. - 1998. - Vol. 98 - No. 8. - P. 2663-2684.
16. Brown M.B., Jones S.A. Hyaluronic acid: a unique topical vehicle for the localized delivery of drugs to the skin // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. -2005. - Vol. 19 - No. 3. - P. 308-18.
17. Белодед A.B. Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями Р. Streptococcus : дис. канд. биол. наук- М., 2008 - С. 174.
18. Girish K.S., Kemparaju К. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidases: a biological review. Life Sciences. -2007. - Vol. 80. - P. 1921-1943.
19. Lolvmcin A.M., Peppcis N.A. Molecular analysis of interpolymer complexation in graft copolymer networks // Polymer - 2000 - Vol. 41 - No. 1 - P. 73-80.
20. Altman R.D. Intra-articular sodium hyaluronate in the osteoarthritis of the knee // Semin. Arthritis. Rheum.- 2000 - Vol. 41.- No. 30 - P. 11-18.
21. Uthman I., Raynauld J.P., Haraoui B. Intra-articular therapy of osteoarthritis // J. Postgrad. Med - 2003 - Vol. 41.- No. 79 - P. 449-453.

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, включающий следующие стадии:
- создание поперечных ковалентных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, посредством введения двух и более сшивающих агентов различных молекулярных масс, в различном соотношении в основной среде, каждый из которых представляет собой (полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир;
- остановка стадии создания поперечных ковалентных связей и связывание свободных эпоксидных групп посредством добавления глицина.
2. Способ по п.1, в котором каждый сшивающий агент независимо характеризуется молекулярной массой, имеющей значение в диапазоне от 500 до 8000 Да.
3. Способ по п.1, в котором мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1 :200 - 1 :600.
4. Способ по п.З, в котором мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:400.
5. Способ по п.1, в котором после добавления глицина реакционную смесь перемешивают при температуре 4-25°С и в течение 10-12 часов.
6. Способ по п.1, в котором полученную реакционную смесь после стадии остановки и связывания эпоксидных групп нейтрализуют до значения pH 7,0±0,5, подвергают диализу в проточной системе с физиологическим фосфатным буфером, где pH принимает значение 7,3±0,2.
7. Способ по п.1, в котором молекулярная масса гиалуроната натрия составляет от 1 *106 Да до 2x106 Да.
8. Способ по п.1, в котором стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 10°С.
9. Способ по п.1, в котором стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в течение 18-22 часов.
10. Способ по п.1, в котором сшивающие агенты могут вводится одновременно, последовательно или через промежуток времени.
11. Способ по п.10, в котором промежуток времени составляет 3-5 часов.
12. Способ по п.1, в котором молярная масса биополимера не превышает 5000
«Да.
13. Биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, предназначенный для использования в качестве эндопротеза синовиальной жидкости и полученный способом по п.1.
14. Биополимер по п.13, молярная масса биополимера в котором не превышает 5000 «Да.
15. Биополимер по п.13, в котором степень сшивки составляет 10±3 %.
PCT/RU2019/001019 2019-12-25 2019-12-26 Способ получения модифицированного гиалуронана WO2021133190A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019143704 2019-12-25
RU2019143704A RU2750000C1 (ru) 2019-12-25 2019-12-25 Способ получения модифицированного гиалуронана и его применение в медицине, в том числе при эндопротезировании

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021133190A1 true WO2021133190A1 (ru) 2021-07-01

Family

ID=76504805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/001019 WO2021133190A1 (ru) 2019-12-25 2019-12-26 Способ получения модифицированного гиалуронана

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2750000C1 (ru)
WO (1) WO2021133190A1 (ru)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886787A (en) * 1984-07-23 1989-12-12 Pharmacia Ab Method of preventing adhesion between body tissues, means for preventing such adhesion, and process for producing said means
RU2386641C2 (ru) * 2008-07-09 2010-04-20 Институт синтетических полимерных материалов (ИСПМ) им. Н.С. Ениколопова РАН Способ получения модифицированной ретинолом сшитой соли гиалуроновой кислоты
CN104086788A (zh) * 2014-07-17 2014-10-08 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种注射用修饰透明质酸钠凝胶
RU2582702C1 (ru) * 2015-08-19 2016-04-27 федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) Способ получения композиции на основе модифицированного гиалуроната натрия, композиция на основе модифицированного гиалуроната натрия и ее применение
CN109161037A (zh) * 2018-07-18 2019-01-08 江苏地韵医疗科技有限公司 一种水凝胶复合物、制备方法及应用
US20190055368A1 (en) * 2017-08-16 2019-02-21 Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel
CN109513043A (zh) * 2017-09-20 2019-03-26 刘宏飞 一种注射用修饰透明质酸钠凝胶及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4886787A (en) * 1984-07-23 1989-12-12 Pharmacia Ab Method of preventing adhesion between body tissues, means for preventing such adhesion, and process for producing said means
RU2386641C2 (ru) * 2008-07-09 2010-04-20 Институт синтетических полимерных материалов (ИСПМ) им. Н.С. Ениколопова РАН Способ получения модифицированной ретинолом сшитой соли гиалуроновой кислоты
CN104086788A (zh) * 2014-07-17 2014-10-08 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种注射用修饰透明质酸钠凝胶
RU2582702C1 (ru) * 2015-08-19 2016-04-27 федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) Способ получения композиции на основе модифицированного гиалуроната натрия, композиция на основе модифицированного гиалуроната натрия и ее применение
US20190055368A1 (en) * 2017-08-16 2019-02-21 Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel
CN109513043A (zh) * 2017-09-20 2019-03-26 刘宏飞 一种注射用修饰透明质酸钠凝胶及其制备方法
CN109161037A (zh) * 2018-07-18 2019-01-08 江苏地韵医疗科技有限公司 一种水凝胶复合物、制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
RU2750000C1 (ru) 2021-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fakhari et al. Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering, as a dermal filler and in osteoarthritis treatment
US8481080B2 (en) Method of cross-linking hyaluronic acid with divinulsulfone
CA2550718C (en) Cohesive gels from cross-linked hyaluronan and/or hylan, their preparation and use
EP1753787B1 (en) Method of covalently linking hyaluronan and chitosan
RU2360928C2 (ru) Комплексная матрица для медико-биологического применения
Schiraldi et al. Biotechnological production and application of hyaluronan
Li et al. Click chemistry-based biopolymeric hydrogels for regenerative medicine
US20090004276A1 (en) Novel injectable chitosan mixtures forming hydrogels
CN113454166A (zh) 基于多糖和两性离子聚合物的水凝胶组合物及其使用方法
TW200938208A (en) Crosslinked hyaluronic acid in emulsion
CN101903408A (zh) 壳聚糖组合物
CZ20011650A3 (cs) Zesítěné hyaluronové kyseliny
CN114502599B (zh) 一种超支化聚甘油多缩水甘油醚及其作为多糖交联剂的用途
BRPI0708128A2 (pt) derivado de ácido hialurÈnico, processo para produção de um derivado de ácido hialurÈnico, composição, artigo cosmético, artigo sanitário, médico ou cirúrgico, cápsula ou microcápsula de medicamento, métodos para realizar procedimentos em oftalmologia, no tratamento de osteoartrite, e no tratamento de cáncer, para realizar administração transdérmica e dérmica de um agente farmacologicamente ativo, e administração dérmica de um cosmético, e para realizar procedimentos no tratamento de perda de cabelo ou calvìcie, métodos oftalmológico, de tratamento de osteoartrite, de uma ferida, e de perda de cabelo ou calvìcie, e, uso de um derivado de ácido hialurÈnico
CN105324486B (zh) 透明质酸的制造方法和含有通过上述制造方法制造的透明质酸的防粘连用组合物
RU2477138C1 (ru) Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону
RU2582702C1 (ru) Способ получения композиции на основе модифицированного гиалуроната натрия, композиция на основе модифицированного гиалуроната натрия и ее применение
Fakhari Biomedical application of hyaluronic acid nanoparticles
Vasiliu et al. Microbial exopolysaccharides for biomedical applications
RU2750000C1 (ru) Способ получения модифицированного гиалуронана и его применение в медицине, в том числе при эндопротезировании
EP2844310A1 (en) Shape-memory cross-linked polysaccharides
AU2017251957B2 (en) Hyaluronic acid conjugates and uses thereof
EP4368643A1 (en) High-swelling hyaluronic acid bead gel
Brekke et al. Hyaluronan as a biomaterial
ES2781787T3 (es) Carboxialquil quitosano

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19957490

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19957490

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1